Химерные вирусы, представляющие неприродные поверхностные белки, и их применение

ХИМЕРНЫЕ ВИРУСЫ, ПРЕДСТАВЛЯЮЩИЕ НЕПРИРОДНЫЕ ПОВЕРХНОСТНЫЕ БЕЛКИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Настоящее изобретение относится к химерным вирусам, содержащим негативную нить РНК,которые делают возможной иммунизацию индивида, например птицы, против двух инфекционных агентов, используя один химерный вирус по настоящему изобретению. В частности, настоящее изобретение относится к химерным вирусам гриппа, разработанным таким образом, что они экспрессируют и встраивают в свои вирионы слитый белок, содержащий эктодомен белка инфекционного агента и трансмембранный и цитоплазматический домены белка вируса гриппа. Такие химерные вирусы индуцируют иммунный ответ против вируса гриппа и инфекционного агента. Настоящее изобретение также относится к химерным вирусам псевдочумы птиц (NDV),разработанным таким образом, что они экспрессируют и встраивают в свои вирионы слитый белок,содержащий эктодомен белка инфекционного агента и трансмембранный и цитоплазматический домены белка NDV. Такие химерные вирусы индуцируют иммунный ответ против NDV и инфекционного агента.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: МАУНТ СИНАЙ СКУЛ ОФ МЕДСИН 016217 Область техники Настоящее изобретение относится к химерным вирусам, содержащим негативную нить РНК, которые делают возможной иммунизацию индивида, например птицы, против двух инфекционных агентов,используя один химерный вирус по настоящему изобретению. В частности, настоящее изобретение относится к химерным вирусам гриппа, разработанным таким образом, что они экспрессируют и включают в свои вирионы слитый белок, содержащий эктодомен белка инфекционного агента и трансмембранный и цитоплазматический домены белка вируса гриппа. Такие химерные вирусы индуцируют иммунный ответ против вируса гриппа и инфекционного агента. Настоящее изобретение также относится к химерным вирусам псевдочумы птиц (NDV), разработанным так, что они экспрессируют и включают в свои вирионы слитый белок, содержащий эктодомен белка инфекционного агента и трансмембранный и цитоплазматический домены белка NDV. Такие химерные вирусы индуцируют иммунный ответ противNDV и инфекционного агента. Предпосылки создания изобретения Ряд содержащих ДНК вирусов были генетически сконструированы таким образом, что направляют экспрессию гетерологичных белков в системах клеток-хозяев (например, вирус коровьей оспы, бакуловирус и т.п.). Недавно аналогичный прогресс был достигнут с вирусами, содержащими позитивную нить РНК, (например, полиовирусом). Полагают, что продукты экспрессии этих конструкций, т.е. продукт гетерологичного гена или химерный вирус, экспрессирующий продукт гетерологичного гена, могут быть эффективны для композиций вакцин (или субъединичных, или цельно-вирионных вакцин). Одним из недостатков использования вирусов, таких как вирус коровьей оспы, для конструирования рекомбинантных или химерных вирусов для применения в вакцинах является отсутствие вариабельности его основных эпитопов. Отсутствие вариабельности вирусных штаммов сильно ограничивает повторное использование химерного вируса коровьей оспы, поскольку множественные вакцинации создадут устойчивость хозяина к штамму, так что инокулированный вирус не может инфицировать хозяина. Иммунизация устойчивого индивидуума химерным вирусом коровьей оспы, таким образом, не будет индуцировать ответ иммунной системы. Напротив, вирусы, содержащие негативную нить РНК, являются привлекательными кандидатами для конструирования химерных вирусов, используемых в вакцинах. Вирусы, содержащие негативную нить РНК, например вирус гриппа, являются желательными, поскольку их широкая генетическая вариабельность делает возможным конструирование огромного набора композиций вакцин, которые стимулируют иммунитет без риска развития устойчивости. 2.1. Вирусы, содержащие негативную нить РНК Семейства вирусов, содержащих покрытую оболочкой однонитевую РНК негативного смыслового генома, классифицируют в группы, имеющие несегментированные геномы (Paramyxoviridae, Rhabdoviridae) или имеющие сегментированные геномы (Orthomyxoviridae, Bunyaviridae и Arenaviridae). СемействаParamyxoviridae и Orthomyxoviridae подробно описаны ниже и используются в примерах по настоящему изобретению. Семейство Paramyxoviridae состоит из вируса псевдочумы птиц (NDV), вируса парагриппа,вируса Сендай, обезьяньего вируса 5 и вируса эпидемического паротита. Семейство Orthomyxoviridae содержит вирусы гриппа типа А, В и С, а также вирусы Тогото и Дхори и вирус инфекционной анемии семговых. 2.1.1. Вирус гриппа Вирионы гриппа содержат внутреннее рибонуклеопротеиновое ядро (спиральный нуклеокапсид),содержащий однонитевой РНК-геном, и внешнюю липопротеиновую оболочку с внутренним покрытием из матриксного белка (M1). Сегментированный геном вируса гриппа А состоит из восьми молекул (для вируса гриппа С из семи) линейных однонитевых РНК негативной полярности, которые кодируют десять полипептидов, включающих белки РНК-зависимой РНК-полимеразы (РВ 2, РВ 1 и РА) и нуклеопротеин(NP), формирующих нуклеокапсид; матриксные мембранные белки (M1, M2); два поверхностных гликопротеина, выступающих из содержащей липид оболочки: гемаглютинин (НА) и нейраминидаза (NA),неструктурный белок (NS1) и белок ядерного экспорта (NEP). Транскрипция и репликация генома происходят в ядре, а сборка происходит через почкование в плазматической мембране. Вирусы могут перегруппировывать гены во время смешанной инфекции. Вирус гриппа адсорбируется на клетках посредством активности связывания НА с сиалилолигосахаридами в гликопротеинах и гликолипидах клеточной мембраны. После эндоцитоза вириона в клеточной эндосоме происходит конформационное изменение молекулы НА, облегчающее мембранное слияние, что, таким образом, запускает декапсидацию. Нуклеокапсид перемещается в ядро, где вирусная мРНК транскрибируется. Вирусная мРНК транскрибируется с помощью уникального механизма, в котором вирусная эндонуклеаза отщепляет кэппированный 5'-конец от клеточных гетерологичных мРНК,которые затем служат в качестве праймеров для транскрипции вирусной матричной РНК с помощью вирусной транскриптазы. Транскрипты терминируются в сайтах 15-22 оснований от концов их матриц, в которых последовательности олиго(U) действуют в качестве сигналов для добавления участков поли(А). Вирусные РНК-транскрипты затем перемещаются в клеточную мембрану и связываются с недавно транскрибированными трансмембранными вирусными белками. Затем NA отщепляет остатки сиаловой-1 016217 кислоты от углеводных составляющих гликопротеинов, связанных с мембранной, что приводит к упаковке и высвобождению из клетки потомства вируса. Из восьми вирусных молекул РНК, полученных таким образом, шесть являются моноцистронными информационными молекулами, которые непосредственно транслируются в белки, представляющие НА, NA, NP и вирусные полимеразные белки РВ 2, РВ 1 и РА. Другие два транскрипта подвергаются сплайсингу, при этом каждый дает две мРНК, которые транслируются с использованием различных рамок считывания с получением M1, M2, NS1 и NEP. Другими словами, восемь вирусных РНК-сегментов кодируют десять белков: девять структурных и один неструктурный. Краткое изложение генов вируса гриппа и их белковых продуктов представлено ниже в табл. 1. Таблица 1. РНК-сегменты генома вируса гриппа и распределения кодированияа Патогенность вирусов гриппа модулируется множеством вирусных факторов и факторов хозяина. Среди факторов хозяина, вовлеченных в борьбу с вирусной инфекцией, система интерферона типа I (IFN/) представляет мощный противовирусный врожденный защитный механизм, возникший относительно рано в эволюции эукариотических организмов (Garcia-Sastre, 2002, Microbes Infect 4: 647-55). Противовирусная система IFN/ включает три основных стадии: (i) обнаружение вирусной инфекции и секрецию IFN/; (ii) связывание IFN/ с его рецепторами и индукцию транскрипции стимулируемыхIFN/ генов и (iii) синтез противовирусных ферментов и белков. Большинство вирусов, однако, имеют приобретенную специфическую генетическую информацию, кодирующую молекулы антагонистовIFN/, которые эффективно блокируют одну или несколько стадий противовирусной системы IFN/. Вирусы гриппа А зкспрессируют неструктурный белок в инфицированных клетках, белок NS1 (описанный подробно ниже), который противодействует клеточному IFN/-ответу (Garcia-Sastre et al., 1998,Virology 252:324-30). 2.1.1.1. Высокопатогенный вирус птичьего гриппа В последние годы сообщалось об эпидемиях заболевания, вызванного высокопатогенным вирусом птичьего гриппа (HPAI), в Азии и Европе (Kawaoka et al., 2005, Natl. Rev. Microbiol. 3:591-600; Koopmanset al., 2004, Lancet 363:587-593). Эпидемии, в которые вовлечен вирус гриппа А, вирусы подтипа H5N1 иH7N7, приводили к летальным инфекциям домашней птицы и смерти ограниченного числа людей(Tweed et al., 2004, Emerg. Infec. Dis. 10:2196-2199). Один из последних вирусов H5N1 циркулировал среди домашней птицы в Китае в последние годы (Chen et al., 2005, Nature 436:191-192), и хотя первичными носителями этого вируса считаются мигрирующие птицы, полагают, что в увеличение географического распространения вносит вклад в передачу от инфицированной домашней птицы обратно мигрирующим птицам. В настоящее время вирус H5N1, появившийся из Азии, распространяется по Европе и Африке(Enserink, 2006, Science, 311:932). Показано, что оптовая выбраковка оказалась успешной стратегией искоренения эпидемий H5N1 в Гонконге в 1997 и Нидерландах в 2003 г. (Lipatov et al., 2004, J. Virol. 78:8951-8959). Поскольку человеческие жертвы недавних эпидемий HPAI имели близкий контакт с инфицированной домашней птицей, из этого следует, что профилактику межвидовой передачи вирусов птичьего гриппа (AIV) можно осуществить путем искоренения AIV у домашней птицы благодаря забою. Однако по экономическим и практическим причинам только уничтожение домашней птицы больше не считается предпочтительным методом контроля этого заболевания. Кроме того, по этическим и экологическим причинам выбраковка мигрирующих диких птиц считается неприемлемой практикой. НедавноOIE (Всемирная организация здоровья животных) и FAO (Продовольственная и сельскохозяйственная организация объединенных наций) рекомендовали рассматривать вакцинацию домашней птицы для контроля AIV. Кроме того, сообщалось, что вакцинация цыплят инактивированной Н 5-вакциной была успешной для прерывания передачи вируса в полевом исследовании (Ellis et al., 2004, Avian Pathol. 33:405412). Недавно в Китае вакцинация была принята в качестве составной части программы контроля AIV. Возможность того, что высокопатогенный штамм H5N1 может стать передаваемым от человека к человеку, выражается в терминах глобальной пандемии, при этом WHO не желает оценить общую смертность в случае рекомбинации вируса H5N1 в человеческую форму. Поэтому ясна необходимость в способе контроля инфекции H5N1 у сельскохозяйственного скота, от которого, как полагают, произошло наибольшее количество передач человеку. 2.1.2. Вирус псевдочумы птиц Вирус псевдочумы птиц представляет собой покрытый оболочкой вирус, содержащий линейный,однонитевой, несегментированный, негативный смысловой РНК-геном. Геномная РНК содержит гены в порядке 3'-N-P-M-F-HN-L, подробно описанном ниже. Геномная РНК также содержит лидерную последовательность на 3'-конце. Структурные элементы вириона включают вирусную оболочку, являющуюся липидной двухслойной оболочкой, происходящей из плазматической мембраны клетки. Из оболочки выступает гликопротеин, гемаглютинин-нейраминидаза (HN), обеспечивающий активность как гемаглютина (например, связывания с рецептором/слияния), так и нейраминидазы. Гликопротеин слияния (F), который также взаимодействует с вирусной мембраной, сначала продуцируется в виде неактивного предшественника, затем подвергается посттрансляционному расщеплению с образованием двух связанных дисульфидными связями полипептидов. Активный белок F вовлечен в проникновение NDV в клетки хозяина путем облегчения слияния вирусной оболочки с плазматической мембранной клетки хозяина. Матриксный белок (M) вовлечен в сборку вируса и взаимодействует как с вирусной мембраной, так и белками нуклеокапсида. Основной белковой субъединицей нуклеокапсида является нуклеокапсидный белок (N), придающий капсиду симметрию спирали. В ассоциации с нуклеокапсидом находятся белки Р и L. Полагают, что подвергаемый фосфорилированию фосфопротеин (Р) играет регуляторную роль в транскрипции и может быть вовлечен в метиллирование, фосфорилирование и полиаденилирование. Ген L, кодирующий РНКзависимую РНК-полимеразу, требуется для синтеза вирусной РНК вместе с белком Р. Белок L, занимающий почти половину кодирующей способности вирусного генома, является наибольшим из вирусных белков и играет важную роль как в транскрипции, так и репликации. Репликация всех вирусов, содержащих негативную нить РНК, в том числе NDV, осложнена отсутствием клеточного механизма, требуемого для репликации РНК. Кроме того, геном в виде негативной нити не может транслироваться непосредственно в белок, а должен сначала транскрибироваться в копию в виде позитивной нити (мРНК). Следовательно, после проникновения в клетку хозяина вирус не может синтезировать требуемую РНК-зависимую РНК-полимеразу. При инфицировании вместе с геномом в клетку должны попасть белки L, Р и N.-3 016217 Была выдвинута гипотеза, что большинство или все вирусные белки, транскрибирующие мРНКNDV, также осуществляют их репликацию. Механизм, с помощью которого регулируется альтернативное применение (т.е. транскрипция или репликация) одного и того же состава белков, не точно определен, но, по-видимому, в не него встроен избыток свободных форм одного или нескольких нуклекапсидных белков, в частности N. Непосредственно после проникновения вируса транскрипция инициируется белком L с использованием в качестве матрицы негативной нити РНК в нуклеокапсиде. Синтез вирусной РНК регулируется так, что во время транскрипции продуцируются моноцистронные мРНК. После транскрипции вторым существенным событием при инфицировании вирусами, содержащими негативную нить РНК, является репликация вирусного генома. Как и в случае других вирусов, содержащих негативную нить РНК, репликация генома вируса псевдочумы птиц (NDV) опосредуется специфичными в отношении вируса белками. Первыми продуктами репликативного синтеза РНК являются комплементарные копии (т.е. позитивной полярности) РНК генома NDV (кРНК). Эти плюс-нитевые копии (антигеномы) отличаются от транскриптов в виде плюс-нитевых мРНК по структуре их концов. В отличие от транскриптов в виде мРНК антигеномные кРНК не являются кэппированными и метиллированными на 5'-конце и не являются усеченными и полиаденилированными на 3'-конце. кРНК являются концевыми с их негативно-нитевыми матрицами и содержат всю генетическую информацию каждого сегмента геномной РНК в комплементарной форме. кРНК служат в качестве матриц для синтеза вирусных геномов в виде негативных нитей NDV (vPHK). Геномы в виде негативных нитей NDV(vPHK), так и антигеномы (кРНК) заключаются в капсид с помощью нуклеокапсидных белков; единственными не заключенными в капсиды разновидностями РНК являются вирусные мРНК. Для NDV местом репликации вирусной РНК является цитоплазма, которая также является местом транскрипции. Сборка вирусных компонентов, по-видимому, происходит в плазматической мембране клетки хозяина, и зрелый вирус высвобождается с помощью почкования. 2.2. Иммуногенные композиции Технология рекомбинантных ДНК и способы конструирования с использованием обратной генетики предоставляют уникальный подход к получению рекомбинантных вирусов, используемых в иммуногенных композициях. В частности, настоящее изобретение относится к способу конструирования содержащего негативную нить РНК вируса так, что он экспрессирует, или представляет не только природные вирусные антигены, то также любой антиген, который можно сконструировать так, чтобы он включался в белковую оболочку вируса. Особый интерес представляют антигены инфекционных организмов,отличных от вируса гриппа. Таким образом, можно разработать один вирус в качестве иммуногенного компонента, используемого для стимуляции, активации или индукции иммунного ответа, который бы предоставил защиту против по крайней мере двух патогенов. Такой химерный вирус можно подвергнуть дополнительной разработке, если необходимо модифицировать его вирулентность, т.е. так, чтобы он мог быть аттенуированным или дополнительно аттенуированным. Аттенуированные вирусы гриппа могут быть эффективны, поскольку являются иммуногенными и способны реплицироваться, но не являются патогенными. Считают, что живые вакцины индуцируют повышенную перекрестную клеточную цитотоксичность, а также гуморальный ответ, что обеспечивает лучшую защиту, чем инактивированные вакцины(Gorse and Belshe, 1990, J. Clin. Microbiol. 28:2539-2550; и Gorse et al., 1995, J. Infect. Dis. 172:1-10). Вовторых, вероятно, что в защитный иммунитет против вирусных заболеваний вовлечен IgA-ответ слизистых оболочек, который не отмечается при традиционных внутримышечных вакцинах (Nelson et al.,1998, Vaccine 16:1306-1313). Наконец, живые вакцины также имеют преимущество интраназального введения, которое исключает опухание и болезненность мышцы, иногда сопровождающих внутримышечное введение инактивированной вакцины, дополненной адъювантом. Сообщалось, что живые вакцины индуцируют не только гуморальные ответы против гомотипического вируса гриппа, но также перекрестную клеточную цитотоксичность. Таким образом, настоящим изобретением предлагается возможность разработки новых и более эффективных иммунных композиций, например композиций вакцин, для диагностики, профилактики, регулирования или лечения как вирусных, так и невирусных патогенов. 3. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к химерным вирусам, содержащим негативную нить РНК, разработанным для экспрессии слитых белков, которые включаются в вирион, к способам получения таких химерных вирусов и к применению таких вирусов, например в качестве иммуногенов, в иммуногенных композициях или в in vitro анализах. Химерные вирусы по настоящему изобретению характеризуются тем, что на поверхности вириона презентированы не только антигены, связанные с вирусом, но также слитых белков. Настоящее изобретение относится к химерным вирусам гриппа и химерным NDV, которые делают возможной иммунизацию индивида, например птицы или человека, против двух инфекционных агентов путем введения химерного вируса гриппа или химерного NDV. В одном из аспектов использование одного вируса для индукции иммунного ответа уменьшает частоту введения иммунизирующей компози-4 016217 ции. В другом аспекте использование одного вируса для индукции иммунного ответа снижает стоимость иммунизации индивидов. Более низкая стоимость иммунизации индивидов увеличивает вероятность того, что больше индивидов смогут иметь возможность подвергнуться иммунизации, и, следовательно,снижает затраты, связанные с лечением индивидов, страдающих инфекцией. Настоящее изобретение также относится к применению химерного вируса по настоящему изобретению в композициях (например, иммуногенных композициях) для людей или животных. В частности,химерные вирусы по настоящему изобретению можно использовать в качестве вакцин против широкого ряда вирусов и/или антигенов. Поскольку химерный вирус разрабатывается с целью экспрессии чужеродного эпитопа в вирионе, то композиции (например, композиции вакцин), содержащие химерный вирус по настоящему изобретению, могут быть предназначены для иммунизации против множества штаммовых вариантов, различных вирусов или против совершенно различных инфекционных агентов или связанных с заболеванием антигенов (например, бактерий, паразитов, грибов или специфичных в отношении опухолей антигенов). Можно использовать большое разнообразие способов введения композиций живых аттенуированных вирусов человеку или животному для индуцирования иммунного ответа или ответа с соответствующей продукцией цитокинов. К таким способам относятся, но ими не ограничиваются, интраназальный, интратрахиальный, пероральный, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный способы. Химерные вирусы по настоящему изобретению делают возможной иммунизацию индивида (например, птиц) против двух инфекционных заболеваний путем введения химерных вирусов. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения химерные вирусы по настоящему изобретению делают возможной иммунизацию птиц против вируса птичьего гриппа и вируса псевдочумы птиц путем введения химерного вируса по настоящему изобретению. Птиц можно легко иммунизировать опрыскиванием химерным вирусом или введением химерного вируса в водном растворе, таком как вода, которую они пьют. Настоящее изобретение основано отчасти на обнаружении, сделанном заявителями, что эффективный иммунный ответ против двух инфекционных агентов можно получить путем разработки вируса гриппа, экспрессирующего и включающего в свой вирион слитый белок, содержащий цитоплазматический и трансмембранный домены по крайней мере одного основного гликопротеина вируса и эктодомен белка второго инфекционного агента, причем слитый белок функционально замещает основной гликопротеин. В одном из аспектов встраивание слитого белка в вирион приводит к увеличению иммунного ответа на эктодомен второго инфекционного агента. Конструирование цитоплазматического и трансмембранного доменов основного гликопротеина вируса в слитом белке делает возможным встраивание слитого белка в вирион. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения основной гликопротеин представляет собой один из белков НА и/или NA вируса гриппа или оба эти белка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения основной гликопротеин представляет собой один из белков HN и F NDV, или оба эти белка. Функциональное замещение по крайней мере одного основного гликопротеина вируса исключает необходимость ограничивать размер вирусного генома (например, генома вируса гриппа). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения функциональное замещение по крайней мере одного основного гликопротеина вируса слитым белком ослабляет репликацию вируса у индивидов. Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему слитый белок, имеющий (i) эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, слитый с (ii) трансмембранным и цитоплазматическим доменами гликопротеина, кодируемого основным геном вируса гриппа, где слитый белок содержится в вирусе птичьего гриппа, в котором функция основного гена обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным вирусу птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген гемаглютинина (НА). В других вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген нейраминидазы (NA). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа является аттенуированным. В соответствии с этими вариантами осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа может быть аттенуирован мутацией в гене NS1. Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему слитый белок, имеющий (i) эктодомен белка HN NDV, слитый с (ii) трансмембранным и цитоплазматическим доменами белка NA вируса гриппа, где слитый белок содержится в вирусе птичьего гриппа, в котором функция белка NA обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным вирусу птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа является аттенуированным. В соответствии с этими вариантами осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа может быть аттенуирован мутацией в гене NS1. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любой тип, подтип или штамм вируса птичьего гриппа. Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный сегмент NA вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка-5 016217 считывания NA модифицирована так, что кодирующие эктодомен NA нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена нейраминидазы инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется N-концом, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа. Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный сегмент НА вируса гриппа, кодирующий слитый с гемаглютинином белок, в котором открытая рамка считывания НА модифицирована так, что кодирующие эктодомен НА нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен способного к слиянию/связывающегося с рецептором антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется С-концом, так что слитый с гемаглютинином белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа. Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент НА вируса гриппа, включающий (а) первую открытую рамку считывания,кодирующую белок гемаглютинин вируса птичьего гриппа, и (b) вторую открытую рамку считывания,кодирующую слитый с гемаглютинином белок, в которой кодирующие эктодомен гемаглютинина нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или кодирующими связанный с заболеванием антиген, который прикрепляется Сконцом, так что и гемаглютинин вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и включаются в химерный вирус птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения первую открытую рамку считывания сегмента НА химерного вируса птичьего гриппа модифицируют, удаляя содержащееся множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина. Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент NA вируса гриппа, включающий: (а) первую открытую рамку считывания,кодирующую белок нейраминидазу вируса птичьего гриппа, и (b) вторую открытую рамку считывания,кодирующую слитый с нейраминидазой белок, в которой кодирующие эктодомен нейраминидазы нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или кодирующими связанный с заболеванием антиген, который прикрепляется Nконцом, так что и нейраминидаза вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и включаются в химерный вирус птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа включает сегмент НА, имеющий открытую рамку считывания, модифицированную удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина. Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему упакованный сегмент NA вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка считывания NA модифицирована так, что кодирующие эктодомен NA нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена HN NDV, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в химерный вирус птичьего гриппа. Слитый с нейраминидазой белок обеспечивает химерный вирус птичьего гриппа активностью нейраминидазы. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению содержит упакованный сегмент гена NS1, кодирующий модифицированный белок NS1, который уменьшает антагонистическую в отношении клеточного интерферона активность вируса. Неограничивающие примеры мутаций в гене NS1, приводящих к модифицированному белку NS1, представлены в разделе 5.1.2. ниже. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например,рекомбинантным ДНК-молекулам), кодирующим сегмент NA химерных вирусов птичьего гриппа по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантным ДНК-молекулам), кодирующим сегмент НА химерных вирусов птичьего гриппа по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантным РНК-молекулам), кодирующим сегмент NA или сегмент НА химерных вирусов птичьего гриппа по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам размножения химерного вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению, включающим культивирование химерного вируса птичьего гриппа в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию вирусом птичьего гриппа. Настоящее изобретение также относится к способам получения иммуногенной композиции, включающим (а) размножение химерного вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию вирусом птичьего гриппа; и (b) сбор потомства вируса, причем вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, адекватных для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так что потомство вируса пригодно для применения в иммуногенных композициях, например композициях вакцин. Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему слитый белок, имеющий (i) эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, слитый с (ii) трансмембранным и цитоплазматическим доменами гликопротеина, кодируемого основным геном вируса гриппа, причем слитый белок содержится в аттенуированном вирусе гриппа, в котором-6 016217 функция основного гена обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственным аттенуированному вирусу гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген гемаглютинина (НА). В других вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном вируса гриппа является ген нейраминидазы (NA). Аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа может быть любым типом, подтипом или штаммом вируса гриппа. Например, аттенуированный химерный вирус гриппа может быть вирусом гриппа А, вирусом гриппа В или вирусом гриппа С. Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный сегмент NA вируса гриппа, кодирующий слитый с нейраминидазой белок, в котором открытая рамка считывания NA модифицирована так, что кодирующие эктодомен NA нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена нейраминидазы инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется N-концом, так что слитый с нейраминидазой белок экспрессируется и встраивается в аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус гриппа по настоящему изобретению содержит сегмент НА, имеющий открытую рамку считывания, модифицированную удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина. Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный сегмент НА вируса гриппа, кодирующий слитый с гемаглютинином белок, в котором открытая рамка считывания НА модифицирована так, что кодирующие эктодомен НА нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена гемаглютинина инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, который прикрепляется С-концом, так что слитый с гемаглютинином белок экспрессируется и встраивается в аттенуированный химерный вирус гриппа. Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент НА вируса гриппа, содержащий (а) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок гемаглютинин вируса гриппа, и (b) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с гемаглютинином белок, в которой кодирующие эктодомен гемаглютинина нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или кодирующими связанный с заболеванием антиген, который прикрепляется С-концом,так что и гемаглютинин вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и включаются в аттенуированный химерный вирус гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения первую открытую рамку считывания сегмента НА аттенуированного химерного вируса гриппа модифицируют с удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина. Настоящее изобретение относится к аттенуированному химерному вирусу гриппа, содержащему упакованный бицистронный сегмент NA вируса гриппа, содержащий (а) первую открытую рамку считывания, кодирующую белок нейраминидазу вируса гриппа, и (b) вторую открытую рамку считывания, кодирующую слитый с нейраминидазой белок, в которой кодирующие эктодомен нейраминидазы нуклеотиды заменены нуклеотидами, кодирующими эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или кодирующими связанный с заболеванием антиген, который прикрепляется N-концом,так что и нейраминидаза вируса гриппа, и слитый белок экспрессируются и содержатся в аттенуированном химерном вирусе гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус гриппа по настоящему изобретению содержит сегмент НА, имеющий открытую рамку считывания, модифицированную удалением содержащего множество основных аминокислот сайта расщепления гемаглютинина. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус гриппа по настоящему изобретению содержит упакованный сегмент гена NS1, кодирующий модифицированный белок NS1, который уменьшает антагонистическую, в отношении клеточного интерферона, активность вируса. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например,рекомбинантным ДНК-молекулам), кодирующим сегмент NA аттенуированных химерных вирусов гриппа по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к рекомбинантныммолекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантным ДНК-молекулам), кодирующим сегмент НА аттенуированных химерных вирусов гриппа по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот (например, рекомбинантным РНКмолекулам), кодирующим сегмент NA или сегмент НА аттенуированных химерных вирусов гриппа по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам размножения аттенуированного химерного вируса гриппа по настоящему изобретению, содержащим культивирование аттенуированного химерного вируса гриппа в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию вирусом гриппа. Настоящее изобретение также относится к способам получения иммуногенной композиции, включающим: (а) размножение аттенуированного химерного вируса гриппа по настоящему изобретению в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию аттенуированным вирусом гриппа; и (b) сбор потомства вируса, причем вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, адек-7 016217 ватных для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так что потомство вируса пригодно для применения в иммуногенных композициях, например композициях вакцин. Настоящее изобретение также относится к химерным вирусам NDV. В частности, настоящее изобретение относится к химерным NDV, включающим слитый белок, имеющий (i) эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от NDV, слитый с (ii) трансмембранным и цитоплазматическим доменами гликопротеина, кодируемого основным геном NDV, где слитый белок содержится в NDV, в котором функция основного гена обеспечивается слитым белком или природным гликопротеином, свойственнымNDV. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном NDV является ген, кодирующий белок F. В других вариантах осуществления настоящего изобретения основным геном NDV является ген, кодирующий белок HN. В соответствии с этим изобретением можно использовать любой тип, подтип или штамм NDV. Настоящее изобретение относится к химерному NDV, включающему упакованный геном, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, слитый с белком F, имеющий трансмембранный и цитоплазматический домены белка F и эктодомен антигена инфекционного агента, отличного от NDV, или связанного с заболеванием антигена, который прикрепляется С-концом, так что белок, слитый с белком F, экспрессируется и встраивается в химерный NDV. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения геном химерного NDV содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F, так что белок F экспрессируется и встраивается в химерный NDV помимо белка,слитого с белком F NDV. В других вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, слитый с белком F NDV, заменяет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F NDV, и белок, слитый с белком F, обеспечивает функцию белка F в химерном NDV. Настоящее изобретение относится к химерному NDV, содержащему упакованный геном, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, слитый с HN, имеющий трансмембранный и цитоплазматический домены белка HN и эктодомен антигена инфекционного агента, отличного отNDV, или связываемого с заболеванием антигена, который прикрепляется N-концом, так что белок, слитый с HN, экспрессируется и встраивается в химерный NDV. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения геном химерного NDV содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок HN, так что белок HN экспрессируется и встраивается в химерный NDV помимо белка, слитого с HN NDV. В других вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, слитый с HN, заменяет нуклеотидную последовательность, кодирующую белок HN NDV, и белок, слитый с HN, обеспечивает функцию белка HN в химерном NDV. Настоящее изобретение относится к рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим белок F или белок HN NDV. Настоящее изобретение относится к способам размножения химерного NDV по настоящему изобретению, содержащим культивирование химерного NDV в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию NDV. Настоящее изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции, включающему: (а) размножение химерного NDV по настоящему изобретению в яйце с эмбрионом или клеточной линии, чувствительной к инфицированию NDV; и (b) сбор потомства вируса, причем вирус выращивают до достаточных количеств и в условиях, адекватных для того, чтобы вирус был свободен от загрязнения, так чтобы потомство вируса могло бы использоваться в иммуногенных композициях, например композициях вакцин. Настоящее изобретение относится к яйцам с эмбрионами, включающим химерные вирусы по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к клеточным линиям, содержащим химерные вирусы по настоящему изобретению. Настоящее изобретение, кроме того, относится к иммуногенным композициям, содержащим химерные вирусы по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам индуцирования у индивида иммунного ответа на один, два или более инфекционных агента, содержащим введение эффективного количества химерного вируса гриппа по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является не являющееся человеком млекопитающее (например, свинья, лошадь, собака или кошка). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индивидом является птица. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу индуцирования иммунного ответа у птицы на один, два или более инфекционных агента, содержащему введение эффективного количества химерного вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам индуцирования у индивида иммунного ответа на один, два или более инфекционных агентов, включающим введение индивиду эффективного количества химерного NDV по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является не являющееся человеком млекопитающее (например, свинья, лошадь, собака или кошка). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индивидом является птица. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования им-8 016217 мунного ответа у птицы на один, два или более инфекционных агента, включающим введение птице эффективного количества химерного NDV по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам индуцирования у индивида иммунного ответа на один, два или более инфекционных агента, включающим введение индивиду эффективного количества аттенуированного химерного вируса гриппа по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является не являющееся человеком млекопитающее (например,свинья, лошадь, собака или кошка). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индивидом является птица. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способам индуцирования у человека иммунного ответа на один, два или более инфекционных агента, содержащим введение больному эффективного количества химерного вируса по настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится к способам индуцирования иммунного ответа на связанный с заболеванием антиген, включающим введение индивиду эффективного количества химерного вируса по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является птица. 3.1. Терминология Используемый в настоящем описании термин животное включает, но ими не ограничиваются,домашних животных (например, собак и кошек), животных зоопарка, животных ферм (например, жвачных, нежвачных, крупный рогатый скот и домашнюю птицу), диких животных и лабораторных животных (например, грызунов, таких как крысы, мыши и морские свинки, и кроликов) и животных, которых клонировали или модифицировали либо генетическим, либо другим способом (например, трансгенных животных). Используемый в настоящем описании термин приблизительно при использовании в отношении числа относится к любому числу в пределах 1, 5 и 10% указанного числа. Используемое в настоящем описании выражение аминоконец NS1 относится к аминокислотам Nконцевого аминокислотного остатка (аминокислотного остатка 1) по аминокислотный остаток 115, аминокислотные остатки с 1 по 100, аминокислотные остатки с 1 по 75, аминокислотные остатки с 1 по 50,аминокислотные остатки с 1 по 25 или аминокислотные остатки с 1 по 10 белка NS1 вируса гриппа. Делеции амино-конца могут включать делеции, состоящие из 5, предпочтительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155,160, 165, 170 или 175 аминокислотных остатков с N-конца NS1. Используемое в настоящем описании выражение карбоксильный конец NS1 относится к аминокислотам со 116 по карбоксиконцевой аминокислотный остаток, аминокислотам со 101 по карбоксиконцевой аминокислотный остаток, аминокислотам с 76 по карбоксиконцевой аминокислотный остаток,аминокислотам с 51 по карбоксиконцевой аминокислотный остаток или аминокислотам с 26 по карбоксиконцевой аминокислотный остаток белка NS1 вируса гриппа лошадиных, когда аминоконец NS1 представляет собой аминокислоты с 1 по аминокислотный остаток 115, аминокислоты с 1 по 100, аминокислоты с 1 по 75, аминокислоты с 1 по 50 или аминокислоты с 1 по 25, соответственно, белка NS1 вируса гриппа. Делеции карбоксиконца могут включать делеции, состоящие из 5, предпочтительно 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140,145, 150, 155, 160, 165, 170 или 175 аминокислотных остатков с карбоксиконца NS1. Используемые в настоящем описании взаимозаменяемо термины заболевание или нарушение относятся к состоянию индивида и охватывают, но ими не ограничиваются, пролиферативные заболевания (например, лейкоз, фиброз, карциному (в том числе злокачественную, незлокачественную, метастатическую и неметастатическую карциномы) и лимфому) и инфекции, вызванные инфекционным агентом(например, вирусом, бактерией, паразитом) и сопровождающие их состояние или симптом. Используемый в настоящем описании термин эпитоп относится к сайтам, фрагментам или району молекулы (например, полипептида или белка), имеющим антигенную или иммуногенную активность индивида. Эпитоп, имеющий иммуногенную активность, представляет собой сайт, фрагмент или район молекулы (например, полипептида или белка), который вызывает гуморальный ответ у индивида. Эпитоп, имеющий антигенную активность, представляет собой сайт, фрагмент или район молекулы, с которым антитело иммуноспецифически связывается, что можно определить любым способом, хорошо известным квалифицированному в данной области специалисту, например, с помощью иммунологических анализов. Используемый в настоящем описании термин фрагмент в контексте агента, подобного белку, относится к пептиду или полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность по крайней мере из 2 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 5 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 10 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 15 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 20 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 25 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 40 непрерывных амино-9 016217 кислотных остатков, по крайней мере из 50 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 60 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 70 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 80 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 90 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 100 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 125 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 150 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 175 непрерывных аминокислотных остатков, по крайней мере из 200 непрерывных аминокислотных остатков или по крайней мере из 250 непрерывных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности пептида, полипептида или белка. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фрагмент полноразмерного белка сохраняет активность полноразмерного белка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент полноразмерного белка не сохраняет активность полноразмерного белка. Используемый в настоящем описании термин фрагмент в контексте нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид или белок, относится к нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по крайней из 2 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 5 непрерывных нуклеотидов, по крайней 10 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 15 непрерывных нуклеотидов,по крайней мере из 20 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 25 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 30 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 35 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 40 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 50 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 60 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 70 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 80 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 90 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 100 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 125 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 150 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 175 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 200 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 250 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 300 непрерывных нуклеотидов, по крайней мере из 350 непрерывных нуклеотидов или по крайней мере из 380 непрерывных нуклеотидов последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, полипептид или белок. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент нуклеиновой кислоты кодирует пептид или полипептид, который сохраняет активность полноразмерного белка. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент полноразмерного белка не сохраняет активность полноразмерного белка. Термин гетерологичная последовательность, используемый в контексте агента, подобного белку,относится к молекуле, которая не встречается в природе в виде молекулы, связанной с основой химерного вируса или, в частности, гликопротеином химерного вируса. Термин гетерологичная последовательность в контексте последовательности нуклеиновой кислоты или молекулы нуклеиновой кислоты относится к молекуле, которая не встречается в природе в виде молекулы, связанной с геномом основы химерного вирусы. Используемый в настоящем описании термин иммуноспецифически связывает антиген и аналогичные термины относятся к молекулам, которые специфически связываются с антигеном и не специфически связываются с другой молекулой (например, специфичные в отношении антигена антитела содержат как модифицированные антитела (т.е. антитела, которые содержат модифицированный константный домен IgG (например, IgG1), или их FcRn-связывающий фрагмент (например, Fc-домен или шарнирная область - Fc-домен и немодифицированные антитела (т.е. антитела, которые не содержат модифицированный константный домен IgG (например, IgG1), или их FcRn-связывающий фрагмент (например, Fcдомен или шарнирная область - Fc-домен. Молекулы, специфически связывающие один антиген, могут перекрестно реагировать с родственными антигенами. Предпочтительно, чтобы молекула, специфически связывающая один антиген, не реагировала перекрестно с другими антигенами. Молекулу, специфически связывающую антиген, можно идентифицировать, например, с помощью иммунологического анализа, BIAcore и других методов, хорошо известных специалистам в данной области. Молекула, специфически связывает антиген, если она связывает указанный антиген с большим сродством, чем любой другой перекрестно реагирующий антиген, что определяется с использованием экспериментальных методов, таких как радиоиммуноанализы (RIA) и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Смотри, например, Paul, ed., 1989, Fundamental ImmunologySecond Edition, Raven Press, New York at pages 332-336, в отношении обсуждения, касающегося специфичности антител. Используемый в настоящем описании термин в комбинации в контексте назначения индивиду терапии(й) относится к применению более одного вида терапии (например, более одного профилактического средства и/или терапевтического средства). Использование термина в комбинации не ограничивает порядок, в котором терапию (например, профилактические и/или терапевтические средства) назначают индивиду (например, индивиду с инфекцией, вызванной вирусом гриппа, и вызванной NDV инфекцией или с сопровождающим их симптомом или состоянием или индивиду с другой инфекцией (например, другой вирусной инфекцией). Первый вид терапии (например, первое профилактическое или терапевтическое средство) можно назначать перед (например, за 5, 15, 30, 45 мин, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96- 10016217 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 12 недель) назначением второго вида терапии, одновременно с назначением второй терапии или после (например, через 5, 15, 30, 45 мин, 1, 2, 4, 6, 12, 24, 48, 72, 96 ч, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 или 12 недель) назначения второй терапии (например, второго профилактического или терапевтического агента) индивиду (например, индивиду с инфекцией, вызванной вирусом гриппа, вызванной NDV инфекцией или с сопровождающим их симптомом или состоянием, или с другой инфекцией (например,другой вирусной инфекцией. Используемое в настоящем описании выражение антагонистическая в отношении интерферона активность агента, подобного белку, относится к белку или полипептиду или их фрагменту, производному или аналогу, которые уменьшают или ингибируют иммунный ответ, в который вовлечен клеточный интерферон. В частности, белок или полипептид или их фрагмент, производное или аналог (например, NS1 вируса гриппа), обладающие антагонистической в отношении интерферона активностью, снижают или ингибируют экспрессию и/или активность интерферона. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения выражение антагонистическая в отношении интерферона активность относится к вирусному белку или полипептиду или его фрагменту, производному или аналогу (например, белку вируса гриппа), которые уменьшают или ингибируют иммунный ответ, в который вовлечен клеточный интерферон. Вирусный белок или полипептид с антагонистической в отношении интерферона активностью может предпочтительно влиять на экспрессию и/или активность одного или двух типов интерферона(IFN). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения влияние происходит на экспрессию и/или активность IFN-. В другом из вариантов осуществления настоящего изобретения влияние происходит на экспрессию и/или активность IFN-. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения влияние происходит на экспрессию и/или активность IFN-. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения экспрессия и/или активность IFN-, IFN- и/или IFN- в яйце с эмбрионом или клетке уменьшается от приблизительно 1 до приблизительно 100 раз, от приблизительно 5 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 20 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 10 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 5 раз, от приблизительно 40 до приблизительно 80 раз или в 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 раз с помощью агента, подобного белку, с антагонистической в отношении интерферона активностью относительно экспрессии и/или активности IFN-, IFN- и/или IFN- в контрольном яйце с эмбрионом или клетке, не экспрессирующих или не приводимых в контакт с таким агентом, подобным белку,что определяется методами, описанными в настоящем описании или известных специалисту в данной области. Используемое в настоящем описании выражение системы с недостатком IFN или субстраты с недостатком IFN относится к системам, например клеткам, линиям клеток и животным, таким как мыши, куры, индейки, кролики, крысы, лошади и т.п., в которых не продуцируется один, два или более типов IFN, или вообще не продуцируется какой-либо тип IFN, или продуцируются низкие уровни одного,двух или более типов IFN, или продуцируются низкие уровни любого IFN (т.е. снижена экспрессия IFN на 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% или более по сравнению с компетентной в отношении IFN системой при одних и тех же условиях), которые не отвечают или отвечают менее эффективно на один, два или более типов IFN, или не отвечают на любой тип IFN, и/или в которых имеется недостаток активности противовирусных генов, индуцируемых одним, двумя или более типами IFN или индуцируемых любым типом IFN. Используемые в настоящем описании термины инфекция, вызванная вирусом гриппа инфекция,вызванная вирусом птичьего гриппа инфекция и вызванная NDV инфекция относятся ко всем стадиям жизненного цикла вируса гриппа, вируса птичьего гриппа, NDV или другого инфекционного агента(например, вирусной или бактериальной инфекции) у индивида (в том числе инвазии и репликации вируса гриппа, вируса птичьего гриппа, NDV или другого инфекционного агента в клетке или ткани организма), а также патологическому состоянию, являющемуся следствием инвазии и репликации вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или NDV. Инвазия и размножение вируса гриппа, вируса птичьего гриппа,NDV или другого инфекционного агента содержат, без ограничения, следующие стадии: присоединение вируса (например, частицы вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или NDV) к клетке, слияние вируса с клеточной мембраной, ввод генетической информации вируса в клетку, экспрессию вирусных белков(например, белков вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или NDV), продукцию новых вирусных частиц(т.