Композиция, включающая ингибитор il-1 и гидрогелевый эфир, и способы ее применения

1 Область, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области терапии и профилактики воспаления. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композиции, применяемой в целях предотвращения или лечения воспалительных заболеваний. Предпосылки изобретения Воспаление - защитная реакция организма в ответ на механические повреждения, инфекцию или антигенную стимуляцию. Воспалительная реакция может протекать по патологическому типу, когда она запущена неадекватным стимулом, таким как аутоантиген, развивается необычным образом или продолжается после устранения повреждающих агентов. При том, что этиология воспаления изучена слабо, в последнее время получен большой объем информации о молекулярных аспектах воспаления. Эти исследования привели к идентификации отдельных цитокинов, которые активно участвуют в медиации воспаления. Цитокинами называют внеклеточные белки, которые модифицируют поведение клеток, в особенности тех клеток, которые находятся вблизи области синтеза и высвобождения цитокинов. Интерлейкин-1 (IL-1) является одним из наиболее сильных из известных воспалительных цитокинов и считается ключевым медиатором многих заболеваний, обозначенных как интерлейкин-1-обусловленные заболевания. IL-1, который вырабатывается в основном (но не только) клетками макрофагально/моноцитарного ряда, может синтезироваться в двух формах: IL-1 альфа (IL-1) и IL-1 бета(IL-1). Заболевание или клиническое состояние считается IL-1 обусловленным, если спонтанное или экспериментальное заболевание или клиническое состояние связано с повышенными уровнями IL-1 в жидкостях тела или тканях или же клетки и ткани, извлеченные из организма,продуцируют повышенные уровни IL-1 в культуре. Во многих случаях подобные интeрлейкин-1-обусловленные заболевания распознают по двум следующим дополнительным признакам: (1) патологические проявления, ассоциированные с заболеванием или клиническим состоянием, могут быть воспроизведены экспериментально на животных введением IL-1; и (2) индуцированная у экспериментальных животных патология может быть подавлена или отменена лечением агентами, которые подавляют действие IL-1. По меньшей мере, два из трех патологических проявления характерны для большинства интерлейкин-1-обусловленных заболеваний, а во многих случаях имеют место все три патологических проявления. Неполный список острых и хронических интерлейкин-1(IL-1) обусловленных воспалительных заболеваний включает следующие нозологии: острый панкреатит; ALS; болезнь Альцгеймера; кахексия/анорексия; астма; атеросклероз; синдром 2 хронической усталости; лихорадка; диабет (например, инсулин-зависимый диабет); гломерулонефрит; реакция "трансплантат против хозяина"; геморрагический шок; гиперальгезия; воспалительные заболевания кишечника; воспаления суставов, включая остеоартрит, псориатический артрит и ревматоидный артрит; ишемические поражения, включая церебральную ишемию (напр., повреждения мозга в результате травмы, эпилепсии, геморрагии или инсульта,что может приводить к нейродегенерации); заболевания легких (напр., ARDS); множественная миелома; множественный склероз; миелогенные(напр., AML и CML) и другие лейкозы; миопатии (например, нарушения метаболизма мышечных белков, особенно при сепсисе); остеопороз; болезнь Паркинсона; боль; избыточная работа; псориаз; реперфузионные повреждения; септический шок; побочные последствия радиотерапии, временная дисфункция суставов нижней челюсти; метастазирующие опухоли; или воспаления, вызванные разрывом и растяжением связок, повреждением хряща, ортопедической операцией, инфекцией и т.п. Хроническим воспалительным заболеваниям суставов подвержены в различной степени миллионы людей во всем мире. Ревматоидный артрит - это заболевание суставов, при котором кость и хрящ эрозированы пролиферирующей инвазивной соединительной тканью, называемой паннусом,и которая происходит из синовиальной мембраны. Болезнь может захватывать периартикулярные структуры, такие как бурса, оболочки сухожилий и сами сухожилия, а также такие экстраартикулярные ткани, как субкутис, сердечнососудистая система, легкие, селезенка, лимфатические узлы, скелетная мускулатура, нервная система (центральная и периферическая) и глаза(ed.), 11:1828). Остеоартрит - частое заболевание суставов, характеризующееся дегенеративными изменениями в суставном хряще и реактивной пролиферацией кости и хряща вокруг сустава. Остеоартрит - это активный клеточный процесс, который может быть обусловлен неадекватным ответом хондроцитов на катаболические и анаболические стимулы. На ранних стадиях остеоартрита наблюдаются изменения определенных матриксных молекул суставного хряща (Thonar et al., (1993), Reumatic diseaseclinics of North America, Moskowitz (ed.), 19:635657 и Shinmei et al., (1992), Arthritis Rheum.,35:1304-1308). Считается, что ревматоидный артрит является следствием экспозиции соответствующего антигена в иммуногенетически чувствительном хозяине. Антигены, которые потенциально могут инициировать иммунный ответ, приводящий к ревматоидному артриту, могут быть как эндогенными, так и экзогенными. К возможным эндогенным антигенам относятся коллаген, мукополисахариды и ревматоидные факторы. К экзо 3 генным антигенам относятся микоплазмы, микобактерии, спирохеты и вирусы. Продукты иммунной реакции (например, простагландины и кислородные радикалы) вызывают воспаление суставов и запускают деструктивные изменения суставов (например, коллагеназа). Острота заболевания может довольно сильно варьировать, но при этом большинство больных претерпевают перемежающиеся рецидивы и ремиссии с общей тенденцией к медленно прогрессирующей деструкции и деформации сустава. К клиническим проявлениям относится симметричный полиартрит периферических суставов с болью, напряженностью, отеками и потерей функции пораженного сустава; несгибаемость суставов по утрам; утрата хряща и эрозия костного вещества с подвывихом суставов в результате постоянного воспаления. К экстраартикулярным проявлениям относятся ревматоидное воспаление лимфатических узлов, ревматоидный васкулит, плевропульмональные воспаления, склерит, синдром хронической усталости, синдром Фелти (спленомегалия и нейтропения), остеопороз и потеря весаSimon (1986) Advances in Reumatology, Synderman (ed.), 70(2):263-284). Клинические проявления приводят к высокой степени болезненности,нарушающей повседневную жизнь больных. Участие интерлейкина-1 в патогенезе артрита подтверждается двумя группами доказательств. Во-первых, в синовиальной ткани и жидкости пораженных артритом суставов было обнаружено повышенное количество интерлейкина-1 и кодирующей его мРНК. См., например,Buchan et al., Third Annual General Meeting ofNon-Lymphocytic Cytokines, M. Powanda et al.,(eds.), pp.387-392 (Alan R. Liss, Inc.). Во-вторых,как показано во многих случаях, введение интерлейкина-1 в здоровые ткани сустава приводит к эрозии хряща и кости. В одном из экспериментов внутрисуставные инъекции IL-1 кроликам вызывали деструкцию хряща in vivo (Pettipher et al., (1986), Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A.,83:8749-8753). В других опытах показана обусловленная IL-1 деградация хряща и кости в тканевых эксплантатах (Saklatavala et al., (1987),Developvent of Diseases of Cartilage and BoneAmerican Association of Immunologists, 183:14641468). Согласно одной из общепринятых теорий, используемых для объяснения причинной связи между IL-1 и артритом, IL-1 стимулирует клетки различных типов, такие как фибробласты и хондроциты, к продукции провоспалительных и деградирующих соединений, таких как простагландин Е 2 и металлопротеиназы. 4 Антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL1ra) - это белок человека, который действует как природный ингибитор интерлейкина-1. Антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1ra) был описан как потенциальный агент для клинического применения при лечении обусловленныхIL-1 заболеваний (Австралийский патент No. 649245). Однако IL-1rа имеет относительно короткий срок полужизни. Поэтому для лечения обусловленных IL-1 заболеваний было бы предпочтительно вводить IL-1rа в составе таких фармакологических форм, которые обеспечивают контролируемое его высвобождение. Одним из материалов, используeмых для приготовления подобных фармакологических форм,является гиалуроновая кислота. Гиалуроновая кислота - это природный мукополисахарид, состоящий из остатков D-глюкуроновой кислоты и N-ацетил-D-глюкозамина в неразветвленной цепи. Полимер имеет средний молекулярный вес (5-6) х 106 и обладает прекрасной биосовместимостью. В суставном хряще гиалуроновая кислота играет важную роль в конструировании хрящевого матрикса, агрегируя с протеогликаном. Кроме того показано, что при различных патологических состояниях, таких как ревматоидный артрит, остеоартрит и инфекционный артрит, концентрация и молекулярный вес гиалуроновой кислоты в суставе меняются,что приводит к изменениям в составе синовиальной жидкости. Для усиления реологических свойств гиалуроновой кислоты или увеличения времени деградации отдельных лекарств применяли как перекрестное сшивание гиалуроновой кислоты, так и получение других ее производных (Cortivo et al., (1991), Biomaterials, 2:727730; Benedetti et al., (1990), J. Controlled Release,13:33-41 и Hunt et al., (1990), J. Controlled Release, 12:159-169). Показано, что введение высокомолекулярных производных гиалуроновой кислоты может восстанавливать поврежденный слой гиалуроновой кислоты на поверхности суставного хряща и может быть эффективным лечением отдельных поражений суставов, а также применяться в фундаментальных исследованиях. Ниже приведены отдельные научные публикации, посвященные подобному использованию производных гиалуроновой кислоты для лечения различных поражений суставов.of the American Association of Equine Practitioners, St. Louis, Mo., p.345-348; Wigren et al.,(1975), Upsala J. Med. Sci. Suppl., 17:1-20; и Gingerich et al., (1980), Res Vet Sci, 30:192-197. Применение гиалуроновой кислоты для лечения суставов человека описано Реуron et al., (1974)Pathologie Biologie, 22(8):731-736. Внутриартикулярное использование гиалуроновой кислоты 5 для лечения суставов лошадей стало более широким в связи с коммерческим применением таких препаратов, как Hylartil и Нуlartin V фирмы Pharmacia и препарата Synacid фирмыSterivet. Однако при том, что такие симптомы,как боль и снижение подвижности являются серьезной проблемой в лечении заболеваний суставов, гиалуроновая кислота непосредственно не устраняет данные симптомы. Гиалуроновую кислоту используют также для доставки лекарственных препаратов. В частности, описано применение одной гиалуроновой кислоты и в смеси с кортизоном для лечения суставов у различных животных, в особенности у лошадей (Rydell et al., (1971), ClinicalOrthopaedics and Related Research, 80:25-32). В другой научной публикации описано получение микросфер из эфиров гиалуроновой кислоты и их применение для интраназального введения инсулина (Illium et al., (1994), J. Controlled Release, 29:133-141). Пустые сферы, полученные методом эмульсификации с последующим упариванием растворителя, в течение часа выдерживают в растворе инсулина, а затем лиофилизируют. При введении овцам средняя биодоступность составляла 11% от уровня, достижимого при подкожном введении инсулина. Подобная система была также использована для доставки фактора роста нервов (Ghezzo et al.,(1992), Int. J. Pharm. 87:21-29). Однако было показано, что при введении в коленный сустав собаки физиологических концентраций (3 мг/ мл) высокомолекулярной (6 х 106) или низкомолекулярной (5 х 105) гиалуроновой кислоты в смеси с радиоактивным альбумином, объем распределения альбумина и скорость выведения лишь незначительно превышали эти параметры в сравнении с коленными суставами, в которых концентрация(0,03 мг/мл) высокомолекулярной гиалуроновой кислоты или концентрация низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (0,3 мг/мл) были снижены (Myers and Brandt (1995), J. Rheumatol,22:1732-1739). Эти данные дают основание полагать, что сочетаемое применение гиалуроновой кислоты с белком, таким как IL-1ra, будет не более эффективным, чем применение одной гиалуроновой кислоты для лечения воспалительных заболеваний, особенно при интраартикулярном введении. Задачей настоящего изобретения является разработка терапевтических методов и композиций для лечения воспалительных заболеваний, обусловленных IL-1. Указанная задача и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны из приведенного ниже описания. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей полимер, контролирующий высвобождение (например, гиалуронан), и белковый ингибитор IL1 (например, IL-1ra) в качестве агента для лечения воспалительных заболеваний, обусловлен 001792 6 ных IL-1. Указанный способ лечения применим для млекопитающих, включая человека. Краткое описание чертежей Различные аспекты и преимущества настоящего изобретения станут более понятными с помощью чертежей, описание которых приведено ниже. На фиг. 1 представлены уровни IL-1ra после подкожного введения или только IL-1ra в цитратном буфере (CSEP), или IL-1ra, смешанного с гиалуроновой кислотой в CSEP. На фиг. 2 показано количество IL-1ra, остающегося в суставах морских свинок после внутрисуставного введения или только IL-1ra вCSEP, или IL-1ra, смешанного с гиалуроновой кислотой в CSEP. На фиг. 3 отражена концентрация IL-1ra в синовиальной жидкости кроликов после внутрисуставного введения или только IL-1ra вCSEP, или IL-1ra, смешанного с гиалуроновой кислотой в CSEP. На фиг. 4 приведена гистологическая оценка остроты заболевания коленных суставов крыс, иммунизированных бычьим коллагеном типа II, после внутрисуставного введения или только гиалуроновой кислоты в CSEP, или IL1ra, смешанного с гиалуроновой кислотой вCSEP. На фиг. 5 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO.1), кодирующая рекомбинантный IL-1ra человека (rhuIL-1ra). Представлена также аминокислотная последовательность (SEQ ID NO.2) rhuIL-1ra, где первый аминокислотный остаток обозначен Мn, а n равно 0 или 1. На фиг. 6 представлен эффект ежедневного введения (QD) IL-1ra, смешанного с гиалуроновой кислотой в CSEP в сравнении с введениемIL-1ra в CSEP, или гиалуроновой кислоты вCSEP, или только CSEP на диаметр локтевого сустава крыс с развившимся после введения коллагена типа II артритом. На фиг. 7 представлен эффект ежедневного введения (QD) IL-1ra, смешанного с кислотой вCSEP на вес лап у крыс с развившимся после введения коллагена типа II артритом. На фиг. 8 представлен эффект ежедневного введения (QD) IL-1ra, смешанного с кислотой вCSEP на воспаление, образование паннуса, а также повреждение хряща и кости у крыс с развившимся после введения коллагена типа II артритом. На фиг. 9 представлен эффект ежедневного введения (QD), введения через день(Q2D) и через два дня (Q3D) IL-1ra, смешанного с гиалуроновой кислотой в CSEP в сравнении с введением гиалуроновой кислоты в CSEP(QD), или в отсутствие лечения, на диаметр голеностопного 7 сустава крыс с развившимся после введения коллагена типа II артритом. На фиг. 10 представлен эффект ежедневного введения (QD), введения через день(Q2D) и через два дня (Q3D) IL-1ra, смешанного с гиалуроновой кислотой в CSEP в сравнении с введением гиалуроновой кислоты в CSEP(QD), или в отсутствие лечения, на вес лап у крыс с развившимся после введения коллагена типа II артритом. Подробное описание изобретения Заявленные в настоящем изобретении фармацевтические композиции содержат смесь контролирующего высвобождение полимера(например, гиалуронана) и белкового ингибитора IL-1 (например, IL-1ra). Более конкретно,настоящее изобретение направлено на введение фармацевтического состава, содержащего гиалуронан и белковый ингибитор IL-1 (например,IL-1ra), приводящее к относительно продолжительному повышению уровней IL-1ra. Заявка на Патент США No 60/011,419, поданная 9-го февраля 1996 г. Коллинзом и озаглавленная в сопроводительном письме к Заявке как Композиция и способ для лечения воспалительных заболеваний (документ Поверенного А-365 Р), Заявка на Патент США No 60/032,789, поданная 6-го декабря 1996 г. Коллинзом и Бевилаквой и озаглавленная в сопроводительном письме к Заявке как Композиция и способ для лечения воспалительных заболеваний (документ Поверенного А-365 А-Р) и Заявка на Патент США No 60/036,241, поданная 23 го января 1997 г. Коллинзом и Бевилаквой и озаглавленная в сопроводительном письме к Заявке как Композиция и способ для лечения воспалительных заболеваний (документ Поверенного No A-365B-P) включены в настоящее описание в качестве ссылок. Ингибиторами интерлейкина-1 (IL-1) могут являться любые белки, способные специфически предотвращать активацию клеточных рецепторов IL-1. Классы ингибиторов интерлейкина-1 включают: антагонисты рецептора интерлейкина-1, такие как описанный ниже IL-1rа; анти-IL-1-рецептор моноклональные антитела (ЕР 623674); IL-1 связывающие белки, такие как растворимые рецепторы IL-1 (Патенты США No 5,492,888,5,488,032, 5,464,937, 5,319,071 5,180,812); антиIL-1-моноклональные антитела (WO 9501997,WO 9402627, WO 9006371, US 4,935,343, ЕР 3644778, ЕР 267611 и ЕР 220063); дополнительные белки рецептора IL-1 (WO 96/23067); все источники информации приведены здесь в качестве ссылок. Предпочтительные формы IL-1rа (гликозилированная и негликозилированная), а также способы его получения и применения, описаны в Патенте США No 5,075,222 (обозначенном далее как Патент 222) и патентах WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221 и WO 96/22793, приведенных в на 001792 8 стоящем описании в качестве ссылок. В частности, заявлены и описаны в Патенте 222 три формы IL-1ra (IL-1ra, IL-1rа и IL-lrax), а также их варианты. IL-1ra представляет собой белок с молекулярной массой 22-23 кД (SDSPAGE), с приблизительной изоэлектрической точкой 4.8 и элюирующийся с колонки Mono QFPLC 52 mM NaCl в Трис-буфере, рН 7.6. IL1ra представляет собой белок с молекулярной массой 22-23 кД, элюирующийся с колонки Q 48 mM NaCl. И IL-1ra, и IL-1ra являются гликозилированными. IL-1rax - белок с молекулярной массой 20 кД, элюирующийся с колонкиMono Q 48 mM NaCl, и не гликозилированный. Все три данные ингибитора обладают сходной функциональной и иммунологической активностью. Один из описанных способов полученияIL-1ra состоит в выделении IL-1ra из моноцитов человека, где он продуцируется естественным образом. Второй описанный способ предусматривает выделение гена, кодирующего IL-1ra,клонирование данного гена в подходящих векторах и клетках-хозяевах, экспрессию гена для получения ингибиторов и выделение ингибиторов. Второй способ, который по сути является примером методов рекомбинантных ДНК, является предпочтительным. Методы рекомбинантных ДНК особенно предпочтительны, поскольку с их помощью удается получить сравнительно большие количества белка более высокой чистоты.