Моноклональное антитело человека к ctla-4 и способы его применения

006972 Перекрестная ссылка на сходные заявки В настоящей заявке декларируется приоритет предварительной патентной заявки США 60/113647,зарегистрированной 23 декабря 1998 г., раскрытие которой полностью включено здесь в качестве ссылки. Краткое изложение сущности изобретения В соответствии с настоящим изобретением здесь предлагаются целиком человеческие моноклональные антитела против антигена 4 цитотоксических Т-лимфоцитов человека (CTLA-4). Предлагаются последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности, включающие молекулы тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов, в частности прилегающие последовательности тяжелых и легких цепей, покрывающие районы, определяющие комплементарность (CDRs), особенно отFR1 и/или CDR1 до CDR3 и/или в пределах FR4. Дополнительно предлагаются антитела, имеющие сходные связывающие свойства, и антитела (или другие антагонисты), имеющие функциональные свойства,сходные с раскрытыми здесь антителами. Известный уровень техники Регуляция иммунного ответа у больных должна обеспечить желаемое лечение многих заболеваний человека, что может вести к специфичности действия, которая редко встречается при применении традиционных лекарств. Должна быть возможной как позитивная, так и негативная регуляция иммунного ответа. В связи с регуляцией иммунного ответа интенсивно изучается и характеризуется роль Т-клеток и Вклеток. В результате этих исследований оказалось, что во многих случаях роль Т-клеток особенно важна для профилактики и лечения заболеваний. Т-клетки обладают очень сложными системами контроля взаимодействия между ними. Для процесса взаимодействия между Т-клетками используется множество рецепторов и растворимых факторов. Таким образом, какой эффект может оказывать любой конкретный сигнал на иммунный ответ, зависит от конкретных факторов, рецепторов и обратных рецепторов, которые вовлечены в данный путь. Пути негативной регуляции ответов так же важны, как и пути, требуемые для активации. Обучение тимуса, которое ведет к Т-клеточной толерантности, представляет собой один из механизмов предотвращения иммунного ответа на конкретный антиген. Известны также другие механизмы, такие как секреция цитокинов, подавляющих иммунный ответ. Активация Т-клеток требует не только стимуляции через рецептор антигена (Т-клеточный рецептор(TCR, но и дополнительного сигнала через костимуляторные молекулы поверхности клетки, такие какCD28. Лигандами для CD28 являются белки В 7-1 (CD80) и В 7-2 (CD86), которые экспрессируются на антигенпредставляющих клетках, таких как дендритные клетки, активированные В-клетки или моноциты, которые взаимодействуют с CD28 или CTLA-4 Т-клеток для предоставления костимуляторного сигнала. Роль костимуляторной сигнализации исследована при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите (ЕАЕ) Perrin et al., Immunol. Res. 14:189-99 (1995). ЕАЕ представляет собой аутоиммунное нарушение, индуцированное Th1-клетками, направленными против антигенов миелина, что является моделью для изучения in vivo роли костимуляции, опосредованной В 7, в индукции патологического иммунного ответа. С помощью растворимого гибридного белкового лиганда рецепторов В 7, а также моноклональных антител, специфичных в отношении либо CD80, либо CD86, Perrin et al. показали, что костимуляция В 7 играет важную роль в определении клинического исхода заболевания при ЕАЕ. Взаимодействие между В 7 и CD28 является одним из нескольких костимуляторных путей проведения сигнала, который, по-видимому, существенен для инициирования созревания и пролиферации специфичных в отношении антигена Т-клеток. Отсутствие костимуляции при одновременной неадекватной продукции ИЛ-2 предотвращает последующую пролиферацию Т-клеток и вызывает состояние отсутствия реакции, называемое "анергией". Множество вирусов и опухолей могут тормозить активацию и пролиферацию Т-клеток, что ведет к недостаточной активности или отсутствию реакции иммунной системы хозяина по отношению к инфицированным или трансформированным клеткам. Среди ряда возможных нарушений Т-клеток анергия может, по меньшей мере, частично отвечать за неспособность организма хозяина удалять патогенные или опухолевые клетки. Применение белка В 7 для опосредования противоопухолевого иммунного ответа было описано вHarding et al., Nature 356:607-609 (1994) демонстрируют, что опосредуемая CD28 передача сигнала костимулирует Т-клетки мыши и предотвращает индукцию анергии в клонах Т-клеток. Смотри также патенты США 5434131, 5770197 и 5773253, а также заявки на международные патентыWO 93/00431,WO 95/01994, WO 95/03408, WO 95/24217 и WO 95/33770. Из указанного выше ясно, что для активации и последующей дифференцировки до эффекторной функции Т-клеткам требуется два типа сигналов от антигенпредставляющей клетки (АРС). Во-первых,при взаимодействиях между TCR Т-клеток и молекулами МНС, представляющими пептиды на АРС, возникает специфичный в отношении антигена сигнал. Во-вторых, имеется не зависимый от антигена сигнал, который возникает при взаимодействии CD28 с членами семейства В 7 (В 7-1 (CD80) или В 7-2(CD86. Вначале было неясно, на каком точно этапе иммунного ответа вмешивается CTLA-4. МышиныйCTLA-4 был впервые идентифицирован и клонирован Brunet et al., Nature 328:267-270 (1987) в качестве-1 006972 одного из результатов поиска молекул, которые предпочтительно экспрессируются на цитотоксических Т-лимфоцитах. Вскоре после этого был идентифицирован и клонирован CTLA-4 человека Dariavach etal., Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988). Молекулы CTLA-4 мыши и человека имеют приблизительно 76% общей гомологии последовательности и приближаются к полной идентичности последовательности в своих цитоплазматических доменах (Dariavach et al., Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988. CTLA-4 является членом иммуноглобулинового (Ig) суперсемейства белков. Суперсемейство Ig представляет собой группу белков, которые проявляют ключевые структурные особенности либо вариабельного (V), либо константного (С) домена молекул Ig. Члены суперсемейства Ig включают, но не ограничиваются этим,собственно иммуноглобулины, молекулы класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) (т.е. МНС класса I и II) и молекулы TCR. В 1991 году Linsley et al., J. Exp. Med. 174:561-569 (1991) предположили, что CTLA-4 является вторым рецептором для В 7. Сходным образом Harper et al., J. Immunol. 147:1037-44 (1991) показали, что молекулы CTLA-4 и CD28 являются близко родственными у мыши и человека по последовательности, по экспрессии мессенджера, по структуре гена и по хромосомной локализации. Смотри также Balzano et al.,Int. J. Cancer. Suppl. 7:28-32 (1992). Последующее доказательство этой роли получено благодаря функциональным исследованиям. Например, Lenschow et al., Science 257:789-792 (1992) показали, что CTLA4-Ig вызывает долговременное выживание трансплантатов островков поджелудочной железы. Freeman et(1992) описывают иммуносупрессию in vivo растворимой формой CTLA-4. Linsley et al., J. Exp. Med. 176:1595-604 (1992) получили антитела, которые связывали CTLA-4 и которые не реагировали перекрестно с CD28, и заключили, что CTLA-4 коэкспрессируется с CD28 на активированных Т-лимфоцитах и кооперативно регулирует адгезию Т-клеток и активацию под действием В 7. Kuchroo et al., Cell 80:707-18(1995) показали, что костимуляторные молекулы В 7-1 и В 7-2 дифференцированно активируют пути развития Th1/Th2. Yi-Qun et al., Int. Immunol. 8:37-44 (1996) показали, что для костимуляторных сигналов от членов семейства В 7 при их добавлении к недавно активированным хранящим память Т-клеткам имеются дифференциальные требования в отношении растворимых вызванных из памяти антигенов. Смотри также de Boer et al., Eur J. Immunol. 23:3120-5 (1993). Несколькими группами высказано предположение об альтернативных или отдельных рецептор/лиганд взаимодействиях для CTLA-4 по сравнению с CD28 и даже предположено наличие третьего В-7 комплекса, который узнается антителом ВВ 1. Смотри, например, Hathcock et al., Science 262:905-7(1993) и Boussiotis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11059-63 (1993). Однако Freeman et al., J. Immunol. 161:2708-15 (1998), обсуждают данные о том, что антитело ВВ 1 связывает молекулу, которая идентична поверхностно-клеточной форме CD74, и, следовательно, ВВ 1 mAb связывается с белком, отличным от В 7-1, и этот эпитоп имеется также на белке В 7-1. Таким образом, это наблюдение потребовало пересмотра работ в данной области с применением ВВ 1 mAb при анализе экспрессии и функции CD 80. Начиная с 1993 года с кульминацией в 1995 году, исследователи предприняли дальнейшее выяснение роли CTLA-4 в стимуляции Т-клеток. Во-первых, благодаря применению моноклональных антител против CTLA-4 Walunas et al., Immunity 1:405-13 (1994) представили доказательства того, что CTLA-4 может действовать в качестве негативного регулятора активации Т-клеток. После этого Waterhouse et al.,Science 270:985-988 (1995) показали, что в лимфатических узлах и селезенке дефицитных по CTLA-4 мышей накапливаются Т-лимфобласты с повышенным уровнем маркеров активации. Т-лимфобласты проникали также в печеночную ткань, ткань сердца, легочную и панкреатическую ткань, количество сывороточного иммуноглобулина было повышенным, а после стимуляции через Т-клеточный рецептор их Т-клетки пролиферировали спонтанно и сильно, но они были подвержены клеточной гибели, индуцированной перекрестной сшивкой Fas-рецептора и гамма-облучением. Waterhouse et al., заключили, чтоCTLA-4 действует как негативный регулятор активации Т-клеток и является жизненно важным для контроля гомеостаза лимфоцитов. В комментарии в том же выпуске Allison and Krummel, Science 270:932933 (1995) обсудили работу Waterhouse et al., как демонстрирующую то, что CTLA-4 действует, снижая ответ Т-клеток, или обладает тормозной сигнальной функцией в активации и развитии Т-клеток. Tivol etal., Immunity 3:541-7 (1995) также создали дефицитных по CTLA-4 мышей и показали, что у таких мышей быстро развивается лимфопролиферативное заболевание с мультиорганной лимфоцитарной инфильтрацией и разрушением ткани, в частности с тяжелым миокардитом и панкреатитом. Они заключили, что CTLA-4 играет ключевую роль в негативной регуляции активации Т-клеток и поддержании иммунологического гомеостаза. Krummel and Allison, J. Exp. Med. 182:459-65 (1995) позднее выяснили, чтоCD28 и CTLA-4 обладают противоположным действием на ответ Т-клеток на стимуляцию. Они создали антитело против CTLA-4 и исследовали эффекты его связывания с CTLA-4 в системе с использованием высокоочищенных Т-клеток. В их сообщении было показано, что присутствие низких количеств В 7-2 на свежеполученных Т-клетках может частично тормозить пролиферацию Т-клеток и это торможение опосредуется взаимодействиями с CTLA-4. Сшивание CTLA-4 вместе с TCR и CD28 сильно тормозит про-2 006972 лиферацию и секрецию ИЛ-2 Т-клетками. Наконец, эти результаты показали, что CD28 и CTLA-4 передают противоположные сигналы, которые, по-видимому, суммируются Т-клеткой в формировании ответа на антиген. Таким образом, они заключили, что результат стимуляции рецептора антигена Т-клетки регулируется костимуляторными сигналами CD28, а также тормозными сигналами, идущими от CTLA-4. Смотри также Krummel et al., Int. Immunol. 8:519-23 (1996), и патент США 5811097, и заявку на международный патентWO 97/20574. Было проведено множество дополнительных экспериментов для дальнейшего выяснения упомянутой выше функции CTLA-4. Например, Walunas et al., J. Exp. Med. 183:2541-50 (1996) благодаря применению антител против CTLA-4 предположили, что сигналы CTLA-4 не регулируют выживаемость клеток или ответ на ИЛ-2, но в действительности тормозят зависимую от CD28 продукцию ИЛ-2. Также Perrin et al., J. Immunol. 157:1333-6 (1996) показали, что антитела против CTLA-4 при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите (ЕАЕ) обостряют заболевание и повышают смертность. Обострение заболевания было связано с повышенным образованием энцефалитогенных цитокинов TNF-alpha, IFNgamma и ИЛ-2. Таким образом, они заключили, что CTLA-4 регулирует интенсивность аутоиммунного ответа при ЕАЕ, ослабляя образование воспалительного цитокина и клинические проявления заболевания. Смотри также Hurwitz et al., J. Neuroimmunol. 73:57-62 (1997) и Cepero et al., J. Exp. Med. 188:199204 (1998) (aнти-CTLA-4 шпильковый рибозим, который специфически блокирует экспрессию CTLA-4 после трансфекции гена на модели мышиных Т-клеток). Кроме того, Blair et al., J. Immunol. 160:12-5 (1998) оценили функциональные влияния группы моноклональных антител (mAbs) на CTLA-4 на покоящихся CD4+ клетках. Их результаты показали, что некоторые моноклональные антитела к CTLA-4 могут тормозить пролиферативные ответы покоящихся CD4+ клеток и переход клеточного цикла из фазы G0 в фазу G1. Ингибиторные эффекты CTLA-4 были очевидными в пределах 4 ч, во время, когда экспрессия CTLA-4 на поверхности клетки остается неопределяемой. Однако другие CTLA-4 mAbs не имели ингибиторных эффектов, что указывает на то, что связывание mAbs с CTLA-4 само по себе не достаточно для опосредования негативной регуляции Т-клеточных ответов. Интересно, что, пока продукция ИЛ-2 была выключена, ингибиторные aнти-CTLA-4 mAbs допускали индукцию и экспрессию гена выживания клеток bcl-X(L). В соответствии с данным наблюдением клетки оставались жизнеспособными, и после связывания CTLA-4 апоптоз не определялся. В связи с анергией Perez et al., Immunity 6:411-7 (1997) показали, что индукция анергии Т-клеток предотвращалась путем блокирования CTLA-4, и они заключили, что исход узнавания антигена Т-клетками определяется путем взаимодействия CD28 или CTLA-4 на Т-клетках с молекулами В 7. Также VanParijs et al., J. Exp. Med. 186:1119-28 (1997) исследовали роль интерлейкина 12 и костимуляторов в анергии Т-клеток in vivo и нашли, что при ингибировании связывания CTLA-4 при индукции анергии пролиферация Т-клеток блокировалась и не стимулировалась окончательная дифференцировка Тh1. Однако Тклетки, подвергнутые действию толерогенного антигена в присутствии как ИЛ-12, так и aнти-CTLA-4 антитела, не становились анергичными и вели себя идентично Т-клеткам, которые встречались с иммуногенным антигеном. Эти результаты предполагали, что in vivo в индукцию анергии вносят вклад два процесса: встреча с CTLA-4, которая ведет к блокаде способности Т-клеток пролиферировать, и отсутствие цитокина воспалительного типа, ИЛ-12, который предотвращает дифференцировку Т-клеток в Тh1 эффекторные клетки. Сочетание ИЛ-12 и aнти-CTLA-4 антитела было достаточным для превращения обычно толерантного стимула в иммуногенный. В отношении инфекций McCoy et al., J. Exp. Med. 186:183-7 (1997) показали, что анти-СТLA-4 антитела существенно увеличивают и ускоряют Т-клеточный иммунный ответ на Nippostrongylus brasiliensis,ведущий к значительному снижению количества взрослых особей и раннему окончанию отложения яиц паразитами. Смотри также Murphy et al., J. Immunol. 161:4153-4160 (1998) (Leishmania donovani). В отношении рака Kwon et al., PNAS USA 94:8099-103 (1997) разработали модель сингенного рака простаты мышей и изучили два отдельных воздействия, предназначенных для выяснения ответа, направленного против рака простаты, через усиленную костимуляцию Т-клеток: (i) обеспечение прямой костимуляции клетками рака простаты с трансдуцированной экспрессией лиганда В 7.1 и (ii) опосредуемая антителом блокада in vivo CTLA-4 T-клеток, которая предотвращает негативную регуляцию Т-клеток. Было показано, что опосредуемая антителом блокада in vivo CTLA-4 усиливает иммунные ответы против рака простаты. Также Young et al., Cancer Res. 57:4036-41 (1997) исследовали, ведет ли блокада функцииCTLA-4 к повышению противораковых ответов Т-клеток на различных стадиях опухолевого роста. На основании результатов, полученных in vitro и in vivo, они обнаружили, что блокада CTLA-4 у индивидуумов, больных раков, повышает способность генерировать противораковые эффекты Т-клеток, но выраженность такого усиливающего действия была ограничена ранними стадиями опухолевого роста в их модели. Дополнительно Hurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10067-71 (1998) исследовали зависимость генерации опосредуемого Т-клетками противоопухолевого ответа от встречи рецептора Т-клеток с главным комплексом гистосовместимости/антигеном, а также от связывания CD28 с В 7. Некоторые опухоли, такие как карцинома молочной железы SM1, не поддавались aнти-CTLA-4 иммунотерапии. Так,благодаря применению сочетания блокады CTLA-4 и вакцины, состоящей из SM1 клеток, экспрессирующих колониестимулирующий фактор, гранулоцитов-макрофагов, наблюдалась регрессия исходных-3 006972 опухолей SM1, несмотря на неэффективность любого лечения, применяемого по отдельности. Эта сочетанная терапия приводила к длительной иммунной реакции по отношению к SM1 и зависела как отCD4(+), так и от CD8(+) Т-клеток. Результаты позволили предположить, что блокада CTLA-4 действует на уровне антигенпредставляющих клеток хозяина. В отношении диабета Luhder et al., J. Exp. Med. 187:427-32 (1998) вводили mAb против CTLA-4 трансгенным по TCR мышам, моделирующим диабет на различных стадиях заболевания. Они обнаружили, что встреча CTLA-4 в момент, когда потенциально диабетогенные Т-клетки активируются впервые,является центральным событием; если встреча обеспечивается, то происходит инвазия островков, но она остается совершенно безвредной в течение месяцев. Если этого не происходит, то инсулит становится намного более агрессивным и быстро развивается диабет. В связи с иммунизацией вакциной Horspool et al., J. Immunol. 160:2706-14 (1998) обнаружили, что интактное mAb против CTLA-4, но не Fab фрагменты, подавляет первичный гуморальный ответ наpCIA/beta gal, не затрагивая вызываемых из памяти ответов, что указывает на то, что активация CTLA-4 тормозит образование антител, но не прайминг Т-клеток. Блокада лигандов для CD28 и CTLA-4, CD80(В 7-1) и CD86 (В 7-2), выявила отдельную и неперекрывающуюся функцию. Блокада CD80 при исходной иммунизации полностью блокировала первичные и вторичные ответы антител, тогда как блокада CD86 подавляла первичные, но не вторичные ответы. Одновременная блокада CD80 + CD86 была менее эффективной при подавлении ответов антител, чем блокада любого по отдельности. Усиление костимуляции посредством совместного введения экспрессирующих В 7 плазмид увеличивало ответы CTL, но не ответы антител, и не было получено указаний на смещение Тh1 в сторону Th2. Эти данные позволяют предполагать сложные и отдельные функции для CD28, CTLA-4, CD80 и CD86 при костимуляции Тклеток после вакцинации нуклеиновой кислотой. В связи с отторжением аллотрансплантата Markees et al., J. Clin. Invest. 