е. частиц вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или NDV) и высвобождение вируса (например, частиц вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или NDV) из клетки. Инфекция дыхательных путей (например, вызванная вирусом гриппа или NDV инфекция) может быть инфекцией верхних дыхательных путей(URI), инфекцией нижних дыхательных путей (LRI) или их комбинацией. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения инфекция является вторичной инфекцией (например, вторичной пневмонией), которая проявляется после возникновения первичной инфекции (например, вирусной пневмонии). Вторичные инфекции возникают благодаря первичной инфекции или симптома или состояния,сопровождающего ее, которые провоцируют у инфицированного индивида такую вторичную инфекцию. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения патологическое состояние, являющееся- 11016217 следствием инвазии и репликации вируса гриппа, вируса птичьего гриппа или NDV, является острым заболеванием, вызванным вирусом гриппа, вирусом птичьего гриппа или NDV. Острые стадии инфекций дыхательных путей могут проявляться в виде пневмонии и/или бронхиолита, симптомы которых могут включать гипоксию, асфиксию, дистресс-синдром, быстрое дыхание, стерторозное дыхание, цианоз и т.п. В острой стадии инфекций дыхательных путей (например, вызванных вирусом гриппа и NDV инфекций) необходимо, чтобы подвергнуть индивидуума медицинскому вмешательству, такому как госпитализация, введение кислорода, интубация и/или вентиляция. Используемый в настоящем описании термин выделенный в контексте вирусов относится к вирусу, происходящему из одного родительского вируса. Вирус можно выделить, используя обычные способы, известные специалисту в данной области, содержащие, но ими не ограничиваясь, способы, основанные на очистке из бляшки и серийном разведении. Используемый в настоящем описании термин выделенный в контексте молекул нуклеиновых кислот относится к молекуле нуклеиновой кислоты, отделенной от других молекул нуклеиновых кислот,присутствующих в природном источнике молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может быть, по существу, свободна от другого клеточного материала, или культуральной среды при получении рекомбинантными методами, или по существу свободна от химических предшественников или других химических продуктов при химическом синтезе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вирусный белок, является выделенной. Используемые в настоящем описании термины регулировать, регулирование и регулировка относятся к положительным эффектам, которые индивид получает от терапии (например, профилактического или терапевтического средства), которая не приводит к излечению заболевания (например, инфекции). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения индивиду назначают один или несколько видов терапии (например, профилактических или терапевтических средств, таких как антитело по настоящему изобретению) для регулирования инфекции, вызванной вирусом гриппа, инфекции,вызванной вирусом птичьего гриппа или NDV, или инфекции, вызванной другим инфекционным агентом, одного или нескольких ее симптомов или состояния, сопровождающего инфекцию, вызванную вирусом гриппа, или вызванную NDV инфекцию, или инфекцию, вызванную другим инфекционным агентом, усиленного такой инфекцией или усиливающего такую инфекцию, для профилактики прогрессирования или ухудшения инфекции. Используемое в настоящем описании выражение множественность заражения или MOI - это среднее число вирусов на инфицированную клетку. MOI определяют делением числа добавленных вирусов (мл добавленныебляшкообразующие единицы) на число добавленных клеток (мл добавленныеклетки/мл). Используемое в настоящем описании выражение ген NS1 относится к гену, кодирующему неструктурный белок (NS1) вируса гриппа. NS1 является одной из восьми молекул, кодируемых сегментированным геномом вируса гриппа А и других вирусов. Продукт гена NS1 относится к продукту гена(например, РНК или белку), кодируемому геном NS1. В случае белка продукт гена NS1 является полноразмерным и обладает активностью NS1 дикого типа (например, из штамма A/WSN/33). Используемые в настоящем описании термины нуклеиновые кислоты, нуклеотидные последовательности и молекулы нуклеиновых кислот содержат молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК), молекулы РНК (например, мРНК), комбинации молекул ДНК и РНК или гибридные молекулы ДНК/РНК и аналоги молекул ДНК или РНК. Такие аналоги можно создать с использованием, например,нуклеотидных аналогов, которые содержат, но ими не ограничиваются, инозин или тритилированные основания. Такие аналоги могут включать молекулы ДНК или РНК, содержащие модифицированные остовы, которые придают молекулам полезные свойства, такие как, например, устойчивость к нуклеазам или увеличенная способность пересекать клеточные мембраны. Нуклеиновые кислоты или нуклеотидные последовательности могут быть однонитевыми, двунитевыми, могут содержать и однонитевые, и двунитевые части и могут содержать трехнитевые части, но предпочтительной является двунитевая ДНК. Используемые в настоящем описании термины профилактика и предотвращение относятся к предотвращению рецидива или возникновения одного или нескольких симптомов заболевания (например, вирусной инфекции или другого инфекционного заболевания) или уменьшению таких симптомов у индивида в результате назначения терапии (например, профилактического или терапевтического средства). Например, в контексте назначения индивиду терапии инфекции профилактика и предотвращение относятся к ингибированию или уменьшению развития или возникновения инфекции (например, инфекции, вызванной вирусом гриппа, вызванной NDV инфекции, или сопровождающего ее состояния, или инфекции, отличной от инфекции, вызванной вирусом гриппа или NDV, или сопровождающего ее состояния) или предотвращению рецидива, возникновения или развития одного или нескольких симптомов инфекции (например, инфекции, вызванной вирусом гриппа, вызванной NDV инфекции или сопровождающего их состояния, или инфекции, отличной от инфекции, вызванной вирусом гриппа, вызваннойNDV инфекции или сопровождающего ее состояния) у индивида в результате назначения терапии (на- 12016217 пример, профилактического или терапевтического средства) или назначения комбинации терапии (например, комбинации рофилактических и терапевтических средств). Используемый в настоящем описании термин протективный антиген в контексте инфекционного агента включает любую молекулу, которая при введении индивиду способна вызывать защитный иммунный ответ против инфекционного агента. Используемые в настоящем описании термины профилактическое средство и профилактические средства относятся к любому средству (средствам), которые можно использовать для профилактики заболевания (например, инфекции) или его симптома (например, инфекции, вызванной вирусом гриппа,вызванной NDV инфекции, или сопровождающего их состояния или симптома, или инфекции, отличной от инфекции, вызванной вирусом гриппа или NDV, или сопровождающего ее состояния или симптома). Предпочтительно профилактическое средство представляет собой средство, которое, как известно, можно использовать, было использовано или используется в текущий момент времени для профилактики или профилактики возникновения, развития, прогрессирования и/или тяжести заболевания или его симптома(например, инфекции или состояния или симптома, сопровождающего ее) . Используемое в настоящем описании выражение очищенный в контексте вирусов относится к вирусу, который, по существу, свободен от клеточного материала и культуральных сред источника в виде клетки или ткани, из которого вирус получают. Формулировка по существу свободен от клеточного материала включает препараты вируса, в которых вирус отделен от компонентов клеток, из которых его выделяют или в которых его рекомбинантно продуцируют. Таким образом, вирус, который по существу свободен от клеточного материала, включает препараты белка, имеющие менее приблизительно 30, 20,10 или 5% (по сухому весу) клеточного белка (на который в данном описании также приводится ссылка в виде загрязняющий белок). Вирус также по существу свободен от культуральной среды, т.е. культуральная среда представляет менее приблизительно 20, 10 или 5% объема препарата вируса. Вирус можно очистить с использованием традиционных способов, известных специалисту в данной области, содержащих, но ими не ограничиваются, хроматографию и центрифугирование. Используемые в настоящем описании термины индивид или пациент используются взаимозаменяемо. Используемые в настоящем описании термины индивид или индивиды относятся к животному (например, птицам, рептилиям и млекопитающим). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является млекопитающее, включая не являющееся приматом млекопитающее (например, верблюда, осла, зебру, корову, лошадь, кошку, собаку, крысу и мышь) и примата (например, обезьяну, шимпанзе и человека). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является не являющееся человеком млекопитающее. В других вариантах осуществления настоящего изобретения индивидом является человек. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения возраст млекопитающего (например, человека) составляет 0-6 месяцев, 6-12 месяцев,1-5 лет, 5-10 лет, 10-15 лет, 15-20 лет, 20-25 лет, 25-30 лет, 30-35 лет, 35-40 лет, 40-45 лет, 45-50 лет, 5055 лет, 55-60 лет, 60-65 лет, 65-70 лет, 70-75 лет, 75-80 лет, 80-85 лет, 85-90 лет, 90-95 лет или 95-100 лет. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения индивидом или пациентом является птица. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения возраст птицы составляет 0-3 месяца, 3-6 месяцев, 6-9 месяцев, 9-12 месяцев, 12-15 месяцев, 15-18 месяцев или 18-24 месяца. Используемый в настоящем описании термин синергический в контексте назначения или результата терапии относится к комбинированной терапии (например, комбинирование профилактических или терапевтических средств), которая более эффективна, чем аддитивные эффекты любых двух или более отдельных терапий (например, одного или более профилактических или терапевтических агентов). Синергический эффект комбинированной терапии (например, комбинирование профилактических или терапевтических средств) делает возможным использование более низких доз одной или нескольких видов терапии (например, одного или нескольких профилактических или терапевтических средств) и/или более редкое назначение указанной терапии индивиду с заболеванием (например, вызванной вирусом гриппа инфекцией, вызванной NDV инфекцией или сопровождающим их состоянием или симптомом, или инфекцией, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной NDV инфекции, или сопровождающим ее состоянием или симптомом). Возможность использовать более низкие дозы терапии (например, профилактических или терапевтических средств) и/или назначать указанную терапию реже снижает токсичность, связанную с назначением указанной терапии индивиду, не снижая эффективность указанных видов терапии для профилактики или лечения заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции или сопровождающего ее состояния или симптома, или инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной NDV инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома). Кроме того, синергический эффект может привести к увеличению эффективности терапии (например, профилактических или терапевтических средств) для профилактики, регулирования или лечения заболевания (например, вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной NDV инфекции или сопровождающего их состояния или симптома, или инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции,вызванной NDV инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома). Наконец, синергический эффект комбинированной терапии (например, профилактических или терапевтических средств) может- 13016217 исключить или уменьшить неблагоприятные или нежелательные побочные эффекты, связанные с применением любой терапии по отдельности. Используемые в настоящем описании термины терапии и виды терапии могут относиться к любому протоколу(ам), способу(ам) и/или средству(ам), которые можно использовать для профилактики,лечения, регулирования или уменьшения интенсивности заболевания (например, рака, вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной NDV инфекции, или сопровождающего их состояния или симптома,или инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции или вызванной NDV инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения термины терапия и виды терапии относятся к биологической терапии, поддерживающей терапии и/или другим видам терапии, используемым для лечения, регулирования, профилактики или уменьшения интенсивности заболевания, инфекции или сопровождающего их состояния или симптома,известным специалисту в данной области. Используемые в настоящем описании термины терапевтическое средство и терапевтические средства относятся к любому средству(ам), которое можно использовать для профилактики, лечения,регулирования или уменьшения интенсивности заболевания (например, инфекции или ее симптома (например, вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной NDV инфекции или сопровождающего их состояния или симптома, инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной NDV инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома). Предпочтительно терапевтическим средством является средство, которое, как известно, можно использовать, или которое использовали или используется в текущий момент времени для профилактики,лечения, регулирования или уменьшения интенсивности заболевания или сопровождающего его симптома (например, вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной NDV инфекции или сопровождающего их состояния или симптома, инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной NDV инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома). Используемые в настоящем описании термины лечить и лечение в контексте назначения индивиду терапии относится к исключению, уменьшению или уменьшению интенсивности симптомов заболевания, на которое направлена терапия. Что касается инфекций (например, вызванных вирусом гриппа или вирусом NDV) лечение относится к исключению или контролю репликации инфекционного агента(например, вируса), уменьшению числа инфекционных агентов (например, снижению титра вируса),уменьшению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности инфекции (например, вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной NDV инфекции или сопровождающих их состояния или симптомов,инфекции, отличной от вызванной вирусом гриппа инфекции, вызванной NDV инфекции, или сопровождающего ее состояния или симптома) или уменьшению интенсивности одного или нескольких симптомов, являющихся следствием назначения одной или нескольких терапий (в том числе, но ими не ограничиваются, введения одного или нескольких профилактических или терапевтических средств). Что касается рака, лечение относится к исключению, удалению, модификации или контролю первичной, региональной или метастатической раковой ткани, являющихся следствием введения одного или нескольких терапевтических средств по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения такие термины относятся к минимизации или отсрочке распространения рака, являющихся следствием введения одного или нескольких терапевтических средств по настоящему изобретению индивиду с таким заболеванием. В других вариантах осуществления настоящего изобретения такие термины относятся к исключению вызывающих заболевание клеток. Описание фигур Фиг. 1. Схематическое представление гибридной конструкции NAf-HN Конструкция содержит нуклеотиды 3' некодирующей области вирусной РНК NA WSN, нуклеотиды кодирующей NA области, соответствующие цитоплазматическому хвостовому и трансмембранному доменам белка NA плюс первая аминокислота эктодомена NA, за которой следуют нуклеотиды кодирующей области белка HN NDV B1 (эктодомен HN), два последовательных стоп-кодона, нетранслируемые нуклеотиды рамки считывания NA WSN и 5' некодирующая область вирусной РНК WSN. Фиг. 2. Схематическое представление изменения последовательности с множеством основных аминокислот НА Нуклеотидная последовательность, определяемая как НА H5N1, представляет нуклеотиды 10131045 (SEQ ID NO:13; аминокислотная последовательность SEQ ID NO:14) открытой рамки считывания поверхностного гликопротеина НА Influenza A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Нуклеотиды 1026-1038 заменили одним нуклеотидом цитозином, используя удаляющую ПЦР и сайт-направленный мутагенез, что привело к получению нуклеотидной последовательности невирулентного НА (SEQ ID NO:15; аминокислотная последовательность SEQ ID NO:16). Изменения в последовательности соответствуют замене последовательности из 5 основных аминокислот одной аминокислотой треонином. Фиг. 3. Схематическое представление изменения последовательности нуклеиновой кислоты НА Последовательность, определяемая как невирулентный НА, представляет нуклеотиды 1013-1033 открытой рамки считывания поверхностного гликопротеина НА, основанных на консенсусных последо- 14016217 вательностях белков НА невирулентного Influenza A/Vietnam/1203/04 (H5N1) (SEQ ID NO:15; аминокислотная последовательность SEQ ID NO:16). Подчеркнутые остатки аденозина заменены так, что мутации были синонимичными, что привело к получению нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:17 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO:16. Фиг. 4. Схема усеченных мутантов pPol1VN1203 NS А. Кодирующая область сегмента гена NS H5N1 представляет собой 833 нуклеотида. В. Конструкция pPol1VN1203 NS1-126 имеет делецию в гене NS из нуклеотидов 379-456 кодирующей области, вставку 3 стоп-кодонов и рестрикционного сайта для BglII. С. Конструкция pPol1VN1203 NS1-99 имеет делецию в гене NS из нуклеотидов 298-456 кодирующей области, вставку 4 стоп-кодонов, рестрикционного сайта для BglII и рестрикционного сайта дляD. Конструкция pPol1VN1203 NS1-73 имеет делецию в гене NS из нуклеотидов 219-456 кодирующей области, вставку 4 стоп-кодонов, рестрикционного сайта для Bgl и рестрикционного сайта дляPacI. Фиг. 5. Схема pNDV/B1 Изображенная последовательность фланкирована на 3'-конце промотором Т 7 и на 5'-конце рибозимом HDV и терминатором Т 7. Сайт встраивания между генами Р и М включает уникальный рестрикционный сайт для XbaI. Фиг. 6. Анализ Вестерн-блоттингом экспрессии KGFR в химерных вирусах rNDV Химерные вирусы rNDV (линия 1), rNDV-KGFR (линия 2) и rNDV-KGFR/F-CT (линия 3) выращивали в куриных яйцах с эмбрионами возрастом 10 дней. Очищенные вирусы подвергали анализу Вестерн-блоттингом с использованием крысиного антитела против KGFR и антимышиного HRPO в качестве первого и второго антител, соответственно. Фиг. 7. Анализ Вестерн-блоттингом экспрессии НА Н 7 в химерных вирусах rNDV Химерные вирусы rNDV (линия 1), rNDV-KGFR (линия 2) и rNDV-KGFR/F-CT (линия 3) выращивали в куриных яйцах с эмбрионами возрастом 10 дней. Очищенные вирусы подвергали анализу Вестерн-блоттингом с использованием крысиного антитела против НА Н 7 и антимышиного HRPO в качестве первого и второго антител, соответственно. Фиг. 8. Модификация сайта расщепления белка F rNDV(А) Схематическое представление генома rNDV/B1 с двумя или тремя аминокислотными заменами в сайте расщепления белков F. Пептидная связь, подвергаемая расщеплению, в белке F показана с использованием косой черты. (В) Образование соклетий в клетках CEF, инфицированных rNDV с модифицированными белками F. Клетки CEF инфицировали при множественности заражения, составляющей 0,001, вирусами rNDV/Bl, rNDV/F2aa и rNDV/F3aa. Распространение вирусов контролировали каждые 24 часа с помощью иммунофлуоресцентного анализа. Фиг. 9. Конструирование и характеристика способного к слиянию вектора rNDV, экспрессирующего белок НА HPAI H7rNDV/F3aa-chimericH7 с представленными последовательностями GE/GS, Kozak и частичной последовательностью НА Н 7 (SEQ ID NO: 36).(В) Сравнение кинетик роста вирусов, Log TCID против времени после инокуляции (ч). Квадрат,rNDV/Bl; треугольник rNDV/F3aa; выделенная жирным звездочка rNDV/Bl-H7; звездочка rNDV/F3aachimericH7.(С) Экспрессия белка НА Н 7 дикого типа или химерного белка НА Н 7 в клетках, инфицированных(D) Встраивание химерного белка НА Н 7 в вирионы rNDV увеличено по сравнению с встраиванием белка НА Н 7 дикого типа. Линия 1: rNDV/B1-H7; линия 2: rNDV/F3aa-chimericH7. Ряд 1: Н 7 -птичьего гриппа; ряд 2: -NDV. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к химерным вирусам, содержащим негативную нить РНК, сконструированным с целью экспрессии слитых белков, которые встраиваются в вирион, к способам получения таких химерных вирусов и применению таких вирусов, например, в качестве иммуногенов, в иммуногенных композициях или в in vitro анализах. Химерные вирусы по настоящему изобретению характеризуются наличием на поверхности вириона не только антигенов, связанных с вирусом, но также слитого белка. Вирусы, которые могут быть сконструированы в соответствии со способами по настоящему изобретению, могут представлять собой любой покрытый оболочкой вирус. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вирусы, которые могут быть сконструированы в соответствии со способами по настоящему изобретению, могут быть сегментированными или несегментированными геномами,однонитевыми или двунитевыми геномами и экспрессировать по крайней мере один основной гликопро- 15016217 теин (например, NA, НА, HN или F), который включается в оболочку вируса. Вирусы, используемые в соответствии со способами по настоящему изобретению, могут быть выбраны из природных штаммов,вариантов или мутантов; подвергнутых мутагенезу вирусов (например, с помощью воздействия УФоблучением, мутагенов и/или пассирования); гибридных вирусов, содержащих части геномов двух различных вирусов (для вирусов с сегментированными геномами); и/или генетически сконструированных вирусов. Например, мутантные вирусы можно получить с помощью природной изменчивости, воздействия УФ-облучением, воздействия химическими мутагенами, с помощью пассирования в не факультативных хозяевах, с помощью формирования гибридных вирусов, содержащих части геномов двух различных вирусов (т.е. с помощью коинфицирования аттенуированного сегментированного вируса с другим штаммом, имеющим желаемые антигены) и/или с помощью генной инженерии (например, с использованием обратной генетики). Неограничивающие примеры вирусов с сегментированными геномами, используемых в соответствии со способами по настоящему изобретению, содержат вирусы семейства Orthomyxoviridae (например,вирусы гриппа), Bunyaviridae (например, Bunyamwera), Reoviridae и Arenaviridae (например, вирус лихорадки Ласса). Неограничивающие примеры вирусов с несегментированными геномами, используемых в соответствии со способами по настоящему изобретению, содержат вирусы семейства Coronaviridae (например, коронавирус человека (SARS, Hepadnaviridae (например, вирус гепатита А, В или С), Herpesviridae (например, вирус простого герпеса), Poxviridae (например, вирус натуральной оспы), Rhabdoviridae (например, вирус везикулярного стоматита (VSV), вирус Сендай и вирус бешенства), Paramyxoviridae(например, вирус кори и респираторно-синцитиальный вирус) и Filoviridae (например, вирусы Марбург и Эбола). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения сегментированным вирусом является вирус гриппа. В других вариантах осуществления настоящего изобретения несегментированным вирусом является NDV. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения вирусы, выбираемые для применения в настоящем изобретении, являются аттенуированными и/или имеют недостаток антагонистической в отношении IFN активности, т.е. они являются инфекционными и могут реплицироваться in vivo,но дают лишь низкие титры, приводящие к субклиникическим уровням инфекции, которые не являются патогенными. Такие вирусы можно аттенуировать любым способом, известным в данной области и/или приведенным в качестве примера в настоящем описании, например, созданием вируса, содержащего мутацию в гене NS1 или содержащего модификацию в аминокислотной последовательности с множеством основных аминокислот перед сайтом расщепления в белке НА. Такие аттенуированные вирусы, разработанные в соответствии с настоящим изобретением, являются, следовательно, идеальными кандидатами для иммуногенных композиций, например, живых противовирусных вакцин. При введении индивиду аттенуированные химерные вирусы по настоящему изобретению способны вызывать иммунный ответ и индуцировать иммунитет как к вирусу, так и к неприродному или слитому белку. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения неприродный белок происходит из патогена. Вдобавок, введение индивиду такого химерного вируса вызывает иммунный ответ и/или иммунитет к указанному патогену помимо вируса. Настоящее изобретение также относится к применению химерного вируса по настоящему изобретению в композициях (например, иммуногенных композициях) для людей или животных (например,птиц). В частности, химерные вирусы, которые являются аттенуированными, можно использовать в качестве вакцин против широкого ряда вирусов и/или заболеваний. Поскольку химерный вирус конструируется для экспрессии гетерологичных генных последовательностей в качестве чужеродных эпитопов в вирионе, композиции, содержащие химерный вирус по настоящему изобретению, (например, композиции вакцин) могут быть предназначены для иммунизации против множества штаммовых вариантов, различных вирусов или против совершенно различных инфекционных агентов или связанных с заболеванием антигенов (например, бактерий, паразитов, грибов или специфичных в отношении опухолей антигенов), из которых происходят гетерологичные генные последовательности. Можно использовать большое число различных способов введения композиций живых аттенуированных вирусов индивиду, являющемуся человеком или животным, для индуцирования иммунного ответа или ответа, в который вовлечены соответствующие цитокины. К ним относятся, но ими не ограничиваются, интраназальный, интратрахиальный, пероральный, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный и подкожный способы. 5.1. Химерные вирусы гриппа 5.1.1. Химерный вирус птичьего гриппа, содержащий слитый белок, встраиваемый в его вирион Настоящее изобретение относится к конструированию такого вируса птичьего гриппа, когда слитый белок кодируется геномом и при его экспрессии встраивается в вирион. Можно выбрать и использовать в соответствии с настоящим изобретением любой тип, подтип или штамм вируса птичьего гриппа, который можно сконструировать для экспрессии и встраивания слитого белка в вирион птичьего гриппа, в том числе, но ими не ограничиваясь, природные штаммы, варианты или мутанты, подвергнутые мутагенезу вирусы, гибридные вирусы, содержащие части геномов двух различных вирусов, и/или генетически сконструированных вирусов. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вирусы- 16016217 птичьего гриппа по настоящему изобретению представляют собой неприродные вирусы. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения вирусы птичьего гриппа по настоящему изобретению представляют генетически сконструированные вирусы. Неограничивающие примеры вирусов птичьего гриппа содержат подтипы H5N1, H6N2, H7N3, H9N2 и H10N7 вируса гриппа А. Для генетического манипулирования вирусом гриппа требуется сконструировать по крайней мере один из восьми сегментов вирусной РНК, которые составляют вирусный геном. Мутагенез генома можно получить благодаря методам обратного конструирования (см. раздел 5.4). Однако гибкость генома вируса гриппа ограничена как числом сегментов, так и длиной сегментов, которые можно стабильно интегрировать в вирус. Общая стабильность длинных вставок неизвестна, и сегменты, содержащие такие вставки, или их части, могут быть потеряны благодаря образованию гибридных вирусов, содержащих части геномов двух различных вирусов, через несколько поколений. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вирус птичьего гриппа конструируют таким образом,что один из его основных поверхностных белков замещается слитым белком. Соответственно, настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему по крайней мере один слитый белок, включающий эктодомен (ED) белка инфекционного агента,отличного от вируса гриппа, и цитоплазматический (СТ) и трансмембранные (ТМ) домены или трансмембранный (ТМ) домен по крайней мере одного основного гликопротеина вируса гриппа, причем по крайней мере один слитый белок функционально замещает по крайней мере один основной гликопротеин вируса птичьего гриппа. Другими словами, вирус птичьего гриппа служит в качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в ее вирион слитого белка вместо основного гликопротеина вируса гриппа. Встраивание ТМ и СТ доменов или ТМ домена гликопротеина вируса гриппа, соответствующего основному гликопротеину вируса птичьего гриппа, функционально замещаемого слитым белком, делает возможным встраивание слитого белка в вирион вируса птичьего гриппа. ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка могут соответствовать или происходить из любого вируса гриппа, который позволяет встраивать слитый белок в вирион вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену типа, подтипа или штамма вируса птичьего гриппа, отличного от вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену вируса гриппа, отличного от вируса птичьего гриппа. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы. Вирион вируса птичьего гриппа содержит два основных поверхностных гликопротеина, гемаглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), каждый из которых содержит цитоплазматический домен, трансмембранный домен и эктодомен. Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или белка НА, или белкаNA вируса гриппа. Поскольку СТ домен НА или NA может не требоваться для встраивания слитого белка в вирион вируса птичьего гриппа, то в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок конструируют таким образом, что он содержит только ТМ домен НА или NA. Например,показано, что СТ домен NA не требуется для правильной упаковки этого белка в оболочки вируса гриппаA (Garcia-Sastre et al., 1995, Virus Res. 37:37-47, который включен в качестве ссылки в полном объеме). Следовательно, если при создании слитого белка используются структурные домены, соответствующие доменам белка NA, то настоящее изобретение относится к конструированию слитого белка, содержащего только ТМ домен, соответствующий белку NA вируса гриппа. Соответственно, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения конструируют слитый белок, содержащий только ТМ домен,соответствующий ТМ домену белка NA вируса гриппа. ТМ и СТ домены белков НА и NA вируса гриппа структурно отличаются тем, что домены находятся на С-конце белка НА и на N-конце белка NA. Помимо различной ориентации двух доменов в каждом классе поверхностного гликопротеина ТМ и СТ структурные домены могут включать еще неизвестные различия в функциональные группы, зависящие от их относительного расположения в пределах полипептидной цепи. Поэтому при конструировании слитого белка в вирусе птичьего гриппа ориентация эктодомена инфекционного агента, сливаемого с ТМ и СТ доменами или ТМ доменом гликопротеина вируса гриппа, будет определяться выбором ТМ и СТ доменов или ТМ домена. Например, если эктодомен инфекционного агента прикрепляется N-концом, то можно использовать ТМ и СТ домены белка NA вируса гриппа. НА и NA проявляют конкурирующую активность в отношении слияния с клеткой и высвобождения из клетки, соответственно, которые необходимы для инфективности и размножения вируса. НА связывается с N-ацетилнейраминовой кислотой (NeuNAc; сиаловой кислотой) на поверхности клетки, что приводит к поглощению вируса клеткой хозяином, в то время как NA отщепляет составляющие сиаловой кислоты с поверхности клетки, что приводит к высвобождению потомства вируса из инфицированной- 17016217 клетки. Нарушение любой из этих двух видов активности приводит к нефункциональному вирусу. Соответственно, для сохранения компетентности вируса при замещении поверхностного гликопротеина его функция в химерном вирусе должна обеспечиваться слитым белком. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа включает слитый белок, проявляющий нейраминидазную активность. В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит слитый белок, проявляющий активность связывания с рецептором. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит два слитых белка, один из которых проявляет нейраминидазную активность, а другой - активность связывания с рецептором. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит слитый белок, содержащий эпитоп гетерологичного инфекционного агента,при этом слитый белок проявляет нейраминидазную активность или активность связывания с рецептором. В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит слитый белок, проявляющий активность связывания с рецептором. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит поверхностный белок,содержащий эктодомен белка HN вируса псевдочумы птиц (NDV) и ТМ и СТ домены белка NA вируса гриппа A/WSN/33, при этом эктодомен HN проявляет нейраминидазную активность. В других вариантах осуществления настоящего изобретения химерный вирус птичьего гриппа содержит поверхностный белок, содержащий эктодомен белка НА гетерологичного вируса гриппа (например, белка НА Н 7 или белка НА Н 9). НА и NA кодируются отдельными сегментами вирусного генома, и замена всей кодирующей области природного белка устраняет большинство ограничений длины последовательности, кодирующей встроенный белок. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен плюс 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков(а) эктодомена основного гликопротеина вируса гриппа. Например, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка NA вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков(а) эктодомена белка NA вируса гриппа и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может замещать функцию белка NA. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка NA вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков(а) эктодомена белка NA вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка NA вируса гриппа, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально заместить белок NA. В другом варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен или цитоплазматический и трансмембранный домены белка NA, полный домен ножки, или его фрагмент, белка NA, который предшествует его глобулярной головке, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально заместить белок NA. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка НА вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков(а) эктодомена белка НА вируса гриппа и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально заместить белок НА. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка НА вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков(а) эктодомена белка НА вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка НА вируса гриппа, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально заместить белок НА. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения по крайней мере один слитый белок химерного вируса птичьего гриппа по настоящему изобретению не содержит полноразмерный эктодомен гетерологичного белка (например, содержит антигенный фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента) и может содержать или может не содержать, кроме того, один или несколько фрагментов эктодомена природного основного гликопротеина. Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка может содержать фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомена слитого белка может содержать фрагменты и природного основного гликопротеина, и белка гетерологичного инфекционного агента. В вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых слитый белок замещает основной поверхностный гликопротеин, функцию поверхностного гликопротеина должен обеспечивать слитый белок, т.е. слитый белок должен проявлять функциональность поверхностного гликопротеина, которого он замещает. Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям (т.е. рекомбинантным сегментам), кодирующим слитые белки, описанные в разделе 5.1.1. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.1, содержат 3' и 5' сигналы встраивания, которые необхо- 18016217 димы для правильной репликации, транскрипции и упаковки вирусной РНК (Fujii et al., 2003, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 100: 2002-2007; Zheng et al., 1996, Virology 217:242-251, каждый из которых включены в описание в качестве ссылки в полном объеме). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в рекомбинантных сегментах по настоящему изобретению, следовательно, используются 3' и 5' некодирующие и/или нетранслируемые последовательности сегментов вирусов внутри одного и того же типа или штамма вируса, что и используемый в качестве основы вирус птичьего гриппа. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.1, которые содержат 3' некодирующую область РНК NA вируса гриппа, кодирующую NA область, соответствующую СТ и ТМ доменам белкаNA, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 и 1 остатков (остаток) эктодомена белка NA вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка NA вируса гриппа, нетранслируемые области рамки считывания белка NA и 5' некодирующую область вирусной РНК NA. В качестве альтернативы замещению белков NA или НА вируса птичьего гриппа для получения химерного вируса гриппа, содержащего эктодомен, или его фрагмент, белка инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, и ТМ и/или СТ домены вируса гриппа, можно использовать обратную генетику и бицистронные методы. См., например, патент США 6887699, патент США 6001634, патент США 5854037 и патент США 5820871, каждый из которых, таким образом, включены в качестве ссылки в полном объеме. Бицистронные подходы содержат встраивание кодирующей области слитого белка в открытую рамку считывания необходимого белка вируса и его стоп кодона. Вставка фланкируется IRES и любыми нетранслируемыми сигнальными последовательностями необходимого белка, в который она встраивается, и не должна нарушать открытую рамку считывания, сигнал упаковки, полиаденилирования или промоторы транскрипции необходимого вирусного белка. Любые IRES, хорошо известные в данной области или описанные в настоящем изобретении, можно использовать в соответствии с настоящим изобретением (например, IRES гена BiP, нуклеотиды 372-592 HUMGRP78-данных, введенных в базу данных GenBank; или IRES вируса энцефаломиокардита (EMCV), нуклеотиды 1430-2115CQ867238-данных, введенных в базу данных GenBank). Поскольку при бицистронном подходе функция НА или NA не замещается, то часть эктодомена слитого белка не ограничивается белком, который обеспечивает функцию замещаемого белка НА или NA. Эктодомен такого слитого белка может соответствовать любой гетерологичной молекуле или включать фрагмент любой гетерологичной молекулы, содержащей, но ими не ограничиваются, антигены, связанные с заболеванием антигены и антигены любого белка инфекционного агента (например, любого протективного антигена, связанного с вирусными, бактериальными или паразитарными инфекционными агентами). Неограничивающие примеры антигенов,информационных агентов или связанных с ними, для применения в соответствии со способами по настоящему изобретению представлены в разделе 5.3 ниже. Замещение необходимого поверхностного белка вируса-основы или введение рекомбинантного сегмента в вирусный геном может аттенуировать получаемый в результате химерный вирус, т.е. химерный вирус будет проявлять сниженную репликацию относительного дикого типа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения желательна аттенуация химерного вируса, так что химерный вирус остается, по крайней мере частично, инфекционным и может реплицироваться in vivo, но только образует низкие титры, что приводит к субклиническим уровням инфекции, которые не являются патогенными. Такие аттенуированные химерные вирусы особенно эффективны для таких вариантов осуществления настоящего изобретения, в которых вирус вводят индивиду для действия в качестве иммуногена, например, для живой вакцины. Вирусы можно аттенуировать любым способом, известным в данной области и/или приведенным в качестве примера, например, разработки вируса, содержащего мутацию в гене NS1 или содержащего модификацию в аминокислотной последовательности с множеством основных аминокислот перед сайтом расщепления в белке НА (см. патент США 6468544; патент США 6669943; Li et al., 1999, J. Infect. Dis. 179: 1132-1138, каждый из которых, таким образом, включен в качестве ссылки в полном объеме). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию в гене NS1 вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которая, как известно, в других вирусах гриппа уменьшает способность продукта гена NS1 служить антагонистом ответа, в который вовлечен клеточный интерферон. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию в гене НА вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которая, как известно, в других вирусах гриппа уменьшает способность клеточных протеаз расщеплять белок в ее активную форму и, таким образом, уменьшает или исключает индуцируемое НА слияние и инфективность. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию как в гене НА, так и в гене NS1 вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которые, как известно, в других вирусах гриппа уменьшают вирусную активность или по отдельности, или при объединении. Титры аттенуированных химерных вирусов птичьего гриппа и вирусов птичьего гриппа дикого типа можно определить с помощью любого- 19016217 метода, хорошо известного в данной области или описанного в настоящем описании (например, анализов гемаглютинации, анализа бляшкообразования, инфекционных доз для яйца (EID50), инфекционных доз для культуры тканей (TCID50) и т.п.), и вирусы можно размножить в условиях, описанных в данном описании или хорошо известных в данной области (например, в клетках CEF, клетках MDCK (например,в MEM, 10% объем/объем фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллин/стрептомицин при 37 С в инкубаторе с 5% СО 2 и увлажнением) или куриных яйцах с эмбрионами (например, в стационарном инкубаторе при 37 С с 55% относительной влажностью). Альтернативно, вирусы можно размножить в клетках (например, клетках CEF, клетках MDCK и т.п.), которые выращивают в бессывороточной среде или среде с уменьшенным содержанием сыворотки (например, ТРСК трипсин). 5.1.2. Химерный аттенуированный вирус гриппа, содержащий слитый белок, встроенный в его вирион Настоящее изобретение относится к конструированию аттенуированного вируса гриппа, у которого слитый белок кодируется геномом и при экспрессии встраивается в вирион. Другими словами, настоящее изобретение относится к применению аттенуированного вируса гриппа (родительского вируса) в качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в его вирион слитого белка. В качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в вирусный вирион слитого белка,можно использовать любой тип или штамм аттенуированного вируса гриппа, содержащий, но ими не ограничивающийся, природные штаммы, варианты или мутанты, подвергнутые мутагенезу вирусы; гибридные вирусы, содержащие части геномов двух различных вирусов, и/или генетически модифицированные вирусы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения родительские вирусы гриппа, используемые в соответствии с настоящим изобретением, не являются природными вирусами. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения родительские вирусы гриппа, используемые в соответствии с настоящим изобретением, являются генетически сконструированными вирусами. Вирусы гриппа, используемые в качестве основы по настоящему изобретению, могут естественным образом иметь аттенуированный фенотип, или их можно сконструировать с встраиванием связанной с аттенуированным фенотипом мутации, известной в данной области или описанной в настоящем описании (например, мутации в вирусном белке NS1 или вирусном белке НА). В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения аттенуированным вирусом является вирус гриппа А. В других вариантах осуществления настоящего изобретения аттенуированным вирусом является вирус гриппа В. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированным вирусом является вирус гриппа С. Неограничивающие примеры вирусов гриппа, которые можно сконструировать в соответствии с настоящим изобретением, содержат подтип H10N4, подтип H10N5, подтип H10N7, подтип H10N8, подтип H10N9, подтип H11N1, подтип H11N13, подтип H11N2, подтип H11N4, подтип H11N6, подтипPIG/BEIJING/439/82, штамм TAYLOR/1233/47 или штамм C/YAMAGATA/10/81 вируса гриппа С. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, имеет сниженную способность служить антагонистом клеточного интерферона (IFN). В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, является типом или штаммом вируса гриппа, содержащим мутацию в генеNS1, что приводит к снижению способности вируса служить антагонистом ответа, в который вовлечен клеточный интерферон. Примеры типов мутаций, которые могут быть встроены в ген NS1 вируса гриппа, содержат делеции, замены, вставки и их комбинации. Одну или несколько мутаций можно ввести гделибо в гене NS1 (например, N-конце, С-конце или где-нибудь между этими концами) и/или в регуляторном элементе гена NS1. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением,включает геном, имеющий ген NS1 вируса гриппа с мутацией на N-конце. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус) включает геном,- 21016217 имеющий ген NS1 вируса гриппа с мутацией на С-конце. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, включает геном, имеющий мутацию в гене NS1 вируса гриппа, приводящую к делеции, состоящей из 5, предпочтительно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 99,100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 или 175 аминокислотных остатков с С-конца NS1 или делеции между 5-170, 25-170, 100-170, 100-160, или 105-160 аминокислотными остатками с С-конца. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, включает геном,содержащий мутацию в гене NS1 вируса гриппа, приводящую к делеции всех аминокислотных остатков за исключением аминокислотных остатков 1-126, аминокислотных остатков 1-120, аминокислотных остатков 1-115, аминокислотных остатков 1-110, аминокислотных остатков 1-100, аминокислотных остатков 1-99, аминокислотных остатков 1-95, аминокислотных остатков 1-85, аминокислотных остатков 1-80,аминокислотных остатков 1-75, аминокислотных остатков 1-73, аминокислотных остатков 1-70, аминокислотных остатков 1-65, аминокислотных остатков 1-60, причем N-концевая аминокислота соответствует номеру 1. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа по настоящему изобретению содержит геном, содержащий мутацию в гене NS1 вируса гриппа, используемого в качестве основы, которая уменьшает способность продукта гена NS1 служить антагонистом ответа, в который вовлечен клеточный интерферон, и позволяет при множественности заражения (MOI) между 0,0005 и 0,001, 0,001 и 0,01, 0,01 и 0,1 или 0,1 и 1 или MOI, составляющей 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005,0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 или 6,0, аттенуированному вирусу расти до титров, более низких от приблизительно 1 до приблизительно 100 раз, от приблизительно 5 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 20 до приблизительно 80 раз или от приблизительно 40 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 10 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 5 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 4 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 3 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 2 раз или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40,45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 раз по сравнению с титрами вируса гриппа дикого типа, в клетках (например, клетках, происходящих от человека, мыши, крысы, свиньи, собаки, лошади или птицы (например, НЕр-2, А 549, 293 Т, клетках почки собаки Madin-Darby (MDCK) или фибробластах куриных эмбрионов (CEF, что определяется через приблизительно 2-10 дней, 3-7 дней, 3-5 дней или 2, 3, 4,5, б, 7, 8, 9, 10 дней после инфицирования при размножении в одних и тех же условиях. Титры аттенуированных вирусов гриппа и вирусов гриппа дикого типа можно определить с использованием любого метода, хорошо известного в данной области или описанного в настоящем описании (например, анализов гемаглютинации, анализа бляшкообразования, инфекционных доз для яйца (EID50), инфекционных доз для культуры тканей (TCID50) и т.п.), и вирусы можно размножить в условиях, описанных в настоящем описании или хорошо известных в данной области (например, в клетках CEF, клетках MDCK (например,в MEM, 10% объем/объем фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллин/стрептомицин при 37 С в термостате с 5% CO2 и увлажнением) или в куриных яйцах с эмбрионами (например, в стационарном термостате при 37 С с 55% относительной влажностью). Альтернативно, вирусы можно размножить в клетках (например, клетках CEF, клетках MDCK и т.п.), которые выращивают в бессывороточной среде или среде с уменьшенным содержанием сыворотки (например, ТРСК трипсин). В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, включает геном, содержащий мутацию в гене НА вируса гриппа, используемого в качестве основы, которая уменьшает или исключает способность клеточных протеаз расщеплять белок в его активную форму. Примеры типов мутаций, которые можно ввести в ген НА вируса гриппа, содержат делеции, замены, вставки или их комбинации. Одну или несколько мутаций предпочтительно вводят в сайт расщепления НА (например, нуклеотиды 1013-1039 AY818135-данных, введенных в базу данных GenBank). Как правило, мутации, уменьшающие расщепляемость белка НА, определяемую с помощью стандартных способов в CEF, коррелируют со снижением вирулентности в in vivo анализах (Horimoto and Kawaoka, 1994, 68: 3120-3128; который таким образом полностью включен в настоящее описание в качестве ссылки). В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, включает геном, имеющий мутацию в гене НА вируса гриппа,приводящую к замене нуклеотидов 1026-1038 единственным нуклеотидом с основанием в виде тимина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию в гене НА вируса гриппа, используемого в качестве основы, которая уменьшает или исключает способность клеточных протеаз расщеплять белок в его активную форму и позволяет при множественности заражения (MOI) между 0,0005 и 0,001, 0,001 и 0,01, 0,01 и 0,1 или 0,1 и 1 или MOI, составляющей 0,0005, 0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5,2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 или 6,0, аттенуированному вирусу расти до титров, более низких от приблизительно 1 до приблизительно 100 раз, от приблизительно 5 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 20 до приблизительно 80 раз или от приблизительно 40 до приблизительно 80 раз, от приблизи- 22016217 тельно 1 до приблизительно 10 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 5 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 4 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 3 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 2 раз или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75,80, 85, 90, 95 или 100 раз по сравнению с титрами вируса гриппа дикого типа, в клетках (например, клетках, происходящих от человека, мыши, крысы, свиньи, собаки, лошади или птицы (например, НЕр-2,А 549, 293 Т, клетках почки собаки Madin-Darby (MDCK) или фибробластах куриных эмбрионов (CEF,что определяется через приблизительно 2-10 дней, 3-7 дней, 3-5 дней или 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней после инфицирования при размножении в одних и тех же условиях. Белок НА, содержащий такую мутацию, антигенно не отличается от родительского белка НА дикого типа, т.е. все антитела, направленные против белка НА дикого типа, будут перекрестно реагировать с мутантным белком НА, и все антитела против мутантного белка НА будут перекрестно реагировать с белком НА дикого типа. Титры аттенуированных вирусов гриппа и вирусов гриппа дикого типа можно определить с использованием любого метода, хорошо известного в данной области или описанного в данном описании (например, анализов гемаглютинации, анализов бляшкообразования, инфекционных доз для яйца (EID50), инфекционных доз для культуры тканей (TCID50) и т.п.), и вирусы можно размножить в условиях, описанных в данном описании или хорошо известных в данной области (например, в клетках CEF, клетках MDCK (например,в MEM, 10% объем/объем фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллин/стрептомицин при 37 С в термостате с 5% СО 2 и увлажнением) или в куриных яйцах с эмбрионами (например, в стационарном термостате при 37 С с 55% относительной влажностью). Альтернативно, вирусы можно размножить в клетках (например, клетках CEF, клетках MDCK и т.п.), которые выращивают в бессывороточной среде или среде с уменьшенным содержанием сыворотки (например, ТРСК трипсин). В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа (родительский вирус), используемый в соответствии с настоящим изобретением, содержит геном, содержащий(i) мутацию в гене НА вируса гриппа, используемого в качестве основы, которая уменьшает или исключает способность клеточных протеаз расщеплять белок в его активную форму, и (ii) мутацию в гене NS1,которая приводит к уменьшению способности вируса служить антагонистом ответа, в который вовлечен клеточный интерферон. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный вирус гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию и в гене НА, и в генеNS1 вируса гриппа, используемого в качестве основы, которая позволяет при множественности заражения (MOI) между 0,0005 и 0,001, 0,001 и 0,01, 0,01 и 0,1 или 0,1 и 1 или MOI, составляющей 0,0005,0,0007, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 или 6,0, аттенуированному вирусу расти до титров, более низких от приблизительно 1 до приблизительно 100 раз, от приблизительно 5 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 20 до приблизительно 80 раз или от приблизительно 40 до приблизительно 80 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 10 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 5 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 4 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 3 раз, от приблизительно 1 до приблизительно 2 раз или приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10,15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 раз по сравнению с титрами вируса гриппа дикого типа, в клетках (например, клетках, происходящих от человека, мыши, крысы, свиньи,собаки, лошади или птицы (например, НЕр-2, А 549, 293 Т, клетках почки собаки Madin-Darby (MDCK) или фибробластах куриных эмбрионов (CEF, что определяется через приблизительно 2-10 дней, 3-7 дней, 3-5 дней или 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 дней после инфицирования при размножении в одних и тех же условиях. Настоящее изобретение относится к химерному аттенуированному вирусу гриппа, содержащему по крайней мере один слитый белок, имеющий эктодомен (ED), или его фрагмент, инфекционного агента,отличного от вируса гриппа, и цитоплазматический (СТ) и трансмембранный (ТМ) домены или трансмембранный (ТМ) домен основного гликопротеина вируса гриппа, причем по крайней мере один слитый белок функционально замещает по крайней мере один основной гликопротеин вируса птичьего гриппа. Другими словами, аттенуированный вирус гриппа служит в качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в ее вирион по крайней мере одного слитого белка вместо основного гликопротеина вируса гриппа. Встраивание ТМ и СТ доменов или ТМ домена гликопротеина вируса гриппа,соответствующего основному гликопротеину вируса гриппа, функционально замещаемого слитым белком, делает возможным встраивание слитого белка в вирион аттенуированного вируса гриппа. ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка могут соответствовать или происходить из любого вируса гриппа,который делает возможным встраивание слитого белка в вирион аттенуированного вируса гриппа, используемого в качестве основы. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену типа, подтипа или штамма вируса гриппа, отличного от аттенуированного вируса гриппа, используемого в качестве основы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену вируса гриппа разновидности, отличной от аттенуированного вируса гриппа, используемого в качестве основы. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам- 23016217 или ТМ домену аттенуированного вируса гриппа, используемого в качестве основы. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или белка НА, или белка NA вируса гриппа. Поскольку СТ домен НА или NA может быть необходим для встраивания слитого белка в вирион вируса гриппа, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок конструируют так, что он содержит только ТМ домен НА или NA. ТМ и СТ домены белков НА и NA вируса гриппа структурно отличаются по тому, что домены находятся на С-конце белка НА и на N-конце белка NA. Помимо различного расположения двух доменов в каждом классе поверхностного гликопротеина ТМ и СТ структурные домены могут содержать еще неизвестные различия в функциональных группах, зависящих от их относительного расположения в пределах полипептидной цепи. Поэтому при конструировании слитого белка в аттенуированном вирусе гриппа расположение эктодомена, или его фрагмента, инфекционного агента, сливаемого с ТМ и СТ доменами или ТМ доменом гликопротеина вируса гриппа, будет определяться выбором ТМ и СТ доменов или ТМ домена. Для сохранения компетентности вируса при замещении поверхностного гликопротеина его функция в химерном вирусе должна обеспечиваться слитым белком. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус гриппа содержит слитый белок, проявляющий нейраминидазную активность. В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус гриппа содержит слитый белок, проявляющий активность связывания с рецептором. В другом варианте осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус содержит два слитых белка, один из которых проявляет нейраминидазную активность, а другой активность связывания с рецептором. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус гриппа содержит слитый белок, содержащий фрагмент белка гетерологичного инфекционного агента, при этом слитый белок проявляет нейраминидазную активность или активность связывания с рецептором. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус гриппа содержит поверхностный белок, содержащий эктодомен белка HN вируса псевдочумы птиц (NDV) и ТМ и СТ домены белка NA вируса гриппа A/WSN/33, при этом эктодомен HN проявляет нейраминидазную активность. В других вариантах осуществления настоящего изобретения химерный аттенуированный вирус гриппа включает слитый белок, содержащий эктодомен белка НА гетерологичного подтипа или штамма вируса гриппа (например, эктодомен НА Н 7 или эктодомен НА Н 9). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения по крайней мере один слитый белок химерного аттенуированного вируса гриппа по настоящему изобретению не содержит весь эктодомен гетерологичного белка (например, включает антигенный или протективный фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента) и может содержать или может не содержать, кроме того,один или несколько фрагментов эктодомена природного основного гликопротеина. Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка может включать фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка может включать фрагменты и природного основного гликопротеина, и белка гетерологичного инфекционного агента. В вариантах осуществления настоящего изобретения, когда слитый белок замещает основной поверхностный гликопротеин, функцию поверхностного гликопротеина должен обеспечивать слитый белок, т.е. слитый белок должен проявлять функциональность поверхностного гликопротеина, который он замещает. Эктодомен слитых белков, описанных в разделе 5.1.2, может соответствовать или происходит из любого гликопротеина, или его фрагмента, инфекционного агента (в том числе вирусных, бактериальных или паразитарных инфекционных агентов). Неограничивающие примеры гликопротеинов инфекционных агентов представлены в разделе 5.3 ниже. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен плюс 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена основного гликопротеина вируса гриппа. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка NA вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 13, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена белка NA вируса гриппа и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально замещать белок NA. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка NA вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков (остаток) эктодомена белка NA вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка NA вируса гриппа, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально замещать белок NA. В другом варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен или цитоплазматический и трансмембранный домены белка NA, полный домен ножки, или его фрагмент, белка NA, который предшествует его глобулярной головке, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок мо- 24016217 жет функционально замещать белок NA. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка НА вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена белка НА вируса гриппа и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может замещать функцию белка НА. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка НА вируса гриппа, 1-15,1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков (остаток) эктодомена белка НА вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка НА вируса гриппа, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, так что слитый белок может функционально замещать белок НА. Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям (т.е. рекомбинантным сегментам), кодирующим слитые белки, описанные в разделе 5.1.2. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.2., содержат 3' и 5' сигналы встраивания, которые необходимы для правильной репликации, транскрипции и упаковки вирусной РНК (Fujii et al., 2003, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007; Zheng et al., 1996, Virology 217:242-251, каждый из которых полностью включен в настоящее описании в качестве ссылки). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в рекомбинантных сегментах по настоящему изобретению, следовательно, используются 3' и 5' некодирующие и/или нетранслируемые последовательности сегментов вирусов внутри одного и того же типа или штамма вируса, что аттенуированный вирус гриппа, используемый в качестве основы. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.2, которые содержат 3' некодирующую область РНК NA вируса гриппа, кодирующую NA область, соответствующую СТ и ТМ доменам белка NA, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 и 1 остатков (остаток) эктодомена белка NA вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка NA вируса гриппа, нетранслируемые области рамки считывания белка NA и 5' некодирующую область вирусной РНК NA. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.2, которые содержат полноразмерный домен ножки, или его фрагмент, белка NA, который предшествует его глобулярной головке. В качестве альтернативы замещению белков NA или НА аттенуированного вируса гриппа для получения химерного вируса гриппа, содержащего эктодомен инфекционного агента, отличного от вируса гриппа, или связанный с заболеванием антиген и ТМ и/или СТ домены вируса гриппа, можно использовать обратную генетику и бицистронные методы. См., например, патент США 6887699, патент США 6001634, патент США 5854037 и патент США 5820871, каждый из которых таким образом включен в качестве ссылки в настоящее описании в полном объеме. Неограничивающие примеры гетерологичных молекул, таких как связанные с заболеванием антигены и антигены, происходящие из инфекционного агента, которые можно использовать в соответствии со способами по настоящему изобретению, (например, связанные с заболеванием антигены или вирусные белки) представлены в разделе 5.3 ниже. 5.1.3. Химерные вирусы птичьего гриппа, содержащие эктодомен белка HN вируса псевдочумы птиц Настоящим изобретением охватывается конструирование вируса птичьего гриппа, в котором слитый белок, содержащий эктодомен белка HN вируса псевдочумы птиц, кодируется геномом и при экспрессии встраивается в вирион. Можно выбрать и использовать в соответствии с настоящим изобретением любой тип или штамм вируса птичьего гриппа, который можно сконструировать для экспрессии и встраивания в вирион вируса птичьего гриппа слитого белка, включая, но ими не ограничиваясь, природные штаммы, варианты или мутанты, подвергнутые мутагенезу вирусы; гибридные вирусы, содержащие части геномов двух различных вирусов, и/или генетически сконструированные вирусы. Неограничивающие примеры вирусов птичьего гриппа содержат подтип H5N1, H6N2, H7N3, H9N2 или H10N7 вируса гриппа А. Настоящее изобретение относится к химерному вирусу птичьего гриппа, содержащему слитый белок, имеющий эктодомен (ED) белка HN вируса псевдочумы птиц (NDV) и цитоплазматический (СТ) и трансмембранный (ТМ) домены или трансмембранный (ТМ) домен белка NA вируса гриппа, причем слитый белок функционально замещает белок NA вируса птичьего гриппа. Другими словами, вирус птичьего гриппа служит в качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в ее вирион слитого белка вместо белка NA вируса птичьего гриппа. Встраивание ТМ и СТ доменов или ТМ домена белка NA вируса гриппа в слитый белок делает возможным встраивание слитого белка в вирион вируса птичьего гриппа. ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка могут соответствовать или происходить из любого вируса гриппа, который делает возможным встраивание слитого белка в вирион вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы. Кодирующие последовательности ТМ и СТ доменов, используемые в соответствии с настоящим- 25016217 изобретением, могут быть получены или происходить из опубликованной последовательности любого белка NA любого штамма или подтипа вируса гриппа (например, АY651447-данных, введенных в базу данных GenBank, из штамма A/Viet Nam/1203/2004(H5N1); AY96877-данных, введенных в базу данныхGenBank, из штамма A/turkey/Canada/63(H6N2); AY706954-данных, введенных в базу данных GenBank,из штамма A/duck/Hainan/4/2004(H6N2); AY646080-данных, введенных в базу данных GenBank, из штамма A/chicken/British Columbia/GSChumanB/04(H7N3); или DQ064434-данных, введенных в базу данных GenBank, из штамма A/chicken/Beijing/8/98 (H9N2. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену типа или штамма вируса птичьего гриппа, отличного от вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы. В других вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену вируса гриппа, отличного от вируса птичьего гриппа. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены или ТМ домен слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам или ТМ домену вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и СТ доменам белка NA A/WSN/33 вируса гриппа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка NA вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена белка NA вируса гриппа и эктодомен белка HN NDV. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка NA вируса гриппа, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков (остаток) эктодомена белка NA вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка NA вируса гриппа, и эктодомен белка HN NDV. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит полноразмерный домен ножки, или его фрагмент, белкаNA, который предшествует его глобулярной головке, и эктодомен белка HN NDV. В других конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен или цитоплазматический и трансмембранный домены белка NA и, кроме того, включает полный домен ножки, или его фрагмент, белка NA, который предшествует его глобулярной головке, и эктодомен белка HNNDV. В качестве альтернативы замещению белка NA вируса птичьего гриппа для получения химерного вируса гриппа, содержащего эктодомен белка HN NDV и ТМ и/или СТ домены вируса гриппа, можно использовать обратную генетику и бицистронные методы. См., например, патент США 6887699,патент США 6001634, патент США 5854037 и патент США 5820871, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки. Настоящее изобретение относится к нуклеотидным последовательностям (т.е. рекомбинантные сегменты), кодирующим слитые белки, описанные в разделе 5.1.3. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантные сегменты, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.3, содержат 3' и 5' сигналы встраивания, которые необходимы для правильной репликации, транскрипции и упаковки вирусной РНК (Fujii et al., 2 0 03, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 100:2002-2007; Zheng et al., 1996, Virology 217:242-251, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки). В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в рекомбинантных сегментах по настоящему изобретению, следовательно, используются 3' и 5' некодирующие и/или нетранслируемые последовательности сегментов вирусов внутри одного и того же типа или штамма вируса, что используемый в качестве основы вирус птичьего гриппа. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения рекомбинантный сегмент включает нуклеиновые кислоты, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.1.3, которые содержат 3' некодирующую область РНК NA вируса гриппа, кодирующую NA область, соответствующую СТ и ТМ доменам белка NA, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 и 1 остатков (остаток) эктодомена белка NA вируса гриппа, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка NA вируса гриппа, нетранслируемые области рамки считывания белка NA и 5' некодирующую область вирусной РНКNA. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантный сегмент включает, в направлении от 3' к 5', 3' некодирующую область РНК NA вируса WSN (19 нуклеотидов),нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки 1-36 (108 нуклеотидов) кодирующей NA области,нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки 51-568 белка HN NDV B1, два последовательных стоп-кодона, 157 нуклеотидов нетранслируемой области рамки считывания белка NA WSN и 5' некодирующую область РНК вируса WSN (28 нуклеотидов). Смотри фиг. 1. Замещение белка NA вируса гриппа, используемого в качестве основы, или введение рекомбинантного сегмента в вирусный геном может аттенуировать получаемый в результате химерный вирус, т.е. химерный вирус будет проявлять сниженную репликацию относительного дикого типа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения желательна аттенуация химерного вируса, так что химерный вирус остается, по крайней мере частично, инфекционным и может реплицироваться in vivo,но образует только низкие титры, что приводит к субклиническим уровням инфекции, которые не явля- 26016217 ются патогенными. Такие аттенуированные химерные вирусы особенно подходят для таких вариантов осуществления настоящего изобретения, в которых вирус вводят индивиду для того, чтобы он действовал в качестве иммуногена, например, для живой вакцины. Вирусы можно аттенуировать с помощью любого способа, известного в данной области и/или приведенного в качестве примера в данном описании, например конструирования вируса, содержащего мутацию в гене NS1 или содержащего модификацию в аминокислотной последовательности с множеством основных аминокислот перед сайтом расщепления в белке НА (см. патент США 6468544; патент США 6669943; Li et al., 1999, J. Infect. Dis. 179:1132-1138, каждый из которых таким образом в полном объеме включен в настоящее описание в качестве ссылки). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию в гене NS1 вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которая, как известно, в других вирусах гриппа уменьшает способность продукта гена NS1 служить антагонистом ответа, в который вовлечен клеточный интерферон. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению включает геном, содержащий мутацию в гене НА вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которая, как известно, в других вирусах гриппа уменьшает или исключает способность клеточных протеаз расщеплять белок в ее активную форму и, таким образом, уменьшает или исключает индуцируемое НА слияние и инфективность. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения аттенуированный химерный вирус птичьего гриппа по настоящему изобретению содержит геном, содержащий мутацию и в гене НА, и в гене NS1 вируса птичьего гриппа, используемого в качестве основы, которые, как известно, в других вирусах гриппа уменьшают или исключают вирусную активность или по отдельности, или при объединении. Титры аттенуированных химерных вирусов птичьего гриппа и вирусов птичьего гриппа дикого типа можно определить с использованием любого метода, хорошо известного в данной области или описанного в данном описании (например, анализов гемаглютинации, анализов бляшкообразования, инфекционных доз для яйца (EID50), инфекционных доз для культуры тканей (TCID50) и т.п.), и вирусы можно размножить в условиях, описанных в данном описании или хорошо известных в данной области (например, в клеткахCEF, клетках MDCK (например, в MEM, 10% объем/объем фетальной телячьей сыворотки (FCS), 1% пенициллин/стрептомицин при 37 С в инкубаторе с 5% СО 2 и увлажнением) или куриных яйцах с эмбрионами (например, в стационарном инкубаторе при 37 С с 55% относительной влажностью). Альтернативно, вирусы можно размножить в клетках (например, клетках CEF, клетках MDCK и т.п.), которые выращивают в бессывороточной среде или среде с уменьшенным содержанием сыворотки (например,ТРСК трипсин). 5.2. Химерный вирус псевдочумы птиц Настоящее изобретение относится к конструированию вируса псевдочумы птиц (NDV), в котором по крайней мере один слитый белок кодируется геномом и при экспрессии содержится в вирионе. Можно выбрать и использовать в соответствии с настоящим изобретением любой тип или штамм NDV, который можно сконструировать для экспрессии и встраивания в вирион NDV по крайней мере одного слитого белка, содержащий, но ими не ограничиваясь, природные штаммы, варианты или мутанты, подвергнутые мутагенезу вирусы; гибридные вирусы, содержащие части геномов двух различных вирусов, и/или генетически сконструированные вирусы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретенияNDV является встречающимся в природе вирусом. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения NDV является генетически сконструированным вирусом. Например, как описано в настоящем описании, в соответствии со способами по настоящему изобретению можно использовать мутантные штаммы рекомбинантного NDV, rNDV/F2aa и rNDV/F3aa, в которых сайт расщепления белкаF заменен сайтом, содержащим один или два дополнительных остатков аргинина, что делает возможной активацию мутантного сайта расщепления с помощью повсеместно экспрессируемых протеаз семейства фуринов. Неограничивающие примеры NDV, которые можно использовать в соответствии со способами по настоящему изобретению, содержат B1, LaSota, YG97, МЕТ 95 и F48E9. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения химерный NDV или rNDV по настоящему изобретению включает слитый белок, содержащий эктодомен белка НА вируса гриппа; в конкретном примере в соответствии с эти вариантом осуществления белком НА вируса гриппа является белок НА вируса гриппа Н 7. Настоящее изобретение относится к химерному NDV, содержащему по крайней мере один слитый белок, имеющий эктодомен (ED), или его фрагмент, белка инфекционного агента, отличного от белкаNDV, и цитоплазматический (СТ) и/или трансмембранный (ТМ) домены основного гликопротеина NDV. Настоящее изобретение также относится к химерному NDV, содержащему по крайней мере один слитый белок, имеющий ED, или его фрагмент, и ТМ домен белка инфекционного агента, отличного от гликопротеина NDV, и СТ домен основного гликопротеина NDV. Настоящее изобретение, кроме того, относится к химерному NDV, содержащему слитый белок, имеющий ED, или его фрагмент, и СТ домен белка инфекционного агента, отличного от гликопротеина NDV, и ТМ домен основного гликопротеина NDV. Другими словами, вирус NDV служит в качестве основы, которую конструируют для экспрессии и встраивания в ее вирион слитого белка. Встраивание ТМ и/или СТ доменов основного гликопротеинаNDV в слитый белок делает возможным встраивание слитого белка в вирион NDV. TM и/или СТ домены слитого белка могут соответствовать или происходить из любого NDV, который делает возможным встраивание слитого белка в вирион NDV, используемого в качестве основы. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и/или СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и/или СТ доменам типа или штамма NDV, отличного от NDV, используемого в качестве основы. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и/или СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и/или СТ доменам NDV, используемого в качестве основы. Вирион NDV включает два основных поверхностных гликопротеина, белок слияния (F) и гемаглютинин-нейраминидазу (HN), оба из которых содержат цитоплазматический домен, трансмембранный домен и эктодомен. Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения ТМ и/или СТ домены слитого белка соответствуют ТМ и/или СТ доменам или белка F, или белка HNNDV. ТМ и СТ домены белков F или HN NDV структурно отличаются по тому, что домены находятся на С-конце белка F и на N-конце белка HN. Поэтому при конструировании слитого белка в NDV ориентация эктодомена инфекционного агента, сливаемого с ТМ и/или СТ доменами гликопротеина NDV, будет определяться выбором ТМ и/или СТ доменов. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения по крайней мере один слитый белок химерного NDV включает ТМ домен и 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена основного гликопротеина NDV. Например, в конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка F NDV, 1-15,1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена белка F NDV и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от NDV, так что слитый белок может функционально замещать белок F. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка F NDV, 1-15, 1-10, 15, 1-3, 2 или 1 остатков (остаток) эктодомена белка F NDV, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка F NDV, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от NDV, так что слитый белок может функционально замещать белок F. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит трансмембранный домен белка HNNDV, 1-15, 1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 непосредственно примыкающих остатков (остаток) эктодомена белкаHN NDV и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от NDV, так что слитый белок может замещать функцию белка HN. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения слитый белок содержит цитоплазматический и трансмембранный домены белка HN NDV, 1-15,1-10, 1-5, 1-3, 2 или 1 остатков (остаток) эктодомена белка HN NDV, которые непосредственно примыкают к трансмембранному домену белка HN NDV, и эктодомен, или его фрагмент, инфекционного агента, отличного от NDV, так что слитый белок может функционально замещать белок HN. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения поверхностный гликопротеинNDV (т.е. белок HN или F) замещен слитым белком, который обеспечивает требуемую функцию(и) гликопротеина NDV. В соответствии с этими вариантами осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка должен выбираться так, чтобы он обеспечивал требуемую функцию(и) замещенного гликопротеина NDV. В других вариантах осуществления настоящего изобретения слитый белок экспрессируется и встраивается в вирион NDV помимо природных поверхностных гликопротеинов NDV. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения по крайней мере один слитый белок химерного NDV по настоящему изобретению не включает полный эктодомен гетерологичного белка (например, включает антигенный фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента) и может содержать или может не содержать, кроме того, один или несколько фрагментов эктодомена природного основного гликопротеина. Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка может включать фрагмент эктодомена белка гетерологичного инфекционного агента. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эктодомен слитого белка может включать фрагменты и природного основного гликопротеина, и белка гетерологичного инфекционного агента. В вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых слитый белок замещает основной поверхностный гликопротеин, функцию поверхностного гликопротеина должен обеспечивать слитый белок, т.е. слитый белок должен проявлять функциональность поверхностного гликопротеина, которого он замещает. При условии, что слитый белок, описанный в разделе 5.2, не требуется для замещения функции необходимого вирусного гликопротеина, эктодомен слитого белка может соответствовать или происходить из любой гетерологичной молекулы, содержащей, но ими не ограничиваются, любой антиген инфекционного агента (в том числе антигены вирусных, бактериальных и паразитарных инфекционных агентов) и любой связанный с заболеванием антиген. Неограничивающие примеры антигенов инфекционных агентов и/или связанных с заболеванием антигенов представлены в разделе 5.3 ниже. Настоящим изобретением охватываются нуклеотидные последовательности, кодирующие слитые белки, описанные в разделе 5.2. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность включает нуклеиновые кислоты, кодирующие последовательность Kozak,- 28016217 за которой следует конец гена, межцистронный нуклеотид (Т), и последовательность начала гена белка FNDV, за которым следует 5' нетранслируемая область и ORF белка НА H7N2. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения штаммы NDV, используемые в соответствии с настоящим изобретением, являются штаммами вируса со сниженной вирулентностью, т.е. такие штаммы, которые обычно проявляют низкую вирулентность или бессимптомную инфекцию у птиц, например, штамм В 1, штамм LaSota или штамм Met95. Настоящее изобретение также относится к применению высоковирулентных штаммов NDA, например, YG97 или F48E9, или штаммовNDV, которые были модифицированы с помощью генетической рекомбинации с использованием способов, известных в данной области или приведенных в качестве примера в данном описании. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению NDV, в котором белок F NDV был генетически модифицирован в сайте расщепления для того, чтобы увеличить активность слияния. В конкретном примере в соответствии с настоящим изобретением модифицированный белок F включает две-три аминокислотных мутаций в сайте расщепления F. Замещение необходимого поверхностного белка вируса, используемого в качестве основы, или введение нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый белок, в вирусный геном может привести к аттенуации, или дополнительной аттенуации, получаемого в результате химерного вируса, т.е. химерный вирус будет проявлять сниженную репликацию относительно дикого типа. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения желательна аттенуация, или дополнительная аттенуация, химерного вируса, так что химерный вирус остается, по крайней мере частично, инфекционным и может реплицироваться in vivo, но образует только низкие титры, что приводит к субклиническим уровням инфекции, которые не являются патогенными. Такие аттенуированные химерные вирусы особенно подходят для таких вариантов осуществления настоящего изобретения, в которых вирус вводят индивиду для того, чтобы он действовал в качестве иммуногена, например, для живой вакцины. Вирусы можно аттенуировать с помощью любого способа, известного в данной области. 5.3. Антигены, которые можно сконструировать в химерных вирусах по настоящему изобретению В соответствии с настоящим изобретением можно сконструировать любую гетерологичную молекулу в вирусе, используемом в качестве основы, для вызова иммунного ответа на указанную молекулу. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения любой антиген любого инфекционного патогена или любой антиген, связанный с каким-либо заболеванием, который способен вызывать иммунный ответ, можно сконструировать в NDV и/или вирусе гриппа, используемом в качестве основы. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения антигеном является гликопротеин. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения антиген способен функционально заместить основной гликопротеин вируса гриппа и/или NDV. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения антиген проявляет активности нейраминидазы или гемаглютинина (например,слияния/связывания с рецептором). При выборе используемого в качестве основы вируса для экспрессии антигена принимается во внимание ориентация нуклеотидов, кодирующих антиген. Например, если антиген в природе прикрепляется аминоконцом, ТМ и СТ домены или ТМ домен, используемые при конструировании слитого белка, будут соответствовать ТМ и СТ доменам или ТМ домену необходимого вирусного белка вируса, используемого в качестве основы, или родственного вируса, который также в природе прикрепляется через его аминоконец, например, белка NA вируса гриппа или белка HN NDV. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения вирусный антиген конструируют в NDV или вирусе гриппа в качестве основы. Неограничивающие примеры вирусных антигенов содержат антигены Adenoviridae (например, мастаденовируса и авиаденовируса), Herpesviridae (например, вируса 1 простого герпеса, вируса 2 простого герпеса, вируса 5 простого герпеса, вируса 6 простого герпеса, вируса Эпштейна-Барра, HHV6-HHV8 и цитомегаловируса), Leviviridae (например, левивируса, энтеробактерий фазы MS2, аллолевивируса), Poxviridae (например, поксвирусов позвоночных, парапоксивируса, авипоксвируса, каприпоксвируса, лепорипоксвируса, суипоксвируса, вируса контагиозного моллюска и поксвирусов насекомых), Papovaviridae (например, полиомавируса и папилломавируса), Paramyxoviridae (например, парамиксовируса, вируса 1 парагриппа, Mobillivirus (например, вируса кори),Rubulavirus (например, вируса эпидемического паротита), Pneumonovirinae (например, пневмовируса,респираторно-синцитиального вируса), респираторно-синцитиального вируса человека и метапневмовируса (например, пневмовируса птиц и метапневмовируса человека, Picornaviridae (например, энтеровируса, риновируса, гепатовируса (например, вируса гепатита А человека), кардиовируса и артровируса),Reoviridae (например, ортореовируса, орбивируса, ротавируса, циповируса, фидживируса, фитореовируса и оризавируса), Retroviridae (например, ретровирусов типа В млекопитающих, ретровирусов типа С млекопитающих, ретровирусов типа С птиц, группы ретровирусов типа D, ретровирусов BLV-HTLV,лентивируса (например, вируса 1 иммунодефицита человека и вируса 2 иммунодефицита человека (например, gp160 ВИЧ), спумавируса), Flaviviridae (например, вируса гепатита С, вируса денге, вируса Западного Нила), Hepadnaviridae (например, вируса гепатита В), Togaviridae (например, альфавируса (например, вируса Синдбис) и Rubivirus (например, вируса краснухи), Rhabdoviridae (например, везикуловируса, лиссавируса, вируса эфемерной лихорадки, циторабдовируса и нуклеорабдовируса), Arenaviridae