Связывающие молекулы человека, способные нейтрализовать вирус гриппа h5n1, и их применение

СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ ЧЕЛОВЕКА, СПОСОБНЫЕ НЕЙТРАЛИЗОВАТЬ ВИРУС ГРИППА H5N1, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, таким как моноклональные антитела человека, которые связываются с вирусом гриппа H5N1 и обладают нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа H5N1. Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим антитела, их последовательностям и композициям,включающим указанные антитела, а также к способам идентификации или получения антител. Указанные антитела могут быть использованы для диагностики, профилактики и/или лечения гриппа, вызываемого вирусом гриппа H5N1. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанные антитела обеспечивают перекрестную защиту in vivo от разных подтипов вируса гриппа, что позволяет предотвратить и/или лечить грипп, вызываемый подтипами вируса гриппа на основе Н 5, Н 2, Н 6, Н 9 и H1. Ван Ден Бринк Эдвард Норберт, Де Крэйф Корнелис Адриан, Тросби Марк (NL) Медведев В.Н. (RU) 017203 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к медицине. В частности, настоящее изобретение относится к диагностике, профилактике и/или лечению гриппа, вызываемого вирусом гриппа H5N1. Уровень техники Вирусы гриппа состоят из трех типов А, В и С. Вирусы гриппа типа А инфицируют целый ряд птиц и млекопитающих, включая человека, лошадей, морских млекопитающих, свиней, хорьков и цыплят. Вирусы гриппа типа А вызывают у животных легкие локализованные формы инфекций дыхательных путей и кишечника. Однако существуют высокопатогенные штаммы вируса гриппа типа А, такие какH5N1, которые вызывают системные инфекции у домашней птицы, при которых смертность может достигать 100%. Животные, инфицированные вирусом гриппа типа А, часто являются переносчиками вирусов гриппа, при этом установлено, что некоторые подтипы могут передаваться человеку. Вирусы гриппа типа А можно классифицировать на подтипы на основании аллельных вариаций в антигенных областях двух генов, кодирующих поверхностные гликопротеины, а именно гемагглютинин(НА) и нейраминидазу (NA), которые необходимы для присоединения и высвобождения вируса из клетки. Другие основные вирусные белки включают нуклеопротеин, структурный белок нуклеокапсида,мембранные белки (M1 и М 2), полимеразы (РА, РВ и РВ 2) и неструктурные белки (NS1 и NS2). В настоящее время известны шестнадцать подтипов НА (Н 1-Н 16) и девять антигенных вариантовNA (N1-N9) вируса гриппа типа А. Ранее были известны только три подтипа, поражающие человека(H1N1, H1N2 и H3N2). Однако за последние годы были получены данные о том, что патогенный подтипH5N1 вируса птичьего гриппа типа А смог преодолеть межвидовой барьер и инфицировать человека,став причиной смерти нескольких субъектов, что было зарегистрировано в Гонконге в 1997 и 2003 гг. Вирус птичьего гриппа поражает у человека клетки дыхательных путей, а также кишечник, печень,селезенку, почки и другие органы. Для птичьего гриппа характерны такие симптомы как жар, затруднение дыхания, включая одышку и кашель, лимфопения, диарея и нарушение регулирования уровней сахара в крови. В отличие от сезонного гриппа наибольшему риску подвергаются здоровые взрослые люди,составляющие основную часть населения. Из-за высокой патогенности определенных подтипов вируса птичьего гриппа типа А, в частности H5N1, и продемонстрированной ими способности инфицировать человека существует большой экономический и общественный риск для здоровья людей, обусловленный указанными вирусными штаммами, включая реальную опасность распространения эпидемии и пандемии данного заболевания. Масштаб опасности можно проиллюстрировать пандемией гриппа в 1918 г., который стал причиной смерти более 50 млн человек. В настоящее время нет эффективных вакцин от гриппа, вызываемого H5N1, поэтому пассивная иммунотерапия с использованием иммуноглобулинов может быть альтернативным методом лечения. Как было отмечено в научной литературе, пассивная вакцинация во время пандемии 1918 г. позволила вдвое сократить смертность. Таким образом, с учетом благоприятного терапевтического воздействия иммуноглобулинов на людей существует потребность в связывающих молекулах, предпочтительно в связывающих молекулах человека, способных нейтрализовать H5N1. Настоящее изобретение позволяет получить такие связывающие молекулы и показывает, что они могут быть использованы в медицине, в частности для диагностики, профилактики и/или лечения гриппа, вызываемого H5N1. Описание чертежей На фиг. 1 показан анализ методом иммуноблоттинга разных гемагглютининов (НА) с использованием антител CR6307 (левая часть), CR6323 (средняя часть) и CR5111 (правая часть). Рекомбинантные НА подвергали анализу методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и иммуноблоттинга. В полосах 1 показан sHA штамма H5N1TV; в полосах 2 показан рекомбинантный НА, подтип Н 5 (А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1; в полосах 3 показан рекомбинантный НА, подтип Н 3 (А/Вайоминг/3/2003 (H3N2; и в полосах 4 показан рекомбинанный НА, подтипH1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1). Указано также положение, где могут быть обнаружены НА 0, НА 1 и НА 2. На фиг. 2 показана средняя клиническая оценка для группы мышей, полученная при выполнении исследования (пример 12), в котором за один день до инфицирования вирусом гриппа H5N1 мышам профилактически вводили в разных дозах три моноклональных антитела человека против H5N1: CR6261,CR6323 и CR6325. На фиг. 3 показано изменение массы тела во время профилактического введения мышам антител против H5N1 в течение 21 дня после инфицирования (пример 12). На фиг. 4 показано число выживших мышей в разных группах при выполнении исследования, представленного на фиг. 2 и 3 (пример 12). На фиг. 5 показана смертность в зависимости от дозы антител против H5N1, вводимой при выполнении исследования, представленного на фиг. 2-4 (пример 12). На фиг. 6 показана средняя клиническая оценка для группы мышей, полученная при выполнении исследования (пример 13), в котором мышей инфицировали смертельной дозой вируса гриппа H5N1 и в разные периоды времени после инфицирования (4 ч, 1, 2 и 3 дня) вводили моноклональное антитело противH5N1 CR6261 или неродственное антитело CR2006 (которое вводили в 1-й день после инфицирования).-1 017203 На фиг. 7 показано число выживших животных в каждой группе при выполнении исследования,представленного на фиг. 6. Все животные в группах 1-4 за исключением одного животного в группе 1 были живы в течение всего исследования до 21-го дня после инфицирования. Все животные в группе 5 умерли на 9-й день. На фиг. 8 показнаа средняя масса тела мышей в каждой группе при выполнении исследования,представленного на фиг. 6. Массу тела мышей в группе 5 прекратили измерять на 9-й день, так как все мыши в указанной группе умерли к данному времени. Все остальные мыши в группах 1-4 достигли нормальной массы тела на 21-й день после инфицирования, хотя скорость восстановления массы тела в каждой группе зависела от времени начала лечения. На фиг. 9 показано процентное значение выживших животных в каждой группе при выполнении исследования, в котором мышей инфицировали смертельной дозой вируса гриппа H1N1 и в разные периоды времени (за 1 день до инфицирования, через 1, 2 и 3 дня после инфицирования) вводили моноклональное антитело против H5N1 CR6261 или неродственное антитело CR57 (которое вводили в 1-й день после инфицирования). На фиг. 10 показана средняя масса тела мышей в каждой группе при выполнении исследования,представленного на фиг. 9. Массу тела мышей в группе 5 прекратили измерить на 9-й день, так как все мыши в указанной группе умерли к данному времени. Все остальные мыши в группах 1-4 достигли нормальной массы тела на 21-й день после инфицирования, хотя скорость восстановления массы тела в каждой группе зависела от времени начала лечения. Описание изобретения Ниже приведены определения терминов, использованных в настоящем описании изобретения. В значении, использованном в настоящем описании изобретения, термин "связывающая молекула" означает интактный иммуноглобулин, включающий моноклональные антитела, такие как химерные, гуманизированные или моноклональные антитела человека, или антигенсвязывающий и/или содержащий вариабельную область фрагмент иммуноглобулина, конкурирующий с интактным иммуноглобулином за специфическое связывание с партнером связывания иммуноглобулина, например H5N1. Независимо от структуры антигенсвязывающий фрагмент связывается с антигеном, узнаваемым интактным иммуноглобулином. Антигенсвязывающий фрагмент может включать пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, состоящую по меньшей мере из 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70,80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 или 250 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности связывающей молекулы. Термин "связывающая молекула" в используемом здесь значении включает все классы и подклассы иммуноглобулинов, известные в данной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей связывающие молекулы можно разделить на пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, при этом некоторые из указанных классов можно далее разделить на подклассы (изотипы), например IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Антигенсвязывающие фрагменты включают, в частности, фрагменты области, определяющей комплементарность, (CDR)Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, одноцепочечные антитела (scFv), двухвалентные одноцепочечные антитела, одноцепочечные фаговые антитела, диатела, триатела, тетратела (поли)пептиды, содержащие, по меньшей мере, фрагмент иммуноглобулина, достаточный для обеспечения специфического связывания антигена с (поли)пепитидом и т.д. Вышеуказанные фрагменты могут быть получены методами синтеза, путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов либо генетически созданы методами рекомбинантных ДНК. Методы получения таких фрагментов хорошо известны в данной области и описаны, например, в публикации Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow and D. Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,New York, которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент могут иметь один или несколько сайтов связывания. При наличии нескольких сайтов связывания такие сайты связывания могут быть одинаковыми или разными. Связывающая молекула может быть голой или неконъюгированной связывающей молекулой, но также может быть частью иммуноконъюгата. Голая или неконъюгированная связывающая молекула является связывающей молекулой, которая не конъюгирована, функционально не связана или каким-либо другим образом физически или функционально не связана с эффекторной частью или меткой, такой как,например, токсическое вещество, радиоактивное вещество, липосома, фермент. Следует отметить, что голые или неконъюгированные связывающие молекулы включают также связывающие молекулы, которые были стабилизированы, полимеризованы, гуманизированы или изменены каким-либо другим образом за исключением присоединения эффекторной части или метки. Таким образом, в объем настоящего изобретения входят все модифицированные после трансляции голые и неконъюгированные связывающие молекулы, включая модификации, произведенные в естественном окружении клетки, продуцирующей связывающую молекулу, клеткой, продуцирующей рекомбинантную связывающую молекулу, и введенные человеком после получения исходной связывающей молекулы. Термин "голая или неконъюгированная связывающая молекула", несомненно, предполагает способность связывающей молекулы образовывать функциональные связи с эффекторными клетками и/или молекулами после введения в ор-2 017203 ганизм, так как некоторые из таких взаимодействий необходимы для оказания биологического действия. Поэтому отсутствие связанной эффекторной группы или метки применимо к определению голой или неконъюгированной связывающей молекулы in vitro, но не in vivo. В используемом здесь значении термин "биологический образец" означает образцы разных типов,включая пробы крови и другие жидкие образцы биологического происхождения, твердые образцы ткани,такие как биоптат или культуры ткани, или клетки, полученные из указанных образцов, и их потомство. В определение данного термина входят также образцы, которые были каким-либо образом изменены после их получения, например в результате обработки реагентами, солюбилизации или обогащения определенными компонентами, такими как белки или полинуклеотиды. Указанный термин служит для определения разных типов клинических образцов, полученных у любого вида, а также включает клетки в культуре, клеточные супернатанты и клеточные лизаты. Термин "области, определяющие комплементарность" (CDR) в используемом здесь значении означает последовательности в вариабельных областях связывающих молекул, таких как иммуноглобулины,которые обычно в значительной степени способствуют образованию антигенсвязывающего сайта, комплементарного по форме и распределению заряда узнаваемого эпитопа антигена. Области CDR могут быть специфичными к линейным эпитопам, эпитопам прерывистого типа или конформационным эпитопам белков или фрагментов белков, присутствующим в белке в нативной конформации или в некоторых случаях в денатурированной форме, например в результате солюбилизации в SDS. Эпитопы могут также состоять из посттрансляционных модификаций белков. Термин "делеция" в используемом здесь значении означает изменение аминокислотной или нуклеотидной последовательности, в которой отсутствует один или несколько аминокислотных или нуклеотидных остатков по сравнению с исходной часто природной молекулой. Термин "регулирующая экспрессию последовательность нуклеиновой кислоты" в используемом здесь значении означает полинуклеотидные последовательности, необходимые для экспрессии и/или влияющие на экспрессию функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Регулирующие экспрессию последовательности нуклеиновых кислот, в частности соответствующие инициирующие и терминирующие транскрипцию, промоторные, энхансерные последовательности; репрессорные или активаторные последовательности; эффективные РНК-процессирующие сигналы, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, стабилизирующие цитоплазматическую мРНК; последовательности, усиливающие эффективность трансляции (например,сайты связывания рибосомы); последовательности, повышающие устойчивость белка; и при желании последовательности, усиливающие секрецию белка, могут представлять собой любую последовательность нуклеиновой кислоты, проявляющую активность в выбранном организме-хозяине, и могут быть выделены из генов, кодирующих белки, которые являются гомологичными или гетерологичными организму-хозяину. Специалисту в данной области хорошо известны методы идентификации и использования регулирующих экспрессию последовательностей. Термин "функциональный вариант" в используемом здесь значении означает связывающую молекулу, включающую нуклеотидную и/или аминокислотную последовательность, которая изменена одним или несколькими нуклеотидами и/или аминокислотами по сравнению с нуклеотидными и/или аминокислотными последовательностями исходной связывающей молекулы, но при этом по-прежнему может конкурировать за связывание с партнером связывания, например H5N1, с исходной связывающей молекулой. Другими словами, модификации аминокислотной и/или нуклеотидной последовательности исходной связывающей молекулы не оказывают существенного влияния или не изменяют характеристики связывания связывающей молекулы, кодированной данной нуклеотидной последовательностью или содержащей данную аминокислотную последовательность, т.е. связывающая молекула по-прежнему может узнавать и связывать свою мишень. Функциональный вариант может содержать консервативные модификации последовательности, включающие замены, добавления и делеции нуклеотидов и аминокислот. Указанные модификации могут быть произведены стандартными методами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и неспецифический ПЦР-опосредованный мутагенез, и могут включать природные, а также неприродные нуклеотиды и аминокислоты. Консервативные замены аминокислот включают замены, в которых аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, обладающим аналогичными структурными или химическими свойствами. В данной области определены семейства аминокислотных остатков с одинаковыми боковыми цепями. Указанные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин,аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), лишенными заряда полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин,лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), -разветвленными боковыми цепями (например,треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин,триптофан). Специалисту в данной области должно быть известно, что могут быть использованы другие классификации семейств аминокислотных остатков, отличные от вышеуказанной классификации. Кроме того, вариант может содержать неконсервативные замены аминокислот, например замену аминокислоты-3 017203 аминокислотным остатком, обладающим другими структурными или химическими свойствами. Подобные незначительные вариации могут также включать делеции или инсерции аминокислот либо как делеции, так и инсерции. Аминокислотные остатки, которые могут быть заменены, вставлены или удалены без нарушения иммунологической активности, можно определить с помощью компьютерных программ,хорошо известных в данной области. Мутация в нуклеотидной последовательности может быть единственным изменением, произведенным в локусе (точковая мутация), таким как транзиция или трансверсия, или, альтернативно, в одном локусе может быть вставлено, удалено или заменено несколько нуклеотидов. Кроме того, одно или несколько изменений может быть произведено в любом числе локусов нуклеотидной последовательности. Мутации могут быть выполнены любым приемлемым методом, известным в данной области. Термин "хозяин" в используемом здесь значении означает организм или клетку, в которую введен вектор, такой как клонирующий вектор или вектор экспрессии. Организм или клетка могут быть прокариотическими или эукариотическими. Следует отметить, что в определение данного термина входит не только определенный организм или клетка, но также потомство такого организма или клетки. Так как в последующих поколениях могут иметь место определенные изменения, возникшие вследствие мутации или под влиянием окружающей среды, такое потомство фактически может не быть идентичным исходному организму или клетке, но по-прежнему входит в определение термина "хозяин" в значении, используемом в настоящем описании изобретения. Термин "человеческий" применительно к связывающим молекулам по настоящему изобретению означает молекулы, которые непосредственно получены у человека или созданы на основе человеческой последовательности. Если связывающая молекула получена или создана на основе человеческой последовательности и затем модифицирована, такая молекула по-прежнему считается человеческой в значении, используемом в настоящем описании изобретения. Другими словами, термин "человеческий" применительно к связывающим молекулам включает связывающие молекулы, содержащие вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии клеток человека или созданные на основе вариабельных или константных областей, присутствующих в лимфоцитах человека и модифицированных каким-либо образом. Таким образом, связывающие молекулы человека могут содержать аминокислотные остатки, не кодированные последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии клеток человека, включать замены и/или делеции (например, мутации, введенные, например, путем неспецифического или сайт-специфического мутагенеза in vitro или в виде соматической мутации in vivo). Термин "на основе" использован в настоящем описании изобретения применительно к ситуации, когда последовательность нуклеиновой кислоты может быть точно скопирована с матрицы или получена с незначительными мутациями, например, при помощи подверженных ошибкам методов ПЦР, или синтезирована в соответствии с матрицей в виде точной копии или с незначительными модификациями. Полусинтетические молекулы, полученные на основе последовательностей человека,также считаются человеческими в соответствии с определением, используемым в настоящем описании изобретения. Термин "инсерция", известный также как термин "добавление", означает изменение в аминокислотной или нуклеотидной последовательности, представляющее собой добавление одного или нескольких аминокислотных или нуклеотидных остатков по сравнению с исходной последовательностью. Термин "выделенный" применительно к связывающим молекулам по настоящему изобретению означает связывающие молекулы, которые, по существу, не содержат других белков или полипептидов, в частности не содержат других связывающих молекул, обладающих другими антигенными специфичностями, а также, по существу, не содержат другого клеточного вещества и/или химических веществ. Например, связывающие молекулы, полученные рекомбинантными методами, предпочтительно, по существу, не содержат культуральной среды, и связывающие молекулы, полученные методами химического синтеза, предпочтительно, по существу, не содержат химических предшественников или других химических веществ, т.