Таким образом, в объем настоящего изобретения включен также IL-1ra, содержащийN-концевую метионильную группу, что является результатом экспрессии в прокариотических клетках, таких как E.coli. Как указано выше, в объем настоящего изобретения также включены модифицированные формы IL-1ra. Под модифицированными формами IL-1ra понимаются такие варианты полипептидов, в которых аминокислоты в последовательности IL-1ra (1) делетированы (делетированные варианты), (2) вставлены (дополнительные варианты) или (3) заменены(варианты с заменами). Для делетированных вариантов IL-1ra характерны делеции аминокислотных последовательностей размером от 1 до 30 аминокислотных остатков, более типично от 1 до 10 аминокислотных остатков и наиболее типично от 1 до 5 последовательных остатков. Возможны Nконцевые и С-концевые внутренние делеции. Делеции в аминокислотной последовательностиIL-1ra могут быть произведены в областях слабой гомологии с последовательностями других членов семейства IL-1. Делеции в аминокислотной последовательности IL-1ra могут быть произведены в областях существенной гомологии с последовательностями других членов семействаIL-1 и, по-видимому, могут значительно изменять его биологическую активность. 9 В случае дополнительных вариантов IL-1ra каждый полипептид может включать аминоили карбокситерминальные добавки, длина которых может составлять от одного остатка до ста и более остатков, а также внутренние внутрипоследовательные вставки одного или многих аминокислотных остатков. Размер внутренних вставок может колебаться в пределах от 1 до 10 аминокислотных остатков, более типично от 1 до 5 аминокислотных остатков и наиболее типично от 1 до 3 аминокислотных остатков. Аминотерминальные дополнительные варианты включают добавление метионина (например, как артефакт прямой экспрессии белка в культуре рекомбинантных бактерий) или другого аминокислотного остатка или последовательности. Другим примером аминотерминальной инсерции служит слияние с сигнальной последовательностью (или же с другими пре-про последовательностями) для облегчения секреции белка из рекомбинантных клетокхозяев. Каждый полипептид может включать сигнальную последовательность, отобранную для распознавания и процессинга ( например,разрезания сигнальной пептидазой) в клеткаххозяевах. Для прокариотических клеток-хозяев,которые не распознают и не процессируют природную сигнальную последовательность IL-1ra,каждый полипептид может включать прокариотическую сигнальную последовательность, выбранную, например, из группы, включающей последовательности щелочной фосфатазы, пенициллиназы или лидерные последовательности термостабильного энтеротоксина II. Для дрожжевых клеток каждый полипептид может иметь сигнальную последовательность, выбранную,например, из группы, включающей лидерные последовательности дрожжевой инвертазы,альфа-фактора или кислой фосфатазы. Для экспрессии в клетках млекопитающих каждый полипептид может иметь нативную сигнальную последовательность IL-1ra, хотя могут быть использованы и другие сигнальные последовательности млекопитающих, например, последовательности других членов семейства IL-1. К вариантам с дополнениями на карбоксиконцевом участке относятся химерные белки, в которых IL-1ra слит с частью или полным константным доменом тяжелой или легкой цепи иммуноглобулинов человека. В подобных химерных белках иммуноглобулиновая часть предпочтительно представлена всеми доменами за исключением первого домена константной области тяжелой цепи таких иммуноглобулинов человека, как IgG, IgA, IgM, IgE (IgG, IgG1IgG3). Специалисту очевидно, что любая аминокислота любой иммуноглобулиновой части может быть делетирована или заменена одной или несколькими аминокислотами, или же одна или несколько аминокислот могут быть добавлены при условии, что IL-1ra остается антагонистом 10 рецептора IL-1, а иммуноглобулиновая часть сохраняет одно или несколько своих характерных свойств. В случае вариантов IL-1ra с заменами, каждый из таких полипептидов характеризуется удалением хотя бы одной аминокислоты из IL1ra и вставкой на его место другого остатка. К вариантам с заменами относятся аллельные варианты, характеризующиеся природными заменами в нуклеотидных последовательностях в конкретных популяциях, которые могут приводить или не приводить к аминокислотным заменам. При выборе возможных сайтов мутации квалифицированный специалист может использовать любую доступную информацию о связывающем или активном сайте полипептида. Примеры вариантов с заменами приведены в WO 91/17184, WO 92/16221 и WO 96/09323. Один из методов идентификации аминокислотных остатков или областей для мутагенеза белков назван аланин-сканирующим мутагенезом (Cunningham and Wells (1989), Science,244:1081-1085, работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). При данном подходе идентифицируют аминокислотный остаток или группу целевых остатков (например, такие заряженные остатки, как Arg, Asp, His, Lys,Glu) и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (наиболее предпочтительно аланином или полиаланином) для изменения взаимодействия аминокислот с окружающей водной средой внутри или вне клетки. Такие остатки, проявляющие функциональную чувствительность к заменам, затем вычищают путем введения дополнительных или альтернативных остатков в места замен. Таким образом,сайт для введения модификации в аминокислотную последовательность оказывается предетерминированным и для оптимизации проведения мутации в данном сайте проводят сканирование аланина или случайный мутагенез, а полученный вариант полипептида скринируют в отношении оптимального сочетания нужной активности и степени этой активности. К сайтам, представляющим особый интерес для заместительного мутагенеза, относятся те сайты, в которых обнаруживаемые в IL-1ra аминокислоты существенно отличаются по наличию боковых цепей, заряду и/или гидрофобности от IL-1ra-подобных белков, таких как IL1ra других биологических видов или других членов семейства IL-1. Также представляют интерес сайты, в которых конкретные остаткиIL-1ra идентичны таковым в IL-1rа-подобных белках. Эти положения обычно важны для сохранения биологической активности белка. Исходно данные сайты модифицируют путем замен, вводимых относительно консервативным способом. Такие консервативные замены приведены в таблице 1 под заголовком Предпочтительные замены. Если подобные замены приводят к изменению биологической активности, 11 то далее проводят более существенные замены(Возможные замены). Могут быть также произведены и другие добавления или делеции с последующим скринингом полученных полипептидов. Таблица 1. Замены аминокислот Исходный остаток Предпочтительные Возможные замены замены А 1 а (А) Консервативные модификации аминокислотной последовательности (и соответствующие модификации кодирующей ее нуклеотидной последовательности) IL-1ra могут привести к образованию белков с аналогичными функциональными и химическими характеристиками. Наоборот, существенные модификации функциональных и/или химических свойств IL-1ra могут быть достигнуты отбором замен, которые значительно различаются по эффекту на поддержание (а) структуры полипептидного каркаса в области замены, например, сохранение плоской или спиральной структуры, (б) изменяют заряд или гидрофобность белка в сайте замены или (в) добавляют боковую цепь. Встречающиеся в природе остатки подразделяют на несколько групп на основе общих свойств боковой цепи: 1. гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2. нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr; 3. кислые: Asp, Glu; 4. основные: Asn, Gln, His, Lys, Arg; 5. ароматические: Тrр, Туr, Phe; 6. остатки, влияющие на ориентацию цепи: Gly, Pro. К неконсервативным заменам могут относиться замены одного из членов группы на другой. Такие заменяющие остатки могут вводиться в области IL-1ra, гомологичные или не гомологичные с другими представителями семействаIL-1. К конкретным мутациям в последовательности IL-1ra относятся замены неприродной аминокислоты на N-конце, С-конце или в любом месте белка, который модифицирован добавлением N-связанного или O-связанного углевода. Подобные модификации могут оказать 001792 12 ся особенно полезны, поскольку добавление аминокислоты (например, цистеина) может создавать преимущество при связывании с водорастворимым полимером с образованием производного, как описано ниже. Кроме того последовательность IL-1ra может быть модифицирована добавлением или удалением N-связанного или O-связанного сайта гликозилирования. Аспарагин-связанный сайт гликозилирования представляет собой трипептидную последовательность, которая специфически распознается соответствующими клеточными ферментами гликозилирования. Эти трипептидные последовательности имеют структуру Asn-Xaa-Thr илиAsn-Xaa-Ser, где Хаа может быть любой аминокислотой кроме Pro. В конкретном варианте осуществления изобретения варианты IL-1ra существенно гомологичны аминокислотной последовательности IL-1ra (SEQ ID NO:2). Термин существенно гомологичны означает степень гомологии, которая обычно превышает 70%,более предпочтительно превышает 80%, еще более предпочтительно превышает 90%, и наиболее предпочтительно составляет 95%. Процент гомологии вычисляют как процент аминокислотных остатков, обнаруживаемых в меньшей из двух последовательностей при сопоставлении с идентичными аминокислотными остатками в сравниваемой последовательности, при том что четыре пробела на 100 аминокислот могут быть введены для облегчения такого сопоставления, как описано Dayhoff in Atlas ofProtein Sequence and Structure, 5:124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.С. (работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). Существенно гомологичными считаются также варианты IL-1ra,которые могут быть выделены посредством перекрестной реактивности с антителами к аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2,или такие варианты, чьи гены могут быть выделены гибридизацией с ДНК SEQ ID NO.1 или ее сегментами. Получение вариантов IL-1ra подробно описано далее. Подобные варианты могут быть получены введением соответствующих нуклеотидных замен в ДНК, кодирующие варианты IL1 га, или же химическим синтезом нужных вариантов IL-1ra in vitro. Как очевидно квалифицированному специалисту, могут быть произведены многочисленные комбинации делеций, инсерций и замены, при том, что окончательные варианты IL-1ra будут сохранять биологическую активность. Методы мутагенеза, позволяющие заменить,вставить или делетировать один или несколько нужных аминокислотных остатков, хорошо известны из уровня техники (см., например, Патент США No. 4,518,584, упоминаемый в настоящем описании в качестве ссылки). Имеется две главных переменных при конструировании каждого варианта: локализация сайта мутации и 13 природа мутации. При конструировании каждого варианта локализация каждого сайта мутации и природа каждой мутации определяются биохимическими характеристиками, которые хотят изменить. Каждый мутационный сайт может быть модифицирован индивидуально или серийно, например, (1) первоначальной заменой каких-либо консервативных остатков и затем, в зависимости от полученного результата, введением более радикальной замены, (2) делецией конкретного аминокислотного остатка или (3) инсерцией одного или нескольких аминокислотных остатков вблизи избранного сайта. Квалифицированным специалистом, с учетом приведенного описания, могут быть получены химически модифицированные производные IL1ra и вариантов IL-1ra. С использованием гликозилированного, негликозилированного или дегликозилированного IL-1ra и вариантов IL-1ra можно получить конъюгаты. Обычно используют негликозилированный IL-1ra и варианты IL1ra. К приемлемым для дериватизации IL-1ra и вариантов IL-1ra химическим веществам относятся водорастворимые полимеры. Водорастворимые полимеры предпочтительны, поскольку связанный с ними белок не будет преципитировать в водной среде, в частности в физиологической среде организма. Предпочтительно, полимер должен быть фармацевтически приемлемым для приготовления терапевтического продукта или композиции. Квалифицированный специалист сможет выбрать нужный полимер с учетом изложенных соображений и в зависимости от того, будет ли конъюгат полимер/белок применяться терапевтически и, если будет, с учетом желаемой дозы, времени циркуляции и устойчивости к протеолизу. К удобным,клинически приемлемым водорастворимым полимерам относятся (но не ограничиваются перечисленными) полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиэтиленгликоль-пропиональдегид, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза,декстран, поливиниловый спирт (PVA), поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1.3.6 триоксан, сополимер этилена и малеинового ангидрида, поли-бета-аминокислоты (в виде гомополимеров или случайных сополимеров),поли(n-винилпирролидон) полиэтиленгликоль,гомополимеры пропиленгликоля (PPG) и другие полиалкиленовые оксиды, сополимеры полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (POG) (например, глицерол) и другие полиоксиэтилированные полиолы,полиоксиэтилированный сорбитол или полиоксиэтилированная глюкоза, колониковые кислоты или другие углеводородные полимеры, фиколл или декстран и смеси указанных соединений. В понятие полиэтиленгликоль входит любая форма полиэтиленгликоля, использованная для дериватизации других белков, напри 001792 14 мер, моно-(C1-C10)-алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль. Полиэтиленгликоль-пропиональдегид может иметь преимущества для производства из-за его стабильности в воде. Водорастворимые полимеры могут иметь любой молекулярный вес и быть разветвленными или неразветвленными. Обычно водорастворимые полимеры имеют средний молекулярный вес около 2 кД -100 кД (термин около означает,что в препарате водорастворимого полимера некоторые молекулы будут весить больше, некоторые меньше, в сравнении с указанным молекулярным весом). Средний молекулярный вес каждого водорастворимого полимера находится в пределах от около 5 кД до 50 кД, более предпочтительно - от 12 кД до 25 кД и наиболее предпочтительно составляет около20 кД. Обычно, чем выше молекулярный вес и чем больше разветвлен полимер, тем выше отношение полимер:белок. В зависимости от желательного терапевтического профиля (например,продолжительности контролируемого высвобождения; возможных эффектов на биологическую активность; простоты обращения; степени(или отсутствия ее) антигенности и других известных эффектов водорастворимого полимера на терапевтический белок) могут применяться полимеры с другим молекулярным весом. Водорастворимые полимеры должны прикрепляться к белку с учетом возможного влияния на функциональные и антигенные домены белка. В целом, может быть проведена химическая дериватизация в любых приемлемых условиях для реакции белка с молекулой активированного полимера. Активирующие группы, которые могут быть использованы для превращения полимера в активную молекулу, включают следующие группы: сульфон, малеимид, сульфгидрил, тиол, трифлат, тресилат, азидирин, оксиран и 5-пиридил. Водорастворимые полимеры обычно присоединяются к белку через - или аминогруппы аминокислот или реактивную тиоловую группу, но считается также, что водорастворимая группа может быть присоединена к любой реактивной группе белка, которая достаточно реактивна для присоединения водорастворимой группы в приемлемых условиях реакции. Так, водорастворимый полимер может быть ковалентно связан с белком через реактивную группу, например, свободную амино- или карбоксильную группу. К аминокислотным остаткам, имеющим свободную аминогруппу, относятся остатки лизина и N-терминальные аминокислотные остатки. Свободную карбоксильную группу имеют остатки аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и С терминальные аминокислотные остатки. К остаткам со свободной тиоловой группой относятся остатки цистеина. Методы получения белков, конъюгированных с водорастворимыми полимерами, обычно 15 предусматривают два этапа: (а) реакция белка с водорастворимым полимером в условиях, при которых белок оказывается соединенным с одним или более водорастворимым полимером и(б) выделение продукта реакции. Условия реакции для каждого случая конъюгации могут быть выбраны из известных из уровня техники и соответственно модифицированы, но обязательно должны исключать или ограничивать такие значения параметров реакции (температуры, присутствия растворителей, значения рН), которые могли бы инактивировать подлежащий модификации белок. В целом, оптимальные условия реакции определяют для каждого конкретного случая, исходя из известных параметров и желаемого результата. Например, чем выше отношение водорастворимый полимер:конъюгат белка, тем выше выход конъюгированного продукта. Оптимальное отношение (в смысле эффективности реакции, когда не имеется избытка не прореагировавших белка или полимера) определяется такими факторами, как желаемая степень дериватизации (например, моно-, ди-,три-, и т.