Композиция для лечения респираторных синцитиальных вирусов

КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНЫХ СИНЦИТИАЛЬНЫХ ВИРУСОВ Изобретение относится к специфическим композициям, которые являются эффективными для снижения уровней мРНК RSV, уровней белка RSV и титров вируса у пациента, например млекопитающего, такого как человек. Родственные заявки По настоящей заявке испрашивается преимущество приоритета по предварительной заявке США 60/642364, поданной 7 января 2005, которая включена здесь в качестве ссылки в полном объеме. Область техники Изобретение относится к области лечения респираторных синцитиальных вирусов (RSV) и к композициям и способам модуляции репликации вируса и более конкретно к отрицательной регуляции гена(генов) респираторного синцитиального вируса олигонуклеотидами посредством РНК интерференции,вводимыми местно в легкие и носовой ход ингаляционно/интраназально или системно путем инъекции/внутривенно. Предпосылки. Вследствие выполняемой природной функции дыхательные пути подвергаются воздействию множества патогенов, находящихся в воздухе, которые вызывают различные респираторные заболевания. Вирусная инфекция дыхательных путей является наиболее распространенной причиной госпитализации детей раннего возраста в развитых странах мира приблизительно с 91000 ежегодных госпитализаций в США стоимостью 300 млн . Респираторно-синцитиальный вирус человека (RSV) и вирус парагриппа(PIV) являются двумя основными факторами респираторных заболеваний; вместе они инфицируют верхние и нижние дыхательные пути, приводя к крупу, пневмонии и бронхиолиту (Openshaw, P.J.M. Respir.Res. 3 (Suppl 1), S15-S20 (2002), Eastern, A.J., et al., Clin. Microbiol. Rev. 17, 390-412 (2004. Только RSV инфицирует до 65% всех детей первого года жизни и фактически всех детей первых 2 лет. RSV является важной причиной заболеваемости и смертности также и у пожилых людей. Иммунитет после RSV инфекции не является ни полным, ни длительным, и, следовательно, повторные инфекции имеют место во всех возрастных группах. У детей, переболевших RSV бронхиолитом, более вероятно развитие хрипов и астмы в более позднем возрасте. Поиск эффективного лечения и вакцины против RSV продолжался в течение почти четырех десятилетий и имел небольшой успех (Openshaw, P.J.M. Respir. Res. 3 (Suppl 1),S15-S20 (2002), Maggon, K. et al., Rev. Med. Virol. 14, 149-168 (2004. В настоящее время не одобрено ни одной вакцины против RSV. Штаммы обоих вирусов также существуют у животных, не относящихся к человеку, таких как крупный рогатый скот, козы, свиньи и овцы, что приводит к убыткам в сельском хозяйстве, молочной и мясной промышленности (Easton, A.J., et al., Clin. Microbiol. Rev. 17, 390-412 (2004. Оба RSV содержат несегментированные РНК геномы с минус-цепью и принадлежат семейству парамиксовирусов. Целый ряд особенностей этих вирусов вносит свой вклад в трудность профилактики и лечения. Вирусные геномы мутируют с высокой скоростью вследствие отсутствия механизма корректировки считывания РНК геномов, представляя значительную трудность в создании надежной вакцины или противовирусного лекарственного средства (Sullender, W.M. Clin. Microbiol. Rev. 13, 1-15 (2000. От перспективных ингибиторов слитого белка (F) RSV частично отказались, поскольку у вируса развились устойчивые мутации, которые были картированы в F гене (Razinkov, V., et. al., Antivir. Res. 55, 189-200(2002), Morton, C.J. et al. Virology 311, 275-288 (2003. Оба вируса связаны с клеточными белками, что прибавляет трудностей к получению бесклеточного вирусного материала для вакцинации (Burke, E., etal., Virology 252, 137-148 (1998), Burke, E., et al., J. Virol. 74, 669-675 (2000), Gupta, S., et al., J. Virol. 72,2655-2662 (1998. Наконец, иммунология обоих, и особенно иммунология RSV, является чрезвычайно сложной (Peebles, R.S., Jr., et al., Viral. Immunol. 16, 25-34 (2003), Haynes, L.M., et al., J. Virol. 11, 98319844 (2003. Применение RSV белков в качестве вакцин приводит к "иммунопотенциированию" или к усиленному вакциной заболеванию (Polack, F.P. et al. J. Exp. Med. 196, 859-865 (2002. В целом проблема недооценивается вследствие недавнего закрытия множества биофармацевтических программ противRSV. Геном RSV содержит одиночную обратную цепь РНК длиной 15222 нуклеотидов, продуцирующую одиннадцать основных белков (Falsey, A.R., and E.E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13:37184). Два из этих белков, гликопротеины F (слитый) и G (связывающий), являются основными белками поверхности и наиболее важными для индукции защитного иммунитета. SH (малый гидрофобный) белок, М (матриксный) белок и М 2 (22 кДа) белок связаны с оболочкой вируса, но не вызывают защитный иммунный ответ. Обнаружено, что белки N (основной белок, связанный с нуклеокапсидом), Р (фосфопротеин) и L (основной белок полимеразы) связаны с РНК вириона. Два неструктурных белка NS1 иNS2, по-видимому, принимают участие во взаимодействии хозяина и вируса, но отсутствуют в инфицирующих вирионах. Штаммы RSV человека были разделены на две основные группы, A и В. Было показано, что гликопротеин G является наиболее дивергентным среди белков RSV. Считается, что изменчивость гликопротеина G RSV между двумя группами RSV и в пределах этих групп играет важную роль в способностиRSV вызывать ежегодные вспышки эпидемии. Гликопротеин G содержит 289-299 аминокислот (в зависимости от штамма RSV) и имеет внутриклеточную, трансмембранную и высоко гликозилированную стеблеобразную структуру 90 кДа, а также гепаринсвязывающие домены. Этот гликопротеин существует в секретируемой и мембраносвязанной формах. В настоящее время не существует эффективных способов лечения RSV инфекции (Maggon K. and S.Bank, 2004, Reviews in Medical Virology 14:149-68). Инфицирование нижних отделов дыхательных путейRSV в большинстве случаев излечивается самостоятельно. Отсутствуют четкие руководства или критерии по лечению или госпитализации и выписке детей младшего и старшего возраста с этим заболеванием. Гипоксию, которая может иметь место в связи с RSV инфекцией, можно лечить кислородом через носовой катетер. Механическая вентиляция у детей с дыхательной недостаточностью, шоком или рецидивирующим апноэ может снижать смертность. Некоторые лечащие врачи назначают стероиды. Однако некоторые исследования показали, что лечение стероидами не влияет на течение болезни детей младшего и старшего возраста, госпитализированных с бронхиолитом. Следовательно, кортикостероиды отдельно или в комбинации с бронхолитиками могут быть бесполезными при лечении бронхиолита у здоровых в других отношениях пациентов, не получающих механическую вентиляцию. Стероиды также использовались у детей младшего и старшего возраста с первичными сердечно-легочными заболеваниями, такими как бронхолегочная дисфазия и астма. Рибавирин, аналог гуанозина, обладающий противовирусной активностью, использовали для лечения детей младшего и старшего возраста с RSV бронхиолитом с середины 1980-х, но многие исследования, оценивающие его применение, показали противоречивые результаты. В большинстве центров применение рибавирина в настоящее время ограничено пациентами с иммунодефицитом и тяжелобольными. Тяжесть RSV бронхиолита была связана с низкими сывороточными концентрациями ретинола, но исследования у госпитализированных детей с RSV бронхиолитом показали, что добавление витамина А не обеспечивает положительного эффекта. Терапевтические исследования 1500 мг/кг внутривенно введенного RSV иммуноглобулина или 100 мг/кг ингаляционно введенного иммуноглобулина при RSV инфекции нижних отделов дыхательных путей также не показали значительных благоприятных эффектов. В развитых странах лечение RSV инфекции нижних отделов дыхательных путей в основном ограничено симптоматической терапией. Противовирусное лечение обычно ограничено опасными для жизни ситуациями вследствие высокой стоимости и отсутствием единого мнения в отношении эффективности. В развивающихся странах главным лечением является кислород (при его доступности) и единственным способом снижения смертности является профилактика. РНК интерференция или "РНК-i" представляет собой термин, первоначально предложенный Fire и сотрудниками для описания научных наблюдений, что двуспиральная РНК (ds-РНК) может блокировать генную экспрессию при введении червям (Fire et al, Nature 391:806-811, 1998). Короткая ds-РНК направляет геноспецифичный пост-транскрипционный сайленсиг у многих организмов, в том числе у позвоночных, и представляет новый инструмент для изучения функции гена. РНК-i была предложена в качестве способа разработки нового класса терапевтических средств. Однако до настоящего времени это главным образом оставалось предположением без демонстрации доказательств возможности терапевтического использования РНК-i. Таким образом, существует необходимость в безопасных и эффективных вакцинах против RSV,особенно для детей младшего и старшего возраста. Также существует необходимость в лекарственных средствах и способах лечения RSV инфекции во всех возрастных группах и у индивидуумов с иммунодефицитом. Также существует необходимость в научных методах для характеристики защитной иммунной реакции на RSV для изучения патогенеза этого заболевания и для облегчения скрининга лекарственных средств и вакцин. Настоящее изобретение преодолевает недостатки, ранее существующие в уровне техники, обеспечивая способы и композиции, эффективные для модуляции или профилактики RSV инфекции. В частности, настоящее изобретение вносит вклад в уровень техники, предлагая i-РНК агенты,которые, как было показано, снижают уровни RSV in vitro и in vivo, а также являются эффективным в отношении двух основных подтипов RSV и демонстрируют терапевтическую активность молекул этого класса. Краткое изложение изобретения Настоящее изобретение основано на in vitro и in vivo демонстрации того, что RSV можно ингибировать путем интраназального введения i-РНК агентов, а также парентеральным введением таких агентов,и идентификации эффективных i-РНК агентов из Р, N и L гена RSV, которые могут снижать уровни РНК,как с подтипом А, так и с подтипом В RSV. Исходя из полученных результатов, настоящее изобретение относится к особым композициям и способам, применимым для снижения уровней мРНК RSV, уровней белков RSV и титров вируса RSV у пациента, например млекопитающего, такого как человек. Настоящее изобретение в особенности относится к i-РНК агентам, главным образом, состоящим из или содержащим по меньшей мере 15 или более смежных нуклеотидов одного из генов RSV, особенно генов Р, N и L RSV, и более конкретно к агентам, содержащим 15 или более смежных нуклеотидов одной из последовательностей, представленных в табл. 1(а-с). i-РНК агент предпочтительно состоит из менее 30 нуклеотидов на цепь, например 21-23 нуклеотидов, таких как указано в табл. 1(а-с). Двухцепочечныйi-РНК агент может либо иметь тупые концы или более предпочтительно иметь выступы из 1-4 нуклеотидов с одного или обоих 3'-концов этого агента. Кроме того, i-РНК агент может либо содержать только природные рибонуклеотидные субъединицы,либо может быть синтезирован таким образом, что содержит одну или несколько модификаций сахара или основания одной или нескольких рибонуклеотидных субъединиц, включенных в этот агент. i-РНК агент дополнительно может быть модифицирован таким образом, чтобы он присоединялся к лиганду,-2 017847 который выбран для улучшения стабильности, распределения или включения в клетку этого агента, например к холестерину. i-РНК агенты дополнительно могут находиться в изолированной форме или могут представлять собой часть фармацевтической композиции, используемой для описанных здесь способов,в частности в качестве фармацевтической композиции, изготовленной для доставки в легкие или носовой ход или изготовленной для парентерального введения. Фармацевтические композиции могут содержать один или несколько i-РНК агентов и в некоторых вариантах осуществления будут содержать два или несколько i-РНК агентов, каждый из которых направлен на различные сегменты гена RSV или на два различных гена RSV. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам снижения уровней вирусной мРНКRSV в клетке. Такие способы включают в себя стадию введения пациенту одного из i-РНК агентов по настоящему изобретению, как здесь дополнительно описано ниже. В способах по настоящему изобретению используются клеточные механизмы, вовлеченные в РНК интерференцию для селективного разрушения вирусной мРНК в клетке, и в них включена стадия контактирования клетки с одним из противовирусных i-РНК агентов по настоящему изобретению. Такие способы можно выполнять непосредственно на клетке или их можно осуществлять у пациента-млекопитающего путем введения пациенту одного изi-РНК агентов/фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Снижение вирусной мРНК в клетках в результате приводит к уменьшению количества продуцируемого вирусного белка и в организме приводит к уменьшению титра реплицирующегося вируса (как показано в "Примерах"). Способы и композиции по изобретению, например способы и композиции i-РНК агента, могут быть использованы в любой дозе и/или в составе описанных здесь, а также любым путем введения, описанным здесь. Особенно важным является показанное здесь интраназальное введение i-РНК агента и его способность ингибировать репликацию вируса в респираторных тканях. Подробное изложение одного или нескольких вариантов осуществления этого изобретения приведено в прилагаемых чертежах и в приведенном ниже описании. Другие признаки, объекты и преимущества этого изобретения будут очевидны из описания, чертежей и формулы изобретения. Эта заявка включает в себя все процитированные ссылки, патенты и патентные заявки в качестве ссылок в полном объеме для любых целей. Краткое описание чертежей Фиг. 1 - in vitro ингибирование RSV с использованием i-РНК агентов. i-РНК агенты, представленные в табл. 1(а-с), были протестированы на анти-RSV активность в исследовании бляшкообразования,описанном в примерах. Каждая колонка (столбец) представляет i-РНК агент, приведенный в табл. 1(а-с),например колонка 1 представляет собой первый агент в табл. 1 а и т.д. Были идентифицированы активныеi-РНК агенты. Фиг. 2 - дозозависимое ингибирование RSV in vitro с использованием i-РНК агентов. Были протестированы примеры активных агентов из табл. 1 на анти-RSV активность в исследовании бляшкообразования, в четырех концентрациях, как описано в примерах. С тестируемыми активными i-РНК агентами был обнаружен дозозависимый ответ. Фиг. 3 - in vitro ингибирование подтипа В RSV с использованием i-РНК агентов. i-РНК агенты,представленные на фиг. 2, были протестированы на анти-RSV активность в отношении подтипа В в исследовании бляшкообразования, описанного в примерах. Тестируемые i-РНК агенты ингибировали подтип В. Фиг. 4 - in vivo ингибирование RSV с использованием i-РНК агентов. Агенты, описанные на этом чертеже, были протестированы на анти-RSV активность в модели на мышах, как описано в примерах. iРНК агенты эффективно снижали титры вируса in vivo. Фиг. 5 - in vivo ингибирование RSV с использованием AL-DP-1730. AL-DP-1730 тестировали в отношении активности в зависимости от дозы с использованием способов, приведенных в примерах. У этих агентов был показан дозозависимый ответ. Фиг. 6 - in vivo ингибирование RSV с использованием i-РНК агентов. i-РНК агенты, описанные на этом чертеже, тестировали на анти-RSV активность in vivo, как описано в примерах. Фиг. 7 - in vivo ингибирование RSV с использованием i-РНК агентов. i-РНК агенты, описанные на этом чертеже, были протестированы на анти-RSV активность in vivo, как описано в примерах. Фиг. 8 А - in vivo ингибирование RSV с использованием i-РНК агентов при местном введении. Фиг. 8 В - in vivo ингибирование RSV с использованием i-РНК агентов при доставке с помощью аэрозоля. i-РНК агенты, описанные на этом чертеже, были протестированы на анти-RSV активность invivo, как описано в этом примере. Фиг. 9 - in vivo защита от RSV инфекции с использованием i-РНК агентов. i-РНК агенты, описанные на этом чертеже, были протестированы до заражения RSV для исследования защитного действия. Подробное описание Для удобства изложения термин "нуклеотид" или "рибонуклеотид" здесь иногда используется в отношении одной или нескольких субъединиц РНК-агента. Будет понятно, что термин "рибонуклеотид" или "нуклеотид" здесь может, в случае модифицированной РНК или заменителя нуклеотида, также относиться к модифицированному нуклеотиду, или заменяющей части, дополнительно описанным ниже, в одном или нескольких положениях. Используемый здесь "РНК-агент" представляет собой немодифицированную РНК, модифицированную РНК или нуклеозид-заменитель, каждая из которых описана здесь или хорошо известна в области РНК синтеза. Хотя описаны многочисленные модифицированные РНК и нуклеозиды-заменители, предпочтительные примеры включают в себя те, которые более резистентны к разрушению нуклеазами, чем немодифицированные РНК. Предпочтительные примеры включают в себя тех, которые имеют 2' модификацию сахара, модификацию выступов одиночной цепи, предпочтительно 3'-выступа одиночной цепи, или, в частности, в случае одноцепочечной, 5'-модификацию, которая включает в себя одну или более фосфатных групп или один или несколько аналогов фосфатной группы. Используемый здесь "i-РНК-агент" (сокращенно от "интерферирующий РНК-агент") представляет собой РНК-агент, который может отрицательно регулировать экспрессию целевого гена, например RSV. Не привязываясь к теории, i-РНК-агент может действовать посредством одного или ряда механизмов,включая посттрансляционное расщепление целевой мРНК, иногда называемых в этой области РНК-i, или посредством пре-транскрипционных или пре-трансляционных механизмов. i-РНК-агент может представлять собой двухспиральный (ds) i-РНК-агент. Используемый здесь "ds i-РНК-агент" (сокращенно от "двухспиральный i-РНК-агент"), представляет собой i-РНК-агент, который включает в себя более одной и предпочтительно две спирали, в которых гибридизация внутри цепи может образовывать участок дуплексной структуры. "Спираль" здесь относится к непрерывной последовательности нуклеотидов (в том числе неприродных или модифицированных нуклеотидов). Две или несколько цепей могут быть отдельными молекулами, или каждая образовывать часть, или они могут быть ковалентно связаны, например, линкером, например полиэтиленгликолем, с образованием одной молекулы. По меньшей мере одна цепь может включать в себя участок, достаточно комплементарный целевой РНК. Такую цепь называют "антисмысловой спиралью". Вторую цепь, заключенную в ds-РНК-агент, которая содержит участок комплементарности в отношении антисмысловой цепи, называют "смысловой спиралью". Однако ds i-РНК-агент также может быть образован из одной молекулы РНК, которая является, по меньшей мере, частично самокомплементарной, образуя,например, шпилечную или длинную узкую выступающую структуру, включающую дуплексный участок. В этом случае термин "спираль" относится к одному из участков молекулы РНК, который комплементарен другому участку той же молекулы РНК. Хотя в клетках млекопитающих длинные ds i-РНК-агенты могут вызывать интерфероновый ответ,который зачастую является повреждающим, короткие ds i-РНК агенты не запускают интерфероновый ответ, по меньшей мере, не в такой степени, которая причиняет вред клетке и/или организму хозяина. iРНК-агенты по настоящему изобретению включают в себя молекулы, которые являются достаточно короткими, чтобы не запускать повреждающий интерфероновый ответ в клетках млекопитающих. Таким образом, введение композиции i-РНК-агента (например, составленной, как описано здесь) в клетки млекопитающего, может быть использовано для подавления экспрессии гена RSV, избегая повреждающего интерферонового ответа. Молекулы, которые являются достаточно короткими, что они не запускают повреждающий интерфероновый ответ, здесь называются si-РНК-агентами или si-РНК. Используемые здесь "si-РНК-агент" или "si-РНК" относятся к i-РНК-агенту, например ds i-РНК-агенту, который является достаточно коротким, что не вызывает повреждающий интерфероновый ответ в клетках человека, например имеет двуспиральный участок менее 30 пар нуклеотидов. Описанные здесь выделенные i-РНК-агенты, в том числе ds i-РНК-агенты и si-РНК-агенты, могут опосредовать подавление гена, например, путем разрушения РНК. Для удобства такая РНК также называется здесь подавляемой РНК. Такой ген также называетсягеном-мишенью. Предпочтительно подавляемая РНК представляет собой продукт гена RSV, в частности продукт гена Р, N или L. Используемая здесь фраза "опосредует РНК-i" относится к способности агента подавлять специфично последовательности ген-мишень. "Подавление гена-мишени" означает процесс, посредством которого клетка, не контактируя с этим агентом, содержит и/или секретирует определенный продукт генамишени, контактируя с этим агентом, будет содержать и/или секретировать по меньшей мере на 10, 20,30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% меньше такого генного продукта по сравнению с подобной клеткой, которая не контактировала с этим агентом. Такой продукт гена-мишени, например, может быть матричной РНК (мРНК), белком или регуляторным элементом. В противовирусных применениях настоящего изобретения подавление гена-мишени будет приводить к снижению "титра вируса" в клетке или у пациента. Используемое здесь "снижение титра вируса" относится к уменьшению числа жизнеспособных вирусов, продуцируемых клеткой или обнаруженных в организме, в котором подавляли вирусный ген-мишень. Уменьшение клеточного количества продуцированного вируса предпочтительно будет приводить к уменьшению измеряемого количества вируса, продуцируемого в тканях пациента, подвергающегося лечению, и уменьшению тяжести симптомов вирусной инфекции. i-РНК-агенты по настоящему изобретению также называются "противовирусными i-РНКагентами". Используемый здесь "ген RSV" относится к любому гену, идентифицированному в геноме вирусаRSV (см. Falsey, A.R., и Е.E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13:371-84). Эти гены хорошо известны в этой области и включают в себя N, Р и L гены, которые показаны здесь в качестве примеров. Используемый здесь термин "комплементарность" используется для обозначения достаточной степени комплементарности для осуществления стабильного и специфического связывания между соединением по изобретению и целевой молекулой РНК, например молекулой мРНК вируса RSV. Для специфического связывания необходима достаточная степень комплементарности во избежание неспецифического связывания олигомерного соединения с нецелевыми последовательностями в условиях, при которых специфическое связывание является желаемым, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo исследований или терапевтического воздействия или в случае in vitro исследований, в условиях, при которых проводят эти исследования. Нецелевые последовательности обычно отличаются по меньшей мере на 4 нуклеотида. Использованный здесь i-РНК-агент является "достаточно комплементарным" РНК-мишени, например мРНК-мишени (например, мРНК-мишени RSV), если i-РНК-агент уменьшает продукцию белка, кодируемого в клетке РНК-мишенью. i-РНК-агент также может быть "полностью комплементарным" целевой РНК, например, эта целевая РНК и i-РНК агент гибридизируются предпочтительно с образованием гибрида, сформированного исключительно из пар оснований Уотсона-Крика в области полной комплементарности. "Достаточно комплементарный" i-РНК-агент может включать в себя внутренний участок(например, по меньшей мере 10 нуклеотидов), который полностью комплементарен вирусной РНКмишени. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления i-РНК-агент специфически распознает различие в один нуклеотид. В этом случае этот i-РНК-агент только опосредует РНК-i, если полная комплементарность обнаружена в области (например, в пределах 7 нуклеотидов) с отличием в один нуклеотид. Предпочтительные i-РНК-агенты будут основаны на смысловых и антисмысловых последовательностях,представленных в примерах, или состоять или содержать их. Используемый здесь термин "по существу идентичная" при использовании в отношении первой нуклеотидной последовательности по сравнению со второй нуклеотидной последовательностью означает, что первая нуклеотидная последовательность идентична второй нуклеотидной последовательности, за исключением не более одной, двух или трех нуклеотидных замен (например, аденозин замещен урацилом). Используемый здесь термин "пациент" относится к млекопитающему, которому проводят лечение нарушения, опосредованного вирусной экспрессией, например RSV инфекции, или у которого проводят профилактическое лечение для предупреждения вирусной инфекции. Пациентом может быть любое млекопитающее, такое как примат, корова, лошадь, мышь, крыса, собака, свинья, коза. В предпочтительном варианте осуществления пациентом является человек. Используемое здесь лечение RSV инфекции относится к улучшению любых биологических или патологических показателей, которые 1) опосредованы частично наличием вируса в организме пациента и 2) на исход которых может влиять снижение уровня присутствующих продуктов гена вируса. Создание и выбор i-РНК-агентов. Настоящее изобретение основано на демонстрации подавления гена-мишени респираторного вируса in vivo после местного введения в легкие и носовые ходы i-РНК-агента, либо посредством интраназального введения/ингаляции, либо системно/парентерально посредством инъекции и в результате лечения вирусной инфекции. Настоящее изобретение дополнительно распространяется на применение i-РНКагентов в отношении нескольких респираторных вирусов и лечение обеих вирусных инфекций совместным введением двух и более i-РНК-агентов. На основе этих результатов это изобретение особенно относится к i-РНК-агенту, который может быть использован при лечении вирусной инфекции, в частности респираторных вирусов и, в частности,RSV инфекции, в изолированной форме и в виде описанной ниже фармацевтической композиции. Такие агенты будут включать в себя смысловую цепь, имеющую по меньшей мере 15 или более смежных нуклеотидов, комплементарных вирусному гену, и антисмысловую цепь, имеющую по меньшей мере 15 или более смежных нуклеотидов, комплементарных последовательности смысловой цепи. Особенно эффективными являются i-РНК-агенты, состоящие, по существу состоящие из нуклеотидной последовательности из генов Р, N и L RSV, приведенной в табл. 1(а-с), или содержащие ее.i-РНК-агенты по настоящему изобретению основаны и содержат по меньшей мере 15 или более смежных нуклеотидов из одного из i-РНК-агентов, активность которых показана в табл. 1(а-с). В таких агентах этот агент может состоять, по существу состоять из полной последовательности, приведенной в этой таблице, или содержать ее, или может содержать 15 или более смежных остатков, приведенных в табл. 1(а-с) наряду с дополнительными нуклеотидами смежных участков гена-мишени.i-РНК-агент можно рационально создать на основе информации о последовательности и желаемых характеристиках и информации, представленной в табл. 1(а-с). Например, i-РНК-агент можно создать в соответствии с последовательностью агентов, представленных в таблицах, а также принимая во внимание полную кодирующую последовательность гена-мишени. В соответствии с этим, настоящее изобретение относится к i-РНК-агентам, содержащим смысловую цепь и антисмысловую цепь, каждая содержит последовательность по меньшей мере 15-21 или 23 нук-5 017847 леотидов, которая по существу идентична, как определено выше, части гена респираторного вируса, в частности Р, N или L генам белка RSV. Характерные i-РНК-агенты включают в себя агенты, содержащие 15 или более смежных нуклеотидов одного из агентов, представленных в табл. 1(а-с). Антисмысловая цепь i-РНК-агента должна быть равной длины или, по меньшей мере, быть длиной 15-19, 25, 29, 40 или 50 нуклеотидов. Ее длина должна быть равной или меньше 50, 40 или 30 нуклеотидов. Предпочтительные диапазоны составляют длину 15-30, от 17 до 25, от 19 до 23 и от 19 до 21 нуклеотидов. Характерные i-РНК-агенты включают в себя цепь, содержащую 15 или более нуклеотидов одной из антисмысловых цепей одного из агентов, представленных в табл. 1(а-с). Смысловая цепь i-РНК-агента должна быть равной или быть по меньшей мере 15-19, 25, 29, 40 или 50 нуклеотидов в длину. Ее длина должна быть равной или должна быть меньше 50, 40 или 30 нуклеотидов. Предпочтительными диапазонами длины являются 15-30, от 17 до 25, от 19 до 23 и от 19 до 21 нуклеотидов. Характерные i-РНК-агенты включают в себя цепи, содержащие 15 или более нуклеотидов из одной из смысловых цепей одного из агентов, представленных в табл. 1(а-с). Двуспиральный участок i-РНК-агента должен быть равен или быть, по меньшей мере, длиной 1525, 29, 40 или 50 пар нуклеотидов. Его длина должна быть равной или быть менее 50, 40 или 30 пар нуклеотидов. Предпочтительные диапазоны длины составляют 15-30, от 17 до 25, от 19 до 23 и от 19 до 21 пар нуклеотидов. Длина каждой цепи агентов, представленных в табл. 1(а-с), составляет 21 нуклеотид. i-РНК-агенты содержат двуспиральный участок из 19 нуклеотидов с 2-нуклеотидным выступом на каждом 3'-конце агента. Эти агенты могут быть модифицированы, как описано здесь, для получения эквивалентных агентов, содержащих, по меньшей мере, часть этих последовательностей (15 или более смежных нуклеотидов) и/или модификаций в отношении нуклеотидных оснований и связей. В основном i-РНК-агенты настоящего изобретения включают в себя участок достаточной комплементарности к гену вируса, например Р, N или L белку RSV, и нуклеотидная длина которых достаточна для того, чтобы этот i-РНК-агент или его фрагмент, мог опосредовать отрицательную регуляцию специфического вирусного гена. Антисмысловые цепи i-РНК-агентов по настоящему изобретению предпочтительно полностью комплементарны последовательностям мРНК гена вируса, как здесь для Р, L или N белка RSV. Однако идеальная комплементарность между i-РНК-агентом и мишенью не является обязательной, но соответствие должно быть достаточным для обеспечения возможности i-РНК-агента или продукта его расщепления осуществлять прямой специфический сайленсинг последовательности, например, посредством РНК-i расщепления мРНК RSV. Следовательно, i-РНК-агенты по настоящему изобретению включают в себя смысловую цепь и антисмысловую цепь, каждая содержит последовательность по меньшей мере 16, 17 или 18 нуклеотидов,которые по существу идентичны, как определено ниже, одной из последовательностей гена вируса, в частности Р, N или L белка RSV, такой как агент, представленный в табл. 1(а-с), за исключением того,что не более 1, 2 или 3 нуклеотидов в цепи соответственно замещено другими нуклеотидами (например,аденозин заменен урацилом), по существу сохраняя способность ингибировать экспрессию RSV в культивируемых клетках человека, как определено ниже. Эти агенты, следовательно, будут содержать по меньшей мере 15 или более нуклеотидов, идентичных одной из последовательностей гена вируса, в частности генам белков Р, L или N RSV, но введено 1, 2 или 3 основания спаренных вопреки принципу комплементарности в отношении либо последовательности-мишени мРНК вируса, либо между смысловой и антисмысловой цепью. Некомплементарные спаривания с последовательностью-мишенью мРНК вируса,особенно в антисмысловой цепи, являются наиболее допустимыми в концевых областях и при их наличии предпочтительно находятся в концевой области или областях, например, в пределах 6, 5, 4 или 3 нуклеотидов 5'- и/или 3'-конца, наиболее предпочтительно в пределах 6, 5, 4 или 3 нуклеотидов 5'-конца смысловой цепи или 3'-конца антисмысловой цепи. Смысловая цепь должна быть только достаточно комплементарной антисмысловой цепи для сохранения двуспирального характера молекулы по всей длине. Предпочтительно, чтобы смысловая и антисмысловая цепи были выбраны так, чтобы i-РНК-агент включал в себя одну цепь или неспаренный участок на одном или обоих концах этой молекулы, например, приведенные в качестве примера в табл. 1(а-с). Следовательно, i-РНК-агент содержит смысловую и антисмысловую цепи, предпочтительно спаренные таким образом, что содержат выступ, например один или два 5'- либо 3'-выступа, но предпочтительно 3'-выступ из 2-3 нуклеотидов. Большинство вариантов осуществления будут иметь 3'-выступ. Предпочтительные si-РНК-агенты будут иметь одноцепочечные выступы, предпочтительно 3'-выступы, от 1 до 4, или предпочтительно 2 или 3 нуклеотида в длину, на одном или обоих концах i-РНК-агента. Выступы могут быть результатом того, что одна цепь длиннее другой, или результатом того, что две цепи одинаковой длины были смещены. 5'-концы предпочтительно фосфорилированы. Предпочтительная длина дуплексного участка составляет от 15 до 30, наиболее предпочтительно 18-23 нуклеотида в длину, например в ряду si-РНК-агентов, рассмотренных выше. Также включены варианты осуществления, в которых две цепи si-РНК-агента связаны, например ковалентно связаны. Шпилька или другие одноцепочечные структуры, предоставляющие желаемую двухцепочечную область,-6 017847 и предпочтительно 3'-выступ также входят в это изобретение. Оценка i-РНК агентов-кандидатов. Можно оценить способность i-РНК агента-кандидата к отрицательной регуляции экспрессии генамишени. Например, i-РНК агент-кандидат может быть предоставлен и приведен во взаимодействие с клеткой, например клеткой человека, которая была инфицирована или будет инфицирована интересующим вирусом, например вирусом, содержащим ген-мишень. Альтернативно, клетка может быть трансфектирована конструкцией, экспрессирующей вирусный ген-мишень, таким образом избегая необходимости вирусного инфицирования модели. Уровень экспрессии гена-мишени до и после контакта с i-РНК агентом-кандидатом можно сравнить, например, по РНК, уровню белка или титру вируса. Если определено, что количество РНК, белка или вируса, экспрессированного из гена-мишени, меньше после контакта с i-РНК-агентом, то можно сделать вывод о том, что этот i-РНК-агент отрицательно регулирует экспрессию гена-мишени. Уровень вирусной РНК-мишени или вирусного белка в клетке или титра вируса в клетке или ткани можно определить любым желаемым способом. Например, уровень РНК-мишени можно определить нозерн-блоттингом, обратно-транскрипционной полимеразно-цепной реакцией (ОТ-РЦР),b-ДНК анализом или анализом защиты от РНКазы. Уровень белка можно определить, например, вестернблот анализом или с помощью иммунофлуоресценции. Титр вируса можно определить в анализе бляшкообразования. Тестирование стабильности, модификация и повторное тестирование i-РНК-агентов.i-РНК агент-кандидат можно оценить в отношении стабильности, например его подверженность расщеплению эндонуклеазой или экзонуклеазой, например, когда i-РНК-агент вводят в организм пациента. Могут быть использованы способы для идентификации сайтов, подверженных модификации, в частности расщеплению, например расщеплению под действием компонента, находящегося в организме пациента. После идентификации сайтов, подверженных расщеплению, может быть сконструирован и/или синтезирован новый i-РНК-агент, в котором возможный сайт расщепления делают устойчивым к расщеплению, например, путем введения 2'-модификации на участке расщепления, например, 2'-О-метильной группы. Этот новый i-РНК-агент может быть повторно тестирован на стабильность и этот процесс можно повторять, пока не будет обнаружено, что i-РНК проявляет желаемую стабильность. Тестирование in vivo.i-РНК-агент, идентифицированный как способный ингибировать экспрессию вирусного гена, может быть протестирован на функциональную активность in vivo в модели на животных (например, у млекопитающего, например у мыши, крысы или примата), как показано в примерах. Например, i-РНК-агент можно вводить животному и i-РНК-агент можно оценить в отношении его биораспределения, стабильности и его способности ингибировать экспрессию гена вируса, например RSV, или снижать титр вируса.i-РНК-агент можно вводить непосредственно в целевую ткань, например, путем инъекции или iРНК-агент можно вводить в животную модель таким же образом, которым вводили бы человеку. Как показано здесь, этот агент предпочтительно можно вводить путем ингаляции в виде средства для лечения вирусной инфекции.i-РНК-агент также можно оценить в отношении его внутриклеточного распределения. Такая оценка может включать в себя определение, попал ли i-РНК-агент в клетку. Такая оценка также может включать в себя определение стабильности (например, полужизни) i-РНК-агента. Оценку i-РНК-агента in vivo можно облегчить, используя i-РНК-агент, конъюгированный с детектируемой меткой (например, флуоресцентной меткой, такой как флуоресцин; радиоактивной меткой, такой как 35S, 32P, 33 Р или 3 Н; частицами золота или антигенными частицами для иммуногистохимии) или другим подходящим способом определения.i-РНК-агент можно оценить в отношении его способности отрицательно регулировать экспрессию вирусного гена. Уровни экспрессии вирусного гена in vivo можно определить, например, гибридизациейin situ, или путем выделения РНК из ткани до и после воздействия i-РНК-агента. В тех случаях, когда животном необходимо пожертвовать для получения ткани, контрольное животное, не подвергавшееся воздействию, будет служить для