е. указанные молекулы отделены от химических предшественников или других химических веществ, используемых в процессе синтеза белка. Термин "выделенный" применительно к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие молекулы по настоящему изобретению, означает молекулы нуклеиновых кислот, в которых нуклеотидные последовательности, кодирующие связывающие молекулы, не содержат других нуклеотидных последовательностей, в частности нуклеотидных последовательностей, кодирующих связывающие молекулы, которые связываются с партнерами связывания, отличными от H5N1. Кроме того, термин "выделенный" относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые, по существу, полностью отделены от других клеточных компонентов, сопровождающих нативную молекулу нуклеиновой кислоты в естественных условиях в природном хозяине, таких как, например, рибосомы, полимеразы или геномные последовательности, с которыми данная молекула связана в естественных условиях. Кроме того, "выделенные" молекулы нуклеиновых кислот, такие как молекулы кДНК, могут, по существу, не содержать другого клеточного вещества или культуральную среду при получении рекомбинантными методами или могут, по существу, не содержать химических предшественников или других химических веществ при получении методами химического синтеза. Термин "моноклональное антитело" в используемом здесь значении означает препарат молекул ан-4 017203 титела с одинаковым молекулярным составом. Моноклональное антитело характеризуется одной специфичностью связывания и сродством к конкретному эпитопу. Таким образом, термин "моноклональное антитело человека" означает антитело, обладающее одной специфичностью связывания, которое содержит вариабельные и константные области, выделенные из последовательностей иммуноглоблулина зародышевой линии клеток человека или полученные на их основе или выделенные из полностью синтетических последовательностей. Способ получения моноклонального антитела не имеет конкретного значения. Термин "природный" в значении, используемом в настоящем описании изобретения применительно к объекту, означает, что данный объект может быть найден в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме, которая может быть выделена из природного источника и не была намеренно модифицирована человеком в лабораторных условиях, является природной последовательностью. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" в значении, используемом в настоящем изобретении, означает полимерную форму нуклеотидов и включает смысловые и антисмысловые цепи РНК, кДНК, геномной ДНК, а также синтетические формы и смешанные полимеры вышеуказанной молекулы. Нуклеотид является рибонуклеотидом, дезоксинуклеотидом или модифицированной формой нуклеотида любого типа. В определение данного термина входят также одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК. Кроме того, полинуклеотид может включать природные и модифицированные нуклеотиды либо те и другие вместе, связанные природными и/или неприродными нуклеотидными связями. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированы химическими или биохимическими методами либо могут содержать неприродные или производные нуклеотидные основания, что должно быть хорошо известно специалистам в данной области. Такие модификации включают, например, метки, метилирование, замену одного или нескольких природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как неполяризованные связи (например, метилфосфонаты, сложные фосфортриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.), поляризованные связи (например, фосфортиоаты, фосфордитиоаты и т.д.), части с боковыми цепями (например, полипептиды), интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.д.), хелаторы,алкилаторы и модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). В определение вышеуказанного термина входит также любая топологическая конформация, включающая одноцепочечные, двухцепочечные, частично дуплексные, триплексные, шпилькообразные, кольцевые и подобные висячему замку конформации. Кроме того, указанный термин включает синтетические молекулы, имитирующие способность полинуклеотидов связываться с определенной последовательностью при помощи водородной связи и других химических взаимодействий. Такие молекулы известны в данной области и включают, например, молекулы, в которых фосфатные связи в остове молекулы заменены пептидными связями. Применительно к последовательности нуклеиновой кислоты указанная молекула включает комплемент за исключением особо оговоренных случаев. Таким образом, в определение молекулы нуклеиновой кислоты, имеющей определенную последовательность, входит комплементарная цепь с комплементарной последовательностью. Комплементарная цепь может быть также использована, например, в терапии антисмысловыми последовательностями при создании гибридизирующих зондов и праймеров для ПЦР. Термин "функционально связанный" относится к двум или более элементам последовательности нуклеиновой кислоты, которые обычно физически связаны и функционально взаимодействуют друг с другом. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если данный промотор может инициировать или регулировать транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности, при этом считается, что кодирующая последовательность "контролируется" промотором. Термин "фармацевтически приемлемый наполнитель" означает любое инертное вещество, объединенное с активной молекулой, такой как лекарственное средство, агент или связывающая молекула, для получения отвечающей требованиям или стандартной лекарственной формы. "Фармацевтически приемлемый наполнитель" является наполнителем, который не токсичен для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и совместим с другими ингредиентами композиции, содержащей данное лекарственное средство, агент или связывающую молекулу. Фармацевтически приемлемые наполнители широко применяются в данной области. Термин "специфическое связывание" в используемом здесь значении применительно к взаимодействию связывающей молекулы, например антитела, и партнера связывания, например антигена, означает,что данное взаимодействие зависит от наличия у партнера связывания определенной структуры, например антигенной детерминанты или эпитопа. Другими словами, антитело предпочтительно связывает или узнает своего партнера связывания, даже если такой партнер связывания находится в смеси с другими молекулами или организмами. Связывание может быть опосредовано ковалентными или нековалентными взаимодействиями либо комбинацией обоих взаимодействий. Таким образом, термин "специфическое связывание" означает иммуноспецифическое связывание с одним антигеном или его фрагментом и отсутствие иммуноспецифического связывания с другими антигенами. Связывающая молекула, которая иммуноспецифически связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низким сродством, определяемым, например, при помощи радиоиммуноанализов (RIA),твердофазных иммуноферментных анализов (ELISA), BIACORE или других анализов, известных в дан-5 017203 ной области. Связывающие молекулы или их фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, могут перекрестно взаимодействовать с родственными антигенами. Связывающие молекулы или их фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, предпочтительно перекрестно не взаимодействуют с другими антигенами. Термин "замена" в используемом здесь значении означает замену одной или нескольких аминокислот или нуклеотидов соответственно другими аминокислотами или нуклеотидами. Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество связывающей молекулы по настоящему изобретению, которое позволяет эффективно предотвращать, ослаблять и/или лечить состояние, возникающее вследствие инфицирования H5N1. Термин "лечение" означает терапевтическое лечение, а также профилактические или превентивные меры, направленные на лечение, прекращение развития или, по меньшей мере, замедление развития заболевания. Нуждающимися в лечении субъектами являются субъекты, страдающие заболеванием, возникшим вследствие инфицирования H5N1, а также субъекты, инфицирование которых H5N1 необходимо предотвратить. Субъекты, которые частично или полностью выздоровели после инфицирования H5N1,могут также нуждаться в лечении. Профилактика предполагает ингибирование или уменьшение распространения H5N1 либо ингибирование или уменьшение возникновения, развития или прогрессирование одного или нескольких симптомов, ассоциированных с инфицированием H5N1. Термин "вектор" означает молекулу нуклеиновой кислоты, в которую может быть вставлена вторая молекула нуклеиновой кислоты для введения хозяину, где она будет реплицирована и в некоторых случаях экспрессирована. Другими словами, вектор может переносить молекулу нуклеиновой кислоты, с которой он связан. В определение термина "вектор" в значении, используемом в настоящем описании изобретения, входят клонирующие векторы и векторы экспрессии. Векторы включают, не ограничиваясь ими, плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) и дрожжевые искусственные хромосомы (YAC), а также векторы, полученные из бактериофагов, растительных или животных (включая человека) вирусов. Векторы включают ориджин репликации, узнаваемый предполагаемым хозяином,и в случае векторов экспрессии, промотор и другие регуляторные области, узнаваемые хозяином. Вектор,содержащий вторую молекулу нуклеиновой кислоты, вводят в клетку путем трансформации, трансфекции или использования механизмов проникновения вирусов. Некоторые векторы могут автономно реплицировать в хозяине, в который они были введены (например, векторы с репликацией бактериального типа могут реплицировать в бактериях). Другие векторы могут быть интегрированы в геном хозяина при введении в хозяина и, таким образом, реплицируют вместе с геномом хозяина. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам человека, способным специфически связываться с вирусом гриппа H5N1 и обладающим нейтрализующей активностью в отношении H5N1. Настоящее изобретение относится также к связывающим молекулам, связывающимся с эпитопом в белке гемагглютинина, который является одинаковым в разных подтипах вируса гриппа и поэтому родственным связывающим молекулам, перекрестно взаимодействующим с подтипами вируса гриппа Н 5, H1, H2,Н 6 и Н 9, такими как H5N1, H1N1 и другими штаммами гриппа, содержащими белок НА с вышеуказанными эпитопами. Настоящее изобретение относится также к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим, по меньшей мере, область связывания связывающих молекул человека. Настоящее изобретение далее относится к применению связывающих молекул человека по настоящему изобретению для профилактики и/или лечения субъекта, страдающего гриппом, вызываемым вирусом H5N1, или находящегося в условиях повышенного риска возникновения гриппа, вызываемого вирусом H5N1. Кроме того, настоящее изобретение относится к применению связывающих молекул человека по настоящему изобретению для диагностики/обнаружения H5N1. Подробное описание изобретения Первым объектом настоящего изобретения являются связывающие молекулы, способные специфически связываться с вирусом гриппа типа А, в частности с вирусом гриппа типа А подтипа H5N1. Связывающие молекулы предпочтительно являются связывающими молекулами человека. Связывающие молекулы по настоящему изобретению предпочтительно обладают нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа типа А подтипа H5N1. Другим объектом настоящего изобретения являются связывающие молекулы, способные специфически связываться с разными штаммами вируса гриппа H5N1 и/или обладают нейтрализующей активностью в отношении указанных штаммов. Указанные штаммы могут входить в штаммы вируса гриппа H5N1 клада 1, клада 2 или клада 3. Филогенетические анализы генов НА, выполненные во время вспышки гриппа, вызванного H5N1, в 2004 и 2005 гг., показали наличие двух разных линий генов НА, получивших название кладов 1 и 2. Вирусы в каждом из указанных кладов распространены в неперекрывающихся географических районах Азии. Вирусы H5N1 с Индокитайского полуострова полностью соответствуют кладу 1, в то время как изоляты H5N1, полученные в нескольких соседних странах, отличаются от изолятов клада 1 и относятся к более разнообразному кладу 2. Вирусы H5N1 клада 1 были выделены у людей и птиц во Вьетнаме, Таиланде и Камбодже, но только у птиц - в Лаосе и Малайзии. Вирусы клада 2 были обнаружены в вирусах, выделенных исключительно у птиц в Китае, Индонезии, Японии и Южной Корее. Вирусы, выделенные у птиц и людей в Гонконге в-6 017203 2003 и 1997 гг., образовали соответственно клады 1' (также определяемые в кладе 1) и 3 (см. WHO GlobalInfluenza Program Surveillance Network, 2005). Гемагглютинины указанных кладов имеют разные аминокислотные последовательности. Примеры штаммов клада 1 включают, не ограничиваясь ими,А/Гонконг/213/03, А/Вьетнам/1194/04, А/Вьетнам/1203/04 и А/Таиланд/1(KAN-1)/2004. Примеры штаммов клада 2 включают, не ограничиваясь ими, А/Индонезия/5/05, А/горный гусь/Куинхай/1 А/05,А/индейка/Турция/1/05 и А/Аньхой/1/05. Примеры штаммов клада 3 включают, не ограничиваясь ими,А/Гонконг/156/97 и А/гусь/Гуандун/1/96. Другие штаммы можно найти, например, в публикации WHOGlobal Influenza Program Surveillance Network, 2005 и на сайте http://www.who.int/csr/disease/avian influenza/guidelines/recommendationvaccine.pdf. Связывающие молекулы по настоящему изобретению предпочтительно могут специфически связываться со штаммами клада 1, клада 2 и клада 3 и обладают нейтрализующей активностью в отношении указанных штаммов. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут специфически связываться с вирусом гриппа H5N1, который является жизнеспособным, живым и/или инфективным или находится в инактивированной/ослабленной форме. Методы инактивации/ослабления вируса гриппа H5N1 хорошо известны в данной области и включают, не ограничиваясь ими, воздействие формалином, -пропиолактоном (BPL), мертиолатом и/или ультрафиолетовым светом. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут также специфически связываться с одним или несколькими фрагментами вируса гриппа H5N1, такими как, например, препарат одного или нескольких белков и/или (поли)пептидов, полученных из подтипа H5N1, или одного или нескольких белков и/или полипептидов H5N1, полученных рекомбинантными методами. При осуществлении способов лечения и/или профилактики гриппа, вызываемого вирусом H5N1, связывающие молекулы предпочтительно могут специфически связываться с доступными поверхностными белками H5N1, такими как поверхностные гликопротеины, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), которые необходимы для присоединения и высвобождения вируса из клетки, или мембранные белки (M1 и М 2). В конкретном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению могут специфически связываться с молекулой НА штаммов H5N1. Связывающие молекулы могут специфически связываться с субъединицей НА 1 и/или НА 2 молекулы НА. Связывающие молекулы могут специфически связываться с линейными, структурными и/или конформационными эпитопами в субъединице НА 1 и/или НА 2 молекулы НА. Молекула НА может быть очищена от вирусов или получена рекомбинантными методами и необязательно выделена перед использованием. Альтернативно НА может быть экспрессирован на поверхности клеток. В диагностических целях связывающие молекулы могут также специфически связываться с белками, не присутствующими на поверхности H5N1, которые включают нуклеопротеин, структурный белок нуклеокапсида, полимеразы (РА, РВ и РВ 2) и неструктурные белки (NS1 и NS2). Нуклеотидные и/или аминокислотные последовательности белков разных штаммов H5N1 могут быть найдены в базе данныхGenBank, базе данных последовательностей вирусов гриппа NCBI, базе данных последовательностей вирусов гриппа (ISD), базе данных EMBL и/или других базах данных. Специалисты в данной области могут легко получить доступ к соответствующим базам данных с целью нахождения таких последовательностей. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению могут специфически связываться с фрагментом вышеуказанных белков и/или полипептидов, если указанный фрагмент содержит по меньшей мере один эпитоп, узнаваемый связывающими молекулами по настоящему изобретению. Термин "эпитоп" в используемом здесь значении означает часть, способную связываться со связывающей молекулой по настоящему изобретению с достаточно высоким сродством с образованием обнаруживаемого комплекса антиген-связывающая молекула. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут или не могут специфически связываться с внеклеточной частью НА (именуемым также в настоящем описании изобретения растворимым гемагглютинином (sHA. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть интактными молекулами иммуноглобулина, такими как поликлональные или моноклональные антитела, либо связывающие молекулы могут быть антигенсвязывающими фрагментами, включающими, не ограничиваясь ими, Fab, F(ab'),F(ab')2, Fv, dAb, Fd, фрагменты области, определяющей комплементарность (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), двухвалентные одноцепочечные антитела, одноцепочечные фаговые антитела, диатела,триатела, тетратела и (поли)пептиды, содержащие по меньшей мере один фрагмент иммуноглобулина,достаточный для обеспечения специфического связывания антигена со штаммами вируса гриппа H5N1 или его фрагментом. В предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению являются моноклональными антителами человека. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы в невыделенной или выделенной форме. Кроме того, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы отдельно или в смеси, включающей по меньшей мере одну связывающую молекулу (ее вариант или фрагмент) по настоящему изобретению. Другими словами, связывающие молекулы могут быть использованы в комбинации, например, в виде фармацевтической композиции, содержащей две или более связывающих молекул по настоящему изобретению, их вариантов или фрагментов. Например, свя-7 017203 зывающие молекулы, обладающие разной, но комплементарной активностью, могут быть объединены в монотерапии для достижения требуемого профилактического, терапевтического или диагностического эффекта, и, альтернативно, связывающие молекулы, обладающие одинаковой активностью, могут быть также объединены в монотерапии для достижения требуемого профилактического, терапевтического или диагностического эффекта. Указанная смесь может далее необязательно включать по меньшей мере одно другое лекарственное средство. Для профилактики и/или лечения гриппа, вызываемого вирусом гриппаH5N1, могут быть использованы такие лекарственные средства, как, например, ингибиторы М 2 (например, амантидин, римантадин) и/или ингибиторы нейраминидазы (например, занамивир, озелтамивир). Связывающие молекулы по настоящему изобретению обычно могут связываться со своими партнерами связывания, т.е. вирусом гриппа H5N1 или его фрагментами, с константой сродства (значение Kd),которая меньше 0,210-4 М, 1,010-5 М, 1,010-6 М, 1,010-7 М, предпочтительно меньше 1,010-8 М, более предпочтительно меньше 1,010-9 М, более предпочтительно меньше 1,010-10 М, еще предпочтительнее меньше 1,010-11 М и, в частности, меньше 1,010-12 М. Константы сродства могут быть разными для разных изотипов антител. Например, аффинное связывание для изотипа IgM соответствует сродству связывания, равному по меньшей мере примерно 1,010-7 М. Константы сродства можно измерить, используя резонанс поверхностного плазмона, например, в системе BIACORE (Pharmacia Biosensor AB,Uppsala, Sweden). Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут связываться с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом в растворимой форме, например в образце или суспензии, или могут связываться с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом, связанным или прикрепленным к носителю или субстрату,например на титрационных микропланшетах, мембранах, гранулах и т.д. Носители или субстраты могут быть изготовлены из стекла, пластика (например, полистирола), полисахаридов, найлона, нитроцеллюлозы, тефлона и т.д. Поверхность таких носителей может быть твердой или пористой и может иметь любую удобную форму. Кроме того, связывающие молекулы могут связываться с вирусом гриппа H5N1 в очищенной/выделенной или неочищенной/невыделенной форме. Связывающие молекулы по настоящему изобретению обладают нейтрализующей активностью. Нейтрализующую активность можно измерить методами, представленными в настоящем описании изобретения. Альтернативные анализы, позволяющие измерить нейтрализующую активность, описаны, например, в руководстве WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva: World HealthOrganisation, 2005, version 2002.5. Настоящее изобретение относится к выделенной связывающей молекуле человека, способной узнавать и связываться с эпитопом в субъединице НА 2 белка гемагглютинина(НА) вируса гриппа, отличающейся тем, что указанная связывающая молекула обладает нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа, включающего НА подтипа Н 5. Примеры штаммов вируса гриппа, которые содержат такой НА подтипа Н 5 и являются важными штаммами с учетом опасности пандемии, включают H5N1, H5N2, H5N8 и H5N9. Особенно предпочтительными являются связывающие молекулы, которые, по меньшей мере, нейтрализуют штамм вируса гриппа H5N1. Указанная связывающая молекула по настоящему изобретению предпочтительно не зависит от эпитопа субъединицы НА 1 белка НА для связывания с указанным белком НА. Известное антитело мыши, описанное в данной области (С 179), которое связывается с тем же эпитопом в домене НА 2, зависит также от связывания с эпитопом в домене НА 1 белка НА. Такое условие является неблагоприятным, так как создает возможность для ускользания мутантов, которые не могут быть больше узнаны антителом. Кроме того, ряд антител по настоящему изобретению (таких как CR6307 и CR6323) не зависит от конформационных эпитопов и узнает эпитоп НА 2 даже в уменьшенной форме (при использовании вестерн-блоттинга). Такие антитела обладают преимуществом по сравнению с антителами, известными в данной области, так как, если изменение конформации вызвано белком НА вследствие мутации в другой части белка, такое изменение конформации скорее всего не воспрепятствует связыванию антител по настоящему изобретению с эпитопом НА 2, в то время как антитела, зависящие от конформации, могут утратить способность связываться при возникновении таких мутаций. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающая молекула по настоящему изобретению также обладает нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа,включающего НА подтипа H1, и указанная связывающая молекула предпочтительно обладает нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа, включающего НА подтипа Н 2, Н 6 и/или Н 9. В настоящем описании изобретения показано, что связывающие молекулы по настоящему изобретению взаимодействуют с эпитопом, присутствующим в эпитопах НА 2, имеющихся в подтипах Н 5, H1, H2, Н 6 и Н 9, а также показано, что связывающие молекулы по настоящему изобретению перекрестно нейтрализуют подтипы вируса гриппа благодаря наличию данного эпитопа. Можно сделать вывод о том, что связывающие молекулы по настоящему изобретению, которые зависят от связывания с определенной частью домена НА 2 (а не от другого подверженного мутациям эпитопа в НА 1) могут перекрестно нейтрализовать подтипы вируса гриппа, так как указанные молекулы, по-видимому, не зависят от связывания с доменами в НА 1, которые могут быть существенно изменены в результате дрейфа антигенов. На основании настоящего описания изобретения квалифицированный специалист может теперь определить, дейст-8 017203 вительно ли антитело перекрестно взаимодействует с белками НА из разных подтипов и способно ли данное антитело нейтрализовать вирусы гриппа разных подтипов in vivo. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающая молекула по настоящему изобретению связывается с эпитопом в субъединицу НА 2, выбираемой из группы, включающей аминокислотную последовательность GVTNKVNSIIDK (SEQ ID NO: 368), GVTNKVNSIINK (SEQKITSKVNNIVDK (SEQ ID NO: 375). Как можно заключить из данных, приведенных в табл. 13, определенные связывающие молекулы по настоящему изобретению CR6261, CR6325 и CR6329 взаимодействуют с эпитопом GVTNKVNSIIDK (SEQ ID NO: 368), присутствующем в H5N1, и на указанные молекулы не влияет мутация в эпитопе TGLRN в НА 1, который влияет на связывание С 179. Кроме того, на некоторые связывающие молекулы, такие как CR6307 и CR6323, не влияет ускользающий мутант, как указано в публикации Okuno et al. (1993), образующийся в результате мутации валинглутаминовая кислота в положении 6 (выраженный последовательностью GVTNKENSIIDK (SEQ ID NO: 370. Указанный эпитоп является частью удлиненной альфа-спирали в области НА 2. Остатки в данном предполагаемом эпитопе, которые в соответствии с прогнозом являются наиболее растворимыми, обозначены жирным шрифтом и подчеркнуты, GVTNKENSIIDK (SEQ ID NO: 370). Указанные аминокислоты должны быть наиболее доступными для связывающей молекулы и, таким образом, могут образовывать наиболее важную область эпитопа. В соответствии с данной точкой зрения выделенные аминокислоты являются абсолютно консервативными по идентичности и положению во всех представленных последовательностях. Указанную информацию можно использовать для прогнозирования связывающих эпитопов в подтипах вируса гриппа, не содержащих вышеуказанные последовательности (т.е. штаммы Н 3, Н 7 и В). Предпочтительной связывающей молекулой по настоящему изобретению является связывающая молекула, выбираемая из группы, состоящей изCDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 311 и область CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 312. В предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающая молекула по настоящему изобретению предназначена для применения в качестве лекарственного средства и предпочтительно для диагностики, терапевтического и/или профилактического лечения гриппа. В одном варианте осуществления изобретения причиной возникновения указанного гриппа является вирус гриппа, вызывающий вспышку пандемии или способный вызвать вспышку пандемии (см. WO 2007/045674 и таблицы, приведенные в указанной публикации). Штамм вируса гриппа, вызывающий вспышку пандемии, при которой-9 017203 болезнь, обусловленную указанными штаммами, можно лечить связывающими молекулами по настоящему изобретению, выбирают из группы, включающей вирусы H1N1, H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, на основе Н 2 и H9N2. Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, содержащей связывающую молекулу по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый наполнитель. Другой вариант осуществления изобретения относится к применению связывающей молекулы по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для диагностики, профилактики и/или лечения гриппа. Такой грипп может возникнуть в небольшой группе населения, но может также распространиться по всему миру в виде сезонной эпидемии или, что еще хуже, в виде глобальной пандемии,при которой миллионы людей окажутся в группе риска. Настоящее изобретение относится к связывающим молекулам, способным нейтрализовать штаммы вируса гриппа, вызывающие такие сезонные эпидемии, а также возможную пандемию. Важно отметить, что с помощью связывающих молекул по настоящему изобретению можно прогнозировать необходимую защиту и лечение от многочисленных штаммов вируса гриппа, так как из вышеизложенного следует, что благодаря связыванию с эпитопом,который является общим для белков НА разных штаммов вируса гриппа, можно перекрестно нейтрализовать такие штаммы, используя связывающие молекулы по настоящему изобретению. Такое положение является весьма благоприятным, поскольку связывающие молекулы могут защитить млекопитающих при введении до или после инфицирования (как показано в примерах), а также в тех случаях, когда не ясно (на ранних стадиях заболевания), вызвано ли данное заболевание штаммом на основе H1, Н 2, Н 5,Н 6 или Н 9. Молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы для профилактики или лечения гриппа у работников здравоохранения, военных и всего населения. Связывающие молекулы по настоящему изобретению можно получать и хранить в больших количествах, так как они обеспечивают защиту от разных штаммов, вызывающих пандемию, что позволит подготовиться к возможной пандемии гриппа в будущем. В предпочтительном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы человека по настоящему изобретению отличаются тем, что указанные связывающие молекулы человека выбирают из группы, состоящей изa) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 4, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;b) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 7, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;c) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 10, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12;d) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 13, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15;e) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 19, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21;f) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 24, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:- 10017203 25, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26;g) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 30, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32;h) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 33, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35;i) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 36, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38;j) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 42, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44;k) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 7, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48;l) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 33, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 51;m) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 55, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57;n) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 262, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 263, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 264, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 265, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 266, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 267; о) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 268, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 269, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 270, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 271, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 272, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 273; р) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 274, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 275, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 276, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 277, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 278, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDq) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 280, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 281, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 282, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 283, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 284, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDr) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 286, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 287, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 288, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 289, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 290, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDs) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 292, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 293, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 294, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 295, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 296, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDt) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 304, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 305, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 306, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 307, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 308, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDu) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 310, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 311, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 312, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 313, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 314, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDv) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 238, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 239, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 240, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 241, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 242, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDw) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 244, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 245, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 246, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 247, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 248, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 249; х) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 250, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 251, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 252, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 253, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 254, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDy) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 256, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 257, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 258, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последова- 12017203 тельность SEQ ID NO: 259, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 260, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDz) связывающей молекулы человека, включающей область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 298, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 299, область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 300, область CDR1 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 301, область CDR2 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 302, и область CDR3 легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 303. В конкретном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению включают область CDR1 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQID NO: 1, область CDR2 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и область CDR3 тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. ОбластиCDR связывающих молекул по настоящему изобретению представлены в табл. 7. Области CDR определены в соответствии с описанием, приведенным в публикации Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins ofImmunological Interest. В одном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы могут включать две, три, четыре, пять или все шесть областей CDR, рассмотренных в настоящем описании изобретения. Связывающие молекулы по настоящему изобретению предпочтительно включают по меньшей мере две области CDR, рассмотренные в настоящем описании изобретения. В одном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению включают VH1-69 VH-области зародышевой линии клеток (см. публикацию Tomlinson I.M., WilliamsCentre for Protein Engineering (1997. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению включают тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи аминокислотной последовательности, выбираемой из группы, включающей SEQ ID NO: 59, SEQ IDNO: 345, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 361 и SEQ ID NO: 365. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению включают легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи аминокислотной последовательности,выбираемой из группы, включающей SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91,SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQID NO: 355, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 363 и SEQ ID NO: 367. Вариабельные области тяжелых и легких цепей связывающей молекулы по настоящему изобретению представлены в табл. 8. Другим объектом настоящего изобретения являются функциональные варианты связывающих молекул по настоящему изобретению. Молекулы считаются функциональными вариантами связывающей молекулы по настоящему изобретению, если указанные варианты могут конкурировать с исходными связывающими молекулами за специфическое связывание с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом. Другими словами, функциональные варианты по-прежнему могут связываться с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом. Функциональные варианты предпочтительно могут конкурировать за специфическое связывание по меньшей мере с двумя (или более) разными штаммами вируса гриппа H5N1 или его фрагментами, которые специфически связываются исходными связывающими молекулами. Кроме того,молекулы считаются функциональными вариантами связывающей молекулы по настоящему изобретению, если они обладают нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа H5N1, предпочтительно в отношении по меньшей мере двух (или более) штаммов вируса гриппа H5N1, которые могут быть нейтрализованы исходной связывающей молекулой. Функциональные варианты включают, не ограничиваясь ими, производные, которые, по существу, аналогичны первичной структуре последовательности, но содержат, например, химические и/или биохимические модификации in vitro или in vivo, отсутствующие в исходной связывающей молекуле. Такие модификации включают, в частности, ацетилирование, ацилирование, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, перекрестное связывание, образование дисульфидной связи, гликозилирование, гидроксилирование, метилирование, окисление, пегилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование и тому подобные. Альтернативно, функциональные варианты могут быть связывающими молекулами по настоящему изобретению, включающими аминокислотную последовательность, содержащую замены, инсерции, делеции или их комбинации одной или нескольких аминокислот по сравнению с аминокислотными последовательностями исходных связывающих молекул. Кроме того, функциональные варианты могут включать усечения аминокислотной последовательности у одного или обоих амино- или карбоксиконцов.- 13017203 Функциональные варианты по настоящему изобретению могут обладать одинаковым или разным, более высоким или более низким сродством связывания по сравнению с исходной связывающей молекулой, но по-прежнему способны связываться с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом. Например, функциональные варианты по настоящему изобретению могут обладать более высоким или более низким сродством связывания с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом по сравнению с исходными связывающими молекулами. Аминокислотные последовательности вариабельных областей, включающих, но не ограничиваясь ими, рамки считывания, гипервариабельные участки, в частности области CDR3, предпочтительно являются модифицированными. Вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи обычно включают три гипервариабельных участка, содержащих три CDR, и более консервативные области, так называемые рамки считывания (FR). Гипервариабельные участки содержат аминокислотные остатки изCDR и аминокислотные остатки из гипервариабельных петель. Функциональные варианты, входящие в объем настоящего изобретения, по меньшей мере примерно на 50-99%, предпочтительно по меньшей мере примерно на 60-99%, более предпочтительно по меньшей мере примерно на 70-99%, еще предпочтительнее по меньшей мере примерно на 80-99%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно на 90-99%, по меньшей мере примерно на 95-99% и, в частности, по меньше мере на 97-99% гомологичны аминокислотным последовательностям исходных связывающих молекул по настоящему изобретению. Для выполнения оптимального сравнительного анализа аминокислотных последовательностей и определения подобных или идентичных аминокислотных остатков могут быть использованы компьютерные алгоритмы, такие как Gap или Bestfit, известные специалисту в данной области. Функциональные варианты могут быть получены в результате изменения исходных связывающих молекул или их частей общими методами молекулярной биологии, известными в данной области, которые включают, не ограничиваясь ими, подверженные ошибкам методы ПЦР, сайт-направленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов, сайт-направленный мутагенез и перестановку тяжелых и/или легких цепей. В одном варианте осуществления изобретения функциональные варианты по настоящему изобретению обладают нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа H5N1. Указанная нейтрализующая активность может быть аналогична, выше или ниже по сравнению с исходными связывающими молекулами. Поэтому в определение термина "связывающая молекула (человека)" входят также функциональные варианты связывающей молекулы (человека). Другим объектом настоящего изобретению являются иммуноконъюгаты, т.е. молекулы, включающие по меньшей мере одну связывающую молекулу по настоящему изобретению и по меньшей мере одну метку, например обнаруживаемую часть/агент. В объем настоящего изобретения входят также смеси иммуноконъюгатов по настоящему изобретению или смеси по меньшей мере одного иммуноконъюгата по настоящему изобретению и другой молекулы, такой как лекарственное средство, другая связывающая молекула или иммуноконъюгат. В другом варианте осуществления изобретения иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут включать несколько меток. Указанные метки могут быть одинаковыми или разными и могут быть нековалентно связаны/конъюгированы со связывающими молекулами. Метки могут быть также связаны/конъюгированы непосредственно со связывающими молекулами человека путем ковалентного связывания. Альтернативно, метки могут быть связаны/конъюгированы со связывающими молекулами при помощи одного или нескольких связующих соединений. Квалифицированному специалисту должны быть хорошо известны методы конъюгирования меток со связывающими молекулами. Метки иммуноконъюгатов по настоящему изобретению могут представлять собой лекарственные средства, но могут также быть обнаруживаемыми частями/агентами. Метки, приемлемые для применения в терапии и/или профилактике, могут быть токсинами или их функциональными частями, антибиотиками, ферментами, другими связывающими молекулами, усиливающими фагоцитоз или иммунную стимуляцию. Иммуноконъюгаты, включающие обнаруживаемый агент, могут быть использованы в диагностике, например для определения инфицирования субъекта штаммами вируса гриппа H5N1 или контроля за развитием или прогрессированием гриппа, обусловленного вирусом гриппа H5N1, в виде части процедуры клинического исследования, например для определения эффективности назначенной схемы лечения. Однако иммуноконъюгаты могут быть также использованы для обнаружения других вирусов гриппа, для аналитических и/или диагностических целей. Обнаруживаемые части/агенты включают, не ограничиваясь ими, ферменты, искусственно введенные группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, биолюминесцентные вещества, радиоактивные вещества, металлы, излучающие позитроны, и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов. Метки, используемые для мечения связывающих молекул с целью обнаружения, анализа и/или диагностики, зависят от конкретных методов обнаружения/анализа/диагностики и/или от методов, используемых для иммуногистохимического окрашивания образцов (ткани), проточной цитометрии, цитометрического обнаружения сканирующим лазером,флуоресцентных иммуноанализов, твердофазных иммуноферментных анализов (ELISA), радиоиммуноанализов (RIA), биоанализов (например, анализов фатоцитоза), вестерн-блоттинга и т.д. Приемлемые метки, используемые для обнаружения/анализа/диагностики, и/или методы их применения, известные в данной области, находятся в компетенции квалифицированного специалиста. Кроме того, связывающие молекулы человека или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению- 14017203 могут быть также присоединены к твердым носителям, которые особенно полезны при выполнении иммуноанализов in vitro или очистки вируса гриппа H5N1 или его фрагмента. Такие твердые носители могут быть пористыми или непористыми, плоскими или неплоскими. Связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть гибридизированы с последовательностями-маркерами, такими как пептид, для облегчения очистки. Такие примеры включают, не ограничиваясь ими, гексагистидиновую метку, гемагглютининовую (НА) метку, myc-метку или флаговую метку. Альтернативно, антитело может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата антител. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть конъюгированы/связаны с одним или несколькими антигенами. Указанные антигены предпочтительно являются антигенами, узнаваемыми иммунной системой субъекта, в организм которого введен конъюгат связывающая молекула-антиген. Антигены могут быть одинаковыми, но могут также отличаться друг от друга. Методы конъюгирования, используемые для присоединения антигенов к связывающим молекулам,хорошо известны в данной области и включают, не ограничиваясь ими, применение перекрестносшивающих агентов. Связывающие молекулы по настоящему изобретению связываются с вирусом гриппа H5N1, и антигены, присоединенные к связывающим молекулам, инициируют мощную атаку Т-клеток на конъюгат, что в конечном счете вызывает разрушение вируса гриппа H5N1. Помимо получения иммуноконъюгатов химическими методами путем прямого или непрямого конъюгирования, например с помощью линкера, иммуноконъюгаты могут быть получены в виде слитых белков, содержащих связывающие молекулы по настоящему изобретению и соответствующую метку. Слитые белки могут быть получены методами, известными в данной области, такими как, например, методы рекомбинантных ДНК, используемые для создания молекул нуклеиновых кислот, включающих нуклеотидные последовательности, кодирующие связывающие молекулы, вместе с нуклеотидными последовательностями, кодирующими приемлемые метки и затем экспрессирующими молекулы нуклеиновых кислот. Другим объектом настоящего изобретения является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая,по меньшей мере, связывающую молекулу, функциональный вариант или иммуноконъюгат по настоящему изобретению. Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть использованы в качестве промежуточных веществ для клонирования, например, в процессе созревания аффинности, описанного выше. В предпочтительном варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот являются выделенными или очищенными. Специалисту должно быть понятно, что функциональные варианты указанных молекул нуклеиновых кислот также входят в объем настоящего изобретения. Функциональные варианты являются последовательностями нуклеиновых кислот, которые могут быть транслированы при помощи стандартного генетического кода с образованием аминокислотной последовательности, идентичной последовательности, транслированной из исходных молекул нуклеиновых кислот. Молекулы нуклеиновых кислот предпочтительно кодируют связывающие молекулы, включающие вышеописанные области CDR. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, включающие две, три, четыре, пять или даже все шесть областей CDR связывающих молекул по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, включающие тяжелую цепь, содержащую вышеуказанные последовательности вариабельной области тяжелой цепи. В другом варианте осуществления изобретения молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, включающие легкую цепь, содержащую вышеуказанные последовательности вариабельной области легкой цепи. Нуклеотидные последовательности связывающих молекул по настоящему изобретению приведены в разделе "Примеры" (см., например, табл. 6 и 8). Другим объектом настоящего изобретения являются векторы, т.е. конструкции нуклеиновых кислот, включающие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению. Векторы могут быть получены из плазмид, такие как F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti и т.д.; космид; фагов,таких как лямбда, лямбдоид, М 13, Mu, Р 1, Р 22, Q, Т-четный, Т-нечетный, Т 2, Т 4, Т 7 и т.д.; растительных вирусов. Векторы могут быть использованы для клонирования и/или экспрессии связывающих молекул по настоящему изобретению и даже в генотерапии. В объем настоящего изобретения входят также векторы, включающие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот по настоящему изобретению,функционально связанных с одной или несколькими регулирующими экспрессию молекулами нуклеиновых кислот. Выбор вектора зависит от методов рекомбинантных ДНК и используемого хозяина. Векторы могут быть введены в клетки-хозяева путем трансфекции фосфатом кальция, инфицирования вирусом, трансфекции, опосредованной DEAE-декстраном, трансфекции липофектамином или электропорации. Векторы могут реплицировать автономно или вместе с хромосомой, в которую они была интегрированы. Векторы предпочтительно содержат один или несколько селектируемых маркеров. Выбор маркеров может зависеть от выбранных клеток-хозяев, хотя данное условие не является критическим для настоящего изобретения, как должно быть хорошо известно специалистам в данной области. Указанные маркеры включают, не ограничиваясь ими, канамицин, неомицин, пуромицин, гигромицин, зеоцин, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV-TK), ген дигидрофолат-редуктазы мыши (dhfr). В объем- 15017203 настоящего изобретения входят также векторы, включающие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие молекулы человека по настоящему изобретению, функционально связанные с одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, кодирующих белки или пептиды,которые могут быть использованы для выделения связывающих молекул человека. Указанные белки или пептиды включают, не ограничиваясь ими, глутатион-S-трансферазу, мальтозасвязывающий белок, металлсвязывающий полигистидин, зеленый флуоресцентный белок, люциферазу и бета-галактозидазу. Хозяева, содержащие одну или несколько копий вышеуказанных векторов, являются дополнительным объектом настоящего изобретения. Хозяевами предпочтительно являются клетки-хозяева. Клеткихозяева включают, не ограничиваясь ими, клетки млекопитающих, растений, насекомых, грибов или бактерий. Бактериальные клетки включают, не ограничиваясь ими, клетки грамположительных бактерий или грамотрицательных бактерий, в частности несколько видов рода Escherichia, таких как E.coli и Pseudomonas. В группе клеток грибов предпочтительно используют дрожжевые клетки. Экспрессия в дрожжах может быть достигнута при использовании таких штаммов дрожжей как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Hansenula polymorpha. Кроме того, в качестве клеток-хозяев могут быть использованы клетки насекомых, такие как клетки дрозофилы и Sf9. Клетками-хозяевами могут быть также растительные клетки, в частности клетки культурных растений, таких как лесные растения, или клетки растений,предназначенных для получения пищевых продуктов и сырья, таких как злаки или медицинские растения, клетки декоративных растений или клетки цветочных культур. Трансформированные (трансгенные) растения или растительные клетки получают известными методами, например путем переноса генов, опосредованного агробактериями, трансформации листовых дисков, трансформации протопласта в результате переноса ДНК, индуцированного полиэтиленгликолем,электропорации, обработки ультразвуком, микроинъекции или ударного переноса генов. Кроме того,приемлемой экспрессирующей системой может быть система на основе бакуловируса. Экспрессирующие системы с использованием клеток млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка(СНО), клетки COS, клетки BHK, клетки NSO или клетки меланомы Боуса, являются предпочтительными в настоящем изобретении. Клетки млекопитающих позволяют получить экспрессированные белки с посттрансляционными модификациями, которые больше всего подобны природным молекулам млекопитающих. Так как настоящее изобретение относится к молекулам, которые могут быть введены человеку,особенно предпочтительной является экспрессирующая система, полностью принадлежащая человеку. Поэтому еще предпочтительнее клетки-хозяева являются клетками человека. Примерами клеток человека являются, в частности, клетки HeLa, 911, АТ 1080, А 549, 293 и HEK293 Т. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения продуцирующие клетки человека включают, по меньшей мере, функциональную часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей область Е 1 аденовируса в экспрессируемом формате. В более предпочтительных вариантах осуществления изобретения указанные клетки-хозяева получают из сетчатки глаза человека и иммортализуют нуклеиновыми кислотами, включающими последовательности Е 1 аденовируса, в частности, клетки 911 или линию клеток, депонированную в европейскую коллекцию культур клеток (ЕСАСС), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain, 26 февраля 1996 г. под номером 96022940 и продаваемую под товарным знаком PER.C6 (PER.C6 является зарегистрированным товарным знаком компании Crucell Holland B.V.). "Клетки PER.C6", предназначенные для указанных целей, являются клетками, депонированными под номером 96022940, или клетками-предшественниками, пассажами в обратном или прямом направлении, потомством клетокпредшественников депонированных клеток, а также производными любых вышеуказанных клеток. Рекомбинантные белки в клетках-хозяевах могут быть получены методами, хорошо известными в данной области. Использование клеток, продаваемых под товарным знаком PER.C6, в качестве основы для получения представляющих интерес белков описано в публикации WO 00/63403, которая полностью включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Дополнительным объектом настоящего изобретения является способ получения связывающей молекулы по настоящему изобретению. Данный способ включает стадии: а) культивирования хозяина по настоящему изобретению в условиях, обеспечивающих экспрессию связывающей молекулы, и b) необязательно выделения экспрессированной связывающей молекулы. Экспрессированные связывающие молекулы могут быть выделены из бесклеточного экстракта, но указанные молекулы предпочтительно выделяют из культуральной среды. Вышеуказанный способ получения может быть также использован для создания функциональных вариантов связывающих молекул и/или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению. Методы выделения белков, таких как связывающие молекулы, из бесклеточных экстрактов или культуральной среды хорошо известны специалисту в данной области. Связывающие молекулы,функциональные варианты и/или иммуноконъюгаты, полученные вышеописанным способом, также входят в объем настоящего изобретения. Альтернативно, помимо экспрессии в хозяевах, таких как клетки-хозяева, связывающие молекулы и иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут быть синтезированы в стандартных синтезаторах пептидов или в бесклеточных системах трансляции с использованием нуклеиновой кислоты РНК, выделенной из молекул ДНК по настоящему изобретению. Связывающие молекулы и иммуноконъюгаты,- 16017203 полученные вышеописанными методами синтеза или в бесклеточных системах трансляции, также входят в объем настоящего изобретения. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть также продуцированы в организме трансгенных животных, отличных от человека, таких как кролики, козы или коровы, и секретированы, например, в молоко. В другом альтернативном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы по настоящему изобретению, предпочтительно связывающие молекулы человека, специфически связывающиеся с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом, могут быть получены в организме трансгенных млекопитающих, отличных от человека, таких как, например, трансгенные мыши или кролики, экспрессирующие гены иммуноглобулина человека. Трансгенные млекопитающие, отличные от человека, предпочтительно имеют геном, включающей трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, кодирующие все или части связывающих молекул человека по настоящему изобретению. Трансгенные млекопитающие, отличные от человека, могут быть иммунизированы очищенным или обогащенным препаратом вируса гриппа H5N1 или его фрагмента. Методы иммунизации млекопитающих, отличных от человека, хорошо известны в данной области. См. публикации Using Antibodies: A Laboratory Manual,Edited by: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York и Current Protocols in Immunology, Edited by: J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, W.Strober (2001), John WileySons Inc., New York, которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Методы иммунизации часто включают множественные иммунизации с использованием или без использования адъювантов, таких как полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда, но могут также включать иммунизации голой ДНК. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы человека продуцированы В-клетками, плазматическими клетками и/или клетками памяти, полученными у трансгенных животных. В другом варианте осуществления изобретения связывающие молекулы человека продуцированы гибридомами, которые получают в результате гибридизации В-клеток, полученных у вышеописанных трансгенных млекопитающих, отличных от человека, с иммортализованными клетками. В-клетки, плазматические клетки и гибридомы, полученные у вышеописанных трансгенных млекопитающих, отличных от человека, и связывающие молекулы человека, полученные у вышеописанных трансгенных млекопитающих, отличных от человека, В-клетки, плазматические клетки и/или клетки памяти и гибридомы также входят в объем настоящего изобретения. Еще одним объектом настоящего изобретения является способ идентификации связывающей молекулы, такой как связывающая молекула человека, например, моноклональное антитело человека или его фрагмент, специфически связывающиеся с вирусом гриппа H5N1, или молекулы нуклеиновой кислоты,кодирующие такие связывающие молекулы, который включает стадии: (а) контактирования коллекции связывающих молекул на поверхности реплицируемых генетических упаковок с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом в условиях, обеспечивающих связывание; (b) по меньшей мере, однократный отбор реплицируемой генетической упаковки, связывающейся с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом; (с) разделения и отделения реплицируемой генетической упаковки, связывающейся с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом, от реплицируемых генетических упаковок, которые не связываются с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом. Реплицируемая генетическая упаковка по настоящему изобретению может быть прокариотической или эукариотической и включает клетки, споры, дрожжи, бактерии, вирусы, (бактерио)фаг, рибосомы и полисомы. Предпочтительной реплицируемой генетической упаковкой является фаг. Связывающие молекулы, такие как, например, одноцепочечные Fv-фрагменты, отображены на реплицируемой генетической упаковке, то есть присоединены к группе или молекуле, локализованной на наружной поверхности реплицируемой генетической упаковки. Реплицируемая генетическая упаковка является подвергаемой скринингу единицей, включающей исследуемую связывающую молекулу, связанную с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную связывающую молекулу. Молекула нуклеиновой кислоты должна быть реплицирована in vivo (например, в виде вектора) или in vitro(например, методом ПЦР, транскрипции и трансляции). Репликация in vivo может быть автономной (в случае клетки), с помощью факторов хозяина (в случае вируса) или с помощью хозяина и вируса-хелпера(в случае фагомида). Реплицируемые генетические упаковки, отображающие коллекцию связывающих молекул, получают путем введения молекул нуклеиновых кислот, кодирующих отображаемые экзогенные связывающие молекулы, в геномы реплицируемых генетических упаковок с образованием слитых белков с эндогенными белками, которые обычно экспрессированы на наружной поверхности реплицируемых генетических упаковок. Экспрессия слитых белков, перенос к наружной поверхности и сборка позволяют получить отображение экзогенных связывающих молекул на наружной поверхности реплицируемых генетических упаковок. Стадии отбора при осуществлении вышеуказанного способа по настоящему изобретению могут быть выполнены с использованием живых, еще инфективных или инактивированных вирусов гриппаH5N1. Вирус гриппа H5N1 может быть инактивирован методами инактивации вирусов, хорошо известными специалисту в данной области, такими как обработка формалином, -пропиолактоном (BPL), мертиолатом и/или ультрафиолетовым светом. Методы испытания с использованием живого, инфективного и/или жизнеспособного, частично или полностью инактивированного вируса гриппа H5N1 хорошо из- 17017203 вестны специалисту в данной области. Вирус гриппа H5N1, используемый при осуществлении вышеуказанного способа, может быть не выделен, например может присутствовать в сыворотке и/или крови инфицированного субъекта. Используемый вирус гриппа H5N1 может быть также выделен из культуры клеток в приемлемой среде. В одном варианте осуществления изобретения вирус гриппа H5N1 находится в суспензии при контактировании с реплицируемыми геномными упаковками. Альтернативно, указанные вирусы могут быть также связаны с носителем в процессе контактирования. В одном варианте осуществления изобретения первый и последующий отборы могут быть произведены в отношении штамма вируса гриппа H5N1 одного клада. Альтернативно первый и последующий циклы отбора могут быть произведены в отношении штаммов вируса гриппа H5N1 разных кладов (например, первый отбор выполняют в отношении штаммов клада 1 и второй отбор выполняют в отношении штаммов клада 2 или 3). Альтернативно, стадии отбора могут быть выполнены в присутствии фрагмента вируса гриппаH5N1, такого как, например, препараты клеточных мембран, рекомбинантные белки или полипептидыH5N1, слитые белки, включающие белки или полипептиды H5N1, клетки, экспрессирующие рекомбинантные белки или полипептиды H5N1, и тому подобные. Внеклеточно экспонированные части указанных белков или полипептидов также могут быть использованы в качестве отбираемого материала. Фрагменты вируса гриппа H5N1 могут быть иммобилизованы на приемлемом материале перед использованием или могут быть использованы в суспензии. В одном варианте осуществления изобретения отбор может быть произведен в отношении разных фрагментов вируса гриппа H5N1 или фрагментов разных штаммов вируса гриппа H5N1. Специалисту в данной области должны быть известны методы обнаружения приемлемых отбираемых комбинаций. Отбор может быть произведен методами ELISA или FACS. Еще одним объектом настоящего изобретения является способ получения связывающей молекулы,специфически связывающейся со штаммом вируса гриппа H5N1 или его фрагментом, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такую связывающую молекулу, который включает стадии: а) выполнения вышеописанного метода идентификации связывающих молекул и b) отделения от выделенной реплицируемой генетической упаковки связывающей молекулы и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную связывающую молекулу. Коллекция связывающих молекул на поверхности реплицируемых генетических упаковок может быть коллекцией scFv или Fab. При обнаружении или идентификации нового scFv или Fab вышеуказанным методом идентификации связывающих молекул или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих связывающие молекулы, ДНК, кодирующая scFv или Fab, может быть выделена из бактерий или фагов и объединена при помощи стандартных методов молекулярной биологии с образованием конструкций, кодирующих scFab, двухвалентные scFv, Fab или полные иммуноглобулины человека требуемой специфичности (например, IgG, IgA или IgM). Указанные конструкции могут быть трансфецированы в приемлемые линии клеток, в результате чего могут быть получены полные моноклональные антитела человека (см. публикации Huls et al., 1999; Boel et al., 2000). Как было отмечено выше, предпочтительной реплицируемой генетической упаковкой является фаг. Методы отображения на фаге, используемые для идентификации и получения связывающих молекул(человека), например моноклональных антител (человека), в настоящее время являются хорошо разработанными методами, известными специалисту в данной области. Указанные методы описаны, например, в патенте США 5696108; Burton and Barbas, 1994; de Kruif et al., 1995b и Phage Display: A LaboratoryManual. Edited by: C.F. Barbas, D.R. Burton, J.K. Scott and G.J. Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Все указанные публикации полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки. Для создания библиотек отображения на фаге коллекции генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей моноклонального антитела человека экспрессируют на поверхности бактериофага, предпочтительно нитевидного бактериофага, частиц, например, в форме одноцепочечных Fv (scFv) или Fab (см. публикацию de Kruif et al., 1995b). Большие библиотеки фагов, экспрессирующих фрагменты антитела, обычно содержат более 1,0109 специфичностей антител и могут быть собраны из V-областей иммуноглобулина, экспрессированных в В-лимфоцитах иммунизированных или неиммунизированных субъектов. В конкретном варианте осуществления изобретения фаговую библиотеку связывающих молекул, предпочтительно фаговую библиотеку scFv, создают из РНК, выделенной из клеток, полученных у субъекта, вакцинированного против вируса гриппа (например, H5N1), недавно вакцинированного против неродственного патогенного организма, недавно переболевшего гриппом, вызванным вирусом гриппа H5N1, или у здорового субъекта. РНК может быть выделена из костного мозга или периферической крови, предпочтительно из лимфоцитов периферической крови, выделенных В-клеток или даже из субпопуляций В-клеток, таких как В-клетки памяти. Субъект может быть животным, предпочтительно человеком. В предпочтительном варианте осуществления изобретения библиотеки могут быть собраны из V-областей иммуноглобулина, экспрессированных В-клетками памятиIgM. Альтернативно, библиотеки отображения на фаге могут быть созданы из вариабельных областей иммуноглобулина, которые были частично собраны in vitro для введения дополнительного разнообразия антител в библиотеку (полусинтетические библиотеки). Например, собранные in vitro вариабельные области содержат фрагменты синтезированных, рандомизированных или частично рандомизированных- 18017203 ДНК в указанных областях молекул, необходимых для специфичности антител, например в областяхCDR. Фаговые антитела, специфичные к вирусу гриппа H5N1, можно выбрать из библиотеки путем введения вируса или его фрагмента в фаговую библиотеку для связывания фагов, экспрессирующих фрагменты антитела, специфичные к данному вирусу или его фрагменту. Несвязанные фаги удаляют промыванием и связанные фаги элюируют для инфицирования бактерий E.coli и последующего размножения. Для достаточного обогащения фагов, специфически связывающихся с вирусом или его фрагментом,обычно необходимо несколько циклов отбора и размножения. При желании, прежде чем ввести в фаговую библиотеку вирус или его фрагмент, указанную фаговую библиотеку можно сначала очистить, подвергая фаговую библиотеку воздействию материала, не являющегося мишенью, такого как вирусы или их фрагменты другого штамма, т.е. вирусы гриппа, отличные от вируса H5N1. Указанные очищающие вирусы или их фрагменты могут быть связаны с твердой фазой или могут находиться в суспензии. Фаги могут быть также отобраны путем связывания со сложными антигенами, такими как сложные смеси белков или (поли)пептидов H5N1, необязательно содержащие другой материал. Клетки-хозяева, экспрессирующие один или несколько белков или (поли)пептидов вируса гриппа H5N1, также могут быть использованы для отбора. Метод отображения на фаге с использованием указанных клеток-хозяев может быть расширен и усовершенствован в результате удаления неродственных связывающих веществ в процессе скрининга путем добавления избытка клеток-хозяев, не содержащих молекулы-мишени или содержащих молекулы, не являющиеся мишенями, которые подобны, но не идентичны мишени, что позволяет значительно повысить вероятность обнаружения требуемых связывающих молекул. Очистка может быть произведена до, во время или после скрининга вирусом или его фрагментами. Указанный метод получил название метода MABSTRACT (MABSTRACT является зарегистрированным товарным знаком компании Crucell Holland B.V., см. также патент США 6265150, который включен в настоящее описание изобретения в качестве ссылки). Другим объектом настоящего изобретения является способ получения связывающей молекулы, потенциально обладающей нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа H5N1, предпочтительно, по меньшей мере, в отношении штаммов вируса гриппа H5N1 клада 1, клада 2 и клада 3, который включает стадии: (а) выполнения способа получения связывающей молекулы, специфически связывающейся с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей описанную выше связывающую молекулу, и (b) подтверждения того, что выделенная связывающая молекула обладает нейтрализующей активностью в отношении данного вируса, предпочтительно, по крайней мере, в отношении штаммов вируса гриппа H5N1 клада 1 и клада 2. Анализы, подтверждающие наличие у связывающей молекулы нейтрализующей активности, хорошо известны в данной области (см.WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva: World Health Organisation, 2005 version 2002.5). Другим объектом настоящего изобретения является связывающая молекула, обладающая нейтрализующей активностью, получаемая описанными выше способами. Еще одним объектом настоящего изобретения являются композиции, содержащие, по меньшей мере, связывающую молекулу, предпочтительно моноклональное антитело человека по настоящему изобретению, по меньшей мере, ее функциональный вариант, по меньшей мере, иммуноконъюгат по настоящему изобретению или их комбинацию. Кроме того, указанные композиции могут содержать стабилизирующие молекулы, такие как альбумин, или полиэтиленгликоль, или соли. Предпочтительно используемыми солями являются соли, которые сохраняют требуемую биологическую активность связывающих молекул и не вызывают каких-либо нежелательных токсикологических эффектов. При необходимости связывающие молекулы человека по настоящему изобретению могут быть покрыты определенным веществом или нанесены на определенное вещество для защиты от воздействия кислот или других естественных или искусственных условий, которые могут инактивировать связывающие молекулы. Еще одним объектом настоящего изобретения являются композиции, содержащие, по меньшей мере, молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Указанные композиции могут включать водные растворы, такие как водные растворы, содержащие соли (например NaCl или вышеописанные соли), детергенты (например, додецилсульфат натрия (SDS и/или другие приемлемые компоненты. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим, по меньшей мере, связывающую молекулу, такую как моноклональное антитело человека по настоящему изобретению (ее функциональный фрагмент или вариант), по меньшей мере, иммуноконъюгат по настоящему изобретению, по меньшей мере, композицию по настоящему изобретению или их комбинации. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению далее включает по меньшей мере один фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемые наполнители хорошо известны специалисту в данной области. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может далее включать по меньшей мере одно другое лекарственное средство. Приемлемые средства также хорошо известны специалисту в данной области. В одном варианте осуществления изобретения фармацевтические композиции могут включать две или более связывающие молекулы, обладающие нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа H5N1. В одном варианте осуществления изобретения связывающие молекулы обладают синерги- 19017203 ческой нейтрализующей активностью при использовании в комбинации. Другими словами, указанные композиции включают по меньшей мере две связывающие молекулы, обладающие нейтрализующей активностью, отличаясь тем, что указанные связывающие молекулы оказывают синергическое действие,направленное на нейтрализацию вируса гриппа H5N1. В используемом здесь значении термин "синергический" означает, что объединенное действие связывающих молекул, используемых в комбинации, является более сильным, чем их аддитивные действия при отдельном применении. Синергически действующие связывающие молекулы могут связываться с разными структурами в одинаковых или разных фрагментах вируса гриппа H5N1. Синергическое действие вычисляют при помощи комбинационного индекса. Понятие комбинационного индекса (CI) было введено Чоу и Талалаем (1984). Композиции могут также включать одну связывающую молекулу, обладающую нейтрализующей активностью, и одну связывающую молекулу, специфически связывающуюся с H5N1, которая не обладает нейтрализующей активностью. Не обладающие и обладающие нейтрализующей активностью молекулы, специфически связывающиеся с H5N1, могут также синергически нейтрализовать вирус гриппа H5N1. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может далее включать по меньшей мере одно другое терапевтическое, профилактическое и/или диагностическое средство. Указанная фармацевтическая композиция предпочтительно включает по меньшей мере одно другое профилактическое и/или терапевтическое средство. Указанные другие терапевтические и/или профилактические средства предпочтительно являются средствами, способными предотвращать и/или лечить грипп, вызываемый вирусом гриппа H5N1, и/или состояние, возникшее после такого гриппа. Терапевтические и/или профилактические средства включают, не ограничиваясь ими, противовирусные средства. Такие средства могут быть связывающими молекулами, мелкими молекулами, органическими или неорганическими соединениями, ферментами, полинуклеотидными последовательностями, противовирусными пептидами и т.д. Другими средствами, которые в настоящее время используют для лечения субъектов, инфицированных вирусом гриппа H5N1, являются ингибиторы М 2 (например, амантидин, римантадин) и/или ингибиторы нейраминидазы (например, занамивир, озелтамивир). Указанные средства могут быть использованы в комбинации со связывающими молекулами по настоящему изобретению. Средства, способные предотвращать и/или лечить грипп, вызываемый вирусом гриппа H5N1, и/или состояние, возникшее после такого гриппа, которые находятся на экспериментальной стадии, также могут быть использованы в качестве других терапевтических и/или профилактических средств, пригодных для использования в настоящем изобретении. Связывающие молекулы или фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть испытаны на приемлемых животных моделях до их введения человеку. Такие животные модели включают, не ограничиваясь ими, мышей, хорьков и обезьян. Фармацевтические композиции должны быть стерильными и устойчивыми в условиях изготовления и хранения. Связывающие молекулы, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот или композиции по настоящему изобретению могут быть получены в виде порошка, предназначенного для восстановления в соответствующем фармацевтически приемлемом наполнителе, до или во время введения. В случае стерильных порошков, используемых для получения стерильных инъекционных растворов, предпочтительными методами получения являются вакуумная сушка и сушка вымораживанием (лиофилизация), которые позволяют получить порошок активного ингредиента вместе с любым дополнительным требуемым ингредиентом из ранее стерилизованного фильтрованием раствора. Альтернативно связывающие молекулы, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот или композиции по настоящему изобретению могут находиться в растворе, при этом соответствующий фармацевтически приемлемый наполнитель может быть добавлен и/или смешан до или во время введения для получения стандартной дозированной инъецируемой формы. Фармацевтически приемлемый наполнитель, используемый при осуществлении настоящего изобретения, предпочтительно может быть пригоден для достижения высокой концентрации лекарственного средства, для сохранения требуемой текучести и, при необходимости, для замедления абсорбции. На выбор оптимального способа введения фармацевтических композиций влияют несколько факторов, которые включают физико-химические свойства активных молекул в композициях, неотложность клинической ситуации и соответствие концентраций активных молекул в плазме требуемому терапевтическому действию. Например, при необходимости, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть получены вместе с носителями, защищающими их от быстрого высвобождения, например, в виде композиций с пролонгированным действием, которые включают имплантаты, чрескожные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Для указанной цели могут быть использованы поддающиеся биологическому разложению, биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимер молочной кислоты. Кроме того, может быть необходимо нанести на связывающие молекулы покрытие или вводить связывающие молекулы вместе с веществом или соединением, предотвращающим инактивацию связывающих молекул человека. Например, связывающие молекулы могут быть введены субъекту в приемлемом носителе, таком как липосомы или разбавитель. Способы введения можно разделить на две основные категории: пероральные и парентеральные спо- 20017203 собы введения. Предпочтительным способом введения является внутривенное введение или ингаляция. Лекарственные формы для перорального введения могут быть получены в виде таблеток, пастилок,лепешек, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий, твердых капсул, мягких желатиновых капсул, сиропов или эликсиров, пилюль, драже, жидкостей, гелей или взвесей. Указанные композиции могут содержать фармацевтически приемлемые наполнители, включающие,не ограничиваясь ими, инертные разбавители, гранулирующие и дезинтегрирующие вещества, связывающие вещества, смазывающие вещества, консерванты, красители, ароматизаторы или подсластители,растительные или минеральные масла, смачивающие вещества и загустители. Могут быть также получены фармацевтические композиции по настоящему изобретению, предназначенные для парентерального введения. Композиции для парентерального введения могут иметь форму водных или неводных изотонических стерильных нетоксичных растворов или суспензий, предназначенных для инъекций или вливаний. Растворы или суспензии могут включать агенты, нетоксичные для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, такие как 1,3-бутандиол, раствор Рингера, раствор Хэнкса, изотонический раствор хлорида натрия, масла, жирные кислоты, местнодействующие анестезирующие средства, консерванты, буферы, вещества, повышающие вязкость или растворимость, водорастворимые антиоксиданты, растворимые в масле антиоксиданты и хелатообразователи металлов. Другим объектом настоящего изобретения является применение связывающих молекул, таких как моноклональные антитела человека (их функциональные фрагменты и варианты), иммуноконъюгаты,композиции или фармацевтические композиции по настоящему изобретению, в качестве лекарственного средства. Таким образом, в объем настоящего изобретения входит также способ лечения и/или профилактики гриппа, вызываемого вирусом гриппа H5N1, при помощи связывающих молекул, иммуноконъюгатов, композиций или фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Вышеуказанные молекулы могут быть использованы для диагностики, профилактики, лечения гриппа, вызываемого вирусом гриппа H5N1, или для комбинации указанных целей. Указанные молекулы пригодны для лечения субъектов, страдающих гриппом, вызываемым вирусом гриппа H5N1, которые ранее не подвергались никакому лечению, и субъектов, которые ранее подвергались лечению или в настоящее время проходят курс лечения от гриппа, вызываемого вирусом гриппа H5N1. Связывающие молекулы могут быть использованы для введения таким субъектам, как работники здравоохранения, родственники инфицированных субъектов, рабочие птицеферм и т.д. Вышеуказанные молекулы или композиции могут быть использованы вместе с другими молекулами, пригодными для диагностики, профилактики и/или лечения. Связывающие молекулы могут быть использованы in vitro, ex vivo или in vivo. Например, связывающие молекулы, такие как моноклональные антитела человека (или их функциональные варианты), иммуноконъюгаты, композиции или фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить вместе с вакциной против вируса гриппа H5N1 (при наличии такой вакцины). Альтернативно, указанную вакцину можно также вводить до или после введения молекул по настоящему изобретению. Вместо вакцины вместе со связывающими молекулами по настоящему изобретению могут быть использованы противовирусные средства. Приемлемые противовирусные средства были указаны выше. Молекулы по настоящему изобретению обычно входят в состав композиций и фармацевтических композиций по настоящему изобретению в терапевтически или диагностически эффективном количестве. Альтернативно, указанные молекулы могут быть получены и введены отдельно. Например, другие молекулы, такие как противовирусные средства, могут быть введены системно, в то время как связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть введены внутривенно. Схемы введения лекарственного средства могут быть определены с возможностью достижения оптимальной требуемой реакции (например, терапевтической реакции). Приемлемая доза может составлять, например, 0,1-100 мг/кг массы тела, предпочтительно 0,5-15 мг/кг массы тела. Кроме того, например, можно ввести одну ударную дозу, несколько разделенных доз, повторяемых через определенные интервалы времени, или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в зависимости от сложившейся терапевтической ситуации. Молекулы и композиции по настоящему изобретению предпочтительно являются стерильными. Методы стерилизации указанных молекул и композиций хорошо известны в данной области. Другие молекулы, используемые для диагностики, профилактики и/или лечения, могут быть введены в соответствии со схемой введения, предложенной для связывающих молекул по настоящему изобретению. Другие молекулы, вводимые отдельно, могут быть введены субъекту до(например, за 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60 мин, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ч, 2, 3, 4, 5, 7 дней, 2, 4 или 6 недель), одновременно или после (например, через 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60 мин, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24 ч, 2, 3, 4, 5, 7 дней, 2, 4 или 6 недель) введения одной или нескольких связывающих молекул человека или фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Точную схему введения обычно определяют в процессе клинических испытаний с участием людей. Связывающие молекулы человека и фармацевтические композиции, содержащие связывающие молекулы человека, обычно используют и часто предпочтительно используют для введения людям в качестве терапевтических средств in vivo, так как иммунная реакция реципиента на введенное антитело часто оказывается менее выраженной, чем при введении моноклональной, химерной или гуманизированной- 21017203 связывающей молекулы мыши. Другим объектом настоящего изобретения является применение связывающих молекул, таких как нейтрализующие моноклональные антитела человека (их функциональные фрагменты и варианты), иммуноконъюгатов, молекул нуклеиновых кислот, композиций или фармацевтических композиций по настоящему изобретению, для получения лекарственного средства для диагностики, профилактики, лечения гриппа, вызываемого вирусом гриппа H5N1, или для комбинации указанных целей. В объем настоящего изобретения входят также наборы, включающие, по меньшей мере, связывающую молекулу, такую как нейтрализующее моноклональное антитело человека (его функциональные фрагменты и варианты), по меньшей мере, иммуноконъюгат, по меньшей мере, молекулу нуклеиновой кислоты, по меньшей мере, композицию, по меньшей мере, фармацевтическую композицию, по меньшей мере, вектор, по меньшей мере, хозяина по настоящему изобретению или их комбинацию. Вышеуказанные компоненты, входящие в наборы по настоящему изобретению, необязательно упакованы в соответствующие емкости и снабжены этикеткой с информацией о применении для диагностики, профилактики и/или лечения указанных заболеваний. Вышеуказанные компоненты могут храниться в емкостях для одной или нескольких доз в виде водного, предпочтительно стерильного раствора или в виде лиофилизованной, предпочтительно стерильной восстанавливаемой композиции. Указанные емкости могут быть изготовлены из разных материалов, таких как стекло или пластик, и могут обеспечивать стерильный доступ (например, указанная емкость может быть баллоном с раствором для внутривенного введения или флаконом с пробкой, проницаемой для иглы для подкожных инъекций). В комплект набора могут входить дополнительные емкости, содержащие фармацевтически приемлемый буфер. В набор могут далее входить другие вещества, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, которые включают другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, культуральную среду для одного или нескольких приемлемых хозяев и, возможно, даже по меньшей мере одно другое терапевтическое, профилактическое или диагностическое средство. К набору могут прилагаться инструкции, обычно вкладываемые в коммерческие упаковки терапевтических, профилактических или диагностических продуктов, которые содержат, например, информацию о показаниях, применении, дозировке, изготовлении, введении,противопоказаниях и/или предупреждения, относящиеся к применению таких терапевтических, профилактических или диагностических продуктов. Настоящее изобретение далее относится к способу обнаружения вируса гриппа H5N1 в образце, который включает стадии: (а) контактирования образца с диагностически эффективным количеством связывающей молекулы (ее функциональных фрагментов и вариантов) или иммуноконъюгата по настоящему изобретению и (b) выявления специфического связывания связывающей молекулы или иммуноконъюгата с молекулой образца. Образцом может быть биологический образец, включающий, не ограничиваясь ими, кровь, сыворотку, стул, мокроту, носоглоточные аспираты, бронхиальный лаваж, мочу, ткань или другой биологический материал, полученный у (потенциально) инфицированных субъектов, или небиологический образец, такой как вода, питье и т.д. (Потенциально) инфицированные субъекты, которыми могут быть люди, а также животные, предположительно являющиеся носителями вируса гриппаH5N1, могут быть исследованы на наличие вируса с помощью связывающих молекул человека или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению. Образец может быть сначала обработан методами, позволяющими сделать его более приемлемым для обнаружения вируса. Обработка образца, предположительно и/или действительно содержащего вирус, предполагает расщепление вируса на антигенные компоненты, такие как белки, (поли)пептиды или другие антигенные фрагменты. Связывающие молекулы человека или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению контактируют с образцом в условиях, делающих возможным образование иммунологического комплекса между связывающими молекулами человека и вирусом или его антигенными компонентами, которые могут присутствовать в образце. Образование иммунологического комплекса, свидетельствующего о присутствии вируса в образце, затем обнаруживают и измеряют приемлемыми средствами. Такие методы включают иммуноанализы гомогенного и гетерогенного связывания, такие как радиоиммуноанализы (RIA), ELISA, иммунофлуоресцентные анализы, иммуногистохимические анализы, FACS, BIACORE и анализы методом вестерн-блоттинга. Предпочтительными методами выполнения анализов, в частности, применяемыми для широкомасштабного клинического исследования сыворотки и крови субъектов и получаемых из крови продуктов,являются ELISA и вестерн-блоттинг. Особенно предпочтительным анализом является ELISA. Связывающие молекулы или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению, используемые в качестве реагентов при выполнении указанных анализов, обычно связывают с внутренней поверхностью лунок титрационных микропланшетов. Связывающие молекулы или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут быть непосредственно связаны с лункой титрационного микропланшета. Однако максимальное связывание связывающих молекул или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению с лунками может быть достигнуто в результате предварительной обработки лунок полилизином до введения связывающих молекул или иммуноконъюгатов по настоящему изобретению. Кроме того, связывающие молекулы или иммуноконъюгаты по настоящему изобретению могут быть ковалентно связаны с лунками известными методами. Связывающие молекулы или иммуноконъюгаты обычно используют для покрытия в количестве 0,01-100 мкг/мл, хотя могут быть использованы большие, а также меньшие количества. За- 22017203 тем в лунки, покрытые связывающими молекулами или иммуноконъюгатами по настоящему изобретению, добавляют образцы. Кроме того, связывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть использованы для идентификации специфических связывающих рецепторов вируса гриппа H5N1. Связывающими рецепторами могут быть эпитопы белков и/или полипептидов. Указанные эпитопы могут быть линейными,структурными и/или конформационными. В одном варианте осуществления изобретения связывающие рецепторы могут быть идентифицированы при помощи анализа PEPSCAN (см. WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al., 1996). Альтернативно, можно исследовать рандомизированную пептидную библиотеку, включающую пептиды, полученные из белка вируса гриппа H5N1, с целью обнаружения пептидов, способных связываться со связывающими молекулами по настоящему изобретению. Обнаруженные связывающие рецепторы/пептиды/эпитопы могут быть использованы в качестве вакцин и для диагностики гриппа, вызываемого вирусом гриппа H5N1. В том случае, если связывающие молекулы связываются с фрагментами, отличными от белков и/или полипептидов, связывающие рецепторы могут быть идентифицированы масс-спектрометрией, высокоэффективной жидкостной хроматографией и спектроскопией ядерного магнитного резонанса. Другим объектом настоящего изобретения является способ скрининга связывающей молекулы (ее функционального фрагмента или варианта) в отношении специфического связывания с эпитопом вируса гриппа H5N1, подобному эпитопу, связываемому связывающей молекулой человека по настоящему изобретению, который включает стадии: (а) контактирования исследуемой связывающей молекулы, связывающей молекулы по настоящему изобретению и вируса гриппа H5N1 или его фрагмента; (b) определения способности исследуемой связывающей молекулы конкурировать за специфическое связывание с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом со связывающей молекулой по настоящему изобретению. На следующей стадии можно определить, обладают ли отобранные связывающие молекулы, способные специфически связываться с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом, нейтрализующей активностью. Связывающая молекула, способная конкурировать за специфическое связывание с вирусом гриппа H5N1 или его фрагментом со связывающей молекулой по настоящему изобретению, также входит в объем настоящего изобретения. В описанном выше способе скрининга "специфическое связывание с тем же эпитопом" предполагает также специфическое связывание, по существу, или в основном с тем же эпитопом,с которым связывается связывающая молекула по настоящему изобретению. Способность блокировать связывание или конкурировать со связывающими молекулами по настоящему изобретению за связывание с вирусом гриппа H5N1 обычно показывает, что исследуемая связывающая молекула связывается с эпитопом или сайтом связывания вируса гриппа H5N1, который в структурном отношении перекрывает сайт связывания вируса гриппа H5N1, иммуноспецифически узнаваемый связывающими молекулами по настоящему изобретению. Альтернативно, указанная способность может показывать, что исследуемая связывающая молекула связывается с эпитопом или сайтом связывания, расположенным достаточно близко к сайту связывания, иммуноспецифически узнаваемому связывающими молекулами по настоящему изобретению, что позволяет пространственно или каким-либо другим образом ингибировать связывание связывающих молекул по настоящему изобретению с вирусом гриппа H5N1. Как правило, конкурентное ингибирование измеряют при помощи анализа, при выполнении которого антигенную композицию, т.