д.), молекулярный вес выбранного полимера, разветвленности или неразветвленности полимера, а также условиями реакции. Соотношение водорастворимого полимера (например,ПЭГа) к белку обычно колеблется в пределах от 1:1 до 100:1. Один или более очищенный конъюгат может быть получен из каждой смеси стандартными методами очистки, к которым среди прочих относятся диализ, высаливание,ультрафильтрация, ионообменная хроматография, гель-фильтрация и электрофорез. При желании может быть получен химически модифицированный по N-концу белок. Выбирают водорастворимый полимер соответствующего молекулярного веса, разветвленности и т.п., определяют соотношение водорастворимого полимера и белка (или пептида) в реакционной смеси, тип осуществляемой реакции и метод выделения выбранного химически модифицированного поN-концу белка. Метод получения препарата химически модифицированного по N-концу белка(например, отделение, при необходимости, данной формы от других монодериватизированных форм) может представлять собой очистку Nтерминально химически модифицированного белка из популяции молекул химически модифицированного белка. Избирательная Nтерминальная химическая модификация может быть проведена путем восстановительного алкилирования, при котором используется различающаяся реактивность различных типов первичных аминогрупп (лизина против Nтерминальных), доступных для дериватизации в конкретном белке. В соответствующих условиях реакции достижима существенная селективная дериватизация белка по N-концу с полимером, содержащим карбонильную группу. Например, можно избирательно прикрепить водорастворимый полимер к N-концу белка прове 001792 16 дением реакции при таком значении рН, которое позволяет использовать преимущество в разнице между рКа -аминогруппы остатков лизина и -аминогруппы N-терминального остатка белка. При такой избирательной дериватизации прикрепление водорастворимого полимера к белку контролируемо: конъюгация с полимером происходит преимущественно по Nконцу белка без существенной модификации других реактивных групп, таких как аминогруппы боковых цепей лизина. Для проведения восстанавливающего алкилирования водорастворимый полимер может принадлежать к одному из описанных выше типов и должен иметь один реакционноспособный альдегид для связывания с белком. Может быть использован полиэтиленгликоль-пропиональдегид,содержащий единственный реакционноспособный альдегид. В соответствии с настоящим изобретением заявлен химически дериватизированный белок, включая его моно- или поли- (например,2-4) ПЭГ-производные. Пэгирование может быть проведено любой известной из уровня техники реакцией. Методы получения ПЭГированнного белкового продукта обычно предусматривают два этапа: (а) реакция белкового продукта с полиэтиленгликолем (например, реакционноспособным эфиром или альдегидным производным ПЭГа) в условиях, при которых белок оказывается соединенным с одной или более группами ПЭГа и (б) выделение продукта(или продуктов) реакции. В целом, оптимальные условия реакции определяют для каждого конкретного случая, исходя из известных параметров и желаемого результата. Имеется ряд дополнительных методов,доступных квалифицированному специалисту. См., например, заявку ЕР 0 401 384, упоминаемую в настоящем описании в качестве ссылки; а также Malik et al., (1992), Exp.Hematol., 20:10281035; Francis (1992), Focys on Growth Factors,3(2):4-10. (published by Mediscript, MountainCourt, Friern Barnet Lane, London N20 OLD, UK); ЕР 0 154 316; ЕР 0 401 384; WO 92/16221; WO 95/34326 и другие публикации, упоминаемые в настоящем описании в качестве ссылок. В частности, пэгирование может быть осуществлено посредством реакций ацилирования или алкилирования с реактивной молекулой полиэтиленгликоля. Таким образом, к заявленным в настоящем изобретении белковым продуктам относятся также и пэгированные белки,в которых группы ПЭГа присоединены через ацильные или алкильные группы. Эти продукты могут быть моно-пэгированными или полипэгированными (например, содержать 2-6, а предпочтительно 2-5 групп ПЭГа). Группы ПЭГа обычно присоединяются к белку через - или-аминогруппы аминокислот, но считается также, что группы ПЭГ могут быть присоединены к любой аминогруппе белка, которая достаточно 17 реакционноспособна для присоединения группы ПЭГ в приемлемых условиях реакции. При пэгировании ацилированием обычно происходит реакция активных эфирных производных полиэтиленгликоля (ПЭГ) с белком. Для реакции ацилирования выбранный полимер (или полимеры) должны обладать одной реактивной эфирной группой. Для проведении реакции пэгирования может быть использована любая из известных или открытых впоследствии реактивная молекула ПЭГ. Предпочтительным активированным эфиром ПЭГ является ПЭГ, этерифицированный N-гидроксисукцинимидом (NHS). Считается, что термин ацилирование включает без ограничений следующие типы связей между терапевтическим белком и таким водорастворимым полимером, как ПЭГ: амидная,карбаматная, уретановая и им подобные (см.Chamow (1994), Bioconugate Chem., 5(2):133140). Условия реакции могут быть выбраны из известных из уровня техники условий реакций пэгирования и соответственно модифицированы, но должны исключать такие значения параметров реакции (температуры, присутствия растворителей, значения рН), которые могли бы инактивировать подлежащий модификации белок. Пэгирование ацилированием обычно приводит к получению полипэгированного белка. Предпочтительно, связующим звеном является амид. Также предпочтительно, чтобы полученный продукт был по существу (например, 95%) моно-, ди- или трипэгированным. Однако могут образовываться образцы с более высокой степенью пэгирования, количество которых зависит от конкретных условий реакции. При желании более очищенные пэгированные образцы могут быть отделены от смеси (в частности, не прореагировавшего ПЭГа) стандартными методами очистки, к которым среди прочих относятся диализ, высаливание, ультрафильтрация, ионообменная хроматография, гель-фильтрация и электрофорез. Для пэгирования алкилированием обычно требуется реакция терминального альдегидного производного ПЭГа с белком в присутствии восстанавливающего агента. Для восстановительной реакции алкилирования выбранный полимер (полимеры) должен иметь одну реактивную альдегидную группу. Примером реактивного альдегида ПЭГ служит полиэтиленгликоль-пропиональдегид, который стабилен в воде, или его моно С 1-С 10 алкокси- или арилоксипроизводные (см. Патент США 5,252,714). Пэгирование алкилированием может также приводить к получению полипэгированного белка. Можно подобрать условия реакции для предпочтительного пэгирования только аминогрупп на N-конце белка (т.е. получения монопэгированного белка). При монопэгировании и полипэгировании группы ПЭГа предпочтительно связваются с белком через -СН 2-NН 001792 18 группы. С учетом роли -СН 2-группы такой тип связи обозначается как алкильная связь. Восстановительное алкилирование для получения по существу гомогенной популяции продукта монополимер/белок обычно включает два этапа: (а) взаимодействие белка с реактивной молекулой ПЭГа в условиях восстановительного алкилирования, при значении рН,обеспечивающем избирательную модификацию(б) выделение продукта (или продуктов) реакции. Дериватизация путем восстановительного алкилирования использует преимущество в разнице между рКа аминогрупп остатков лизина и(рКа представляет собой такое значение рН, при котором 50% аминогрупп протонировано, а 50%- нет). Реакцию проводят при таком значении рН,которое позволяет использовать преимущество в разнице между рКа -аминогруппы остатков лизина и -аминогруппы N-терминального остатка белка. Вообще, если значение рН ниже,требуется больший избыток полимера по сравнению с белком (т.е. чем меньше доступно Nтерминальных реактивных -аминогрупп, тем больше полимера требуется для достижения оптимальных условий. Если значение рН выше(т.е. доступно больше реактивных групп, соответственно требуется меньше молекул полимера). Для целей настоящего изобретения значение рН обычно находится в пределах 3-9, предпочтительно 3-6. Для восстановительного алкилирования восстанавливающий агент должен быть стабилен в водном растворе и предпочтительно восстанавливать только Шиффово основание, образовавшееся на начальных этапах восстановительного алкилирования. Подходящие восстанавливающие агенты могут быть выбраны из группы, включающей борогидрид натрия, цианоборогидрид натрия, диметиламинборан, триметиламинборан и пиридинборан. Особенно удобным восстанавливающим агентом является цианоборогидрид. Другие параметры реакции, такие как растворитель, время реакции, температуры и способ очистки продуктов, определяют конкретно для каждого случая,основываясь на опубликованной информации по дериватизации белков водорастворимыми полимерами. При такой избирательной дериватизации прикрепление водорастворимого полимера (содержащего такую реакционноспособную группу, как альдегид) к белку контролируемо: конъюгация с полимером происходит преимущественно по N-концу белка без существенной модификации других реактивных групп, таких как аминогруппы боковых цепей лизина. Препарат обычно состоит более чем на 90% из конъюгата белка с монополимером, более типично, более чем на 95% из конъюгата белка с монополиме 19 ром, при этом оставшаяся часть молекул в реакцию не вступила (т.е. белок без полимерных групп). Пэгирование может быть также осуществлено посредством водорастворимых полимеров, имеющих, по меньшей мере, одну реактивную гидроксигруппу (например, полиэтиленгликоля). При этом водорастворимый полимер вступает в реакцию с реагентом, обладающим карбонильной, нитрильной или сульфоновой группой, для конверсии гидроксильной группы в реактивный акцептор Михаэля, образуя тем самым активированный линкер, пригодный для модифицирования различных белков с получением улучшенных биологически активных конъюгатов. Реактивный карбонил, нитрил или сульфон означает карбонильную, нитрильную или сульфоновую группу, с которой связана вторая карбоновая группа с образованием реактивного сайта для тиол-специфического связывания второго углерода карбонильной, нитрильной или сульфоновой группы (WO 92/16221). Активированные линкеры могут быть монофункциональными, бифункциональными или многофункциональными. К реактивам, имеющим реактивные сульфоновые группы, и которые могут быть использованы в данных методах, относятся без ограничений хлоросульфон,винилсульфон и дивинилсульфон. В специфическом варианте осуществления изобретения водорастворимый полимер активирован акцептором Михаэля. В заявке WO 95/13312 описаны, inter alia, водорастворимые сульфон-активированные полиэтиленгликоли,высоко селективные для связывания с тиоловыми группами вместо аминогрупп на молекулах или поверхностях. Эти производные ПЭГа устойчивы к гидролизу при нахождении длительное время в водной среде и к рН 11 или ниже, а также образуют связи с молекулами, что приводит к образованию гидролитически стабильных конъюгатов. Связь между ПЭГом и биологически активной молекулой достигается за счет связи между сульфоновой группой и тиоловой группой, что приводит к образованию структуры PEG-SO2-CH2-CH2-S-W, где W обозначает биологически активную молекулу, и где сульфоновая группа представлена винилсульфоном или активным этилсульфоном. Особенно полезны два гомобифункциональные производные, а именно ПЭГ-бис-хлоросульфон и ПЭГ-бисвинилсульфон. В заявке на Патент США No 08/473,809,поданной 7 июня 1995 г. и включенной в настоящее описание в качестве ссылки, описаны способы получения сульфон-активированных линкеров путем получения соединения, имеющего реактивную гидроксильную группу, и конверсии гидроксильной группы в реактивный акцептор Михаэля с образованием активированного линкера. При этом в качестве растворителя для конверсии используется тетрагидрофуран(THF). В заявке на Патент США No. 08/611,918, 001792 20 поданной 6 марта 1996, и приведенной в настоящем описании в качестве ссылки, описан процесс очистки активированных линкеров с применением хроматографии гидрофобного взаимодействия для разделения линкеров на основе размера и функции концевой группы. Полинуклеотиды Настоящее изобретение относится также к полинуклеотидам, кодирующим IL-1-ra и варианты IL-1ra. Основываясь на настоящем описании и используя универсальную таблицу кодонов, любой квалифицированный специалист может легко определить все нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности IL-1-ra и вариантов IL1ra. Методы рекомбинантной экспрессии, осуществленные в соответствии с приведенным ниже описанием, могут быть применены для получения таких полинуклеотидов и экспрессии кодируемых ими белков. Например, путем введения нуклеотидной последовательности, кодирующей IL-1-ra или вариант IL-1ra в соответствующий вектор, квалифицированный специалист может легко получить большие количества нужной нуклеотидной последовательности. Затем последовательности могут быть использованы для получения проб для гибридизации или праймеров для амплификации. Альтернативно,полинуклеотид, кодирующий IL-1-ra или вариант IL-1ra, может быть введен в вектор экспрессии. При введении вектора экспрессии в соответствующие хозяйские клетки можно получить большие количества нужного белка. Как видно из дальнейшего описания, существуют многочисленные системы хозяин/вектор, пригодные для получения нужных нуклеотидных последовательностей и/или продукции нужных белков. К ним относятся, но не ограничиваются перечисленными, плазмидныe, вирусные и инсерционные векторы и прокариотические и эукариотические клетки-хозяева. Квалифицированный специалист может адаптировать систему хозяин/вектор для наращивания и экспрессии гетерологичной ДНК с целью получения или экспрессии заявленных в настоящем изобретении последовательностей. Кроме того, как следует из настоящего описания и что очевидно квалифицированному специалисту, нуклеотидные последовательности включают вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие IL-1ra и имеющие последовательность, приведенную на фиг. 5, а также нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются (предпочтительно в жестких условиях гибридизации) с данными нуклеотидными последовательностями [Maniatis et al.,(1982), Molecular Cloning ( A Laboratory Manual),Cold Spring Harbor Laboratory, pp. 387-389]. Примером гибридизации в жестких условиях служит гибридизация в 4 х SSC при 62-67 с последующей отмывкой в 0.1 х SSC при 62-67 в течение часа. Альтернативно, жесткую гиб 21 ридизацию можно провести в 45-55%-ном формамиде, 4 х SSC при 40-45. В объем настоящего изобретения также включены последовательности ДНК, которые гибридизуются с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 в мягких условиях гибридизации и которые кодируют варианты IL-1ra. Примерами таких мягких условий гибридизации могут служить гибридизация в 4 х SSC при 45-55 С или гибридизация в 30-40 %-ном формамиде при 40-45. В настоящем изобретении также заявлены рекомбинантные ДНК-конструкты, включая векторную ДНК вместе с последовательностями ДНК,кодирующими нужные белки. В каждом из таких ДНК-конструктов нуклеотидные последовательности, кодирующие нужные белки (с сигнальными пептидами или без них), функционально связаны с приемлемыми регуляторными последовательностями, способными направлять репликацию и/или экспрессию нужного белка в определенном хозяине. Рекомбинантная экспрессия Получение полинуклеотидов Нуклеотидные последовательности, кодирующие IL-1-га или варианты IL-1ra, могут быть получены различными способами, включая (но не ограничиваясь перечисленными) химический синтез, скрининг геномных и кДНКовых библиотек, скрининг экспрессионных библиотек и/или ПЦР-амплификация кДНК. Данные методы, а также и другие, пригодные для выделения искомых нуклеотидных последовательностей, описаны в следующих руководствах: Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborGuide to Molecular Cloning Techniques, Vol.152,Academic Press, Inc., San Diego, CA., которые включены в настоящее описание в качестве ссылок. Химический синтез нуклеотидных последовательностей проводят в соответствии с методами, хорошо известными из уровня техники,описанными, например, в работах Engels et al.,(1989), Angew Chem. Intl. Ed., 28:716-734 иWells et al., (1985), Gene, 34:315, включенных в настоящее описание в качестве ссылок. Эти методы включают фосфотриэфирный, фосфорамидатный и Н-фосфонатный методы синтеза нуклеотидных последовательностей. Большие нуклеотидные последовательности,например,длиннее 100 нуклеотидов, могут быть синтезированы в виде нескольких фрагментов. Затем фрагменты лигируют друг с другом и получают нуклеотидные последовательности, кодирующие нужный белок. Предпочтительным методом является синтез на полимерной подложке с использованием обычной химии фосфорамидатов. 22 Альтернативно, искомые нуклеотидные последовательности можно получить при скрининге соответствующих кДНКовых библиотек(например, библиотеки, полученной из одной или нескольких тканей, в которых экспрессируется данный белок) или геномных библиотек(библиотека, полученная из тотальной геномной ДНК). Источником для получения кДНКовой библиотеки обычно служит ткань любого вида,в которой данный белок экспрессируется в приемлемых количествах. Источником для получения геномной библиотеки могут быть любая ткань или ткани любого млекопитающего или животных других видов, в которой имеется ген,кодирующий нужный белок. Гибридизационные смеси могут быть проскринированы на наличие ДНК, кодирующей нужный белок, с применением одного или более нуклеотидных зондов (олигонуклеотиды, кДНК или фрагменты геномной ДНК, обладающие достаточным уровнем гомологии с кДНК или геном, который нужно проклонировать), которые будут избирательно гибридизоваться с кДНК или геном, присутствующим в библиотеке. Используемые для такого скрининга пробы обычно представляют собой небольшой фрагмент ДНК того же или сходного вида, что и вид животного, из клеток которого получена библиотека. Альтернативно, зонды могут быть вырожденными, что обсуждается далее. Обычно гибридизацию проводят путем отжига олигонуклеотидного зонда или кДНК с клонами в условиях такой жесткости, которая предотвращает неспецифическое связывание, но делает возможным связывание с зондом или праймером тех клонов, которые обладают значительным уровнем гомологии. Обычно параметры жесткости гибридизации и последующих отмывок зависят от размера (т.