Моноклональное антитело человека, обладающее опсонизирующей фагоцитарной киллерной активностью в отношении enterococcus и staphylococcus aureus, и его применение

МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ЧЕЛОВЕКА, ОБЛАДАЮЩЕЕ ОПСОНИЗИРУЮЩЕЙ ФАГОЦИТАРНОЙ КИЛЛЕРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ENTEROCOCCUS И STAPHYLOCOCCUS AUREUS, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Данное изобретение связано с человеческими связывающими молекулами, специфически связывающимися с энтерококками и обладающими киллерной активностью в отношении энтерококков, молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими указанные связывающие молекулы человека, композициями, содержащими связывающие молекулы человека, и способами идентификации или получения человеческих связывающих молекул. Также человеческие связывающие молекулы могут быть использованы в диагностике, профилактике и/или лечении состояния, вызываемого Enterococcus. Тросби Марк, Крамер Роберт Арьен,Де Крэйф Корнелис Адриан (NL) Медведев В.Н. (RU) 016717 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к медицине. В частности, оно относится к диагностике, профилактике и/или лечению инфекции энтерококками. Уровень техники Энтерококки являются грамположительными, факультативно анаэробными бактериями семействаEnterococcaceae. Они классифицировались ранее как стрептококки группы D. Энтерококки обнаружены в кишечниках большинства людей и обычно их выделяют из стула, мочи и мест внутрибрюшной инфекции и инфекции нижних конечностей. Бактерии рода Enterococcus часто рассматриваются как безвредные симбиониты желудочно-кишечного тракта, но в последние 10 лет они стали важной причиной нозокомиальных (внутрибольничных) инфекций, не вследствие увеличенной вирулентности, а вследствие устойчивости к антибиотикам. Согласно оценке в Соединенных Штатах Америки 800000 случаев энтерококковой инфекции имеют место каждый год, приводя к расходам около 500 млн . Для инфицирования хозяев энтерококки первично колонизируют поверхности слизистых оболочек. Энтерококки являются этиологическими агентами бактериемии, инфекций хирургических ран, инфекций мочевых путей и эндокардита. Они ассоциированы также с облигатными анаэробами в смешанных инфекциях, которые приводят к внутрибрюшным абсцессам. В общем и целом имеются приблизительно семнадцать видов энтерококков, среди которых Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium, по-видимому, наиболее часто детектируются в фекалиях человека. Е. faecalis является ответственным за большинство энтерококковых инфекций людей, обычно составляя 80-90% клинических изолятов. Е. faecium детектируется гораздо менее часто, но, тем не менее, имеет значение вследствие высокой частоты устойчивости к множественным антибактериальным агентам. Энтерококковые инфекции обычно лечат антимикробными агентами и до недавнего времени они удовлетворительно контролировались с использованием этих агентов. Однако возникают лекарственноустойчивые (антибиотикорезистентные) энтерококковые штаммы, и инфекция,вызываемая штаммами, устойчивыми ко всем доступным в настоящее время антибиотикам, может стать серьезной проблемой в ближайшем будущем. Некоторые энтерококки уже приобрели наследственную резистентность к антибиотикам на основе -лактама (пенициллинам), а также многим аминогликозидам. В последние два десятилетия в нозокомиальных инфекциях госпитализированных пациентов появились особенно вирулентные штаммы Enterococcus, которые устойчивы даже к антибиотику ванкомицину(ванкомицинорезистентный Enterococcus, или VRE). Несмотря на настоятельную потребность в развитии новых антибиотиков, основные фармацевтические компании, по-видимому, потеряли интерес в отношении рынка антибиотиков. В 2002 году только 5 из более чем 500 лекарственных средств в клиническом развитии фазы II или фазы III были новыми антибиотиками. В последние 6 лет были зарегистрированы только 10 антибиотиков и только 2 из них не проявляли перекрестной реактивности с существующими лекарственными средствами (и, следовательно, не подвергались тем же самым картинам устойчивости к лекарственным средствам). Эта тенденция была отнесена к нескольким факторам: стоимости развития новых лекарственных средств и относительно малому возврату инвестирования, которые дают лечение инфекционных заболеваний, в сравнении с лекарственными средствами против гипертензии, артрита и лекарственных средств, влияющих на образ жизни, например против импотенции. Другим способствующим этому фактором является увеличивающаяся трудность нахождения новых мишеней, дополнительно повышающая затраты на развитие. Таким образом, исследование новых терапий или превентивных мер для (полирезистентных) бактериальных инфекций срочно необходимо для удовлетворения этого надвигающегося кризиса здравоохранения. Активная иммунизация вакцинами и пассивная иммунизация иммуноглобулинами являются многообещающими альтернативами классической терапии малыми молекулами. Несколько бактериальных заболеваний, которые когда-то вызывали широко распространенные болезнь, потерю трудоспособности и смерть, могут быть теперь предотвращены с использованием вакцин. Эти вакцины основаны на ослабленных (аттенуированных) или мертвых бактериях, компонентах бактериальной поверхности или на инактивированных токсинах. Иммунная реакция, индуцируемая вакциной, в основном направлена на иммуногенные структуры, ограниченное количество белков или сахарные структуры на бактериях, которые активно процессируются иммунной системой. Поскольку эти иммуногенные структуры являются очень специфическими для конкретного организма, эта вакцина должна содержать иммуногенные компоненты всех вариантов бактерий, против которых должна защищать эта вакцина. Вследствие этого,вакцины являются комплексными, занимают продолжительное время и являются дорогими для их развития. Дополнительным осложнением создания вакцин является феномен "замещения антигена". Это происходит, когда становятся преобладающими новые штаммы, которые являются серологически и, следовательно, антигенно отличающимися от штаммов, охватываемых этими вакцинами. Иммунный статус популяций при риске нозокомиальных инфекций дополнительно усложняет создание вакцин. Эти пациенты являются неотъемлемо нездоровыми и могут даже быть иммунодефицитными (иммунокомпрометированными) (вследствие действия иммуносупрессивных лекарственных средств), что приводит к замедленному или недостаточному иммунитету против инфицирующих патогенов. Кроме того, за исключением ситуации в случае определенных элективных (избирательных) процедур, может возникнуть невозможность идентификации и вакцинации находящихся при риске пациентов во время предоставления-1 016717 им достаточной иммунной защиты от инфекции. Прямое введение терапевтических иммуноглобулинов, также называемое пассивной иммунизацией,не требует иммунной реакции от пациента и, следовательно, дает немедленную защиту. Кроме того, пассивная иммунизация может быть направлена на бактериальные структуры, которые не являются иммуногенными и которые являются менее специфическими для конкретного организма. Пассивная иммунизация против патогенных организмов основывалась на иммуноглобулинах, полученных из сывороток людей-доноров или доноров, не являющихся людьми. Однако полученные из крови продукты имели потенциальные риски для здоровья, неотъемлемо связанные с этими продуктами. Кроме того, иммуноглобулины могут проявлять вариацию от партии к партии и могут иметь ограниченную доступность в случае неожиданных массовых воздействий. Рекомбинантно полученные антитела не имеют этих недостатков и, следовательно, предоставляют возможность замены иммуноглобулинов, полученных из сывороток. Мышиные моноклональные антитела, направленные против энтерококковых антигенов, известны в данной области. (см. WO 03/072607). Однако мышиные антитела являются ограниченными в отношении их применения in vivo вследствие проблем, связанных с введением мышиных антител людям, таких как короткий полупериод существования в сыворотке, неспособность запуска некоторых эффекторных функций человека и индукция нежелательной разительной иммунной реакции против мышиного антитела в человеке (НАМА).WO 99/18996 относится к энтерококковым антигенам и вакцинам. WO 99/18996 описывает дополнительно кроличью антисыворотку против конъюгированных очищенных антигенов из энтерококков и опсонизирующую активность такой антисыворотки. Хотя WO 99/18996 относится к антителам человека в качестве желаемых молекул, антитела, фактически описанные и используемые в этом патенте, являются антителами кроличьего происхождения, и этот документ фактически не описывает действительно никаких антител человека и их последовательностей. Ввиду их терапевтического преимущества в людях, все еще имеется потребность в моноклональных антителах человека против энтерококков. Кроме того, существует потребность в данной области в антителах человека, которые могут убивать более широкий диапазон бактерий, таких как энтерококки и стафилококки. Данное изобретение обеспечивает эти антитела и показывает, что они могут быть использованы в медицине, в частности, для диагностики, предотвращения и/или лечения энтерококковых инфекций. Описание чертежа На чертеже показаны данные эксперимента in vivo. На Y-оси показана величина КОЕ/мл в крови мышей, тогда как на Х-оси изображены соответствующие антитела. Эти антитела использовали в количестве 15 мг/кг, за исключением CR6016 и CR6241, которые использовали в количестве 7,5 мг/кг. За исключением CR6043 and CR6071, все эти антитела имели медиану, которая значимо отличалась от медианы контрольного IgG (P0,05 против контрольного IgG1). Описание изобретения Здесь ниже представлены определения терминов, использованных в этом изобретении. Определения Аминокислотная последовательность. Термин "аминокислотная последовательность" относится в данном контексте к природновстречающимся или синтетическим молекулам, таким как последовательность пептида, олигопептида,полипептида или белка. Связывающая молекула. В данном контексте термин "связывающая молекула" относится к интактному иммуноглобулину, в том числе моноклональным антителам, таким как химерные, гуманизированные или моноклональные антитела человека, или к содержащему антигенсвязывающий и/или вариабельный домен фрагменту иммуноглобулина, который конкурирует с интактным иммуноглобулином за специфическое связывание с партнером связывания этого иммуноглобулина, например, энтерококками. Независимо от структуры,этот антигенсвязывающий фрагмент связывается с тем же самым антигеном, который узнается интактным иммуноглобулином. Антигенсвязывающий фрагмент может содержать пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность по меньшей мере 2 смежных аминокислотных остатков,по меньшей мере 5 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 10 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 15 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 20 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 25 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 30 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 35 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 40 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 50 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 60 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 70 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 80 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 90 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 100 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 125 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 150 смежных аминокислотных остатков, по-2 016717 меньшей мере 175 смежных аминокислотных остатков, по меньшей мере 200 смежных аминокислотных остатков или по меньшей мере 250 смежных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности этой связывающей молекулы. Термин "связывающая молекула" в данном контексте включает в себя все классы и подклассы иммуноглобулинов, известные в данной области. В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей, связывающие молекулы могут быть разделены на пять основных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Антигенсвязывающие фрагменты включают в себя, в частности, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd,фрагменты определяющего комплементарность района (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), бивалентные одноцепочечные антитела, одноцепочечные фаговые антитела, диатела, триатела, тетратела,(поли)пептиды, которые содержат по меньшей мере один фрагмент иммуноглобулина, который является достаточным для придания специфическому антигену связывания с этим (поли)пептидом, и т.д. Приведенные выше фрагменты могут быть получены синтетическим или ферментативным либо химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов, или они могут быть сконструированы генной инженерией способами рекомбинантных ДНК. Эти способы получения хорошо известны в данной области и описаны, например, в справочнике Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow and D. Lane (1988),Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, который включен здесь в качестве ссылки. Связывающая молекула или ее антигенсвязывающий фрагмент могут иметь один или несколько сайтов связывания. Если имеются более чем один сайт связывания, эти сайты связывания могут быть идентичными друг другу или они могут быть различными. Связывающая молекула может быть "голой" или неконъюгированной связывающей молекулой, но может быть также частью иммуноконъюгата. Голой или неконъюгированной связывающей молекулой называют связывающую молекулу, которая не является конъюгированной, функционально связанной или иным образом физически или функционально ассоциированной с эффекторной частью или меткой,такой, в частности, как токсичное вещество, радиоактивное вещество, липосома, фермент. Должно быть понятно, что голые или неконъюгированные связывающие молекулы не исключают связывающие молекулы, которые были стабилизированы, мультимеризованы, гуманизированы или подвергнуты иной манипуляции, отличающейся от присоединения эффекторной части молекулы или метки. Таким образом,все посттрансляционно модифицированные голые и неконъюгированные связывающие молекулы включены здесь, в том числе, когда произведены модификации в природном окружении клетки, продуцирующей связывающую молекулу, рекомбинантной клеткой, продуцирующей связывающую молекулу,или введены рукой человека после получения исходной связывающей молекулы. Конечно, термин голая или неконъюгированная связывающая молекула не исключает способности этой связывающей молекулы образовывать функциональные ассоциации с эффекторными клетками и/или молекулами после введения в тело, так как некоторые из этих взаимодействий являются необходимыми для проявления биологического действия. Таким образом, отсутствие ассоциированных эффекторных групп или метки применимо в определении голой или неконъюгированной связывающей молекулы in vitro, но не in vivo. Биологическая проба. В данном контексте термин "биологическая проба" включает в себя различные типы проб, в том числе пробы крови или других жидкостей биологического происхождения, пробы твердых тканей, такие как проба биопсии (биоптат) или культуры тканей, или клеток, полученных из них, и их потомства. Этот термин включает в себя также пробы, которые были подвергнуты манипуляциям каким-либо путем после их заготовки, например обработкой реагентами, солюбилизацией или обогащением в отношении некоторых компонентов, таких как белки или полинуклеотиды. Этот термин включает в себя различные типы клинических проб, полученных из любых видов, а также включает в себя клетки в культуре, супернатанты клеток и лизаты клеток. Определяющие комплементарность районы (CDR). Термин "определяющие комплементарность районы" означает в данном контексте последовательности в вариабельных областях связывающих молекул, таких как иммуноглобулины, которые обычно способствуют в значительной степени образованию антигенсвязывающего сайта, который является комплементарным по форме и распределению зарядов эпитопу, узнаваемому на антигене. Эти CDR-районы могут быть специфическими в отношении линейных эпитопов, прерываемых эпитопов или конформационных эпитопов белков или фрагментов белков, либо когда они присутствуют на белке в его нативной конформации, либо, в некоторых случаях, когда они присутствуют на белках, денатурированных, например, солюбилизацией в ДСН. Эпитопы могут также состоять из посттрансляционных модификаций белков. Делеция. Термин "делеция" означает в данном контексте изменение либо в аминокислотной, либо в нуклеотидной последовательности, в которой один или несколько аминокислотных остатков или нуклеотидных остатков соответственно отсутствуют в сравнении с исходной, часто природно встречающейся, молекулой.-3 016717 Регулирующая экспрессию последовательность нуклеиновой кислоты. Термин "регулирующая экспрессию последовательность нуклеиновой кислоты" относится в данном контексте к полинуклеотидным последовательностям, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности или влияющим на экспрессию функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Эти регулирующие экспрессию последовательности нуклеиновых кислот, такие, в частности, как последовательности, подходящие для инициации транскрипции, терминации, промоторные последовательности, энхансерные последовательности; репрессорные или активаторные последовательности; сигналы эффективного процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматические мРНК; последовательности, которые усиливают эффективность трансляции (например, сайты связывания рибосом); последовательности, которые увеличивают стабильность белка; и, когда желательно, последовательности, которые усиливают секрецию белка, могут быть любой последовательностью нуклеиновой кислоты, обнаруживающей активность в выбранном организме-хозяине, и могут быть получены из генов, кодирующих белки, которые являются либо гомологичными, либо гетерологичными относительно организма-хозяина. Идентификация и использование регулирующих экспрессию последовательностей является рутиной для специалиста в данной области. Функциональный вариант. Термин "функциональный вариант" в данном контексте относится к связывающей молекуле, которая содержит нуклеотидную и/или аминокислотную последовательность, которая изменена одним или несколькими нуклеотидами и/или аминокислотами в сравнении с нуклеотидной и/или аминокислотной последовательностями исходной связывающей молекулы и которая все еще способна конкурировать за связывание с партнером связывания, например, энтерококками с исходной связывающей молекулой. Другими словами, эти модификации в аминокислотной и/или нуклеотидной последовательности исходной связывающей молекулы не влияют значимо или не изменяют характеристики связывания связывающей молекулы, кодируемой этой нуклеотидной последовательностью или содержащей эту аминокислотную последовательность, т.е. эта связывающая молекула все еще способна узнавать и связывать ее мишень. Функциональный вариант может иметь консервативные модификации последовательности, включающие в себя нуклеотидные и аминокислотные замены, добавления и делеции. Эти модификации могут быть введены стандартными способами, известными в данной области, такими как сайт-направленный мутагенез и случайный ПЦР-опосредованный мутагенез, и могут содержать как природные, так и неприродные нуклеотиды и аминокислоты. Консервативные аминокислотные замены включают в себя замены, в которых аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим сходные структурные или химические свойства. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, были определены в данной области. Эти семейства включают в себя аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин,аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, аспарагин, глутамин, серин, треонин,тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например,треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин,триптофан). Специалисту в данной области будет ясно, что могут быть также использованы другие классификации семейств аминокислотных остатков, чем классификация, использованная выше. Кроме того,некоторый вариант может иметь неконсервативные аминокислотные замены, например замену аминокислоты аминокислотным остатком, имеющим отличающиеся структурные или химические свойства. Сходные минорные вариации могут также включать в себя аминокислотные делеции или инсерции либо и то, и другое. Руководство в определении, какие аминокислотные остатки могут быть заменены, инсертированы или делетированы без уничтожения иммунологической активности, может быть найдено с использованием компьютерных программ, хорошо известных в данной области. Мутация в нуклеотидной последовательности может быть единственным изменением, произведенным в локусе (точковой мутацией), такой как транзиционная или трансверсионная (заместительная) мутация, или, альтернативно, множественные нуклеотиды могут быть инсертированы, делетированы или изменены в единственном локусе. Кроме того, одно или несколько изменений могут быть произведены в любом количестве локусов в одной нуклеотидной последовательности. Эти мутации могут быть получены любым подходящим способом, известным в данной области. Хозяин. Термин "хозяин" в данном контексте относится к организму или клетке, в которую был введен вектор, такой как клонирующий вектор или экспрессирующий вектор. Этот организм или эта клетка могут быть прокариотическими или эукариотическими. Должно быть понятно, что этот термин относится не только к конкретному рассматриваемому организму и конкретной рассматриваемой клетке, но также и к потомству такого организма или такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут иметь место в генерациях-потомствах вследствие мутации или влияний окружающей среды, такое потомство может быть, фактически, идентичным исходному организму или исходной клетке, но все еще они будут вклю-4 016717 чены в объем термина "хозяин" в данном контексте. Человек (человеческий). Термин "человек" ("человеческий") при применении к связывающим молекулам относится к молекулам, которые либо непосредственно получены из человека, либо основаны на человеческой последовательности. При получении связывающей молекулы из человека или на основе человеческой последовательности и последующей модификации, эта молекула все еще должна рассматриваться как человеческая, как это делается во всем этом описании. Другими словами, термин "человеческая" в применении к связывающим молекулам предназначен для включения связывающих молекул, имеющих вариабельные и константные области, встречающиеся в человеке или лимфоцитах человека и модифицированных в некоторой форме. Таким образом, связывающие молекулы человека могут включать в себя аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека, содержать замены и/или делеции (например, мутации, введенные, например, неспецифическим или сайтнаправленным мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo). Термин "на основе" относится в данном контексте к ситуации, когда последовательность нуклеиновой кислоты может быть точно копирована из матрицы или с минорными мутациями, например, при использовании способов склонной к ошибкам ПЦР, или получена синтетически для точного соответствия матрице или с минорными модификациями. Полусинтетические молекулы на основе последовательностей нуклеиновых кислот человека также рассматриваются в данном контексте как последовательности человека. Инсерция. Термин "инсерция", также известный как термин "добавление", означает изменение в аминокислотной или нуклеотидной последовательности, приводящее к добавлению одного или нескольких аминокислотных или нуклеотидных остатков соответственно в сравнении с исходной последовательностью. Внутренняя (эндогенная) активность. Термин "внутренняя (эндогенная) активность" при применении к связывающим молекулам, определенным здесь, относится к связывающим молекулам, которые способны связывать определенные белковые или углеводные антигены на поверхности патогенов, таких как бактерии, и которые могут ингибировать способность этого патогена нормально расти и делиться. Такие связывающие молекулы могут,например, блокировать вхождение специфических нутриентов, требуемых для роста или транспорта элементов токсичных отходов из бактерий. Посредством последнего действия они могут также увеличивать чувствительность бактерий к действию антибиотических лекарственных средств. Выделенные. Термин "выделенные" при применении к связывающим молекулам, определенным здесь, относится к связывающим молекулам, которые являются, по существу, свободными от других белков или полипептидов, в частности свободны от других связывающих молекул, имеющих отличающиеся антигенные специфичности, а также, по существу, свободны от другого клеточного материала и/или химикалиев. Например, когда эти связывающие молекулы получают рекомбинантно, они являются предпочтительно,по существу, свободными от культуральной среды, а когда эти связывающие молекулы получают химическим синтезом, они предпочтительно, по существу, свободны от химических предшественников или других химикалиев, т.е. они отделены от химических предшественников или других химикалиев, которые участвуют в синтезе этого белка. Термин "выделенные" в применении к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим связывающие молекулы, определенные здесь, относится к молекулам нуклеиновых кислот, в которых нуклеотидные последовательности, кодирующие эти связывающие молекулы, свободны от других нуклеотидных последовательностей, в частности нуклеотидных последовательностей, кодирующих молекулы, которые связывают партнеры связывания, другие чем энтерококки. Кроме того,термин "выделенные" относится к молекулам нуклеиновых кислот, которые, по существу, отделены от других клеточных компонентов, которые природно сопутствуют нативной молекуле нуклеиновой кислоты в ее природном хозяине, например от рибосом, полимераз или геномных последовательностей, с которыми она природно ассоциирована. Кроме того, "выделенные" молекулы нуклеиновых кислот, такие как кДНК-молекулы, могут быть, по существу, свободными от другого клеточного материала или культуральной среды при получении рекомбинантными способами или, по существу, свободны от химических предшественников или других химикалиев при химическом синтезе. Моноклональное антитело. Термин "моноклональное антитело" относится в данном контексте к препарату молекул антител единого молекулярного состава. Моноклональное антитело проявляет единственную специфичность связывания и аффинность в отношении конкретного эпитопа. Таким образом, термин "моноклональное антитело человека" относится к антителу, проявляющему единственную специфичность связывания, которое имеет вариабельную и константную области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека или основанные на последовательностях иммуноглобулина зародышевой линии человека либо полученные из полностью синтезированных последовательностей. Способ получения моноклонального антитела не является ограниченным. Природно встречающиеся. Термин "природно встречающиеся" в применении к объекту относится к тому факту, что объект-5 016717 может быть обнаружен в природе. Например, последовательность полипептида или последовательность полинуклеотида, которая присутствует в организме, которая может быть выделена из природного источника и которая не была преднамеренно модифицирована человеком в лаборатории, является природно встречающейся. Молекула нуклеиновой кислоты. Термин "молекула нуклеиновой кислоты" в контексте данного изобретения относится к полимерной форме нуклеотидов и включает в себя как смысловую, так и антисмысловую цепи РНК, кДНК, геномной ДНК и синтетические формы и смешанные полимеры вышеуказанных молекул. Нуклеотидом называют рибонуклеотид, дезоксинуклеотид или модифицированную форму любого типа нуклеотида. Этот термин также включает в себя одноцепочечные и двухцепочечные формы ДНК. Кроме того, полинуклеотид может включать в себя любой или оба из природно-встречающегося и модифицированного нуклеотида, связанных вместе природно встречающимися и/или не встречающимися в природе нуклеотидными связями. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть модифицированы химически или биохимически или могут содержать неприродные или дериватизованные нуклеотидные основания, как будет вполне понятно специалистам в данной области. Такие модификации включают в себя, например, метки,метилирование, замену одного или нескольких природно-встречающихся нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как незаряженные связи (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.), заряженные связи (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.), группы боковых цепей (например, полипептидов), интеркаляторы (например, акридин, псорален и т.д.), хелаторы, алкилирующие группы и модифицированные связи (например, альфа-аномерные нуклеиновые кислоты и т.д.). Приведенный выше термин включает в себя также любую топологическую конформацию, в том числе одноцепочечную, двухцепочечную, частично дуплексную, триплексную, в виде шпильки, кольцевую конформацию и запертую "висячим замком" конформацию. Включены также синтетические молекулы, которые имитируют полинуклеотиды в их способности связываться со сконструированной последовательностью через образование водородной связи и другие химические взаимодействия. Такие молекулы известны в данной области и включают в себя, например, молекулы, в которых пептидные связи заменяют фосфатные связи в скелете этой молекулы. Ссылка на последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя комплементарную ей последовательность, если нет другого указания. Таким образом, при ссылке на молекулу нуклеиновой кислоты, имеющей конкретную последовательность, должно быть понятно, что эта ссылка включает в себя ее комплементарную цепь с ее комплементарной последовательностью. Эта комплементарная цепь применима также, например, для антисмысловой терапии, гибридизационных зондов и ПЦР-праймеров. Функционально связанные. Термин "функционально связанные" относится к двум или более элементам последовательности нуклеиновой кислоты, которые обычно физически связаны и находятся в функциональной взаимосвязи друг с другом. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если этот промотор способен инициировать или регулировать транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности, причем в этом случае кодирующая последовательность должна пониматься как последовательность, находящаяся "под контролем" этого промотора. Опсонизирующая активность."Опсонизирующей активностью" называют способность опсонина (обычно либо связывающей молекулы, например антитела, либо факторов комплемента сыворотки) связываться с поверхностью патогенна либо посредством специфического узнавания антигена (в случае антител), либо через каталитическое действие связанных с поверхностью молекул (например, уменьшенного отложения C3b как результата действия связанных с поверхностью антител). Фагоцитоз опсонизированных патогенов усиливается вследствие специфического узнавания рецепторов на фагоците для опсонина (Fc-рецептора в случае,когда сами антитела являются опсонинами, и рецептора комплемента в случае, когда комплемент является опсонином). Некоторые бактерии, особенно инкапсулированные бактерии, которые устойчивы к фагоцитозу вследствие присутствия капсулы, становятся чрезвычайно аттратируемыми фагоцитами, такими как нейтрофилы и макрофаги, при покрытии опсонизирующим антителом, и их скорость клиренса из кровотока и инфицированных органов поразительно усиливается. Опсонизирующая активность может быть измерена общепринятым способом (например, анализом опсонизирующого фагоцитарного убивания). Фармацевтически приемлемый эксципиент. Под "фармацевтически приемлемым эксципиентом" имеют в виду инертное вещество, которое объединено с активной молекулой, такой как лекарственное средство, агент или связывающая молекула, для приготовления приемлемой или удобной лекарственной формы. Фармацевтически приемлемым эксципиентом является эксципиент, который является нетоксичным в отношении реципиента в используемых дозах и концентрациях и является совместимым с другими ингредиентами готовой формы, содержащей лекарственное средство, агент или связывающую молекулу. Специфически связывающие. Термин "специфически связывающие" в данном контексте при ссылке на взаимодействие связы-6 016717 вающей молекулы, например антитела, и его партнера связывания, например антигена, означает, что это взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры, например антигенной детерминанты или эпитопа, на партнере связывания. Другими словами, это антитело преимущественно связывает или узнает партнер связывания, даже когда партнер связывания присутствует в смеси других молекул или организмов. Это связывание может быть опосредовано ковалентными или нековалентными взаимодействиями или комбинацией обоих. Другими словами, термин "специфически связывающиеся" означает иммуноспецифическое связывание с антигеном или его фрагментом и неспецифическое связывание с другими антигенами. Связывающая молекула, которая иммуноспецифически связывается с антигеном, может связываться с другими пептидами или полипептидами с более низкой аффинностью, как определено, например, радиоиммуноанализами (RIA), твердофазными иммуноферментными анализами (ELISA),BIACORE или другими анализами, известными в данной области. Связывающие молекулы или их фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, могут быть перекрестно реактивными с родственными антигенами. Предпочтительно связывающие молекулы или их фрагменты, которые иммуноспецифически связываются с антигеном, не реагируют перекрестно с другими антигенами. Замены."Замена" в данном контексте означает замену одной или нескольких аминокислот или нуклеотидов отличающимися аминокислотами или нуклеотидами соответственно. Терапевтически эффективное количество. Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество связывающей молекулы,определенной здесь, которое является эффективным для предотвращения, ослабления и/или лечения состояния, возникающего из инфекции Enterococcus. Лечение. Термин "лечение" относится к терапевтическому лечению, а также профилактическим или превентивным мерам для лечения или прекращения или, по меньшей мере, замедления прогрессирования заболевания. Лица, нуждающиеся в лечении, включают в себя лиц, уже пораженных состоянием, проявляющимся в результате инфекции Enterococcus, а также лица, в которых должна быть предотвращена инфекция Enterococcus. Субъекты, частично или полностью выздоровевшие от инфекции Enterococcus, могут также нуждаться в лечении. Предотвращение включает в себя ингибирование или уменьшение распространения Enterococcus или ингибирование или уменьшение проявления, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, ассоциированных с инфекцией Enterococcus. Вектор. Термин "вектор" означает молекулу нуклеиновой кислоты, в которую может быть встроена другая молекула нуклеиновой кислоты для введения в хозяина, где она будет реплицироваться и в некоторых случаях экспрессироваться. Другими словами, вектор способен транспортировать молекулу нуклеиновой кислоты, с которой он был связан. Клонирующие, а также экспрессирующие векторы рассматриваются под термином "вектор" в данном контексте. Векторы включают в себя, но не ограничиваются ими, плазмиды, космиды, бактериальные искусственные хромосомы (ВАС) и дрожжевые искусственные хромсомы (YAC) и векторы, произведенные из бактериофагов или вирусов растений или животных (в том числе человека). Векторы содержат сайт инициации репликации, узнаваемый предполагаемым хозяином, и в случае экспрессирующих векторов промотор и другие регуляторные районы, узнаваемые этим хозяином. Вектор, содержащий вторую молекулу нуклеиновой кислоты, вводят в клетку трансформацией, трансфекцией или с использованием механизмов вирусного вхождения. Некоторые векторы способны к автономной репликации в организме хозяина, в который их вводят (например, векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации, могут реплицироваться в бактериях). Другие векторы могут быть интегрированы в геном хозяина после введения в этого хозяина и посредством этого реплицироваться вместе с геномом хозяина. Сущность изобретения Данное изобретение относится к связывающим молекулам человека, способным специфически связываться с энтерококками и проявляющими киллерную и/или ингибирующую рост активность в отношении энтерококков. Изобретение относится также к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих, по меньшей мере, связывающий район связывающих молекул человека. Изобретение дополнительно обеспечивает применение связывающих молекул человека согласно изобретению в профилактике и/или лечении субъекта, имеющего инфекцию Enterococcus или находящегося при риске развития инфекции Enterococcus. Наряду с этим, изобретение относится к применению связывающих молекул человека согласно изобретению в диагностике/детектировании Enterococcus. Подробное описание изобретения В первом аспекте данное изобретение включает в себя связывающие молекулы, способные специфически связываться с видами Enterococcus. Предпочтительно эти связывающие молекулы являются связывающими молекулами человека. Предпочтительно связывающие молекулы согласно изобретению проявляют киллерную активность в отношении видов Enterococcus. В дополнительном аспекте эти связывающие молекулы согласно изобретению способны специфически связываться по меньшей мере с двумя разными видами Enterococcus и/или имеют киллерную активность в отношении по меньшей мере-7 016717 двух разных видов Enterococcus. Предпочтительно связывающие молекулы согласно изобретению способны специфически связываться по меньшей мере с тремя, по меньшей мере четырьмя, по меньшей мере пятью, по меньшей мере шестью, по меньшей мере семью, по меньшей мере восемью, по меньшей мере девятью, по меньшей мере десятью, по меньшей мере одиннадцатью, по меньшей мере двенадцатью, по меньшей мере тринадцатью, по меньшей мере четырнадцатью, по меньшей мере пятнадцатью, по меньшей мере шестнадцатью, по меньшей мере семнадцатью разными видами Enterococcus и/или имеют киллерную активность в отношении этих разных видов Enterococcus. Виды Enterococcus, с которыми способны специфически связываться или в отношении которых имеют киллерную активность связывающие молекулы согласно изобретению, выбраны из группы, состоящей из Е. asini, E. avium, E. casseliflavus, E. cecorum, E. columbae, E. dispar, E. durans, Е. faecalis, E. faecium, E. flavescens, E. gallinarum, E.E. faecalis и Е.faecium являются предпочтительными видами. В одном варианте осуществления связывающие молекулы согласно изобретению способны специфически связываться с разными штаммами в одном виде Enterococcus или имеют киллерную активность в отношении разных штаммов в одном видеEnterococcus. В другом варианте осуществления связывающие молекулы согласно изобретению могут даже быть способны специфически связываться по меньшей мере с одной другой грамположительной бактерией и/или грамотрицательной бактерией и/или имеют киллерную активность в отношении по меньшей мере одной другой грамположительной бактерии и/или грамотрицательной бактерии, в том числе, но не только, стрептококков группы А; Streptococcus pyrogenes, стрептококков группы В; Streptococcus agalactiae, Streptococcus milleri, Streptococcus pneumoniae, Viridans streptococci; Streptococcus mutans, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Actinomyces israelii, Norcardia asteroides, Norcardia brasiliensis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi А, ВС, Salmonella enteritidis, Salmonella cholerae-suis, Salmonella virchow, Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Shigellaboydii, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mallei, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Campylobacter pylori, Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni, Bacteroides fragilis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis,Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Bordetella pertussis, Brucella abortus, Brucella melitensis, Legionella pneumophila, Treponema pallidum, Treponema carateum, Leptospira interrogans, Leptospira biflexa,Borrelia recurrentis, Borrelia burgdorferi, Mycoplasma pneumoniae, Coxiella burnetii, Clamydia trachomatis,Clamydia psittaci, Clamydia pneumoniae. Связывающие молекулы согласно изобретению могут быть способны специфически связываться с энтерококками и необязательно другими грамположительными и/или грамотрицательными бактериями, которые являются жизнеспособными, живыми и/или инфективными или которые находятся в инактивированной/аттенуированной форме. Способы инактивации/аттенуации бактерий хорошо известны в данной области и включают в себя, но не ограничиваются ими, обработку антибиотиками, обработку УФ, обработку формальдегидом и т.