сравнения. Вирусную мРНК-мишень можно выявлять любым желаемым способом, в том числе, но не только, ОТ-РЦР, нозерн-блоттингом, методом разветвленной ДНК или анализом защиты от РНКазы. Альтернативно или дополнительно, экспрессию вирусного гена можно контролировать путем проведения вестерн-блоттинга на тканевых экстрактах, обработанных i-РНК-агентом,или с помощью ELISA. Титр вируса можно определить, используя анализ количества бляшкообразующих единиц. Химия i-РНК. Здесь описаны выделенные i-РНК-агенты, например ds-РНК-агенты, которые опосредуют РНК-i для ингибирования экспрессии вирусного гена, например Р белка RSV. Рассмотренные здесь РНК-агенты включают в себя другие немодифицированные РНК, а также РНК, которые были модифицированы, например, для улучшения эффективности, и полимеры заменителей нуклеозидов. Немодифицированная РНК относится к молекуле, в которой компоненты нуклеиновой кислоты, а именно сахара, основания и фосфатные части, такие же, или по существу такие же, как встре-7 017847 чаются в природе, предпочтительно которые естественным образом встречаются в организме человека. В этой области упоминались редкие или необычные, но встречающиеся в природе РНК, в виде модифицированных РНК, см., например, Limbach et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2183-2196. Такие редкие или необычные РНК, часто называемые модифицированными РНК (по-видимому, вследствие того, что они являются результатом пост-транскрипционной модификации) при использовании здесь входят в понятие немодифицированной РНК. Используемая здесь модифицированная РНК относится к молекуле, в которой один или несколько компонентов нуклеиновой кислоты, а именно сахара, основания и фосфатные части, отличаются от таковых, встречающихся в природе, предпочтительно, отличные от тех, которые встречаются в организме человека. Хотя их называют модифицированными "РНК" они, разумеется,вследствие модификации будут включать в себя молекулы, которые не являются РНК. Заменители нуклеозидов представляют собой молекулы, в которых рибофосфатный скелет заменен нерибофосфатной конструкцией, что позволяет основаниям находиться в правильном пространственном расположении так,чтобы гибридизация была, по существу, сходной с гибридизацией, наблюдаемой с рибофосфатным скелетом, например незаряженные вещества, имитирующие рибофосфатный скелет. Здесь рассмотрены примеры всего, приведенного выше. Описанные здесь модификации могут быть внесены в любую двухспиральную РНК и описанную здесь РНК-подобную молекулу, например i-РНК-агент. Может быть желательно модифицировать одну или обе, антисмысловую и смысловую цепи i-РНК-агента. Поскольку нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры субъединиц или мономеров, многие модификации, описанные ниже, встречаются в положении, которое повторяется в нуклеиновой кислоте, например модификация основания, или фосфатной части, или несвязывающего О фосфатной части. В некоторых случаях модификация будет встречаться в нуклеиновой кислоте во всех положениях, подвергаемых воздействию, но во многих, и в действительности в большинстве случаев, этого не произойдет. Для примера модификация может встречаться только в 3'- или 5'-концевом положении, может только встречаться в терминальной области, например в положении на концевом нуклеотиде или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах цепи. Модификация может встречаться в двуспиральном участке, односпиральном участке или в обоих. Например, фосфоротиоатная модификация в положении не связывающего О может встречаться только на одном или обоих концах, может встречаться только в терминальных областях, например, в положении на концевом нуклеотиде или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах цепи, или может встречаться в двуспиральной и односпиральной областях, особенно на концах. Подобным образом модификация может встречаться в смысловой цепи, антисмысловой цепи или на обеих. В некоторых случаях смысловая и антисмысловая цепи будут иметь одинаковые модификации или модификации того же класса, а в других случаях смысловая и антисмысловая цепи будут иметь различные модификации, например, в некоторых случаях это может быть желательно для модификации только одной цепи, например смысловой цепи. Две основные задачи для введения модификаций в i-РНК-агенты представляют собой стабилизацию в отношении расщепления в биологическом окружении и улучшение фармакологических свойств, например фармакодинамических свойств, которые дополнительно рассмотрены ниже. Другие подходящие модификации сахара, основания или скелета i-РНК-агента описаны в совместно поданной заявке PCT/US 2004/01193, поданной 16 января 2004. i-РНК-агент может включать в себя неприродное основание, например основание, описанное в совместно поданной заявке PCT/US 2004/011822, поданной 16 апреля 2004. i-РНК-агент может включать в себя неприродный сахар, например неуглеводную циклическую молекулу-носитель. Характерные особенности неприродных сахаров для использования в i-РНК-агентах описаны в совместно поданной заявке PCT/US 2004/11829, поданной 16 апреля 2003.i-РНК-агент может содержать межнуклеотидную связь (например, хиральную фосфоротиоатную связь), пригодную для повышения устойчивости к действию нуклеазы. Дополнительно или альтернативно, i-РНК-агент может включать в себя рибозоподобное соединение для повышенной устойчивости к нуклеазе. Характерные межнуклеотидные связи и рибозоподобные вещества для повышенной устойчивости к нуклеазе описаны в совместно поданной заявке PCT/US 2004/07070 поданной 8 марта 2004.i-РНК-агент может включать в себя мономерные субъединицы, конъюгированные с лигандом, и мономеры для синтеза олигонуклеотидов. Характерные мономеры описаны в совместно поданной заявке США 10/916185, поданной 10 августа 2004.i-РНК-агент может образовывать комплекс с амифипатической частью. Характерные амифипатические части для использования с i-РНК-агентами описаны в совместно поданной заявке PCT/US 2004/07070, поданной 8 марта 2004. В другом варианте осуществления i-РНК-агент может быть составлен в комплексное вещество для доставки, особенностью которого является модульный комплекс. Этот комплекс может включать в себя носитель, связанный с одним или более (предпочтительно двумя или более, более предпочтительно всеми тремя) из: (а) конденсирующим агентом (например, веществом, способным притягивать, например связывать, нуклеиновую кислоту, например, посредством ионных или электростатических взаимодействий); (b) агентом слияния (например, вещества, способного сливаться и/или транспортироваться через клеточную мембрану) и (с) наводящей группой, например агентом, наводящим на клетку или ткань, лектином, гликопротеином, липидом или белком, например антителом, которое связывается с заданным типом клетки. i-РНК-агенты, составленные в комплексное вещество для доставки, описаны в совместно поданной заявке PCT/US 2004/07070, поданной 8 марта 2004.i-РНК-агент может иметь неканонические спаривания, например, между смысловой и антисмысловой последовательностями дуплекса i-РНК. Характерные особенности неканонических i-РНК-агентов описаны в совместно поданной заявке PCT/US 2004/07070, поданной 8 марта 2004. Повышенная устойчивость к нуклеазе.i-РНК-агент, например i-РНК-агент, который нацелен на RSV, может иметь повышенную устойчивость к нуклеазам. Для повышенной устойчивости к нуклеазе и/или афинности связывания с мишенью i-РНК-агент,например смысловая и/или антисмысловая цепь i-РНК-агента, может содержать, например, 2'модифицированные рибозные звенья и/или фосфоротиоатные связи. Например, 2' гидроксильная группа(ОН) может быть модифицирована или заменена рядом различных "окси" или "дезокси" заместителей. Примеры модификаций "окси"-2' гидроксильной группы включают в себя алкокси или арилокси(ПЭГ), О(СН 2 СН 2 О)nCH2CH2OR; "замкнутые" нуклеиновые кислоты (LNA), в которых 2' гидроксил соединен, например, метиленовым мостиком с 4' углеродом той же рибозы; O-АМИН и аминоалкокси,О(СН 2)n-АМИН, (например, АМИН=NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклиламино, ариламино,диариламино, гетероариламино или дигетероариламино, этилендиамин, полиамино). Заслуживает внимания то, что олигонуклеотиды, содержащие только метоксиэтильную группу (МОЕ), (ОСН 2 СН 2 ОСН 3,производные ПЭГ), демонстрируют устойчивость к нуклеазе, сравнимую с таковой у олигонуклеотидов,модифицированных робустфосфоротиоатной модификацией."Дезокси" модификации включают в себя водород (т.е. дезоксирибозные сахара, которые являются особенно релевантными выступающим частям частично ds-РНК); галоген (например, фтор); амино (например, NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино,дигетероариламино или аминокислота); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-АМИН (АМИН=NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклиламино, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино), NHC(O)R (R=алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероарил или сахар), циано; меркапто; алкил-тиоалкил; тиоалкокси и алкил, циклоалкил, арил, алкенил и алкинил, которые необязательно могут быть заменены, например, функциональной аминогруппой. Предпочтительными заместителями являются 2'-метоксиэтил, 2'-ОСН 3, 2'-O-аллил, 2'-С-аллил и 2'фтор. Одним путем повышения резистентности является идентификация сайтов расщепления и модификация таких сайтов для ингибирования расщепления, как описано в совместно поданной заявке США 60/559917, поданной 4 мая 2004. Например, динуклеотиды 5'-UA-3', 5'-UG-3', 5'-CA-3', 5'-UU-3' или 5'СС-3' могут служить в качестве сайтов расщепления. Следовательно, повышенная устойчивость к нуклеазе может быть достигнута путем модифицирования 5'-нуклеотида, получая, в результате, например,по меньшей мере один 5'-уридин-аденин-3' (5'-UA-3') динуклеотид, где уридин представляет собой 2'модифицированный нуклеотид; по меньшей мере один 5'-уридин-гуанин-3' (5'-UG-3') динуклеотид, где 5'-уридин представляет собой 2'-модифицированный нуклеотид; по меньшей мере один 5'-цитидинаденин-3' (5'-СА-3') динуклеотид, где 5'-цитидин представляет собой 2'-модифицированный нуклеотид; по меньшей мере один 5'-уридин-уридин-3' (5'-UU-3') динуклеотид, где 5'-уридин представляет собой 2'модифицированный нуклеотид; или по меньшей мере один 5'-цитидин-цитидин-3' (5'-СС-3') динуклеотид, где 5'-цитидин представляет собой 2'-модифицированный нуклеотид. i-РНК-агент может включать в себя по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 таких динуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления все пиримидины i-РНК-агента несут 2'-модификацию, и,следовательно, i-РНК-агент обладает повышенной устойчивостью к эндонуклеазам. Для максимального увеличения резистентности к нуклеазе 2' модификации можно использовать в комбинации с одним или несколькими модификациями фосфатного линкера (например, фосфоротиоат). Так называемыми "химерными" олигонуклеотидами являются нуклеотиды, содержащие две или более различных модификаций. Включение сахаров в фуранозной форме в олигонуклеотидный скелет также может снижать эндонуклеолитическое расщепление. i-РНК-агент дополнительно может быть модифицирован включением 3' катионной группы или инвертированием нуклеозида на 3'-конце 3'-3' связью. В другом варианте 3'-конец может быть блокирован аминоалкильной группой, например 3' C5-аминоалкил dT. Другие 3'-конъюгаты могут ингибировать 3'-5' экзонуклеолитическое расщепление. Не привязываясь к теории, 3'-конъюгат,такой как напроксен или ибупрофен, может ингибировать экзонуклеолитическое расщепление путем стерического блокирования экзонуклеазы от связывания с 3'-концом олигонуклеотида. Даже небольшие алкильные цепи, арильные группы или гетероциклические конъюгаты или модифицированные сахара привязываясь к теории, 5'-конъюгат, такой как напроксен или ибупрофен, может ингибировать экзонуклеолитическое расщепление путем стерического блокирования экзонуклеазы от связывания с 5'-концом олигонуклеотида. Даже небольшие алкильные цепи, арильные группы или гетероциклические конъюгаты или модифицированные сахара (D-рибоза, дезоксирибоза, глюкоза и т.