е., числа нуклеотидов) кДНК или олигонуклеотидного зонда, а также от того, является ли зонд вырожденным. При составлении гибридизационной смеси учитывается также вероятность идентификации клона (т.е. скринируется кДНКовая или геномная библиотека). Когда в качестве зонда используют фрагмент ДНК (такой, как кДНК), то условия гибридизации выбирают, как описано Ausubel et al.,(1994), eds, Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press. После гибридизации гибридизационную среду отмывают в условиях подходящей жесткости, которая зависит от таких факторов, как размер зонда, ожидаемая гомология зонда и клона, характер скринируемой гибридизационной среды, число скринируемых клонов и т.д. Далее приведены примеры жестких отмывочных растворов, которые обычно имеют низкую ионную силу и применяются при сравнительно высоких температурах: 1) 0.015 М 23 Например, в одном из протоколов используется 6 х SSC с 0.05% пирофосфата натрия при температуре от 35 С до 63 С, в зависимости от длины зонда. Например, зонд, состоящий из 14 ти оснований, отмывают при 35-40 С, из 17-ти при 45-50 С, из 20-ти - при 52-57 С и из 23-х при 57-63 С. При повышенном неспецифическом (фоновом) связывании температура может быть повышена на 2-3 С. В другом протоколе для отмывки используется хлорид тетраметиламмония (ТМАС). В состав одного из жестких отмывочных растворов входят 3 М ТМАС,50 mM Tris-HCl, pH 8.0 и 0.2% SDS. Другим удобным методом получения нужной нуклеотидной последовательности является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В этом случае кДНК получают из поли(А)+РНК или тотальной РНК с помощью фермента обратной транскриптазы. К кДНК добавляют два праймера (олигонуклеотиды), обычно комплементарные двум различным областям кДНК, а также полимеразу,например, Taq полимеразу. При этом полимераза амплифицирует область кДНК между праймерами. Олигонуклеотидные последовательности,отобранные в качестве зондов или праймеров,должны иметь достаточную длину и быть достаточно недвусмысленными, чтобы минимизировать неспецифическое связывание, которое может иметь место при скрининге или ПЦРамплификации. Дополнительно, зонды или праймеры могут быть полностью или частично вырожденными, т.е. представлять собой смесь зондов/праймеров, в совокупности кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность, но использующих для этого различные кодоны. Альтернатива получению вырожденных зондов состоит во введении инозина в некоторые или во все кодоны, положение которых варьирует в зависимости от биологического вида. Олигонуклеотидные зонды или праймеры могут быть получены методами химического синтеза ДНК, как описано выше. Векторы ДНК, кодирующая нужные белки, может быть встроена в векторы для дальнейшего клонирования (амплификации ДНК) или экспрессии. Могут быть использованы коммерчески доступные векторы или же вектор конструируют специально. Выбор или конструирование соответствующего вектора определяются несколькими параметрами: 1) будет ли данный вектор использован для амплификации ДНК или для экспрессии ДНК, 2) размер ДНК, встраиваемой в вектор, 3) предполагаемая клеткахозяин, которая будет трансформирована вектором. В любом векторе нуклеотидная последовательность, кодирующая нужный белок, оперативно связана с одной или более регуляторной последовательностью, которые способны направлять, контролировать и вообще как-либо влиять на экспрессию данного белка в конкрет 001792 24 ных хозяйских клетках. Каждый вектор содержит различные компоненты в зависимости от его назначения (амплификация ДНК или экспрессия ДНК) и совместимости с определенными хозяйскими клетками. В состав вектора обычно входят следующие компоненты (без ограничения перечисленными): сигнальная последовательность, начало репликации, один или более селективный(е) или маркерный(е) ген(ы),промотор, энхансер, последовательность терминации транскрипции и подобные указанным. Данные компоненты могут быть получены из природных источников или же синтезированы известными методами. К подходящим прокариотическим векторам клонирования относятся бактериофаги, в частности производные фага лямбда, плазмиды E.coli (например, pBR322, colBluescript (Stratagene, LaJolla, CA. Могут использоваться другие векторы экспрессии, многочисленные виды которых известны из уровня техники и которые совместимы с описанными ниже клетками-хозяевами. Сигнальная последовательность Нуклеиновая кислота, кодирующая сигнальную последовательность, может быть пристроена к 5'-концу последовательности, кодирующей нужный белок, т.е., она может быть компонентом вектора или являться частью нуклеотидной последовательности, кодирующей нужный белок. Например, известна нуклеиновая кислота, кодирующая природную сигнальную последовательность IL-1ra (Патент СШАNo.5,075,222). Начало репликации Векторы клонирования и экспрессии обычно включают нуклеотидные последовательности, обеспечивающие вектору возможность репликации в одном или нескольких типах клеток-хозяев. В случае вектора клонирования такая последовательность дает вектору возможность реплицироваться независимо от хозяйской хромосомной ДНК и включает начало репликации или автономно реплицирующуюся последовательность. Такие последовательности хорошо известны. Начало репликации плазмидыpBR322 приемлемо для большинства грамотрицательных бактерий, а различные другие начала репликации (например, вируса SV40, вирусов полиомы, аденовируса, VSV или BPV) пригодны для векторов, предназначенных для клонирования в клетках млекопитающих. Обычно начало репликации не является необходимым для векторов, предназначенных для экспрессии в клетках млекопитающих (например, начало репликации SV40 часто используют только потому, что оно содержит ранний промотор). Селективный ген Векторы клонирования и экспрессии обычно содержат селективный ген. Данный ген кодирует маркерный белок, необходимый для выживания или роста трансформированной 25 клетки-хозяина при выращивании на селективной культуральной среде. Нетрансформированные вектором клетки не будут содержать селективного гена и потому не выживут в данной культуральной среде. Типичные селективные гены кодируют белки, которые а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам: например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину; б) комплементируют ауксотрофные недостаточности или в) предоставляют критически важные питательные вещества, недоступные из культуральной среды. Другие селективные гены используют для амплификации экспрессируемых генов. Амплификация представляет собой процесс, при котором гены, кодирующие нужный белок, и гены, необходимые для роста клеток, тандемно повторяются снова и снова в хромосомах последовательных поколений рекомбинантных клеток. Примерами селективных маркеров, подходящих для клеток млекопитающих, служат дигидрофолатредуктаза (DHFR) и тимидинкиназа. Клеткитрансформанты выращивают под селективным давлением, при котором, благодаря перенесенному вектором маркеру выживают только истинные трансформанты. Селективное давление обеспечивается культивированием трансформированных клеток в условиях последовательно повышающейся концентрации селективного агента в среде, что приводит к амплификации селективного гена и ДНК, кодирующей нужный белок. В результате на амплифицированной ДНК синтезируются повышенные количества нужного белка. Например, клетки, трансформированные селективным геном DHFR, были впервые выделены путем культивирования всей совокупности трансформантов в культуральной среде с метотрексатом, конкурентным антагонистом DHFR. Подходящими клетками-хозяевами для DHFR дикого типа являются клетки яичника китайского хомячка, дефицитные по активности DHFRU.S.A77(7)-4216-4220: работа приведена здесь в качестве ссылки). Трансформированные клетки культивировали при повышающихся концентрациях метотрексата. Это приводило к синтезу множественных копий гена DHFR и, сопутствующим образом, множественных копий другой ДНК, присутствующей в векторе экспрессии,например ДНК, кодирующей нужный белок. Промотор Как экспрессионный, так и векторы клонирования, обычно содержат промотор, который распознается хозяйским организмом и функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нужный белок. Промотор представляет собой нетранслируемую последовательность, расположенную выше(5') стартового кодона структурного гена (обычно в пределах 100-1000 пар оснований), которая контролирует транскрипцию и трансляцию кон 001792 26 кретной последовательности нуклеиновой кислоты, в частности, кодирующей нужный белок. Промоторы обычно подразделяют на два класса: индуцибильные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибильные промоторы индуцируют усиление транскрипции ДНК, находящейся под их контролем, в ответ на какие-либо изменения в условиях культивирования, например температурный сдвиг или наличие или отсутствие какого-либо питательного вещества. Известно большое число промоторов, распознаваемых разнообразными клетками-хозяевами. Промотор может быть функционально связан с ДНК, кодирующей нужный белок путем рестрикционного удаления существующего промотора из ДНК и вставкой нужной промоторной последовательности. Нативная промоторная последовательность IL-1ra может быть использована для контроля амплификации и/или экспрессии ДНК, кодирующей нужный белок. Гетерологичный промотор, однако, является более предпочтительным, поскольку он допускает более высокий уровень транскрипции и обеспечивает более высокий уровень выхода экспрессируемого белка в сравнении с нативным промотором при том, что он совместим с выбранной клеточной системой экспрессии. Например,любая из нативных промоторных последовательностей любого из членов семейства IL-1 может быть использована для контроля амплификации и/или экспрессии ДНК, кодирующей нужный белок. К промоторам, удобным для использования в прокариотических хозяевах, относятся бета-лактамазный и лактозный промотор; промотор щелочной фосфатазы и триптофановая (tpr) промоторная система; система гена бактериальной люминесценции (luxR) и такие гибридные промоторы, как tac промотор. Приемлемы также и другие известные бактериальные промоторы. Их нуклеотидные последовательности опубликованы, что дает возможность квалифицированному специалисту лигировать их с нужными последовательностями ДНК с применением линкеров или адапторов,необходимых для создания желаемых сайтов рестрикции. Из уровня техники известны также удобные промоторные последовательности для использования в клетках дрожжей. Известны промоторы для использования в клеткаххозяевах млекопитающих, включая промоторы,выделенные из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы птиц, аденовирус (например, аденовирус типа 2), вирус бычьей папилломы, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирусы, вирус гепатита В и, наиболее предпочтительно, обезьяньего вируса 40 (SV40). К другим удобным промоторам млекопитающих относятся гетерологичные промоторы млекопитающих, например, промоторы теплового шока и промотор актина. 27 Энхансер Как экспрессионный, так и векторы клонирования обычно содержат энхансерные последовательности для усиления транскрипции в клетках высших эукариот последовательностей ДНК, кодирующих нужный белок. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно длиной 10-300 пар оснований,которые влияют на промотор, усиливая транскрипцию. Энхансеры имеют относительную ориентацию и их активность зависит от локализации. Они могут быть расположены как с 5'конца, так и с 3'-конца транскрипционной единицы. Дрожжевые энхансеры преимущественно используют с дрожжевыми промоторами. Известны энхансерные последовательности ряда генов млекопитающих (например, глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и инсулина). Примерами энхансерных элементов, активирующих эукариотические промоторы, служат вирусные энхансеры, такие как энхансерSV40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансер аденовируса. При том, что энхансер может быть встроен в вектор как в 5'-положении, так и 3'положении по отношению к фрагменту ДНК,кодирующему нужный белок, обычно он занимает 5'-положение относительно промотора. Терминация транскрипции Экспрессионные векторы, применяемые в эукариотических клетках-хозяевах, обычно содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Подобные последовательности обычно находятся в 5'- (и иногда в 3'-) нетранслируемых областях эукариотических ДНК или кДНК. Данные области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые как полиаденилированные фрагменты в нетранслируемой части мРНК, кодирующей нужный белок. Конструирование вектора Конструирование приемлемых векторов,содержащих один или более из перечисленных выше компонентов (вместе со смысловыми областями, кодирующими нужный белок) может быть проведено стандартными методами лигирования. Выделенные плазмиды или фрагменты ДНК разрезают, кроят и заново лигируют в нужном порядке для получения необходимого вектора. Чтобы убедиться, что сконструирована правильная последовательность, лигирующей смесью трансформируют E.coli и трансформантов отбирают известными способами, как описано выше. Затем из трансформантов выделяют вектор, подвергают рестрикционному анализу и/или секвенированию для подтверждения наличия нужного конструкта. Может быть использован также и вектор, обеспечивающий транзиторную экспрессию ДНК, кодирующей нужный белок, в клетках млекопитающих. Вообще говоря, транзиторная экспрессия предусматривает использование вектора экспрессии, который 28 способен эффективно реплицироваться в клетках-хозяевах, так что в клетках аккумулируется множество копий экспрессионного вектора и,затем, синтезируются большие количества нужного белка, кодируемого вектором экспрессии. Каждая система транзиторной экспрессии, состоящая из соответствующего вектора экспрессии и клеток-хозяев, обеспечивает удобную идентификацию белков, кодируемых клонированными ДНК, а также возможность быстрого скрининга данных белков в отношении нужных биологических или физиологических свойств,например, позволяет проводить идентификацию биологически-активного варианта белка IL-1ra. Клетки-хозяева В объем настоящего изобретения включены также любые рекомбинантные клеткихозяева, содержащие нуклеотидную последовательность, необходимую для экспрессии нужного белка. Примерами прокариотических и эукариотических клеток-хозяев служат клетки бактерий, млекопитающих, грибов, насекомых,дрожжей или растений. К прокариотическим клеткам-хозяевам относятся (но не ограничиваются перечисленными) эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные организмы (например,E.coli (HB101, DH5a, DH10 и МС 1061); Bacilli,такие как B.subtilis; Pseudomonas, такие как Р.aeruginosa; Streptomyces spp.; Salmonella typhymurium или Serratia marcescans. Примером конкретного осуществления изобретения может служить экспрессия нужного белка в E.coli. В дополнение к прокариотическим клеткам-хозяевам приемлемыми хозяевами для экспрессии нужного белка могут служить такие эукариотические микроорганизмы, как нитчатые грибы и дрожжи. Saccharomyces cerevisae,или обычные пекарские дрожжи, являются наиболее широко используемыми низшими эукариотами-хозяевами, однако хорошо известны и широко доступны представители и других родов, видов и штаммов. Нужный белок можно экспрессировать в гликозилированной форме в каких-либо клетках-хозяевах, полученных из многоклеточного организма. Такие клеткихозяева обеспечивают сложный процессинг и гликозилирование белка. В принципе, можно использовать культуру любых эукариотических клеток позвоночных и беспозвоночных, включая клетки растений и насекомых. Примером конкретного осуществления изобретения может служить экспрессия нужного белка при помощи бакуловирусной системы в клетках насекомых. Наращивание клеток позвоночных в культуре(культура тканей) является хорошо известным подходом и поэтому в качестве клеток-хозяев могут быть использованы клетки позвоночных. Примерами полезных клеточных линий млекопитающих могут служить (но не ограничиваются перечисленными) клетки почки обезьяны линии CV1, трансформированные SV40 (COS 29 7), линия клеток почки эбриона человека (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре), клетки почки хомячка и клетки яичника китайского хомячка. К другим приемлемым линиям клеток млекопитающих относятся (но не ограничиваются перечисленными) клетки HeLa, мышиные клетки L929, линии клеток ЗТЗ, полученные из мышейSwiss, Balb-c или NIH, а также линии клеток хомячка ВНК или НаК. Примером конкретного осуществления изобретения может служить экспрессия нужного белка в клетках COS. Клетки-хозяева могут быть трансфицированы (или трансформированы) нужной нуклеиновой кислотой в соответствующих условиях,обеспечивающих экспрессию нуклеотидной последовательности. Методы отбора нужных клеток-хозяев, а также методы трансформации,культивирования, амплификации, скрининга,также, как и методы получения и очистки продукта, хорошо известны из уровня техникиNo. 