101:2446-55 (1998) обнаружили на мышиной модели отторжения кожного аллотрансплантата, что приживаемость исходно зависит от присутствия IFN-gamma, CTLA-4 и CD4(+) Т-клеток. Добавление в схему протокола mAb противCTLA-4 или против IFN-gamma было связано с быстрым отторжением трансплантата, тогда как mAb против ИЛ-4 не оказывали действия. В связи с изучением роли CTLA-4 относительно CD28 Fallarino et al., J. Exp. Med. 188:205-10 (1998) создали трансгенных мышей по TCR с дефектным активирующим рекомбиназу геном 2 и CD28 дикого типа или дефектным CD28, которых иммунизировали экспрессирующей антиген опухолью. Праймированные Т-клетки мышей обоих типов продуцировали цитокины и пролиферировали в ответ на стимуляторные клетки, не экспрессирующие В 7. Однако, в то время как ответ CD28+/+ Т-клеток усиливался костимуляцией В 7-1, ответ CD28-/- Т-клеток сильно тормозился. Это торможение снималось моноклональными антителами против В 7-1 или CTLA-4. Таким образом, CTLA-4 может значительно тормозить активацию Т-клеток в отсутствие CD28, что указывает на то, что антагонизм опосредуемого TCR сигнала достаточен для объяснения тормозного действия CTLA-4. Сходным образом, Lin et al., J. Exp. Med. 188:199-204 (1998) изучали отторжение сердечных аллотрансплантатов у мышей, дефектных по CD28. Сердца Н-2(q) трансплантировали аллогенным мышам дикого типа или дефектным по CD28 (Н-2(b. Отторжение трансплантата у дефектных по CD28 мышей происходило позднее, чем у мышей дикого типа. Обработка реципиентов дикого типа CTLA-4-иммуноглобулином (Ig) или mAbs против В 7-1 плюсmAbs против В 7-2 значительно продлевала выживание аллотрансплантата. Напротив, обработка дефектных по CD28 мышей CTLA-4-Ig, mAbs против В 7-1 плюс mAbs против В 7-2 или блокирующим mАb против CTLA-4 вызывала ускорение отторжения аллотрансплантата. Эта повышенная скорость отторжения аллотрансплантата была связана с более сильной инфильтрацией моноядерных клеток и повышенным уровнем транскриптов IFN-gamma и ИЛ-6 в сердцах доноров у необработанных мышей дикого типа и у дефектных по CD28 мышей, обработанных CTLA-4-Ig или mAb против CTLA-4. Таким образом, отрицательная регуляторная роль CTLA-4 выходит за пределы способности предотвращать активациюCD28 посредством лигандной конкуренции. Даже в отсутствие CD28 CTLA-4 играет ингибиторную роль в регуляции отторжения аллотрансплантата. Исследовали также дополнительные характеристики экспрессии CTLA-4. Например, Alegre et al., J.Immunol. 157:4762-70 (1996) предположили, что CTLA-4 поверхности быстро интернализуется, что может объяснить низкий уровень экспрессии, обычно определяемый на клеточной поверхности. Они заключили, что CD28 и ИЛ-2 играют важную роль в повышении экспрессии CTLA-4. Кроме того, аккумуляция CTLA-4 на клеточной поверхности, по-видимому, регулируется, главным образом, за счет его быстрого эндоцитоза. Также Castan et al., Immunology 90:265-71 (1997) на основе иммуногистохимического анализа экспрессии CTLA-4 in situ предположили, что Т-клетки зародышевого центра, которые являютсяCTLA-4-позитивными, могли бы быть важными для иммунной регуляции. Соответственно, в свете широкой и важной роли, которую CTLA-4, по-видимому, играют в иммунном ответе, было бы желательно создать антитела к CTLA-4, которые могут быть эффективно применены в иммунотерапии. Более того, было бы желательно создать антитела против CTLA-4, которые могут быть применены при хронических заболеваниях, при которых требуются повторные введения антител.-4 006972 Краткое описание фигур На фиг. 1 представлена серия нуклеотидных и аминокислотных последовательностей тяжелой цепи и легкой каппа-цепи иммуноглобулиновых молекул в соответствии с изобретением: 4.1.1 (фиг. 1 А), 4.8.1(фиг. 1 В), 4.14.3 (фиг. 1 С), 6.1.1 (фиг. 1D), 3.1.1 (фиг. 1 Е), 4.10.2 (фиг. 1F), 2.1.3 (фиг. 1G), 4.13.1 (фиг. 1 Н),11.2.1 (фиг. 1I), 11.6.1 (фиг. 1J), 11.7.1 (фиг. 1 К), 12.3.1.1 (фиг. 1L) и 12.9.1.1 (фиг. 1 М). На фиг. 2 представлено сравнение последовательностей между предсказанными аминокислотными последовательностями тяжелой цепи клонов 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1,11.7.1, 12.3.1.1 и 12.9.1.1 и аминокислотной последовательностью родительской линии DP-50 (3-33). Различия между последовательностью родительской линии DP-50 и той же последовательностью в клонах обозначены жирным шрифтом. На фигуре также указаны положения последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 антител в виде затенений. На фиг. 3 представлено сравнение последовательностей между предсказанными аминокислотными последовательностями тяжелой цепи клона 2.1.3 и аминокислотной последовательностью родительской линии DP-65 (4-31). Различия между последовательностью родительской линии DP-65 и той же последовательностью в клоне обозначены жирным шрифтом. На фигуре также указаны положения последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 антитела в виде подчеркивания. На фиг. 4 представлено сравнение последовательностей между предсказанными аминокислотными последовательностями легкой каппа-цепи клонов 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 4.10.2 и 4.13.1 и аминокислотной последовательностью родительской линии А 27. Различия между последовательностью родительской линии А 27 и той же последовательностью в клоне обозначены жирным шрифтом. На фигуре также указаны положения последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 антитела в виде подчеркивания. Кажущиеся делеции в CDR1s клонов 4.8.1, 4.14.3 и 6.1.1 обозначены как "0s". На фиг. 5 представлено сравнение последовательностей между предсказанными аминокислотными последовательностями легкой каппа-цепи клонов 3.1.1, 11.2.1, 11.6.1 и 11.7.1 и аминокислотной последовательностью родительской линии 012. Различия между последовательностью родительской линии 012 и той же последовательностью в клоне обозначены жирным шрифтом. На фигуре также указаны положения последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 антитела в виде подчеркивания. На фиг. 6 представлено сравнение последовательностей между предсказанными аминокислотными последовательностями легкой каппа-цепи клона 2.1.3 и аминокислотной последовательностью родительской линии А 10/А 26. Различия между последовательностью родительской линии А 10/А 26 и той же последовательностью в клоне обозначены жирным шрифтом. На фигуре также указаны положения последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 антитела в виде подчеркивания. На фиг. 7 представлено сравнение последовательностей между предсказанными аминокислотными последовательностями легкой каппа-цепи клона 12.3.1 и аминокислотной последовательностью родительской линии А 17. Различия между последовательностью родительской линии А 17 и той же последовательностью в клоне обозначены жирным шрифтом. На фигуре также указаны положения последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 антитела в виде подчеркивания. На фиг. 8 представлено сравнение последовательностей между предсказанными аминокислотными последовательностями легкой каппа-цепи клона 12.9.1 и аминокислотной последовательностью родительской линии А 3/А 19. Различия между последовательностью родительской линии А 3/А 19 и той же последовательностью в клоне обозначены жирным шрифтом. На фигуре также указаны положения последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 антитела в виде подчеркивания. На фиг. 9 представлено обобщение N-концевых аминокислотных последовательностей, полученных с помощью прямого белкового секвенирования тяжелой и легкой цепей антител. На фиг. 10 представлена определенная дополнительная информация, характеризующая некоторые из антител в соответствии с настоящим изобретением. На фиг. 10 А суммированы данные, относящиеся к клонам 3.1.1, 41.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.14.3 и 6.1.1. Представлены данные, относящиеся к концентрации, изоэлектрическому фокусированию (ИЭФ), ДДС-Nа-ПАГЭ, размерно-эксклюзионной хроматографии (SEC),жидкостной хромато/масс-спектроскопии (ЖХМС), масс-спектроскопии (MALDI), N-концевым последовательностям легких цепей. Дополнительная подробная информация, относящаяся к ИЭФ, представлена на фиг. 10 В; информация, относящаяся к ДДС-Nа-ПААГ, представлена на фиг. 10 С; и SEC антитела 4.1.1 на фиг. 10D. На фиг. 11 представлена экспрессия В 7-1 и В 7-2 на клетках Raji с применением mAbs против CD80PE и CD86-PE. На фиг. 12 представлено зависимое от концентрации увеличение продукции ИЛ-2 в тесте Т-лимфобластов/Raji, индуцированное блокирующими антителами против CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 и 6.1.1). На фиг. 13 представлено зависимое от концентрации увеличение продукции IFN- в тесте Т-лимфобластов/Raji, индуцированное блокирующими антителами против CTLA-4 (BNI3, 4.1.1, 4.8.1 и 6.1.1) (тот же донор Т-клеток). На фиг. 14 представлено среднее увеличение продукции ИЛ-2 Т-клетками от 6 доноров, индуцированное блокирующими антителами против CTLA-4, в тесте Т-лимфобластов/Raji.-5 006972 На фиг. 15 представлено среднее увеличение продукции INF- Т-клетками от 6 доноров, индуцированное блокирующими антителами против CTLA-4, в тесте Т-лимфобластов/Raji. На фиг. 16 представлено увеличение продукции ИЛ-2 в hPBMC от 5 доноров, индуцированное блокирующими mAbs против CTLA-4, измеренное через 72 ч после стимуляции SEA. На фиг. 17 представлено увеличение продукции ИЛ-2 в цельной крови от 3 доноров, индуцированное блокирующими mAbs против CTLA-4, измеренное через 72 и 96 ч после стимуляции SEA. На фиг. 18 представлено торможение роста опухоли антителами против CTLA-4 мыши в мышиной опухолевой модели фибросаркомы. На фиг. 19 представлено увеличение продукции ИЛ-2, индуцированное антителами против CTLA-4(4.1.1 и 11.2.1) настоящего изобретения, через 72 ч в тестах Т-лимфобластов/Raji и суперантигена (цельная кровь и моноядерные клетки периферической крови от 6 доноров). На фиг. 20 представлено дозозависимое увеличение продукции ИЛ-2, индуцированное антителами против CTLA-4 (4.1.1 и 11.2.1) настоящего изобретения, через 72 ч в тесте Т-лимфобластов/Raji. На фиг. 21 представлено дозозависимое увеличение продукции ИЛ-2, индуцированное антителами против CTLA-4 (4.1.1 и 11.2.1) настоящего изобретения, через 72 ч в тесте суперантигена с цельной кровью при стимуляции 100 нг/мл суперантигена. На фиг. 22 представлены серии дополнительных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей следующих цепей антител против CTLA-4: полноразмерная тяжелая цепь 4.1.1 (кДНК 22(а), геномная ДНК 22(b) и аминокислотная последовательность 22(с, полноразмерная дегликозилированная тяжелая цепь 4.1.1 (кДНК 22(d) и аминокислотная последовательность 22(е, легкая цепь 4.1.1 (кДНК 22(f) и аминокислотная последовательность 22(g, полноразмерная тяжелая цепь 4.8.1 (кДНК 22(h) и аминокислотная последовательность 22(i, легкая цепь 4.8.1 (кДНК 22(j) и аминокислотная последовательность 22(k, полноразмерная тяжелая цепь 6.1.1 (кДНК 22(l) и аминокислотная последовательность 22(m, легкая цепь 6.1.1 (кДНК 22(n) и аминокислотная последовательность 22(о, полноразмерная тяжелая цепь 11.2.1 (кДНК 22(р) и аминокислотная последовательность 22(q и легкая цепь 11.2.1 (кДНК 22(r) и аминокислотная последовательность 22(s. Краткое изложение существа изобретения В соответствии с первым вариантом настоящего изобретения предлагается антитело, которое способно связывать CTLA-4, включающее аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая включает прилегающую аминокислотную последовательность от последовательности FR1 до последовательности FR3 включительно, кодируемую семейством генов человека VH3-33, и которая включает, по меньшей мере, одну из аминокислотных замен в последовательностях CDR1, последовательностях CDR2 или рамках последовательностей, представленных на фиг. 2. В предпочтительном осуществлении аминокислотная последовательность включает последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 70. В другом предпочтительном осуществлении антитело дополнительно включает аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, включая последовательность, выбираемую из группы, состоящей из последовательности, включающей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ IDNO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 71. В соответствии со вторым вариантом настоящего изобретения предлагается антитело, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая включает SEQ ID NO: 1, и аминокислотную последовательность вариабельной части легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 14. В соответствии с третьим вариантом настоящего изобретения предлагается антитело, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая включает SEQ ID NO: 2, и аминокислотную последовательность вариабельной части легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 15. В соответствии с четвертым вариантом настоящего изобретения предлагается антитело, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая включает SEQ ID NO: 4, и аминокислотную последовательность вариабельной части легкой цепи, которая включает SEQ ID NO: 17. В соответствии с пятым вариантом настоящего изобретения предлагается выделенное моноклональное антитело человека, которое способно взаимодействовать с CTLA-4. В предпочтительном осуществлении антитело способно конкурировать за связывание с CTLA-4 с антителом, выбираемым из группы, состоящей из 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 и 12.9.1.1. В другом предпочтительном осуществлении антитело обладает, по существу, сходной специфичностью связывания с CTLA-4, что и антитело, выбираемое из группы, состоящей из 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2,4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 и 12.9.1.1. В другом предпочтительном осуществлении антитело выбирают из группы, состоящей из 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1,11.7.1, 12.3.1.1 и 12.9.1.1. В другом предпочтительном осуществлении антитело не реагирует перекрестно с CTLA-4 низших видов млекопитающих, предпочтительно низшие виды млекопитающих включают мышь, крысу и кролика и более предпочтительно мышь и крысу. В другом предпочтительном осуществ-6 006972 лении антитело реагирует перекрестно с CTLA-4 приматов, предпочтительно приматы включают длиннохвостых макак и макак-резус. В другом предпочтительном осуществлении антитело обладает избирательностью в отношении CTLA-4 по сравнению с CD28, В 7-2, CD44 и hIgG1 более чем приблизительно 100:1 и предпочтительно приблизительно 500:1 или более. В другом предпочтительном осуществлении сродство связывания антитела составляет приблизительно 10-9 М или выше и предпочтительно приблизительно 10-10 М или выше. В другом предпочтительном осуществлении антитело тормозит связывание между CTLA-4 и В 7-2 с IС 50 меньше чем приблизительно 100 нМ и предпочтительно меньше чем приблизительно 0,38 нМ. В другом предпочтительном осуществлении антитело тормозит связывание междуCTLA-4 и В 7-1 с IC50 меньше чем приблизительно 100 нМ или выше и предпочтительно меньше чем приблизительно 0,50 нМ. В другом предпочтительном осуществлении антитело увеличивает продукцию ИЛ-2 в тесте Т-лимфобластов/Raji приблизительно на 500 пг/мл или выше и предпочтительно приблизительно на 3846 пг/мл или выше. В другом предпочтительном осуществлении антитело увеличивает продукцию IFN- в тесте Т-лимфобластов/Raji приблизительно на 500 пг/мл или выше и предпочтительно приблизительно на 1233 пг/мл или выше. В другом предпочтительном осуществлении антитело увеличивает продукцию ИЛ-2 в тесте суперантигена в hPBMC или цельной крови приблизительно на 500 пг/мл или выше. В другом предпочтительном осуществлении антитело увеличивает продукцию ИЛ-2 в тесте суперантигена в hPBMC или цельной крови приблизительно на 500 пг/мл или предпочтительно на 1500 пг/мл или выше, или выше чем приблизительно на 30% или предпочтительно на 50% по отношению к контролю. В соответствии с шестым вариантом настоящего изобретения предлагается гуманизированное (приближенное к человеческому) антитело, которое обладает, по существу, сходной специфичностью связывания с CTLA-4, что и антитело, выбираемое из группы, состоящей из 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1,4.14.3, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 и 12.9.1.1. В предпочтительном осуществлении антитело не реагирует перекрестно с CTLA-4 низших видов млекопитающих, предпочтительно низшие виды млекопитающих включают мышь, крысу и кролика и предпочтительно мышь и крысу. В другом предпочтительном осуществлении антитело реагирует перекрестно с CTLA-4 приматов, предпочтительно приматы включают длиннохвостых макак и макак-резус. В другом предпочтительном осуществлении антитело обладает избирательностью в отношении CTLA-4 по сравнению с CD28, В 7-2, CD44 и hIgG1 более чем приблизительно 100:1 и предпочтительно приблизительно 500:1 или более. В другом предпочтительном осуществлении сродство связывания антитела составляет приблизительно 10-9 М или выше и предпочтительно приблизительно 10-10 М или выше. В другом предпочтительном осуществлении антитело тормозит связывание между CTLA-4 и В 7-2 с IC50 меньше чем приблизительно 100 нМ и предпочтительно меньше чем приблизительно 0,38 нМ. В другом предпочтительном осуществлении антитело тормозит связывание между CTLA-4 и В 7-1 с IС 50 меньше чем приблизительно 100 нМ или выше и предпочтительно меньше чем приблизительно 0,50 нМ. В другом предпочтительном осуществлении антитело увеличивает продукцию ИЛ-2 в тесте Т-лимфобластов/Raji приблизительно на 500 пг/мл или выше и предпочтительно приблизительно на 3846 пг/мл или выше. В другом предпочтительном осуществлении антитело увеличивает продукцию IFN- в тесте Т-лимфобластов/Raji приблизительно на 500 пг/мл или выше и предпочтительно приблизительно на 1233 пг/мл или выше. В другом предпочтительном осуществлении антитело увеличивает продукцию ИЛ-2 в тесте суперантигена в hPBMC или цельной крови приблизительно на 500 пг/мл или выше. В другом предпочтительном осуществлении антитело увеличивает продукцию ИЛ-2 в тесте суперантигена в hPBMC или цельной крови приблизительно на 500 пг/мл или предпочтительно на 1500 пг/мл или выше, или выше чем приблизительно на 30% или предпочтительно 