д.) могут блокировать 3'-5'экзонуклеазы.i-РНК-агент может иметь повышенную устойчивость к нуклеазам в тех случаях, когда двуспиральный i-РНК-агент включает в себя односпиральный нуклеотидный выступ по меньшей мере на одном конце. В предпочтительных вариантах осуществления нуклеотидный выступ включает в себя от 1 до 4,предпочтительно от 2 до 3 непарных нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления непарный нуклеотид односпирального выступа, который непосредственно прилегает к концевой паре нуклеотидов, содержит пуриновое основание, а концевая пара нуклеотидов представляет собой пару G-C, или по меньшей мере две из последних четырех комплементарных пар нуклеотидов представляют собой пары G-C. В дополнительных вариантах осуществления нуклеотидный выступ может иметь 1 или 2 непарных нуклеотида и в приводимом в качестве примера варианте осуществления нуклеотидный выступ представляет собой 5'-GC-3'. В предпочтительных вариантах осуществления нуклеотидный выступ находится на 3'-конце антисмысловой цепи. В одном варианте осуществления i-РНК-агент включает в себя 5'CGC-3' мотив на 3'-конце антисмысловой цепи так, что образуется 2-нуклеотидный выступ 5'-GC-3'. Таким образом, i-РНК-агент может включать в себя модификации таким образом, чтобы ингибировать разрушение, например, нуклеазами, например эндонуклеазами или экзонуклеазами, находящимися в организме пациента. Эти мономеры здесь называются NRM, или мономерами, стимулирующими устойчивость к нуклеазе, соответствующие модификации - NRM-модификациями. Во многих случаях эти модификации будут модулировать также и другие свойства i-РНК-агента, например способность взаимодействовать с белком, например транспортным белком, например сывороточным альбумином или членом RISC, или способность первой и второй последовательностей образовывать дуплекс с другой либо образовывать дуплекс с другой последовательностью, например молекулой-мишенью. В i-РНК-агент или последовательность i-РНК агента можно вводить одну или несколько NRM модификаций. NRM модификацию можно использовать больше одного раза в последовательности или в iРНК-агенте.NRM модификации включают в себя некоторые модификации, которые могут располагаться только на концах, и другие, которые могут следовать в любом положении. Некоторые NRM модификации, которые могут ингибировать гибридизацию, предпочтительно используют только в концевых областях и более предпочтительно не в сайте расщепления или в области расщепления последовательности, которая нацелено воздействует на последовательность или ген, особенно на антисмысловую цепь. Их можно использовать всюду в смысловой цепи при условии сохранения достаточной гибридизации между двумя цепями ds i-РНК-агента. В некоторых вариантах осуществления желательно поместить NRM в сайт расщепления или в область расщепления смысловой цепи, поскольку это может свести к минимуму нецелевое подавление. В большинстве случаев NRM модификации будут распределяться по-разному в зависимости от того, содержатся ли они на смысловой или антисмысловой цепи. На антисмысловой цепи модификации,которые препятствуют или ингибируют эндонуклеазное расщепление, не следует вставлять в область,которая подвергается RISC-опосредованному расщеплению, например, сайт расщепления или область расщепления (как описано у Elbashir et al., 2001, Genes and Dev. 15: 188, здесь включено в качестве ссылки). Расщепление мишени происходит примерно в середине 20 и 21 нуклеотида антисмысловой цепи или примерно 10 или 11 нуклеотидов выше первого нуклеотида на целевой мРНК, которая комплементарна антисмысловой цепи. Используемый здесь сайт расщепления относится к нуклеотидам либо на стороне сайта расщепления, на целевой мРНК, либо на цепи i-РНК-агента, которая гибридизируется с ним. Область расщепления означает нуклеотиды в пределах 1, 2 или 3 нуклеотидов сайта расщепления в том и другом направлении. Такие модификации могут быть введены в концевые области, например в концевое положение или в пределах 2, 3, 4 или 5 положения этого конца, последовательности, которая нацелено воздействует, или последовательности, которая нацелено не воздействует на последовательность пациента. Привязанные лиганды. На свойства i-РНК-агента, в том числе его фармакологические свойства, можно воздействовать или их можно задавать, например, путем введения лигандов, например привязанных лигандов. К i-РНК-агенту можно привязать большое разнообразие веществ, например лигандов, например, к носителю субъединицы мономера, конъюгированного с лигандом. Ниже описаны примеры применительно к мономерной субъединице, конъюгированной с лигандом, но она является только предпочтительной, вещества могут быть соединены с i-РНК-агентом в других местах. Предпочтительными лигандами являются лиганды, которые соединены, предпочтительно ковалентно, либо напрямую, либо опосредованно через промежуточную связь с носителем. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд присоединен к носителю через промежуточную связь. Лиганд, или привязанный лиганд может присутствовать на мономере, конъюгированном с лигандом, когда мономер,- 10017847 конъюгированный с лигандом, встроен в растущую цепь. В некоторых вариантах осуществления лиганд может быть встроен в "предшественник" субъединицы мономера, конъюгированной с лигандом, после того, как "предшественник" субъединицы мономера, конъюгированной с лигандом, был встроен в растущую цепь. Например, мономер, имеющий, например, аминоконцевую связь, например ТАР-(СН 2)nNH2,может быть встроен в растущую смысловую или антисмысловую цепь. В последующем процессе, т.е. после встраивания предшественника субъединицы мономера в цепь, лиганд, имеющий электрофильную группу, например пентафторфениловый сложный эфир или альдегидную группу, впоследствии может быть присоединен к предшественнику мономера, конъюгированного с лигандом, путем присоединения электрофильной группы лиганда к концевой нуклеофильной группе связи предшественника субъединицы мономера, конъюгированной с лигандом. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд изменяет распределение, нацеленное воздействие или время жизни i-РНК-агента, в который он встроен. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд обеспечивает повышенную афинность к выбранной мишени, например молекуле, клетке или клеточному типу, компартменту, например компартменту клетки или организма, ткани, органу или участку тела, например, по сравнению с разновидностями, не имеющими такого лиганда. Предпочтительные лиганды могут улучшать транспорт, гибридизацию и специфические свойства, а также могут улучшать резистентность к нуклеазам полученного в результате природного или модифицированного олигонуклеотида, или полимерной молекулы, содержащей только комбинацию описанных здесь мономеров и/или природных или модифицированных рибонуклеотидов. Вообще, лиганды могут включать в себя терапевтические модификаторы, например, для усиления захвата; диагностические соединения или репортерные группы, например, для мониторинга распределения; поперечно-сшивающие агенты; части, придающие устойчивость к нуклеазе; и природные или неприродные нуклеиновые основания. Общие примеры включают в себя липофильные молекулы, липиды,лектины, стероиды (например, уваол, гецигенин, диосгенин), терпены (например, тритерпены, например сарсасапогенин, фриеделин, эпифриеделанольное производное литохолевой кислоты), витамины, углеводы (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновая кислота),белки, вещества, связывающие белки, нацеливающие молекулы интегрина, поликатионы, пептиды, полиамины и пептидомиметики. Лиганд может быть природной или рекомбинантной либо синтетической молекулой, такой как синтетический полимер, например синтетическая полиаминокислота. Примеры полиаминокислот включают в себя полиаминокислоту полилизин (PLL), поли L-аспарагиновую кислоту, поли L-глутаминовую кислоту, сополимер стирена и малеинового ангидрида, сополимер поли (L-лактид-ко-гликолид), сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида, сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламид (НМРА),полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловая кислота),полимеры N-изопропилакриламида или полифосфазин. Примеры полиаминов включают в себя полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, пептидоподобный полиамин, дендримерный полиамин, аргинин, амидин, протамин, катионные части, например катионный липид, катионный порфирин, четвертичная соль полиамина или альфа-спиральный пептид. Также лиганды могут включать в себя наводящие группы, например агенты, наводящие на клетку или ткань, например тиротропин, меланотропин, белок А сурфактанта, муцин, гликозилированная полиаминокислота, трансферрин, бисфосфонат, полиглутамат, полиаспартат или RGD пептид или RGDподобный пептид. Лигандами могут быть белки, например гликопротеины, липопротеины, например липопротеины низкой плотности (ЛПНП), или альбумины, например сывороточный альбумин человека (САЧ), или пептиды, например молекулы, обладающие специфической афинностью к со-лиганду, или антитела, например антитело, которое связывается с заданным типом клеток, например злокачественными клетками или остеоцитами. Лиганды также могут включать в себя гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать в себя непептидные виды, такие как кофакторы, мультивалентная лактоза, мультивалентная галактоза, N-ацетил-галактозамин, N-ацетил-глюкозамин, мультивалентная маноза или мультивалентная фукоза. Лигандом может быть, например, липополисахарид, активатор р 38 MAP киназы или активаторNF-B. Лигандом может быть вещество, например лекарственное средство, которое может усиливать поступление i-РНК-агента в клетку, например, путем разрушения клеточного цитоскелета, например, путем разрушения клеточных микротрубочек, микрофиламентов и/или промежуточных филаментов. Этим лекарственным средством может быть, например, таксон, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, джасплакинолид, латрункулин А, фаллоидин, свинхолид А, инданоцин или миосервин. В одном аспекте лиганд представляет собой липид или молекулу на основе липида. Такой липид или молекула на основе липида предпочтительно связывается с сывороточным белком, например сывороточным альбумином человека (САЧ). Другие молекулы, которые могут связываться с САЧ, также могут быть использованы в качестве лигандов. Например, может быть использован непроксин или аспирин. Липидный лиганд или лиганд на основе липида может (а) повышать устойчивость к разрушению конъюгата, (b) улучшать наведение или увеличивать транспорт в клетку-мишень или клеточную мембрану и/или (с) может быть использован для регуляции связывания с сывороточным белком, например САЧ. Лиганд на основе липида может быть использован для модуляции, например регуляции связывания конъюгата с тканью-мишенью. Например, липид или лиганд на основе липида, который связывается с САЧ прочнее, с меньшей вероятностью будет направляться в почки и, следовательно, с меньшей вероятностью будет выводиться из организма. Липидный лиганд или лиганд на основе липида, который связывается с САЧ менее прочно, может быть использован для направления этого конъюгата в почки. В предпочтительном варианте осуществления лиганд на основе липида связывается с САЧ. Предпочтительно он связывается с САЧ с достаточной афинностью так, что этот конъюгат предпочтительно будет распределяться в непочечную ткань. Однако предпочтительно, чтобы афинность не была такой высокой, что связывание САЧ-лиганд было необратимым. В другом аспекте лиганд представляет собой вещество, например витамин или питательное вещество, которое поглощается клеткой-мишенью, например пролиферирующей клеткой. Они особенно применимы при лечении заболеваний, характеризующихся нежелательной клеточной пролиферацией, например, злокачественного или незлокачественного типа, например, злокачественных клеток. Примеры витаминов включают в себя витамины А, Е и K. Другие витамины, которые можно привести в качестве примера, включают в себя витамины группы В, например фолиевую кислоту, В 12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль или другие витамины или питательные вещества, поглощаемые злокачественными клетками. В другом аспекте лиганд представляет собой вещество, проникающее в клетку, предпочтительно спиральное вещество, проникающее в клетку. Предпочтительно это вещество является амфипатическим. Характерным примером является пептид, такой как tat или antennapedia. Если этот агент представляет собой белок, он может быть модифицирован, включая пептидилподобные, инвертомеры, непептидные или псевдо-пептидные связи, и использование D-аминокислот. Спиральный агент предпочтительно представляет собой альфа-спиральный агент, который предпочтительно