4,419,446; указанные источники информации приведены здесь в качестве ссылок). Например, для клеток млекопитающих, не имеющих клеточной стенки, может быть использован метод кальций-фосфатной преципитации. Могут быть использованы электропорация, микроинъекция и другие известные методы. Кроме того, имеется возможность получения нужного белка гомологичной рекомбинацией или методами рекомбинантных нуклеиновых кислот с использованием контролирующих элементов, введенных в клетки, уже содержащие ДНК, кодирующую нужный белок. Гомологичная рекомбинация представляет собой метод,первоначально разработанный для таргетинга(нацеливания) генов для индукции или коррекции мутаций в транскрипционно-активных генах (Kucherlapati (1989), Prog. In Nucl. AcidRes. And Mol. Biol., 36:301; работа упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). Первоначальный подход был разработан как метод введения специфических мутаций в конкретные области генома млекопитающих (Thomas et al.,(1986), Cell, 44:419-428; Thomas and Capecchi(1987), Cell, 51:503-512 и Doetschman et al.,(1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:85838587; все работы упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок) или для коррекции специфических мутаций в дефектных генах(Doetschman et al., (1987), Nature, 330: 576-578; работа также упоминается в настоящем описании в качестве ссылки). Примерами могут служить способы, описанные в Патенте США No. 5,272,071; заявках WO 92/01069; WO 93/03183;WO 94/12650 и WO 94/31560, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок). Посредством гомологичной рекомбинации,поледовательность ДНК, которая должна ока 001792 30 заться встроенной в геном, может быть направлена в специфическую область представляющего интерес гена. Достигается это прикреплением ее к нацеливающей ДНК. Нацеливающая ДНК - это ДНК, комплементарная (гомологичная) некоторой области геномной ДНК. Небольшие фрагменты нацеливающей ДНК, комплементарные конкретной области генома, входят в контакт с родительской нитью ДНК во время процесса репликации ДНК. Общим свойством перенесенной в клетку ДНК является способность гибридизоваться и потому рекомбинировать с другими фрагментами эндогенной ДНК через области общей гомологии. Если такая комплементарная нить прикреплена к олигонуклеотиду, содержащему мутацию или другую последовательность ДНК, она также встраивается во вновь синтезируемую нить в результате рекомбинации. В результате функции проверки считывания появляется вероятность того, что новая последовательность ДНК будет служить матрицей. Таким образом, перенесенная ДНК оказывается встроенной в геном. Если известна последовательность конкретного гена, в частности нуклеотидная последовательность, кодирующая нужный белок,можно синтезировать (или получить другим способом, например, соответствующей рестрикцией нативной ДНК в специфических сайтах, ограничивающих нужную область) последовательность, контролирующую экспрессию(фрагмент ДНК, комплементарный выбранной области гена). Такой фрагмент служит нацеливающей последовательностью при введении в клетку и будет гибридизоваться с гомологичной ему областью генома. Если подобная гибридизация происходит при репликации ДНК, то такой фрагмент ДНК и любые прикрепленные к нему дополнительные последовательности будут работать как фрагменты Оказаки и будут встроены во вновь синтезируемую дочернюю нить ДНК. Прикрепленными к фрагментам нацеливающей ДНК оказываются такие участки ДНК,которые могут влиять на экспрессию представляющего интерес белка. Например, промотор/энхансер, супрессор или экзогенный элемент, модулирующий транскрипцию, встраиваются в геном клетки-хозяина в такой ориентации и близости, которые достаточны для влияния на транскрипцию представляющего интерес белка. Контролирующие элементы не кодируют нужный белок, но контролируют определенную часть ДНК генома клетки-хозяина. Таким образом, экспрессия нужного белка может быть достигнута не трансфекцией кодирующей его ДНК,а использованием нацеливающей ДНК (содержащей области гомологии с эндогенным представляющим интерес геном) в сочетании с регуляторными элементами ДНК, обеспечивающими последовательность эндогенного гена узна 31 ваемыми сигналами транскрипции нужного белка. Культивирование клеток-хозяев Способы культивирования рекомбинантных клеток-хозяев для продукции нужного белка будут варьировать в зависимости от многих факторов и соображений; оптимальная процедура в каждой конкретной ситуации становится понятной квалифицированному специалисту после непродолжительных экспериментов. Рекомбинантные клетки-хозяева культивируют в подходящей среде и экспрессируемый белок собирают, выделяют и очищают из культуральной среды (или из клеток, если он экспрессируется внутриклеточно) с использованием известных из уровня техники методов. Конкретно,любые рекомбинантные клетки, используемые для получения желаемого белка, могут культивироваться в среде, обеспечивающей индукцию промоторов, селекцию соответствующих клеток-хозяев или амплификацию гена, кодирующего нужный белок. При необходимости в состав среды могут вводиться гормоны и/или другие ростовые факторы (такие, как инсулин,трансферрин или эпидермальный ростовой фактор), соли (такие, как хлорид натрия, соли кальция, магния и фосфаты), буферы (такие, какHEPES), нуклеозиды (такие, как аденозин и тимидин), антибиотики (такие, как гентамицин),микроэлементы (неорганические соединения,конечная концентрация которых не превышает микромолей), а также глюкоза или другой источник энергии. Могут также вводиться и другие добавки в соответствующих концентрациях,что очевидно для квалифицированного специалиста. Приемлемые для конкретных клетокхозяев культуральные условия, такие как температура, рН и т.п., также хорошо известны квалифицированному специалисту Полученный продукт экспрессии может быть вычищен почти до гомогенности с использованием известных из уровня техники методов. Примеры методов очистки описаны в патенте США No.5,075,222 и заявке WO 91/08285. Предпочтительно, чтобы продукт экспрессии был по существу очищенным. По существу очищенный применительно к IL-1ra означает, что в немодифицированной форме IL-1ra обладает сравнительно высокой удельной активностью, предпочтительно в пределах 150,000 - 500,000 единиц рецептора/мг,как определено в работах Hannum et al., (1990),Nature, 343:336-340 и Eisenberg et al., (1990),Nature, 343:341-346, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок. Однако необходимо понимать, что вариант IL-1ra может обладать другой удельной активностью. Фармацевтические композиции Обычно любая из фармацевтических композиций включает терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одного IL-1ra,варианта IL-1ra или его химического производного (объединенных понятием IL-1ra про 001792 32 дукт), а также материал, обеспечивающий контролируемое высвобождение, оптимально объединенные в носителе. Носитель предпочтительно включает один или более из фармацевтически и физиологически приемлемых материалов в смеси с IL-1ra продуктом и материалом, обеспечивающим контролируемое высвобождение. Полимеры, контролирующие высвобождение,могут быть выбраны из многочисленных эрозивных полимеров (например, сополимеров поли(молочно-ко-гликолевой кислоты) (PLGA),смеси полимеров PLGA, блок-сополимеров ПЭГа, молочной и гликолевой кислоты, поли(цианоакрилатов); полимеров, вызывающих поверхностную эрозию(например,поли(ангидридов) и поли(ортоэфиров; эфиров гидрогеля (например, полиолов Плюроник, поли(винилового спирта), поли(винилпирролидона), сополимеров малеинового ангидрида и алкилвинилового эфира, поли(2-гидроксиэтил метакрилата(рНЕМА), метакриловой кислоты(МАА), смеси рНЕМА и МАА, целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозы), гиалуронана, альгината, коллагена, желатины, альбумина и крахмала и декстрана, а также их системных композиций или же препаратов липосом или микросфер. Такие композиции могут оказывать влияние на физическое состояние, стабильность,скорость высвобождения in vivo, скорость выведения in vivo заявленных в настоящем изобретении белков и их производных. Оптимальные фармацевтические композиции для конкретного белка могут быть получены квалифицированным специалистом в зависимости от способа введения и желаемой дозировки. Примеры фармацевтических композиций приведены в Gombotz and Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6:332351 и Remington's Pharmaceutical Sciences, 18thEd. (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA 18042,pp. 1435-1712; все работы упоминаются в настоящем описании в качестве ссылок). Конкретные композиции для контролируемого высвобождения доступны от следующих поставщиков: DepoTech Corp., San Diego, CA (Depofoam мультивезикулярные липосомы) иAlkermes, Inc., Cambridge, MA (ProLease,PLGA микросферы). Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к системе доставки лекарств, основанных на гиалуронане в растворимых и нерастворимых поперечносшитых формах. Под термином гиалуронан понимается гиалуронан, гиалуроновая кислота,их соли (такие как гиалуронат натрия), эфиры,энзиматические производные и поперечносшитые гели гиалуроновой кислоты и химически модифицированные производные гиалуроновой кислоты (такие, как гилан). Немодифицированная или модифицированная гиалуроновая кислота служит вектором, обеспечивающим медленное высвобождение лекарственного препарата из системы. 33 Гиалуронан может быть любого типа, который подходит для использования в указанных целях. Он может быть экстрагирован из различных материалов, например, петушиных гребней или пуповинных канатиков или же получен из бактериальных культур, например культур гемолитических стрептококков групп А и С. Примеры форм гиалуронана описаны Peyron andNo.4,582,865,4,605,691,4,636,524, 4,713,448, 4,716,154, 4,716,224,4,772,419, 4,851,521, 4,957,774, 4,863,907,5,128,326, 5,202,431, 5,336,767, 5,356,883; в заявках на Европейский патент No. 0 057 604 А 2 и 0 718 312 А 2; и WO 96/05845; все указанные источники информации приведены здесь в качестве ссылок. Гиалуронан должен иметь достаточную степень чистоты, чтобы избежать искаженной или токсической реакции у млекопитающего,подвергающегося лечению. Это означает, что гиалуронан должен быть свободен от пирогенов и иметь достаточно низкое содержание белков и/или нуклеиновых кислот, с которыми он природным образом ассоциирован, чтобы не провоцировать заметной иммунной реакции. Подходящие способы очистки описаны в Патентах США No.4,141,973. 5,411,874, 5,442,053, 5,559,104,5,563,051, а также в японских заявках на патентNo. 145944/1977, 67100/1979, 74796/1980, упоминаемых в настоящем описании в качестве ссылок. Гиалуронан может присутствовать в виде свободной кислоты или любой фармакологически приемлемой соли. Среди солей можно упомянуть соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, и соли щелочно-земельных металлов, например, кальция и магния. Предпочтительным источником гиалуронана является культура соответствующего микроорганизма. Для целей настоящего изобретения может быть использован гиалуронан с молекулярным весом, лежащим в широких пределах. Обычно молекулярный вес гиалуронана лежит между 0.1 34 х 106 и 1 х 107, предпочтительно между 0.5 х 106 и 5 х 106, более предпочтительно , между 1 х 106 и 5 х 106, и, наиболее более предпочтительно,между 1 х 106 и 4 х 106 (т.е., между 1 х 106 и 2 х 106). Увеличение молекулярного веса гиалуронана путем введения поперечных сшивок может быть достигнуто различными способами. Sakuria et al. в Патенте США No. 4,716,224 описывают поперечно-сшитую гиалуроновую кислоту и ее соли, полученные сшиванием гиалуроновой кислоты или ее солей полифункциональным эпоксидом. В Патенте США No. 4,863,907 Sakuria et al. описывают поперечно-сшитый глюкозаминогликан и его соли, полученные сшиванием глюкозаминогликана и его солей полифункциональным эпоксидным соединением. Huang etal. в заявке на Европейский патент No. 0 507 604 А 2 описывают ионо-связанные карбоксилсодержащие полисахариды, для которых связывающим агентом служит соединение с тривалентным катионом. Malson et al. в Патенте СШАNo.4,716,154 и в Патенте США No. 4,772,419 описывают сшивание гиалуроновой кислоты биили полифункциональными эпоксидами или их соответствующими галогидринами, эпифалогидринами или галидами, а также дивинилсульфоном. В Патенте США No. 4,957,744 dellaValle et al., описывают поперечно-сшитые эфиры гиалуроновой кислоты, полученные этерификацией карбоксильных групп гиалуроновой кислоты полигидриловыми спиртами. Balasz etal. в Патентах США No. 4,582,865, 4,605,691 и 4,636,524 описывают сшивание гиалуроновой кислоты и ее солей, а также других полисахаридов реакцией с дивинилсульфоном. В Патентах США No. 5,128,326 и 4,582,865 Balasz et al. описывают сшивание гиалуроновой кислоты и ее солей при помощи формальдегида, эпоксидов,полиазиридиловых соединений и дивинилсульфона. В Патенте США No. 4,713,448 Balasz et al. описывают химическую модификацию гиалуроновой кислоты путем реакции с такими альдегидами, как формальдегид, глутаральдегид и глиоксаль, и указывают на возможность образования поперечных сшивок. В Патенте США No. 5,356,883 Kuo et al., описывают сшивание гиалуроновой кислоты реакцией с бискарбодиимидами. В заявке ЕР 0 718 312 А 2 Nguyen описывают сшивание гиалуроновой кислоты и ее солей, а также других полисахаридов, реакцией с ди- или полиангидридами. Концентрация гиалуронана в продуктах,основанных на растворимых полимерах, может находиться в пределах от 0.05% до 5% по весу и выше, в зависимости от конечного использования продукта, предпочтительно от 0.1% до 4% по весу, более предпочтительно от 1% до 3% по весу. Концентрация ингибитора IL-1 может варьировать в очень широких пределах и предпочтительно определяется в зависимости от растворимости ингибитора IL-1, его фармаколо 35 гической активности, желаемого эффекта конечного продукта и т.д. Поперечно-сшитый гиалуронан обычно растворяют в растворителе (например, в физиологическом растворе) до такой вязкости, которая достаточна для прохождения раствора через иглу шприца. Низкая вязкость материала значительно облегчает введение, делая возможным применение концентрированных водных растворов гиалуронана при определении доз. Так,например, 1%-ный водный раствор гиалуронана может быть использован для введения доз объемом около 10 миллилитров, при этом доза может содержать около 100 миллиграмм активного ингредиента, если ее вязкость не превышает 200c/s (как определено при помощи вискозиметраCannon-Manning Semi-Micro, согласно протоколам ASTM D 445 и D 2515). Заявленная в настоящем изобретении система доставки препарата включает следующие компоненты: 1. растворы гиалуронана, в которых растворено или диспергировано лекарственное вещество; 2. поперечно-сшитый гель гиалуронана,образующий макромолекулярную клетку, в котором диспергировано лекарственное вещество; 3. поперечно-сшитый смешанный гель гиалуронана и, по меньшей мере, одного другого гидрофильного полимера, в котором диспергировано лекарственное вещество; 4. поперечно-сшитый гель гиалуронана или поперечно-сшитый смешанный гель гиалуронана и, по меньшей мере, одного другого гидрофильного полимера,содержащий лекарственное вещество, которое ковалентно связано с макромолекулами гиалуроновой кислоты или другого полимера. Имеется несколько способов сочетания лекарства с гелем и, соответственно, может быть получено несколько типов продуктов. Один из способов предусматривает диффузию лекарственного препарата в гель, когда гель помещен в раствор препарата. Процесс диффузии обычно происходит медленно и зависит от концентрации препарата, температуры раствора, размера частиц геля и т.п. Полученный таким способом продукт представляет собой гель, в котором лекарственный препарат диспергирован однородно. Такой же продукт может быть получен путем дегидратации гиалуронанового геля с последующим его пропитыванием раствором препарата. Для дегидратации геля можно использовать водозамещающий органический растворитель или, альтернативно, вода из геля может быть удалена высушиванием. Однако,предпочтительно использовать растворитель,поскольку после высушивания при низкой или повышенной температуре гель не может заново набухнуть до исходного объема. С другой стороны, после дегидратации растворителем гель набухает до того объема, который он имел до 36 обработки. Предпочтительными растворителями являются этанол и изопропанол, а также такие кетоны, как ацетон, хотя можно использовать и другие растворители. Для получения продуктов данного типа может использоваться и другой подход. Он состоит в обеспечении набухания в растворе лекарственного препарата концентрированного геля гиалуроновой кислоты, полученного ранее проведенной реакцией поперечного сшивания в сравнительно концентрированном растворе гиалуронана. При том, что использование всех трех методов приводит к получению практически того же самого продукта, каждый из методов имеет свои преимущества в случае конкретного продукта и потому выбор метода должен производиться с учетом таких параметров, как природа лекарственного препарата, желаемая концентрация лекарственного препарата в системе,скорость доставки и т.д. Для получения раствора гиалуронана, в котором растворен или диспергирован лекарственный препарат, приемлемы любые обычные методы. Полученный из любого источника гиалуронан может быть растворен в воде или физиологическом растворе до желаемой концентрации, а затем в этом растворе растворяют или диспергируют лекарственный препарат. Альтернативно, раствор или дисперсия препарата могут быть смешаны с раствором гиалуронана. Концентрацию полимера выбирают, исходя из конечного применения продукта и молекулярного веса гиалуронана. Концентрацию лекарственного вещества выбирают в зависимости от желаемой активности продукта. Для загрузки поперечно-сшитого набухшего геля лекарственным препаратом путем процесса диффузии гель помещают в раствор препарата. Время завершения этого процесса зависит от размера частиц геля, степени набухания геля, температуры процесса, перемешивания, концентрации лекарственного препарата в растворе и т.п. При соответствующей комбинации данных параметров набухший гель может быть загружен препаратом за относительно короткое время. Для дегидратации поперечно-сшитого геля растворителем достаточно поместить гель в любой форме (т.е. в форме мелких частиц или мембраны) в растворитель, предпочтительно летучий растворитель (например, изопропанол),и выдержать его в растворителе такое время,которое достаточно для удаления воды из геля. Степень удаления воды зависит от размеров частиц или толщины мембраны, отношения гель/растворитель и т.