е. композицию, содержащую вирус гриппа H5N1 или его фрагменты,смешивают с эталонными связывающими молекулами, т.е. связывающими молекулами по настоящему изобретению, и исследуемыми связывающими молекулами. Исследуемые связывающие молекулы обычно присутствуют в избытке. Для таких простых исследований конкурентного связывания могут быть использованы методы на основе ELISA и вестерн-блоттинга. Используя вторичные антитела вида или изотипа, специалист в данной области может обнаружить только связанные эталонные связывающие молекулы, связывание которых будет меньше в присутствии исследуемой связывающей молекулы, узнающей,по существу, тот же эпитоп. При выполнении исследования конкурентного связывания между эталонной связывающей молекулой и любой исследуемой связывающей молекулой (независимо от вида или изотипа) можно сначала пометить эталонную связывающую молекулу обнаруживаемой меткой, такой как,например, биотин, ферментативная, радиоактивная или другая метка, позволяющей произвести последующую идентификацию. Связывающие молекулы, идентифицированные при помощи указанных анализов конкурентного связывания ("конкурирующие связывающие молекулы" или "перекрестно взаимодействующие связывающие молекулы"), включают, не ограничиваясь ими, антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты, связывающиеся с эпитопом или сайтом связывания, с которыми связывается эталонная связывающая молекула, т.е. связывающая молекула по настоящему изобретению, а также антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты, связывающиеся с эпитопом или сайтом связывания, расположенным достаточно близко к эпитопу, с которым связывается эталонная связывающая молекула в процессе конкурентного связывания между исследуемыми связывающими молекулами и эталонной связывающей молекулой. Конкурирующие связывающие молекулы по настоящему изобретению,присутствуя в избытке, предпочтительно ингибируют специфическое связывание эталонной связывающей молекулы с выбранным видом-мишенью по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 50% и наиболее предпочтительно по меньшей- 23017203 мере на 75-90% или даже больше. Идентификация одной или нескольких конкурирующих связывающих молекул, которые связываются примерно, по существу, в основном или с тем же эпитопом, что и связывающие молекулы по настоящему изобретению, не вызывает никаких технических трудностей. Так как конкурирующие связывающие молекулы идентифицируют по сравнению с эталонной связывающей молекулой, т.е. связывающей молекулой по настоящему изобретению, очевидно, что для идентификации конкурирующей связывающей молекулы, которая связывается с тем же или, по существу, с тем же эпитопом, что и эталонная связывающая молекула, нет необходимости определять эпитоп, с которым связывается эталонная связывающая молекула и конкурирующая связывающая молекула. Примеры Настоящее изобретение далее проиллюстрировано приведенными ниже примерами. Приведенные примеры не ограничивают объем настоящего изобретения. Пример 1. Создание библиотек отображения на фаге scFv с использованием РНК, экстрагированной из В-клеток памяти. Периферическую кровь брали у нормальных здоровых доноров при помощи венопунктирования и помещали в пробирки для проб с антикоагулянтом EDTA. Пробу крови (45 мл) дважды разводили PBS,30 мл аликвоты наносили на 10 мл фиколл-гипака (Pharmacia) и центрифугировали с ускорением 900g без перерывов в течение 20 мин при комнатной температуре. Супернатант осторожно удаляли непосредственно над белым слоем, содержащим лимфоциты и тромбоциты. Затем указанный слой осторожно удаляли (10 мл), переносили в чистую 50-мл пробирку, трижды промывали 40 мл PBS и центрифугировали с ускорением 400g в течение 10 мин при комнатной температуре для удаления тромбоцитов. Полученный после центрифугирования осадок, содержащий лимфоциты, ресуспендировали в среде RPMI,содержащей 2% FBS, и определяли число клеток методом подсчета клеток. Примерно 1108 лимфоцитов окрашивали для флуоресцентной сортировки клеток, используя CD24, CD27 и поверхностный IgM в качестве маркеров для выделения В-клеток памяти IgM. Для физической сортировки и выделения В-клеток памяти использовали устройство Becton Dickinson Digital Vantage, действующее в режиме предельного напряжения сдвига. Лимфоциты были получены в виде небольшой компактной популяции в окнеFSC/SSC. В-клетки памяти (CD24+/CD27+) затем отделяли от не подвергнутых воздействию В-клеток(CD24+/CD27-) и Т-клеток памяти (CD24-/CD27+). На следующей стадии В-клетки памяти IgM (IgM+) отделяли от В-клеток-"переключателей" памяти (IgM-) путем экспрессии IgM. На данной стадии Вклетки памяти IgM сортировали в отдельной пробирке. Клетки в количестве 1105 собирали вDMEM/50% FBS и после окончания сортировки центрифугировали с ускорением 400g в течение 10 мин и лизировали в 500 мкл раствора для экстрации полной РНК TRIZOL (Invitrogen). РНК экстрагировали из раствора для лизиса с использованием 200 мкл хлороформа и осаждали изопропанолом в соответствии с инструкцией, прилагаемой к раствору TRIZOL. Затем вводили 1 мкл красителя для гранул (Novogen) для усиления и визуализации процесса гранулирования. Полную РНК растворяли в 23 мкл DEPCобработанной ультрачистой воды (Invitrogen) и использовали для конверсии кДНК при помощи обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen). К образцу РНК добавляли 1 мкл произвольных гексамеров(500 нг/мкл) (Promega), смешивали и плавили при 65 С в течение 5 мин в устройстве для ПЦР с нагреваемой крышкой. Образец быстро охлаждали на влажном льду и добавляли следующие компоненты: 8 мкл 5-кратного буфера RT (250 мМ трис-HCl, рН 8,3, 375 мМ KCl, 15 мМ MgCl2), 2 мкл несколькихdNTP (по 10 мМ каждого) (Invitrogen), 2 мкл DTT (100 мМ), 2 мкл ингибитора РНКазы (40 ед./мкл)(Promega), 2 мкл Superscript III (200 ед./мкл) (Invitrogen). Полученную смесь сначала инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре и затем на 1 ч переносили в устройство для ПЦР с нагреваемой крышкой при 50 С. Взаимодействие прекращали, нагревая до 75 С в течение 15 мин. Полученную кДНК разбавляли до 200 мкл ультрачистой водой и хранили при -20 С до последующего применения. Было выполнено два цикла амплификации при помощи ПЦР с использованием наборов праймеров,показанных в табл. 1 и 2, для выделения VH- и VL-областей иммуноглобулина из соответствующего донорского спектра. Была использована следующая композиция для амплификации методом ПЦР: 5 мкл матричной кДНК, 32,75 мкл ультрачистой воды, 2,5 мкл каждого праймера (10 мкМ), 5 мкл 10-кратного буфера для ПЦР (200 мМ трис-HCl, рН 8,4, 500 мМ KCl), 1,5 мкл MgCl2 (50 мМ), 0,5 мкл несколькихdNTP (по 25 мМ каждого), 0,25 мкл Taq-полимеразы (5 ед./мкл) (Invitrogen). В результате выполнения первого цикла амплификации соответствующей кДНК с использованием наборов праймеров, указанных в табл. 1, было получено 7, 6 и 9 продуктов, содержащих примерно 650 пар оснований, соответственно для VH-области, V-области каппа-цепи и V-области лямбда-цепи. Для амплификации VH-области Вклеток памяти IgM использовали константный праймер ОСМ в комбинации с ОН 1-ОН 7. Для амплификации первого цикла была использована следующая программа термической циклизации: 2 мин при 96 С(стадия денатурации), 30 циклов по 30 с при 96 С/30 с при 55 С/60 с при 72 С, конечное удлинение в течение 10 мин при 72 С и охлаждение при 4 С. Продукты наносили и выделяли из 1% агарозного геля в колонках для гелевой экстракции (Qiagen) и элюировали в 50 мкл 1 мМ трис-HCl, рН 8,0. Десять процентов продуктов, полученных в первом цикле (5 мкл), подвергали амплификации второго цикла с использованием праймеров, приведенных в табл. 2. Указанные праймеры были удлинены сайтами рестрикции,- 24017203 позволяющими выполнять направленное клонирование соответствующих VL- и VH-областей в векторе отображения на фаге PDV-C06. Для амплификации второго цикла была использована следующая программа ПЦР: 2 мин при 96 С (стадия денатурации), 30 циклов по 30 с при 96 С/30 с при 60 С/60 с при 72 С, конечное удлинение в течение 10 мин при 72 С и охлаждение при 4 С. Продукты, полученные во втором цикле (350 пар оснований), сначала группировали в соответствии с естественной частотой Jсегментов, обнаруженных в генных продуктах иммуноглобулина, в результате чего было получено 7, 6 и 9 пулов соответственно для VH-области, V-области каппа-цепи и V-области лямбда-цепи (см. табл. 3 и 4). Для достижения нормализованного распределения последовательной иммуноглобулина в иммунной библиотеке 6 пулов V-области каппа-цепи и 9 пулов V-области лямбда-цепи смешивали в соответствии с процентными значениями, указанными в табл. 3. Единственный конечный пул VL-области (3 мкг) расщепляли в течение ночи рестрикционными ферментами SalI и NotI, наносили и выделяли из 1,5% агарозного геля (350 пар оснований) в колонках для гелевой экстракции Qiagen и лигировали с SalI-NotIразрезанным вектором PDV-C06 (5000 пар оснований) следующим образом: 10 мкл вектора PDV-C06(50 нг/мкл), 7 мкл вставки VL-области (10 нг/мкл), 5 мкл 10-кратного буфера для лигирования (NEB), 2,5 ДНК-лигазы Т 4 (400 ед./мкл) (NEB), 25,5 мкл ультрачистой воды (отношение вектора к вставке было равно 1:2). Лигирование выполняли в течение ночи на водяной бане при 16 С. Затем объем удваивали,добавляя воду, экстрагировали равным объемом фенола-хлороформа-изоамилового спирта (75:24:1) (Invitrogen) и затем хлороформом (Merck) и осаждали 1 мкл красителя для гранул (Novogen), 10 мкл ацетата натрия (3 М, рН 5,0) и 100 мкл изопропанола в течение 2 ч при -20 С. Полученный образец центрифугировали с ускорением 20000g в течение 30 мин при 4 С. Полученный осадок промывали 70% этанолом и центрифугировали в течение 10 мин с ускорением 20000g при комнатной температуре. Этанол удаляли при помощи вакуумной аспирации, осадок после центрифугирования подвергали воздушной сушке, в течение нескольких минут и растворяли в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 8,0. 1 мкл лигируемой смеси использовали для трансформации 40 мкл электрокомпетентных клеток TG-1(Stratagene) в охлаждаемой 0,1 см кювете для электропорации (Biorad), используя для указанной цели устройство Genepulser II (Biorad) с установками 1,7 кВ, 200 Ом, 25 мкф (временная константа 4,5 мс). Сразу же после импульсной обработки бактерии вымывали из кюветы 1000 мкл среды SOC (Invitrogen),содержащей 5% (мас./об.) глюкозы (Sigma), при 37 С и переносили в 15 мл круглодонную пробирку с культурой. Использовали еще 500 мкл SOC/глюкозы для вымывания оставшихся бактерий из кюветы и добавляли в пробирку с культурой. Бактерии восстанавливали культивированием в течение 1 ч при 37 С в термостате с шейкером, вращающемся со скоростью 220 об/мин. Трансформированные бактерии культивировали на больших 240 мм квадратных чашках Петри (NUNC), содержащих 200 мкл агара 2TY (16 г/л бактотриптона, 10 г/л бактодрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl, 15 г/л агара, рН 7,0), в который вводили 50 мкг/мл ампициллина и 5% (мас./об.) глюкозы (Sigma). Титр 1:1000 культивировали для подсчета на 15 см чашках Петри, содержащих такую же среду. Процесс трансформации повторяли последовательно 20 раз, полную библиотеку культивировали на 30 больших квадратных чашках Петри и выращивали в течение ночи на паровой бане для культуры при 37 С. При выполнении рассмотренного способа обычно получали около 1107 КОЕ. Промежуточную библиотеку VL-областей легких цепей собирали с планшетов,осторожно соскабливая бактерии в 10 мкл среды 2TY для одного планшета. Массу клеток определяли,измеряя оптическую плотность при 600 нм (OD600), и двукратное количество бактерий, соответствующее 500 OD, использовали для получения максимальной плазмидной ДНК в двух колонках Р 500maxiprep (Qiagen) в соответствии с инструкциями изготовителя. Аналогично вариабельным VL-областям продукты VH-JH второго цикла сначала смешивали до достижения нормального распределения J-сегментов (см. табл. 4), в результате чего было получено 7 субпулов VH-областей, именуемых РН 1-РН 7. Полученные пулы смешивали до достижения нормализованного распределения последовательностей в процентных значениях, указанных в табл. 4, в результате чего была получена одна фракции VH-областей, которую расщепляли рестрикционными ферментами SfiI и XhoI и лигировали с промежуточной библиотекой SfiI-XhoI-разрезанных векторов PDV-VL, которая была получена в соответствии с приведенным выше описанием. Лигирование, очистку, последующую трансформацию TG1 и сбор бактерий выполняли точно так же, как было описано для промежуточной библиотеки VL-областей (см. выше). Конечную библиотеку (примерно 5106 КОЕ) проверяли в отношении частоты вставок при помощи ПЦР колоний с использованием набора праймеров, фланкирующих вставленные VH-VL-области. Более чем у 95% колоний были обнаружены вставки требуемой длины (см. табл. 5). Продукты ПЦР колоний были использованы для последующего анализа последовательностей ДНК с целью проверки изменения последовательностей и определения процентного значения колоний,имеющих полную открытую рамку считывания (ORF). Полученное значение обычно превышало 70%(см. табл. 5). Кроме того, анализировали частоту мутаций в генах V-области. Из 50 последовательностей 47 (94%) не имели конфигурацию зародышевой линии клеток, что свидетельствует о процессе мутации и соответствует фенотипу В-клеток памяти, использованных в качестве источника РНК для библиотеки. И наконец, библиотеку изымали, амплифицировали с помощью фагов-хелперов СТ (см. WO 02/103012) и использовали для отбора фагового антитела методами пэннинга, описанными ниже.- 25017203 Пример 2. Отбор фагов, несущих одноцепочечные Fv-фрагменты против H5N1. Фрагменты антитела отбирали, используя библиотеки отображения антител на фаге, созданные в соответствии с приведенным выше описанием, общепринятым методом отображения на фаге и методомMABSTRACT, описанным в патенте США 6265150 и публикации WO 98/15833 (которые включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки). Кроме того, в настоящем изобретении были использованы методы и фаги-хелперы, описанные в публикации WO 02/103012 (которая включена в настоящее описание изобретения в качестве ссылки). Отбор производили в отношении рекомбинантного гемагглютинина (НА) подтипа Н 5(А/Вьетнам/1203/2004; см. SEQ ID NO: 110), полученного при использовании векторов на основе бакуловируса в клетках насекомых (Protein Sciences, CT, USA). Аминокислотная последовательность НА из изолята А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1TV) и консенсусная аминокислотная последовательность, представляющая НА из штаммов, выделенных в Индонезии и Китае (H5N1IC), показаны соответственно в SEQ IDNO: 111 и SEQ ID NO: 112. Отбор также производили в отношении растворимого рекомбинантного НА(sHA) из H5N1. Последовательность, кодирующую внеклеточную (растворимую) часть НА (sHA) из изолята А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), представляющую НА, идентифицированный в штаммах гриппа, выделенных в Таиланде и Вьетнаме (sHA штамма H5N1TV, SEQ ID NO:113) в 2004 г. (клад 1), и консенсусную последовательность, представляющую растворимые части НА штаммов H5N1, выделенных в Индонезии и Китае (sHA штамма H5N1IC, SEQ ID NO: 114) в 2003/2004 гг. (клад 2), клонировали в векторе экспрессии, содержащем myc- и his-метку, стандартными методами клонирования ДНК. НА штаммов H5N1TV иH5N1IC отличаются в 9 положениях аминокислотных остатков, локализованных в субъединице НА 1 молекул. ДНК трансфецировали стандартными методами в клетках PER.C6 с целью временной и/или устойчивой экспрессии. sHA очищали от супернатанта культуры при помощи аффинной хроматографии хелата металла в колонках FF HisTrap (Amersham Bioscience) в соответствии с инструкциями изготовителя. Антигены НА (рекомбинантные НА и sHA штамма H5N1TV) разводили в PBS (5,0 мкг/мл), вводили в пробирки Nunc-Immuno MaxiSorp (Nunc) и инкубировали в течение ночи при 4 С на вращающемся колесе. Содержимое иммунологических пробирок удаляли и пробирки трижды промывали в блокирующем буфере (2% обезжиренного сухого молока (ELK) в PBS). Затем иммунологические пробирки полностью заполняли блокирующим буфером и инкубировали в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Кроме того, иммунологические пробирки сенсибилизировали в течение ночи антителом против mycметки и инкубировали с блокирующим буфером, содержащим 5 мкг/мл myc-меченного sHA штаммаH5N1TV. Аликвоты собранной библиотеки отображения на фаге (500-1000 мкл, 0,51013 - 11013 КОЕ,амплифицированные с помощью фага-хелпера СТ (см. WO 02/103012 блокировали в блокирующем буфере, содержащем 10% фетальной телячьей сыворотки, инактивированной методом, отличным от нагревания, и 2% сыворотки мыши, в течение 1-2 ч при комнатной температуре. Блокированную фаговую библиотеку вводили в иммунологические пробирки, инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре и промывали промывочным буфером (0,05% (об./об.) твина-20 в PBS) для удаления несвязанных фагов. Связанные фаги элюировали из соответствующего антигена, инкубируя с 1 мл 100 мМ триэтиламина (TEA) в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем элюированные фаги смешивали с 0,5 мл 1 М трис-HCl, рН 7,5, до достижения нейтрального значения рН. Полученную смесь использовали для инфицирования 5 мл культуры E.coli, окрашенной XL1-синим, которая была выращена при 37 С до OD при 600 нм, равной примерно 0,3. Фаги оставляли инфицировать бактерии, окрашенные XL1-синим, в течение 30 мин при 37 С. Затем смесь центрифугировали в течение 10 мин с ускорением 3000g при комнатной температуре и бактериальный осадок ресуспендировали в 0,5 мл среды из 2-триптона и дрожжевого экстракта (2TY). Полученную бактериальную взвесь распределяли в две чашки с агаровой средой 2TY, содержащей тетрациклин, ампициллин и глюкозу. Чашки инкубировали в течение ночи при 37 С, колонии соскабливали с чашек и использовали для получения обогащенной фаговой библиотеки в соответствии с описанием, приведенным в публикациях De Kruif et al. (1995a) и WO 02/103012. Соскобленные бактерии использовали для инокуляции среды 2TY, содержащей ампициллин, тетрациклин и глюкозу, и выращивали при 37 С до OD при 600 нм, равной 0,3. Доблавляли фаги-хелперы СТ и оставляли инфицировать бактерии, после чего указанную среду заменяли средой 2TY, содержащей ампициллин, тетрациклин и канамицин. Культуру продолжали инкубировать в течение ночи при 30 С. На следующий день бактерии удаляли из среды 2TY центрифугированием, после чего фаги в среде осаждали полиэтиленгликолем (PEG) 6000/NaCl. И, наконец, фаги растворяли в 2 мл PBS, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), стерилизовали фильтрованием и использовали для следующего цикла отбора. Альтернативно, отбор фагов производили в линиях клеток, экспрессирующих полноразмерный НА. С указанной целью клетки PER.C6 трансфецировали векторами экспрессии, содержащими полную кодирующую последовательность непроцессированного НА из изолята А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1TV) и консенсусную последовательность, представляющую непроцессированные НА штаммов H5N1, выделен- 26017203 ных в Индонезии и Китае (H5N1IC). Параллельно с отбором каждого фага выполняли анализ методом проточной цитометрии с использованием антитела против НА, чтобы убедиться в экспрессии НАH5N1TV- и Н 5N1IC-трансфецированными клетками PER.C6 (данные не приведены). Нетрансфецированные клетки PER.C6 в количестве 10106 ресуспендировали в 0,5 мл собранной фаговой библиотеки и 0,5 мл культуральной среды для PER.C6, содержащей 4% ELK, и инкубировали в течение 1 ч в переворачивающемся роторе, вращающемся со скоростью 5 об/мин, при 4 С. Смесь фаговой библиотеки/нетрансфецированных клеток PER.C6 центрифугировали в течение 5 мин с ускорением 300g при 4 С и супернатант, содержащий фаги, удаляли во второй раз с 10106 нетрансфецированных клеток PER.С 6. Удаленный фаговый препарат смешивали с 1106 НА-экспрессирующих клеток PER.C6 и инкубировали в течение 2 ч в переворачивающемся роторе, вращающемся со скоростью 5 об/мин, при 4 С. Затем клетки центрифугировали в течение 2 мин с ускорением 3000g и клеточный дебрис ресуспендировали в 1 мл PBS/0,05% твина-20 для вымывания несвязанных фагов. Клетки центрифугировали в течение 2 мин с ускорением 3000g и повторяли промывку еще 5 раз. После каждой промывки клетки переносили в новую пробирку. Связанные фаги элюировали из антигена, инкубируя с 1 мл 100 мМ TEA в течение 10 мин в переворачивающемся роторе, вращающемся со скоростью 5 об/мин, при комнатной температуре. Клетки центрифугировали в течение 2 мин с ускорением 3000g и элюированные фаги переносили в 50 мл пробирку, содержащую 0,5 мл 1 М раствора трис-HCl, рН 7,5. Выделение и размножение элюированных фагов производили в соответствии с приведенным выше описанием. Были выполнены два цикла отбора до выделения отдельных одноцепочечных фаговых антител. После второго цикла отбора отдельные колонии E.coli использовали для получения моноклональных фаговых антител. Отдельные колонии выращивали до лог-фазы на 96-луночном планшете и инфицировали фагами-хелперами VCS-M13, после чего в течение ночи происходило образование фаговых антител. Супернатанты, содержащие фаговые антитела, использовали при выполнении анализа ELISA для связывания с антигенами НА. Альтернативно, фаговые антитела осаждали PEG/NaCl и стерилизовали фильтрованием для выполнения анализа методом проточной цитометрии. Пример 3. Проверка наличия НА-специфических одноцепочечных фаговых антител. Отобранные одноцепочечные фаговые антитела, полученные в результате вышеописанного скрининга, проверяли методом ELISA в отношении специфичности, т.е. связывания с антигенами НА. Для указанной цели экспрессированный в бакуловирусе рекомбинантный НА (Protein Sciences, CT, USA) и очищенные sHA штаммов H5N1TV и H5N1IC наносили на планшеты для ELISA Maxisorp. Антитело против myc-метки mA 9E10 (Roche) иммобилизовали на планшетах для ELISA Maxisorp в качестве отрицательного контрольного антитела. Покрытые планшеты трижды промывали PBS, содержащим 0,1% об./об. твина-20, и блокировали в PBS, содержащем 3% BSA или 2% ELK, в течение 1 ч при комнатной температуре. Отобранные одноцепочечные фаговые антитела инкубировали в течение 1 ч в таком же объеме PBS, содержащего 4% ELK, для получения блокированных фаговых антител. Содержимое планшетов удаляли, планшеты трижды промывали PBS/0,1% твина-20 и в лунки добавляли блокированные одноцепочечные фаговые антитела. Планшеты инкубировали в течение 1 ч, промывали PBS/0,1% твина 20 и производили обнаружение связанных фаговых антител (путем измерения OD при 492 нм), используя антитело против М 13, конъюгированное с пероксидазой. Одновременно выполняли контрольный эксперимент, в котором вместо одноцепочечного фагового антитела использовали отрицательное контрольное одноцепочечное фаговое антитело. В результате отбора на разных антигенах НА с использованием библиотеки В-клеток памяти IgM было получено 92 уникальных одноцепочечных фаговых антитела, специфичных к рекомбинантному НА или sHA. Альтернативно, при помощи анализа методом проточной цитометрии исследовали реактивность одноцепочечных антител, отобранных для связывания с НА-экспрессирующими клетками PER.С 6. Фаги,осажденные PEG/NaCl, смешивали с равным объемом смеси PBS/2% ELK и блокировали в течение 30 мин на льду. Блокированные фаги добавляли к осажденным на гранулы клеткам (нетрансфецированные клетки PER.C6 и НА-экспрессирующие клетки PER.C6) и инкубировали в течение 1 ч на льду. Клетки трижды промывали PBS/1% BSA, центрифугировали в течение 1 мин с ускорением 300g и визуализировали связывание одноцепочечных фаговых антител с клетками, используя биотинилированное антитело против М 13 (Fitzgerald) и затем конъюгат стрептавидина-фикоэритрина (Caltag). Отбор с использованием НА-экспрессирующих клеток PER.C6 позволил получить 24 уникальных одноцепочечных фаговых антитела, которые не были идентифицированы во время отбора с использованием других белков рекомбинантного НА. Пример 4. Исследование НА-специфических scFv-фрагментов. Из отобранных клонов специфических одноцепочечных фаговых антител (scFv) была получена плазмидная ДНК и стандартными методами были определены нуклеотидные и аминокислотные последовательности. Идентичность нуклеотидной и аминокислотной последовательности и генов VH- и VLобластей (см. публикацию Tomlinson I.M. et al. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom:MRC Centre for Protein Engineering (1997 scFv-фрагментов показана в табл. 6. Области CDR НАспецифических иммуноглобулинов показаны в табл. 7.- 27017203 Пример 5. Создание полностью человеческих молекул иммуноглобулина (моноклональные антитела человека) из отобранных одноцепочечных Fv-фрагментов. Вариабельные области тяжелых и легких цепей scFv-фрагментов клонировали методом рестрикционного гидролиза для экспрессии в IgG-векторах экспрессии pIg-С 911-НС 1 (см. SEQ ID NO: 141), pIGC909-C (см. SEQ ID NO: 142) или pIg-C910-С (см. SEQ ID NO: 143). Нуклеотидные последовательности для всех конструкций проверяли стандартными методами, известными специалисту в данной области. Полученные экспрессирующие конструкции, кодирующие тяжелые и легкие цепи IgG1 человека,временно экспрессировали вместе в клетках 293 Т, при этом были получены супернатанты, содержащие антитела IgG1 человека, которые очищали стандартными методами очистки. Антитела IgG1 человека титровали в диапазоне концентраций от 10 до 0,003 мкг/мл против Н 5 (данные не приведены). В качестве контрольного антитела использовали антитело, специфичное к SARS-CoV. Молекулы IgG1 характеризовались такой же реактивностью, которая была продемонстрирована для одноцепочечных фаговых антител. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи антител, именуемыхCR6141, CR6255, CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268, CR6272, CR6296, CR6301, CR6307,CR6310, CR6314, CR6323, CR6325, CR6327, CR6328, CR6329, CR6331, CR6332, CR6334, CR6336,CR6339, CR6342, CR6343 и CR6344, а также вариабельные области тяжелой и легкой цепей приведены в табл. 8. Связывание IgG против НА с НА-экспресирующими клетками PER.C6 исследовали при помощи проточной цитометрии. Анализ связывания антитела с НА методом проточной цитометрии показал, что антитела CR6255, CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268, CR6307, CR6310, CR6314, CR6323,CR6325, CR6331 и CR6344 связаны с НА (H5N1TV)-экспрессирующими клетками PER.C6 (см. табл. 9). Антитела CR6261 и CR6344 также демонстрировали связывания с нетрансфецированными контрольными клетками, но полученные сигналы были примерно в 10 раз слабее сигналов, полученных для связывания с НА (H5N1TV)-экспрессирующими клетками PER.C6 (см. табл. 9). Не было обнаружено связывания контрольного антитела CR3014 с НА-экспрессирующими клетками и нетрансфецированными контрольными клетками. Пример 6. Нейтрализация in vitro вируса гриппа H5N1 H5N1-специфическими IgG (анализ нейтрализации вируса). Для определения способности отобранных IgG блокировать вирус гриппа H5N1 in vitro были выполнены анализы нейтрализации вируса (VNA). VNA выполняли с использованием клеток MDCK(АТСС CCL-34). Клетки MDCK культивировали в культуральной среде для клеток MDCK (среда MEM,содержащая антибиотики, 20 мМ HEPES и 0,15% (мас./об.) бикарбоната натрия (полная среда MEM),содержащей 10% (об./об.) фетальной телячьей сыворотки). Реанжированный штамм NIBRG-14 вирусаH5N1, использованный при выполнении данного анализа, разводили до титра 4103 TCID 50/мл (доза,инфицирующая 50% культуры ткани в 1 мл), который вычисляли методом Спирмана и Карбера. Препараты IgG (200 мкг/мл) дважды последовательно разводили (1:2 - 1:16) в полной среде MEM в дублированных лунках. 25 мкл соответствующего титра IgG смешивали с 25 мкл взвеси вируса (100 TCID 50/25 мкл) и инкубировали в течение 1 ч при 37 С. Затем взвесь переносили в виде двух копий на 96-луночные планшеты, содержащие конфлюэнтные культуры MDCK в 50 мкл полной среды MEM. До использования клетки MDCK высевали в количестве 3104 на лунку в культуральную среду для клеток MDCK, выращивали до слияния клеток, промывали 300-350 мкл PBS, рН 7,4, после чего в каждую лунку добавляли 50 мкл полной среды MEM. Инокулированные клетки культивировали в течение 3-4 дней при 33 С и ежедневно проверяли появление цитопатического эффекта (СРЕ). СРЕ сравнивали с положительным контрольным образцом (клетки, инокулированные NIBRG-14) и отрицательным контрольным образцом(псевдоинокулированные клетки). Полное отсутствие СРЕ в отдельной культуре клеток определяли как защитное действие. При выполнении данного анализа в качестве положительного контрольного образца использовали антитело овцы против НА вируса гриппа H5N1 А/Вьетнам/1194/04 (04/214, NIBSC). Кроме того, культуры исследовали на наличие вируса при помощи иммуногистохимии. С указанной целью удаляли супернатант культуры и клетки фиксировали 40% (об./об.) ацетона и 60% (об./об.) метанола в течение 15 мин. Фиксированные клетки блокировали в течение 30 мин при 37 С в блокирующем буфере (200 мМ NaCl, 0,2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA), 0,01% тримерозала, 0,2% (об./об.) твина-20, 20 мМ трис-HCl, рН 7,45), содержащем 2% (мас./об.) BSA и 5% (об./об.) козьей сыворотки. Затем клетки инкубировали в течение 1 ч при 37 С с 50 мкл смеси моноклональных антител мыши против вируса гриппа типа A (Chemicon), разведенной в отношении 1:1000 в промывочном буфере. Выполнив три промывки промывочным буфером, добавляли 50 мкл биотин-конъюгированного антитела козы против IgG мыши (Jackson), разведенного в отношении 1:1000 в промывочном буфере, и инкубировали в течение 1 ч при 37 С. Выполнив три промывки промывочным буфером, добавляли 50 мкл конъюгата стрептавидина-пероксидазы (Calbiochem), разведенного в отношении 1:3000 в промывочном буфере, и инкубировали в течение 30 мин при 37 С. Выполнив еще три промывки промывочным буфером, окрашивание визуализировали раствором АЕС (0,12% (мас./об.) 3-амино-9-этилкарбазола, 30% (об./об.) N-Nдиметилформамида и 70% (об./об.) ацетатного буфера), содержащим раствор 1 мкл H2O2/1 мл АЕС. Вы- 28017203 полнив три промывки промывочным буфером, окрашивание анализировали под микроскопом. Антитела человека против НА, именуемые CR6255, CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268,CR6307, CR6310, CR6314, CR6323, CR6325, CR6331 и CR6344, анализировали вышеописанным методомVNA. Все антитела нейтрализовали реаранжированный штамм NIBRG-14 вируса гриппа H5N1. Концентрации (в мкг/мл), при которых указанные антитела защищают культуры MDCK от СРЕ, приведены в табл. 10. В лунках, в которых был обнаружен цитопатический эффект (СРЕ), наличие вируса было подтверждено иммуногистохимическим окрашиванием (данные не приведены). Для более точного определения нейтрализующей активности Н 51 М 1-специфических IgG in vitro повторяли анализы нейтрализации вируса с использованием NIBRG-14, но в данном случае препаратыIgG дополнительно разводили. Препараты IgG (200 мкг/мл) последовательно дважды разводили (1:1 1:512) в полной среде MEM и исследовали в четырежды дублированных лунках при выполнении вышеописанного анализа VNA. Нейтрализующую активность антител человека против H5N1, именуемыхCR6344, определяли методом VNA. Все антитела, за исключением CR6272 и CR6339, нейтрализовали реаранжированный штамм NIBRG-14 вируса гриппа H5N1. Концентрации (в мкг/мл, в присутствии 100TCID 50 вируса), при которых указанные антитела защищают культуры MDCK от СРЕ, приведены в табл. 11. В лунках, в которых был обнаружен цитопатический эффект (СРЕ), наличие вируса было подтверждено иммуногистохимическим окрашиванием (данные не приведены). Пример 7. Анализ методом иммуноблоттинга Н 5N1-специфических IgG. Для дальнейшего исследования специфичности антител против НА разные антигены рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа типа А анализировали методом SDS-PAGE в восстановительных условиях с последующим выполнением анализа антител против НА методом иммуноблоттинга. Полипептид НА 0 состоит из субъединиц НА 1 и НА 2. Антитело CR5111, Н 5N1-специфическое контрольное антитело, узнавало субъединицу НА 1 и интактный (нерасщепленный) полипептид НАО sHA штаммаH5N1TV (см. фиг. 1, правая часть, полоса 1). Кроме того, антитело CR5111 узнавало субъединицу НА 1 рекомбинантного НА подтипа Н 5 (А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1); см. SEQ ID NO: 110), полученную с использованием векторов на основе бакуловируса в клетках насекомых (Protein Sciences, CT, USA) (фиг. 1, правая часть, полоса 2). Нерасщепленный полипептид НА 0 не был обнаружен в указанном препарате НА. Разницу в размере субъединиц НА, показанных в полосах 1 и 2, можно объяснить разным гликозилированием НА, экспрессированного в клетках насекомых и клетках PER.С 6. Антитело CR111 не узнавало полипептиды НА 1 и/или НА 0 рекомбинантного НА подтипа H1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1(см. фиг. 1, правая часть, полоса 4) или рекомбинантного НА подтипа Н 3 (А/Вайоминг/3/2003 (H3N2(фиг. 1, правая часть, полоса 3). Антитела CR6307 и CR6323 узнавали субъединицы НА 2 sHA штамма H5N1TV (см. фиг. 1, левая и средняя части, полосы 1) и рекомбинантный НА подтипа Н 5 (А/Вьетнам/1203/2002 (H5N1) (см. фиг. 1,левая и средняя части, полосы 2). Интересно отметить, что субъединица НА 2, присутствующая в интактных, нерасщепленных полипептидах НА 0, не была узнана. По-видимому, эпитоп, узнаваемый антителами CR6307 и CR6323, становится доступным при расщеплении НА 0. Кроме того, антитела CR6307 иCR6323 узнавали субъединицу НА 2 рекомбинантного НА подтипа H1 (А/Новая Каледония/20/99(H1N1 (см. фиг. 1, левая и средняя часть, полосы 4), но не узнавали субъединицу НА 2 рекомбинантного НА подтипа Н 3 (А/Вайоминг/3/2003 (H3N2 (см. фиг. 1, левая и средняя части, полосы 3), причем оба рекомбинантных НА были получены с использованием векторов на основе бакуловируса в клетках насекомых (Protein Sciences, CT, USA). Так как сайт связывания нейтрализующих антител CR6307 и CR6323 является консервативным в штаммах вируса гриппа типа А подтипов H1 и Н 5, молекулу, содержащую указанный сайт связывания, можно считать (частью) вакцины, способной индуцировать широкий перекрестно реактивный ответ антитела против вируса гриппа. Вслед за антителами CR6307 и CR6323 анализу методом иммуноблоттинга были подвергнуты антитела, именуемые CR6141, CR6296 и CR6301. Каждое из трех указанных антител было способно связываться с субъединицей НА 2 sHA штамма H5N1TV и рекомбинантным НА подтипа Н 5(А/Вьетнам/1203/2004; H5N1) (данные не приведены). Пример 8. Анализ методом FACS с целью определения специфичности к субъединицам Н 5N1 специфических IgG. Чтобы определить влияние субъединицы НА 1 на связывание антител против H5N1, выполняли анализ, в котором субъединицу НА 1 выделяли из НА-экспрессирующих клеток PER.С 6. НАэкспрессирующие клетки PER.C6 трижды промывали PBS, рН 7,4 и инкубировали в течение 10 мин в подкисленном PBS, рН 4,9. Затем клетки промывали PBS, рН 7,4 и в течение 10 мин обрабатывали 10 мкг/мл трипсина в PBS, рН 7,4 для расщепления молекул НА 0 на субъединицы НА 1 и НА 2, связанные дисульфидной связью. И, наконец, клетки инкубировали в течение 20 мин в 20 мМ DTT в PBS, рН 7,4 для отделения субъединицы НА 1 от мембраносвязанной субъединицы НА 2. Необработанные клетки и клетки, обработанные кислотой/трипсином/DTT, дважды промывали PBS, содержащим 1% мас./об. BSA. Для выполнения анализа методом проточной цитометрии использовали 2,5105 клеток на одно окраши- 29