имеет липофильную и липофобную фазы. Модификации 5'-фосфата. В предпочтительных вариантах осуществления i-РНК-агенты являются 5' фосфорилированными или включают в себя фосфорильный аналог в начале 5'-конца. Модификации 5'-фосфата антисмысловой цепи включают в себя модификации, которые совместимы с опосредованным RISC подавлением гена. Подходящие модификации включают в себя 5'-монофосфат НО)2(О)Р-O-5'); 5'-дифосфат НО)2(О)Р-ОР(НО)(О)-O-5'); 5'-трифосфат НО)2(О)Р-O-(НО)(О)Р-О-Р(НО)(О)-O-5'); 5'-гуанозиновый кэп (7 метилированный или неметилированный) (7m-G-O-5'-(НО)(О)P-O-(НО)(О)P-О-P(НО)(О)-O-5'); 5'аденозиновый кэп (Аррр) и любую модифицированную или немодифицированную нуклеотидную кэпструктуру. Другие подходящие модификации 5'-фосфата будут известны специалисту. Смысловую цепь можно модифицировать для инактивации смысловой цепи и предотвращения образования активных RISC, тем самым потенциально уменьшая нецелевые эффекты. Это можно осуществить путем модификации, которая предотвращает 5'-фосфорилирование смысловой цепи, например, путем модификации 5'-О-метилрибонуклеотидом (см. Nykanen et al., (2001) ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 107, 309-321.) Также могут быть использованы другие модификации, которые предотвращают фосфорилирование, например простое замещение 5'ОН на Н, а не О-Ме. Альтернативно, крупную объемную группу можно добавить к 5'-фосфату, преобразовывая его в фосфодиэфирную связь. Доставка i-РНК-агентов в ткани и клетки. Композиции. Описанные здесь i-РНК-агенты могут быть составлены для введения пациенту, предпочтительно для местного введения в легкие и носовой ход (респираторные ткани) путем ингаляции или интраназального введения, или парентерально, например, путем инъекции. Для упрощения изложения составы, композиции и способы в этом разделе рассматриваются в основном в отношении немодифицированных i-РНК-агентов. Однако должно быть понятно, что эти составы, композиции и способы могут использоваться на практике с другими i-РНК-агентами, например модифицированными i-РНК-агентами, и такое использование входит в объем этого изобретения. Составленная композиция i-РНК-агента может принимать целый ряд форм. В некоторых примерах композиция является, по меньшей мере, частично кристаллической, однородно кристаллической и/или безводной (например, менее 80, 50, 30, 20 или 10% воды). В другом примере i-РНК-агент находится в водной фазе, например в растворе, который включает воду, эта форма является предпочтительной для введения ингаляционным путем. Композиции в водной фазе или кристаллические композиции могут быть включены в состав носителя, например липосомы (особенно для водной фазы), или частицы (например, микрочастицы, подходящей для кристаллической композиции). В основном композицию i-РНК-агента составляют таким образом, чтобы она была совместима с предусмотренным способом введения. Препарат i-РНК-агента может быть изготовлен в комбинации с другим агентом, например другим терапевтическим средством или средством для стабилизации i-РНК-агента, например белком, который образует комплекс с i-РНК-агентом с образованием i-РНБ. Другие агенты включают себя хелатообра- 12017847 зующие вещества, например EDTA (например, для удаления двухвалентных катионов, таких как Mg2+),соли, ингибиторы РНКазы (например, ингибитор РНКазы широкой специфичности, такой как РНКзин) и тому подобные. В одном варианте осуществления препарат i-РНК-агента включает в себя другой i-РНК-агент, например второй i-РНК-агент, который может опосредовать РНК-i в отношении второго гена. Другие препараты могут включать в себя по меньшей мере три, пять, десять, двадцать, пятьдесят или сотню или больше различных видов i-РНК. В некоторых вариантах осуществления эти агенты направлены на один и тот же вирус, но различные последовательности-мишени. В другом варианте осуществления каждый iРНК-агент направлен на различные вирусы. Как показано в примере, более одного вируса можно ингибировать путем совместного введения двух i-РНК-агентов одновременно или в близкие интервалы времени, каждый из которых направлен на один из вирусов, подвергаемых лечению. Способы лечения и пути доставки. Композиция, которая включает в себя i-РНК-агент по настоящему изобретению, например i-РНКагент, направленный на RSV, может быть введена пациенту различными путями. Характерные примеры путей введения включают в себя ингаляцию, внутривенный путь, назальную или пероральную доставку лекарственного средства. Предпочтительным способом введения i-РНК-агентов по настоящему изобретению является прямое введение в легкие и носовой ход или системное, путем парентерального введения.i-РНК-агент можно включать в состав фармацевтических композиций, подходящих для введения. Например, композиции могут включать один или несколько i-РНК-агентов и фармацевтически приемлемый носитель. Используемое здесь выражение "фармацевтически приемлемый носитель" означает включение любого или всех растворителей, дисперсионной среды, покрытий, антибактериальных и противогрибковых средств, изотонических веществ и веществ, задерживающих абсорбцию, и подобного, совместимых с фармацевтическим введением. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в этой области. Поскольку не любая обычная среда или агент совместимы с активным соединением, в этих композициях предусмотрено их применение. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в состав этих композиций. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить различными путями в зависимости от того, какое лечение является желательным, местное или системное, и в зависимости от области, в которой проводят лечение. Введение может быть местным (в том числе интраназальным или интрапульмональным), пероральным или парентеральным. Предпочтительный путь введения включает в себя внутривенное вливание, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию. В основном доставку i-РНК-агентов по настоящему изобретению осуществляют для достижения места инфекции в организме пациента. Предпочтительным способом достижения этого является либо местное введение в легкие или носовой ход, например в респираторные ткани путем ингаляции, распыления или интраназального введения, или путем системного введения, например парентеральным введением. Составы для ингаляции или парентерального введения хорошо известны в уровне техники. Такие составы могут включать в себя стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы,разбавители и другие подходящие добавки, примером является PBS или 5% раствор декстрозы в воде. Для внутривенного использования общую концентрацию раствора следует регулировать для обеспечения изотоничности препарата. Описанные здесь активные соединения предпочтительно вводят в легкие или носовой ход пациента любым подходящим способом. Активные соединения можно вводить путем введения аэрозольной суспензии респираторных частиц, содержащих активное соединение или активные соединения, которые вдыхает пациент. Активное соединение можно распылять в различных формах, таких как, но не только,средства для ингаляции в виде сухого порошка, ингаляторы с дозирующим устройством или суспензии жидкость/жидкость. Вдыхаемые частицы могут быть жидкими или твердыми. Частицы могут необязательно содержать другие терапевтические ингредиенты, такие как амилорид, бензамил или фенамил, с выбранным соединением, включенным в количество, эффективное для подавления реабсорбции воды из слизистого секрета дыхательных путей, как описано в патенте США 4501729. Конкретная фармацевтическая композиция необязательно может быть объединена с носителем для облегчения дисперсии или переноса. Подходящий носитель, такой как сахар (т.е. декстроза, лактоза, сахароза, трегалоза, маннитол) может быть смешан с активным соединением или соединениями в любом подходящем соотношении (например, в соотношении 1 к 1 по массе). Частицы, содержащие активное соединение для практического использования настоящего изобретения, должны включать частицы пригодного для вдыхания размера, то есть частицы достаточно мелкого размера для прохождения через рот или нос и гортань при ингаляции и в бронхи и альвеолы легких. В основном частицы размером примерно от 1 до 10 мкм (более предпочтительно размером примерно менее 5 мкм) являются пригодными для вдыхания. Частицы неприродного для вдыхания размера, которые включены в аэрозоль, имеют тенденцию откладываться в горле, и проглатываются, и количество невдыхаемых частиц в аэрозоле предпочтительно уменьшают до минимума. Для назального введения размер частиц в интервале 10-500 мкм является предпочтительным для обеспечения задержки в носовой полости. Жидкие фармацевтические композиции активного соединения для получения аэрозоля могут быть получены путем объединения активного соединения с подходящим носителем, таким как стерильная апирогенная вода. Гипертонические солевые растворы, используемые для осуществления настоящего изобретения, предпочтительно представляют собой стерильные апирогенные растворы, содержащие от 1 до 15 мас.% физиологически приемлемой соли и более предпочтительно от 3 до 7 мас.% физиологически приемлемой соли. Аэрозоли жидких частиц, содержащие активное соединение, могут быть получены любым подходящим способом, как, например, струйным распылителем под давлением или ультразвуковым распылителем, см., например, патент США 4501729. Распылители представляют собой коммерчески доступные устройства, которые превращают растворы или суспензиции активного ингредиента в терапевтическую аэрозольную пыль либо посредством ускоренного выхода сжатого газа, обычно воздуха или кислорода, через узкое выходное отверстие вентури или посредством ультразвукового встряхивания. Подходящие композиции для использования в распылителях состоят из активного ингредиента в жидком носителе, активный ингредиент содержит вплоть до 40% мас./мас. состава, но предпочтительно менее 20% мас./мас. Носителем обычно является вода (и наиболее предпочтительно стерильная апирогенная вода) или разбавленный водный спиртовой раствор, предпочтительно сделанный изотоническим,но может быть гипертоническим с жидкостями организма путем добавления, например, хлорида натрия. Необязательные добавки включают в себя консерванты, если состав не изготовляют стерильным, например метилгидроксибензоат, антиоксиданты, ароматизаторы, эфирные масла, буферные агенты и поверхностно-активные вещества. Аэрозоли твердых частиц, содержащие активное соединение, могут быть получены подобным образом с любым аэрозольным генератором терапевтических твердых частиц. Аэрозольные генераторы для введения твердых лекарственных частиц пациенту вырабатывают пригодные для вдыхания частицы и создают объем аэрозоля, содержащий заранее определенную отмеренную дозу терапевтического средства в количестве, подходящем для введения человеку. Одним иллюстративным типом аэрозольного генератора твердых частиц является инсуффлятор. Подходящие составы для введения путем вдувания включают в себя мелкоизмельченные порошки, которые можно доставлять с помощью инсуффлятора или доставлять в носовую полость путем вдыхания через нос. В инсуффляторе порошок (например, его отмеренная доза, эффективная для проведения описанных здесь лечебных мероприятий) содержится в капсулах или картриджах, обычно сделанных из желатина или пластика, которые либо прокалываются или открываются in situ и порошок доставляется выбрасываемым воздухом через это устройство при вдыхании или с помощью ручного насоса. Порошок, используемый в инсуффляторе, состоит либо только из активного ингредиента, либо из порошкообразной смеси, содержащей активный ингредиент, подходящий порошкообразный разбавитель, такой как лактоза, и необязательно поверхностно-активное вещество. Активный ингредиент обычно содержит от 0,1 до 100 мас./мас. состава. Второй тип иллюстративного генератора аэрозолей включает в себя ингалятор с дозирующим устройством. Ингаляторы с дозирующим устройством представляют собой находящиеся под давлением аэрозольные дозаторы, обычно содержащие суспензию или раствор активного ингредиента в сжиженном пропелленте. При использовании эти устройства рассеивают состав через клапан, приспособленный для доставки отмеренного объема, обычно от 10 до 200 мкл, для получения распыляемого раствора мелких частиц, содержащего активный ингредиент. Подходящие пропелленты включают в себя некоторые хлорфторуглеродные соединения, например дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан и их смеси. Композиция дополнительно может содержать один или несколько сорастворителей, например этанол, поверхностно-активные вещества, такие как олеиновая кислота или триолеат сорбитана,антиоксидант и подходящие ароматизаторы. Введение может осуществлять пациент или другой человек, например, осуществляющий уход за больным. Лицом, осуществляющим уход за больным, может быть любой человек, связанный с обеспечением ухода за человеком: например, в больнице, хосписе, кабинете врача, амбулаторной клинике; сотрудник здравоохранения, например врач, медсестра, или другой практикующий врач; или супруг, или опекун, например родители. Лечение может обеспечиваться отмеренными дозами или дозатором, доставляющим отмеренную дозу. Термин "терапевтически эффективное количество" представляет собой количество, присутствующее в композиции, которое необходимо для обеспечения желаемого количества лекарственного средства пациенту, которому проводят лечение, для получения ожидаемой физиологической реакции. В одном варианте осуществления терапевтически эффективные количества двух или нескольких i-РНК-агентов,каждый направленный на различные респираторные вирусы, например RSV, вводят пациенту одновременно. Термин "физиологически эффективное количество" представляет собой количество, доставляемое пациенту для получения желаемого профилактического или лечебного эффекта. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает, что носитель может проникать в лег- 14017847 кие, не оказывая существенных неблагоприятных токсикологических эффектов на легкие. Термин "совместное введение" относится к введению пациенту двух или нескольких агентов и, в частности, двух или нескольких i-РНК-агентов. Эти агенты могут содержаться отдельной фармацевтической композицией и могут быть введены в одно и тоже время или эти агенты могут содержаться в отдельных композициях и могут быть введены пациенту последовательно. Поскольку два агента можно определить у пациента в одно и то же время, говорят, что эти два агента введены совместно. Типы фармацевтических эксципиентов, которые используются в качестве носителя, включают в себя стабилизаторы, такие как сывороточный альбумин человека (САЧ), наполнители, такие как углеводы,аминокислоты и полипептиды; регуляторы рН или буферы; соли, такие как хлорид натрия; и подобные. Эти носители могут находиться в кристаллической или аморфной форме или могут представлять собой смесь двух форм. Наполнители, которые являются особенно значимыми, включают в себя совместимые углеводы,полипептиды, аминокислоты или их комбинации. Подходящие углеводы включают в себя моносахариды, такие как галактоза, D-манноза, сорбоза и подобное; дисахариды, такие как лактоза, трегалоза и подобное; циклодекстрины, такие как 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрин; и полисахариды, такие как раффиноза, мальтодекстрины, декстраны и подобные; алдитолы, такие как маннитол, ксилитол и подобное. Предпочтительная группа углеводов включает в себя лактозу, трегалозу, раффинозу, мальтодекстрины и маннитол. Подходящие полипептиды включают в себя аспартам. Аминокислоты включают в себя аланин и глицин, глицин является предпочтительным. Подходящие регуляторы рН или буферы включают в себя органические соли, полученные из органических кислот и оснований, такие как цитрат натрия, аскорбат натрия и подобное; предпочтительным является цитрат натрия. Дозы.i-РНК-агент можно вводить в однократной дозе примерно менее 75 мг на 1 кг массы тела или примерно менее 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 либо 0,0005 мг на 1 кг массы тела и менее 200 нмоль i-РНК-агента (например, примерно 4,41016 копий) на 1 кг массы тела, или менее 1500, 750, 300, 150, 75, 15, 7,5, 1,5, 0,75, 0,15, 0,075, 0,015, 0,0075, 0,0015, 0,00075, 0,00015 нмоль iРНК-агента на 1 кг массы тела. Единичную дозу, например, можно вводить ингаляционной дозой или распылением либо путем инъекции. В одном примере используется доза в интервале 0,02-25 мг/кг. Доставка i-РНК-агента непосредственно в легкие или носовой ход может быть в дозе порядка примерно от 1 примерно до 150 мг/носовой ход. Доза может представлять собой количество, эффективное для лечения или профилактики заболевания или нарушения. В одном варианте осуществления единичную дозу вводят один раз в сутки. При другом использовании единичную дозу вводят дважды в первый день, а затем ежедневно. Альтернативно, однократное введение дозы может быть меньше одного раза в сутки, например, менее чем каждые 2, 4, 8 или 30 дней. В другом варианте осуществления единичную дозу не вводят с определенной частотой (например, нерегулярная частота). Например, единичную дозу можно вводить лишь один раз. Поскольку опосредуемое iРНК-агентом подавление гена может сохраняться в течение нескольких дней после введения композицииi-РНК-агента, во многих случаях возможно вводить композицию с частотой менее одного раза в день или для некоторых случаев только один раз в течение всего периода лечения. В одном варианте осуществления пациенту вводят начальную дозу и одну или несколько поддерживающих доз i-РНК-агента, например двуспирального i-РНК-агента, или si-РНК агента (например,предшественника, например, более крупного i-РНК-агента, который может быть процессирован в siРНК-агент, или ДНК, которая кодирует i-РНК-агент, например двуспиральный i-РНК-агент или si-РНКагент либо его предшественник). Поддерживающая доза или дозы обычно ниже начальной дозы, например на половину меньше начальной дозы. Поддерживающий режим может включать в себя лечение пациента дозой или дозами в интервале от 0,01 мг до 75 мг/кг массы тела в сутки, например 70, 60, 50, 40,30, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005, 0,001 или 0,0005 мг/кг массы тела в сутки. Поддерживающие дозы предпочтительно вводят не более одного раза каждые 5-14 дней. Кроме того, период лечения может продолжаться в течение периода времени, который будет варьировать в зависимости от природы конкретного заболевания, его тяжести и общего состояния пациента. В предпочтительных вариантах осуществления дозы можно вводить не более одного раза в сутки, например, не более одного раза в 24, 36, 48 или более часов, например, не более одного раза каждые 5 или 8 дней. После лечения следят за изменениями состояния пациента и снятием симптомов болезненного состояния. Дозу соединения можно либо увеличивать в случае отсутствия заметной реакции у пациента на текущие уровни доз или дозу можно снизить, если заметно снятие симптомов болезненного состояния, если болезненное состояние было снято или если наблюдаются нежелательные побочные эффекты. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция i-РНК-агента включает в себя множество видов i-РНК-агентов. Разновидности i-РНК-агентов могут иметь последовательности, которые не перекрываются и не являются смежными относительно природных последовательностеймишеней, например последовательности-мишени гена RSV. В другом варианте осуществления множест- 15017847 во видов i-РНК-агента является специфичным в отношении различных природных генов-мишеней. Например, i-РНК-агент, который нацелен на ген Р белка RSV, может присутствовать в той же фармацевтической композиции, что и i-РНК-агент, который нацелен на другой ген, например ген N белка. В другом варианте осуществления i-РНК-агенты являются специфичными для разных вирусов, например RSV. Концентрация композиции i-РНК-агента представляет собой количество, достаточно эффективное для лечения или профилактики заболевания или для регуляции физиологического состояния у людей. Концентрация или количество вводимого i-РНК-агента будет зависеть от параметров, определяемых для этого агента и способа введения, например назально или пульмонально. Например, для назальных композиций требуются гораздо меньшие концентрации некоторых ингредиентов во избежание раздражения или ожога носовых ходов. Иногда необходимо разбавлять пероральную композицию вплоть до 10-100 раз для получения подходящей композиции для назального введения. Определенные факторы могут влиять на дозу, необходимую для эффективного лечения пациента, в том числе, но не только, тяжесть заболевания или нарушения, получаемое ранее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст пациента и наличие других заболеваний. Также будет понятно, что эффективная доза i-РНК-агента, такого как si-РНК-агент, используемого для лечения, может увеличиваться или снижаться на протяжении курса конкретного лечения. Изменения в дозе могут быть обусловлены или стать очевидными из результатов диагностических анализов. Например, за пациентом наблюдают после введения композиции i-РНК-агента. На основании информации наблюдения может быть введено дополнительное количество композиции i-РНК-агента. Изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не являются ограничивающими. Примеры Создание противовирусных si-РНК против мРНК RSV.si-РНК против Р, N и L мРНК RSV синтезировали химически с использованием известных способов. Перечислены последовательности si-РНК и некоторое ингибирование перекрестной активности между подтипами и значения IC50 (табл. 1(а-с. Исследование in vitro и вирусная инфекция. Клетки Vero E6 культивировали до 80% слияния в DMEM, содержащей 10% FBS, инактивированную нагреванием. Для введения si-РНК добавляли 4 мкл Transit-TKO к 50 мкл бессывороточной DMEM и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем добавляли указанную концентрацию si-РНК к реактиву среда/ТКО соответственно и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Добавляли смесь РНК к 200 мкл DMEM, содержащей 10% FBS, а затем к клеточному монослою. Клетки инкубировали при 37 С, 5% СО 2 в течение 6 ч. Смесь РНК удаляли осторожным промыванием 1 сбалансированным солевым раствором Хенкса (HBSS) и в лунки добавляли 300 бляшкообразующих единиц (pfu) RSV/A2 (MOI=30) на лунку и подвергали адсорбции в течение 1 ч при 37 С, 5% СО 2. Вирус удаляли и клетки промывали 1 HBSS. Клетки покрывали 1% метилцеллюлозой в DMEM, содержащей 10% FBS среды, и инкубировали в течение 6 дней при 37 С, 5% СО 2. Клетки подвергали иммуноокрашиванию на наличие бляшек с использованием моноклонального антитела 131-2 А к F белку. Доставка si-РНК и вирусная инфекция in vivo. Беспатогенных самок мышей BALB/c в возрасте 4 недели покупали у Harlan. Во время заражения и интраназального капельного введения (i.n.) мыши находились под наркозом. Мышей иммунизировали интраназальным капельным введением указанного количества si-РНК, либо несвязанной, либо в комплексе с 5 мкл Transit TKO. 150 мкл Synagis (моноклональное антитело клон 143-6 С, к F белку RSV) и контроль мышиный изотип (IgG1) вводили внутрибрюшинно (i.p.) за 4 ч до заражения RSV (106 PFURSV/A2). Использовали десять мышей на группу. Массу животных проверяли на 0, 2, 4 и 6 день после заражения. Легкие забирали на 6 день после заражения и исследовали на RSV с помощью анализа иммунологического окрашивания бляшек. Анализ иммунологического окрашивания бляшек. 