д. При необходимости обработку растворителем можно проводить несколько раз. Растворитель из геля удаляют высушиванием при нормальном давлении или в вакууме при комнатной или повышенной температуре. Дегидратированный таким образом гель помещают в раствор препарата, где он набухает до первоначального объема. Конкретные 37 композиции гиалуронана доступны от следующих производителей: BioMatrix, Inc. Ridgefield,NJ (Synvisc, смесь 10:90 жидкого гилана и гелеобразного гилана); Fidia S.p.A., AbanoTerme, Italy (Hyalgan (натриевая соль гиалуроновой кислоты из петушиного гребня (MB от 500,000 до 700 000; Kaken PharmaceuticalCo., Ltd., Tolyo, Japan (Artz, 1% раствор гиалуроновой кислоты из петушиного гребня (МВ 700 000); Pharmacia AB, Stockholm, Sweden(Healon гиалуроновая кислота из петушиного гребня (МВ 4 x 106); Genzyme Corporation,Cambridge, MA (Surgicoat, рекомбинантная гиалуроновая кислота); Pronova Biopolymer, Inc.,Portsmouth, NH (Гиалуроновая Кислота FCH,высокомолекулярная (MB1.5-2.2 x 106) гиалуроновая кислота, приготовленная из культур(каталог компании, 1997, номер 385908), полученная из Streptococcus sp.); Intergen Company,Purchase, NY (гиалуроновая кислота из петушиного гребня, (MB 1 x 106); Diosyth Inc., Chicago. IL; Amerchol Corp., Edison, NJ и KyowaHakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Japan. Первичный растворитель в носителе может быть по своей природе как водным, так и неводным. Кроме того носитель может содержать другие фармацевтически приемлемые наполнители для модификации или поддержания рН,предпочтительно в интервале 6.0-7.0, более предпочтительно на уровне 6.5 (например, такие буферы как нитратный, фосфатный и глициновый); наполнители для лиофилизации (например, маннитол и глицин); вещества для поддержания осмолярности (например, маннитол и хлорид натрия); поверхностно-активные вещества (например, полисорбат 20, полисорбат 80,тритон и Плюроникс); вещества для поддержания вязкости, прозрачности, цвета, стерильности, стабильности (например, сахароза и сорбитол); антиоксиданты (например, сульфит натрия и гидросульфит натрия); консерванты (например, бензойная кислота и салициловая кислота); вещества, определяющие запах или аромат состава; вещества, контролирующие скорость растворения (например, такие солюбилизаторы или солюбилизирующие агенты, как спирты, полиэтиленгликоли и хлорид натрия); скорость высвобождения, эмульгирующие агенты, суспендирующие агенты, растворители, наполнители,векторы доставки; разбавители и/или фармацевтические адъюванты. Оптимальный фармакологический состав для данного белка может быть определен квалифицированным специалистом в зависимости от способа введения и желаемой дозировки (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990) Mack Publishing 38 упоминаемую в настоящем описании в качестве ссылки). Конкретные фармакологические составы таковы: 10 мМ цитрат натрия, 140 мМ хлорид натрия, 0.5 мМ ЭДТА, 0.1%-ный полисорбат 80 (объем/объем) в воде, рН 6.5 (нитратный буферный состав); и 10 мМ фосфат натрия, 140 мМ хлорид натрия, от 0.1% (вес/вес) до 0.01% полисорбата 80 (объем/объем) в воде, и, дополнительно, 0.5 мМ ЭДТА, рН 6.5 (фосфатный буферный состав). Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения предусматривает растворение или суспендированиеIL-1ra в виде тонко разделенных частиц в 0.15%-ном растворе гиалуронана или его соли (например, гиалуронана натрия) или в воде или в водном растворителе (например, в таких физиологических растворах, как растворы водорастворимых солей натрия, 3-5%-ные растворы глюкозы, 3-5%-ные растворы ксилитола, а также цитратные и фосфатные буферные растворы). Гиалуронан и IL-1ra можно смешать путем впрыскивания раствора IL-1ra из шприца во второй шприц с гиалуронаном с последующим насасыванием и выпусканием, а также размешиванием или микрофлюидизацией. Смеси IL1ra можно хранить при 0-5 С без деградации или агрегации белка. Концентрация гиалуронана может варьировать в пределах 0.1-5% (объем/объем), но предпочтительна концентрация 2%. Аналогично, конечная концентрация IL-1ra в препарате может составлять 0.1-200 мг/мл, но предпочтительна концентрация 100 мг/мл. Значение рН конечного раствора или суспензии доводят до 6.0-7.5. После приготовления фармацевтические композиции могут храниться в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого или дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие композиции могут храниться в виде готовых к применению форм или форм, требующих растворения перед введением (например, лиофилизированных). Предпочтительно хранение подобных составов при температурах ниже 4 С, и еще более предпочтительно при -70 С. Предпочтительно, чтобы содержащие IL-1rа составы хранились и вводились при значениях рН, близких к физиологическим. Считается, что хранение и введение композиций при высоких рН (например, выше 8) или при низких рН (например, ниже 5) нежелательно, так что интервал рН между 6.0 и 7.0 считается предпочтительным, а значение рН 6.5 более предпочтительным. Один из вариантов осуществления настоящего изобретения подразумевает использование наборов для введения единичных доз. Эти наборы могут содержать один контейнер с высушенным белком и второй контейнер с водным составом. Включенные в объем настоящего изобретения наборы могут состоять из одно- и двухкамерных заполненных шприцев (например, шприцев для жидкостей и лиошприцев, 39 таких как Lyo-Ject, двухкамерных заполненных лиошприцев), доступных от Vetter GmbH,Ravensburg, Germany. Ингибиторы IL-1 (например, продукты IL1ra) могут быть введены пациенту в терапевтически эффективных количествах для лечения IL1-обусловленных заболеваний, как указано выше, включая воспалительные заболевания суставов (например, псориазный артрит и ревматоидный артрит. Под термином пациент подразумеваются как люди, так и животные (например, кошки, собаки и лошади). Ингибитор IL-1 (например, предпочтительно, продукт IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) может быть введен путем местного, энтерального или парентерального введения, включая без ограничений внутривенное,внутримышечное, внутриартериальное, внутриоболочечное, внутрикапсулярное, внутриорбитальное, внутрисердечное, внутрикожное, интраперитонеальное, транстрахеальное, подкожное, субкутикулярное, внутрисуставное, субкапсулярное, субарахноидальное, интраспинальное,интравентрикулярное и интрастенальное введение или вливание. Ингибитор IL-1 (например,предпочтительно, продукт IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) может быть также введен оральным способом или через слизистую оболочку, например, интраназально, подъязычно, буккально или ректально для системной доставки. Ингибиторы IL-1 (например, предпочтительно, продукт IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) вводят посредством внутрисуставных, подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций. В качестве примера,не ограничивающего объем притязаний настоящего изобретения, можно привести внутрисуставное введение ингибиторов IL-1 (например,предпочтительно, продукта IL-1rа или, более предпочтительно, IL-1rа) для лечения ревматоидного артрита или остеоартрита. В качестве примера, не ограничивающего объем притязаний настоящего изобретения, ингибиторы IL-1(например, предпочтительно, продукт IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) могут быть введены подкожно или внутримышечно для лечения ревматоидного артрита, воспалительных заболеваний кишечника, множественного склероза, множественной миеломы или миелогенных (например, AML и CML) и других лейкозов. В качестве примера, не ограничивающего объем притязаний настоящего изобретения, ингибиторы IL-1 (например, предпочтительно,продукт IL-1ra или, более предпочтительно, IL1ra) могут быть введены внутривенно для лечения повреждений мозга в результате травмы,эпилепсии, геморрагии или инсульта, для лечения реакции трансплантат против хозяина или введены внутрижелудочково для лечения повреждений мозга в результате травмы. Вне зависимости от способа введения лечение IL-1 обусловленных заболеваний требует доз инги 001792 40 биторов IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL1ra), эффективных для предотвращения, снижения или облегчения симптомов заболевания с тем, чтобы противодействовать прогрессирующей деструкции суставного хряща, обусловленной деградацией протеогликанов, которые являются молекулярными компонентами суставного хряща. Поскольку гиалуронан и IL-1ra являются веществами, природно встречающимися у млекопитающих, считается, что не существует наследуемого верхнего предела переносимой дозы. Однако, как при любом медикаментозном лечении, неразумно превышать дозу, необходимую для достижения желаемого эффекта. Конкретную дозу вычисляют, исходя из приблизительного веса тела или поверхности тела больного. Среди факторов, определяющих соответствующую дозировку, могут быть конкретная нозологическая форма, которую нужно излечить или предотвратить, острота заболевания, способ введения, а также возраст, пол и клиническое состояние больного. Последующие уточняющие вычисления, необходимые для определения соответствующей дозировки, рутинно проводятся квалифицированными специалистами, особенно с учетом дозировочной информации, изложенной в настоящем описании. Дозировка может также определяться на основе известных дозировочных тестов в сочетании с соответствующими данными доза-ответ. Частота введений зависит от заболевания и состояния больного, а также от фармакокинетических параметров ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra), использованного в фармакологической форме, и от способа введения. Ингибитор IL-1 (например, предпочтительно,продукт IL-1ra или, более предпочтительно, IL1ra) может быть введен однократно, или, в случае острых и продолжительных расстройств,вводиться ежедневно меньшими дозами, или же вводиться начальной болюсной дозой, за которой следуют повторные введения или контролируемая постоянная доставка. Также считается,что могут практиковаться и другие способы постоянной или почти постоянной дозировки. Например, химическая дериватизация может приводить к получению форм постоянного высвобождения, которые создают эффект постоянного присутствия препарата в кровотоке в предсказуемых количествах, определяемых дозировкой. Предпочтительные способы применения продуктовIL-1 обусловленных заболеваний, включая такие воспалительные состояния суставов, как ревматоидный артрит и псориатический артрит, приведены в AU 9173636. Эти способы включают:(1) единичные внутрисуставные инъекции IL1ra, производимые периодически для предотвращения или лечения вспышки артрита и (2) периодические подкожные инъекции продуктаIL-1ra. При парентеральном введении единичная доза может составлять до 200 мг, обычно до 150 мг и, предпочтительно, до 100 мг. При введении в суставную полость фармацевтическую композицию предпочтительно вводить из 3-10 мл шприца, содержащего дозу до 200 мг/мл,обычно до 150 мг и, предпочтительно, до 100 мг продукта IL-1ra, растворенного в изотоническом фосфатном буферном растворе. Препарат вводят в суставную полость с частотой раз в 7-10 дней. Такие инъекции осуществляют 4-5 раз,при необходимости варьируя дозу. Заявленные в настоящем изобретении фармацевтические композиции в зависимости от показаний могут вводиться вместе с другими терапевтическими агентами. Ингибитор IL-1 (например, предпочтительно, продукт IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) и один или более дополнительный противовоспалительный препарат могут вводиться раздельно или в сочетании. Информация относительно следующих соединений может быть почерпнута в руководствах TheIL-1-обусловленных заболеваний, включая острое и хроническое воспаление, такие как воспаления суставов (например, ревматоидный артрит), предусматривает применение первой группы лекарств для контроля боли и воспаления, классифицируемых как нестероидные противовоспалительные препараты (NSAIDs). Вторичное лечение предусматривает применение кортикостероидов, медленно действующих антиревматических препаратов (SAARDS) или модифицирующих заболевание (DM) препаратов. Один из специфических вариантов осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании с одим или несколькими NSAIDs для лечения IL-1 обусловленных заболеваний, включая острые и хронические воспаления суставов (например,остеоартрит, псориатический артрит и/или ревматоидный артрит) и реакции трансплантат против хозяина. Противовоспалительное действие NSAIDs, по меньшей мере, частично обусловлено подавлением синтеза простагландиновNSAIDs могут быть подразделены на девять групп: (1) производные салициловой кислоты;(9) пиразолоны. Другой специфический вариант осуществления изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, 001792 42 продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL1ra) в сочетании с одним или несколькими производными салициловой кислоты, эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. Производные салициловой кислоты, эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые соли могут включать ацетаминосалол,алоксипирин, аспирин, бенорилат, бромосалигенин, ацетилсалицилат кальция, холин магнезиум трисалицилит дифлузинал, этерсалат, фендозал, гентизиновую кислоту, гликол салицилат,имидазол салицилат, лизин ацетилсалицилат,мезаламин, морфолин салицилат, 1-нафтил салицилат, олсалазин, парсалмид, фенил ацетилсалицилат, фенилсалицилат, салацетамид, салициламид-О-ацетиловую кислоту, салсалат и сульфасалазин. Структурно близкие производные салициловой кислоты, обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или,более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании (до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одим или несколькими производными пропионовой кислоты, эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. Производные пропионовой кислоты, эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые соли могут включать альминопрофен, беноксапрофен, буклоксиковая кислота, карпрофен, дексиндопрофен, фенопрофен, флуноксапрофен, флупрофен, флурбипрофен, флурклопрофен, ибупрофен, ибупрофен алюминия, ибупроксам, индопрофен, изопрофен, кетопрофен,локсопрофен, миропрофен, напроксен, оксапрозин, пикетопрофен, пимепрофен, пирпрофен,пранопрофен, протизиниковая кислота, пиридоксипрофен, супрофен, тиапрофеновая кислота и тиоксапрофен. Структурно близкие производные пропионовой кислоты, обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретение направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1rа или, более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими производными уксусной кислоты, эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. Производные уксусной кислоты, эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые соли могут включать ацеметацин, алклофенак, амфенак, буфексамак,цинметацин, клопирак, дельметацин, диклофе 43 нак натрия, этодолак, фелбинак, фенклофенак,фенклорак, фенклозиковая кислота, фетиазак,фурофенак, глюкаметацин, ибуфенак, индометацин, изофезолак, изоксепак, лоназолак, метиазиниковая кислота, оксаметацин, окспинак, пиметацин,проглюметацин, сулиндак, тальметацин, тиарамид, тиопинак, толметин, зидометацин и зомепирак. Структурно близкие производные уксусной кислоты, обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или более предпочтительно IL-1ra) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими производными фенаминовой кислоты, эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. Производные фенаминовой кислоты, эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые соли могут включать энфенаминовую кислоту, этофенамат, флуфенаминовую кислоту, изониксин,меклофенаминовую кислоту, мефанаминовую кислоту, нифлуминовую кислоту, тальнифлумат, терофенамат, толфенаминовую кислоту и уфенамат. Структурно близкие производные фенаминовой кислоты, обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании (до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими производными карбоновой кислоты, эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. Производные карбоновой кислоты,эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые соли могут включать клинданак, дифлунизал, флуфенизал, иноридин,кеторолак и тиноридин. Структурно близкие производные карбоксиловой кислоты, обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или,более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании (до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими производными масляной кислоты, эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. Производные масляной кислоты, эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые 44 соли могут включать бумадизон, бутибуфен,фенбуфен и ксенбуцин. Структурно близкие производные бутириловой кислоты, обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими оксикамами,эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. Оксикамы, эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые соли могут включать дроксикам, эноликам, изоксикам, пироксикам, судоксам, теноксикам и 4-гидроксил 1,2-бензотиазин 1,1-диоксид 4-(N-фенил)карбоксамид. Структурно близкие оксикамы,обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1rа или, более предпочтительно, IL-1rа) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими пиразолами,эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. Пиразолы, эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые соли могут включать дифенамизол и эпиризол. Структурно близкие пиразолы, обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими пиразолонами,эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями. Пиразолоны, эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые соли могут включать апазон, азапропазон, бензпиперилон,фепразон, мофебутазон, моразон, оксифенбутазон, фенилбутазон, пипебузон, пропилфеназон,рамифеназон, суксибузон и тиазолинобутазон. Структурно близкие пиразалоны, обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно продукта IL-1ra или более пред 45 почтительно IL-1ra) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими из следующихNSAIDs: -ацетамидокапроиловая кислота, Sаденозилметионин, 3-амино-4-гидроксибутириловая кислота, амиксетрин, анитразафен, антрафенин, бендазак, бендазак