50% по отношению к контролю. В соответствии с седьмым вариантом настоящего изобретения предлагается антитело, которое взаимодействует с CTLA-4, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая включает последовательности FR1, FR2 и FR3 человека, кодируемую семейством генов человека VH3-33,оперативно связанную в рамке с последовательностью CDR1, CDR2 и CDR3, причем последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 независимо выбирают из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, представленных на фиг. 2. В предпочтительно осуществлении антитело по п.32 дополнительно включает любую из соматических мутаций в последовательностях FR1, FR2 и FR3, как продемонстрировано на фиг. 2. В соответствии с восьмым вариантом настоящего изобретения предлагается антитело, которое взаимодействует с CTLA-4, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая включает последовательности FR1, FR2 и FR3 человека, кодируемую семейством генов человека VH3-33,оперативно связанную в рамке с последовательностью CDR1, CDR2 и CDR3, причем антитело имеет следующие свойства: сродство связывания по отношению к CTLA-4 приблизительно 10-9 или выше; торможение связывания между CTLA-4 и В 7-1 с IС 50 приблизительно 100 нМ или менее; торможение связывания между CTLA-4 и В 7-2 с ТС 50 приблизительно 100 нМ или менее; и увеличение продукции цитокинов в тесте Т-клеток человека на 500 пг/мл или выше. В соответствии с девятым вариантом настоящего изобретения предлагается антитело, которое взаимодействует с CTLA-4, включающее аминокислотную последовательность тяжелой цепи, которая включает последовательности FR1, FR2 и FR3, оперативно связанную в рамке с последовательностьюCDR1, CDR2 и CDR3, независимо выбираемую из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, представленных на фиг. 2 и 3, причем антитело имеет следующие свойства: сродство связывания по отношению кCTLA-4 приблизительно 10-9 или выше; торможение связывания между CTLA-4 и В 7-1 с IC50 приблизительно 100 нМ или менее; торможение связывания между CTLA-4 и В 7-2 с IС 50 приблизительно 100 нМ или менее; и увеличение продукции цитокинов в тесте Т-клеток человека на 500 пг/мл или выше. В соответствии с десятым вариантом настоящего изобретения предлагается система культур клеток для определения стимуляции Т-клеток, включающая культуру Т-лимфобластов человека, сокультивируемую с клеточной линией Raji. В предпочтительном осуществлении Т-лимфобласты промывают перед культивированием с клеточной линией Raji. В соответствии с одиннадцатым вариантом настоящего изобретения предлагается метод измерения стимуляции Т-клеток, включающий предоставление культуры Т-лимфобластов человека и клеточной линии Raji; контактирование культуры с агентом; и измерение продукции цитокинов культурой. В соответствии с двенадцатым вариантом настоящего изобретения предлагается функциональный метод скрининга части со стимуляторной функцией в отношении Т-клеток, включающий предоставление культуры Т-лимфобластов человека и клеточной линии Raji; контактирование культуры с данной частью; и измерение продукции цитокинов культурой. В соответствии с тринадцатым вариантом настоящего изобретения предлагается тест Т-клеточной стимуляции для оценки ингибиторной функции CTLA-4, включающий контактирование культуры,включающей Т-лимфобласты человека и клеточную линию Raji, с агентом; и определение продукции цитокинов культурой. В соответствии с четырнадцатым вариантом настоящего изобретения предлагается способ скрининга агента на стимуляторную активность в отношении Т-клеток, включающий контактирование агента с клеточной культурой, включающей Т-лимфобласты человека и клеточную линию Raji; и определение продукции цитокинов культурой. В каждом из вариантов с десятого по четырнадцатый настоящего изобретения в предпочтительном осуществлении Т-лимфобласты промывают перед культивированием с клеточной линией Raji. В другом предпочтительном осуществлении цитокин представляет собой ИЛ-2 или IFN-. В предпочтительном осуществлении агент представляет собой антитело и предпочтительно взаимодействует с CTLA-4. В соответствии с пятнадцатым вариантом настоящего изобретения предлагается тест для измерения стимуляции Т-клеток, включающий предоставление популяции мононуклеарных клеток периферической крови человека (hPBMC) или цельной крови человека, стимулированных энтеротоксином А стафилококка; контактирование культуры с агентом; и измерение продукции цитокинов популяцией клеток. В соответствии с шестнадцатым вариантом настоящего изобретения предлагается функциональный тест для скрининга части со стимуляторной функцией в отношении Т-клеток, включающий предоставление популяции мононуклеарных клеток периферической крови человека или цельной крови человека,стимулированных энтеротоксином А стафилококка; контактирование культуры с данной частью; и определение продукции цитокинов популяцией клеток. В соответствии с семнадцатым вариантом настоящего изобретения предлагается тест Т-клеточной стимуляции для оценки ингибиторной функции CTLA-4, включающий контактирование популяции мононуклеарных клеток периферической крови человека или цельной крови человека, стимулированных энтеротоксином А стафилококка, с агентом; и определение продукции цитокинов популяцией клеток. В соответствии с восемнадцатым вариантом настоящего изобретения предлагается способ скрининга агента на стимуляторную активность в отношении Т-клеток, включающий контактирование агента с популяцией мононуклеарных клеток периферической крови человека или с цельной кровью человека,стимулированных энтеротоксином А стафилококка; и определение продукции цитокинов популяцией клеток. В каждом с пятнадцатого по восемнадцатый варианты настоящего изобретения в предпочтительном осуществлении цитокин представляет собой ИЛ-2. В другом предпочтительном осуществлении продукцию цитокинов измеряют в супернатанте, выделенном из культуры. В предпочтительном осуществлении агент представляет собой антитело и предпочтительно взаимодействует с CTLA-4. Подробное описание предпочтительных осуществлений В соответствии с настоящим изобретением предлагаются полностью человеческие моноклональные антитела против CTLA-4 человека. Предлагаются нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, включающие тяжелую и легкую цепи молекул иммуноглобулина, в частности последовательности, соответствующие близким им последовательностям тяжелой и легкой цепей от FR1 и CDR1 до CDR3 и FR4 включительно. Далее предлагаются антитела, обладающие сходными связывающими свойствами, и антитела (или другие антагонисты), обладающие функциями, сходными с функциями раскрытых здесь антител. Предлагаются также гибридомы, экспрессирующие такие иммуноглобулинoвые молекулы и моноклональные антитела. Определения Если это не определено здесь иначе, научные и технические термины, применяемые в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, которые общепонятны для специалистов. Далее, если-8 006972 это не подразумевается контекстом, отдельные термины должны включать множества и множественные термины должны включать отдельные. В целом, использованные здесь номенклатуры и способы, применяемые в отношении с клеточной и тканевой культурой, молекулярной биологией, а также белковой и олиго- или полинуклеотидной химией и гибридизацией, хорошо известны и общеприняты в технике. Для рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов, клеточной культуры и трансформации применяются стандартные способы (например, электропорация, липофекция). Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с указаниями производителя, или как это обычно производится в технике, или как здесь описано. Указанные выше способы и процедуры обычно проводят в соответствии с традиционными способами, хорошо известными в технике, и как описано в различных общих и более специальных ссылках, которые цитируются и обсуждаются в ходе настоящего описания. Смотри, например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y. (1989, которая включена здесь в качестве ссылки. Используемые здесь номенклатуры и лабораторные процедуры и способы, применяемые в связи с аналитической химией, синтетической органической химией и медицинской и фармацевтической химией, хорошо известны и общеприняты в технике. Для химических синтезов, химических анализов, получения фармацевтических препаратов, их составления и доставки, а также лечения больных применяют стандартные способы. Если это специально не указано иначе, под применяемыми в соответствии с настоящим раскрытием следующими терминами следует понимать следующие значения. Применяемый здесь термин "выделенный полинуклеотид" будет означать полинуклеотид геномного, кДНК или синтетического происхождения или их определенное сочетание, причем "выделенный полинуклеотид" в силу своего происхождения (1) не связан с целым или с частью полинуклеотида, в котором "выделенный полинуклеотид" находится в естественных условиях, (2) операционно связан с полинуклеотидом, к которому он не присоединен в естественных условиях или (3) не существует в природе в виде части более длинной последовательности. Применяемый здесь термин "выделенный белок" обозначает белок, кодируемый кДНК, рекомбинантной РНК, или синтетического происхождения, или определяемый их определенным сочетанием,причем "выделенный белок" в силу своего происхождения или источника происхождения (1) не связан с белками, обнаруженными в природе, (2) свободен от белков из того же источника, например свободен от белков мыши, (3) экспрессируется клетками различных видов или (4) не существует в природе. Применяемый здесь в качестве родового понятия термин "полипептид" относится к нативному белку, фрагментам или аналогам полипептидной последовательности. Следовательно, нативный белок,фрагменты и аналоги являются видами рода полипептидов. Предпочтительные полипептиды в соответствии с изобретением включают тяжелую цепь молекул иммуноглобулинoв человека и легкую каппацепь молекул иммуноглобулинoв человека, представленные на фиг. 1, а также молекулы антител, образуемые сочетаниями, включающими тяжелую цепь молекул иммуноглобулинов и легкую цепь молекул иммуноглобулинов, такую как легкая каппа-цепь молекул иммуноглобулинов, и наоборот, как и их фрагменты и аналоги. Применяемый здесь в отношении объекта термин "существующий в природе" относится к тому факту, что объект может быть обнаружен в природе. Например, полипептидная или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника и которая не была намеренно модифицирована человеком в лаборатории или другим способом, является "существующей в природе". Применяемый здесь термин "операционно связанный" относится к положениям описываемых таким образом компонентов, которые позволяют им функционировать присущим им способом. Управляющая последовательность "операционно связана" с кодирующей последовательностью таким способом, что при условиях, совместимых с управляющими последовательностями, достигается экспрессия кодирующей последовательности. Применяемый здесь термин "управляющая последовательность" относится к полинуклеотидным последовательностям, которые необходимы для обеспечения экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, к которым они присоединены. Природа таких управляющих последовательностей различается в зависимости от организма хозяина; у прокариоттакие управляющие последовательности обычно включают промотор, сайт связывания с рибосомой и последовательность терминации транскрипции; у эукариот управляющие последовательности обычно включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин "управляющие последовательности" предназначен для включения, как минимум, всех компонентов, присутствие которых необходимо для экспрессии и процессинга,и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых полезно, например лидирующие последовательности и последовательности гибридного партнера. Применяемый здесь термин "полинуклеотид" обозначает полимерную форму нуклеотидов длиной,по меньшей мере, 10 оснований, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов, или модифицированной формы любого типа нуклеотида. Термин включает односпиральные и двуспиральные формы ДНК.-9 006972 Применяемый здесь термин "олигонуклеотид" включает существующие в природе и модифицированные нуклеотиды, связанные друг с другом существующими в природе и природно не существующими олигонуклеотидными связями. Олигонуклеотиды представляют собой подгруппу полинуклеотидов,обычно имеющую длину в 200 оснований или менее. Предпочтительно олигонуклеотиды имеют длину от 10 до 60 оснований и более предпочтительно длину от 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 до 40 оснований. Олигонуклеотиды обычно являются односпиральными, например, для проб; хотя олигонуклеотиды могут быть двуспиральными, например, для применения в конструкции мутантного гена. Олигонуклеотиды изобретения могут быть либо смысловыми, либо антисмысловыми олигонуклеотидами. Применяемый здесь термин "существующие в природе нуклеотиды" включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Применяемый здесь термин "модифицированные нуклеотиды" включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными группами cахаров и тому подобное. Применяемый здесь термин "олигонуклеотидные связи" включает такие олигонуклеотидные связи, как фосфортиоатные,фосфордитиоатные, фосфорселеноатные, фосфордиселеноатные, фосфоранилтиоатные, фосфораниладатные, фосфорамидные и тому подобное. Смотри, например, LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990), открытия которых включены здесь в качестве ссылки. Если это желательно, олигонуклеотиды могут включать метку для их определения. Применяемый здесь термин "избирательно гибридизуемый" обозначает определяемо и специфически связанный. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты в соответствии с настоящим изобретением избирательно гибридизуются с цепями нуклеиновых кислот в условиях гибридизации и промывки, которые сводят к минимуму поддающееся оценке количество определяемого неспецифического связывания с нуклеиновыми кислотами. Как известно специалистам в данной области и как здесь обсуждается, могут быть применены очень строгие условия для достижения условий избирательной гибридизации. Обычно гомология последовательностей нуклеотидов между полинуклеотидами, олигонуклеотидами и фрагментами настоящего изобретения и интересующей последовательностью нуклеотидов должна быть, по меньшей мере, 80% и более типично предпочтительно увеличивающаяся гомология, по меньшей мере, до 85%, 90%, 95%, 99% и 100%. Две аминокислотные последовательности являются гомологичными, если между этими последовательностями существует частичная или полная идентичность. Например, 85% гомология обозначает, что 85% аминокислот идентичны, когда две последовательности сравниваются на предмет максимального совмещения. Допускаются пропуски (в любой из двух сравниваемых последовательностей) для максимизации совмещения; причем предпочтительны пропуски длиной 5 или менее и более предпочтительны длиной 2 или менее. В другом варианте предпочтительно две белковые последовательности (или полипептидные последовательности, или берущие от них начало полипептидные последовательности длиной, по меньшей мере, 30 аминокислот) являются гомологичными в применяемом здесь смысле, если показатель совмещения более 5 (в единицах стандартного отклонения), определяемый с помощью программы ALIGN с применением матрицы данных по мутациям и штрафными очками за пропуски 6-ти или более. Смотри Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence andStructure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972 и Supplement 2 к этому тому, pp. 1-10. Две последовательности или их части более предпочтительно являются гомологичными,если их аминокислоты идентичны на 50% или более при оптимальном совмещении с применением программы ALIGN. Применяемый здесь термин "соответствует" обозначает, что последовательность нуклеотидов гомологична (т.е. является идентичной, не имея строгого общего эволюционного происхождения) всей полинуклеотидной последовательности сравнения или ее части или что полинуклеотидная последовательность идентична полипептидной последовательности сравнения. В отличие от этого, термин"комплементарная чему-то" применяется здесь для обозначения того, что комплементарная последовательность гомологична всей последовательности полинуклеотидов сравнения или ее части. Например,нуклеотидная последовательность "ТАТАС" соответствует последовательности сравнения "ТАТАС" и комплементарна последовательности сравнения "GTATA". Следующие термины применяются для описания взаимосвязей последовательностей между двумя или более последовательностями полинуклеотидов или аминокислот: "последовательность сравнения","окно сравнения", "идентичность последовательностей", "процент идентичности последовательностей" и"значительная идентичность". "Последовательность сравнения" представляет собой определенную последовательность, применяемую в качестве основы для сравнения последовательностей; последовательность сравнения может быть частью большей последовательности, например участком полноразмерной кДНК или последовательности гена, данной в списке последовательностей, или может включать полную последовательность кДНК или гена. Обычно длина последовательности сравнения составляет, по меньшей мере, 19 нуклеотидов или 6 аминокислот, чаще, по меньшей мере, 24 нуклеотида или 8 аминокислот и часто, по меньшей мере, 48 нуклеотидов или 16 аминокислот. Так как две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности могут каждая (1) включать последовательность (т.е. часть полной полинуклеотидной или аминокислотной последовательности), которая сходна у двух молекул, и (2) могут- 10006972 дополнительно включать последовательность, которая различается у двух полинуклеотидных или аминокислотных последовательностей, сравнение последовательностей двух (или более) молекул для идентификации и сравнения локальных районов сходства последовательностей обычно выполняют путем сравнения последовательностей двух молекул в "окне сравнения". Применяемый здесь термин "окно сравнения" относится к концептуальному участку из, по меньшей мере, 18 последовательных положений нуклеотидов или 6 аминокислот, в котором полинуклеотидная последовательность или аминокислотная последовательность могут сравниваться с последовательностью сравнения из 18 последовательных положений нуклеотидов или 6 аминокислотных последовательностей и в котором часть полинуклеотидной последовательности в окне сравнения может включать до 20% или менее добавок, делеций, замен и т.