д. Связывающие молекулы согласно изобретению могут также специфически связываться с одним или несколькими фрагментами энтерококков (и других грамположительных и/или грамотрицательных бактерий), такими, например, как препарат одного или нескольких белков и/или (поли)пептидов, полученных из энтерококков или одного или нескольких рекомбинантно полученных энтерококковых белков и/или полипептидов. Для способов лечения и/или предотвращения энтерококковых инфекций эти связывающие молекулы предпочтительно способны специфически связываться с поверхностными доступными белками энтерококков. Для диагностических целей эти связывающие молекулы могут быть также способны специфически связываться с белками, не присутствующими на поверхности энтерококков. Нуклеотидная и/или аминокислотная последовательность белков разных видов и штаммов Enterococcus может быть найдена в базе данных GenBank, базе данных EMBL и/или других базах данных. Специалист в данной области сможет легко найти такие последовательности в соответствующих базах данных. Альтернативно, связывающие молекулы согласно изобретению могут быть способны также специфически связываться с другими энтерококковыми молекулами, в том числе, но не только, поверхностными факторами, которые ингибируют фагоцитарное поглощение; факторами, которые усиливают их выживание в фагоцитах; инвазинами, которые лизируют мембраны эукариотических клеток; полисахаридами; другими компонентами клеточной стенки, такими как тейхоевая кислота, липотейхоевая кислота, рибит, пептидогликан, пентаглициновый олигопептид, N-ацетилглюкозамин, N-ацетилмурамовая кислота, N-ацетилгалактозаминуроновая кислота, N-ацетилфукозамин, N-ацетилглюкозаминуроновая кислота, N-ацетилманнозаминуроновая кислота, О-ацетилглюкозаминмурамовая кислота, галактозаминуроновая кислота, фукозамин, глюкозаминуроновая кислота, маннозаминуроновая кислота, рамноза, гексозамин, гексоза, койибиоза, глицеролфосфат, рибитолфосфат и связывающие звенья между любыми из этих компонентов.-8 016717 В другом варианте осуществления связывающие молекулы согласно изобретению способны специфически связываться с фрагментом вышеупомянутых белков и/или других молекул, где этот фрагмент содержит по меньшей мере одну антигенную детерминанту, узнаваемую связывающими молекулами согласно изобретению. "Антигенной детерминантой" называют в данном контексте часть молекулы, которая способна связываться со связывающей молекулой согласно изобретению с достаточно высокой аффинностью с образованием детектируемого комплекса антиген-связывающая молекула. Связывающими молекулами согласно изобретению могут быть интактные молекулы иммуноглобулина, такие как поликлональные или моноклональные антитела, или этими связывающими молекулами могут быть антигенсвязывающие фрагменты, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, Fab,F(ab'), F(ab')2, Fv, dAb, Fd, фрагменты определяющего комплементарность района (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), бивалентные одноцепочечные антитела, одноцепочечные фаговые антитела, диатела, триатела, тетратела и (поли)пептиды, которые содержат по меньшей мере один фрагмент иммуноглобулина, который является достаточным для придания специфического связывания антигена с энтерококками или их фрагментом. В одном предпочтительном варианте осуществления связывающими молекулами согласно изобретению являются моноклональные антитела человека. Связывающие молекулы согласно изобретению могут быть использованы в невыделенной форме или в выделенной форме. Кроме того, связывающие молекулы согласно изобретению могут быть использованы по отдельности или в смеси, содержащей по меньшей мере одну связывающую молекулу(или ее вариант или фрагмент) согласно изобретению. Другими словами, эти связывающие молекулы могут быть использованы в комбинации, например, в виде фармацевтической композиции, содержащей две или более связывающих молекул согласно изобретению, их вариантов или фрагментов. Например,связывающие молекулы, имеющие разные, но дополняющие активности, могут быть объединены в единой терапии для достижения желаемого профилактического, терапевтического или диагностического эффекта, но, альтернативно, связывающие молекулы, имеющие идентичные активности, могут быть также объединены в единой терапии для достижения желаемого профилактического, терапевтического или диагностического эффекта. Необязательно, эта смесь дополнительно содержит по меньшей мере один другой терапевтический агент. Предпочтительно этот терапевтический агент, такой как, например, антибиотик, применим в профилактике и/или лечении энтерококковой инфекции. Обычно связывающие молекулы согласно изобретению могут связываться с их партнерами связывания, т.е. энтерококками или их фрагментами, с константной аффинности (Kd-величиной), которая ниже 0,210-4 М, 1,010-5 М, 1,010-6 М, 1,010-7 М, предпочтительно ниже 1,010-8 М, более предпочтительно ниже 1,010-9 М, более предпочтительно ниже 1,010-10 М, даже более предпочтительно ниже 1,010-11M и, в частности, ниже 1,010-12 М. Эти константы аффинности могут варьировать для изотипов антител. Например, аффинность связывания для изотипа IgM составляет по меньшей мере приблизительно 1,010-7M. Константы аффинности могут быть измерены, например, с использованием резонанса поверхностных плазмонов, например, с использованием системы BIACORE system (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala,Sweden). Связывающие молекулы согласно изобретению могут связываться с энтерококками или их фрагментом в растворимой форме, например в пробе или в суспензии, или могут связываться с энтерококками или их фрагментом, связанными с носителем или субстратом или прикрепленными к носителю или субстрату, например микротитрационным планшетам, мембранам и гранулам, и т.д. Носители или субстраты могут быть изготовлены из стекла, пластика (например, полистирола), полисахаридов, найлона,нитроцеллюлозы или тефлона и т.д. Поверхность таких носителей может быть твердой или пористой и иметь любую удобную форму. Кроме того, эти связывающие молекулы могут связываться с энтерококками в очищенной/выделенной или неочищенной/невыделенной форме. Связывающие молекулы согласно изобретению проявляют киллерную активность. Киллерная активность в данном контексте включает в себя, но не ограничивается ими, опсонизирующую активность или любую другую активность, повышающую/увеличивающую/усиливающую фагоцитоз и/или фагоцитарное убивание бактерий, например энтерококков; внутреннюю (эндогенную) (киллерную) активность,например уменьшение или ингибирование бактериального роста или прямое убивание бактерий; увеличение чувствительности бактерий к антибиотической обработке; или любую их комбинацию. Опсонизирующая активность может быть, например, измерена, как описано здесь. Альтернативные анализы, измеряющие опсонизирующую активность, описаны, например, в Manual of Molecular and Clinical LaboratoryImmunology, 7th Edition. Анализы для измерения других упомянутых активностей также известны. В одном предпочтительном варианте осуществления связывающие молекулы согласно изобретению содержат по меньшей мере один район CDR3, предпочтительно район CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQSEQ ID NO: 268, SEQ ID NO: 274, SEQ ID NO: 280, SEQ ID NO: 286, SEQ ID NO: 292, SEQ ID NO: 298,SEQ ID NO: 304, SEQ ID NO: 310, SEQ ID NO: 316, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 334,SEQ ID NO: 340 и SEQ ID NO: 346. Районы CDR связывающих молекул согласно изобретению показаны в табл. 11. Районы CDR являются районами в соответствии с Kabat et al. (1991), описанными в Sequencesof Proteins of Immunological Interest. В одном варианте осуществления связывающие молекулы могут содержать два, три, четыре, пять или даже все шесть районов CDR связывающих молекул согласно изобретению. Еще в одном варианте осуществления связывающие молекулы согласно изобретению содержат тяжелую цепь, содержащую вариабельную тяжелую цепь аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90,SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 211, SEQID NO: 429, SEQ ID NO: 431, SEQ ID NO: 433, SEQ ID NO: 435 и SEQ ID NO: 437. В дополнительном варианте осуществления связывающие молекулы согласно изобретению содержат легкую цепь, содержащую вариабельную легкую цепь аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ IDNO: 473, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 479 и SEQ ID NO: 481. Табл. 12 показывает вариабельные области тяжелой и легкой цепей связывающей молекулы согласно изобретению. Другой аспект согласно изобретению включает в себя функциональные варианты определяемых здесь связывающих молекул. Молекулы считаются функциональными вариантами связывающей молекулы согласно этому изобретению, если эти варианты способны конкурировать за специфическое связывание с энтерококками (или другими грамположительными и/или грамотрицательными бактериями) или их фрагментом с исходными связывающими молекулами человека. Другими словами, когда эти функциональные варианты все еще способны связываться с энтерококками или их фрагментом. Предпочтительно функциональные варианты способны конкурировать за специфическое связывание по меньшей мере с двумя (или более) разными видами Enterococcus или их фрагментами, которые специфически связаны с исходными связывающими молекулами человека. Кроме того, считается, что молекулы являются функциональными вариантами связывающей молекулы согласно этому изобретению, если они имеют киллерную активность в отношении энтерококков, предпочтительно против по меньшей мере двух (или более) видов Enterococcus, против которых исходная связывающая молекул проявляет киллерную активность. В другом варианте осуществления эти функциональные варианты связывающей молекулы согласно этому изобретению имеют также киллерную активность в отношении других грамположительных и/или грамотрицательных бактерий. Функциональные варианты включают в себя, но не ограничиваются ими, производные, которые являются, по существу, сходными в первичной структурной последовательности, но которые содержат, например, модификации in vitro или in vivo, химические и/или биохимические, которые не обнаруживаются в исходной связывающей молекуле. Такие модификации включают в себя, в частности, ацетилирование, ацилирование, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, сшивание, образование дисульфидной связи, гликозилирование, гидроксилирование, метилирование, окисление, пэгилирование, протеолитический процессинг, фосфорилирование и т.п. Альтернативно, функциональными вариантами могут быть связывающие молекулы, определенные в данном изобретении, содержащие аминокислотную последовательность, содержащую замены, инсерции, делеции или их комбинации одной или нескольких аминокислот в сравнении с аминокислотными последовательностями исходных связывающих молекул. Кроме того, функциональные варианты согласно этому изобретению могут иметь одинаковые или разные, либо более высокие, либо более низкие, аффинности связывания в сравнении с исходной связывающей молекулой, но все еще являются способными связываться с энтерококками или их фрагментом. Например, функциональные варианты согласно этому изобретению могут иметь увеличенные или уменьшенные аффинности связывания в отношении энтерококков или их фрагмента в сравнении с исходными связывающими молекулами. Предпочтительно аминокислотные последовательности этих вариабельных районов, в том числе каркасных областей, гипервариабельных районов, в частности районов CDR3, являются модифицированными. Обычно вариабельные районы легкой цепи и тяжелой цепи содержат три гипервариабельных района, содержащих триCDR, и более консервативные районы, так называемые каркасные районы (FR). Эти гипервариабельные районы содержат аминокислотные остатки из CDR и аминокислотные остатки из гипервариабельных петель. Функциональные варианты, которые, как предполагается, входят в объем данного изобретения,имеют по меньшей мере приблизительно 50% - приблизительно 99%, предпочтительно по меньшей мере- 10016717 приблизительно 60% - приблизительно 99%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 70% - приблизительно 99%, даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80% - приблизительно 99%, наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% - приблизительно 99%, в частности, по меньшей мере приблизительно 95% - приблизительно 99% и, в частности, по меньшей мере приблизительно 97% - приблизительно 99% гомологию аминокислотной последовательности с исходными связывающими молекулами человека, определенными здесь. Компьютерные алгоритмы, такие, в частности, как Gap или Bestfit, известные специалисту в данной области, могут быть использованы для оптимального сопоставления аминокислотных последовательностей, подлежащих сравнению, и для определения сходных или идентичных аминокислотных остатков. Функциональные варианты могут быть получены изменением исходных связывающих молекул или их частей обычными способами молекулярной биологии, известными в данной области, включающими в себя, но не ограничивающимися ими, склонную к ошибкам ПЦР, олигонуклеотид-направленный мутагенез, сайт-направленный мутагенез и перетасовку тяжелой и/или легкой цепи. В одном варианте осуществления функциональные варианты согласно изобретению имеют киллерную активность в отношении энтерококков. Эта киллерная активность или может быть идентичной, или может быть более высокой или более низкой в сравнении с исходными связывающими молекулами. Кроме того, функциональные варианты с киллерной активностью могут иметь дополнительную активность, подходящую для борьбы с энтерококками. Другие активности упоминаются выше. Таким образом, при использовании термина связывающая молекула (человека) этот термин включает в себя также функциональные варианты связывающей молекулы (человека). Изобретение обеспечивает панель применимых моноклональных антител человека, которые имеют опсонизирующую фагоцитарную киллерную активность в отношении по меньшей мере одного штамма каждого по меньшей мере из двух разных видов Enterococcus и против по меньшей мере одного штаммаStaphylococcus aureus. Антитела согласно изобретению содержат вариабельные области любого из антител CR5140 (SEQ ID NO 395+439), CR5157 (SEQ ID NO 397+441), CR6016 (SEQ ID NO 88+108), CR6043NO 433+477) или CR6429 (SEQ ID NO 435+479), описанных здесь, и антител, содержащих вариабельные области с последовательностями, которые являются по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичными им. Предпочтительно последовательности этих полных антител являются по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичными последовательностям антител, описанных здесь. Было показано, что все эти антитела имеют опсонизирующую фагоцитарную киллерную активность в отношении по меньшей мере двух разных видов Enterococcus (в том числе E. faecalis и E. faecium). Неожиданно, эти антитела были также реактивными против S.aureus (штамма 502), и для некоторых антител (CR6252, CR6415, CR6421) было дополнительно показано,что они были также реактивными против штамма Newman S. aureus, а также против штамма S. epidemidisRP62A), и, следовательно, имеют широкую специфичность и широкий потенциал для терапевтического применения. Эти антитела не связывались с LTA S. aureus, которая является одним из основных компонентов клеточной стенки S. aureus. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления антитела согласно изобретению не связываются специфически с LTA S. aureus. Изобретение обеспечивает также композиции, содержащие по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или более моноклональных антител человека данного изобретения. Конечно, могут быть получены мутанты высокой аффинности или мутанты с другими предпочтительными свойствами с использованием рутинных способов на основе описанных здесь последовательностей антител. Такие улучшенные антитела включены в объем данного изобретения, когда вариабельные области являются по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95% идентичными последовательностям вариабельных областей описанных здесь антител. Еще в одном аспекте изобретение включает в себя иммуноконъюгаты, т.е. молекулы, содержащие по меньшей мере одну связывающую молекулу, определенную здесь и дополнительно содержащую по меньшей мере одну метку, такую, например, как детектируемая часть молекулы/агент. В данном изобретении рассматриваются также смеси иммуноконъюгатов согласно этому изобретению или смеси по меньшей мере одного иммуноконъюгата согласно этому изобретению и другой молекулы, такой как терапевтический агент или другая связывающая молекула или иммуноконъюгат. В следующем варианте осуществления иммуноконъюгаты согласно изобретению могут содержать более одной метки. Эти метки могут быть одинаковыми или отличающимися одна от другой и могут быть соединены/конъюгированы нековалентно со связывающими молекулами. Метка (метки) могут быть соединены/конъюгированы непосредственно со связывающими молекулами человека посредством образования ковалентных связей. Альтернативно, эта метка (метки) могут быть соединены/конъюгированы со связывающими молекулами посредством одного или нескольких линкерных соединений. Способы конъюгирования меток со связывающими молекулами хорошо известны специалисту в данной области.- 11016717 Метками иммуноконъюгатов данного изобретения могут быть терапевтические агенты, но ими могут быть также детектируемые части молекул/агенты. Метками, подходящими в терапии и/или профилактике, могут быть токсины или их функциональные части, антибиотики, ферменты, другие связывающие молекулы, которые усиливают фагоцитоз или иммунную стимуляцию. Иммуноконъюгаты, содержащие детектируемый агент, могут быть использованы диагностически, например, для оценки, был ли субъект инфицирован видом Enterococcus, или для мониторинга развития или прогрессирования энтерококковой инфекции как части процедуры клинического тестирования, например, для определения эффективности конкретной схемы лечения. Однако они могут быть также использованы для других целей детектирования и/или аналитических, и/или диагностических целей. Детектируемые части молекул/агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные материалы, испускающие позитрон металлы и нерадиоактивные парамагнитные ионы металлов. Метки, используемые для мечения связывающих молекул для детектирования и/или аналитических, и/или диагностических целей, зависят от конкретных способов детектирования/анализа/диагностики и/или от используемых способов, таких, например, как иммуногистохимическое окрашивание (тканевых) проб, проточное цитометрическое детектирование, сканирующее лазерное цитометрическое детектирование, флуоресцентные иммуноанализы, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммуноанализы(RIA), биоанализы (например, анализы фагоцитоза), применения вестерн-блоттинга, и т.д. Подходящие метки для способов детектирования/анализа/диагностики и/или способы, известные в данной области,находятся вполне в пределах квалификации специалистов в данной области. Кроме того, связывающие молекулы человека или иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть также присоединены к твердым носителям, которые особенно применимы для иммуноанализов invitro или очистки энтерококков или их фрагмента. Такие твердые носители могут быть пористыми или непористыми, плоскими или неплоскими. Связывающие молекулы данного изобретения могут быть слиты с маркерными последовательностями, такими как пептид, для облегчения очистки. Примеры включают в себя, но не ограничиваются ими, гексагистидиновую метку, гемагглютининовую (НА) метку, меткуmyc или метку flag. Альтернативно, антитело может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата антитела. В другом аспекте связывающие молекулы согласно изобретению могут быть конъюгированы/соединены с одним или несколькими антигенами. Предпочтительно этими антигенами являются антигены, которые узнаются иммунной системой субъекта, которому вводит этот конъюгат связывающая молекула-антиген. Антигены могут быть идентичными, но могут также отличаться друг от друга. Способы конъюгирования для присоединения антигенов и связывающих молекул хорошо известны в данной области и включают в себя, но не ограничиваются ими, применение сшивающих агентов. Связывающие молекулы согласно изобретению будут связываться с энтерококками, и антигены, присоединенные к этим связывающим молекулам, будут инициировать мощную Т-клеточную атаку на этот конъюгат, что будет в конечном счете приводить к деструкции энтерококков. После получения иммуноконъюгатов химически непосредственно или опосредованно, например через линкер, эти иммуноконъюгаты могут быть получены в виде слитых белков, содержащих связывающие молекулы согласно изобретению и подходящую метку. Слитые белки могут быть получены способами, известными в данной области, например рекомбинантно конструированием молекул нуклеиновых кислот, содержащих нуклеотидные последовательности, кодирующие связывающие молекулы, в рамке считывания с нуклеотидными последовательностями, кодирующими подходящую метку (подходящие метки), и затем экспрессией этих молекул нуклеиновых кислот. Другой аспект данного изобретения обеспечивает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере одну связывающую молекулу, функциональный вариант или иммуноконъюгат согласно этому изобретению. Такие молекулы нуклеиновых кислот могут быть использованы в качестве промежуточных продуктов для целей клонирования, например, в процессе созревания аффинности, описанном выше. В предпочтительном варианте осуществления эти молекулы нуклеиновых кислот являются выделенными или очищенными. Предполагается, что специалисту в данной области будет понятно, что функциональные варианты этих молекул нуклеиновых кислот являются также частью данного изобретения. Функциональными вариантами являются последовательности нуклеиновых кислот, которые могут быть непосредственно транслированы с использованием стандартного генетического кода с обеспечением аминокислотной последовательности, идентичной аминокислотной последовательности, транслируемой из исходных молекул нуклеиновой кислоты. Предпочтительно молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, содержащие район CDR3, предпочтительно район CDR тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 21,SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 57, SEQ IDNO: 316, SEQ ID NO: 322, SEQ ID NO: 328, SEQ ID NO: 334, SEQ ID NO: 340 и SEQ ID NO: 346. В следующем варианте осуществления эти молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы,содержащие два, три, четыре, пять или даже все шесть районов CDR связывающих молекул согласно изобретению. В другом варианте осуществления такие молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, содержащие тяжелую цепь, содержащую вариабельную тяжелую цепь аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86,SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ IDNO: 437. В другом варианте осуществления эти молекулы нуклеиновых кислот кодируют связывающие молекулы, содержащие легкую цепь, содержащую вариабельную легкую цепь аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106,SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118,SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 443,SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 455,SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 467,SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO:477, SEQ ID NO: 479 иSEQ ID NO: 481. Другой аспект согласно изобретению обеспечивает векторы, т.е. конструкции нуклеиновых кислот,содержащие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот согласно данному изобретению. Векторы могут быть получены из плазмид, таких, например, как F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti и т.д.; космид; фагов, таких как лямбда, лямбдоид, М 13, Mu, P1, P22, Q, T-even (Т-четный), T-odd (Т-нечетный), Т 2,Т 4, Т 7 и т.д.; вирусы растений. Векторы могут быть использованы для клонирования и/или для экспрессии связывающих молекул согласно изобретению и могут быть даже использованы для целей генной терапии. Векторы, содержащие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот согласно этому изобретению, функционально связанных с одной или несколькими регулирующими экспрессию молекулами нуклеиновых кислот, также включены в данное изобретение. Выбор вектора зависит от рекомбинантных процедур, которые следуют далее, и от используемого хозяина. Введение векторов в клетки-хозяева может выполняться, в частности, путем кальций-фосфатной трансфекции, вирусной инфекции, опосредованной ДЭАЭ-декстраном трансфекции, трансфекции с использованием липофектамина или электропорации. Векторы могут реплицироваться автономно или могут реплицироваться вместе с хромосомой, в которую они были интегрированы. Предпочтительно, чтобы эти векторы содержали один или несколько селективных маркеров. Выбор маркеров может зависеть от выбранных клеток-хозяев, хотя это не является решающим согласно изобретению, как хорошо известно специалистам в данной области. Они включают в себя, но не ограничиваются ими, канамицин, неомицин, пуромицин, гигромицин, зеоцин, ген тимидинкиназы из вируса Herpes simplex (HSV-TK), ген дигидрофолатредуктазы из мыши (dhfr). Векторы,содержащие одну или несколько молекул нуклеиновых кислот, описанных выше, функционально связанных с одной или несколькими молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими белки или пептиды,которые могут быть использованы для выделения этих связывающих молекул человека, также включены в настоящее изобретение. Такие белки или пептиды включают в себя, но не ограничиваются ими, глутатион-S-трансферазу, белок, связывающий мальтозу, металлсвязывающий полигистидин, зеленый флуоресцирующий белок, люциферазу и бета-галактозидазу. Хозяева, содержащие одну или несколько копий вышеупомянутых векторов, являются дополнительным предметом данного изобретения. Предпочтительно этими хозяевами являются клетки-хозяева. Клетки-хозяева включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки млекопитающего, растения, насекомого, клетки грибного или бактериального происхождения. Бактериальные клетки включают в себя, но не ограничиваются ими, клетки из грамположительных бактерий или грамотрицательных бактерий, таких как несколько видов родов Escherichia, таких как Е. coli, и Pseudomonas. В группе грибных клеток предпочтительно используют дрожжевые клетки. Экспрессия в дрожжах может быть достигнута с использованием, в частности, таких штаммов дрожжей, как Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae и Hansenula polymorpha. Кроме того, в качестве клеток-хозяев могут быть использованы клетки насекомых,такие как клетки из Drosophila и Sf9. Кроме этого, клетками-хозяевами могут быть клетки растений, такие, в частности, как клетки из культурных растений, таких как растения лесов сельскохозяйственного значения, или клетки из растений, обеспечивающих пищевые продукты и сырьевые материалы, таких как злаковые растения или лекарственные растения, или клетки из декоративных растений, или клетки из цветочных луковичных культур. Трансформированные (трансгенные) растения или клетки растений получают известными способами, например Agrobacterium-опосредованным переносом генов, трансформацией дисков из листьев, трансформацией протопластов индуцируемым полиэтиленом переносом ДНК,электропорацией, обработкой ультразвуком, микроинъекцией или баллистическим переносом генов. До- 13016717 полнительно, подходящей системой экспрессии может быть бакуловирусная система. Экспрессирующие системы, использующие клетки млекопитающих, такие как клетки яичника китайского хомячка (СНО),клетки COS, клетки ВНК или клетки меланомы Bowes являются предпочтительными в данном изобретении. Клетки млекопитающих обеспечивают экспрессированные белки с посттрансляционными модификациями, которые наиболее сходны с природными молекулами, происходящими из млекопитающих. Поскольку данное изобретение имеет дело с молекулами, которые могут быть предназначены для введения людям, особенно предпочтительной могла бы быть полностью человеческая экспрессирующая система. Таким образом, даже более предпочтительно клетками-хозяевами являются клетки-человека. Примерами клеток человека являются, в частности, клетки HeLa, 911, АТ 1080, А 549, 293 и НЕК 293 Т. В предпочтительных вариантах осуществления человеческие клетки-продуценты содержат, по меньшей мере, функциональную часть последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей район Е 1 аденовируса, в экспрессируемом формате. Даже в более предпочтительных вариантах указанные клетки-хозяева получают из ретины человека и иммортализуют с нуклеиновыми кислотами, содержащими последовательности аденовирусного Е 1, например, клетки 911 или линия клеток, депонированная в Европейской Коллекции Культур Клеток (ЕСАСС), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Great Britain 29 февраля под номером 96022940 и продаваемая под товарным названием PER.C6 (PER.C6 является зарегистрированным товарным названием Crucell Holland B.V.). Здесь "PER.C6" относится к клеткам, депонированным под номером 96022940, или их предкам, пассажам, более ранним и более поздним, а также потомкам от предков депонированных клеток, а также производным любых из вышеуказанных. Получение рекомбинантных белков в клетках-хозяевах может выполняться в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Применение этих клеток, продаваемых под товарным названием PER.C6, в качестве платформы получения представляющих интерес белков было описано в WO 00/63403, описание которого включено здесь в качестве ссылки в его полном виде. Способ получения связывающей молекулы по изобретению является дополнительной частью согласно изобретению. Этот способ предусматривает стадии: а) культивирования хозяина согласно изобретению в условиях, благоприятных для экспрессии указанной связывающей молекулы, и, b) необязательно, извлечения экспрессированной связывающей молекулы. Экспрессированные связывающие молекулы или иммуноконъюгаты могут быть извлечены из бесклеточного экстракта, но предпочтительно, когда извлекают из культуральной среды. Описанный способ получения может быть использован также для получения функциональных вариантов связывающих молекул и/или иммуноконъюгатов данного изобретения. Способы извлечения белков, таких как связывающие молекулы, из бесклеточных экстрактов или культуральной среды хорошо известны специалисту в данной области. Связывающие молекулы, функциональные варианты и/или иммуноконъюгаты, получаемые описанным выше способом, также являются частью данного изобретения. Альтернативно, после экспрессии у хозяев, таких как клетки-хозяева, связывающие молекулы и иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть получены синтетически с использованием общепринятых пептидных синтезаторов или в бесклеточных системах трансляции с использованием нуклеиновой кислоты (РНК), полученной из ДНК-молекул в соответствии с этим изобретением. Связывающие молекулы и иммуноконъюгаты, получаемые описанными выше синтетическими способами получения или бесклеточными системами трансляции, также являются частью данного изобретения. Еще в одном варианте осуществления связывающие молекулы согласно данному изобретению могут быть получены также у трансгенных, не являющихся человеком, млекопитающих, таких, например,как кролики, козы или коровы, и секретированы, например, в их молоко. Еще в одном альтернативном варианте осуществления связывающие молекулы согласно изобретению, предпочтительно связывающие молекулы человека, специфически связывающиеся с энтерококками или их фрагментом, могут генерироваться трансгенными млекопитающими (не человеком), такими как,например, трансгенные мыши или кролики, которые экспрессируют гены иммуноглобулина человека. Предпочтительно эти трансгенные млекопитающие (не человек) имеют геном, содержащий трансген тяжелой цепи человека и трансген легкой цепи человека, кодирующие полностью или частично описанные выше связывающие молекулы человека. Эти трансгенные (не человек) млекопитающие могут быть иммунизированы очищенным или обогащенным препаратом энтерококков или их фрагмента. Протоколы для иммунизации млекопитающих (не человека) хорошо установлены в данной области. См. Using Antibodies: A Laboratory Manual, Edited by: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, ColdMargulies, E.M. Shevach, W. Strober (2001), John WileySons Inc., New York, описания которого включены здесь в качестве ссылки. Протоколы иммунизации часто включают в себя множественные иммунизации либо с адъювантами, либо без адъювантов, таких как полный адъювант Фрейнда и неполный адъювант Фрейнда, но могут также включать в себя иммунизации голой ДНК. В другом варианте осуществления связывающие молекулы человека продуцируются В-клетками или клетками плазмы, полученными из трансгенных животных. Еще в одном варианте осуществления связывающие молекулы человека продуцируются гибридомами, которые получают слиянием В-клеток, полученных из описанных выше- 14016717 трансгенных млекопитающих (не человека), с иммортализованными клетками. В-клетки, клетки плазмы и гибридомы, получаемые из описанных выше трансгенных млекопитающих (не человека), и связывающие молекулы человека, получаемые из описанных выше млекопитающих (не человека), В-клеток, клеток плазмы и гибридом, также являются частью данного изобретения. В следующем аспекте изобретение обеспечивает способ идентификации связывающей молекулы,такой как связывающая молекула человека, например моноклональное антитело человека или его фрагмент, специфически связывающейся по меньшей мере с двумя разными бактериальными организмами или молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими такие связывающие молекулы, и предусматривает стадии: (а) контактирования коллекции связывающих молекул на поверхности реплицируемых генетических упаковок с первым бактериальным организмом в условиях, благоприятных для связывания, (b) отбора по меньшей мере один раз на связывание реплицируемой генетической упаковки с этим первым бактериальным организмом, (с) необязательно, отделения реплицируемой генетической упаковки, связывающейся с первым бактериальным организмом, от реплицируемых генетических упаковок, которые не связываются с первым бактериальным организмом, контактирование отделенных реплицируемых упаковок со вторым бактериальным организмом в условиях, благоприятных для связывания и отбора по меньшей мере один раз на связывание реплицируемой генетической упаковки со вторым бактериальным организмом, и (d) отделения и извлечения реплицируемой генетической упаковки, связывающейся с первым и/или вторым бактериальным организмом, от реплицируемых генетических упаковок, которые не связываются с первым и/или вторым бактериальным организмом. Конечно, описанные выше способы,продленные отборами на третий и последующие бактериальные организмы, также являются частью данного изобретения. Другой частью согласно изобретению является способ идентификации связывающей молекулы, такой как связывающая молекула человека, например моноклональное антитело человека или его фрагмент, специфически связывающийся с видами энтерококков или молекулами нуклеиновых кислот, кодирующими такую связывающую молекулу. Такой способ предусматривает те же самые стадии,что и способ, описанный выше. Реплицируемой генетической упаковкой в данном контексте могут быть клетки, споры, дрожжи, бактерии, вирусы, (бактерио)фаги, рибосомы и полисомы. Предпочтительной реплицируемой генетической упаковкой является фаг. Связывающие молекулы, такие как, например,одноцепочечные Fv, представляются на этой реплицируемой генетической упаковке, т.е. они присоединяются к группе или молекуле, расположенной на наружной поверхности реплицируемой генетической упаковки. Эта реплицируемая генетическая упаковка является подвергаемым скринингу звеном, содержащим связывающую молекулу, подлежащую скринингу, связанную с молекулой нуклеиновой кислоты,кодирующей указанную связывающую молекулу. Эта молекула нуклеиновой кислоты должна быть реплицируемой либо in vivo (например, в векторе), либо in vitro (например, при помощи ПЦР, транскрипции и трансляции). In vivo репликация может быть автономной (как для клетки), при помощи факторов хозяина (как для вируса) или при помощи как хозяина, так и хелперного вируса (как для фагмиды). Реплицируемые генетические упаковки, представляющие коллекцию связывающих молекул, образуются введением молекул нуклеиновых кислот, кодирующих экзогенные связывающие молекулы, подлежащие представлению в геномах реплицируемых генетических упаковок, для образования слитых белков с эндогенными белками, которые в норме экспрессируются из наружной поверхности реплицируемых генетических упаковок. Экспрессия этих слитых белков, транспорт к наружной поверхности и сборка приводят к представлению (дисплею) экзогенных связывающих молекул из наружной поверхности реплицируемых генетических упаковок. Стадия (стадии) отбора в этом способе по изобретению может выполняться с бактериальными организмами, которые являются живыми и все еще инфекционными или инактивированными. Инактивацию бактериального организма можно выполнить способами бактериальной инактивации, хорошо известными специалисту, такими, например, как способ с низким рН, т.е. рН 4, в течение 6 ч-21 дней; обработка органическим растворителем/детергентом, т.е. добавление органических растворителей и детергентов (Тритона Х-100 или Твина-80) к бактерии; облучение УФ-светом; гамма-облучение и обработка релевантными антибиотиками. Способы испытания, является ли бактериальный организм еще живым,инфекционным и/или жизнеспособным или частично или полностью инактивированным, хорошо известны специалисту в данной области. Используемые в описанном выше способе бактериальные организмы могут быть невыделенными, например, присутствующими в сыворотке и/или крови инфицированного индивидуума. Используемые бактериальные организмы могут быть также выделенными в виде дискретных колоний после ночной культуры при 37 С на подходящей среде, такой как агар с овечьей кровью. В одном варианте осуществления первый и/или второй бактериальный организм находятся в суспензии при контакте с реплицируемыми генетическими упаковками. Альтернативно, они могут быть связаны с носителем при контактировании. В другом варианте осуществления первый и второй бактериальные организмы являются бактериальными организмами из разных бактериальных семейств, например первый является грамотрицательной бактерией, а второй является грамположительной бактерией. Таким путем могут быть найдены связывающие молекулы, способные специфически связываться с грамположительными и грамотрицательными бактериями. Первый и второй бактериальные организмы могут быть оба энтерококками. В одном варианте осуществления первый и второй бактериальные организмы явля- 15016717 ются разными штаммами одного и того же вида бактерий, например вида Enterococcus, такого как Е. faecalis или Е. faecium. Таким путем могут быть найдены видоспецифические связывающие молекулы, которые способны специфически связываться с разными штаммами в одном виде. В другом варианте осуществления первый и второй бактериальный организм, каждый, является членом разных видов Enterococcus, например первый и второй виды Enterococcus выбраны из группы, состоящей из Е. faecalis и Е.faecium. Таким путем могут быть найдены связывающие молекулы, способные специфически связываться с разными видами в одном роде бактерий. Альтернативно, стадия отбора может выполняться в присутствии фрагмента этих бактериальных организмов, такого, например, как препараты мембран клеток, препараты мембран клеток, которые были ферментативно обработаны для удаления белков (например, протеазой К), препараты мембран клеток,которые были ферментативно обработаны для удаления углеводных частей молекул (например, периодатом), рекомбинантных белков или полисахаридов. Еще в одном варианте осуществления стадия отбора может выполняться в присутствии одного или нескольких белков или (поли)пептидов, полученных из этих бактериальных организмов, слитых белков, содержащих эти белки или (поли)пептиды, и т.п. Экспонированные внеклеточно части этих белков могут быть также использованы в качестве селективного материала. Живые или инактивированные бактериальные организмы или их фрагменты могут быть иммобилизованы на подходящем материале перед применением. Альтернативно, живые или иммобилизованные бактерии используют в суспензии. В одном варианте осуществления отбор может выполняться на различных материалах, полученных из бактериальных организмов. Например, первый раунд отбора может выполняться на живых или инактивированных бактериальных организмах в суспензии, в то время как второй и третий раунд отбора могут выполняться на рекомбинантных бактериальных белках и полисахаридах соответственно. Конечно, здесь рассматриваются также другие комбинации. Разные бактериальные материалы могут быть также использованы во время одной стадии отбора/пэннинга. В следующем аспекте это изобретение обеспечивает способы, в которых эти бактериальные организмы, используемые в стадии (стадиях) отбора, получают из тех же самых или разных фаз роста этих бактерий, например лаг-фазы, log-фазы, стационарной фазы или фазы смерти. Этим путем, например, могут быть найдены фазоспецифические антибактериальные связывающие молекулы. Например, первым бактериальным организмом может быть Е. faecalis в стационарной фазе, тогда как вторым бактериальным организмом является Е. faecium в лаг-фазе. Дополнительные комбинации находятся вполне в рамках квалификации специалиста в данной области. Еще в одном аспекте изобретение обеспечивает способ получения связывающей молекулы, специфически связывающейся по меньшей мере с двумя разными бактериальными организмами, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такую связывающую молекулу, где этот способ предусматривает стадии: а) выполнения описанного выше способа идентификации связывающих молекул и b) выделения из извлеченной реплицируемой генетической упаковки этой связывающей молекулы или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанную связывающую молекулу. Коллекцией связывающих молекул на поверхности реплицируемых генетических упаковок может быть коллекция scFv или Fab. После установления или идентификации новых scFv или Fab вышеупомянутым способом идентификации связывающих молекул или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих эти связывающие молекулы, ДНК, кодирующая эти scFv или Fab, может быть выделена из этих бактерий или фагов и комбинирована стандартными способами молекулярной биологии для получения конструкций, кодирующих бивалентныеscFv или полные иммуноглобулины человека желаемой специфичности (например, IgG, IgA или IgM). Эти конструкции могут быть трансфицированы в подходящие клеточные линии и могут быть получены полные моноклональные антитела человека (см. Huls et al., 1999; Boel et al., 2000). Как упоминалось ранее, предпочтительной реплицируемой генетической упаковкой является фаг. Способы фагового дисплея для идентификации и получения связывающих молекул (человека), например моноклональных антител (человека), являются в настоящее время хорошо установленными способами,известными специалисту в данной области. Они описаны, например, в патенте США 5696108; BurtonYork. Все эти ссылки включены здесь в их полном виде. Для конструирования библиотек фагового дисплея, коллекции генов вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи моноклонального антитела человека экспрессируют на поверхности частиц бактериофага, предпочтительно нитеобразного бактериофага, в форме одноцепочечного Fv (scFv) или в форме Fab (см. de Kruif et al., 1995b). Большие библиотеки экспрессирующих фрагмент антитела фагов обычно содержат более 1,0109 специфичностей антител и могут быть собраны из V-областей иммуноглобулина, экспрессируемых в В-лимфоцитах иммунизированных или неиммунизированных индивидуумов. В конкретном варианте осуществления изобретения фаговую библиотеку связывающих молекул, предпочтительно фаговую библиотеку scFv, получают из РНК, выделенной из клеток субъекта, который был вакцинирован против бактерии, недавно вакцинирован против неродственного патогена, недавно страдавшего от хронической или острой бактериальной инфекции, например энтерококковой инфекции, или здорового индивидуума. РНК может быть выделена, в частности, из костного мозга или периферической крови, предпочтительно из лимфоцитов- 16016717 периферической крови или выделенных В-клеток или даже субпопуляций В-клеток. Таким субъектом может быть животное, вакцинированное против бактерии, или животное, которое имеет или имело бактериальную инфекцию. Предпочтительно таким животным является человек, который был вакцинирован против бактерии или имеет или перенес хроническую бактериальную инфекцию или острую бактериальную инфекцию. Предпочтительно, чтобы такой человек недавно выздоровел от указанной бактериальной инфекции. Альтернативно, библиотеки фагового дисплея могут быть сконструированы из вариабельных областей иммуноглобулина, которые частично составлены in vitro для введения дополнительного разнообразия антител в этой библиотеке (полусинтетические библиотеки). Например, составленные in vitro вариабельные области содержат участки синтетически полученных рандомизированных или частично рандомизированных ДНК в тех областях этих молекул, которые важны для специфичности антитела, например CDR-районах. Фаговые антитела, специфичные в отношении бактерий, таких как энтерококки,могут быть отобраны из этой библиотеки путем приведения в контакт бактерий или их материала действию фаговой библиотеки для создания возможности связывания фагов, экспрессирующих фрагменты антител, специфические в отношении этих бактерий или их материала. Не связанные фаги удаляют промыванием, а связанные фаги элюируют для инфицирования бактерий Е. coli и последующего размножения. Обычно требуются многочисленные циклы отбора и размножения для достаточного обогащения фагами, специфически связывающимися с этими бактериями или их материалом. Если желательно, перед тем как подвергнуть фаговую библиотеку действию бактерий или их материала, фаговую библиотеку можно сначала сократить путем приведения этой фаговой библиотеки в контакт с материалом, не являющимся мишенью, таким как бактерии отличающегося семейства, вида и/или штамма или бактерии в отличающейся фазе роста, или материал из этих бактерий. Такие бактерии - "сократители" или материал из них могут быть связаны с твердой фазой или могут находиться в суспензии. Фаги могут быть также отобраны на предмет связывания с комплексными антигенами, такими как комплексные смеси бактериальных белков или (поли)пептидов, необязательно дополненные бактериальными полисахаридами или другим бактериальным материалом. Клетки-хозяева, экспрессирующие один или несколько белков или(поли)пептидов бактерий, таких как энтерококки, могут быть также использованы для отбора. Способ фагового дисплея с использованием таких клеток-хозяев может быть далее улучшен путем дальнейшего"сокращения" за счет нерелевантных связывающих агентов во время скрининга путем добавления избытка клеток-хозяев, не содержащих молекул-мишеней или содержащих молекулы, не являющиеся мишенями, которые сходны, но не идентичны мишени и посредством этого сильно увеличивают шанс нахождения релевантных связывающих молекул. Конечно, такое "сокращение" может выполняться до, во время или после скрининга с бактериальным организмом или его материалом. Этот способ называют способом Mabstract (Mabstract является зарегистрированным товарным названием Crucell HollandB.V., см. также патент США 6265150, который включен здесь в качестве ссылки). Еще в одном аспекте изобретение обеспечивает способ получения связывающей молекулы с потенциальной киллерной активностью в отношении бактериального организма, предпочтительно по меньшей мере двух разных бактериальных организмов, где способ предусматривает стадии: (а) выполнения способа получения связывающей молекулы, специфически связывающейся по меньшей мере с двумя разными бактериальными организмами или молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей такую связывающую молекулу, как описано выше, и (b) подтверждения того, обладает ли выделенная связывающая молекула киллерной активностью в отношении бактериального организма, предпочтительно по меньшей мере против двух разных бактериальных организмов. Анализы на предмет подтверждения того, обладает ли связывающая молекула киллерной активностью, например опсонизирующей активностью, хорошо известны в данной области (см., например, Manual of Molecular and Clinical Laboratory Immunology, 7thEdition). В следующем варианте осуществления указанную связывающую молекулу тестируют также на любую другую активность. Другие применимые активности упоминаются выше. В следующем аспекте изобретение относится к связывающей молекуле с киллерной активностью в отношении по меньшей мере двух, предпочтительно по меньшей мере трех или более разных бактериальных организмов, таких, например, как энтерококки, и получаемой способами, описанными выше. Фармацевтическая композиция, содержащая указанную связывающую молекулу, дополнительно содержащая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент, также является аспектом данного изобретения. Фармацевтически приемлемые эксципиенты хорошо известны специалисту в данной области. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один другой терапевтический агент. Подходящие агенты также хорошо известны специалисту в данной области. Еще в одном дополнительном аспекте данное изобретение обеспечивает композиции, содержащие по меньшей мере одну связывающую молекулу, предпочтительно моноклональное антитело человека по этому изобретению, по меньшей мере один ее функциональный вариант, по меньшей мере один иммуноконъюгат по этому изобретению или их комбинации. Кроме них, эти композиции могут содержать interalia стабилизирующие молекулы, такие как альбумин или полиэтиленгликоль, или соли. Предпочтительно используемыми солями являются соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность- 17016717 этих связывающих молекул и не сообщают нежелательных токсикологических эффектов. Если необходимо, связывающие молекулы человека согласно изобретению могут иметь покрытия или быть внесены в материал или нанесены на материал для защиты их от действия кислот или других природных или неприродных условий, которые могут инактивировать эти связывающие молекулы. Еще в одном аспекте данное изобретение обеспечивает композиции, содержащие по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, определенную в данном изобретении. Эти композиции могут содержать водные растворы, такие как водные растворы, содержащие соли (например, NaCl или соли, описанные выше), детергенты (например, ДСН) и/или другие подходящие компоненты. Кроме того, данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере одну связывающую молекулу, такую как моноклональное антитело человека по этому изобретению (или его функциональный фрагмент или вариант), по меньшей мере один иммуноконъюгат согласно изобретению, по меньшей мере одну композицию согласно изобретению, или их комбинации. Фармацевтическая композиция согласно изобретению дополнительно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый эксципиент. В одном варианте осуществления фармацевтические композиции могут содержать две или более связывающие молекулы, которые имеют киллерную активность в отношении бактериального организма,например, вида Enterococcus. В одном варианте осуществления эти связывающие молекулы проявляют синергическую киллерную активность при использовании в комбинации. Другими словами, эти композиции содержат по меньшей мере две связывающие молекулы с киллерной активностью, отличающиеся тем, что эти связывающие молекулы действуют синергически в убивании бактериального организма,такого, например, как вид Enterococcus. В данном контексте термин "синергическое" означает, что эффект объединенное действие этих связывающих молекул при их сочетанном использовании выше аддитивного эффекта при их индивидуальном использовании. Эти синергически действующие связывающие молекулы могут связываться с разными структурами на одних и тех же или на разных фрагментах этого бактериального организма. В одном варианте осуществления связывающие молекулы, действующие синергически в уничтожении бактериального организма, могут быть способны также к синергическому уничтожению и других бактериальных организмов. Синергизм рассчитывают при помощи индекса комбинации. Концепция индекса комбинации (CI) была описана Chou and Talalay, 1984. Две или более связывающие молекулы, имеющие синергическую активность, имеют индивидуальные способы действия. Например, первая связывающая молекула может иметь опсонизирующую активность, тогда как вторая связывающая молекула может иметь другую активность повышения/увеличения/усиления фагоцитоза,или первая связывающая молекула может обладать внутренней (эндогенной) (киллерной) активностью,например, уменьшая или ингибируя бактериальный рост или непосредственно уничтожая бактерии, тогда как вторая связывающая молекула увеличивает чувствительность бактерий к обработке антибиотиком. Должно быть понятно, что здесь рассматриваются также и другие комбинации. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один другой терапевтический, профилактический и/или диагностический агент. Предпочтительно фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один другой профилактический и/или терапевтический агент. Предпочтительно указанные дополнительные терапевтический и/или профилактический агенты являются агентами, способными предотвращать и/или лечить бактериальную, например энтерококковую, инфекцию и/или состояние, происходящее из такой инфекции. Терапевтические и/или профилактические агенты включают в себя, но не ограничиваются ими, антибактериальные агенты. Такими агентами могут быть связывающие молекулы, малые молекулы, органические или неорганические соединения, ферменты, полинуклеотидные последовательности, противомикробные пептиды и т.д. Другими агентами, которые используются в настоящее время для лечения пациентов, инфицированных бактериальными инфекциями, являются антибиотики, такие как ванкомицин, тейкопланин, синергические комбинации, включающие в себя ампициллин или ванкомицин и аминогликозид или сулбактам, пенициллины, в том числе пенициллины широкого спектра, карбапенемы, макролиды, хинолоны, тетрациклины, хлорамфеникол, даптомицин, линезолид, хинупристин/далфопристин. Они могут быть использованы в комбинации со связывающими молекулами согласно изобретению. Агенты, способные предотвращать и/или лечить инфекцию, вызываемую бактериями, и/или состояние, происходящее из такой инфекции, которые находятся в экспериментальной фазе, могут быть также использованы в качестве других терапевтических и/или профилактических агентов, применимых в данном изобретении. Связывающие молекулы или фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть испытаны в подходящих системах моделей животных перед применением в людях. Такие системы моделей животных включают в себя, но не ограничиваются ими, мышиные модели сепсиса и перитонита, крысиные модели сепсиса и эндокардита и кроличьи модели эндокардита. Обычно фармацевтические композиции должны быть стерильными и стабильными в условиях приготовления и хранения. Связывающие молекулы, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот или композиции данного изобретения могут быть в форме порошка для воссоздания (воспроизведения) в подходящем фармацевтически приемлемом эксципиенте перед временем или во время доставки. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными- 18016717 способами получения являются сушка в вакууме и сушка вымораживанием (лиофилизация), которые дают порошок активного ингредиента плюс любого дополнительного желаемого ингредиента, из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора. Альтернативно, связывающие молекулы, иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот или композиции данного изобретения могут находиться в растворе, и подходящий фармацевтически приемлемый эксципиент может быть добавлен и/или смешан до времени или во время доставки для обеспечения инъецируемой формы унифицированной дозы. Предпочтительно фармацевтически приемлемый эксципиент, используемый в данном изобретении, является подходящим для высокой концентрации лекарственного средства, может сохранять должную текучесть и, если необходимо, может задерживать абсорбцию. На выбор оптимального способа введения фармацевтических композиций будут влиять несколько факторов, в том числе физико-химические свойства активных молекул в этих композициях, безотлагательность клинической ситуации и взаимосвязь концентраций в плазме активных молекул с желаемым терапевтическим эффектом. Например, если необходимо, связывающие молекулы согласно изобретению могут быть приготовлены с носителями, которые будут защищать их от быстрого высвобождения, например, в виде формы регулируемого высвобождения, включающей в себя имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Кроме того, могут быть использованы биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Кроме того, может быть необходимым покрытие связывающих молекул материалом или соединением или совместное введение связывающих молекул с материалом или соединением, которые предотвращают инактивацию связывающих молекул человека. Например, связывающие молекулы могут вводиться субъекту в подходящем носителе,например липосомах, или разбавителе. Способы введения могут быть подразделены на две основные категории, пероральное и парентеральное введение. Предпочтительным способом является внутривенное введение. Пероральные дозированные формы могут быть приготовлены, например, в виде таблеток, пастилок,лепешек, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий, твердых капсул, мягких желатиновых капсул, сиропов или эликсиров, пилюль, драже, жидкостей, гелей или суспензий. Эти готовые формы могут содержать фармацевтически приемлемые эксципиенты, в том числе,но не только, инертные разбавители, гранулирующие и дезинтегрирующие агенты, связывающие агенты,смазывающие агенты, консерванты и загущающие агенты. Фармацевтические композиции данного изобретения могут быть также приготовлены для парентерального введения. Готовые формы для парентерального введения могут быть представлены, например,в виде водных или неводных изотонических стерильных нетоксичных инъекционных или инфузионных растворов или суспензий. Эти растворы или суспензии могут содержать агенты, которые являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, такие как 1,3-бутандиол, раствор Рингера, раствор Хенка, изотонический раствор хлорида натрия, масла, жирные кислоты, местные анестезирующие агенты, консерванты, буферы, увеличивающие вязкость или растворимость агенты, водорастворимые антиоксиданты, маслорастворимые антиоксиданты и хелатирующие металлы агенты. В следующем аспекте связывающие молекулы, такие как моноклональные антитела человека (их функциональные фрагменты и варианты), иммуноконъюгаты, композиции или фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть использованы в качестве лекарственного средства. Таким образом, способ лечения и/или предотвращения бактериальной (грамположительной и/или грамотрицательной), например энтерококковой, инфекции с использованием этих связывающих молекул, иммуноконъюгатов, композиций или фармацевтических композиций согласно изобретению является другой частью данного изобретения. Вышеупомянутые молекулы могут быть использованы, например, в диагностике,профилактике, лечении или их комбинациях бактериальной инфекции. Важные клинические инфекции,вызываемые энтерококками, включают в себя, но не ограничиваются ими, инфекции мочевых путей,внутрибрюшные, тазовые инфекции и инфекции мягких тканей, бактериеимию, бактериальный эндокардит, дивертикулит, менингит, перитонит, остеомиедит, септический артрит, абсцессы, раневые инфекции и пневмонию. Они пригодны для лечения еще не лечившихся пациентов, страдающих от бактериальной инфекции, и пациентов, которые лечились или обрабатывались в отношении бактериальной инфекции. Они могут быть использованы для таких пациентов как госпитализированные младенцы, младенцы, рожденные преждевременно, жертвы ожогов, пожилые пациенты, иммунодефицитные пациенты, такие как пациенты, получающие химиотерапию, иммуносупрессированные пациенты, такие как пациенты, получившие трансплантированные органы, иммунодефицитные пациенты, пациенты, подвергающиеся инвазивной процедуре, и работники здравоохранения. Каждое введение может защищать против дополнительной инфекции бактериальным организмом в течение до трех или четырех недель и/или будет замедлять проявление или прогрессирование симптомов, ассоциированных с этой инфекцией. Связывающие молекулы согласно изобретению могут также увеличивать эффективность существующего антибиотического лечения увеличением чувствительности этой бактерии к данному антибиотику, может стимулиро- 19016717 вать иммунную систему для атаки на эту бактерию другими способами, чем посредством опсонизации. Эта активация может приводить к длительно длящейся защите от этой инфекционной бактерии. Кроме того, связывающие молекулы согласно изобретению могут непосредственно ингибировать рост этой бактерии или ингибировать факторы вирулентности, необходимые для ее выживания во время инфекции. Вышеупомянутые молекулы или композиции могут быть использованы вместе с другими молекулами, применимыми в диагностике, профилактике и/или лечении. Они могут быть использованы in vitro,ex vivo или in vivo. Например, связывающие молекулы, такие как моноклональные антитела человека(или их функциональные варианты), иммуноконъюгаты, композиции или фармацевтические композиции согласно изобретению могут вводиться совместно с вакциной против этого бактериального организма(если она доступна). Альтернативно, эта вакцина может также вводиться до или после введения молекул согласно изобретению. Вместо вакцины, антибактериальные агенты могут также использоваться вместе со связывающими молекулами согласно изобретению. Подходящие антибактериальные агенты упоминаются выше. Указанные молекулы обычно готовят в виде композиций и фармацевтических композиций согласно изобретению в терапевтически или диагностически эффективном количестве. Альтернативно, они могут быть приготовлены и введены по отдельности. Например, другие молекулы, такие как антибактериальные агенты, могут применяться системно, тогда как связывающие молекулы согласно изобретению могут применяться внутриоболочечно или интравентрикулярно. Схемы введения доз могут быть приспособлены для обеспечения оптимальной желаемой реакции(например, терапевтической реакции). Подходящим диапазоном доз может быть, например, диапазон 0,1-100 мг/кг массы тела, предпочтительно 0,5-15 мг/кг массы тела. Кроме того, например, может быть введен единственный болюс (ударная доза), несколько разделенных доз могут вводиться на протяжении времени или эта доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена в соответствии с необходимостью терапевтической ситуации. Молекулы и композиции по данному изобретению являются предпочтительно стерильными. Способы стерилизации этих молекул и композиций хорошо известны в данной области. Другие молекулы, применимые в диагностике, профилактике и/или лечении могут быть введены в сходной схеме введения доз, предложенной для связывающих молекул согласно изобретению. Если эти другие молекулы вводят отдельно, они могут вводиться пациенту до (например, за 2, 5, 10, 15,30, 45, 60 мин, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ч, 2, 3, 4, 5, 7 дней, 2, 4 или 6 недель ранее), одновременно или после (например, 2, 5, 10, 15, 30, 45, 60 мин, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 ч, 2, 3, 4, 5, 7 дней, 2, 4 или 6 недель после) введения одной или нескольких связывающих молекул человека или фармацевтических композиций согласно изобретению. Точную схему введения доз обычно уточняют во время клинических испытаний на пациентах-людях. Связывающие молекулы человека и фармацевтические композиции, содержащие связывающие молекулы человека, особенно применимы и часто предпочтительны при введении людям в качестве терапевтических агентов, так как иммунные реакции реципиента на введенное антитело часто будет существенно меньшим, чем иммунная реакция в случае введения моноклональной мышиной, химерной или гуманизированной связывающей молекулы. В другом аспекте данное изобретение относится к применению связывающих молекул, таких как человеческие моноклональные антитела-киллеры (их функциональные фрагменты и варианты), иммуноконъюгаты, молекулы нуклеиновых кислот, композиции или фармацевтические композиции согласно изобретению в приготовлении лекарственного средства для диагностики, профилактики, лечения или их комбинации, бактериальной (грамположительной и/или грамотрицательной), например энтерококковой,инфекции. Далее, наборы, содержащие по меньшей мере одну связывающую молекулу, такую как человеческое моноклональное антитело-киллер (его функциональные фрагменты и варианты), по меньшей мере один иммуноконъюгат, по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, по меньшей мере одну композицию, по меньшей мере одну фармацевтическую композицию, по меньшей мере один вектор, по меньшей мере одного хозяина по этому изобретению или их комбинацию, являются также частью данного изобретения. Необязательно, вышеописанные компоненты этих наборов данного изобретения упакованы в подходящих контейнерах и имеют инструкции в отношении диагностики, профилактики и/или лечения указанных состояний. Эти вышеупомянутые компоненты могут храниться в однодозовых или мультидозовых контейнерах в виде водного, предпочтительно стерильного, раствора или в виде лиофилизированной, предпочтительно стерильной, готовой формы для воссоздания. Эти контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик, и могут иметь стерильное входное отверстие для доступа (например, контейнером может быть мешок для внутривенного раствора или флакон, имеющий протыкаемую иглой для подкожных инъекций пробку). Этот набор может дополнительно содержать дополнительные контейнеры, содержащие фармацевтически приемлемый буфер. Он может дополнительно включать в себя другие материалы, желаемые с коммерческой точки зрения или с точки зрения пользователя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, культуральную среду для одного или нескольких хозяев и даже, возможно, по меньшей мере один другой терапевтический, профилактический или диагностический агент. С этими наборами могут быть связаны ин- 20016717 струкции, включаемые обычно в коммерческих упаковках терапевтических, профилактических или диагностических продуктов, которые содержат информацию, например, о показаниях, применении, дозе,приготовлении, введении, противопоказаниях и/или предостережениях, касающихся применения таких терапевтических, профилактических или диагностических продуктов. Связывающие молекулы согласно изобретению могут быть также использованы для покрытия медицинских устройств или полимерных биоматериалов. Данное изобретение относится дополнительно к способу детектирования бактериального организма(грамположительного и/или грамотрицательного) в пробе, причем этот способ предусматривает стадии:(а) контактирования пробы с диагностически эффективным количеством связывающей молекулы (ее функциональных фрагментов и вариантов) или иммуноконъюгата по этому изобретению и (b) определения, связывается ли специфически эта связывающая молекула или иммуноконъюгат с молекулой этой пробы. Предпочтительно этот способ используют для детектирования Enterococcus в пробе. Этой пробой может быть биологическая проба, в том числе, но не только, кровь, сыворотка, моча, ткань или другой биологический материал из (потенциально) инфицированных субъектов, или небиологическая проба,такая как вода, напиток и т.д. Этими (потенциально) инфицированными субъектами могут быть субъекты-люди, но также животные, которые подозреваются в качестве носителей такого бактериального организма, могут быть тестированы на присутствие этого организма с использованием связывающих молекул человека или иммуноконъюгатов согласно изобретению. Эта проба может быть сначала подвергнута манипуляциям, чтобы сделать ее более подходящей для этого способа детектирования. Под манипуляцией понимают, например, обработку пробы, в которой подозревается присутствие бактериального организма таким образом, что этот организм будет дезинтегрироваться в антигенные компоненты, такие как белки,(поли)пептиды или другие антигенные фрагменты. Предпочтительно связывающие молекулы человека или иммуноконъюгаты согласно изобретению контактируют с пробой в условиях, которые позволяют образование иммунологического комплекса между связывающими молекулами человека и бактериальным организмом или его антигенными компонентами, которые могут присутствовать в этой пробе. Затем образование иммунологического комплекса, если оно происходит, указывающее на присутствие бактериального организма в этой пробе, детектируют и измеряют подходящими способами. Такие способы включают в себя, в частности, гомогенные и гетерогенные иммуноанализы связывания, такие как радиоиммуноанализы (RIA), ELISA, иммунофлуоресценцию, иммуногистохимию, FACS, BIACORE и вестернблот-анализы. Предпочтительными способами анализа, особенно для широкомасштабного клинического скрининга сывороток пациентов и крови и полученных из крови продуктов, являются ELISA и вестерн-блотанализ. Особенно предпочтительными являются тесты ELISA. Для применения в качестве реагентов в этих анализах связывающие молекулы или иммуноконъюгаты согласно изобретению предпочтительно связывают с внутренней поверхностью микротитрационных лунок. Связывающие молекулы и иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть непосредственно связаны с микротитрационной лункой. Однако максимальное связывание связывающих молекул или иммуноконъюгатов согласно изобретению с лунками может выполняться предобработкой этих лунок полилизином перед добавлением связывающих молекул или иммуноконъюгатов согласно изобретению. Кроме того, связывающие молекулы или иммуноконъюгаты согласно изобретению могут быть ковалентно присоединены к лункам известными способами. Обычно связывающие молекулы или иммуноконъюгаты используют в количестве 0,01-100 мг/мл для покрытия, хотя могут быть также использованы более высокие, а также более низкие количества. Затем пробы добавляют к лункам, покрытым связывающими молекулами или иммуноконъюгатами согласно изобретению. Кроме того, связывающие молекулы согласно изобретению могут быть использованы для идентификации структур специфического связывания бактериального организма, например Enterococcus. Этими связывающими структурами могут быть эпитопы на белках и/или полипептидах. Они могут быть линейными, но также структурными или конформационными. В одном варианте осуществления связывающие структуры могут быть анализированы с использованием анализа PEPSCAN (см., например, WO 84/03564,WO 93/09872, Slootstra et al., 1996). Альтернативно, библиотека случайных пептидов, содержащая пептиды из белка бактериального организма, может быть подвергнута скринингу на пептиды, способные связываться со связывающими молекулами согласно изобретению. Эти обнаруженные связывающие структуры/эпитопы могут быть использованы в качестве вакцин и для диагностики бактериальных инфекций. В случае, если фрагменты, другие чем белки и/или полипептиды, связываются этими связывающими молекулами, связывающие структуры могут быть идентифицированы масс-спектрометрией, высокоэффективной жидкостной хроматографией и ядерным магнитным резонансом. В следующем аспекте это изобретение обеспечивает способ скрининга связывающей молекулы(или ее функционального фрагмента или варианта) на специфическое связывание с тем же самым эпитопом бактериального организма (грамположительного и/или грамотрицательного), например Enterococcus,что и эпитоп, связываемый связывающей молекулой человека согласно изобретению, причем этот способ предусматривает стадии: (а) контактирования подлежащей скринингу связывающей молекулы, связывающей молекулы согласно изобретению и бактериального организма или его фрагмента, (b) измерения,- 21016717 способна ли подлежащая скринингу связывающая молекула конкурировать за специфическое связывание с бактериальным организмом или его фрагментом со связывающей молекулой согласно изобретению. В дополнительной стадии может быть определено, имеют ли подвергаемые скринингу связывающие молекулы, которые способны конкурировать за специфическое связывание с бактериальным организмом или его фрагментом, киллерную активность, например опсонизирующую активность. Связывающая молекула, которая способна конкурировать за специфическое связывание с бактериальным организмом или его фрагментом со связывающей молекулой согласно изобретению, является другой частью данного изобретения. В вышеописанном способе скрининга "специфическое связывание с тем же самым эпитопом" включает в себя также специфическое связывание, по существу, или в основном с тем же самым эпитопом, что и эпитоп, связываемый связывающей молекулой согласно изобретению. Способность блокировать связывание или конкурировать со связыванием связывающих молекул согласно изобретению с бактериальным организмом обычно указывает на то, что подлежащая скринингу связывающая молекула связывается с эпитопом или сайтом связывания на бактериальном организме, который структурно совпадает с сайтом связывания на бактериальном организме, который иммуноспецифически узнается связывающими молекулами согласно изобретению. Альтернативно, это может указывать на то, что подлежащая скринингу связывающая молекула связывается с эпитопом или сайтом связывания согласно изобретению для стерического или иного ингибирования связывания связывающих молекул согласно изобретению с данным бактериальным организмом. Обычно конкурентное ингибирование измеряют при помощи анализа, в котором антигенную композицию, т.е. композицию, содержащую бактериальный организм или его фрагменты, смешивают со ссылочными связывающими молекулами, т.е. связывающими молекулами согласно изобретению, и связывающими молекулами, подлежащими скринингу. Обычно подлежащие скринингу связывающие молекулы присутствуют в избытке. Протоколы на основе ELISA и вестерн-блоттинга пригодны для применения в таких простых конкурентных исследованиях. С использованием вторичных видо- или изотипспецифических антител можно детектировать только связанные ссылочные связывающие молекулы, связывание которых будет уменьшаться присутствием подлежащей скринингу связывающей молекулы, которая узнает, по существу, тот же самый эпитоп. В проведении конкурентного исследования связывающей молекулы между ссылочной связывающей молекулой и любой подлежащей скринингу связывающей молекулой (независимой от вида или изотипа) можно сначала пометить эту ссылочную связывающую молекулу детектируемой меткой, такой как, например, биотин, ферментная, радиоактивная или другая метка, для возможности последующей идентификации. Связывающие молекулы, идентифицированные этими конкурентными анализами ("конкурентные связывающие молекулы" или "перекрестнореактивные связывающие молекулы") включают в себя, но не ограничиваются ими, антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты, которые связываются с эпитопом или сайтом связывания, связываемым ссылочной связывающей молекулой, т.е. связывающей молекулой согласно изобретению, а также антитела, фрагменты антител и другие связывающие агенты, которые связываются с эпитопом или сайтом связывания, достаточно проксимальным относительно эпитопа, связываемого ссылочной связывающей молекулой, для осуществления конкурентного связывания между подлежащими скринингу связывающими молекулами и ссылочной связывающей молекулой. Предпочтительно конкурентные связывающие молекулы согласно изобретению будут, когда они присутствуют в избытке, ингибировать специфическое связывание ссылочной связывающей молекулы с видом-мишенью по меньшей мере на 10%,предпочтительно по меньшей мере на 25%, более предпочтительно по меньшей мере на 50% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на 75-90% или дажеболее. Идентификация одной или нескольких конкурентных связывающих молекул, которые связываются приблизительно, по существу или в основном с тем же самым или с тем же самым эпитопом, что и связывающие молекулы согласно изобретению,является просто вопросом техники. Поскольку идентификацию конкурентно связывающих молекул определяют в сравнении со ссылочной молекулой, т.