лизинат, бензидамин,бепрозин, броперамол, буколом, буфезолак, ципроквазон, клоксимат, дазидамин, дебоксамет,детоминидин, дифенпайрамид, дифенпирамид,дифисаламин, дитазол, эморфазон, фанетизол месилат, фенфлумизол, флоктафенин, флумизол, флуниксин, флупроквазон, фопиртолин,фосфозал, кваймезал, квайазолин, изониксирн,лефетамин НСl, лефлуномид, лофемизол, лотифазол, лизин клониксинат, месеклазон, набуметон, никтиндол, нимесулид, орготеин, орпаноксин, оксацепролм, оксападол, паранилин, перизоксаль, перизоксаль цитрат, пифоксим, пипроксен, пиразолак, пирвенидон, проквазон,проксазол, тиелавин В, тифламизол, тимегадин,толектин, толпадол, триптамид, а также обозначенные кодовыми номерами компаний препараты 480156S, АА 861, AD1590, AFP860, AI77B,АР 504, AU8001, ВРРС, BW540C, CHINOIN 127,CN100, ЕВ 382, EL508, F1044, FK-506, GV3658,ITF182, KCNTEI6090, КМЕ 4, LA2851, MR714,MR897, MY309, ONО 3144, PR823, PV102,PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133,SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, ТА 60, TAI901, (4-бензоил-1-инданкарбоксиловая кислота),TVX2706, U60257, UR2301, WY41770. Структурно близкие NSAIDs, обладающие сходными с перечисленными выше NSAIDs анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими кортикостероидами, эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями для лечения IL-1-обусловленных заболеваний,как определено выше, включая острое и хроническое воспаление суставов (например, остеоартрит, псориатический артрит и/или ревматоидный артрит); реакцию трансплантат против хозяина и множественный склероз. Кортикостероиды, эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые соли включают гидрокортизон и соединения, являющиеся производными гидрокортизона, такие как 21-ацетоксипрегненолон, алклометразон, альгестон, амцинонид, беклометазон, бетаметазон,бетаметазон валерат, будезонид, хлорпреднизолон, клобетазол, клобетазол пропионат, клобетазон, клобетазон бутират, клокортолон, клопреднол, кортикостерон, кортизон, кортивазол,дефлазакон, дезонид, дезоксимеразон, дексаме 001792 46 тазон, дифлоразон, дифлукортолон, дифлупреднат, эноксолон, флуазакорт, флуклоронид, флуметазон, флуметазон привалат, флунизолид флуцинолон ацетонид, флуоцинонид, флуороцинолон ацетонид, флуокортин бутил, флуорокортолон, флуорокортолон гексаноат, дифлукортолон валерат, флуорометолон, флуперолон ацетат, флупредниден ацетат, флупреднизолон,флуранденолид, формокортал, гальцинонид,налометазон, галопредон ацетат, гидрокортамат,гидрокортизон, гидрокортизон ацетат, гидрокортизон бутират, гидрокортизон фосфат, гидрокортизон 21-натрий сукцинат, гидрокортизон тебутат, мазипредон, медризон, мепреднизон,метилпредниколон, мометазон, фуроат, параметазон, предникарбат, преднизолон, преднизолон 21-диэдриаминоацетат, преднизолон натрий фосфат, преднизолон натрий сукцинат, преднизолон натрий 21-m-сульфобензоат, преднизолон натрий 21-стеарогликолат, преднизолон тебутат,преднизолон 21-триметилацетат, преднизон,преднивал, преднилиден, преднилиден 21 диэтиламиноацетат, тиксокортол, триамцинолон, триамцинолон ацетонид, триамцинолон бенетонид и триамцинолон гексацетонид. Структурно близкие кортикостероиды, обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1rа или,более предпочтительно, IL-1rа) в сочетании (до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими медленно-действующими антиревматическими препаратами (SAARDs) или модифицирующими антиревматическими препаратами (DMARDS),эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями для лечения IL-1-обусловленных заболеваний, как определено выше, включая острое и хроническое воспаление суставов (например, остеоартрит, псориатический артрит и/или ревматоидный артрит); реакцию трансплантат против хозяина и множественный склероз. SAARDs иDMARDS, эфиры предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемые соли включают натрий аллокупреид, ауранофин, ауротиоглюкозу, ауротиоглюканид, азатиоприн,натрий бреквинар, буцилламид, кальций-3 ауротио-2-пропанол-1-сульфонат, хлорамбуцил,хлороквин, клобузарит, купроксолин, циклофосфамид,циклоспорин,дапзон,15 дезоксиспергуалин, диацереин, глюкозамин,соли золота (например, золотая соль хлороквина, золотонатрий тиомалат, золотонатрий тиосульфат), гидроксихлороквин, гидроксимочевину, кебузон, левамизол, лобензарит, меллитин,6-меркаптопурин, метотрексат, мизорибин, микофенолат мофетил, майорал, горчичный азот,D-пенницилламин, имидазолы пиридинола, та 47 кие как SKNF86002 и SB203580, рапамицин,тиолы, тимопоэтин и винкристин. Структурно близкие SAARDs и DMARDS, обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1rа или, более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими ингибиторами СОХ 2, эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями для лечения острого и хронического воспаления. Примером ингибиторов СОХ 2, эфиров предшественников лекарств и их фармацевтически приемлемых солей может служить целекоксиб. Структурно близкие ингибиторы СОХ 2,обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими антимикробными препаратами, эфирами предшественников лекарств или их фармацевтически приемлемыми солями для лечения острого и хронического воспаления. Антимикробные препараты, эфиры предшественников лекарств и их фармацевтически приемлемые соли включают, например, ампициллин, амоксициллин, ауреомицин, бацитрацин, цефтазидим, цефтриаксон, цефотаксим,цефахлор, цефалексин, цефрадин, ципрофлоксацин, клавулановую кислоту, клоксациллин, диклоксациллин, эритромицин, флуклоксациллин,гентамицин, грамицидин, метициллан, неомицин, оксациллин, пенициллин и ванкомицин. Структурно близкие антимикробные препараты,обладающие сходными анальгезирующими и противовоспалительными свойствами, также включены в данную группу. Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1rа или, более предпочтительно, IL-1rа) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими ингибиторами ФНО для лечения IL-1-обусловленных заболеваний, как определено выше, включая острое и хроническое воспаление суставов (например,остеоартрит, псориатический артрит и/или ревматоидный артрит); повреждения мозга в результате травмы, эпилепсии, геморрагии или инсульта и реакцию трансплантат против хозяина. Такие ингибиторы ФНО включают со 001792 48 единения и белки, которые блокируют in vivo синтез или внеклеточное высвобождение ФНО. Специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно,продукта IL-1rа или, более предпочтительно, IL1rа) в сочетании (до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими ингибиторами ФНО, а именно ФНО-связывающими белками (растворимыми рецепторами ФНО), антителами против ФНО,гранулоцитарным колониестимулирующим фактором; талидомидом, BN 50730, тенидапом,Е 5531, тиапафантом РСА 4248, нимесулидом,панавиром, ролипрамом, PR 73401, пептидом Т,MDL 201,449 А, (1R,3S)-цис-1-[9-(2,6-диаминопуринил)]-3-гидрокси-4-циклопентен гидрохлоридом, (1R,3S)-транс-1-[9-(2,6-диамино)пурин]-3-ацетоксициклопентаном, (1R,3S)-транс 1-[9-аденил)]-3-азидоциклопентан гидрохлоридом и (1R,3S)-транс-1-[6-гидроксипурин-9-ил)]3-азидоциклопентаном. ФНО-связывающие белки известны из уровня техники (ЕР 308 378, ЕР 422 339, GB 2 218 101, ЕР 393 438, WO 90/13575, ЕР 398 327,ЕР 412 486, WO 91/03553, ЕР 418 014, JP 127,800/1991, ЕР 433 900, Патент США No. 5,136,021, GB 2 246 569, ЕР 464 533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, ЕР 512 528, ЕР 526 905, WO 93/07863, ЕР 568 928, WO 93/21946, WO 93/19777, ЕР 417 563, Заявка на Патент США No.60/021,443, поданная 9-го июля 1996 г. Фишером, Эдвардсом и Кайфом и озаглавленная в сопроводительном письме к Заявке как Белки, связывающие фактор некроза опухолей (документ Поверенного No.A-415P), Заявка на Патент США No 60/032,534, поданная 6 го декабря 1996 г. Фишером, Эдвардсом и Кайфом и озаглавленная в сопроводительном письме к Заявке как Низкомолекулярные белки,связывающие фактор некроза опухолей (документ Поверенного No. A-415P), Заявка на Патент США No 60/037,737, поданная 23-го января 1997 г. Фишером, Эдвардсом и Кайфом и озаглавленная в сопроводительном письме к Заявке как Низкомолекулярные белки, связывающие фактор некроза опухолей (документ Поверенного No. A-415B-P) и Заявка на Патент СШАNo. 60/039,314, поданная 7-го февраля 1997 г. Фишером, Эдвардсом и Кайфом и озаглавленная в сопроводительном письме к Заявке как Низкомолекулярные белки, связывающие фактор некроза опухолей (документ ПоверенногоNo. A-415C-P). Все указанные источники информации включены в настоящее описание в качестве ссылок. Например, в заявках ЕР 393 438 и ЕР 422 339 описаны аминокислотные и нуклеиновые последовательности 30-кДа ингибитора ФНО,(известного также, как р 55 рецептор) и 40-кДа ингибитора, (известного также, как р 75 рецептор), а также их модифицированных форм (на 49 пример, фрагментов, функциональных производных и вариантов). В заявках ЕР 393 438 и ЕР 422 339 описаны способы выделения генов, ответственных за кодирование ингибиторов, клонирование гена в приемлемых векторе и клетках, а также экспрессия гена для получения ингибиторов. Кроме того, описаны также поливалентные формы (т.е. молекулы, обладающие более чем одной активностью) упомянутых выше ингибиторов ФНО. В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения поливалентная форма может быть сконструирована,например, путем химического связывания, по меньшей мере, одного ингибитора ФНО и какой-либо другой активности посредством клинически приемлемого линкера, например, полиэтиленгликоля (WO 92/16221 и WO 95/34326),посредством пептидного линкера (Neve et al.,(1996), Cytokine, 8(5):365-370). химическим связыванием с биотином, который затем соединяется с авидином (WO 91/03553) и, наконец, конструированием молекул химерных антител (Патент США 5,116,964, WO 89/09622, WO 91/16437 и ЕР 315062). Анти-ФНО антитела включают МАК 195F Fab антитела (Holler et al.,(1993), 1st International Symposium on CytokinesInfectious Diseases,9); CenTNF cA2 анти-ФНО моноклональные антитела (Elliot et al., (1994),Lancet, 334,: 1125-1127 и Elliot et al., (1994),Lancet, 334:1105-1110). Еще один специфический вариант осуществления настоящего изобретения направлен на применение ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в сочетании (до лечения,после лечения или в качестве конкурентной терапии) с растворимым рекомбинантным человеческим Fas-антигеном или его рекомбинантными вариантами для лечения IL-1-обусловленных заболеваний, как определено выше, включая острое и хроническое воспаление суставов (например, остеоартрит, псориатический артрит и/или ревматоидный артрит) и реакцию трансплантат против хозяина. Растворимый рекомбинантный человеческий Fas-антиген и такие его варианты, как Fasслитые белки, методы выделения генов, ответственных за кодирование растворимого рекомбинантного человеческого Fas-антигена, методы клонирования гена в приемлемых векторах и клетках-хозяевах, а также способы экспрессии гена с целью получения ингибиторов описаны в работах WO 96/20206 и Mountz et al., J Immunology, 155:4829-4837, включенных в настоящее описание в качестве ссылок. Приведенные выше примеры не исключают других способов лече 001792 50 ния, которые могут быть применены конкурентно с данными антиартритными соединениями и которые известны квалифицированным специалистам или которые могут быть разработаны квалифицированным специалистом с использованием содержащихся в данном описании указаний. Особые преимущества представляет введение дополнительного противовоспалительного соединения и приготовляемый состав в виде формы единичной дозы для облегчения введения и постоянства дозы. Под понятием "форма единичной дозы" подразумеваются физически дискретные единицы, приемлемые как единичные дозировки для подвергающихся лечению млекопитающих. При этом каждая единица содержит предопределенное количество дополнительных противовоспалительных соединений,рассчитанное для получения нужного терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. В понятие "фармацевтически приемлемый носитель" включены любые и все растворители, дисперсионные среды, покрывающие, антибактериальные и антигрибковые агенты, изотонические агенты и агенты, замедляющие всасывание и подобные им соединения, совместимые с активным ингредиентом, со способом введения, другими ингредиентами фармакологической формы, и не являющиеся вредными для реципиента. Использование подобных сред и агентов хорошо известно из уровня техники (см. например, Remington'sPublishing Co., Easton, PA 18042, pp.1435-1712). Примером фармацевтически приемлемого носителя служит фосфатный буферный раствор. В состав композиций могут быть включены дополнительные активные ингредиенты. Для орального терапевтического применения дополнительное противовоспалительное соединение может быть смешано с наполнителем и использоваться в виде таблеток для глотания, защечных таблеток, пастилок, капсул,эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п.,или может вводиться непосредственно в пищу. Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и т.п. могут также содержать связующее вещество, такое как сок трагаканта, гуммиарабик, крахмал или желатин, наполнитель, такой, как дикальций фосфат, дезинтегрирующий агент, такой как крахмал, альгиновая кислота и т.п., любрикант,такой как магнезиум стеарат; осладитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин или ароматизатор, такой как мята, масло грушанки или вишневый или апельсиновый ароматизатор. Когда форма единичной дозы представляет собой капсулу, он может содержать кроме перечисленных материалов также и жидкий носитель. Могут быть использованы и различные другие материалы, каким-либо образом модифицирующие физическую форму единичной дозы. Например,таблетки, пилюли или капсулы могут быть по 51 крыты шеллаком, сахаром или тем и другим. Безусловно, любой материал, используемый для получения единичной дозы, должен быть фармацевтически чистым и по существу нетоксичным в используемых количествах. Кроме того дополнительное противовоспалительное соединение может быть введено в состав препарата или формы, обеспечивающего контролируемое высвобождение. Количество дополнительного противовоспалительного соединения в подобной терапевтической композиции таково, что обеспечивает поддержание нужной дозировки. Для парентерального терапевтического применения любое противовоспалительное соединение может быть введено в состав стерильного инъекционного раствора. Стерильный инъекционный раствор может быть приготовлен введением необходимого количества дополнительного противовоспалительного соединения в соответствующий фармацевтически приемлемый растворитель, в который при необходимости могут быть введены и другие различные ингредиенты, после чего проводят стерилизующую фильтрацию. Дисперсии могут быть получены введением дополнительного противовоспалительного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. Стерильные инъекционные растворы могут быть получены введением порошка, по меньшей мере, одного дополнительного противовоспалительного соединения в заранее простерилизованный раствор любого дополнительного ингредиента при том, что порошок приготовлен приемлемым способом (например, вакуумным высушиванием или лиофилизацией). Конкретную дозу дополнительного противовоспалительного соединения рассчитывают,исходя из примерного веса тела или поверхности тела больного. К другим факторам, которые необходимо учитывать при определении дозировки, относятся следующие: является ли заболевание, которое хотят вылечить или предотвратить, острым или хроническим, острота заболевания, способ введения препарата, возраст,пол и клиническое состояние больного. Квалифицированным специалистом могут быть выполнены дополнительные расчеты, необходимые для уточнения дозировок каждого из перечисленных выше составов. Дозировку можно также определить, исходя из дозировочных тестов в сочетании с соответствующими данными типа доза-ответ. Так, например, настоящим изобретением предусмотрено, что дозировки дополнительных противовоспалительных соединений могут варьировать для достижения желаемого терапевтического эффекта. Если одно из дополнительных противовоспалительных соединений имеет побочные эффекты, больной может получать его во время чередующихся периодов сочетанной терапии. Например, хро 001792 52 ническое лечение метотрексатом связано с токсичностью для желудочно-кишечного тракта,печени, костного мозга и легких (Sandoval et al.,British Journal of Rheumatology, 34:49-56). Способы контроля за течением заболевания и улучшением состояния больного могут включать специфические тесты, например, направленные на определение системного ответа на воспаление, такие как скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и наличие компонентов острой фазы (ARP). Регистрируют также изменения в отечности нездоровых частей тела. Отмечают снижение напряжения и увеличение подвижности, а также уменьшение болей у пациента. Если состояние больного стабильно, его подвергают повторному недельному курсу лечения с оценкой состояния по окончании курса. При стабильном состоянии больного лечение может быть продолжено. После шести месяцев лечения радиологическими методами, например, рентгенографически, отмечают анатомические изменения в скелете. В конце каждого периода состояние пациента оценивают заново. Сравнение клинических показателей (радиологические данные, РОЭ и АРR) до лечения и после лечения указывает на эффективность лечения. В зависимости от эффективности лечения и состояния больного дозировка может повышаться или оставаться постоянной в течение всего времени лечения. Предпочтительным образом, настоящее изобретение относится к способу, предусматривающему использование IL-1ra в одной из следующих комбинаций для лечения или предотвращенияIL-1-обусловленных заболеваний, как определено выше, включая такие острые и хронические воспаления, как воспаления суставов (например,псориатический артрит и ревматоидный артрит) и связанных с ними симптомов: продукт IL-1ra(например, IL-1ra) и один или несколько из следующих препаратов: метотрексат, сульфасазин и гидроксихлороквин; продукт IL-1ra (например, IL-1ra), метотрексат и гидроксихлороквин; продукт IL-1ra (например, IL-1ra), метотрексат и сульфасазин; и продукт IL-1ra (например, IL1ra), метотрексат и ингибитор ФНО, предпочтительно TNFbp. Еще один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу, предусматривающему введение (например, внутрисуставное, подкожное или внутримышечное) ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в фармакологической форме с полимером, контролирующим высвобождение (например, гиалуронаном) в сочетании(до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с метотрексатом и/илиTNFbp для лечения артрита (например, остеоартрита, псориатического артрита и/или ревматоидного артрита) или ассоциированных с ними симптомов. 