п.(т.е. пропусков) при сравнении с последовательностью сравнения (которая не включает добавки или делеции) для оптимального совмещения двух последовательностей. С помощью различных способов выбирают оптимальное совмещение последовательностей для совмещения окна сравнения, которое может быть проведено с помощью алгоритма локальной гомологии Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981), с помощью алгоритма гомологичного совмещения Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970), с помощью способа поиска сходства Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444(1988), с помощью компьютерных способов осуществления этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA иTFASTA в Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,Medison, Wis.), Geneworks или MacVector software package) или с помощью проверки и наилучшего совмещения (т.е. ведущего к наибольшему проценту гомологии в окне сравнения). Термин "идентичность последовательностей" означает, что две полинуклеотидные или аминокислотные последовательности идентичны в окне сравнения (т.е. на основе совпадения нуклеотида с нуклеотидом или остатка с остатком). Термин "процент идентичности последовательностей" рассчитывают путем сравнения двух оптимально совмещенных последовательностей в окне сравнения, определения числа положений, в которых в обеих последовательностях находится идентичное основание нуклеиновых кислот (например, А, Т, С, G, U или I) или остаток для получения числа парных положений, деления числа парных положений на общее число положений в окне сравнения (т.е. на размер окна) и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Применяемый здесь термин "значительная идентичность" обозначает характеристику полинуклеотидной или аминокислотной последовательности, где полинуклеотидная или аминокислотная последовательность включает последовательность, в которой идентичность последовательности составляет, по меньшей мере, 85%, предпочтительно, по меньшей мере, от 90 до 95%, более обычно, по меньшей мере, 99% при сравнении с последовательностью сравнения в окне сравнения из, по меньшей мере, 18 нуклеотидных (6 аминокислотных) положений, где процент идентичности последовательностей рассчитывают путем сравнения последовательности сравнения с последовательностью, которая может включать делеции или добавки, которые составляют суммарно 20% или менее последовательности сравнения в окне сравнения. Последовательность сравнения может быть частью более крупной последовательности. Применяемые здесь названия двадцати аминокислот и их аббревиатура соответствуют традиционным. Смотри Immunology - А Synthesis (2nd Edition, E.S. Gollub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Assotiates,Sunderland, Mass. (1991, которая включена здесь в качестве ссылки. Стереоизомеры (например, Dаминокислоты) 20 традиционных аминокислот, неприродные аминокислоты, такие как -, дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нетрадиционные аминокислоты, также могут быть подходящими компонентами для полипептидов настоящего изобретения. Примеры нетрадиционных аминокислот включают 4-гидроксипролин, -карбоксиглутамат, -N,N,Nтриметиллизин, -N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин,5-гидроксилизин, -N-метиларгинин и другие сходные аминокислоты и иминокислоты (например, 4 гидроксипролин). При применяемой здесь записи последовательности полипептида направление в левую сторону является направлением к аминоконцу, а направление в правую сторону является направлением к карбокси-концу в соответствии с соглашением и стандартным применением. Сходным образом, если не оговорено иначе, левый конец одноцепочечных полинуклеотидных последовательностей является 5'-концом; направление в левую сторону двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей обозначается как 5'-направление. Направление добавок растущих транскриптов РНК от 5'- к 3'-концу обозначается как транскрипционное направление; области последовательностей на цепи ДНК, которые имеют ту же последовательность, что и РНК, и которые являются транскриптами РНК внутри 5'-конца, обозначаются как "вышележащие последовательности"; области последовательностей на цепи ДНК, которые имеют ту же последовательность, что и РНК, и которые являются транскриптами РНК внутри 3'-конца, обозначаются как "нижележащие последовательности". В применении к полипептидам термин "существенная идентичность" обозначает, что две пептидные последовательности при оптимальном совмещении, таком как с помощью программ GAP или BESTFIT с применением весов негомологичных пропусков, имеют последовательности, идентичные, по меньшей мере, на 80%, предпочтительно последовательности, идентичные, по меньшей мере, на 90%, более предпочтительно последовательности, идентичные, по меньшей мере, на 95%, и наиболее предпочтительно- 11006972 последовательности, идентичные, по меньшей мере, на 99%. Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются по консервативным заменам аминокислот. Под консервативными заменами аминокислот подразумевается взаимозаменяемость остатков, имеющих сходные боковые цепи. Например, группа аминокислот, имеющих алифатические боковые цепи, представляет собой глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группа аминокислот, имеющих алифатическиегидроксильные боковые цепи, представляет собой серин и треонин; группа аминокислот, имеющих амидсодержащие боковые цепи, представляет собой аспарагин и глутамин; группа аминокислот, имеющих ароматические боковые цепи, представляет собой фенилаланин, тирозин и триптофан; группа аминокислот, имеющих основные боковые цепи, представляет собой лизин, аргинин и гистидин; и группа аминокислот, имеющих содержащие серу боковые цепи, представляет собой цистеин и метионин. Предпочтительные консервативные замены групп аминокислот представляют собой валин-лейцин-изолейцин,фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутаминовая-аспарагиновая кислота и аспарагинглутамин. Как здесь обсуждается, минорные вариации аминокислотных последовательностей антител или молекул иммуноглобулинов рассматриваются как охватываемые настоящим изобретением, с условием, что при вариациях в последовательности аминокислот сохраняется, по меньшей мере, 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, 90%, 95% и наиболее предпочтительно 99% идентичности. В частности, рассматриваются консервативные замены аминокислот. Консервативными заменами являются такие, которые имеют место внутри семейства аминокислот, имеющих сходные боковые цепи. Кодируемые генетически аминокислоты обычно подразделяют на семейства: (1) кислые=аспартат, глутамат;(2) основные=лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные=аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные=глицин, аспарагин, глутамин, цистеин,серин, треонин, тирозин. Более предпочтительными семействами являются семейство серина и треонина с алифатическими-гидроксильными боковыми цепями; семейство аспарагина и глутамина с амидсодержашими боковыми цепями; семейство аланина, валина, лейцина и изолейцина с алифатическими боковыми цепями; и семейство фенилаланина, триптофана и тирозина с ароматическими боковыми цепями. Например, логично предположить, что изолированная замена лейцина на изолейцин или валин, аспартата на глутамат, треонина на серин или сходная замена аминокислоты на структурно сходную аминокислоту не должна иметь существенного влияния на связывание или свойства конечной молекулы, особенно, если в замену не вовлечена аминокислота, находящаяся в месте рамки. Можно легко проверить, будет ли замена аминокислоты влиять на функцию пептида, путем определения специфической активности производного пептида. Методы определения здесь подробно описаны. Фрагменты или аналоги антител или молекул иммуноглобулинов могут быть легко получены специалистами в этой области. Предпочтительно, чтобы амино- и карбоксиконцы фрагментов или аналогов находились вблизи границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут быть идентифицированы путем сравнения данных последовательностей нуклеотидов и/или аминокислот с опубликованными или собственными базами данных. Для идентификации мотивов последовательностей или предсказанной конформации доменов белков, которые есть в других белках с известной структурой и/или функцией, предпочтительно применяют компьютеризированные способы сравнения. Известны способы идентификации последовательностей белков, которые формируют известную трехмерную структуру. Bowie et al., Science 253:164(1991). Таким образом, представленные выше примеры демонстрируют, что специалист в данной области может узнать мотивы последовательностей и их структурную конформацию, что может быть использовано для определения структурных и функциональных доменов в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительными аминокислотными заменами являются те, которые: (1) снижают подверженность протеолизу, (2) снижают подверженность окислению, (3) изменяют сродство связывания для образования белковых комплексов, (4) изменяют сродство связывания и (4) придают или модифицируют другие физико-химические и функциональные свойства таких аналогов. Аналоги могут включать различные мутеины с последовательностью, отличной от существующей в природе пептидной последовательности. Например, в существующей в природе последовательности (предпочтительно в части полипептида, лежащей за пределами домена (доменов), образующего межмолекулярные контакты) могут быть произведены одиночные или множественные аминокислотные замены (предпочтительно консервативные аминокислотные замены). Консервативная аминокислотная замена не должна существенно менять структурные характеристики исходной последовательности (например, замещающая аминокислота не должна вызывать тенденции к нарушению спирали, которая имеется в исходной последовательности, или разрушать другие типы вторичной структуры, характерные для исходной последовательности). Примеры различаемых в технике вторичных и третичных структур полипептидов описаны в Proteins, Structures andStructure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991; и Thornton et al., Nature 354:105 (1991), которые включены здесь в виде ссылки. Используемый здесь термин "полипептидный фрагмент" относится к полипептиду, имеющему аминоконцевую или карбоксиконцевую делецию, но в котором оставшаяся аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям существующей в природе последовательности, опреде- 12006972 ленной, например, из последовательности полноразмерной кДНК. Фрагменты обычно имеют длину, равную, по меньшей мере, 5, 6, 8 или 10 аминокислотам, предпочтительно, по меньшей мере, 14 аминокислотам, более предпочтительно, по меньшей мере, 20 аминокислотам, обычно, по меньшей мере, 50 аминокислотам и даже более предпочтительно, по меньшей мере, 70 аминокислотам. Применяемый здесь термин "аналог" относится к полипептидам, включающим сегмент из, по меньшей мере, 25 аминокислот,который имеет значительную идентичность части рассчитанной аминокислотной последовательности и который обладает, по меньшей мере, одним из следующих свойств: (1) специфическим связыванием сCTLA-4 при подходящих для связывания условиях, (2) способностью блокировать связывание CTLA-4 со своими рецепторами или (3) способностью тормозить рост экспрессирующих CTLA-4 клеток in vitro или in vivo. Обычно полипептидные аналоги включают консервативную аминокислотную замену (или добавку или делецию) по сравнению с существующей в природе последовательностью. Аналоги обычно имеют длину, равную, по меньшей мере, 20 аминокислотам, предпочтительно, по меньшей мере, 50 или более аминокислотам, и часто могут иметь ту же длину, что и полноразмерный существующий в природе полипептид. Пептидные аналоги обычно применяют в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарств со свойствами, аналогичными свойствам пептида-образца. Эти типы непептидных соединений называют "пептидными миметиками" или "пептидомиметиками" Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber and Freidinger, TINS p. 392 (1985); и Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987), которые включены здесь в качестве ссылки. Такие соединения часто разрабатываются с целью компьютеризированного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые структурно сходны с терапевтически полезными пептидами, могут быть использованы для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики структурно сходны с пептидомобразом (т.е. полипептидом, который имеет биохимическое свойство или фармакологическую активность), таким как человеческое антитело, но имеют одну или более пептидных связей, необязательно замещенных связью, выбираемой из группы, состоящей из -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -СН-СН- (цис и транс), -СОСН 2-, -СН(ОН)СН 2- и -CH2SO-, с помощью способов, известных в этой области. Для получения более стабильных пептидов может быть использовано систематическое замещение одной или более аминокислот консенсусной последовательности на D-аминокислоту того же типа (например, D-лизин вместо L-лизина). Кроме того, с помощью способов, известных в этой области, могут быть созданы сжатые пептиды, включающие консенсусную последовательность или, по существу, идентичный вариант консенсусной последовательности (Rizo and Gierash Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), включенный здесь в качестве ссылки); например, путем добавления внутренних цистеиновых остатков, способных образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые превращают пептид в циклическую форму."Антитело" или "пептид(ы) антитела" относятся к интактному антителу или его связывающему фрагменту, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. Связывающие фрагменты получают с помощью метода рекомбинантной ДНК или с помощью ферментативного или химического расщепления интактных антител. Связывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab')2, Fv и антитела из одной цепи. Антитело, отличное от "биспецифического" или "бифункционального" антитела,понимается как имеющее идентичные связывающие центры. Антитело, по существу, тормозит взаимодействие рецептора с противорецептором, когда избыток антитела снижает количество рецептора, связанного с противорецептором, по меньшей мере, приблизительно на 20%, 40%, 60% или 80% и чаще более чем на 85% (при измерении в тесте конкурентного связывания in vitro). Термин "эпитоп" включает любую детерминанту белка, способную связываться с иммуноглобулином или рецептором Т-клеток. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические зарядные характеристики. Говорят, что антитело специфически связывает антиген, когда константа диссоциации составляет 1 мкМ, предпочтительно 100 нМ и наиболее предпочтительно 10 нМ. Термин "агент" применяется здесь для обозначения химического соединения или смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта, полученного из биологических материалов. Применяемые здесь термины "метка" и "меченый" относятся к включению выявляемого маркера,например, путем включения радиоактивной аминокислоты или присоединения к полипептиду биотинильных частей, которые могут быть выявлены с помощью меченого авидина (например, стрептавидина,имеющего флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которая может быть определена оптическими или колориметрическими способами). В определенных ситуациях метка или маркер могут быть также лекарственными. В технике известны и могут быть применены различные способы метки полипептидов и гликопротеинов. Примеры меток для полипептидов включают, но не ограничиваются этим, следующее: радиоизотопы и радионуклиды (например, 3H, 14 С, 15N, 35S, 90Y, 99 Тc, 111In, 125I, 131I),флуоресцентные метки (например, ФИТЦ, родамин, лантанид фосфора), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, -галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные, биотининильные группы, предварительно определенные полипептидные эпитопы, узнаваемые вторичным- 13006972 репортером (например, парные последовательности лейциновой застежки, сайты связывания для вторичных антител, домены связывания металла, эпитопные ярлыки). В некоторых осуществлениях метку присоединяют с помощью спейсерных групп различной длины для снижения потенциального стерического затруднения. Применяемый здесь термин "фармацевтический агент или лекарство" относится к химическому соединению или композиции, способным вызывать желаемое терапевтическое действие при правильном введении больному. Другие применяемые здесь химические термины используются в соответствии с традиционным применением в этой области, как это представлено в The MacGraw-Hill Dictionary ofChemical Terms (Parker, S., Ed., MacGraw-Hill, San Francisco (1985, включенном здесь в качестве ссылки. Применяемый здесь термин "антинеопластический агент" относится к агентам, которые обладают функциональным свойством тормозить развитие или прогрессию неоплазмы у человека, в особенности злокачественное (раковое) повреждение, такое как карцинома, саркома, лимфома или лейкемия. Торможение метастазов часто является свойством антинеопластических агентов. Применяемый здесь термин "в значительной мере чистый" обозначает, что вид объекта является преобладающим присутствующим видом (т.е. на молярной основе его больше, чем любого другого индивидуального вида в композиции) и предпочтительно в значительной мере очищенная фракция представляет собой композицию, в которой объект вида составляет, по меньшей мере, приблизительно 50%(на молярной основе) всех присутствующих макромолекулярных видов. Обычно в значительной мере чистая композиция должна включать более чем приблизительно 80% всех макромолекулярных видов,присутствующих в композиции, более предпочтительно более чем приблизительно 85%, 90%, 95% и 99%. Наиболее предпочтительно, чтобы вид объекта был очищен до практически полной гомогенности(загрязняющие виды не могут быть определены в композиции традиционными способами выявления),когда композиция состоит, по существу, из единственного макромолекулярного вида. Термин больной включает человека и субъекты ветеринарии. Структура антител Известно, что основная структурная единица антител включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну "легкую" (приблизительно 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (приблизительно 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область из приблизительно от 100 до 110 или более аминокислот, в первую очередь, ответственную за узнавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область, в первую очередь ответственную за эффекторную функцию. Легкие цепи человека подразделяются на каппа и лямбда легкие цепи. Тяжелые цепи подразделяются на мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон и определяют изотип антитела как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. В пределах легкой и тяжелой цепей вариабельные и константные области соединяются областью "J" из приблизительно 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь включает также область D из приблизительно 10 или более аминокислот. В целом, смотри Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.(1989 (включенный в качестве ссылки во всей полноте для всех целей). Вариабельные области каждой пары цепей легкая/тяжелая образуют связывающий сайт антитела. Таким образом, интактное антитело IgG содержит два связывающих сайта. За исключением бифункциональных или биспецифических антител, два связывающих сайта являются одинаковыми. Все цепи обнаруживают одинаковую общую структуру из относительно консервативных рамочных областей (FR), соединенных тремя гипервариабельными областями, называемыми также областями, определяющими комплементарность или CDRs. CDRs из двух цепей каждой пары располагаются за счет рамочных областей, обеспечивая связывание со специфическим эпитопом. От N-конца к С-концу как легкая, так и тяжелая цепи включают домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Нумерация аминокислот в каждом домене производится в соответствии с определениями Kabat, Sequences of ProteinsMol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989). Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, обладающее двумя различными парами тяжелая/легкая цепей и двумя различными связывающими сайтами. Биспецифические антитела могут быть получены множеством способов, включая слияние гибридом или соединение Fab' фрагментов. Смотри, например, SongsivilaiLachmann Clin. Exp.Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Кроме того, биспецифические антитела могут быть образованы как "диатела" (Hollinger et al., "'Diabodies': small bivalent and(1992. Получение биспецифических антител может быть относительно трудоемким интенсивным процессом по сравнению с получением обычных антител, а выход и степень чистоты биспецифических антител обычно ниже. Биспецифические антитела не существуют в форме фрагментов, содержащих один связывающий сайт (например, Fab, Fab' и Fv).- 14006972 Антитела человека и приближение антител к человеческим Антитела человека не вызывают проблем, связанных с антителами, которые содержат вариабельные и/или константные области мыши или крысы. Наличие таких берущих начало от мыши или крысы белков может вести к быстрому клиренсу антител и может вести к индукции иммунного ответа у больного против такого антитела. Было постулировано, что для избежания применения берущих начало от мыши или крысы антител можно создать антитела, приближенные к человеческим (т.н. "гуманизированные"),или создать полностью человеческие антитела путем введения функции антитела человека грызуну, так чтобы у грызуна образовывались антитела, имеющие полностью человеческие последовательности. Антитела человека Возможность клонировать и реконструировать локусы человека размером, измеряемым миллионами оснований, в YACs и вводить их в половые клетки мыши обеспечивает мощный способ выявления функциональных компонентов очень больших или грубо картированных локусов, а также создание удобных моделей заболеваний человека. Более того, применение такой технологии для замены локусов мыши их человеческими эквивалентами могло бы дать уникальные сведения об экспрессии и регуляции продуктов генов человека во время развития, их связи с другими системами и их вовлечении в индукцию и прогрессию заболевания. Важным практическим приложением такой стратегии является "гуманизация" гуморальной иммунной системы мыши. Введение мыши, у которой эндогенные гены Ig были инактивированы, локусов иммуноглобулина (Ig) человека дает благоприятную возможность изучить механизмы, лежащие в основе программированной экспрессии и сборки антител, а также их роли в развитии В-клеток. Более того, такая стратегия могла бы обеспечить идеальный источник для получения полностью человеческих моноклональных антител (Mabs) - важную веху в направлении осуществления многообещающей терапии заболеваний человека антителами. Ожидается, что полностью человеческие антитела сведут к минимуму иммуногенные и аллергические ответы, присущие мышиным или берущим начало от мыши Mabs, и тем самым повысят эффективность и безопасность вводимых антител. Можно ожидать, что применение полностью человеческих антител обеспечит значительное преимущество в лечении хронических и периодически возобновляющихся заболеваний человека, таких как воспаление, аутоиммунность и рак, для которого требуются повторяющиеся введения антител. Одним из подходов к данной цели было генно-инженерное создание линий мышей с дефицитом продукции антител мыши, с большими фрагментами локусов Ig человека в ожидании того, что такие мыши должны продуцировать широкий репертуар антител человека в отсутствие мышиных антител. Большие фрагменты Ig человека должны сохранять большое разнообразие различных генов, так же как свойственную им регуляцию продукции и экспрессии антител. Благодаря разработке мышиной модели для создания разнообразия антител и их селекции, а также отсутствия иммунологической толерантности к белкам человека, производство набора антител человека такими линиями мышей должно вести к получению высокоаффинных антител против любого интересующего антигена, включая антигены человека. Антигенспецифичные Mabs человека с желаемой специфичностью можно легко получить и отобрать,применяя технологию гибридом. Эта общая стратегия была продемонстрирована в связи с созданием заявителями первых линий XenoMouse, как опубликовано в 1994 году. Смотри Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994). Линии XenoMouse были созданы генно-инженерным способом с применением искусственных хромосом дрожжей (YACs), содержащих конфигурационные фрагменты локуса тяжелой цепи человека и локуса легкой каппа-цепи размером 245 т.п.о. и 190 т.п.о. соответственно, которые содержали каркас последовательностей вариабельного и константного районов (там же). Предлагаемые Ig человека, содержащие YACs, являются совместимыми с мышиной системой как для реконструкции, так и экспрессии антител, и способны замещать инактивированные гены Ig мыши. Это было продемонстрировано по их способности индуцировать выработку В-клеток, продуцировать набор полностью человеческих антител, подобный имеющемуся у взрослого человека, и генерировать антигенспецифические Mabs человека. Эти результаты также предполагали, что введение более крупных порций локусов Ig человека, содержащих большее число V-генов, дополнительных регуляторных элементов и константных районов Ig человека, должно повторять, по существу, полный набор, который характерен для гуморального ответа человека на инфекцию и иммунизацию. Работа Green et al. была недавно расширена до представления набора антител человека, большего, чем 80%, путем введения зародышевой конфигурации фрагментов YAC локусов тяжелой цепи человека и локусов легкой каппа цепи размера в миллион оснований, соответственно, для получения мышей XenoMouse. Смотри Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits J.Exp. Med. 188:483-495 (1998) и патентную заявку США 08/759620, зарегистрированную 3 декабря 1996 года, раскрытие которых включены здесь в качестве ссылки. Такой подход дополнительно обсуждается и описывается в патентных заявках США 07/466008, зарегистрированной 12 января 1990 г., 07/610515, зарегистрированной 8 ноября 1990 г.,07/919297, зарегистрированной 24 июля 1992 г., 07/922649, зарегистрированной 30 июля 1992 г.,08/031801, зарегистрированной 15 марта 1993 г., 08/112848, зарегистрированной 27 августа 1993 г.,08/234145, зарегистрированной 28 апреля 1994 г., 08/376279, зарегистрированной 20 января 1995 г.,- 15006972 08/430938, зарегистрированной 27 апреля 1995 г., 08/464584, зарегистрированной 5 июня 1995 г.,08/464582, зарегистрированной 5 июня 1995 г., 08/463191, зарегистрированной 5 июня 1995 г., 08/462837,зарегистрированной 5 июня 1995 г., 08/486853, зарегистрированной 5 июня 1995 г., 08/486857, зарегистрированной 5 июня 1995 г., 08/486859, зарегистрированной 5 июня 1995 г., 08/462513, зарегистрированной 5 июня 1995 г., 08/724752, зарегистрированной 2 октября 1996 г., и 08/759620, зарегистрированной 3 декабря 1996 г. Смотри также Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) и Green and Jakobovits, J. Exp.Med. 138:483-495 (1998). Смотри также европатентEP 0 463 151 В 1, решение, опубликованное 12 июня 1996 г., заявку на международный патентWO 94/02602, опубликованную 3 февраля 1994 г., заявку на международный патентWO 96/34096, опубликованную 31 октября 1996 г., и WO 98/24893, опубликованную 11 июня 1998 г. Раскрытие каждого из цитированных выше патентов, заявок и ссылок включены здесь в качестве ссылок во всей их полноте. В альтернативном подходе другие, включая GenPharm. International, Inc., применяли минилокусный подход. В минилокусном подходе экзогенный локус Ig мимикрирует благодаря включению кусочков (индивидуальных генов) из локуса Ig. Таким образом, в конструкцию для вставки животному включают один или более генов VH, один или более генов DH, один или более генов JH, константную область мю и вторую константную область (предпочтительно константную область гамма). Этот подход описан в патенте США 5545807, принадлежащем Surani et al., и патентах США 5545806, 5625825, 5625126,5633425, 5661016, 5770429, 5789650 и 5814318, каждый из которых принадлежит Lonberg and Kay, патенте США 5591669, принадлежащем Krimpenfort and Berns, патентах США 5612205, 5721367,5789215, принадлежащих Berns et al., и патенте США 5643763, принадлежащем Choi and Dunn, и принадлежащих GenPharm International заявках на патент США с 07/574748, зарегистрированной 29 августа 1990 г., 07/575962, зарегистрированной 31 августа 1990 г., 07/810279, зарегистрированной 17 декабря 1991 г., 07/853408, зарегистрированной 18 марта 1992 г., 07/904068, зарегистрированной 23 июня 1992 г., 07/990860, зарегистрированной 16 декабря 1992 г., 08/053131, зарегистрированной 26 апреля 1993 г., 08/096762, зарегистрированной 22 июля 1993 г., 08/155301, зарегистрированной 18 ноября 1993 г.,08/161739, зарегистрированной 3 декабря 1993 г., 08/165699, зарегистрированной 10 декабря 1993 г.,08/209741, зарегистрированной 9 марта 1994 г., раскрытия которых включены здесь в качестве ссылки. Смотри также европейский патент 0546073 В 1, международные патентные заявкиWO 92/03918,WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852 и WO 98/24884, раскрытия которых включены здесь в качестве ссылки во всей их полноте. Смотри дополнительно Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberget al., (1994), Taylor et al., (1994) и Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996), раскрытия которых включены здесь в качестве ссылки во всей их полноте. Изобретатели Surani et al., процитированные выше и представляющие Medical Research Counsel("MRC"), получили трансгенную мышь, содержащую локус Ig, с помощью применения минилокусного подхода. Изобретатели из GenPharm International work, цитированные выше, Lonberg and Kay, следуя указаниям указанных заявителей, предложили инактивацию эндогенного Ig локуса мыши, связанного, по существу, с дублированием работы Surani et al. Преимущество минилокусного подхода заключается в быстроте, с которой могут быть получены и введены животным конструкции, включающие части локуса Ig. Соответственно, однако, существенный недостаток минилокусного подхода теоретически заключается в том, что через включение малых количеств генов V, D и J вводится недостаточное разнообразие. Действительно, опубликованная работа, повидимому, поддерживает это опасение. Выработка В-клеток и образование антител животных, полученных с помощью применения минилокусного подхода, представляется сомнительным. Следовательно,исследование, близкое к настоящему изобретению, постоянно было направлено на введение больших порций локуса Ig для достижения большего разнообразия и для усилий воссоздания иммунного репертуара животных. Ответы антимышиного антитела человека (НАМА) привели к попытке получить химерные или гуманизированные другим образом антитела. Хотя химерные антитела содержат константную область человека и вариабельную область мыши, ожидается, что должны наблюдаться ответы некоторого антихимерного антитела человека (НАСА), в особенности при длительных или мультидозных применениях антитела. Таким образом, было бы желательным предложить полностью человеческие антитела противCTLA-4 для того, чтобы избежать участия и/или эффектов ответа НАМА или НАСА. Гуманизация или дисплейная технология Как обсуждалось выше в связи с получением антител человека, имеются преимущества получения антител со сниженной иммуногенностью. До некоторой степени это может быть осуществлено в связи со способами гуманизации и дисплейными методами с помощью подходящих библиотек. Следует понимать, что антитела мыши или антитела других видов могут быть приближены к человеческим или приматным с помощью способов, хорошо известных в данной области. Смотри, например, Winter and Harris,Immunol. Today 14:43-46 (1993) и Wright et al., Crit. Reviews in Immunol. 12:125-168 (1992). Интересующее антитело может быть сконструировано с помощью способов рекомбинантной ДНК для замены СН 1,СН 2, СН 3, шарнирных доменов и/или рамочного домена соответствующей последовательностью челове- 16006972 ка (смотри WO 92/02190 и патенты США 5530101, 5585089, 5693761, 5693792, 5714350 и 5777085). В данной области также известно применение кДНК Ig для конструирования генов химерных иммуноглобулинов (Liu et al., P.N.A.S. 84:3439 (1987) и J. Immunol. 139:3521 (1987. мРНК выделяют из гибридомы или других клеток, продуцирующих антитело, и применяют для получения кДНК. Интересующая кДНК может быть амплифицирована полимеразной цепной реакцией с применением специфичных праймеров (патенты США 4683195 и 4683202). В другом варианте создают и подвергают скринингу библиотеку для выделения интересующей последовательности. Последовательность ДНК, кодирующую вариабельную область антитела, затем соединяют с последовательностями константной области человека. Последовательности генов константных областей человека могут быть найдены у Kabat et al. (1991),Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publication No. 91-3242. Гены С-области человека легко доступны из известных клонов. При выборе изотипа следует руководствоваться желаемыми эффекторными функциями, такими как фиксация комплемента или активность в зависимой от антитела клеточной цитотоксичности. Предпочтительными изотипами являются IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Особенно предпочтительными изотипами для антител изобретения являются IgG2 и IgG4. Может быть использована любая из константных областей легкой цепи человека каппа или лямбда. Химерное гуманизированное антитело затем экспрессируют традиционными способами. Фрагменты антитела, такие как Fv, F(ab')2 и Fab, могут быть получены расщеплением интактного белка, например, с помощью протеаз или химического расщепления. В другом варианте конструируют укороченный ген. Например, химерный ген, кодирующий часть фрагмента F(ab')2, должен включать последовательности ДНК, кодирующие СН 1 домен и шарнирную область цепи Н, кончающуюся стопкодоном трансляции для получения укороченной молекулы. В одном подходе консенсусные последовательности, кодирующие J области тяжелой и легкой цепей, могут быть применены для конструирования олигонуклеотидов для применения в качестве праймеров для введения подходящих сайтов рестрикции в J область для последующего присоединения сегментов V области к сегментам С области человека. кДНК С области может быть модифицирована сайтнаправленным мутагенезом для помещения сайта рестрикции в аналогичное положение последовательности человека. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, космиды, YACs, эписомы, производные от EBV, и тому подобное. Удобным вектором является такой, который кодирует функционально полную последовательность СН или CL иммуноглобулина с подходящими свитами рестрикции, сконструированными так, что любая последовательность VH или VL может быть легко вставлена и экспрессирована. В таких векторах обычно происходит сплайсинг между донорным сайтом сращивания во вставленной области J и акцепторным сайтом сращивания, предшествующим С области человека, а также по областям сращивания, имеющимся в экзонах СН человека. Полиаденилирование и терминация транскрипции происходят по природным хромосомным сайтам, расположенным ниже кодирующих областей. Полученное химерное антитело может быть присоединено к любому сильному промотору, включаяLTRs ретровирусов, например раннему промотору SV-40 (Okayama et al., Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983,LTR вируса саркомы Payca (Gorman et al., P.N.A.S. 79:6777 (1982 и LTR вируса лейкоза мышей Moloney(Grosschedl et al., Cell. 41:885 (1985; нативные промоторы Ig и т.д. Кроме того, антитела человека или антитела других видов могут быть созданы с помощью технологий дисплейного типа, включая, но не ограничиваясь этим, фаговый дисплей, ретровирусный дисплей,рибосомный дисплей и другие способы с применением методов, хорошо известных в данной области, и полученные молекулы могут быть подвергнуты дополнительному созреванию, такому как аффинное созревание, поскольку такие способы хорошо известны в данной области. Wright and Harris, выше, Hanes(1992), Chiswell and McCafferty, TIBTECH 10:80-84 и патент США 5733743. Если дисплейные технологии применяют для получения антител, отличных от человеческих, такие антитела могут быть гуманизированы, как описано выше. С помощью этих способов могут быть получены антитела к экспрессирующим CTLA-4 клеткам,самому CTLA-4, формам CTLA-4, его эпитопам или пептидам и вдобавок экспрессионные библиотеки(смотри, например, патент США 5703057), которые могут быть затем подвергнуты скринингу, как описано выше, на предмет описанных выше активностей. Дополнительные критерии для лечения антителами Как должно быть ясно, обычно нежелательно вызывать гибель экспрессирующих CTLA-4 клеток. Напротив, обычно желательно простое ингибирование связывания CTLA-4 с его лигандами для снижения негативной регуляции Т-клеток. Одними из основных механизмов, посредством которых антитела вызывают гибель клеток, являются фиксация комплемента и участие в CDC. Константная область антитела играет важную роль в связи со способностью антитела к фиксации комплемента и участию в CDC. Таким образом, обычно выбирают изотип антитела, который либо обеспечивает способность к фиксации комплемента, либо нет. В случае настоящего изобретения обычно, как упоминалось выше, применение- 17006972 антитела, вызывающего гибель клеток, не является предпочтительным. Существует ряд изотипов антител, способных к фиксации комплемента и CDC, включая, но не ограничиваясь этим, следующие: IgM мыши, IgG2a мыши, IgG2b мыши, IgG3 мыши, IgM человека, IgG1 человека и IgG3 человека. Эти изотипы не включают, но не ограничиваясь этим, IgG2 человека и IgG4 человека. Должно быть ясным, что полученные антитела не обязательно должны исходно обладать желаемым изотипом, а, напротив, произведенное антитело может обладать любым изотипом, и изотип антитела может быть переключен позднее с помощью традиционных способов, хорошо известных в данной области. Такие способы среди других включают применение способов прямой рекомбинации (смотри, например, патент США 4816397), способов слияния клеток (смотри, например, патентную заявку США 08/730639, зарегистрированную 11 октября 1996 г.). В способе слияния клеток получают линию миеломы или других клеток, которая содержит тяжелую цепь любого желаемого изотипа, и получают другую линию миеломы или других клеток, которая содержит легкую цепь. Такие клетки могут в последствии быть слиты, и может быть выделена клеточная линия, экспрессирующая интактное антитело. В качестве примера большинство обсуждаемых здесь антител CTLA-4 являются IgG2 антителами против CTLA-4. Поскольку такие антитела обладают желаемым связыванием с молекулой CTLA-4, изотип любого из таких антител может быть легко переключен на выработку изотипа IgG4 человека, например, при сохранении той же вариабельной области (которая определяет специфичность антитела и часть его сродства). Соответственно, как только выработаны кандидатные антитела, которые отвечают "структурным" характеристикам, как обсуждалось выше, они обычно могут быть снабжены, по меньшей мере, определенными дополнительными "функциональными" характеристиками, которые желательны при смене изотипа. Конструирование и создание других терапевтических средств В соответствии с настоящим изобретением и основываясь на активности антител, которые здесь получены и охарактеризованы в отношении CTLA-4, облегчается конструирование других средств терапевтического воздействия, включая другие антитела, другие антагонисты или химические части, отличные от антител. Такие средства включают, но не ограничиваются этим, антитела, имеющие сходную связывающую активность или функциональность, улучшенные терапевтические средства на основе антител,такие как биспецифические антитела, иммунотоксины и радиоактивные терапевтические средства, создание пептидных терапевтических средств, генная терапия, в особенности на уровне организма, антисмысловые терапевтические средства и малые молекулы. Более того, как обсуждалось выше, эффекторная функция антител изобретения может быть изменена путем переключения изотипа на IgG1, IgG2,IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE или IgM для различных терапевтических применений. В связи с созданием улучшенных терапевтических средств на основе антител, когда желательной характеристикой является фиксация комплемента, возможно обойти зависимость гибели клеток от комплемента посредством применения, например, биспецифических антител, иммунотоксинов или радиоактивных меток. В связи с биспецифическими антителами могут быть созданы биспецифические антитела, которые включают (i) два антитела, одно со специфичностью в отношении CTLA-4, а другое в отношении второй молекулы, которые соединены вместе, (ii) единое антитело, которое имеет одну цепь, специфичную в отношении CTLA-4, и вторую цепь, специфичную в отношении второй молекулы, или (iii) одноцепочечное антитело, обладающее специфичностью в отношении CTLA-4 и другой молекулы. Такие биспецифические антитела могут быть созданы при применении способов, которые хорошо известны, например, в связи с (i) и (ii) смотри, например, Fanger et al., Immunol. Methods 4:72-81 (1994) и Wright and Harris, выше, и в связи с (iii) смотри, например, Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992). Дополнительно могут быть также получены "каппа-тела" (Ill et al., "Design and constraction of a hybrid(1992. В отношении иммунотоксинов, антитела могут быть модифицированы до проявления активности иммунотоксинов с применением способов, хорошо известных в этой области. Смотри, например, патент США 5194594. В отношении получения радиоактивных антител, такие модифицированные антитела могут быть также легко получены с применением способов, хорошо известных в этой области. Смотри,например, Junghans et al., in Cancer Chemotherapy and Biotherapy, 655-686 (2nd edition, Chafner and Longo,eds., Lippincott Raven (1996. Смотри также патенты США 4681581, 4735210, 5101827, 5102990(RE35500), 5648471 и 5697902. Каждый из иммунотоксинов и радиоактивных молекул должен быть подходящим для уничтожения клеток, экспрессирующих CTLA-4, и особенно тех клеток, в которых антитела настоящего изобретения являются эффективными.- 18006972 В отношении создания терапевтических пептидов, терапевтические пептиды, которые направлены против CTLA-4, могут быть созданы путем использования информации о структуре CTLA-4 и антител к нему, таких как антитела настоящего изобретения (как обсуждается ниже в отношении малых молекул),или скрининга пептидных библиотек. Конструирование и скрининг пептидных терапевтических средств обсуждается в связи с работой Houghten et al., Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al., Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake and Litzi-Davis BioConjugateChem. 3:510-513 (1992). Иммунотоксины и радиоактивные молекулы могут быть также получены сходным образом и с пептидными частями, как обсуждалось выше в отношении антител. Важная информация в отношении связывания антитела с антигеном может быть получена в экспериментах с фаговым дисплеем. Такие эксперименты обычно выполняются путем просмотра библиотеки фагов, экспрессирующих случайные пептиды, на связывание их с антителами изобретения для определения того, могут ли быть выделены пептиды, которые с ними связываются. В случае успешного результата может быть получена определенная информация об эпитопах пептидов, которые связываются. В целом, библиотеки фагов, экспрессирующие случайные пептиды, могут быть приобретены отNew England Biolabs (7-mer and 12-mer libraries, Ph.D.-7 Peptide 7-mer Library Kit и Ph.D.-12 Peptide 12mer Library Kit, соответственно) на основе системы М 13 бактериофага. 7-mer библиотека представляет собой множество из приблизительно 2,0 х 109 независимых клонов, которые представляют большинство,если не все, из 207=1,28 х 109 возможных 7-mer последовательностей. 12-mer библиотека содержит приблизительно 1,9 х 109 независимых клонов и представляет только очень немного образцов потенциального пространства последовательностей 2012=4,1 х 1015 12-mer последовательностей. Каждую из 7-mer и 12-mer библиотек просматривают или проводят скрининг в соответствии с рекомендациями производителя, при котором планшеты покрывали антителом для связывания с соответствующим антителом (например, FcIgG козы против белков человека для антител IgG) с последующим промыванием. Связанный фаг элюируют 0,2 М глицином-НСl, рН 2,2. После 3 циклов селекции/амплификации при постоянных условиях(0,5% Твин) с помощью секвенирования ДНК можно охарактеризовать клоны из библиотек, которые взаимодействуют с одним или более антителами. Реакционную способность пептидов можно определить с помощью ELISA. Для дополнительного обсуждения эпитопного анализа пептидов смотри также Scott,J.K. and Smith, Science, 249:386-390 (1990); Cwirla et al., PNAS USA 87; 6378-6382 (1990); Felici et al., J.Mol. Biol, 222:301-310 (1991), и Kuwabara et al., Nature Biotechnology 15:74-78 (1997). Реализация генной и/или антисмысловой терапии с помощью традиционных способов также облегчается в результате настоящего изобретения. Такие средства могут быть использованы для модуляции функций CTLA-4. В связи с этим антитела настоящего изобретения способствуют разработке и применению связанных с ними функциональных тестов. Разработка и стратегия антисмысловой терапии подробно обсуждается в международной патентной заявкеWO 94/29444. Разработка и стратегия генной терапии хорошо известны. Однако, в частности, применение способов генной терапии с использованием антител должно оказаться особенно выгодным. Смотри, например, Chen et al., Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) и Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). Общий замысел и обсуждение, относящиеся к генной терапии, обсуждаются также в международной патентной заявкеWO 97/38137. Генетический материал, кодирующий антитело настоящего изобретения (такой как 4.1.1, 4.8.1 или 6.1.1 или другой),может быть включен в подходящую экспрессионную систему (либо вирусную, либо ослабленную вирусную,невирусную, безоболочечную или другую) и введен хозяину для выработки антител у хозяина in vivo. В соответствии с настоящим изобретением можно также представить терапию с применением малых молекул. На основе настоящего изобретения могут быть разработаны лекарства для модуляции активности CTLA-4. Знания, полученные при изучении структуры молекулы CTLA-4 и ее взаимодействий с другими молекулами в соответствии с настоящим изобретением, такими как антитела изобретения,CD28, В 7, В 7-1, В 7-2 и другими, могут быть использованы для рационального планирования дополнительных терапевтических воздействий. В этом отношении для концентрирования усилий на открытии лекарств могут быть применены рациональные способы разработки лекарств, такие как рентгеноструктурная кристаллография, молекулярное моделирование с помощью (или при поддержке) компьютера(САММ), качественная или количественная структурно-функциональная взаимосвязь (QSAR) и сходные способы. Рациональная разработка позволяет предсказать белковые или синтетические структуры, которые могут взаимодействовать с молекулой или ее специфическими формами, которые могут быть использованы для модификации или модуляции активности CTLA-4. Такие структуры могут быть синтезированы химически или экспрессированы в биологических системах. Обзор этого подхода сделан у Capsey et al., Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988. Действительно, рациональное конструирование молекул (либо пептидов, пептидомиметиков, малых молекул, либо аналогичных), основанное на известной или описанной структурно-функциональной взаимосвязи с другими молекулами (такими, как антитела в соответствии с настоящим изобретением), вообще становится рутинным. Смотри, например, Fry et al., "Specific, irreversible inactivation of the epidermal growth factor receptorDes. 9:465-72 (1995). Далее, могут быть созданы и синтезированы комбинаторные библиотеки, и они могут быть использованы в программах скрининга, таких как достижение скрининга с высоким выходом. Терапевтические составы и введение Должно быть понятно, что введение терапевтической основы в соответствии с настоящим изобретением должно быть проведено с подходящими носителями, наполнителями и другими агентами, которые включают в составы для обеспечения улучшенного переноса, доставки, толерантности и т.п. Может быть найдено множество подходящих составов в руководстве, известном всем химикам-фармацевтам:Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1975, особенно в главе 87, написанной Blaug, Seymour. Эти составы включают, например, порошки, пасты, мази, желе,воски, масла, липиды, содержащие липиды (катионные или анионные) везикулы (такие как Lipofectin),конъюгаты с ДНК, безводные абсорбирующие пасты, масляно-водные и водно-масляные эмульсии,эмульгированный карбовакс (полиэтиленгликоли различного молекулярного веса), полутвердые гели и полутвердые смеси, содержащие карбовакс. Для лечения и терапии в соответствии с настоящим изобретением может подходить любая из перечисленных выше смесей, предлагаемая так, чтобы активный ингредиент в составе не инактивировался составом и состав был физиологически совместимым и подходил к способу введения. Смотри также Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations",PDA J. Pharm. Sci. Technol. 52:238-311 (1998) и цитированные там ссылки для дополнительной информации, относящейся к наполнителям и носителям, хорошо известным химикам-фармацевтам. Получение антител Антитела в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно получают путем использования трансгенной мыши, которая имеет существенную долю встроенного генома, продуцирующего антитела человека, но которая за счет этого дефицитна в отношении продукции эндогенных мышиных антител. Такие мыши затем способны продуцировать молекулы иммуноглобулинoв человека и антитела, а также имеют дефицит продукции молекул иммуноглобулинов и антитела мыши. Технологии, применяемые для достижения этой цели, раскрыты в патентах, заявках и ссылках, раскрытых здесь в известном уровне техники. В особенности, однако, предпочтительное осуществление получения трансгенных мышей и продукции ими антител раскрыто в патентной заявке США 08/759620, зарегистрированной 3 декабря 1996 г., раскрытие которой включено здесь в качестве ссылки. Смотри также Mendez et al.,Nature Genetics 15:146-156 (1997), раскрытие которой включено здесь в качестве ссылки. С помощью применения такой технологии заявители получили полностью человеческие моноклональные антитела к множеству антигенов. Существенно, что заявители иммунизировали линии XenoMouse мышей интересующим антигеном, извлекали у мышей, которые экспрессируют антитела, лимфатические клетки (такие как В-клетки), гибридизовали такие извлеченные клетки с клеточной линией миелоидного типа для получения иммортализованных гибридомных клеточных линий и проводили скрининг и отбор таких гибридомных клеточных линий для идентификации гибридомных клеточных линий, которые продуцируют антитела, специфичные в отношении интересующего антигена. Заявители применяли такие технологии в соответствии с настоящим изобретением для получения антител, специфичных в отношении CTLA-4. Здесь заявители описывают получение множества гибридомных клеточных линий, которые продуцируют антитела, специфичные в отношении CTLA-4. Кроме того, заявители представляют характеристику антител, продуцируемых такими клеточными линиями, включая анализы нуклеотидной и аминокислотной последовательностей тяжелой и легкой цепей таких антител. Антитела, продуцируемые обсуждаемыми здесь гибридомными клеточными линиями, обозначены как 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 6.1.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 и 12.9.1.1. Каждое из антител, продуцируемых указанными выше клеточными линиями, содержит полностью человеческие IgG2 или IgG4 тяжелые цепи с человеческими легкими каппа-цепями. В целом, антитела в соответствии с настоящим изобретением обладают очень высоким сродством, обладая обычно Кd от приблизительно 10-9 до приблизительно 10-11 М при измерении либо с помощью твердой фазы, либо жидкой фазы. Как должно быть понятно, антитела в соответствии с настоящим изобретением могут экспрессироваться в клеточных линиях, отличных от гибридомных клеточных линий. Последовательности, кодирующие кДНК или геномные клоны для конкретных антител, могут быть использованы для трансформации подходящих клеток хозяина-млекопитающего или немлекопитающего. Трансформация может быть проведена с помощью любого известного способа введения полинуклеотидов в клетку хозяина, включая,например, введение полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и проведения трансдукции клетки- 20006972 хозяина вирусом (или вектором), или с помощью процедур трансфекции, известных в данной области,примеры чего приводятся в патентах США 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455 (данные патенты включены здесь в качестве ссылки). Применяемая процедура трансформации зависит от хозяина, подвергаемого трансформации. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются этим, трансфекцию, опосредуемую декстраном, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию, опосредуемую полибреном, слияние протопластов, электропорацию, бомбардировку частицами, инкапсулирование полинуклеотида(ов) в липосомы, конъюгирование пептидов, использование дендримеров и непосредственную микроинъекцию ДНК в ядра. Клеточные линии млекопитающих, подходящие в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают многие иммортализованные клеточные линии, поставляемые AmericanType Culture Collection (ATCC), включая, но не ограничиваясь этим, клетки яичников китайского хомячка (СНО), NSO0, клетки HeLa, клетки почек детенышей хомячка (ВНК), клетки почек обезьяны (COS),клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер G2) и большое количество других клеточных линий. Для экспрессии рекомбинантных антител могут также использоваться клетки немлекопитяющих, включая, но не ограничиваясь этим, клетки бактерий, дрожжей, насекомых и растений. Сайтнаправленный мутагенез СР 2 домена антитела для устранения гликозилирования может быть предпочтительным для того, чтобы предотвратить изменения или в иммуногенности, фармакокинетике и/или эффекторных функциях, возникающих из-за гликозилирования, не свойственного человеческим антителам. Экспрессионные способы выбирают путем определения того, какая система дает наиболее высокие уровни экспрессии и продуцирует антитела с конститутивными связывающими свойствами CTLA-4. Кроме того, экспрессия антител настоящего изобретения (или других их частей) продуцирующими их клеточными линиями может быть увеличена с помощью применения большого числа известных способов. Например, системы экспрессии генов глутаминсинтетазы и DHFR являются обычными для увеличения экспрессии в определенных условиях. Клеточные клоны с высоким уровнем экспрессии могут быть идентифицированы с применением традиционных способов, таких как клонирование с ограниченным разведением и технология Microdrop. Система DS обсуждается частично или полностью в связи с европейскими патентами 0217846, 0256055 и 0323997 и европейской патентной заявкой 89303964.4. Антитела настоящего изобретения могут также продуцироваться трансгенно с помощью создания млекопитающего или растения, которое является трансгенным в отношении интересующих последовательностей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина и продуцирует антитело в извлекаемой из него форме. В отношении трансгенной продукции у млекопитающих, у них могут продуцироваться антитела и выявляться в молоке коз, коров или других млекопитающих. Смотри, например, патенты США 5827690, 5756687, 5750172 и 5741957. Антитела в соответствии с настоящим изобретением проанализированы структурно и функционально. В отношении структуры антител, аминокислотные последовательности тяжелой и легкой каппацепей предсказаны на основе последовательностей ДНК, полученных с помощью ОТ-ПЦР гибридом. Смотри примеры 3 и 4 и фиг. 1-8 для подтверждения результатов, обсуждаемых в примерах 3 и 4, было также проведено секвенирование N-концов антител. Смотри пример 5 и фиг. 9. Для определения сродства проводили кинетический анализ антител. Смотри пример 2. Антитела в соответствии с настоящим изобретением (и особенно 4.1.1, 4.8.1 и 6.1.1 антитела изобретения) имеют высокое сродство (4.1.1:1,63 Х 1010 1/М; 4.8.1:3,54 Х 1010 1/М; и 6.1.1:7,2 Х 109 1/М). Кроме того, антитела анализировали с помощью изоэлектрического фокусирования (IEF), электрофореза (ДДС-ПАГЭ) в восстанавливающих условиях,эксклюзионной хроматографии, жидкостной хроматографии/масс-спектроскопии и масс-спектроскопии и определяли продукцию антител гибридомами. Смотри пример 6 и фиг. 10. В отношении функционального анализа антител в соответствии с настоящим изобретением, такие предлагаемые антитела являются сильными ингибиторами CTLA-4 и их связывания со своими лигандами - молекулами семейства В 7. Например, антитела в соответствии с настоящим изобретением, как показано, блокируют связывание CTLA-4 либо с В 7-1, либо с В 7-2. Смотри пример 7. Конечно, многие из антител в соответствии с настоящим изобретением обладают наномолярной или субнаномолярной IС 50 в отношении торможения связывания CTLA-4 с В 7-1 и В 7-2. Кроме того, антитела настоящего изобретения обладают прекрасной избирательностью в отношении CTLA-4 по сравнению с CD28, CD44, В 7-2 или hIgG1. Смотри пример 8. Избирательность представляет собой отношение, которое отражает степень предпочтительного связывания молекулы с первым агентом по сравнению со связыванием молекулы со вторым и необязательно другими молекулами. Здесь избирательность обозначает степень предпочтительного связывания антитела изобретения с CTLA-4 по сравнению со связыванием антитела с другими молекулами, такими как CD28, CD44, В 7-2 или hIgG1. Уровень избирательности антител изобретения обычно выше чем 500:1. Антитела настоящего изобретения, как также было показано, индуцируют или увеличивают экспрессию определенных цитокинов (таких, как ИЛ-2 и IFN-) при культивировании Тклеток в модели Т-лимфобластов. Смотри примеры 9 и 10 и фиг. 12-17. Более того, ожидается, что антитела изобретения будут тормозить рост опухолей в соответствующих моделях опухолей in vitro. Создание таких моделей обсуждается в примерах 11 и 12.- 21006972 Результаты, полученные в соответствии с настоящим изобретением, указывают на то, что антитела настоящего изобретения обладают определенными достоинствами, что может сделать настоящие антитела более эффективными, чем имеющиеся в настоящее время терапевтические антитела против CTLA-4. В частности, антитела изобретения 4.1.1, 4.8.1 и 6.1.1 обладают желательными свойствами в высокой степени. Их структурные характеристики, функции или активность являются критериями, которые способствуют созданию или отбору дополнительных антител или других молекул, как обсуждалось выше. Такие критерии включают один или более из следующего: способность конкурировать за связывание с CTLA-4 с одним или более антител изобретения; специфичность связывания с CTLA-4, сходная с одним или более антител изобретения; связывающее сродство в отношении CTLA-4 приблизительно 10-9 М или более и предпочтительно 10-10 М или более; отсутствие перекрестной реакции с CTLA-4 низших млекопитающих, включая предпочтительно мышь, крысу или кролика и предпочтительно CTLA-4 мыши; наличие перекрестной реакции с CTLA-4 приматов, включая предпочтительно CTLA-4 длиннохвостых макак и макак резус; избирательность в отношении CTLA-4 по сравнению с CD28, В 7-2, CD44 или hIgG1, по меньшей мере, около 100:1 или более и предпочтительно приблизительно 300, 400 или 500:1 или более;IС 50 при торможении связывания CTLA-4 с В 7-2 приблизительно 100 нМ или ниже и предпочтительно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,38 нМ или менее;IC50 при торможении связывания CTLA-4 с В 7-1 приблизительно 100 нМ или ниже и предпочтительно 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,50 нМ или менее; увеличение продукции цитокинов в одном или более тестов in vitro, например: увеличение продукции ИЛ-2 в тесте Т-лимфобластов/Raji приблизительно на 500 пг/мл или выше и предпочтительно на 750, 1000, 1500, 2000, 3000 или 3846 пг/мл или более; увеличение продукции IFN- в тесте Т-лимфобластов/Raji приблизительно на 500 пг/мл или более и предпочтительно на 750, 1000 или 1233 пг/мл или более; или увеличение продукции ИЛ-2 в тесте суперантигена в hPBMC или цельной крови приблизительно на 500 пг/мл или более и предпочтительно на 750, 1000, 1200 или 1511 пг/мл или более. При другом выражении величин желательно, чтобы продукция ИЛ-2 увеличивалась приблизительно на 30, 35, 40, 45, 50% или более по отношению к контролю теста. Ожидается, что антитела (или молекулы, сконструированные или синтезированные на их основе),имеющие одно или более из данных свойств, должны обладать эффективностью, сходной с антителами,описанными в настоящем изобретении. Обсуждаемые выше желаемые функциональные свойства часто могут быть результатом связывания молекулы (т.е. антитела, фрагмента антитела, пептида или малой молекулы) с CTLA-4 и торможением его активности сходным образом, что и антитело настоящего изобретения (т.е. связывание с тем же или сходным эпитопом молекулы CTLA-4). Молекулу можно вводить либо прямо (т.е. прямое введение больному таких молекул), или, в противоположном варианте, молекулу можно вводить "непрямо" (т.е. пептид или подобное ему соединение, которое вызывает иммунный ответ у больного (сходный с вакциной), где иммунный ответ включает выработку антител, которые взаимодействуют с тем же самым или сходным эпитопом, или антитело или фрагмент, которые продуцируются in situ после введения генетических материалов, которые кодируют такие антитела или их фрагменты, которые взаимодействуют с тем же самым или сходным эпитопом). Таким образом, должно быть понятно, что эпитоп CTLA-4, с которым взаимодействуют антитела изобретения, может быть полезен в связи с получением и/или схемой терапии в соответствии с настоящим изобретением. При создании лекарства часто полезна также отрицательная информация (т.е. полезен тот факт, что антитело, которое взаимодействует с CTLA-4, вероятно,не взаимодействует с эпитопом, который действует как ингибитор CTLA-4). Таким образом, эпитоп, с которым взаимодействуют антитела изобретения, что не ведет к желаемым функциональным свойствам,может быть также очень полезен. Следовательно, в соответствии с настоящим изобретением рассматриваются также молекулы (и особенно антитела), которые взаимодействуют с теми же самыми или сходными эпитопами, что и антитела изобретения. В дополнение к тому факту, что антитела изобретения и эпитопы, с которыми они взаимодействуют, рассматриваются в соответствии с настоящим изобретением, заявители провели некоторую предварительную работу по картированию эпитопов определенных антител в соответствии с настоящим изобретением и особенно антител 4.1.1 и 11.2.1 изобретения. В качестве первого этапа заявители провели конкурентный анализ BIOcore для создания черновой карты связывания определенными антителами изобретения по их способности конкурировать за связывание с CTLA-4. С этой целью CTLA-4 был связан с чипом BIOcore и первое антитело взаимодействовало с ним в насыщающих условиях, и измеряли конкуренцию последующих вторых антител за связывание с CTLA-4. Этот способ дает возможность создать черновую карту, по которой могут быть классифицированы семейства антител.- 22006972 С помощью этого способа заявители обнаружили, что определенные антитела в соответствии с настоящим изобретением могут быть подразделены на категории, попадая в одну из перечисленных ниже категорий. получены от Pharmingen. На следующем этапе заявители попытались определить, узнают ли антитела изобретения линейный эпитоп на CTLA4 при восстанавливающих и невосстанавливающих условиях при иммуноблоттинге. Заявители обнаружили, что ни одно из антител изобретения 4.1.1, 3.1.1, 11.7.1, 11.6.1 или 11.2.1, повидимому, не узнает восстановленную форму CTLA4 при иммуноблоттинге. Следовательно, похоже, что эпитоп, с которым каждое из этих антител связывается, не является линейным эпитопом, а, скорее, является конформационным эпитопом со структурой, которая разрушается при восстанавливающих условиях. Таким образом, заявители решили определить, что можно узнать об остатках в молекуле CTLA4,которые важны для связывания антител изобретения. Один из способов, использованных заявителями,заключался в проведении кинетических определений обратных скоростей при сравнении CTLA4 человека с двумя высококонсервативными молекулами CTLA4 приматов (CTLA4 длиннохвостых макак и мартышек). Исследование с помощью BIOcore показало, что антитело 4.1.1 изобретения связывается сCTLA4 человека, длиннохвостых обезьян и мартышек с одинаковой скоростью. Однако в отношении обратных скоростей (сродства), антитело 4.1.1 обладало наибольшим сродством (наиболее медленной обратной скоростью) в отношении CTLA4 человека, более высокой обратной скоростью в отношенииCTLA4 длиннохвостой обезьяны и наиболее высокой обратной скоростью в отношении CTLA4 мартышки. Антитело 11.2.1 изобретения, с другой стороны, связывается с CTLA4 человека, длиннохвостых обезьян и мартышек с приблизительно одинаковой скоростью и обладает приблизительно одинаковой относительной обратной скоростью для каждого из трех CTLA4. Эта информация дополнительно указывает на то, что антитела изобретения 4.1.1 и 11.2.1 связываются с различными эпитопами CTLA4. Для дальнейшего изучения эпитопа, с которым связываются антитела изобретения категории В и С,заявители провели определенное исследование по сайт-направленному мутагенезу. В CTLA4 мартышки содержится две важных замены в остатках 105 и 106 по отношению CTLA4 человека. Такими различиями являются замена лейцина на метионин в положении 105 и глицина на серин в положении 106. Соответственно, заявители создавали мутацию кДНК, кодирующей CTLA4 человека, кодирующую мутантный CTLA4, с заменой L105M и G106S. Гомологичная замена в мутантном CTLA4 не влияла на связывание гибридного белка B7.2-IgG1. Кроме того, связывание с антителом изобретения 11.2.1 не изменялось. Однако способность такой молекулы связываться с антителом изобретения 4.1.1 (сходно с мартышками) значительно тормозилась. Далее, заявители вызывали мутацию кДНК, кодирующей CTLA4 мартышки,для создания мутантного CTLA4 мартышки, содержащего замену S106G. Такая замена приводила к восстановлению стабильного связывания антитела 4.1.1 и мутантного CTLA4 мартышки. Кроме того, заяви- 23006972 тели вызывали мутацию кДНК, кодирующей CTLA4 мартышки, для создания мутантного CTLA4 мартышки, содержащего замену M105L. Такая замена частично восстанавливала связывание антитела 4.1.1 с мутантным CTLA4. Каждая из категорий от В до D антител изобретения, по-видимому, обладает сходными функциональными свойствами и, очевидно, имеет возможность действовать как сильный терапевтический агент,направленный против CTLA4. Более того, каждая из молекул характеризуется определенной перекрестной конкуренцией при связывании с CTLA4. Однако, как должно быть ясно из представленного выше обсуждения, каждая из молекул различных категорий, очевидно, взаимодействует с отдельными конформационными эпитопами CTLA4. Из изложенного выше должно быть понятно, что информация об эпитопах, обсуждаемая выше, указывает на то, что антитела (или другие молекулы, как обсуждалось выше), которые перекрестно конкурируют с антителами изобретения, должны, вероятно, иметь определенный терапевтический потенциал в соответствии с настоящим изобретением. Более того, ожидается, что антитела (или другие молекулы, как обсуждалось выше), которые перекрестно конкурируют с антителами изобретения (т.е. перекрестно конкурируют с категорией В, С и/или D антител), должны, вероятно, иметь определенный дополнительный терапевтический потенциал в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, ожидается, что антитела (или другие молекулы, как обсуждалось выше), которые перекрестно конкурируют с антителами изобретения (т.е. перекрестно конкурируют с категорией В, С и/или D антител) и которые (i) не характеризуются пониженным связыванием с CTLA4 мартышек (подобно антителу 11.2.1) или (ii) характеризуются пониженным связыванием с CTLA4 мартышек (подобно антителу 4.1.1), должны, вероятно, иметь определенный дополнительный терапевтический потенциал в соответствии с настоящим изобретением. Антитела (или другие молекулы, как обсуждалось выше), которые конкурируют с категориями А и Е,могут также иметь определенный терапевтический потенциал. Примеры Следующие примеры, включая проведенные эксперименты и достигнутые результаты, предлагаются лишь для целей иллюстрации, и их не следует толковать как ограничивающие настоящее изобретение. Пример 1. Создание гибридом, продуцирующих антитела против CTLA-4. Антитела изобретения получали, отбирали и анализировали в соответствии с настоящим примером. Получение антигена. Для иммунизации мышей XenoMouse получали три различных иммуногена: (i) гибридный белокCTLA-4 (Y201V), который конститутивно экспрессировался на клеточной поверхности.(i) гибридный белок CTLA-4-IgG. Конструирование экспрессионного вектора. кДНК, кодирующую зрелый внеклеточный домен CTLA-4, амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки кДНК тимуса (Clontech) с применением праймеров, разработанных в соответствии с опубликованной последовательностью (Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988. Фрагмент направленно субклонировали в pSR5, экспрессионную плазмиду вируса Sindbis (InVitrogen), с локализацией между сигнальным пептидом онкостатина М человека и доменами СН 1/СН 2/СН 3 IgG gamma 1 (IgG1) человека. Гибридный белок не содержит шарнирного домена, но содержит цистеин-120 во внеклеточном домене CTLA-4 для образования ковалентного димера. Полученный вектор был назван CTLA-4-IgG1/pSR5. Цельность кДНКCTLA-4-IgG1 в векторе была подтверждена секвенированием обеих цепей. Аминокислотная последовательность белка CTLA4-Ig показана ниже. Зрелый внеклеточный домен для CD44 амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки лимфоцитов человека (Clontech) и субклонировали в pSinRepS для получения контрольного белка с идентичной IgG1-концевой частью. Подчеркнуто: сигнальный пептид Жирный шрифт: внеклеточный домен CTLA4- 24006972 кДНК зрелого внеклеточного домена CD28 амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки лимфоцитов человека (Clontech) и затем субклонировали в pCDM8 (J. Immunol. 151:5261-71 (1993 для получения гибридного белка IgG1, содержащего область расщепления тромбином и шарнирную область.CTLA4 мартышки, длиннохвостой макаки и макаки-резус клонировали, исходя из мРНК, выделенной из РHА, стимулированных PBMCs с применением стандартных способов ПЦР с вырожденными праймерами. Секвенирование показало, что аминокислотная последовательность у макаки-резус и длиннохвостой макаки идентична зрелому внеклеточному домену CTLA4 человека с тремя заменами (S13N, I17T иL105M). У мартышки обнаружено десять аминокислотных замен по сравнению со зрелым внеклеточным доменом CTLA4 человека (V21A, V33I, А 41 Т, A51G, 54I, S71F, Q75K, Т 88 М, L105M и G106S). Для картирования аминокислот, важных для взаимодействия антител с CTLA4-IgG человека, применяли сайтнаправленный мутагенез для создания точечных мутаций всех аминокислот, отличающихся у CTLA4 мартышки. Мутации CTLA-IgG человека и мартышки для эпитопного картирования проводили путем установления соответствий сайт-направленного мутагенеза (Promega). Гибридные белки IgG получали импульсной трансфекцией клеток Cos7 и очищали с помощью стандартных способов с применением протеина А. Мутантные белки CTLA4-IgG оценивали по связыванию с антителами с помощью иммуноблоттинга и с применением анализов BIAcore. Экспрессия/очистка рекомбинантного белка. Рекомбинантный вирус синдбис получали электропорацией (Gibco) клеток почек новорожденных хомячков с SP6 транскрибированными in vitro мРНК CTLA-4-IgG1/pSR5 и хелперной мРНК DH26S, как описано в инструкции InVitrogen. Через 48 ч вирус собирали и титровали на оптимальную экспрессию белка в клетках яичников китайского хомячка (СНО-К 1). Клетки СНО-К 1 культивировали в суспензии в среде DMEM/F12 (модифицированной по Дульбекко среде Игла), содержащей 10% термоинактивированной телячьей плодной сыворотки (Gibco), заменимые аминокислоты (Gibco), 4 мМ глутамин (Gibco), пенициллин/стрептомицин (Gibco), 10 мМ Hepes pH 7,5 (Gibco). Для получения CTLA-4IgGl клетки СНО-К 1 ресуспендировали в концентрации 1 х 107 клеток/мл в среде DMEM/F12 и инкубировали с вирусом синдбис в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки затем разводили до 1 х 106/мл средой DMEM/F12, содержащей 1% телячьей плодной сыворотки, истощенной в отношении IgG коровы с помощью протеин А сефарозы (Pharmacia), заменимые аминокислоты, 4 мМ глутамин, 12,5 мМ HepespH 7,5 и пенициллин/стрептомицин. Через 48 ч после инъекции клетки осаждали, собирали кондиционированную среду, добавляли таблетки полного протеазного ингибитора (Boeringer Mannheim), доводилиpH до 7,5 и фильтровали через фильтр 0,2 мкм (Nalgene). Для аффинной очистки гибридного белка использовали FPLC (жидкостную хроматографию быстрого разрешения) (Pharmacia) со скоростью тока 10 мл/мин. Колонку промывали 30 объемами ЗФР и элюировали 0,1 М глицин/НСl pH 2,8 со скоростью 1 мл/мин. Фракции (1 мл) немедленно нейтрализовали до pH 7,5 с помощью Tris, pH 9. СодержащиеCTLA-4-IgG1 фракции идентифицировали с помощью ДДС-ПАГЭ и затем концентрировали с применением Centriplus 50 (Amicon) перед нанесением на колонку сефарозы 200 (Pharmacia) со скоростью 1 мл/мин с использованием в качестве растворителя ЗФР. Содержащие CTLA-4-IgG1 фракции объединяли, стерилизовали фильтрованием через фильтр 0,2 мкм (Millipore), делили на аликвоты и замораживали при -80 С. CD44-IgG1 экспрессировали и очищали с применением тех же способов. CD28-IgG очищали из кондиционированной среды от клеток Cos7, подвергнутых импульсной трансфекции. Характеристика CTLA-4-IgG1. Очищенный CTLA-4-IgG1 двигался в виде единственной полосы при электрофорезе в ДДС-Nа-ПАГ при использовании для окрашивания коллоидного кумасси (Novex). В невосстанавливающих условияхCTLA-4-IgG1 находился в форме димера (100 кДа), который восстанавливался до мономера 50 кДа после обработки 50 мМ DTT (дитиотреитола). Аминокислотное секвенирование очищенного CTLA-4-IgG1 в растворе подтвердило наличие N-конца CTLA-4 (MHVAQPAVVLAS), а также отщепление сигнального пептида онкостатина М от зрелого гибридного белка. CTLA-4-IgG1 связывался с иммобилизованнымB7.1-IgG в зависимости от концентрации, и связывание блокировалось антителом хомячка против CTLA4 человека (BNI3: PharMingen). Стерильный CTLA-4-IgG1 не содержал эндотоксина, и его количественно определяли по ОП 280 с применением коэффициента экстинкции 1,4. Выход очищенного CTLA-4IgG1 варьировал между приблизительно 0,5 и 3 мкг/л клеток СНО-К 1.NMP, N-метилпирролидон; TFE, 2,2,2-трифторэтанол; DCM, дихлорметан; FMOC, флуоренилметоксикарбонил. Все реактивы были поставлены Perkin Elmer за следующими исключениями: TFE,Aldrich Chemical, смола FMOC-PAL-PEG, Perseptive Biosystems. Для аминокислот, для которых требовались защитные группы боковых цепей, применяли Fmoc-Arg(PMC)-ОН, FMOC-Asn(Trt)-ОН, FMOCAsp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-ОН, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOCLys(BOC)-OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH и FMOC-Tyr(tBu)-ОН. Синтез пептида. Пептидный синтез проводили в аппарате Perkin-Elmer 431A, снабженном системой обратного мониторинга через поглощение в УФ при 301 нм (детектор Perkin-Elmer Model 759A). Пептидную последовательность собирали на смоле FMOC-PAL-PEG с применением кондиционных циклов с двойным присоединением. Принудительные двойные присоединения проводили в циклах 10, 11, 18, 19, 20 и с 28 по 33. Смолу промывали 50% смесью DCM и TFE по завершении каждого цикла ацилирования с последующим кепированием непрореагировавших аминогрупп уксусным ангидридом в NMP. Смолу удаляли из реактора после завершения цикла 49, а остаток оставляли до завершения реакции. Отделение пептида от смолы проводили с помощью реактива К (King et al., International Journal of Protein and Peptide Research 36:255-266 (1990 в течение 6 ч с применением 415 мг смoлы, что дало 186 мг сырого пептидаCTLA-4. Характеристика пептида. 25 мг aликвоты сырого пептида CTLA-4 растворяли в 5 мл 6 М гуанидин-HCl/100 мМ К 2 РО 3 при рН 6,4 и элюировали с колонки Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 (16 мм х 600 мм, объем слоя 120 мл) 2 М гуанидин-HCl/100 мМ К 2 РО 3 при рН 6,4 со скоростью 2 мл/мин в течение 180 мин при объеме собираемых фракций 5 мл. Фракции анализировали нанесением 1,7 мкл фракций на Nu-ПАГ для электрофореза по Laemeli, проводимого с применением буфера MES, с визуализацией окраской серебром согласно описанию Daichii. Фракции с молекулярным весом 12 кДа, оцененным по стандартам молекулярного веса, объединяли и хранили при 4 С. Объединенные фракции анализировали с помощью УФ и электрофореза в геле. Аминокислотное секвенирование проводили с помощью абсорбции 100 мкл образца патроном ProSorb (абсорбция мембраной PVDF) с промывкой для удаления солей буфера. Секвенирование проводили на аппарате Applied Biosystems 420. Выявлена ожидаемая N-концевая последовательность(MHVAQPAVVLA). С помощью иммуноблоттинга показано, что пептид узнается BNI3 против CTLA-4 человека (PharMingen). Для удаления соли аликвоту, содержащую 648 мкг материала, помещали в диализную трубку 3500 Da MWCO и диализовали против 0,1% ТФУ/Н 2O при 4 С в течение 9 дней при перемешивании. Все содержимое диализного мешочка лиофилизировали до получения порошка.(iii) Клетки 300.19, трансфецированные CTLa-4 (Y201V). Полноразмерную кДНК CTLA-4 амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки кДНК тимуса человека (Stratagene) и субклонировали в pIRESneo (Clontech). Мутацию CTLA-4, приводящую к конститутивной экспрессии на клеточной поверхности, вводили с помощью MatchMaker Mutagenesis System(Promega). Мутация, вызывающая замену тирозина Y201 на валин, тормозит связывания адаптинового белка АР 50, ответственного за быструю интернализацию CTLA-4 (Chuang et al., J. Immunol. 159:144-151(1997. Свободные от микоплазмы лимфомные клетки 300.19 мыши культивировали в среде RPMI-1640,содержащей 10% плодной сыворотки телят, заменимые аминокислоты, пенициллин/стрептомицин, 2 мМ глутамина, 12,5 мМ Hepes рН 7,5 и 25 мкМ бета-меркаптоэтанола. Клетки электропорировали (3x106/0,4 мл бессывороточной среды RPMI) в 1 мл камере с 20 мкг CTLA-4-Y201V/pIRESneo при 200 в/1180 мкф(Gibco CellPorator). Клетки оставляли на 10 мин и затем добавляли 8 мл предварительно нагретой средыRPMI. Через 48 ч клетки разводили до концентрации 0,5 х 106/мл в полной среде RPMI, содержащей 1 мг/мл G418 (Gibco). С помощью антитела BNI3, конъюгированного с фикоэритрином (PharMingen) было показано, что размноженные резистентные клетки экспрессируют CTLA-4 на клеточной поверхности. С применением стерильной сортировки были выделены клетки с высоким уровнем экспрессии. Иммунизация и получение гибридом. Мышей XenoMouse (в возрасте от 8 до 10 недель) иммунизировали (i) подкожно в основание хвоста 1 х 107 клетками 300.19, которые были трансфецированы, как описано выше для экспрессии CTLA-4, ресуспендированными в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР) с полным адъювантом Фрейнда,или (ii) подкожно в основание хвоста (а) 10 мкг гибридного белка CTLA-4 или (b) 10 мкг белка CTLA-4,эмульгированного с полным адъювантом Фрейнда. В каждом случае введение дозы повторяли 3 или 4 раза с неполным адъювантом Фрейнда. За 4 дня до проведения слияния мышам вводили последнюю инъекцию иммуногена или клеток в ЗФР. Лимфоциты селезенки и/или лимфатических узлов иммунизированных мышей сливали с линией клеток РЗ несекретирующей миеломы мышей и подвергали селекцииHAT, как описано ранее (Gafre, G. and Milstein, С., "Preparation of monoclonal antibodies: strategies andprocedures", Methods Enzymol., 73:3-46 (1981. Был выявлен широкий набор гибридом, все из которых секретировали специфичные в отношении CTLA-4 антитела человека IgG2 или IgG4 (как определено ниже).ELISA анализ. Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA анализ) для определения антител, специфичных в отношении антигена, в сыворотке мышей и супернатантах гибридом проводили, как описано (Coliganet al., Unit 2.1, '"Enzyme-linked immunosorbent assays" in Current protocols in immunology (1994, с применением гибридного белка CTLA-4-Ig для захвата антител. В случае животных, иммунизированных гибридным белком CTLA-4-Ig, заявители проводили дополнительный скрининг на предмет неспецифической реакции против человеческой Ig части гибридного белка. Это делали с применением планшет дляELISA, покрытых IgG1 человека, в качестве отрицательного контроля на специфичность. В предпочтительном ELISA анализе применяли следующие методы. Планшеты для ELISA покрывают 100 мкг/лунку антигена в буфере для покрытия планшета (0,1 М углекислый буфер, рН 9, 6 и NаНСО 3 (м.в. 84) 8,4 г/л). Затем планшеты инкубируют при 4 С в течение ночи. После инкубации буфер для покрытия удаляют, планшет блокируют 200 мкл/лунку блокирующего буфера (0,5% БСА, 0,1% твин-20, 0,01% Thimerosal в 1 х ЗФР) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. В другом варианте планшеты хранят в холодильнике с блокирующим буфером в герметичной упаковке планшета. Блокирующий буфер удаляют и добавляют 50 мкл/лунку супернатанта гибридомы, сыворотки или другого супернатанта гибридомы (положительный контроль) и среды HAT или блокирующего буфера (отрицательный контроль). Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. После инкубации планшет промывают буфером для промывки (1 х ЗФР). Выявляющее антитело(т.е. антитело мыши против человеческого IgG2-HRP (SB, 9070-05) для антител IgG2 или антитело мыши против человеческого IgG4-HRP (SB, 9200-05) для антител IgG4) добавляют в количестве 100 мкл/лунку(антитело мыши против человеческого IgG2-HRP 1:2000 или антитело мыши против человеческого IgG4HRP 1:1000 (каждое из которых разведено блокирующим буфером. Планшеты инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч и затем промывают буфером для промывки. После этого в лунки добавляют по 100 мкл/лунку свежеприготовленного проявляющего раствора (10 мл буфера для субстрата, 5 мгOPD (о-фенилендиамин, Sigma Cat. No. P-7288) и 10 мкл 30% H2O2 (Sigma. Планшеты оставляют на 1020 мин для развития окраски до момента, когда в лунках отрицательного контроля едва начинает появляться окраска. После этого добавляют 100 мкл/лунку останавливающего раствора (2 М H2SO4) и считывают показания с помощью планшетного ридера для ELISA при длине волны 490 нм. Определение констант сродства цельных Mabs человека с помощью BIAcore: измерение сродства очищенных моноклональных антител человека, Fab фрагментов или супернатантов гибридом с помощью плазменного резонанса, проводимого с применением аппарата BIAcore 2000, следуя общим процедурам,очерченным производителем. Кинетический анализ антител проводили с применением антигенов, иммобилизованных на сенсорной поверхности при низкой плотности. Гибридный белок CTLA-4-Ig иммобилизовали на трех поверхностях сенсорных чипов BIAcore при плотности, варьирующей от приблизительно 390 до 900, с применением гибридного белка CTLA-4-Ig в концентрации 20 или 50 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия при рН 5,0 с применением аминосоединяющего набора, поставляемого производителем (BIAcore, Inc.). На четвертой поверхности сенсорного чипа BIAcore был иммобилизован IgG1 (900 RU), и ее применяли в качестве поверхности отрицательного контроля для неспецифического связывания. Кинетический анализ проводили при скорости тока 25 или 50 мкл/мин, а скорости диссоциации (Кd или Koff) и ассоциации (Ка или Коn) определяли с применением программы, предоставляемой производителем (BIA evaluation 3.0),которая обеспечивает выполнение общеприменимых расчетов. Пример 2. Измерение сродства антител против CTLA-4. В следующей таблице представлены результаты измерения сродства для некоторых антител, выбранных этим способом.- 28006972 Как будет рассмотрено, антитела, полученные в соответствии с изобретением, обладают высоким сродством и константами связывания. Пример 3. Структура антител против CTLA-4, полученных в соответствии с изобретением. В следующем обсуждении предлагаются сведения о структуре антител, полученных в соответствии с изобретением. Для анализа структуры антител, полученных в соответствии с изобретением, заявители клонировали гены, кодирующие фрагменты тяжелой и легкой цепи вне конкретной гибридомы. Клонирование и секвенирование генов проводили следующим образом. Поли(А)+ мРНК выделяли из приблизительно 2 х 105 гибридомных клеток, полученных от иммунизированных мышей XenoMouse с применением набора Fast-Track (Invitrogen). Получение кДНК с помощью случайных затравок осуществляли с помощью ПЦР. Специфичные в отношении вариабельной области семейств VH человека или V человека праймеры (Marks et al., "Oligonucleotide primers for polymerase chainprobes", Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991 или универсальный праймер VH человека, MG-30(CAGGTGCAGCTGGAGCAGTCIGG), применяли в сочетании с праймерами, специфичными для константной области С 2 человека (MG-40d; 5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3'), или константной области С (hP2; как описано ранее у Green et al., 1994). Последовательности транскриптов производных Mabs человека тяжелой и легкой каппа-цепей гибридом получали прямым секвенированием продуктов ПЦР, полученных из поли (А+) РНК с применением описанных выше праймеров. Продукты ПЦР клонировали также в pCRII с применением набора для клонирования ТА (Invitrogen), и обе цепи секвенировали с применением наборов для секвенирования Prizm dye-terminator и аппарата для секвенирования ABI377. Все последовательности анализировали путем сравнения с "V BASE sequence directory"(Tomlinson et al., MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) с применением компьютерных программ MacVector и Geneworks. Далее, каждое из антител 4.1.1, 4.8.1, 11.2.1 и 6.1.1 подвергали полноразмерному секвенированию ДНК. Для каждого секвенирования выделяли поли(А)+ мРНК из приблизительно 4 х 106 гибридомных клеток с применением набора mRNA Direct kit (Dynal). мРНК подвергали обратной транскрипции с применением олиго-dТ (18) и набора Advantage RT/PCR kit (Clonetech). Для создания праймеров амплификации, начиная со стартового сайта ATG гена DP50 тяжелой цепи (5'TATCTAAGCTTCTAGACTCGACCGCCACCATGGAGTTTGGGCTGAGCTG-3') и кончая стоп-кодоном константной области IgG2 (5'-TTCTCTGATCAGAATTCCTATCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGCT3'), использовали банк данных для вариабельной области (V Base). К 5'-концу стартового сайтаATG присоединяли оптимальную последовательность Kozak (ACCGCCACC). Тот же способ применяли для создания праймера для стартового сайта ATG гена А 27 каппа-цепи (5'TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGAAACCCCAGCGCAG-3') и стоп-кодона константной области каппа (5'-TTCTTTGATCAGAATTCTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3'). кДНК 012 клонировали с применением праймера к стартовому сайту ATG (5'TCTTCAAGCTTGCCCGGGCCCGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCT-3') и описанного выше праймера к стоп-кодону константной области каппа. кДНК тяжелой цепи клонировали также в виде геномных конструкций с помощью сайт-направленного мутагенеза для введения сайта NheI в конце вариабельного домена J и субклонирования содержащих фрагмент NheI геномных областей IgG2CH1/Hinge/CH2/CH3. Точечная мутация для создания сайта NheI не нарушает аминокислотной последовательности исходной линии. Для амплификации кДНК применяли пары праймеров с использованием набора Advantage High Fidelity PCR Kit (Clonetech). Последовательность продукта ПЦР определяли прямым секвенированием с помощью наборов Dye-terminator sequencing kits и аппарата для секвенированияABI. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионные векторы глутаминсинтазы рЕЕ млекопитающих(Lonza) и три клона секвенировали для подтверждения соматических мутаций. Для каждого клона последовательность бала проверена для обеих цепей в, по меньшей мере, трех реакциях. Негликозилированное антитело 4.1.1 было получено сайт-направленным мутагенезом N294Q в домене СН 2. Рекомбинантные антитела получали преходящей трансфекцией клеток Cos7 в лишенной IgG FCS и очищали с помощью стандартных способов с применением протеин А-сефарозы. Стабильные трансфектанты получали электропорацией мышиных клеток NSO и селекцией в лишенной глутамина среде. Рекомбинантное антитело 4.1.1 с гликозилированием или без него проявляло одинаковые специфичность и сродство к CTLA4 в тестах ELISA и BIAcore in vitro. Анализ использования гена. В следующей таблице представлены данные по использованию гена, полученные для отдельных клонов гибридомы в соответствии с изобретением.- 29006972 Таблица 2 Использование генов тяжелой и легкой цепей Как будет рассмотрено ниже, антитела в соответствии с настоящим изобретением получают с сильным смещением в сторону использования вариабельной области тяжелой цепи DP50. Ген DP-50 обозначают также как ген семейства VH 3-33. Лишь в случае одного антитела, которое было отобрано на основе связывания CTLA-4 и предварительных функциональных тестов in vitro, было показано использование гена тяжелой цепи, отличного от DP-50. В этом клоне, 2.1.3, используется вариабельная область тяжелой цепи DP-65, и он относится к изотипу IgG4. Ген DP-65 обозначают также как ген семейства VH 4-31. С другой стороны, клон 4.9.1, который содержит вариабельную область тяжелой цепи DP-47, связывается сCTLA-4, но не тормозит связывание с В 7-1 или В 7-2. У мышей XenoMouse имеется не более 30 различных функциональных вариабельных генов тяжелой цепи, с участием которых образуются антитела. Таким образом, смещение служит показателем предпочтительного мотива связывания при взаимодействии антитело-антиген в отношении объединенных свойств связывания с антигеном и функциональной активности. Мутационный анализ. Как будет рассмотрено ниже, анализ использования генов дает лишь ограниченное представление о структуре антител. Поскольку В-клетки животных XenoMouse стохастически производят транскрипты тяжелой V-D-J или легкой V-J каппа-цепей, имеется ряд вторичных процессов, включая, но, не ограничиваясь этим, соматическую гипермутацию, n-добавки и расширения CDR3. Смотри, например, Mendezet al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) и заявку на патент США 08/759620, зарегистрированную 3 декабря 1996 г. Соответственно, для дальнейшей оценки структуры антител получали предсказываемые аминокислотные последовательности антител на основании кДНК, полученных из клонов. Кроме того,путем секвенирования белка получали N-концевые аминокислотные последовательности. На фиг. 1 представлены нуклеотидные и предсказанные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой каппа-цепей клонов 4.1.1 (фиг. 1 А) , 4.8.1 (фиг. 1 В), 4.14.3 (фиг. 1 С), 6.1.1 (фиг. 1D), 3.1.1(фиг. 1 Е), 4.10.2 (фиг. 1F), 2.1.3 (фиг. 1G), 4.13.1 (фиг. 1 Н), 11.2.1 (фиг. 1I), 11.6.1 (фиг. 1J) , 11.7.1 (фиг. 1 К),12.3.1.1 (фи. 1L) и 12.9.1.1 (фиг. 1 М). На фиг. 1 А, 1 В и 1D расширенные последовательности антител 4.1.1, 4.8.1 и 6.1.1 были получены клонированием полноразмерных кДНК, как описано выше. На этих фигурах сигнальные пептидные последовательности обозначены жирным шрифтом, а последовательности, используемые для 5'ПЦP-реакции, подчеркнуты. На фиг. 2 представлено сравнение последовательностей предсказанной аминокислотной последовательности тяжелой цепи клонов 4.1.1, 4.8.1, 4.14.3, 6.1.1, 3.1.1, 4.10.2, 4.13.1, 11.2.1, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1 и 12.9.1.1 и аминокислотной последовательностью родительской линии DP-50 (3-33). Различия между последовательностью родительской линии DP-50 и той же последовательностью в клонах обозначены жирным шрифтом. На фигуре также указаны положения последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 антител в виде затенений.