е. связывающей молекулой согласно изобретению,должно быть понятно, что фактически определение эпитопа, с которым связываются ссылочная молекула и конкурентно связывающая молекула, никоим образом не требуется для идентификации конкурентно связывающей молекулы, которая связывается с тем же самым или, по существу, тем же самым эпитопом,что и ссылочная связывающая молекула. Примеры Для иллюстрации согласно изобретению обеспечены следующие примеры. Эти примеры не предназначены для ограничения каким-либо образом объема согласно изобретению. Пример 1. Конструирование библиотек scFv фагового дисплея с использованием РНК, экстрагированной из доноров, подвергнутых скринингу на опсонизирующую активность. Пробы крови брали из доноров, сообщающих о недавней грамположительной бактериальной инфекции, а также здоровых взрослых в возрасте 25-50 лет. Лейкоциты периферической крови выделяли центрифугированием и сыворотку крови сохраняли и замораживали при -80 С. Сыворотку доноров подвергали скринингу на киллерную активность с использованием анализа опсонофагоцитарного убивания(Huebner et al. 1999) и сравнивали с нормальной сывороткой кроликов. Сыворотки из доноров, имеющих фагоцитарную активность, большую, чем в нормальной сыворотке, выбирали для применения в генери- 22016717 ровании библиотек фагового дисплея. Тотальную РНК получали из лейкоцитов периферической крови этих доноров с использованием отделения органической фазы и последующего осаждения этанолом. Полученную РНК растворяли в не содержащей РНКаз воде и определяли концентрацию измерением OD 260 нм. После этого эту РНК разбавляли до концентрации 100 нг/мл. Затем 1 мкг РНК превращали в кДНК следующим образом: к 10 мкл тотальной РНК добавляли 13 мкл DEPC-обработанной ультрачистой воды и 1 мкл случайных гексамеров (500 нг/мкл) и полученную смесь нагревали при 65 С в течение 5 мин и быстро охлаждали на увлажненном льду. Затем к этой смеси добавляли 8 мкл 5 Х буфера первой цепи, 2 мкл dNTP (10 мМ каждый), 2 мкл ДТТ (0,1 М), 2 мкл ингибитора РНКаз (40 Е/мкл) и 2 мкл обратной транскриптазы SuperscriptIII MMLV (200 Е/мкл), инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и инкубировали в течение 1 ч при 50 С. Реакцию останавливали инактивацией нагреванием, т.е. инкубированием этой смеси в течение 15 мин при 75 С. Полученные кДНК-продукты разбавляли до конечного объема 200 мкл DEPC-обработанной ультрачистой водой. Для определения концентрации кДНК использовали OD 260 нм разбавленного в 50 раз раствора (в 10 мМ трис-буфере) разведения полученных кДНК-продуктов. Для каждого донора 5-10 мкл разведенных кДНК-продуктов использовали для ПЦР-амплификации последовательностей семейства тяжелых цепей и легких цепей каппа или лямбда иммуноглобулина гамма с использованием специфических олигонуклеотидный праймеров (см. табл. 17). Кроме того, для одного донора проводили ПЦР-амплификацию последовательностей семейства тяжелых цепей мю и легкой цепи каппа или лямбда. Реакционные смеси ПЦР содержали, наряду с разбавленными кДНК-продуктами, 25 пмоль смысловой праймер и 25 пмоль антисмысловой праймер в конечном объеме 50 мкл 20 мМ Трис-HCl (рН 8,4), 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 250 мкМ dNTP и 1,25 единиц полимеразы Taq. В термоциклере с нагретой крышкой, имеющем температуру 96 С, полученные смеси быстро расплавляли в течение 2 мин с последующими 30 циклами: 30 с при 96 С, 30 с при 55 или 60 С и 60 с при 72 С. Наконец, эти пробы инкубировали 10 мин при 72 С и помещали в холодильник при 4 С до последующего использования. В первом раунде амплификации каждый из восемнадцати смысловых праймеров вариабельной области легкой цепи (двенадцать для легкой цепи лямбда (см. табл. 1; смысловые праймеры HuVL1A-Back,HuVL1IB-Back и HuVL1C-Back смешивали до эквимолярности перед использованием, так же, как и смысловые праймеры HuVL9-Back и HuVL10-Back) и шести для легкой цепи каппа (см. табл. 2 объединяли с антисмысловым праймером, узнающим константную область С-каппа, названным HuCK-FOR 5'ACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT-3' (см. SEQ ID NO: 121) или константной областью С-лямбдаHuCL7-FOR смешивали до эквимолярности перед использованием), с получением 15 продуктов приблизительно 650 п.н. Эти продукты очищали на агарозном геле и выделяли из геля с использованием колонок для экстракции гелей Qiagen. 1/10 каждого из этих выделенных продуктов использовали в идентичной ПЦР-реакции, описанной выше, с использованием восемнадцати смысловых праймеров, посредством которой каждый смысловой праймер легкой цепи лямбда комбинировали с одним из трех J-лямбдаобласть-специфических антисмысловых праймеров и каждый смысловой праймер легкой цепи каппа комбинировали с одним из пяти J-каппа-область-специфических антисмысловых праймеров (см. табл. 3; смысловые праймеры HuVL1A-Back-SAL, HuVL1B-Back-SAL и HuVL1C-Back-SAL смешивали до эквимолярности перед использованием, так же, как и смысловые праймеры HuVL9-Back-SAL и HuVL10Back-SAL). Смысловые праймеры, используемые во второй амплификации, были такими же праймерами,которые использовали в первой амплификации, но были удлинены сайтами рестрикции (см. табл. 3) для возможности направленного клонирования в вектор фагового дисплея PDV-C06 (см. SEQ ID NO: 124). Это приводило к 57 продуктам приблизительно 400 п.н., которые объединяли, как показано в табл. 4, для сохранения природного распределения разных J-сегментов и семейств легких цепей в этой библиотеке,но не представления завышено или занижено определенных семейств. Эти объединенные продукты очищали с использованием колонок для ПЦР-очистки Qiagen. В следующей стадии 3 мкг объединенных продуктов и 100 мкг вектора PDV- С 06 расщепляли SalI и NotI и очищали из геля. После этого выполняли лигирование в течение ночи при 16 С следующим образом. К 500 нг вектора PDV-C06 добавляли 35,70 или 140 нг объединенных продуктов в общем объеме 50 мкл смеси для лигирования, содержащей 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ, 25 мкг/мл БСА и 2,5 мкл ДНК-лигазы Т 4(400 Е/мкл). Эти смеси для лигирования очищали экстракцией смесью фенол/хлороформ с последующей экстракцией хлороформом и осаждением этанолом, способами, хорошо известными специалисту в данной области. Полученную ДНК растворяли в 50 мкл 10 мМ Трис-HCl рН 8,5 и 1 или 2 мкл каждой смеси,для лигирования электропорировали в 40 мкл TG1-компетентных бактерий Е. coli в соответствии с протоколом изготовителя (Stratagene). Трансформанты выращивали в течение ночи при 37 С на 2TY-агаре,дополненном 50 мкг/мл ампициллина и 4,5% глюкозой. Колонии считали для определения оптимального отношения вектора к инсерту. Из смеси для лигирования с оптимальным соотношением множественные аликвоты 1 или 2 мкл электропорировали, как описано выше, и трансформанты росли в течение ночи при 37 С, давая обычно 107 колоний. (Суб)библиотеку вариабельных областей легкой цепи получали выскабливанием трансформантов из чашек с агаром. Эту (суб)библиотеку использовали непосредственно- 23016717 для получения ДНК плазмиды с использованием набора Qiagen QIAFilter MAXI prep. Последовательности тяжелых цепей иммуноглобулина амплифицировали из тех же самых кДНКпрепаратов в сходной процедуре ПЦР с двумя раундами и идентичными параметрами реакции, как описано выше для областей легкой цепи, при условии, что использовали праймеры, представленные в табл. 5 и 6. Первую амплификацию выполняли с использованием серии из восьми смысловых праймеров (см. табл. 5; смысловые праймеры HuVH1B/7A-Back и HuVH1C-Back смешивали до эквимолярности перед использованием), каждый, в комбинации с IgG-специфическим антисмысловым праймером константной области, названным HuCIgG 5'-GTC САС СТТ GGT GTT GCT GGG СТТ-3' (SEQ ID NO: 125) с получением семи продуктов приблизительно 650 п.н. Для одного донора использовали IgM-специфический антисмысловой праймер константной области, названный HuCIgM 5'-TGG AAG AGG CAC GTT СТТ TTC ТТТ-3' (SEQ ID NO: 126) вместо праймера HuCIgG. Эти продукты очищали на агарозном геле и выделяли из геля с использованием колонок для экстракции гелей Qiagen. 1/10 каждого из этих выделенных продуктов использовали в идентичной ПЦР-реакции, описанной выше, с использованием восьми смысловых праймеров, посредством которой каждый смысловой праймер тяжелой цепи комбинировали с одним из четырех JH-цепь-специфических антисмысловых праймеров (см. табл. 6; смысловые праймерыHuVH1B/7A-Back-Sfi и HuVH1C-Back-Sfi смешивали до эквимолярности перед использованием). Смысловые праймеры, используемые в этом втором раунде, были теми же самыми праймерами, которые использовали в первой амплификации, но удлиненными сайтами рестрикции (см. табл. 6) для возможности направленного клонирования в векторе (суб)библиотеки легкой цепи. Это приводило к 28 продуктам приблизительно 400 п.н., которые объединяли, как показано в табл. 7, для сохранения природного распределения разных J-сегментов и семейств тяжелых цепей в этой библиотеке, но не представления завышено или занижено определенных семейств. Эти объединенные продукты очищали с использованием колонок для ПЦР-очистки Qiagen. Затем 3 мкг очищенных продуктов расщепляли SfiI и XhoI и лигировали в вектор (суб)библиотеки легких цепей, который был разрезан теми же самыми рестрикционными ферментами, с использованием процедуры лигирования и объемов, описанных выше для(суб)библиотеки легких цепей. Очистку смеси для лигирования и последующую трансформацию полученной окончательной библиотеки выполняли, как описано выше для (суб)библиотеки легких цепей. Все бактерии, обычно 107, собирали в культуральной среде 2TY, содержащей 50 мкг/мл ампициллин и 4,5% глюкозу, смешивали с глицерином до 15% (об./об.) и замораживали в виде аликвот 1,5 мл при -80 С. Спасение и отбор каждой библиотеки выполняли, как описано ниже. Различные библиотеки были названы GPB-05-M01, GPB-05-G01, GPB-05-G02, GPB-05-G03, GPB-05-G04 и GPB-05-G05. Две другие библиотеки, RAB-03-G01 и RAB-04-G01, конструировали с использованием способа, сходного с вышеописанной процедурой, как описано ранее в международной заявке на патент WO 2005/118644. Пример 2. Конструирование библиотек scFv фагового дисплея с использованием РНК, экстрагированной из В-клеток памяти. Периферическую кровь собирали из нормальных здоровых доноров, выздоровевших доноров или вакцинированных доноров венопункцией с использованием обработанных ЭДТА антикоагуляционных пробирок для крови. Пробу крови (45 мл) разбавляли в 2 раза ЗФР и аликвоты 30 мл наносили на 10 млFicoll-Hypaque (Pharmacia) и центрифугировали при 900g in vivo 20 мин при комнатной температуре без прерываний. Супернатант осторожно удаляли до положения выше белого слоя, содержащего фракцию лимфоцитов и тромбоцитов. Затем этот слой осторожно удаляли (10 мл), переносили в свежую пробирку на 50 мл, промывали три раза 40 мл ЗФР и откручивали при 400g в течение 10 мин при комнатной температуре для удаления тромбоцитов. Полученный осадок, содержащий лимфоциты, ресуспендировали в среде RPMI, содержащей 2% ФТС, и количество клеток определяли подсчетом клеток. Приблизительно 1103 лимфоцитов окрашивались для сортинга флуоресцентных клеток с использованием CD24,CD27 и поверхностного IgM в качестве маркеров для выделения В-клеток переключенной памяти и памяти IgM. Устройство Becton Dickinson Digital Vantage, установленное в режиме Yield Mode, использовали для физического сортинга и выделения В-клеток памяти. Лимфоциты дискриминировали в виде малой компактной популяции из окна FSC/SSC. Затем В-клетки (CD24+/CD27+) отделяли от необученных В-клеток (CD24+/CD27-) и Т-клеток памяти (CD24-/CD27+). В следующей стадии В-клетки памятиIgM (IgM+) отделяли от В-клеток переключенной памяти (IgM-) с использованием экспрессии IgM. В этой стадии В-клетки памяти IgM и В-клетки переключенной памяти подвергали сортингу в отдельных пробирках для проб. 1105-1106 клеток каждой популяции собирали в DMEM/50% ФТС и после завершения сортинга клетки каждой популяции центрифугировали при 400g в течение 10 мин. Затем отсортированные В-клетки использовали в качестве исходного материала для конструирования библиотек согласно способу, описанному в примере 1, с использованием праймера HuCIgM в первом раунде амплификации последовательностей тяжелой цепи иммуноглобулина. Разные библиотеки были названы МЕМ 05-M01, МЕМ-05-М 02, МЕМ-05-М 03, МЕМ-05-М 04, МЕМ-05-М 05, МЕМ-05-М 06, МЕМ-05-М 07, МЕМ 05-М 08, МЕМ-05- М 09 и МЕМ-05-М 10.- 24016717 Пример 3. Отбор фагов, несущих одноцепочечные Fv-фрагменты, специфически связывающиеся с энтерококками. Фрагменты антител отбирали с использованием библиотек фагового дисплея антител, общей технологии фагового дисплея и технологии MAbstract, в основном описанной в патенте США 6265150 и вWO 98/15833 (оба из которых включены здесь в качестве ссылки). Эти используемые фаговые библиотеки антител получены, как описано в примере 1, и библиотеки памяти IgM получены, как описано в примере 2. В данном изобретении использовали способы и хелперные фаги, описанные в WO 02/103012(включенном здесь в качестве ссылки). Для идентификации фаговых антител, узнающих энтерококки,выполняли эксперименты отбора фагов с использованием живых бактерий в суспензии или бактерий,иммобилизованных в иммунопробирках. Используемые штаммы описаны в табл. 8. Все фаговые антитела выделяли из отобранных фагов, причем по меньшей мере в одной стадии в суспензии был использован Е. faecalis 12030. Фаговые антитела, названные SC05-159 и SC05-166, были первоначально выделены из отобранных фагов с использованием иммобилизованного Е. faecalis 12030, но позднее они были выделены также с использованием Е. faecalis 12030 в суспензии. Отборы с использованием бактерий в суспензии выполняли следующим образом. Бактерии выращивали в течение ночи при 37 С на чашках с кровяным агаром и соскабливали в ЗФР, содержащем 2% БСА или 2% ELK, при концентрации 5109 бактерий/мл и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Аликвоту фаговой библиотеки (приблизительно 1013 КОЕ, амплифицированной с использованием хелперного фага СТ (см. WO 02/103012, блокировали в блокирующем буфере (2% ELK или 2% БСА в ЗФР) в течение 0,5-2 ч при комнатной температуре. Эту блокированную фаговую библиотеку добавляли к блокированной бактериальной суспензии с получением общего объема 1 мл и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре в роторе с переворачиванием пробирок с донышка на крышку (5 об/мин). Эту суспензию центрифугировали при 6800g в течение 3 мин при комнатной температуре и супернатант выбрасывали. Бактерии промывали три-восемь раз блокирующим буфером, содержащим 0,05% (об./об.) Твин-20, затем три-восемь раз блокирующим буфером для удаления несвязанных фагов. Связанные фаги элюировали из антигена инкубацией с 1 мл 0,1 М триэтиламина в течение 7 мин при комнатной температуре в роторе с переворачиванием пробирок с донышка на крышку (5 об/мин). Эту суспензию центрифугировали в течение 3 мин при 1700g и затем супернатант смешивали с 0,5 мл 1 М Трис-HCl рН 7,5 для нейтрализации рН. Эту смесь использовали для инфицирования 5 мл культурыXL1-Blue E.coli, которую выращивали при 37 С до OD 600 нм приблизительно 0,3. Фагам давали расти для инфицирования бактерий XL1-Blue в течение 30 мин при 37 С. Затем эту смесь центрифугировали в течение 10 мин при 3200g при комнатной температуре и бактериальный осадок ресуспендировали в 0,5 мл среды 2-триптондрожжевой экстракт (2TY). Полученную бактериальную суспензию делили на две чашки с 2TY-агаром, дополненным тетрациклином, ампициллином и глюкозой. После инкубации в течение ночи этих чашек при 37 С колонии выскабливали из чашек и использовали для получения обогащенной фаговой библиотеки в основном, как описано De Kruif et al. (1995a) и WO 02/103012. Вкратце,соскобленные бактерии использовали для инокуляции среды 2TY, содержащей ампициллин, тетрациклин и глюкозу, и выращивали при температуре 37 С до OD 600 нм 0,3. Добавляли хелперные фаги СТ и давали им инфицировать бактерии, после чего эту среду заменяли на среду 2TY, содержащую ампициллин, тетрациклин и канамицин. Инкубацию продолжали в течение ночи при 30 С. На следующий день бактерии удаляли из среды 2TY центрифугированием, после чего эти фаги в среде осаждали с использованием полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000/NaCl. Наконец, фаги растворяли в 2 мл ЗФР с 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА), стерильно фильтровали и использовали для следующего раунда отбора. Отборы с использованием бактерий, иммобилизованных в иммунопробирках, выполняли следующим образом. Бактерии выращивали в течение ночи при 37 С на чашках с кровяным агаром и соскабливали в карбонатный буфер при концентрации 5109 бактерий/мл. 2 мл добавляли в MaxiSorp NuncImmuno Tube (Nunc) и инкубировали в течение ночи при 4 С в роторе с переворачиванием с донышка на крышку (5 об/мин). Пробирку опустошали и промывали три раза ЗФР. Как пробирку, так и аликвоту фаговой библиотеки (приблизительно 1013 КОЕ, амплифицированной с использованием хелперного фага СТ (см. WO 02/103012 блокировали в блокирующем буфере (2% ELK, 2% БСА или 1% Protifar в ЗФР) в течение 0,5-2 ч при комнатной температуре. Пробирку опустошали, добавляли блокированную фаговую библиотеку и эту пробирку инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре в роторе с переворачиванием пробирок с донышка на крышку (5 об/мин). Эту пробирку промывали пять-пятнадцать раз ЗФР, содержащим 0,1% (об./об.) Твин-20, затем пять-пятнадцать раз ЗФР для удаления несвязанных фагов. Связанные фаги элюировали из антигена инкубированием с 1,5 мл 0,1 М триэтиламина или 50 мМ глицина-HCl, рН 2,2 в течение 10 мин при комнатной температуре в роторе с переворачиванием пробирки с донышка на крышку (5 об/мин). Элюированные фаги смешивали с 0,5 мл 1 М Трис-HCl рН 7,5 для нейтрализации рН. Последующее инфицирование бактерий XL1-Blue E.coli, выращивание инфицированных бактерий и получение обогащенной фаговой библиотеки выполняли, как описано выше для отборов с использованием бактерий в суспензии. Обычно выполняли два раунда отборов перед выделением индивидуальных фаговых антител. От- 25016717 бор мог проводиться дважды на одном и том же штамме бактерий или разные штаммы могли использоваться последовательно. После второго раунда отбора отдельные колонии Е. coli использовали для получения моноклональных фаговых антител. В основном, отдельные колонии выращивали до log-фазы и инфицировали хелперными фагами СТ или VCSM13, после чего образованию фаговых антител давали протекать в течение ночи. Полученные фаговые антитела осаждали PEG/NaCl и стерильно фильтровали и тестировали в ELISA на связывание с Enterococcus, приготовленным, как описано supra. Пример 4. Валидизация энтерококковых специфических одноцепочечных фаговых антител. Отобранные одноцепочечные фаговые антитела, которые получали в скринингах, описанных выше,валидизировали в ELISA на специфическую энтерококковую связывающую активность, т.е. связывание с одним или несколькими энтерококковыми штаммами, полученными, как описано supra. 2,5108 бактерий наносили в течение ночи при 4 С на планшеты Maxisorp ELISA в 50 мкл 50 мМ карбонатного буфера,рН 9,6. В качестве отрицательных контролей наносили комплексные антигены 2% ELK и 1% БСА, оба в ЗФР (рН 7,4). Лунки промывали в ЗФР, содержащем 0,1% (об./об.) Твин-20, и блокировали 300 мкл ЗФР,содержащего 2% ELK, для получения блокированных фаговых антител. Планшеты опустошали и в лунки добавляли блокированные одноцепочечные фаговые антитела. Инкубации давали протекать в течение 1 ч при комнатной температуре, планшеты промывали в ЗФР, содержащем 0,1% (об./об.) Твин-20 и связанные фаговые антитела детектировали с использованием анти-М 13-антитела, конъюгированного с пероксидазой. Поглощение при 492 нм измеряли с использованием спектрофотометра. В качестве контроля эту процедуру выполняли одновременно без одноцепочечного фагового антитела и с отрицательным контрольным одноцепочечным фаговым антителом, направленным против белка оболочки вируса лихорадки Западного Нила (SC04-374). Как показано в табл. 9, выбранные фаговые антитела, названные SC05140, SC05-157, SC05-159, SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-016, SC06-043, SC06-049, SC06-050,SC06-071, SC06-077, SC06-078, SC06-079, SC06-086, SC06-087, SC06-089, SC06-092, SC06-191, SC06-195,SC06-198, SC06-241, SC06-242, SC06-246, SC06-252, SC06-388, SC06-389, SC06-396, SC06-402, SC06-409,SC06-415, SC06-421, SC06-429 и SC06-432, специфически связывались со штаммом Enterococcus faecalis 12030. За исключением SC05-140 и SC06-421, ни одно из выбранных фаговых антител не проявляло какого-либо детектируемого связывания с антигенами отрицательного контроля ELK и БСА. Пример 5. Характеристика энтерококковых специфических scFv. Из выбранных клонов специфического одноцепочечного фагового антитела (scFv) получали плазмидную ДНК и определяли нуклеотидные последовательности в соответствии со стандартными способами. Нуклеотидные последовательности scFv (в том числе сайты для клонирования), названных SC05140, SC05-157, SC05-159, SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-016, SC06-043, SC06-049, SC05-050,SC06-071, SC06-077, SC06-078, SC06-079, SC06-086, SC06-087, SC06-089, SC06-092, SC06-191, SC06-195,SC06-198, SC06-241, SC06-242, SC06-246, SC06-252, SC06-388, SC06-389, SC06-396, SC06-402, SC06-409,SC06-415, SC06-421, SC06-429 и SC06-432, показаны в SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 61,SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ IDNO: 356, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 380,SEQ ID NO: 382, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 390 и SEQ ID NO: 392 соответственно. Аминокислотные последовательности этих scFv, названных SC05-140, SC05-157, SC05159, SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-016, SC06-043, SC06-049, SC05-050, SC06-071, SC06-077,SC06-078, SC06-079, SC06-086, SC06-087, SC06-089, SC06-092, SC06-191, SC06-195, SC06-198, SC06-241,SC06-242, SC06-246, SC06-252, SC06-388, SC06-389, SC06-396, SC06-402, SC06-409, SC06-415, SC06-421,SC06-429 и SC06-432, показаны в SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQCDR-последовательности этих scFvs, специфически связывающих энтерококки, изображены в табл. 10 и 11 соответственно. Пример 6. Конструирование полных человеческих молекул иммуноглобулина (моноклональных антиэнтерококковых антител человека) из отобранных антиэнтерококковых одноцепочечных scFv. Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи scFv, названных SC05-140, SC05-157, SC05-159,SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-016, SC06-043, SC06-049, SC05-050, SC06-071, SC06-077, SC06-078,SC06-079, SC06-086, SC06-087, SC06-089, SC06-092, SC06-191, SC06-195, SC06-198, SC06-241, SC06-242,SC06-246, SC06-252, SC06-388, SC06-389, SC06-396, SC06-402, SC06-409, SC06-415, SC06-421, SC06-429 и SC06-432, клонировали непосредственно с использованием рестрикционного продукта расщепления(см. SEQ ID NO: 128) и pIg-C910-Clambda (см. SEQ ID NO: 129). Вариабельные области тяжелой цепиscFv, названных SC05-140, SC05-157, SC05-159, SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-016, SC06-043,SC06-049, SC05-050, SC06-071, SC06-077, SC06-078, SC06-079, SC06-086, SC06-087, SC06-089, SC06-092,SC06-191, SC06-195, SC06-198, SC06-241, SC06-242, SC06-246, SC06-252, SC06-388, SC06-389, SC06-396,SC06-402, SC06-409, SC06-415, SC06-421, SC06-429 и SC06-432, клонировали в вектор pIg-C911Hcgamma1 с использованием рестрикционного продукта расщепления ферментами SfiI и XhoI. Вариабельную область легкой цепи scFv, названных SC06-016, SC06-050, SC06-077, SC06-086, SC06-191,SC06-241, SC06-396 и SC06-429, клонировали в вектор pIg-C909-Ckappa с использованием рестрикционного продукта расщепления ферментами SalI, XhoI и NotI. Вариабельную область легкой цепи scFv, названных SC05-140, SC05-157, SC05-159, SC05-166, SC05-179, SC05-187, SC06-043, SC06-049, SC06-071,SC06-078, SC06-079, SC06-087, SC06-089, SC06-092, SC06-195, SC06-198, SC06-242, SC06-246, SC06-252,SC06-388, SC06-389, SC06-402, SC06-409, SC06-415, SC06-421 и SC06-432, клонировали в вектор pIgC910-Clambda с использованием рестрикционного продукта расщепления ферментами SalI, XhoI и NotI. После этого нуклеотидные последовательности подтверждали в соответствии со стандартными способами, известными специалисту в данной области. Полученные экспрессирующие pgG105-140C911, pgG105-157C911, pgG105-159C911, pgG105166C911, pgG105-179C911, pgG105-187C911, pgG106-016C911, pgG106-043C911, pgG106-049C911,pgG106-050C911, pgG106-071C911, pgG106-077C911, pgG106-078C911, pgG106-079C911, pgG106086C911, pgG106-087C911, pgG106-089C911, pgG106-092C911, pgG106-191C911, pgG106-195C911,pgG106-198C911, pgG106-0241C911, pgG106-242C911, pgG106-246C911, pgG106-252C911, pgG106388C911, pgG106-389C911, pgG106-396C911, pgG106-402C911, pgG106-409C911, pgG106-415C911,pgG106-421C911, pgG106-429C911 и pgG106-432C911, кодирующие тяжелые цепи антиэнтерококковогоIgG1 человека, и pgG105-140C910, pgG105-157 С 910, pgG105-159C910, pgG105-166C910, pgG105179C910, pgG105-187C910, pgG106-016C909, pgG106-043C910, pgG106-049C910, pgG106-050C909,pgG106-071C910, pgG106-077C909, pgG106-078C910, pgG106-079C910, pgG106-086C909, pgG106087C910, pgG106-089C910, pgG106-092C910, pgG106-191C909, pgG106-195C910, pgG106-198C910,pgG106-0241C909, pgG106-242C910, pgG106-246C910, pgG106-252C910, pgG106-388C910, pgG106389C910, pgG106-396C909, pgG106-402C910, pgG106-409C910, pgG106-415C910, pgG106-421C910,pgG106-429C909 и pgG106-432C910, кодирующие легкие цепи антиэнтерококкового Ig человека, транзиторно экспрессировали в комбинации в клетках 293 Т и получали супернатанты, содержащие IgG1 антитела человека. Нуклеотидные последовательности тяжелых цепей антител, названных CR5140,CR5157, CR5159, CR5166, CR5179, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049, CR6050, CR6071, CR6077,CR6078, CR6079, CR6086, CR6087, CR6089, CR6092, CR6191, CR6195, CR6198, CR6241, CR6242,CR6246, CR6252, CR6388, CR6389, CR6396, CR6402, CR6409, CR6415, CR6421, CR6429 и CR6432, показаны в SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 402,SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 210, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 408,SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 418,SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 428,SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 434 и SEQ ID NO: 436 соответственно. Аминокислотные последовательности тяжелых цепей антител, названных CR5140, CR5157, CR5159, CR5166, CR5179,CR5187, CR6016, CR6043, CR6049, CR6050, CR6071, CR6077, CR6078, CR6079, CR6086, CR6087,CR6089, CR6092, CR6191, CR6195, CR6198, CR6241, CR6242, CR6246, CR6252, CR6388, CR6389,CR6396, CR6402, CR6409, CR6415, CR6421, CR6429 и CR6432, показаны в SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 397, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 399, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90,SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 401, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 405, SEQNO: 435 и SEQ ID NO: 437 соответственно. Нуклеотидные последовательности легкой цепи антител CR5140, CR5157, CR5159, CR5166,CR5179, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049, CR6050, CR6071, CR6077, CR6078, CR6079, CR6086,CR6087, CR6089, CR6092, CR6191, CR6195, CR6198, CR6241, CR6242, CR6246, CR6252, CR6388,CR6389, CR6396, CR6402, CR6409, CR6415, CR6421, CR6429 и CR6432 показаны в SEQ ID NO: 438, SEQID NO: 476, SEQ ID NO: 478 и SEQ ID NO: 480 соответственно. Аминокислотные последовательности легкой цепи антител CR5140, CR5157, CR5159, CR5166, CR5179, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049,- 27016717CR6050, CR6071, CR6077, CR6078, CR6079, CR6086, CR6087, CR6089, CR6092, CR6191, CR6195,CR6198, CR6241, CR6242, CR6246, CR6252, CR6388, CR6389, CR6396, CR6402, CR6409, CR6415,CR6421, CR6429 и CR6432 показаны в SEQ ID NO: 439, SEQ ID NO: 441, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 443, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 445, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 447, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 449, SEQ ID NO: 451, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 453, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 457, SEQ ID NO: 459, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 461, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 479 и SEQ ID NO: 481 соответственно. Специалист в данной области сможет определить вариабельные области тяжелой и легкой цепей вышеописанных антител по Kabat et al. (1991), как описано Sequences of Proteins of Immunological Interest. Вариабельные области этих антител представлены в табл. 12. Эти антиэнтерококковые IgG1-антитела человека проверяли на их способность связываться с энтерококками при помощи ELISA, по существу, как описано для scFv выше; IgG1 анализировали при концентрации 5 г/мл, за исключением следующих IgG1: CR6191 анализировали при 1,6 г/мл, CR6195 при 3,1 г/мл, CR6198 при 4,1 г/мл, CR6241 при 2,1 г/мл, CR6246 при 2,6 г/мл и CR6252 при 3,0 г/мл. Отрицательным контролем было антитело против вируса лихорадки Западного Нила (CR4374). Кроме того, антиэнтерококковые IgG1-антитела человека испытывали на их способность связываться с разными клиническими изолятами Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium (см. табл. 13). Считалось, что антитело связывается с изолятом, когда эта величина в отдельном эксперименте была по меньшей мере в три раза большей в сравнении с величиной отрицательного контроля в этом отдельном эксперименте. Величина отрицательного контроля в табл. 13 является средней величиной из 6 экспериментов. Все антитела, за исключением CR5157, CR5179, CR6016, CR6043, CR6050, CR6246, CR6388, CR6409 и антитела отрицательного контроля, специфически связывались со штаммом Enterococcus faecalis 12030, и все IgG1, за исключением CR5157, CR6016, CR6043, CR6050, CR6241, CR6242, CR6246, CR6388 и CR6409, связывались более чем с одним клиническим изолятом. Антитела CR5187, CR6049, CR6396, CR6402 и CR6421 связывались со всеми испытанными штаммами Enterococcus faecalis и с двумя испытанными штаммамиEnterococcus faecium. Альтернативно, получали партии больше чем 1 мг каждого антитела и очищали их при помощи стандартных процедур. Пример 7. In vitro опсонизирующая фагоцитарная активность энтерококковых специфических IgG,измеренная при помощи анализа опсонофагоцитарного убивания. Опсонофагоцитарный анализ проводили для количественного определения киллерной активности антиэнтерококкового IgG1 человека в отношении энтерококкового клинического изолята 12030. Свежевзятую кровь человека (10-30 мл) смешивали с равным объемом декстрангепаринового буфера (4,5 г декстрана, Sigma Chemical, St. Louis; 28,4 мг натрийгепарина в 500 мл дистиллированной воды) и эту смесь инкубировали при 37 С в течение 1 ч. Верхний слой, содержащий лейкоциты, собирали центрифугированием и выполняли гипотонический лизис оставшихся эритроцитов суспендированием осадка клеток в 1% (мас./об.) NH4Cl. Затем популяцию лейкоцитов промывали в RPMI с 15% фетальной телячьей сывороткой. Для определения концентрации живых лейкоцитов использовали окрашивание трипановым синим и счет в гемоцитометре и конечную концентрацию лейкоцитов доводили до 2107 клеток/мл. Анализ фагоцитоза выполняли в двух повторностях с добавлением или без добавления 100 мкл суспензии лейкоцитов к 100 мкл бактерий (концентрацию доводили спектрофотометрически до 2107 на 1 мл и подтверждали подсчетом жизнеспособных бактерий), 100 мкл антиэнтерококковых IgG1 человека, разведенных в RPMI, и 100 мкл комплемента детеныша кролика. Эту реакционную смесь инкубировали на роторном штативе при 37 С в течение 90 мин; брали пробы в точке 0 и после 90 мин, разбавляли в 1%Proteose Peptone (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) и высевали на чашки с триптическим соевым агаром. Киллерную активность (%) антител рассчитывали вычитанием среднего количества КОЕ, выживающих в пробе, содержащей лейкоциты, из среднего количества КОЕ, выживающих в пробе без лейкоцитов, деления на последнюю величину и умножения на 100. Четыре концентрации антиэнтерококкового IgG1 человека (2500, 250, 25, 2,5 нг/мл) испытывали в двух независимых экспериментах. Обычный регрессионный анализ, использующий пробит-модель, использовали для расчета концентраций, необходимых для 50% убивания бактерий, в этом анализе (см. табл. 14). Пример 8. In vivo активность энтерококковых специфических IgG в мышиной модели сепсиса. Мышиную модель сепсиса Enterococcus (see Hufnagel et al. 2004) использовали для количественного определения активности антиэнтерококкового IgG1 человека в клиренсе энтерококкового клинического изолята 12030 из кровотока. Очищенные IgG1-молекулы CR5159, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049,CR6071, CR6089 и CR6241, имеющие, как было продемонстрировано, in vitro киллерную активность в отношении Enterococcus, и один IgG1 отрицательного контроля, не имеющий киллерной активности в отношении Enterococcus, готовили, как описано выше, и инъецировали i.p. (0,5-1 мл в ЗФР) в группы из восьми мышей BALB/c в дозе 15 мг/кг, за исключением CR6016 и CR6241, которые инъецировали в дозе 7,5 мг/кг. Кроме того, одну группу мышей инъецировали ЗФР. Спустя 24 ч животных инокулировали i.v. 6108 КОЕ штамма Enterococcus 12030. Спустя 4 ч после заражения мыши получали вторую i.p. инъек- 28016717 цию CR5159, CR5187, CR6016, CR6043, CR6049, CR6071, CR6089 и CR6241 в той же самой дозе. Спустя три дня после системного инфицирования животных эвтанизировали и собирали 0,5 мл крови сердечной пункцией. Пробы крови культивировали количественно на элективной для энтерококков агаровой среде; 100 мкл крови, разбавленной в 900 мкл ТНВ, распределяли на чашки в двух повторностях. После ночного инкубирования количество КОЕ считывали на чашке и умножали на 10 с получением КОЕ/мл крови. Это величина непосредственно относится к количеству циркулирующих бактерий в момент умерщвления. Начальной точкой в этой модели является КОЕ Enterococcus в крови спустя 3 дня после инокуляции. Как показано на чертеже, все животные, получавшие ЗФР или контрольный IgG1, имели 102 КОЕ/мл Enterococcus в их крови после 3 дней и медиана была равна 103 КОЕ/мл. В противоположность этому, все группы, которые получали антиэнтерококковые антитела, содержали животных с 10 КОЕ/млEnterococcus в крови. Кроме того, во всех, кроме одного случая, CR5187, медиана была на один log ниже медианы контролей. Одно антитело, CR6089, имело медиану ниже уровня чувствительности в этом анализе (10 КОЕ/мл) и в 6 из 8 животных не было детектируемых бактерий в крови. CR6016 и CR6241, которые использовали в более низкой дозе, все еще имели медианы, близкие к 10 КОЕ/мл крови, свидетельствуя о том, что они имеют высокую активность. Непараметрический дисперсионный анализ (Крускала-Уоллиса) показал, что эти различия были высоко значимыми (р 0,001). Парные сравнения между испытуемым IgG1 и IgG1 отрицательного контроля выполняли с использованием критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони. Антитела CR5159, CR5187, CR6043, CR6049, CR6089 и CR6241 были, все, значимо отличающимися (р 0,05) от контрольного антитела, в то время как различие медиан антителCR6043 и CR6071 не достигало значимости в сравнении с контрольным антителом. Пример 9. Конкурентный анализ IgG1. Для установления, конкурируют ли антитела в этой панели за связывание с той же самой мишенью,был разработан конкурентный ELISA. Энтерококковый штамм 12030 распределяли на поверхности чашки с кровяным агаром и инкубировали в течение ночи при 37 С. Колонии соскабливали из этой чашки с использованием 5 мл 50 мМ карбонатного буфера (8 об. 0,2 М Na2CO3, 17 об. 0,2 М NaHCO3 и 75 об. дистиллированной воды) и центрифугировали в течение 3 мин при 4000 об/мин. Полученный осадок ресуспендировали в 500 мкл карбонатного буфера, опять центрифугировали и осадок ресуспендировали в 500 мкл карбонатного буфера. Плотность клеток определяли измерением OD600 серии разведений этих бактерий. Этот штамм энтерококка разбавляли до плотности 5109 клеток/мл и 100 мкл (5108 клеток) на лунку наносили в течение ночи при 4 С на планшеты Nunc-Immuno Maxisorp F96. После инкубации эти клетки промывали три раза ЗФР и блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре 300 мкл 2%(об./об.) ELK в ЗФР на лунку. В отдельных пробирках 25 мкл каждого из максипрепаратов scFv (полученных, как описано выше), разведенных до субнасыщающих уровней (как определено посредствомELISA выше), смешивали с 25 мкл блокирующего буфера (4% (об./об.) ELK в ЗФР и 50 мкл IgG1 супернатанта, разбавленного до 10 мкг/мл в ЗФР. Эту смесь инкубировали в течение 20 мин на льду. После удаления блокирующего раствора из лунок в каждую лунку добавляли 100 мкл этой смеси и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем эти лунки промывали три раза смесью ЗФР/0,01% (об./об.) Твин и один раз ЗФР. После промывания добавляли 100 мкл анти-М 13-HRP (1:5000 в 2% (об./об.) ELK в ЗФР) на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин. Лунки опять промывали и окрашивание визуализировали добавлением 100 мкл OPD-раствора в каждую лунку. Реакцию визуализации останавливали после 5-10 мин добавлением 50 мкл 1 М H2SO4 в каждую лунку иOD измеряли при 492 нм. Этот эксперимент повторяли дважды со всей панелью антител и контрольнымIgG1 CR4374. Результаты показали, что эти антитела могут быть разделены на несколько отличающихся групп. Группа А состояла из CR6089 и CR6092; группа В состояла из CR5157, CR5187, CR6043, CR6049,CR6388, CR6389, CR6396, CR6402, CR6409, CR6421 и CR6429 и группа С состояла из CR5159, CR5166,CR6050, CR6077, CR6078, CR6086 и CR6191, а остальные из антител CR5140, CR5179, CR6016, CR6071,CR6079, CR6087, CR6195, CR6198, CR6241, CR6242, CR6246, CR6252, CR6415 и CR6432 не конкурировали с каким-либо другим антителом за связывание. Пример 10. In vitro опсонизирующая фагоцитарная активность антиэнтерококковых IgG1-молекул против различных штаммов Е. faecalis, E. faecium и S. aureus, измеренная анализом опсонофагоцитарного убивания. Для определения широты киллерной активности панели моноклональных антиэнтерококковых антител очищенные партии IgG1, приготовленные, как описано выше, анализировали на киллерную активность в анализе опсонофагоцитарного убивания, описанном выше. Испытывали дополнительный штамм Е. faecalis, тип 2; два разных клинических изолята Е. faecium, 740220 и 838970; и клинический изолят S.aureus 502. Восемнадцать антител выбирали из исходной панели 34 антител на основе неконкурентной связывающей способности и активности в анализе опсонофагоцитарного убивания. Как показано в табл. 15, выбранная панель обнаруживала киллерную активность в отношении штаммов Е. faecium при двух концентрациях, 2,5 и 0,025 мкг/мл, хотя активность CR5140, CR6016 и CR6078 была более низкой, чем 20%, против штамма 838970 при наивысшей концентрации. Все, кроме одного антитела, имели измеряе- 29