24-луночные планшеты с клетками Vero Е 6 культивировали до 90% слияния в DMEM, содержащей 10% FBS, инактивированную нагреванием. Легкие мышей гомогенизировали ручным гомогенизатором в 1 мл стерильного PBS Дульбекко (D-PBS) и разводили в 10 раз бессывороточной DMEM. Разведения лизата легочной ткани, содержащей вирус, помещали в 24 луночные планшеты в трех повторах и подвергали адсорбции в течение 1 ч при 37 С 5% СО 2. Лунки покрывали 1% метилцеллюлозой в DMEM,содержащей 10% FBS. Затем планшеты инкубировали в течение 6 дней при 37 С, 5% СО 2. Через 6 дней покровную среду удаляли и клетки фиксировали в ацетон:метаноле (60:40) в течение 15 мин. Клетки блокировали 5% сухим молоком в PBS (Milk/PBS) в течение 1 ч при 37 С. К лункам добавляли антитело к F белку RSV (131-2A) в разведении 1:500 и инкубировали в течение 2 ч при 37 С. Клетки дважды промывали в PBS/0,5% Tween 20. В лунки добавляли комплекс козьих антимышиных IgG со щелочной фосфатазой в разведении 1:500 и инкубировали в течение 1 ч при 37 С. Клетки дважды промывали в с помощью инвертированного микроскопа Olympus. Анализ обработки. Мышей заражали RSV (106 PFU RSV/A2) интраназальным капельным введением в 0 день и обрабатывали 50 мкг указанной si-РНК, вводимой интраназально капельно, в указанные моменты времени (день 1-4 после вирусного заражения). Использовали 3-5 мышей на группу и измеряли титры вируса в лизатах легких на 5 день после заражения вирусом, как описано ранее.i-РНК-агены, представленные в табл. 1(а-с), были протестированы на анти-RSV активность в анализе бляшкообразования, как описано выше (фиг. 1). Каждая колонка (столбец) представляет i-РНК-агент,представленный в табл. 1(а-с), например колонка 1 представляет собой первый агент табл. 1 а, вторая колонка представляет собой второй агент и так далее. Активные i-РНК-агенты идентифицировали по % оставшегося вируса. Были установлены некоторые агенты, которые демонстрировали до 90% ингибирования. Результаты суммированы в табл. 1(а-с). Определяли in vitro ингибирование RSV в зависимости от дозы, используя i-РНК агенты. Примеры активных агентов из табл. 1 тестировали на анти-RSV активность в анализе бляшкообразования, как описано выше, в четырех концентрациях. Дозозависимый ответ был обнаружен с тестируемыми активнымиIn vitro ингибирование подтипа В RSV с использованием i-РНК агентов тестировали, как описано выше. i-РНК-агенты, представленные на фиг. 2, тестировали на анти-RSV активность против подтипа ВIn vivo ингибирование RSV с использованием AL1729 и AL1730 тестировали, как описано выше. Агенты, описанные на фиг. 4, тестировали на анти-RSV активность на мышиной модели. I-РНК-агенты эффективно снижали титры вируса in vivo и были более эффективными, чем контрольное антитело (Mab 143-6 с, мышиное IgG1 Ab, которое утверждено для лечения RSV).AL1730 тестировали на дозозависимую активность с использованием способов, приведенных выше. Эти агенты показали дозозависимый ответ (фиг. 5).i-РНК-агенты, показывающие активность in vitro, тестировали на анти-RSV активность in vivo, как изложено выше. Некоторые агенты показали снижение титров вируса 4 logs при профилактическом введении (фиг. 6).i-РНК-агенты, показывающие in vitro и/или in vivo активность, были протестированы на анти-RSV активность in vivo, как изложено в протоколе обработки, приведенном выше. Некоторые агенты показали снижение титров вируса 2-3 logs (фиг. 7) при введении на 1-2 день после вирусного заражения. Секвенирование изолятов по длине последовательности-мишени. Способ. Выращивание изолятов и выделение РНК. Клинические изоляты от пациентов, инфицированных RSV, получали от Larry Anderson в CDC в Атланте, штат Джорджия (4 штамма) и John DeVincenzo из Университета штата Теннеси, г. Мемфис (15 штаммов). При их выращивании в НЕр-2, эпителиальных клетках человека (АТСС, Cat CCL-23), было отмечено, что 4 изолята из Джорджии росли медленнее, чем 15 штаммов из Теннеси; следовательно, их обрабатывали и анализировали по отдельности. Этот процесс кратко описывается следующим образом.Vero E6, эпителиальные клетки почек обезьяны (АТСС, Cat CRL-1586), выращивали до 95% слияния и инфицировали первичными изолятами в разведении 1/10. Вирус абсорбировался в течение 1 ч при 37 С, затем клетки дополняли D-MEM и инкубировали при 37 С. Каждый день клетки проверяли на наличие цитопатического эффекта (СРЕ) с помощью светового микроскопа. При 90% СРЕ клетки собирали соскабливанием и осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Препараты РНК готовили по стандартным методикам в соответствии с инструкцией производителя. Амплификация N гена RSV. Вирусные РНК собирали после заражения и использовали в качестве матриц в ПЦР с использованием праймеров, которые гибридизируются выше и ниже сайта-мишени ALDP-2017 для амплификации фрагмента 450 пар нуклеотидов. Вся РНК денатурировалась при 65 С в течение 5 мин в присутствии прямого и обратного праймеров к N гену RSV, содержащихся на льду, а затем проводили обратную транскрипцию с использованием Superscript III (Invitrogen) в течение 60 мин при 55 С и в течение 15 мин при 70 С. Продукты ПЦР анализировали гель-электрофорезом на 1% агарозном геле и анализировали по стандартным протоколам. Результаты. Секвенирование первых 15 изолятов подтвердило, что сайт-мишень для ALDP-2017 был полностью консервативным у всех штаммов. Важно, что эта консервативность сохранялась у всех различных популяций, которые включали изоляты и подтипа А, и подтипа В RSV. Интересно то, что при анализе 4 изолятов, растущих медленнее, было обнаружено, что у одного из 4 (LAP6824) была мутация единичного основания в сайте узнавания ALDP-2017. Эта мутация изменила кодирующую последовательность в по- 17017847 ложении 13 N гена RSV N в этом изоляте с А на G. Выводы. Из изолятов от 19 пациентов была определена последовательность N гена RSV в сайте-мишени дляALDP-2017. В 18 из 19 случаев (95%) элемент узнавания для ALDP-2017 является 100% консервативным. У одного из изолятов было изменение единичного основания, изменяющее нуклеотид в положении 13 с А на G в пределах N гена RSV. Это изменение создает единичное G:U неоднозначное соответствие между антисмысловой цепью ALDP-2017 и последовательностью-мишенью. Исходя из соображения потенциала гибридизации такого G:U неоднозначного соответствия, предполагается, что ALDP-2017 будет эффективным в подавлении N гена RSV в этом изоляте. Данные сайленсинга по изолятам. Способы. Клетки Vero E6 культивировали до 80% слияния в DMEM, содержащей инактивированную нагреванием 10% FBS. Для введения si-РНК 4 мкл Transit-TKO добавляли к 50 мкл бессывороточной DMEM и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем указанную концентрацию si-РНК добавляли к реактиву среда/ТКО соответственно и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Смесь РНК добавляли к 200 мкл DMEM, содержащей 10% FBS, а затем к клеточному монослою. Клетки инкубировали при 37 С, 5% СО 2 в течение 6 ч. Смесь РНК удаляли осторожным промыванием 1 сбалансированного солевого раствора Хенкса (HBSS), в лунки добавляли 300 бляшкообразующих единиц (pfu) RSV/A2 (MOI=30) и подвергали адсорбции в течение 1 ч при 37 С, 5% СО 2. Вирус удаляли и клетки промывали 1 HBSS. Клетки покрывали 1% метилцеллюлозой в DMEM, содержащей 10% FBS среду, и инкубировали в течение 6 дней при 37 С, 5% СО 2. Клетки подвергали иммуноокрашиванию на наличие бляшек, используя моноклональное антитело 131-2 А к F белку. Результаты. Сайленсинг наблюдался у всех изолятов (табл. 2). Таблица 2 Вывод. Все протестированные клинические изоляты специфически ингибировались под действием si-РНК 2017 более чем на 85%. Не было изолятов, существенно ингибированных под действием si-РНК 2153,некомплементарно спаренной в качестве контроля. Сайленсинг в исследовании на основе плазмид. Способ. 24-луночный планшет засевали клетками HeLa S6 и выращивали до 80% слияния. Для каждой лунки смешивают 1 мкг плазмиды RSV N-V5 с si-РНК (в указанных условиях), в 50 мкл OPTI-MEM и добавляют в смесь Lipofectamine 2000 (Invitrogen)-Optimem, приготовленную в соответствии с инструкциями производителя, и оставляют стоять 20 мин при комнатной температуре для образования комплекса. Комплекс добавляют к клеткам и инкубируют при 37 С в течение ночи. Удаляют среду, промывают клетки PBS и лизируют с использованием 50 мкл лизирующего буфера (буфер RIPA (50 мМ Tris-HCl рН 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,5% дезоксихолата Na, 1% NP-40, 0,05% SDS) в течение 1-2 мин. Инкубирование количественно определяют измерением уровня белка RSV в клеточных лизатах, определяемого с помощью вестерн-блоттинга с анти-V5 антителом. Результаты. Было показано, что транзиторная плазмидная экспрессия является эффективным анализом для РНКi-агентов (табл. 3). Таблица 3si-РНК 2017 специфически и дозозависимым образом ингибирует продукцию N белка RSV N при транзиторной котрансфекции плазмидой, экспрессирующей N ген RSV. Ингибирование не наблюдалось с некомплементарно спаренной si-РНК 2153 в качестве контроля. Подавление RSV путем аэрозольной доставки si-РНК. Способ. 2 мг/мл раствора ALDP-1729 или ALDP-1730 доставляли путем распыления, используя аэрозольное устройство, в общей сложности в течение 60 с. Вирус получали из легких, как описано выше, и анализировали с помощью ELISA, а не анализа бляшкообразования. В ELISA определяют концентрацию N белкаRSV в клетках, инфицированных вирусом, полученных из лизатов легких мышей.ELISA. Лизат легких разводят 1:1 карбонат-бикарбонатным буфером (NaHCO3, рН 9,6) до рабочей концентрации 6-10 мкг/100 мкл, добавляют в каждую тестируемую лунку и инкубируют при 37 С в течение 1 ч или в течение ночи при 4 С. Лунки промывают 3 PBS/0,5% Tween 20, затем блокируют 5% сухим молоком/PBS в течение 1 ч при 37 С или в течение ночи при 4 С. В лунки добавляют первичное антитело (F белок положительный контроль=клон 131-2 А; G белок положительный контроль=130-2G; отрицательный контроль=нормальные IgG1,(BD Pharmingen, cat. 553454, тестируемая сыворотка или супернатант гибридомы) 1:1000, и инкубируют при 37 С в течение 1 ч или в течение ночи при 4 С. Лунки промывают 3 PBS/0,5% Tween 20. Вторичное антитело (целая молекула козьего антимышиного IgG (H+L), конъюгированная с щелочной фосфатазой), разведенное 1:1000, добавляют в лунки (100 мкл/лунку) и инкубируют при 37 С в течение 1 ч или в течение ночи при 4 С. Промывают 3 PBS/0,5% Tween 20, затем добавляют Npp (Sigmafast) субстрат Sigma Aldrich N2770 в соответствии с инструкциями производителей. Добавляют 200 мкл субстрата на лунку и инкубируют в течение 10-15. Поглощение измеряют при OD 405/495. Вывод. Доставка специфической si-РНК RSV снижает уровни N белка RSV в легких мышей по сравнению с контрольной некомплементарно спаренной si-РНК (фиг. 8 а-b). Ингибирование in vivo на -3 день - профилактика. Способ.In vivo профилактику тестировали с использованием in vivo способа, описанного выше, за исключением того, что si-РНК доставляют в различные моменты времени до заражения RSV от 3 дней до заражения до 4 ч до заражения. Результаты.si-РНК, введенная интраназально вплоть до 3 дней до вирусного заражения, демонстрирует значительное подавление in vivo (фиг. 9). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция, содержащая iRNA-средство для снижения уровней вирусного белка, мРНК вируса или титра вируса в клетке, где iRNA-средство содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где длина каждой цепи составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов и где антисмысловая цепь комплементарна по меньшей мере 15 последовательным нуклеотидам в последовательности GGCUCUUAGCAAAGUCAAG. 2. Композиция по п.1, где длина смысловой цепи и указанной антисмысловой цепи составляет 15-30 нуклеотидов и где указанная антисмысловая цепь комплементарна по меньшей мере 17 последовательным нуклеотидам в последовательности GGCUCUUAGCAAAGUCAAG. 3. Композиция по п.2, где указанное iRNA-средство содержит по меньшей мере один 3'-выступ. 4. Композиция по п.3, где указанное iRNA-средство содержит два 3'-выступа. 5. Композиция по п.4, где последовательность каждого указанного выступа содержит последовательность dTdT. 6. Композиция по п.2, где антисмысловая цепь содержит SEQ ID NO: 268. 7. Композиция по п.2, где смысловая цепь состоит из SEQ ID NO: 267 и антисмысловая цепь состоит из SEQ ID NO:268. 8. Композиция по любому из пп.1-6, где iRNA-средство содержит модификацию, приводящую к повышенной стабильности iRNA-средства в биологическом образце. 9. Композиция по п.8, где iRNA-средство содержит фосфотиоат или 2'-модифицированный нуклеотид. 10. Композиция по п.9, где iRNA-средство содержит фосфотиоат. 11. Композиция по п.9, где iRNA-средство содержит 2'-модифицированный нуклеотид. 12. Композиция по п.11, где 2'-модифицированный нуклеотид содержит модификацию, выбранную из группы, состоящей из 2'-дезокси, 2'-фтор, 2'-O-метил, 2'-О-метоксиэтил (2'-О-МОЕ), 2'-амино и 2'аминоалкокси-модифицированные нуклеотиды. 13. Композиция по п.12, где 2'-модифицированный нуклеотид представляет собой 2'дезоксинуклеотид. 14. Композиция по п.12, где 2'-модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-фтормодифицированный нуклеотид. 15. Композиция по п.12, где 2'-модифицированный нуклеотид содержит 2'-О-метилмодифицированный нуклеотид. 16. Композиция по п.12, где 2'-модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-О-метоксиэтил(2'-О-МОЕ) модифицированный нуклеотид. 17. Композиция по п.12, где 2'-модифицированный нуклеотид представляет собой 2'-аминомодифицированный нуклеотид. 18. Композиция по п.12, где 2'-модифцированный нуклеотид представляет собой 2'аминоалкилокси-модифицированный нуклеотид. 19. Композиция по любому из пп.1-18, где iRNA-средство дополнительно содержит лиганд. 20. Композиция по п.19, где лиганд конъюгирован с 3'-концом смысловой последовательности