53 Еще один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу,предусматривающему введение (например,внутривенное или внутривентрикулярное) ингибитора IL-1 (например, предпочтительно,продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL1ra) в фармакологической форме с полимером,контролирующим высвобождение (например,гиалуронаном) в сочетании (до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с тканевым активатором плазминогена и/илиTNFbp для лечения мозговых повреждений,возникших в результате травмы, эпилепсии,геморрагии или инсульта, которые могут приводить к нейродегенерации. Еще один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу, предусматривающему введение (например, подкожное или внутримышечное) ингибитора IL-1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в фармакологической форме с полимером, контролирующим высвобождение(например, гиалуронаном) в сочетании (до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими из следующих препаратов: кортикостероидами, циклоспорином, интерфероном (например, альфаинтерфероном, бета-интерфероном или консенсусным интерфероном) и/или TNFbp для лечения рассеянного склероза. Еще один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу, предусматривающему введение (например, внутривенное) ингибитора IL1 (например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в фармакологической форме с полимером, контролирующим высвобождение (например, гиалуронаном) в сочетании (до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с одним или несколькими из следующих препаратов: метотрексатом, кортикостероидом, FK-506, циклоспорином, растворимым fas-белком и/или TNFbp для лечения реакции трансплантат против хозяина. Еще один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу,предусматривающему введение (например, подкожное или внутримышечное) ингибитора IL-1(например, предпочтительно, продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в фармакологической форме с полимером, контролирующим высвобождение (например, гиалуронаном) в сочетании (до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с G-CSF и/илиTNFbp для лечения воспалительных заболеваний кишечника. Еще один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу,предусматривающему введение (например, подкожное или внутримышечное) ингибитора IL-1 54 логической форме с полимером, контролирующим высвобождение (например, гиалуронаном) в сочетании (до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с интерфероном (например, альфа-интерфероном, бетаинтерфероном или консенсусным интерфероном) для лечения множественной миеломы, или миелогенных (например, AML и CML) и других лейкозов. Еще один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу, предусматривающему введение (например,подкожное, внутривентрикулярное или внутриоболочечное) ингибитора IL-1 (например, предпочтительно продукта IL-1ra или, более предпочтительно, IL-1ra) в фармакологической форме с полимером, контролирующим высвобождение (например, гиалуронаном) в сочетании(до лечения, после лечения или в качестве конкурентной терапии) с NSAID (например, индометацином) и/или TNFbp для лечения болезни Альцгеймера. Еще один предпочтительный вариант осуществления изобретения относится к способу, предусматривающему введение (например, местная инъекция, подкожная или внутримышечная) ингибитора IL-1 (например,предпочтительно продукта IL-rа или, более предпочтительно, IL-rа) в фармакологической форме с полимером, контролирующим высвобождение (например, гиалуронаном) для лечения временного расстройства функции суставов нижней челюсти. Следующие примеры приведены для более полной иллюстрации настоящего изобретения. Очевидно, что могут быть осуществлены различные модификации описанных способов, не выходящие за пределы заявленного изобретения. Примеры Стандартные методики осуществления способов, описанных в нижеследующих примерах, или приемлемые альтернативные методики,приведены в широко известных руководствах по молекулярной биологии, таких как, например,Sambrook et al., Molecular Cloning, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1987) и Ausubel et al., Current Protocols in MolecularBiology, Green Publishing Associates/Wiley Interscience, New York (1990). Все химические вещества имеют аналитическую степень чистоты или степень USP. Пример 1. Приготовление образца: рекомбинантный человеческий антагонист рецептора IL-1, полученный в E.coli, (rhuIL-1ra), приготовленный в соответствии с описаниями, приведенными в Патенте США No. 5,075,222, вводят в состав следующего раствора: 10 мМ цитрат натрия, 140 мМ хлорид натрия, 0.5 мМ EDTA, 0.1%-ный полисорбат (вес/вес) в воде, рН 6.5 (CSEP). Затем шприцы, содержащие IL-1ra, соединяют через запорный кран со шприцами, содержащими один из следующих контролирующих высвобождение материалов: Н-10 жидкий гилан(Biomatrix, Inc., Ridgefield,Inc.), сшитая гиалуроновая кислота (Мr4 х 106) в виде сухого вещества или растворенная в PBS; гиалуроновая кислота (Мr570,000) в PBS, полученная из культур Streptococcus zooepidemicus (каталожный Н 9390, Sigma, Inc., St.Louis, МО) в виде сухого вещества; поливинилпирролидон (Мr 1.3 х 106) (каталожный 43,719-0, Aldrich Chemical Co., Inc., Milwakee, WI) в виде сухого вещества; карбоксиметилцеллюлоза (каталожный 06139, Polysciences, Inc., Warrington, PA) в виде сухого вещества. Затем IL-1ra смешивают с контролирующим высвобождение материалом, насасывая раствор rhuIL-1ra в шприц с гиалуроновой кислотой и вновь выпуская полученную смесь. Эту операцию проводят несколько раз для полного смешивания. Приготавливают следующие составы: (1) IL-1ra (100 мг/мл)/2%-ный Н-10 гилан; (2) IL-1ra (100 мг/мл)/1%-ная гиалуроновая кислота; (3) IL-1ra (100 мг/мл)/0.5%ный Н-10 гилан; (4) IL-1ra (100 мг/мл)/2%-ная гиалуроновая кислота; (5) IL-1ra (100 мг/мл)/4%-ный поливинилпирролидон и (6) IL1ra (100 мг/мл)/3%-ная карбоксиметилцеллюлоза. Указанные составы вводят подкожно самкам крыс Льюис (Charles River, Portage, MI). В различные сроки после инъекций у животных отбирают кровь через катетер, введенный в яремную вену. Кровь центрифугируют для удаления форменных элементов и полученную плазму тестируют на присутствие IL-1ra с использованием набора для ELISA (Quantikine иммуноанализ IL-1ra человека, RD Systems,Minneapolis, MN) согласно указаниям производителя. Данные выражают в виде зависимости концентрации IL-1ra в плазме (мкг IL/мл плазмы) от времени после введения, как показано в таблице 2 и на фиг.1. Таблица 2. Содержание IL-1ra в плазме (мкг/мл) после подкожных инъекций Как видно из табл. 2 и фиг.1, включениеIL-1ra в гиалуронан, поливинилпирролидон и карбоксиметилцеллюлозу приводит к более продолжительному повышению уровней IL-1ra в плазме в сравнении с введением только IL-1ra. Пример 2.IL-1ra в CSEP радиоактивно метят Na [125I],а затем смешивают с жидким Н-10 гиланом,как описано выше. Радиоактивные IL-1ra или смеси 1L-1rа/ Н-10 гилан вводят внутрисуставно в коленные суставы задних лап морским свинкам (Charles River, Portage, MI). В различ 001792 56 ные сроки после инъекций животных забивают,удаляют коленные суставы и просчитывают на гамма-счетчике, как описано van Lent et al.,(1989), J.Reumatol., 16:1295-1303. КоличествоIL-1ra, остающегося в суставах в каждый момент времени, показано на фиг. 2. Время внутрисуставной полужизни IL-1ra для трех различных фармацевтических составов гиалуронана вычисляют с помощью графиков, аналогичных представленному на фиг. 2, и приведено в таблице 3. Таблица 3. Срок полужизни фармацевтических составов IL1ra в суставах морских свинок после внутрисуставного введения Состав (а) Отношение (б) Время полужизни(а) концентрация IL-1ra составляла 100 мг/мл. Концентрация гиалуронана составляла 2% (вес/объем). Как видно из таблицы 3 и фиг. 2, включение IL-1ra в гиалуронан приводит к более продолжительному сохранению IL-1ra в коленных суставах после внутрисуставного введения. Степень сохранения может регулироваться пропорцией сшитого (гель) и несшитого (жидкость) гиалуронана в конечной лекарственной форме. Пример 3.IL-1ra в CSEP или смесь IL-1ra (100 мг/мл)/2%-ный Н-10 гилан, как описано выше, вводят внутрисуставно в коленные суставы задних лап кроликам (Charles River, Portage,MI). В различные сроки после инъекций животных забивают и коленные суставы промываютPBS для получения синовиальной жидкости. Концентрацию IL-1ra (мкг/мл) в полученной синовиальной жидкости определяют ELJSA(Quantikine, иммуноанализ IL-1ra человека,RD Systems) согласно рекомендациям производителя. Данные приведены в таблице 4 и на фиг. 3. Таблица 4.Срок полужизни фармацевтических составов IL1ra в суставах кроликов после внутрисуставного введения Время после введеТолько IL-1ra 57 24 НД 24 НД Данные не представлены Приведенные результаты свидетельствуют о том, что фармацевтические составы IL-1ra обеспечивают к продолжительное высвобождение интактного IL-1ra в синовиальную жидкость после внутрисуставного введения. Пример 4. Самок крыс Льюис (200-250 г, CharlesRiver, Portage, MI) иммунизируют в день 0 и в день 7 бычьим коллагеном типа II (Elastin Products, Qwensville, МО). На 12-13-й день у них развивается артрит. Крысам (по 8 животных в группе) вводят внутрисуставно жидкий Н-10 гилан в CSEP (50 мкл /колено; всего 1 мг гиалуронана) или смесь IL-1ra (100 мг/мл)/2%-ный НСостав Без обработки Гиалуронан 58 10 гилан (50 мкл /колено; 5 мг IL-1ra/1 мг гиалуронана) в дни 15 и 18 после исходной иммунизации. Контрольной артритной группе инъекций не производят. На 20-й день после исходной иммунизации крыс забивают и коленные суставы собирают для гистологической оценки остроты заболевания. На основании данных таблицы 5 и фиг. 4 можно сделать следующие выводы: (а) лечение IL-1ra значительно подавляет разрушение хряща и кости и оказывает умеренный эффект на синовит; (б) общее повреждение сустава снижается на 70% в сравнении с контролем и (в) обработка одним гиалуронаном не оказывает положительного воздействия по сравнению с лечением IL-1ra. Таблица 5. Концентрация IL-1ra в синовиальной жидкости после внутрисуставного введения Синовит Паннус Хрящ в целом Повреждение косСустав в целом тей 3.250.14 1.50.16 17.69.2.27 1.440.16 23.882.57 22.53.87 2.880.39 1.440.22 16.883.14 1.310.25 2.060.28 Пример 5. Самкам крыс Льюис (200-250 г, CharlesRiver, Portage, MI) проводят внутрикожные инъекции 2 мг/мл бычьего коллагена типа II (ElastinProducts, Owensville, МО) в полном адъюванте Фрейнда (Difco Laboratories, Inc., Ann Arbor, MI) в основание хвоста и в три точки на спине (всего 250 мкл) в день 0 и в день 7. На 12-й день этим животным интраперитонеально вводят 3 мг/кг эндотоксина (LPS типа L-3129, Sigma). В течение последующих пяти дней у крыс наблюдается развитие артрита, и по мере развития заболевания крыс случайным образом разделяют на экспериментальные группы (6-8 животных в группе) и начинают лечение. Крыс обрабатывают в течение шести дней (подкожные инъекции в спину жидкого препарата IL-1ra(100 мг/мл) 2%-ный Н-10 гилан, как описано выше), а затем на 7-й день развития артрита забивают для взятия образцов тканей и определения веса лап. Измерения ширины голеностопных суставов при помощи кронциркуля проводят перед началом артрита, в день распределения на экспериментальные группы и каждый последующий день эксперимента до забоя на 7-й день развития артрита. Данные представляют в виде площади под кривой и определяют процент подавления по сравнению с контролем за все время развития артрита. Тибиотарзальный сустав рассекают на уровне медиальной и латеральной лодыжек для определения окончательного веса лап как еще одного показателя воспаления. Голеностопные суставы собирают и хранят в формалине для гистопатологической оценки. Гистопатология: голеностопные суставы собирают в 10%-ный нейтральный формалин и выдерживают в нем не менее 24-х ч, а затем помещают в декальцификатор Surgipath I (Surgipath, Grayslake, IL.) приблизительно на 1 неделю. По завершении декальцификации отрезают пальцы и голеностопный сустав разрезают в продольном направлении, чтобы получить примерно равные половины. Их заключают в парафин и готовят срезы, которые окрашивают гематоксилином и эозином для общей оценки воспаления и повреждения кости, а также окрашивают толуидиновым синим для специфической оценки изменений хряща согласно следующим критериям: Воспаление 0=Норма 1=Минимальная инфильтрация околосуставной ткани клетками воспаления 2=Слабая инфильтрация 3=Умеренная инфильтрация с умеренной эдемой 4=Выраженная инфильтрация с заметной эдемой 5=Острая инфильтрация с острой эдемой Повреждения хряща 0=Норма 1=От минимальной до слабой утрата окрашивания толуидиновым синим без заметной утраты хондроцитов или разрушения коллагена 2=Слабая утрата окрашивания толуидиновым синим с фокальной слабой (поверхностной) утратой хондроцитов и/или разрушением коллагена 3=Умеренная утрата окрашивания толуидиновым синим с мультифокальной умеренной 59 4=Выраженная утрата окрашивания толуидиновым синим с мультифокальной выраженной (на глубину глубокой зоны) утратой хондроцитов и/или разрушением коллагена 5=Сильная диффузная утрата окрашивания толуидиновым синим с мультифокальной сильной (на глубину конечной отметки) утратой хондроцитов и/или разрушением коллагена Резорбция кости 0=Норма 1=Минимальная: небольшие области резорбции, не слишком заметные при малом увеличении, редкие остеокласты 2=Слабая: более многочисленные области резорбции, не слишком заметные при малом увеличении, остеокласты более многочисленны 3=Умеренная: явная резорбция медуллярных трабекул и кортикального костного вещества без дефектов на всю толщину коры, утрата отдельных медуллярных трабекул, повреждения заметны при малом увеличении, остеокласты более многочисленны 4=Выраженная: дефекты на всю толщину коры, часто с нарушением профиля остающейся кортикальной поверхности, выраженная утрата медуллярного костного вещества, многочисленные остеокласты 5=Сильная: дефекты на всю толщину коры, часто с нарушением профиля остающейся кортикальной поверхности, выраженная утрата медуллярного костного вещества дистальной большеберцовой кости, многочисленные остеокласты, частичная резорбция малых костей предплюсны. Статистический анализ: анализировали клинические данные по ширине голеностопных суставов, определяя площадь под дозировочной кривой с последующим анализом отклонений. Вес лап для каждой группы (среднеестандартное отклонение) определяли в соответствии с тестом Стьюдента. В противоположность отсутствию эффекта при ежедневных дозах IL-1ra(100 мг/мл) в CSEP, ежедневное (QD) подкожное (SQ) введение препарата IL-1ra (100 мг/мл)/2%-ный жидкий гилан Н-10 приводит к снижению опухания лап на 62% и снижению конечного веса лап на 74% (фиг. 6 и 7). Эти результаты явно доказывают превосходный клинический эффект ежедневного введения препарата IL-1ra (100 мг/мл)/2%-ный жидкий гилан Н-10 по сравнению с IL-1ra в CSEP. Кроме того гистологический анализ срезов голеностопных суставов показывает значительное снижение воспаления, образования паннуса и повреждений хряща и кости у крыс, получавших препарат IL-1ra (100 мг/мл) 2%-ный жидкий гилан Н-10, но не IL-1ra в CSEP (фиг. 8). После подтверждения того факта, что ежедневные подкожные инъекции препарата IL-1ra (100 мг/мл) 2%-ный жидкий гилан Н-10 способны изменять прогрессию заболевания, были предприняты исследования для определения про 001792 60 должительности эффекта. У крыс, которым ежедневно вводили препарат IL-1ra (100 мг/мл)/2%-ный жидкий гилан Н-10, отмечено снижение опухания лап на 53% и снижение конечного веса лап на 78% (фиг. 9 и 10). У артритных крыс, которым через день вводили препарат IL-1ra (100 мг/мл)/2%-ный жидкий гилан Н-10, отмечено снижение опухания лап на 35% и снижение конечного веса лап на 62%. У артритных крыс, которым вводили препарат IL1ra (100 мг/мл)/2%-ный жидкий гилан Н-10 каждый третий день, отмечено незначительное(на 27%) снижение опухания лап и снижение конечного веса лап на 19%. Эти результаты опять подтвердили важность поддержания минимальных концентраций препарата в крови (не менее 200 нг/мл) в тот период, когда IL-1ra оказывает воздействие на патогенез в данной модельной системе. Прерывистое блокирование рецептора IL-1 приводит к снижению эффективности. Тем крысам, которые получали инъекции каждый третий день, инъекции проводили на 1-й и 4-й дни развития артрита. Примечательно, что измерения при помощи кронциркуля, выполненные спустя 24 ч после инъекций(день 2 и день 5), указывают на подавление прогрессии артрита (фиг. 9). Однако измерения,произведенные на 2-й или 3-й день после инъекций, но до введения следующей дозы, указывают на прогрессию заболевания, что предположительно является результатом субоптимальных уровней препарата в крови в этот период времени. При том, что настоящее изобретение описано в общем виде и с точки зрения предпочтительных вариантов его осуществления, квалифицированному специалисту очевидно, что возможна разработка других вариантов и модификаций данного изобретения. СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ(ii) НАЗВАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ: КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ(v) ДАННЫЕ ДЛЯ КОМПЬЮТЕРНОЙ ОБРАБОТКИ: