Моноклональное антитело или его фрагмент к подобному ангиопоэтину белку 4 (angptl4) и их применение

МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ИЛИ ЕГО ФРАГМЕНТ К ПОДОБНОМУ АНГИОПОЭТИНУ БЕЛКУ 4 (ANGPTL4) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В изобретении предоставлены моноклональные антитела, которые специфично связываются с ANGPTL4. Предоставлены моноклональные антитела, которые нейтрализуют по меньшей мере один вид активности ANGPTL4. Предоставлены способы лечения нарушения липидного метаболизма с использованием нейтрализующих моноклональных антител. 016185 Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на выдачу патента США 60/642022,поданной 7 января 2005 г., которая включена сюда в виде ссылки для любых целей.I. Область техники, к которой относится изобретение Предоставляются моноклональные антитела, которые специфично связываются с подобным ангиопоэтину белком 4 (ANGPTL4). Предоставляются способы применения моноклональных антител, которые специфично связываются с подобным ангиопоэтину белком 4 (ANGPTL4). Предоставляются фармацевтические композиции, включающие в себя моноклональные антитела, которые специфично связываются с подобным ангиопоэтину белком 4 (ANGPTL4).II. Введение Подобный ангиопоэтину белок 4 консервативен среди нескольких видов млекопитающих, Ge et al.(2004) J. Biol. Chem. 279:2038-2045. Подобный ангиопоэтину белок 4 содержит N-концевой домен с двойной спиралью и С-концевой фибриногенподобный домен, Kim et al. (2000) Biochem. J. 345:603-610.N-концевой сверхскрученный домен опосредует олигомеризацию подобного ангиопоэтину белка 4, Ge etal. (2004) J. Biol. Chem. 279:2038-2045. Олигомеризованный подобный ангиопоэтину белок 4 претерпевает протеолитический процессинг in vivo, что приводит к расщеплению фибриногенподобного домена, GeIII. Сущность изобретения В некоторых вариантах осуществления предоставляется моноклональное антитело, которое специфично связывается с ANGPTL4 и нейтрализует по меньшей мере один вид активности ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является мышиным моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело является гуманизированным моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело человека. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело повышает активность LPL. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело снижает уровень по меньшей мере одного сывороточного липида in vivo. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело связывается с эпитопом в областиSEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 50 от остатка 21 до остатка 174. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело связывается с эпитопом в области SEQ ID NO: 2 от остатка 21 до остатка 169. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело представляет собой 14D12. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело представляет собой 15F2. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело представляет собой 90 В 4. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфично связывается с тем же эпитопом, что и 14D12. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфично связывается с тем же эпитопом,что и 15F2. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело специфично связывается с тем же эпитопом, что и 90 В 4. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, специфично связывающееся сANGPTL4, включающее в себя тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 12-14; по меньшей мере однуCDR, включающую в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 21, 39 и 20; или по меньшей мере одну CDR, включающую в себя аминокислотную последовательность,приведенную в любой из SEQ ID NO: 27-29; где антитело нейтрализует по меньшей мере один вид активности ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, специфично связывающееся с ANGPTL4, включающее в себя легкую цепь, где легкая цепь включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 16-18; по меньшей мере одну CDR,включающую аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 30-32; или по меньшей мере одну CDR, включающую в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 33-35, где антитело нейтрализует по меньшей мере один вид активности ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее тяжелую цепь, которая включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 12-14. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее тяжелую цепь, которая включает в себя по меньшей мере одну CDR, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 21, 39 и 20. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее тяжелую цепь, которая включает в себя по меньшей мере одну CDR, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27-29. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее легкую цепь, которая включает в себя аминокислотную последовательность, приведенную в любой из SEQ ID NO: 16-18. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее легкую цепь, которая включает в себя по меньшей мере одну CDR, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 30-32. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее легкую цепь, которая включает в себя по меньшей мере одну CDR, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ IDNO: 33-35. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя тяжелую цепь, которая содержит-1 016185 аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность,приведенную в SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность,приведенную в SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее тяжелую цепь,включающую в себя CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 21, CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 39, иCDR3, приведенную в SEQ ID NO: 20. В некоторых вариантах осуществления X в SEQ ID NO: 20 является любой аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления X в SEQ ID NO: 20 является гидрофобной аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления X в SEQ ID NO: 20 представляет собой глицин, лейцин, изолейцин, валин или аланин. В некоторых вариантах осуществления X в SEQ ID NO: 20 представляет собой валин или изолейцин. В некоторых вариантах осуществления X в SEQ ID NO: 39 является любой аминокислотой. В некоторых вариантах осуществления X в SEQ ID NO: 39 представляет собой глицин, аспартат или тирозин. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело,содержащее тяжелую цепь, включающую в себя CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 27, CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 28, и CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее легкую цепь, содержащую CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 30, CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 31, и CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления предоставляется антитело, содержащее легкую цепь, включающую CDR1, приведенную в SEQ ID NO: 33, CDR2, приведенную в SEQ ID NO: 34,и CDR3, приведенную в SEQ ID NO: 35. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела. В некоторых вариантах осуществления оно представляет собой scFv-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой Fab-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой F(ab')2-фрагмент. В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собойFab'. В некоторых вариантах осуществления антитело против ANGPTL4 связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления антитело против ANGPTL4 связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 41. В некоторых вариантах осуществления антитело против ANGPTL4 связывается с пептидом,имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления антитело против ANGPTL4 связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 41, и связывается с пептидом, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления предоставляется фармацевтическая композиция, включающая в себя моноклональное антитело, которое специфично связывается с ANGPTL4 и нейтрализует по меньшей мере одну активность ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения нарушения липидного метаболизма, где способ включает в себя введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ снижения уровня одного или нескольких липидов сыворотки, причем способ включает в себя введение пациенту эффективного количества данной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения триглицеридемии, причем способ включает в себя введение пациенту эффективного количества данной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения гиперхолестеринемии, причем способ включает в себя введение пациенту эффективного количества данной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения ожирения, причем способ включает в себя введение пациенту эффективного количества данной фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ лечения диабета, причем способ включает в себя введение пациенту эффективного количества данной фармацевтической композиции.IV. Краткое описание чертежей На фиг. 1 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов, холестерина и свободных жирных кислот (СЖК) у мышей дикого типа в различные моменты времени после инъекции аденовирусной конструкцией, гиперэкспрессирующей полноразмерный мышиный ANGPTL4, как описано в примере В.1. На фиг. 2 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа через трое суток после инъекции аденовирусной конструкции (Ad5-mAngptl-4T), экспрессирующей полноразмерный мышиный ANGPTL4, как описано в примере В.1. На фиг. 3 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого-2 016185 типа через трое суток после инъекции аденовирусной конструкции (Ad5-mAngptl-4T), экспрессирующей полноразмерный мышиный ANGPTL4, как описано в примере В.1. На фиг. 4 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа через четверо суток после инъекции аденовирусной конструкции (Ad5-mAngptl-4 Т), экспрессирующей полноразмерный мышиный ANGPTL4, как описано в примере В.2. На фиг. 5 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого типа через четверо суток после инъекции аденовирусной конструкции (Ad5-mAngptl-4 Т), экспрессирующей полноразмерный мышиный ANGPTL4, как описано в примере В.2. На фиг. 6 показаны сывороточные концентрации триглицеридов, холестерина и свободных жирных кислот (СЖК) у мышей дикого типа (WT) и нокаут-мышей по Angptl4 (НОМ), подвергнутых различным условиям диеты, как описано в примере С. На фиг. 7 показаны масса тела и количество жира в теле мышей дикого типа (WT) и нокаут-мышей по Angptl4 (НОМ), которые получали стандартную диету ("корм") или диету с высоким содержанием жиров (HFD), как описано в примере С. На фиг. 8 показан уровень активности эндогенной липопротеинлипазы (LPL) в мышах дикого типа(WT) и нокаут-мышах по Angptl4 (НОМ) в состояниях с питанием и натощак, как описано в примере D. На фиг. 9 А показаны уровни липидов в печени у мышей дикого типа (WT) и нокаут-мышей поAngptl4 (НОМ), получавших стандартную диету ("корм") или диету с высоким содержанием жиров(HFD). На фиг. 9 В показано гистохимическое окрашивание срезов печени мышей дикого типа (WT) и нокаут-мышей по Angptl4 (НОМ), получавших стандартную диету ("корм") или диету с высоким содержанием жира (HFD), как описано в примере Е. На фиг. 10 показано содержание липидов в миоцитах мышей дикого типа (WT) и нокаут-мышей поAngptl4 (НОМ), получавших диету с высоким содержанием жира (HFD), как описано в примере Е. На фиг. 11, панели А и В, показаны уровни глюкозы и инсулина у мышей дикого типа (WT) и нокаут-мышей по Angptl4 (НОМ), получавших стандартную диету ("корм") или диету с высоким содержанием жира (HFD), как описано в примере F. На панелях С и D показана толерантность к глюкозе и инсулину в мышах дикого типа (WT) и нокаут-мышах Angptl4 (НОМ), получавших диету с высоким содержанием жира (HFD). На фиг. 12 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у нокаутмышей по Angptl4 через трое суток после инъекции аденовирусной конструкции (Ad5-mAngptl-4 Т), экспрессирующей полноразмерный мышиный ANGPTL4, как описано в примере G. На фиг. 13 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у нокаутмышей по Angptl4 через трое суток после инъекции аденовирусной конструкции (Ad5-mAngptl-4 Т), экспрессирующей полноразмерный мышиный ANGPTL4, как описано в примере G. На фиг. 14 показана активность липопротеинлипазы (LPL) in vitro в присутствии возрастающих количеств полноразмерного мышиного ANGPTL4, как описано в примере 1. На фиг. 15 показаны некоторые нейтрализующие моноклональные антитела против мышиногоANGPTL4 (4 А 8, 14D12, и 15F2), которые сохраняли активность LPL от ингибирования ANGPTL4 invitro, как описано в примере L. На фиг. 16 показаны результаты экспериментов для классификации по эпитопам моноклональных антител 4 А 8, 14D12 и 15F2, описанных в примере О. На фиг. 17 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа, получавших стандартную диету, через четверо суток после инъекции моноклональных антител против мышиного ANGPTL4, как описано в примере Р. На фиг. 18 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого типа, получавших стандартную диету, через четверо суток после инъекции моноклональных антител против мышиного ANGPTL4, как описано в примере Р. На фиг. 19 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации свободных жирных кислот(FFA) у мышей дикого типа, получавших стандартную диету, через четверо суток после инъекции моноклональных антител против мышиного ANGPTL4, как описано в примере Р. На фиг. 20 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жира, через четверо суток после инъекции моноклональных антител против мышиного ANGPTL4, как описано в примере Р. На фиг. 21 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жира, через четверо суток после инъекции моноклональных антител против мышиного ANGPTL4, как описано в примере Р. На фиг. 22 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жира, после единичной инъекции моноклональных антител против мышиного ANGPTL4 и после еженедельных инъекций моноклональных антител против мышиного ANGPTL4 в течение 5 недель, как описано в примере Р. На фиг. 23 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жира, после единичной инъекции моноклональных-3 016185 антител против мышиного ANGPTL4 и после еженедельных инъекций моноклональных антител против мышиного ANGPTL4 в течение 5 недель, как описано в примере Р. На фиг. 24 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации кетоновых тел у мышей дикого типа, получавших диету с высоким содержанием жира (HFD), после еженедельных инъекций моноклональных антител против мышиного ANGPTL4 в течение 5 недель, как описано в примере Р. На фиг. 25 показаны измеренные натощак уровни сывороточного триглицерида, общего холестерина, липопротеидов высокой плотности (HDL) и липопротеидов низкой плотности (LDL) у самцов мышей дикого типа ("WT"), гетерозигот ("heb"), и нокаут-мышей ("horn") (панель А) и у самок мышей дикого типа ("WT") и нокаут ("horn") (панель В), получавших стандартную диету ("корм"), как описано в примере С. На фиг. 26 показаны измеренные натощак уровни сывороточного триглицерида, общего холестерина, липопротеидов высокой плотности (HDL) и липопротеидов низкой плотности (LDL) у самцов мышей дикого типа ("WT") и нокаут-мышей ("horn"), получавших диету с высоким содержанием жира (HFD),как описано в примере С. На фиг. 27 показана масса жира тела в граммах у самок (панель А) и самцов (панель В) мышей дикого типа ("WT") и нокаут-мышей по ANGPTL4 ("Horn"), получавших диету с высоким содержанием жира (HFD), как описано в примере С. На фиг. 28 показано потребление пищи (панель А) и процент фекального жира (панель В) у мышей дикого типа ("WT") и нокаут-мышей по ANGPTL4 ("Horn"), получавших диету с высоким содержанием жира, как описано в примере С. На фиг. 29 показано число мышат дикого типа, гетерозиготных и нокаут-мышат, родившихся при скрещивании гетерозиготных родителей, как обсуждается в примере С. На фиг. 30 показана выживаемость мышей дикого типа и нокаут-мышей, получавших диету с высоким содержанием жира (HFD), как описано в примере С. На фиг. 31 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей дикого типа, получавших инъекцию моноклональных антител против ANGPTL4, как описано в примереR. На фиг. 32 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей дикого типа, получавших инъекцию моноклональных антител против ANGPTL4, как описано в примере R. На фиг. 33 показано относительное сродство связывания моноклональных антител 14D12, 15F2 и 90 В 4 в отношении N-mANGPTL4 (панель А) и N-hANGPTL4 (панель В), как описано в примере S. На фиг. 34 показано снижение в процентах измеренного натощак уровня триглицеридов в сыворотке у мышей дикого типа на четвертые сутки (панель А) и седьмые сутки (панель В) после инъекции 14D12 или анти-KLH, как описано в примере Т. На фиг. 35, панели А, показан график концентрации 14D12 и сывороточной концентрации триглицеридов у мышей дикого типа в зависимости от времени после единичной инъекции 14D12, как описано в примере U. На панели В показан график концентрации 14D12 и измеренной натощак концентрации общего холестерина у мышей дикого типа в зависимости от времени после единичной инъекции 14D12,как описано в примере U. На фиг. 36 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у мышей,которые гиперэкспрессируют человеческий ANGPTL4, через четверо суток после инъекции моноклональным антителом против KLH, 14D12, 15F2 или 90 В 4, как описано в примере V. На фиг. 37 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у мышей, которые гиперэкспрессируют человеческий ANGPTL4, через четверо суток после инъекции моноклональным антителом против KLH, 14D12, 15F2 или 90 В 4, как описано в примере V. На фиг. 38 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у нокаутмышей по LDLr после пятнадцати еженедельных инъекций носителем, анти-KLH или 14D12, как описано в примере W. На фиг. 39 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у нокаутмышей по LDLr после пятнадцати еженедельных инъекций носителем, анти-KLH или 14D12, как описано в примере W. На фиг. 40 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у нокаутмышей по АроЕ после пятнадцати еженедельных инъекций носителем, анти-KLH или 14D12, как описано в примере X. На фиг. 41 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у нокаутмышей по АроЕ после пятнадцати еженедельных инъекций носителем, анти-KLH или 14D12, как описано в примере X. На фиг. 42 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у нокаутмышей по LDLr через четверо суток после единичной инъекции анти-KLH или 14D12, как описано в примере W. На фиг. 43 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у нокаутмышей по LDLr через четверо суток после единичной инъекции анти-KLH или 14D12, как описано в-4 016185 примере W. На фиг. 44 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации триглицеридов у нокаутмышей по АроЕ через четверо суток после единичной инъекции анти-KLH или 14D12, как описано в примере X. На фиг. 45 показаны измеренные натощак сывороточные концентрации холестерина у нокаутмышей по АроЕ через четверо суток после единичной инъекции анти-KLH или 14D12, как описано в примере X. На фиг. 46 панели А показан измеренный натощак сывороточный уровень триглицеридов у мышейdb/db до и через неделю после инъекции анти-KLH (Grp-1) и 14D12 (Grp-2), как описано в примере Y. На панели В показан сывороточный уровень триглицеридов у мышей db/db после 8 еженедельных инъекций анти-KLH или 14D12, как обсуждается в примере Y. На фиг. 47 показано выравнивание вариабельных областей тяжелой цепи 14D12 (SEQ ID NO: 12),15F2 (SEQ ID NO: 13) и 90 В 4 (SEQ ID NO: 14), как описано в примере Z. Также показана консенсусная последовательность (SEQ ID NO: 15). Процентная гомология между каждой парой вариабельных областей тяжелой цепи показана ниже. На фиг. 48 показано выравнивание вариабельных областей легкой цепи 14D12 (SEQ ID NO: 16),15F2 (SEQ ID NO: 17) и 90 В 4 (SEQ ID NO: 18), как описано в примере Z. Также показана консенсусная последовательность (SEQ ID NO: 19). Процентная гомология между каждой парой вариабельных областей легкой цепи показана ниже. На фиг. 49 показано связывание некоторых моноклональных антител против ANGPTL4 с фрагментами ANGPTL4, как обсуждается в примере АА.V. Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления Следует понимать, что следующее далее общее описание и следующее подробное описание являются только типовыми и объяснительными, но не ограничивают изобретение, определенное в формуле изобретения. В данной заявке применение единственного числа включает в себя множественное число, кроме конкретно обозначенных иначе случаев. В данной заявке единственное число означает "по меньшей мере один", кроме конкретно обозначенных иначе случаев. В данной заявке применение "или" означает"и/или", кроме обозначенных иначе случаев. Более того, термин "включающий в себя", а также другие термины, например "включает" и "включено", не являются ограничивающими. Также такие термины, как"элемент" или "компонент" охватывают элементы или компоненты, включающие в себя одну единицу, и элементы или компоненты, включающие в себя более одной единицы, кроме конкретно обозначенных иначе случаев. Используемые здесь заголовки разделов предназначены только для целей структуризации и не предполагается, что они ограничивают описанный объект. Все документы или части документов, цитируемые в данной заявке, включая в качестве неограничивающих примеров патенты, заявки на выдачу патента, статьи, книги и трактаты, четко включены сюда полностью в виде ссылки для любой цели. В случае, если один или несколько из включенных литературных или сходных материалов определяет термин противоречиво по отношению к определению термина в данной заявке, данная заявка является определяющей. А. Некоторые определения. Термин "полипептид", "пептид" и "белок" используются здесь взаимозаменяемо для ссылки на полимер аминокислотных остатков. Термины относятся к полимерам аминокислот, содержащим встречающиеся в природе аминокислоты, а также полимеры аминокислот, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются искусственными химическими аналогами встречающейся в природе аминокислоты. Полимеры аминокислот могут иметь любую длину. Используемый здесь термин "антитело" относится к интактному антителу или фрагменту антитела,который конкурирует с интактным антителом за связывание антигена. Фрагменты антитела включают в качестве неограничивающих примеров Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, диатела и другие фрагменты антител, которые сохраняют по меньшей мере одну часть вариабельной области интактного антитела, см.,например, Hudson et al. (2003) Nature Med. 9:129-134. В некоторых вариантах осуществления фрагменты антитела получают ферментативным или химическим расщеплением интактных антител. В некоторых вариантах осуществления фрагменты антитела получают способами рекомбинантной ДНК. Термин "нативный полипептид" относится к встречающемуся в природе полипептиду. Термин "нативное антитело" относится к встречающемуся в природе антителу. Термин "моноклональное антитело" относится к антителу, по существу, из гомогенной популяции антител, которые специфично связываются с одним и тем же эпитопом. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело секретируется гибридомой. В некоторых таких вариантах осуществления гибридому продуцируют некоторыми способами, известными специалистам в данной области, см.,например, Kohler and Milstein (1975) Nature, 256:495-499. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело получают Ic использованием способов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4816567). В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело относится к фраг-5 016185 менту антитела, выделенного из библиотеки фагового дисплея (см., например, Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 и Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597). Для других различных способов получения моноклональных антител см., например, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual"Химерное" антитело относится к антителу, полученному из компонентов по меньшей мере из двух разных источников. В некоторых вариантах осуществления химерное антитело включает в себя часть антитела, происходящего из первого вида, слитую с другой молекулой, например, с частью антитела,происходящего из второго вида. В некоторых таких вариантах осуществления химерное антитело включает в себя часть антитела, происходящего из не относящегося к человеку животного, слитую с частью антитела, происходящей из человека. В некоторых таких вариантах осуществления химерное антитело включает в себя всю вариабельную область или ее часть от антитела, происходящего из не относящегося к человеку животного, слитую константной областью антитела, происходящего из человека."Гуманизированное" антитело относится к не являющемуся человеческим антителу, которое модифицировали так, что оно ближе совпадает (по аминокислотной последовательности) с человеческим антителом. Таким образом, гуманизированное антитело является типом химерного антитела. В некоторых вариантах осуществления модифицируют аминокислотные последовательности вне антигенсвязывающих остатков вариабельной области не относящегося к человеку антитела. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело конструировали путем замены всей определяющей комплементарность области (CDR) или его части в человеческом антителе всей CDR или ее частью из другого антитела, такого как не относящееся к человеку антитело, имеющего требуемую специфичность в отношении связывания антигена. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело включает в себя вариабельные области, в которых все или, по существу, все CDR соответствуют CDR не относящегося к человеку антитела, и все или, по существу, все каркасные области (FR) соответствуют FR человеческого антитела. В некоторых таких вариантах осуществления гуманизированное антитело дополнительно включает в себя константную область (Fc) человеческого антитела. Термин "человеческое антитело" относится к моноклональному антителу, которое содержит последовательности человеческого антитела и не содержит последовательности антитела из животного, не являющегося человеком. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело может содержать синтетические последовательности, не находящиеся в нативных антителах. Данный термин не ограничен способом, которым получены данные антитела. Например, в различных вариантах осуществления человеческое антитело может быть получено в трансгенной мыши, путем фагового дисплея, в человеческих В-лимфоцитах, или рекомбинантными способами. Термин "нейтрализующее антитело" или "антитело, которое нейтрализует" относится к антителу,которое снижает по меньшей мере одну активность полипептида, содержащего эпитоп, с которым данное антитело специфично связывается. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело снижает активность in vitro и/или in vivo. Термин "антигенсвязывающий участок" относится к части антитела, способной специфично связываться с антигеном. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок предоставлен одним или несколькими вариабельными областями антитела. Термин "эпитоп" относится к любой полипептидной детерминанте, способной специфично связываться с иммуноглобулином или В-клеточным рецептором. В некоторых вариантах осуществления эпитоп представляет собой область антигена, который специфично связывается антителом. В некоторых вариантов осуществления эпитоп может включать в себя химически активные поверхностные группировки молекул, таких как аминокислоты, сахарные боковые цепи, фосфорильные или сульфонильные группы. В некоторых вариантах осуществления эпитоп может иметь конкретные характеристики трехмерной структуры (например, "конформационный" эпитоп) и/или конкретные характеристики заряда. Эпитоп определяется как "такой же" как другой эпитоп, если конкретное антитело специфично связывается с обоими эпитопами. В некоторых вариантах осуществления полипептиды, имеющие различные первичные аминокислотные последовательности, могут включать в себя эпитопы, являющиеся одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления эпитопы, которые являются одинаковыми, могут иметь различные первичные аминокислотные последовательности. О различных антителах говорят, что они связываются с одним и тем же эпитопом, если они конкурируют за специфичное связывание с данным эпитопом. Антитело "специфично связывается" с антигеном, когда он преимущественно распознает антиген в комплексной смеси белков и/или макромолекул. В некоторых вариантах осуществления антитело включает в себя антигенсвязывающий участок, которые специфично связывается с конкретным эпитопом. В некоторых таких вариантах осуществления антитело способно связывать различные антигены, если эти различные антигены включают в себя данный конкретный эпитоп. В некоторых случаях, например, гомологичные белки из различных видов могут включать в себя один и тот же эпитоп. В некоторых вариантах осуществления говорят, что антитело специфично связывается с антигеном, когда константа диссоциации (KD)1 мкМ, в некоторых вариантах осуществления когда in константа диссоциации 100-6 016185 нМ, и, в некоторых вариантах осуществления когда константа диссоциации составляет 10 нМ. Термин "ANGPTL4" относится к подобному ангиопоэтину белку 4 из любого позвоночного или млекопитающего, включая в качестве неограничивающих примеров человека, крупный рогатый скот,кур, грызунов, мышь, крысу, свинью, овец, приматов, обезьян и морскую свинку, кроме определенных иначе случаев. Термин также относится к фрагментам и вариантам нативного ANGPTL4, которые сохраняют по меньшей мере один вид активности нативного ANGPTL4 in vivo или in vitro. Термин охватывает полноразмерные непроцессированные формы-предшественники ANGPTL4, а также зрелые формы, возникающие в результате пост-трансляционного расщепления сигнального пептида и формы, возникающие в результате протеолитического процессинга фибриногенового домена. В некоторых вариантах осуществления полноразмерный, непроцессированный мышиный ANGPTL4 имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления полноразмерный, непроцессированный мышиный ANGPTL4 имеет аминокислотную последовательность, приведенную вSEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления полноразмерный, непроцессированный человеческий ANGPTL4 имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2. Термин "Angptl4" относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей ANGPTL4. Термин "LPL" относится к липопротеинлипазе из любого позвоночного или млекопитающего,включая в качестве неограничивающих примеров человека, крупный рогатый скот, кур, грызунов, мышь,крысу, свинью, овец, приматов, обезьян и морскую свинку. В некоторых вариантах осуществления липопротеинлипаза катализирует гидролиз триацилглицерола в хиломикронах и липопротеидах очень низкой плотности (VLDL) с образованием диацилглицерола и аниона свободной жирной кислоты. В некоторых вариантах осуществления липопротеинлипаза также может гидролизовать диацилглицерол. Термин "агент" относится к химическому соединению, к смеси химических соединений, к биологической макромолекуле или к экстракту, полученному из биологических материалов. Термин "антагонист" относится к агенту, который снижает активность ANGPTL4. Термин "агонист" относится к агенту, который повышает активность ANGPTL4. Термин "пациент" включает в себя субъектов-людей и животных. В некоторых вариантах осуществления пациент представляет собой млекопитающее. В некоторых таких вариантах осуществления пациент представляет собой человека."Фрагмент" референсного полипептида относится к непрерывному ряду аминокислот из любой части референсного полипептида. Фрагмент может быть любой длины, меньшей, чем длина референсного полипептида."Вариант" референсного полипептида относится к полипептиду, имеющему одну или несколько аминокислотных замен, делеций или инсерций по отношению к референсному полипептиду."Консервативная" аминокислотная замена относится к замене аминокислоты в полипептиде другой аминокислотой, имеющей сходные свойства, например размер или заряд. В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий консервативные аминокислотные замены, сохраняет по меньшей мере один вид активности незамещенного полипептида. Консервативная аминокислотная замена может включать в себя не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые обычно вводятся путем химического пептидного синтеза, а не путем синтеза в биологических системах. Они включают в себя в качестве неограничивающих примеров пептидомиметики и другие обращенные или инвертированные формы групп аминокислот. Встречающиеся в природе остатки могут подразделяться на классы на основе общих свойств боковых цепей: 1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) кислые: Asp, Glu; 4) основные: His, Lys, Arg; 5) остатки, которые влияют на ориентацию цепей: Gly, Pro; и 6) ароматические: Trp, Tyr, Phe. Например, неконсервативные замены могут включать в себя обмен представителя одного из данных классов на представителя из другого класса. Такие замещенные остатки могут вводиться в области человеческого антитела, гомологичной не относящемуся к человеку антителу, или в негомологичные области молекулы. При проведении замен по настоящим вариантам осуществления может учитываться гидропатический индекс аминокислот. Каждой аминокислоте присвоен гидропатический индекс на основе ее гидрофобности и характеристикам заряда. Они составляют: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин(-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5). В данной области в ряде случаев известна значимость гидропатического аминокислотного индекса в распознавании биологической функции, связанной с взаимодействием белков, Kyte et al., J. Mol. Biol.,157:105-131 (1982). Известно, что в некоторых случаях некоторые аминокислоты могут замещаться на-7 016185 другие аминокислоты, имеющие сходный гидропатический индекс или коэффициент, и при этом сохраняется биологическая активность. При введении изменений, основанных на гидропатическом индексе, в некоторых вариантах осуществления вводится замена аминокислот, гидропатические индексы которых находятся в интервале 2. В некоторых вариантах осуществления вводятся замены в интервале 1 и в некоторых вариантах осуществления вводятся замены в интервале 0,5. Также в данной области известно, что замена подобных аминокислот может эффективно проводиться на основе гидрофильности, в особенности в случаях, где полученный таким образом биологически функциональный белок или пептид предназначается для применения в иммунологических вариантах осуществления, как в настоящем случае. В некоторых вариантах осуществления наибольшая местная средняя гидрофильность белка, направляемая гидрофильностью прилегающих к нему аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, т.е. с биологическими свойствами белка. Данным аминокислотным остаткам присваиваются следующие значения гидрофильности: аргинин(+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,01); глутамат (+3,01); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,51); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). При введении изменений, основанных на сходстве значений гидрофильности, в некоторых вариантах осуществления вводится замена аминокислот, значения гидрофильности которых находятся в интервале 2, в некоторых вариантах осуществления вводятся замены в интервале +1, и в некоторых вариантах осуществления вводятся замены в интервале 0,5. Можно также идентифицировать эпитопы из первичных аминокислотных последовательностей на основе гидрофильности. Данные области также обозначаются как"области ядра эпитопов". Типовые аминокислотные замены приведены в табл. 1. Таблица 1 Аминокислотные замены Специалист в данной области может определить подходящие варианты приведенного здесь полипептида с использованием хорошо известных способов. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может определить подходящие области молекулы, которые могут быть изменены-8 016185 без нарушения активности путем воздействия на области, которые, как полагают, не значимы для активности. В некоторых вариантах осуществления можно идентифицировать остатки и части молекул, консервативных среди сходных полипептидов. В некоторых вариантах осуществления даже области, которые могут быть значимыми для биологической активности или для структуры, могут быть объектами консервативных аминокислотных замен без нарушения биологической активности или без неблагоприятного воздействия на структуру полипептида. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может сделать обзор структурно-функциональных исследований, в которых идентифицируются остатки в сходных полипептидах, которые значимы для активности или структуры. В свете такого сравнения в некоторых вариантах осуществления можно предсказать значимость аминокислотных остатков, значимых для проявления активности или структуры в сходных белках. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может выбрать химически сходные аминокислотные замены для таких предсказанных значимых аминокислотных остатков. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области также может анализировать трехмерную структуру и аминокислотную последовательность в отношении к такой структуре в сходных полипептидах. В некоторых вариантах осуществления в свете такой информации специалист в данной области может предсказывать выравнивание аминокислотных последовательностей антитела в отношении его трехмерной структуры. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может решить не делать радикальных замен аминокислотных остатков, которые, как предсказано, находятся на поверхности белка, поскольку такие остатки могут вовлекаться в важные взаимодействия с другими молекулами. Более того, в некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может генерировать тестируемые варианты, содержащие единичную аминокислотную замену в каждом требуемом аминокислотном остатке. В некоторых вариантах осуществления данные варианты могут затем подлежать скринингу с использованием анализов активности, известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления такие варианты могут использоваться для получения информации о подходящих вариантах. Например, в некоторых вариантах осуществления если открыто, что изменение в конкретном аминокислотном остатке приводит к нарушенной, нежелательно сниженной или неподходящей активности, варианты с такими изменениями могут избегаться. Иными словами, в некоторых вариантах осуществления на основе информации таких рутинных экспериментов специалист в данной области может легко определить аминокислоты, в которых должны избегаться дальнейшие замены отдельно или в комбинации с другими мутациями. Некоторые научные публикации были посвящены предсказанию вторичной структуры, см., например, Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974);Chou et al., Biochemistry, 113 (2) :211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 и Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Более того, в настоящее время доступны компьютерные программы для помощи с предсказанием вторичной структуры. Один из способов предсказания вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например, два полипептида или белка, которые имеют идентичность последовательности свыше 30% или сходство выше 40%, часто имеют сходные структурные топологии. Рост базы данных структур белка(PDB) предоставил повышение предсказательной силы в отношении вторичной структуры, включая потенциальное число вариантов фолдинга в структуре полипептида, см., например, Holm et al., Nucl. Acid.(1997, что имеется ограниченное количество вариантов фолдинга в данном полипептиде или пептиде, и что как только будет разрешено критическое число структур, структурные предсказания станут существенно более точными. Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают в себя "прочесывание"Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997. В некоторых вариантах осуществления вариант антитела сравнения включает в себя вариант гликозилирования, в котором число и/или тип участков гликозилирования изменен относительно аминокислотной последовательности референсного антитела. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида включает в себя большее или меньшее число участков N-гликозилирования относительно нативного полипептида. N-гликозилирование характеризуется последовательностью: Asn-X-Ser или Asn-XThr, в которой аминокислотный остаток, обозначенный как X, может представлять собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина. Замена аминокислотных остатков для создания данной последовательности предоставляет потенциальный новый участок для добавления N-связанной углеводной цепи. Альтернативно, замены, которые элиминируют данную последовательность, будут удалять существующую N-связанную углеводную цепь. В некоторых вариантах осуществления предоставлена перестройкаN-связанных углеводных цепей, при которой один или несколько участков N-гликозилирования (обычно-9 016185 те, которые встречаются в природе) элиминируются и создается один или несколько новых N-связанных участков. Типовые варианты антител включают в себя цистеиновые варианты, в которых один или несколько остатков цистеина подвергнуты делеции или заменены на другие аминокислоты (например, серин) по сравнению с референсной последовательностью антитела. В некоторых вариантах осуществления цистеиновые варианты могут использоваться, когда антитело должно претерпевать изменение фолдинга с образованием биологически активной конформации, например, после выделения нерастворимых телец включения. В некоторых вариантах осуществления цистеиновые варианты имеют меньше остатков цистеина, чем нативные полипептиды. В некоторых вариантах осуществления цистеиновые варианты имеют даже некоторое количество цистеиновых остатков для минимизации взаимодействий, происходящих вследствие неспаренных цистеинов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления аминокислотные замены представляют собой те, которые: (1) снижают чувствительность к протеолизу, (2) снижают чувствительность к окислению, (3) изменяют сродство связывания для образования белковых комплексов, (4) изменяют сродство связывания и/или (4) образуют или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких полипептидов. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления единичные или множественные аминокислотные замены (в некоторых вариантах осуществления консервативные аминокислотные замены) могут быть сделаны во встречающейся в природе последовательности (в некоторых вариантах осуществления в части полипептида вне домена(ов), образующего межмолекулярные контакты). В некоторых вариантах осуществления консервативная аминокислотная замена обычно может существенно не изменять структурных характеристик референсной последовательности (например, в некоторых вариантах осуществления замена аминокислоты не должна вызывать поломку спирали, которая случается в референсной последовательности, или разрушение других типов вторичной структуры, которая характеризует референсную последовательность). Примеры некоторых известных в данной области полипептидных вторичных и третичных структур описаны, например, в Proteins, Structures and Molecular"Процентная идентичность" или "% идентичности" при ссылке на последовательности нуклеиновой кислоты относятся к процентной доле нуклеотидов, идентичных по меньшей мере в двух полинуклеотидных последовательностях, выровненных с использованием алгоритма Basic Local Alignment SearchTool (BLAST), см. Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250. Алгоритм BLAST (версия 2.2.10) предоставлен публично в National Center for Biotechnology Information (NCBI), Бетесда, Мэриленд. Для выравнивания двух полинуклеотидных последовательностей используют инструмент "Blast 2 Sequences", в котором используется программа "blastn" с параметрами, заданными следующим образом по умолчанию: матрица: не применяется; награда за совпадение: 1; штраф за несовпадение: -2; открытие пропуска: 5 штрафных очков; продление пропуска: 2 штрафных очка; параметр для перехода в режим открытия пропусков: 50; ожидание: 10,0; размер слова: 11; фильтр: включен."Процентная идентичность" или "% идентичности" в отношении полипептидных последовательностей относятся к проценту идентичных аминокислот по меньшей мере между двумя полипептидными последовательностями, выровненными с использованием алгоритма Basic Local Alignment Search Tool(BLAST). Cm. Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250. Алгоритм BLAST (версия 2.2.10) предоставляется публично в National Center for Biotechnology Information (NCBI), Бетесда, Мэриленд. Для выравнивания двух полипептидных последовательностей используется инструмент "Blast 2 Sequences", в котором используется программа "blastp", с параметрами, установленными по умолчанию следующим образом: матрица: BLOSUM62; открытие пропуска: 11 штрафных очков; продление пропуска: 1 штрафное очко; параметр для перехода в режим открытия пропусков: 50; ожидание: 10.0; размер слова: 3; фильтр: включен. Термин "эффективная доза" или "эффективное количество" относится к количеству агента, например нейтрализующего антитела, которое приводит к снижению симптомов у пациента или приводит к требуемому биологическому исходу. В некоторых вариантах осуществления эффективной дозы или эф- 10016185 фективного количества достаточно для снижения по меньшей мере одного вида активности ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления эффективную дозу или эффективное количество определяют, как описано выше, в части V.G. Термин "лечение" охватывает терапевтические и профилактические/превентивные меры, кроме указанных иначе случаев. Субъекты, нуждающиеся в лечении, включают в себя в качестве неограничивающих примеров субъектов, уже имевших конкретное состояние или нарушение, а также субъектов,которые рискуют приобрести конкретное состояние или нарушение (например, нуждающихся в профилактических/превентивных мерах). Термин "лечение" относится к введению пациенту средства для терапевтических и/или профилактических/превентивных целей."Терапевтическое средство" относится к средству, которое может вводиться in vivo для обеспечения терапевтического и/или профилактического/превентивного эффекта."Терапевтическое антитело" относится к антителу, которое может вводиться in vivo для обеспечения терапевтического и/или профилактического/превентивного эффекта. Термины "выделенная нуклеиновая кислота" и "выделенный полинуклеотид" применяются взаимозаменяемо и относятся к полинуклеотиду геномного, синтетического происхождения или происхождения из кДНК, или к их комбинации. "Выделенный полинуклеотид" (1) не ассоциирован с частью или целым полинуклеотидом, с которым "выделенный полинуклеотид" находится в природе, или (2) связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе в виде части большей последовательности. В. Структура нативных антител и некоторых фрагментов антител. Нативное антитело обычно имеет тетрамерную структуру. Тетрамер обычно включает в себя две идентичных пары полипептидных цепей, причем каждая пара имеет одну легкую цепь (в некоторых вариантах осуществления примерно 25 кДа) и одну тяжелую цепь (в некоторых вариантах осуществления примерно 50-70 кДа). В нативном антителе тяжелая цепь включает в себя вариабельную область VH и три константные области CH1, CH2 и CH3. Домен VH находится на N-конце тяжелой цепи, а CH3-домен располагается на С-конце. В нативном антителе легкая цепь включает в себя вариабельную область VL и константную область CL. Вариабельная область легкой цепи находится на N-конце легкой цепи. В нативном антителе вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь обычно образуют антигенсвязывающий участок. Константные области обычно отвечают за эффекторную функцию. Нативные человеческие легкие цепи обычно классифицируют на легкие цепи каппа и лямбда. Нативные человеческие тяжелые цепи обычно классифицируют на мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и они определяют изотип антитела, такой как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. IgG имеет подклассы, включающие в себя в качестве неограничивающих примеров IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, включающие в себя в качестве неограничивающих примеров IgM1 и IgM2. IgA имеет подклассы, включающие в себя в качестве неограничивающих примеров IgA1 и IgA2. В нативных человеческих легких и тяжелых цепях вариабельные и константные области обычно соединены "J"-областью длиной примерно 12 или более аминокислот, причем тяжелая цепь также включает в себя "В"-область длиной примерно 10 или более аминокислот, см., например, Fundamental Immunology (1989) ch. 7 (Paul,W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y.). В нативном антителе вариабельные области обычно характеризуются одинаковой общей структурой, в которой относительно консервативные каркасные области (FR) соединены тремя гипервариабельными областями, также называемыми определяющими комплементарность областями (CDR). CDR из двух цепей каждой пары обычно выровнены по каркасным областям, что может обеспечивать связывание специфичного эпитопа. С N-конца на С-конец вариабельные области легких и тяжелых цепей обычно включают в себя домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR на тяжелых цепях обозначаются как H1, H2, и Н 3, тогда как CDR на легких цепях обозначаются как L1, L2 и L3. Обычно CDR3 представляет собой наибольший источник молекулярного разнообразия в антигенсвязывающем участке. Н 3, например, в некоторых случаях может быть коротким, составляя в длину два аминокислотных остатка, или может быть более 26 остатков. Нумерация аминокислот каждого домена обычно приводится в соответствии с определениями Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National(1987) или Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989). В настоящем описании термин "CDR" относится кCDR тяжелой или легкой цепи, кроме указанных иначе случаев."Fab"-фрагмент включает в себя одну легкую цепь, CH1 и вариабельную область одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. "Fab'"-фрагмент включает в себя одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая включает еще одну константную область, простирающуюся между CH1- и СН 2-доменами. Между двумя тяжелыми цепями Fab'-фрагмента может образовываться межмолекулярный дисульфидный мостик с образованием молекулы "F(ab')2"."Fv"-фрагмент включает в себя вариабельные области из тяжелых и легких цепей, но не содержит константных областей. Одноцепочечный Fv-фрагмент (scFv) включает в себя вариабельные области тяжелых и легких цепей, соединенные гибким линкером с образованием единичной полипептидной цепи с- 11016185 антигенсвязывающей областью. Типовые одноцепочечные антитела обсуждаются подробно в WO 88/01649 и патенте США 4946778 и 5260203. В некоторых случаях единственная вариабельная область (половина Fv) может быть способна распознавать и связывать антиген, хотя с более низким сродством, чем Fv. Используемый здесь термин "тяжелая цепь" относится к полипептиду, содержащему часть последовательности вариабельной области тяжелой цепи, достаточную для придания специфичности в отношении антиген отдельно или в комбинации с легкой цепью. Используемый здесь термин "легкая цепь" относится к полипептиду, содержащему часть последовательности вариабельной области легкой цепи, достаточную для придания специфичности в отношении антиген отдельно или в комбинации с тяжелой цепью. С. Конкретные антитела. В некоторых вариантах осуществления предоставляют моноклональные антитела, которые специфически связываются с ANGPTL4. В некоторых таких вариантах осуществления моноклональные антитела являются нейтрализующими моноклональными антителами, которые уменьшают по меньшей мере один вид активности ANGPTL4 in vivo и/или in vitro. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело противANGPTL4 восстанавливает активность LPL в присутствии ANGPTL4 in vitro. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ANGPTL4 уменьшает уровень триглицеридов в сыворотке in vivo. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ANGPTL4 уменьшает общий уровень холестерина in vivo. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ANGPTL4 уменьшает уровень свободных жирных кислот (FFA) in vivo. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело противANGPTL4 уменьшает уровень триглицеридов в сыворотке у LDLr-нокаутных мышей in vivo. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ANGPTL4 уменьшает уровень общего холестерина в сыворотке у LDLr-нокаутных мышей in vivo. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ANGPTL4 уменьшает уровень триглицеридов в сыворотке у АроЕ-нокаутных мышей in vivo. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ANGPTL4 уменьшает уровень общего холестерина в сыворотке у АроЕ-нокаутных мышей in vivo. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ANGPTL4 уменьшает уровень триглицеридов в сыворотке у db/db мышей invivo. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело противANGPTL4 уменьшает уровень общего холестерина в сыворотке у db/db мышей in vivo. В некоторых вариантах осуществления предоставляют моноклональные антитела, которые специфически связываются с ANGPTL4 мыши. В некоторых вариантах осуществления предоставляются моноклональные антитела, которые специфически связываются с ANGPTL4 человека. В некоторых вариантах осуществления предоставляются моноклональные антитела, которые специфически связываются с тем же эпитопом в ANGPTL4 из разных видов (т.е. антитела, которые демонстрируют перекрестную реактивность). В таких вариантах осуществления антитела специфически связываются как с ANGPTL4 мыши, так и с ANGPTL4 человека. В некоторых вариантах осуществления предоставляют нейтрализующие моноклональные антитела,которые специфически связываются с эпитопом в N-концевом домене двойной цепи ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления предоставляются нейтрализующие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом в N-концевом домене двойной цепи ANGPTL4 мыши. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом, находящимся в участке ANGPTL4 мыши (SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 50) с 21 по 174 остаток. В некоторых вариантах осуществления предоставляются нейтрализующие моноклональные антитела, которые специфически связываются с эпитопом в N-концевом домене двойной цепи ANGPTL4 человека. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела специфически связываются с эпитопом, находящимся в участке ANGPTL4 человека (SEQ ID NO: 2) с 21 по 169 остаток. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются моноклональными антителами, не относящимися к человеку. В некоторых таких вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются моноклональными антителами грызунов. В некоторых таких вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются моноклональными антителами мыши. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются химерными моноклональными антителами. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются гуманизированными моноклональными антителами. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются моноклональными антителами человека. В некоторых вариантах осуществления химерные, гуманизированные моноклональные антитела и/или моноклональные антитела человека используются как терапевтические антитела для человека. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующие моноклональные антитела являются фраг- 12016185 ментами антител. Типичные фрагменты антител включены в нижеследующий список, но не ограничены им: Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, диатела и другие фрагменты антител. Предоставляются типичные нейтрализующие моноклональные антитела, обозначенные 14D12,90 В 4 и 15F2. Эти антитела связываются с эпитопом, находящимся между остатками 21 и 174 ANGPTL4 мыши (SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 50). Эти антитела также нейтрализуют активность ANGPTL4. Таким образом, антитела, которые связываются с одним и тем же эпитопом (например, в ANGPTL4 либо человека, либо мыши), также ожидаются обладающими нейтрализующей активностью. Конкретные нейтрализующие моноклональные антитела против ANGPTL4 связываются с одним или несколькими пептидами, выбранными из SEQ ID NO 40-48. Конкретные нейтрализующие моноклональные антитела против ANGPTL4 связываются с одним или несколькими пептидами, выбранными из SEQ ID NO 40-43. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ANGPTL4 связывается с пептидом, имеющим последовательность из SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее моноклональное антитело против ANGPTL4 связывается как с пептидом,имеющим последовательность из SEQ ID NO: 41, так и с пептидом, имеющим последовательность изSEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления предоставляются нейтрализующие моноклональные антитела, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 14D12. В некоторых вариантах осуществления предоставляются нейтрализующие моноклональные антитела, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 15F2. В некоторых вариантах осуществления предоставляются нейтрализующие моноклональные антитела, которые связываются с тем же эпитопом, с которым связывается моноклональное антитело 90 В 4. Конкретные нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 12. Конкретные нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 13. Конкретные нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 14. Конкретные нейтрализующие антитела включают легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 16. Конкретные нейтрализующие антитела включают легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот,приведенной в SEQ ID NO: 17. Конкретные нейтрализующие антитела включают легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 18. Конкретные нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 12, и легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 16. Конкретные нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 13, и легкую цепь,составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 17. Конкретные нейтрализующие антитела включают тяжелую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, составленную из последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 18. 1. Химерные и гуманизированные моноклональные антитела. В некоторых вариантах осуществления антитела, не относящиеся к человеку, являются химерными. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела мыши, которые специфически связываются с ANGPTL4 человека, являются химеризованными. Конкретные примерные способы для получения химерных антител представлены, например, в Morrison et al. (1984) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al. (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al. (1985) Nature 314:452-454 и патентах США 6075181 и 5877397. В некоторых вариантах осуществления антитела, не относящиеся к человеку, являются "гуманизированными". В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела мыши, которые специфически связываются с ANGPTL4 человека, являются гуманизированными. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела мыши, индуцированные против ANGPTL4 мыши, но которые специфически связываются (т.е. перекрестно реагируют) с ANGPTL4 человека, являются гуманизированными. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела сохраняют их специфичность связывания и имеют сниженную иммуногенность (например, сниженный ответ человека на мышиные антитела (НАМА при введении человеку. В некоторых вариантах осуществления гуманизация достигается способами, включая, но не ограничиваясь переносом CDR и конструированием с целью гуманизации инженерным способом, как ниже описано в подробностях. В некоторых вариантах осуществления гуманизированных антител один или несколько гипервариабельных участков (CDR) из легкой и тяжелой цепи вариабельных областей антитела с требуемой специфичностью связывания ("донорное" антитело) переносятся на каркасные области (FR) в акцепторном антителе человека. Примеры переноса гипервариабельных участков описаны, например, в патентах США 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101; Queen et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:1002910033. В некоторых вариантах осуществления один или несколько гипервариабельных участков из легкой и тяжелой цепи вариабельных областей переносятся на консенсус каркасных областей в акцепторном- 13016185 антителе человека. Для создания консенсуса каркасных областей антител человека в некоторых вариантах осуществления каркасные области из нескольких тяжелых или легких цепей антител человека выравниваются с целью определения консенсуса аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления определенные аминокислоты в каркасной области в акцепторном антителе могут быть заменены на аминокислоты из каркасной области донорного антитела. В некоторых таких вариантах осуществления аминокислоты из каркасной области донорного антитела являются аминокислотами, которые способствуют сродству донорного антитела для целевого антигена,см., например, патенты США 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101; Queen et al. (1989) Proc.Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033. В некоторых вариантах осуществления используются компьютерные программы для моделирования донорных и/или акцепторных антител для определения аминокислотных остатков, которые вероятно участвуют в связывании антигена и/или вносят вклад в структуру антиген-связывающего сайта, таким образом способствуя выбору аминокислотных остатков, таких как остатки каркасной области, подлежащих замене в донорном антителе. В некоторых вариантах осуществления гипервариабельные участки из донорного антитела переносятся на акцепторное антитело, содержащее константную область антитела человека. В некоторых таких вариантах осуществления каркасные области также переносятся на акцептор. В некоторых вариантах осуществления гипервариабельные участки из донорного антитела получают из одноцепочечного Fvфрагмента антитела. В некоторых вариантах осуществления каркасные области из донорного антитела получают из одноцепочечного Fv-фрагмента антитела. В некоторых вариантах осуществления перенесенные гипервариабельные участки в гуманизированном антителе в дальнейшем модифицируются (например, путем замены аминокислот, делеций или вставок) для увеличения сродства гуманизированного антитела к целевому антигену. В некоторых вариантах осуществления антитела, не встречающиеся у человека, могут быть гуманизированы, используя генно-инженерный способ, см., например, патенты США 5766886 и 5869619. В некоторых вариантах осуществления инженерного способа информация о структуре вариабельных доменов антитела (например, информация, полученная из кристаллических структур и/или путем молекулярного моделирования) используется для оценки вероятности того, что данный аминокислотный остаток в вариабельной области (а) участвует в связывании антигена, (b) находится на поверхности антитела (т.е. доступен для растворителя) или (с) находится внутри вариабельного участка атитела (т.е. участвует в поддержании структуры вариабельного участка). Более того, в некоторых вариантах осуществления консенсусные последовательности вариабельных участков антител человека генерируются, чтобы идентифицировать аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди вариабельных участков антител человека. В некоторых вариантах осуществления эта информация способствует принятию решения о том, должен ли быть заменен аминокислотный остаток в вариабельном участке антител, не встречающихся у человека. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую CDR1, CDR2 иCDR3 из 14D12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащуюCDR1, CDR2 и CDR3 из 15F2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь,содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 из 90 В 4. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 14D12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 15F2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 90 В 4. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 14D12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 15F2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя тяжелую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 90 В 4. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую CDR1, CDR2 иCDR3 из 14D12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащуюCDR1, CDR2 и CDR3 из 15F2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую CDR1, CDR2 и CDR3 из 90 В 4. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 14D12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 15F2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере один гипервариабельный участок из 90 В 4. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 14D12. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 15F2. Некоторые нейтрализующие антитела включают в себя легкую цепь, содержащую по меньшей мере два гипервариабельных участка из 90 В 4. 2. Изотипы антител. В некоторых вариантах осуществления антитело против ANGPTL4 может быть любым изотипом,выбранным из IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. В некоторых вариантах осуществления антитело противANGPTL4 имеет IgG изотип. В некоторых таких вариантах осуществления антитело принадлежит субклассу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитело против ANGPTL4 имеет IgM изотип. В некоторых таких вариантах осуществления антитело принадлежит субклассу IgM1 или IgM2. В некоторых вариантах осуществления антитело против ANGPTL4 имеет IgA изотип. В некоторых таких вариантах осуществления антитело принадлежит субклассу IgA1 или IgA2. В некоторых вариантах осуществления антитело против ANGPTL4 включает в себя легкую каппа-цепь антитела человека и тяжелую цепь IgG1 или IgG2 антитела человека. В некоторых вариантах осуществления антитело против ANGPTL4 включает в себя легкую каппа-цепь антитела мыши и тяжелую цепь IgG1 или IgG2 антитела мыши. 3. Модифицированные антитела. В различных вариантах осуществления антитело модифицируется с целью изменить одно или несколько его свойств. В некоторых вариантах осуществления модифицированное антитело может обладать преимуществами по сравнению с немодифицированным антителом, такими как увеличенная стабильность, увеличенное время циркуляции или уменьшенная иммуногенность (см., например, патент США 4179337). В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируется путем присоединения небелковой группировки. В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируется путем изменения состояния гликозилирования антитела, например, изменяя число, тип, связь и/или позицию углеводных цепей на антителе. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько химических группировок присоединяются к аминокислотному остову и/или к углеводным остаткам антитела. Конкретные типовые способы присоединения химических группировок к антителу известны специалистам в этой области. Такие способы включают, но не ограничены следующим списком: реакции ацилирования или реакции алкилирования, см., например, ЕР 0401384; Malik et al. (1992), Exp. Hematol., 20:1028-1035; Francis (1992), Focus onEP 0154316; EP 0401384; WO 92116221; WO 95134326; WO 95113312; WO 96111953; WO 96119459 и WO 96119459. В некоторых вариантах осуществления любые из этих реакций используются для получения антитела, которое является химически модифицированным на его N-конце. В некоторых вариантах осуществления антитело присоединяется к детектируемой метке, такой как ферментной, флуоресцентной, изотопной или аффинной метке. В некоторых таких вариантах осуществления детектируемая метка позволяет определять или изолировать антитело. В некоторых вариантах осуществления детектируемая метка позволяет определять антиген, связанный с антителом. В некоторых вариантах осуществления антитело модифицируется путем присоединения его к одному или нескольким полимерам. В некоторых вариантах осуществления антитело присоединяется к одному или нескольким водорастворимым полимерам. В некоторых таких вариантах осуществления соединение с водорастворимым полимером уменьшает вероятность того, что антитело будет преципитировать в водном окружении, таком как физиологические условия. В некоторых вариантах осуществления терапевтическое антитело присоединяется к водорастворимому полимеру. В некоторых вариантах осуществления специалист в данной области может выбрать подходящий водорастворимый полимер, основываясь на соображениях, включающих, но не ограниченных тем, будет ли конъюгат полимер/антитело использоваться в лечении пациента и, в таком случае, учесть фармакологические свойства антитела (например, время полужизни, дозу активность, антигенность и/или другие факторы). Некоторые типичные клинически допустимые водорастворимые полимеры включают, но не ограничены следующим списком: полиэтиленгликоль (PEG); полиэтиленгликоля пропиональдегид; сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля; монометокси-полиэтиленгликоль; карбоксиметилцеллюлоза; декстран; поливиниловый спирт (PVA); поливинилпирролидон; поли-1,3-диоксалан; поли-1,3,6-триоксан; сополимеры этилена/малеинового ангидрида; полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры); поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль; гомополимеры полипропиленгликоля(PPG) и других полиалкиленоксидов; сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида; полиоксиэтилированные полиолы (РОО (например, глицерин) и другие полиоксиэтилированные полиолы; полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированная глюкоза, кишечные кислоты или другие углеводные полимеры; и фиколл, декстран или смеси этого. Некоторые типичные PEG включают в себя в качестве неограничивающих примеров некоторые формы, известные в данной области как использующиеся в модификации антител, например моно(C1-C10)алкокси- или арилокси-PEG. В некоторых вариантах осуществления пропиональдегид-PEG может иметь преимущества при производстве благодаря его стабильности в воде. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер может иметь любую молекулярную массу. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер может быть разветвленным или неразветвленным. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу от примерно 2 до примерно 100 кДа, включая все точки между концевыми точками этого диапазона. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу от примерно 5 до примерно 40 кДа. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу от примерно 10 до примерно 35- 15016185 кДа. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет среднюю молекулярную массу от примерно 15 до примерно 30 кДа. В некоторых вариантах осуществления антитело присоединено к PEG (т.е. антитело является "PEGмодифицированным"). В различных вариантах осуществления PEG имеет низкую токсичность для млекопитающих, см. Carpenter et al. (1971) Toxicol. Appl. Pharmacol., 18, 35-40. В частности, PEGпроизводные аденозиндезаминазы были рекомендованы в Соединенных Штатах для применения у людей для лечения тяжелого комбинированного синдрома иммунодефицита. В различных вариантах осуществления PEG может уменьшать иммуногенность антител. Например, в некоторых вариантах осуществления присоединение PEG к антителу, имеющему последовательность, не встречающуюся у человека,может уменьшать антигенность этого антитела при введении людям. В некоторых вариантах осуществления полимер присоединяется к одной или нескольким реакционноспособным аминокислотным остаткам антитела. Типичные примеры реакционноспособных аминокислотных остатков включают, но не ограничены следующим списком: альфа-аминогруппа N-концевой аминокислоты, эпсилон-аминогруппы боковых цепей лизина, сульфгидридные группы боковых цепей цистеина, карбоксильные группы боковых цепей аспартила и глутамила, альфа-карбоксильная группа Сконцевой аминокислоты, боковые цепи тирозина, активированные гликозильные цепи, присоединенные к некоторым остаткам аспарагина, серина или треонина. Некоторые типичные примеры активированных форм PEG (PEG-реагенты), подходящие для прямых реакций с белками, известны специалистам в данной области. Например, в некоторых вариантах осуществления PEG-реагенты, подходящие для присоединения к аминогруппам включают, но не ограничены следующим списком: активные эфиры карбоновых кислот или карбоновые производные PEG, например те, у которых группа замещения это Nгидроксисукцинимид, п-нитрофенол, имидазол или 1-гидрокси-2-нитробензол-4-сульфонат. В некоторых вариантах осуществления PEG-реагенты, содержащие малеимидо- или галогенацетильные группы, используются для модификации сульфгидрильных групп. В некоторых вариантах осуществления PEGреагенты, содержащие амино, гидразиновые и/или гидразидные группы, могут быть использованы в реакциях с альдегидами, полученными способом окисления периодатом углеводных групп в белках. В некоторых вариантах осуществления водорастворимый полимер имеет по меньшей мере одну реакционноспособную группу. В некоторых вариантах осуществления активированная производная водорастворимого полимера, такого как PEG создается путем реакции водорастворимого полимера с активирующей группой. В некоторых вариантах осуществления активирующая группа может быть монофункциональной, бифункциональной или мультифункциональной. Некоторые типичные примеры активирующих групп, которые могут быть использованы для сшивки водорастворимого полимера к двум или более антителам, включают, но не ограничены следующим списком: сульфоны (например хлорсульфоны, винилсульфоны и дивинилсульфоны), малеимид, сульфгидрил, тиол, трифлат, трезилат, азиридин,оксиран и 5-пиридил. В некоторых вариантах осуществления производная PEG обычно устойчива против гидролиза при длительном пребывании в водном окружении при рН около 11 или меньше. В некоторых вариантах осуществления производная PEG, сшитая с другой молекулой, такой как антитело, придает устойчивость к гидролизу этой молекуле. Некоторые типичные гомобифункцинальные производные PEG включают, но не ограничены следующим списком: PEG-бис-хлорсульфон и PEG-бис-винилсульфон (см.D. Некоторые способы получения моноклональных антител 1. Некоторые гибридомные способы. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела получают стандартными способами. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела получают гибридомными способами. Некоторые такие способы известны специалистам в данной области, см., например, Kohler et al.Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). В некоторых таких вариантах осуществления подходящее животное, такое как мышь, крыса, хомяк, обезьяна или другое млекопитающее, иммунизируется иммуногеном для получения антиген-продуцирующих клеток. В некоторых вариантах осуществления антиген-продуцирующими клетками являются В-клетки, такие как лимфоциты или спленоциты. В некоторых вариантах осуществления лимфоциты (например, лимфоциты человека) иммунизируются in vitro для получения антиген-продуцирующих клеток, см., например, Borreback et al. (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci.USA 85:3995-3999. В некоторых вариантах осуществления антител-продуцирующие клетки сливают с "иммортализованной" клеточной линией, такой как миеломоподобная клеточная линия, для получения гибридомных клеток. В некоторых вариантах осуществления гибридомные клетки, которые продуцируют желаемые антитела, определяются, например, с помощью ELISA. В некоторых вариантах осуществления такие клетки могут быть потом еще раз пассированы и культивированы с использованием стандартных способов. В некоторых вариантах осуществления такие клетки также могут быть выращены in vivo как асцитные опухоли в подходящем животном-хозяине. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела выделяют из среды для культуры гибридомы, сыворотки или асцитной жидкости с использованием стандартных методов разделения, таких как аффинная хроматография. Руководство для получения гибридом и очистке моноклональных антител представлено, например, в Harlow and Lane (1988) Antibod- 16016185ies: A Laboratory Manual Ch. 8 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела мыши продуцируются путем иммунизации иммуногеном генетически-модифицированных мышей. В некоторых таких вариантах осуществления мыши являются ANGPTL4-дефицитными мышами, у которых частично или полностью отсутствует функция ANGPTL4. В некоторых таких вариантах осуществления мыши являются нокаутными мышами, у которых отсутствует весь ген или часть гена ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела человека индуцируются в трансгенных животных (например, у мыши), которые способны к продуцированию антител человека, см., например, патенты США 6075181 А и 6114598 А и WO 98124893 А 2. Например, в некоторых вариантах осуществления гены иммуноглобулинов человека вводятся (например, используя искусственные хромосомы дрожжей, фрагменты хромосом человека или интеграцию в клетки зародышевой линии) в мышь, у которой эндогенные гены Ig были дезактивированы, см., например, Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258; Tomizuka et al. (2000) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:722-727 и Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15146-156 (описывающая трансгенную линию мышей XenoMouse II). В некоторых вариантах осуществления такие трансгенные мыши иммунизируются иммуногеном. В некоторых таких вариантах осуществления, получают лимфатические клетки (такие как В-клетки) мыши,которые экспрессируют антитела. В некоторых таких вариантах осуществления, таким образом, полученные клетки сливаются с "иммортализованной" клеточной линией, такой как миеломоподобная клеточная линия, для получения гибридомных клеток. В некоторых таких вариантах осуществления гибридомные клетки подвергаются скринингу и отбираются, чтобы идентифицировать те клетки, которые продуцируют антитела, специфичные к интересующему антигену. Некоторые типичные способы и трансгенные мыши, подходящие для продуцирования моноклональных антител человека описаны, например, в Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258; Jakobovits (1995) Curr. Opin. Biotechnol. 6:561-566;Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:122-121; сделан обзор в Little et al. (2000) Immunol. Today 21:364-370 и WO 98124893. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела человека против ANGPTL4 могут быть использованы как терапевтические антитела, см. ниже часть V.G. 2. Некоторые способы, основанные на дисплее. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела человека получают с использованием дисплей-ориентированного способа, такого, например, как любой из описанных ниже. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело получают с использованием технологий фагового дисплея. Некоторые типичные способы фагового дисплея применительно к антителам известны специалистам в данной области и описаны, например, в Hoogenboom, Overview of AntibodyMethods and Protocols (2002) 178:1-37 (O'Brien and Aitken, eds., Human Press, Totowa, NJ). Например, в некоторых вариантах осуществления библиотека антител экспонируется на поверхности нитевидного фага, такого как нитевидный нелизирующий фаг fd или М 13. В некоторых вариантах осуществления антитела являются фрагментами антител, такими как scFv, Fab, Fv с введением путем инженерии внутримолекулярной дисульфидной связи для стабилизации пары VH-VL и диател. В некоторых вариантах осуществления антитела с требуемой специфичностью связывания впоследствии могут быть отобраны. Некоторые типичные варианты осуществления способов фагового дисплея описаны ниже более подробно. В некоторых вариантах осуществления библиотека фагового дисплея для антител может быть приготовлена с использованием некоторых способов, известных специалистам в данной области, см., например, Hoogenboom, Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications, from Methods inMolecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178: 1-37 (O'Brien and Aitken,eds., Human Press, Totowa, NJ). В некоторых вариантах осуществления различные репертуары генов приготовляются с помощью ПЦР-амплификации геномной ДНК или кДНК, полученной из мРНК антителпродуцирующих клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления кДНК приготовляется из мРНК В-клеток. В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующую вариабельные области тяжелых и легких цепей, амплифицируют, например, с помощью ПЦР. В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи клонируют в подходящий вектор. В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи случайным образом комбинируют в процессе клонирования с получением, таким образом, объединенной библиотеки кДНК, кодирующей различные scFv или Fab-фрагменты. В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи лигируют перед клонированием в подходящий вектор. В некоторых вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и кДНК легкой цепи лигируют путем последовательного клонирования в подходящий вектор. В некоторых вариантах осуществления кДНК клонируется в вектор фагового дисплея, такой как фагмидный вектор. Некоторые типичные фагмидные векторы, такие как pCES1, известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующая и тяжелую и легкую цепи,- 17016185 представлена на том же векторе. Например, в некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующаяscFv, клонируется с сохранением рамки считывания с частью или с целым геном III, который кодирует малый белок PIII оболочки фага. В некоторых таких вариантах осуществления фагмида управляет экспрессией комплекса scFv-pIII на поверхности фага. С другой стороны, в некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующая тяжелую цепь (или легкую цепь), клонируется с сохранением рамки считывания с частью или с целым геном III, и кДНК, кодирующая легкую цепь (или тяжелую цепь), клонируется после сигнальной последовательности в том же самом векторе. Сигнальная последовательность управляет экспрессией легкой цепи (или тяжелой цепи) в периплазме клетки-хозяина, где тяжелые и легкие цепи собираются в Fab-фрагменты. С другой стороны, в некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующая тяжелую цепь, и кДНК, кодирующая легкую цепь, представлены на отдельных векторах. В некоторых таких вариантах осуществления кДНК тяжелой цепи и легкой цепи клонируются раздельно, одна в фагмиду, а другая - в фаговый вектор, которые оба содержат сигналы для рекомбинации в клеткехозяине in vivo. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная фагмида или фаговые векторы вводятся в подходящего бактериального хозяина, такого как E. coli. В некоторых вариантах осуществления с использованием фагмиды хозяин инфицируется вспомогательным фагом для получения структурных белков фага, таким образом позволяя экспрессию фаговых частиц, несущих комплекс антитело-белок pIII на поверхности фага. В некоторых вариантах осуществления конструируются "синтетические" библиотеки антител, используя репертуары вариабельных генов, которые пересортировываются in vitro. Например, в некоторых вариантах осуществления отдельные сегменты генов, кодирующие тяжелые или легкие цепи (V-D-J илиV-J соответственно) случайным образом комбинируются с использованием ПЦР. В некоторых таких вариантах осуществления дополнительное разнообразие последовательностей может быть получено в CDR и, возможно, FR, например, используя подверженную ошибкам ПЦР. В некоторых таких вариантах осуществления дополнительное разнообразие последовательностей может быть получено в CDR3, например в Н 3 тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления "первичные" или "универсальные" библиотеки фаговых дисплеев конструируются, как описано выше, используя нуклеиновые кислоты, полученные из неиммунизированных животных. В некоторых вариантах осуществления неиммунизированным животным является человек. В некоторых вариантах осуществления "иммунизированные" библиотеки фаговых дисплеев конструируются, как описано выше, используя нуклеиновые кислоты, полученные из иммунизированных животных. В некоторых вариантах осуществления неиммунизированным животным является человек, крыса, мышь, хомяк или обезьяна. В некоторых вариантах осуществления животные иммунизируются любым из описанных ниже иммуногенов. Некоторые типичные библиотеки фаговых дисплеев антител человека доступны из коммерческих источников. Некоторые типичные библиотеки включают, но не ограничены следующим списком: наборы библиотек HUCAL от MorphoSys AG (Мартинштрайд/Мюних, Германия); библиотеки от Crucell(Лунд, Швеция) и библиотеки, доступные от Cambridge Antibody Technology (Кембридж, Великобритания). В некоторых вариантах осуществления отбор антител, имеющих желаемую специфичность связывания из библиотеки фаговых дисплеев, достигается путем последовательных шагов пэннинга. В некоторых вариантах осуществления пэннинга библиотека фаговых препаратов экспонируется антигену. В некоторых таких вариантах осуществления комплексы фаг-антиген отмываются и несвязавшийся фаг удаляется. В некоторых таких вариантах осуществления связавшийся фаг восстанавливается и повторно амплифицируется путем инфицирования E. coli. В некоторых таких вариантах осуществления фаг, продуцирующий моноклональные антитела, может быть клонирован путем изъятия отдельных бляшек. В некоторых вариантах осуществления процесс, описанный выше, повторяется. В некоторых вариантах осуществления антиген, используемый в пэннинге, может быть любым из иммуногенов, описанных ниже. В некоторых вариантах осуществления антиген иммобилизуется на твердой подложке для того, чтобы позволить очистку антигенсвязывающего фага путем аффинной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления антиген биотинилируется, таким образом, позволяя разделение связавшегося фага от несвязавшегося фага, используя покрытые стрептавидином магнитные гранулы. В некоторых вариантах осуществления антиген может быть иммобилизован на клетках (для прямого пэннинга) в срезах замороженных тканей или на мембранах (например, нейлоновая или нитроцеллюлозная мембраны). Другие варианты некоторых процедур пэннинга могут быть обычно определены специалистом в данной области. В некоторых вариантах осуществления система дрожжевого дисплея используется для получения моноклональных антител. В некоторых таких системах антитело экспрессируется как слитый белок с целым дрожжевым белком AGA2 или с его частью, который появляется на поверхности клеточной стенки дрожжей. В некоторых таких вариантах осуществления дрожжевые клетки, экспрессирующие антите- 18016185 ла с желаемой специфичностью связывания, могут потом быть определены путем экспозиции клеток флуоресцентно-меченному антигену. В некоторых таких вариантах осуществления дрожжевые клетки,которые связывают антиген, могут быть выделены путем проточной цитометрии, см., например, Boder etal. (1997) Nat. Biotechnol. 15:553-557. 3. Некоторые способы созревания сродства. В некоторых вариантах осуществления сродство антитела к конкретному антигену увеличивается,когда антитело подвергают созреванию сродства (или "направленной эволюции") in vitro. Нативные антитела проходят созревание сродства in vivo через соматическую гипермутацию с последующей селекцией. Некоторые способы in vitro имитируют этот процесс in vivo, таким образом позволяя продуцировать антитела, имеющие сродство, которое равно или больше по сравнению с нативными антителами. В некоторых вариантах осуществления созревания сродства мутации вводятся в нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область антитела с желаемой специфичностью связывания, см., например, Hudson et al. (2003) Nature Med. 9:129-134; Brekke et al. (2002) Nature Reviews 2:52-62. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в вариабельную область тяжелой цепи, легкой цепи или в обе цепи. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в один или несколько CDR. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в Н 3, L3 или в обе. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят в одну или более FR. В некоторых вариантах осуществления создается библиотека мутаций, например, в фаге, рибосоме или библиотека дрожжевого дисплея так, что антитела с повышенным сродством могут быть идентифицированы стандартными скрининговыми способами, см.,например, Boder et al. (2000) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:10701-10705; Foote et al. (2000) Proc. Nat'l Acad.(O'Brien and Aitken, eds., Human Press, Totowa, NJ) и Hanes et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:14130-14135. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят путем сайт-специфичного мутагенеза, основываясь на информации о структуре антитела, например антиген-связывающего сайта. В некоторых вариантах осуществления мутации вводят, используя комбинаторный мутагенез гипервариабельных участков. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая вариабельную область частично или целиком, случайным образом подвергается мутации, например, используя мутаторные клетки E. coli, перестановку гомологичных генов или подверженную ошибкам ПЦР. В некоторых вариантах осуществления мутации вводятся путем "перетасовки ДНК", см., например, Crameri et al. (1996)Nature Med. 2:100-102; Fermer et al. (2004) Tumor Biology 25:7-13. В некоторых вариантах осуществления "перетасовка цепей" используется для получения антител с повышенным сродством. В некоторых вариантах осуществления перетасовки цепей одну из цепей, например легкую цепь, замещают репертуаром легких цепей, в то время как другая цепь, например тяжелая цепь, остается неизмененной, таким образом обеспечивая специфичность. В некоторых таких вариантах осуществления создается библиотека антител с перетасованными цепями, где неизмененная тяжелая цепь экспрессируется в комбинации с каждой легкой цепью из набора легких цепей. В некоторых вариантах осуществления такие библиотеки могут быть проскринированы на антитела с повышенным сродством. В некоторых вариантах осуществления как легкая, так и тяжелая цепи последовательно замещаются. В некоторых вариантах осуществления замещаются только вариабельные области легкой/тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления замещается только часть вариабельных областей, например гипервариабельные участки, см., например, Hudson et al. (2003) Nature Med. 9:129-134; Brekke et al. (2002)Biotechnology 10:779-83. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела мыши, которые специфически связывают ANGPTL4 человека (включая, но не ограничиваясь моноклональными антителами мыши, индуцированными против ANGPTL4 мыши, но которые специфически связываются (т.е. перекрестно взаимодействуют) с ANGPTL4 человека), подвергаются последовательной перетасовке цепей. В некоторых вариантах осуществления, например, тяжелая цепь данного моноклонального антитела мыши комбинируется с новым набором легких цепей человека и отбираются антитела с желаемым сродством. В некоторых таких вариантах осуществления легкие цепи отобранных антител комбинируются с новым набором тяжелых цепей человека и отбираются антитела с желаемым сродством. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления отбираются антитела человека, имеющие желаемую антиген-связывающую специфичность. В ином случае, в некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь данного моноклонального антитела мыши комбинируется с новым набором легких цепей человека и отбираются антитела с желаемым сродством из этого первого этапа перетасовки. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь первоначального моноклонального антитела мыши комбинируется с новым набором тяжелых цепей человека и отбираются антитела с желаемым сродством из этого второго этапа перетасовки. В некоторых вариантах осуществления легкие цепи человека из антител, отобранных на первом этапе перетасовки,потом комбинируются с тяжелыми цепями человека из антител, отобранных на втором этапе перетасов- 19016185 ки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления отбираются антитела человека, имеющие желаемую антиген-связывающую специфичность. В некоторых вариантах осуществления используется способ "рибосомного дисплея", который заменяет отбор антител с созреванием сродства. В некоторых вариантах осуществления способа рибосомного дисплея нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, амплифицируется с помощью RT-ПЦР между этапами отбора. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления подверженные ошибкам полимеразы могут быть использованы для введения мутаций в нуклеиновую кислоту. Неограничивающий пример такого способа описан в подробностях в Hanes et al. (1998) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:14130-14135. 4. Некоторые рекомбинантные способы. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело получают с помощью рекомбинантных способов, см., например, патент США 4816567. В некоторых таких вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие цепи моноклонального антитела, клонируются и экспрессируются в подходящей клетке-хозяине. Например, в некоторых вариантах осуществления РНК может быть получена с использованием стандартных способов из клеток, экспрессирующих желаемое антитело, таких как зрелые В-клетки или клетки гибридомы. В некоторых вариантах осуществления РНК впоследствии может быть использована для получения кДНК с использованием стандартных способов. В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующую полипептид тяжелой или легкой цепи, амплифицируют, например, путем ПЦР, используя специфичные олигонуклеотидные праймеры. В некоторых вариантах осуществления кДНК клонируют в подходящий экспрессионный вектор. В некоторых вариантах осуществления экспрессионный вектор затем трансформируют или трансфецируют в подходящую клетку-хозяин, такую как клетка-хозяин, которая не продуцирует антитело эндогенно. Некоторые типичные клетки-хозяева включают, но не ограничиваются следующим списком: E. coli, COS-клетки, клетки яичников китайского хомячка (СНО cells) и миеломные клетки. В некоторых вариантах осуществления, где тяжелая и легкая цепи совместно экспрессируются у одного хозяина, полученные антитела могут быть изолированы. В некоторых вариантах осуществления кДНК, кодирующая тяжелую или легкую цепь, может быть модифицирована. Например, в некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой или легкой цепи мыши может быть заменена на константную область тяжелой или легкой цепи человека. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления может быть получено химерное антитело, которое имеет константные области антитела человека, но сохраняет специфичность связывания антитела мыши. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные антитела могут быть экспрессированы в определенных клеточных линиях. В некоторых вариантах осуществления последовательности, кодирующие определенные антитела, могут быть использованы для трансформации, подходящей клеткихозяина млекопитающих. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления трансформация может быть проведена любым известным способом для введения полинуклеотидов в клетку-хозяина. Некоторые типичные способы включают, но не ограничиваются упаковкой полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор), трансдуцирование клетки-хозяина вирусом (или вектором) и использование некоторых процедур трансфекции, известных в данной области, как, например, в патентах США 4399216,4912040, 4740461 и 4959455. В некоторых вариантах осуществления процедура трансформации может зависеть от трансформируемого хозяина. Некоторые типичные способы для введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих известны в данной области и включают, но не ограничиваются следующим списком: декстран-опосредованная трансфекция, преципитация с фосфатом кальция,полибрен-опосредованная трансфекция, слияние протопласта, электропорация, инкапсуляция полинуклеотида(ов) в липосомы и прямая микроинъекция ДНК в ядро. Некоторые типичные клеточные линии млекопитающих, доступные как хозяева для экспрессии, известны в данной области и включают, но не ограничены различными иммортализованными клеточными линиями доступными от Американской Коллекции Типов Культур (АТСС), включающими, но не ограниченными клетками яичника китайского хомячка (СНО-клетки), HeLa-клетками, клетками почек джунгарского хомячка (BHK-клетки), клетками почек обезьяны (COS-клетки), клетками гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Hep G2) и рядом других клеточных линий. В некоторых вариантах осуществления клеточные линии могут быть выбраны путем определения, какие из клеточных линий продуцируют высокие уровни антител, которые специфически связываются с ANGPTL4. Е. Некоторые полипетидные иммуногены. В некоторых вариантах осуществления для получения антител животное иммунизируют иммуногеном. В некоторых вариантах осуществления иммуноген является полипетидом, включающим ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления иммуноген является полипетидом, включающим фрагментANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления иммуноген является полипетидом, включающим Nконцевой домен двойной цепи ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает ANGPTL4 мыши. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает ANGPTL4 мыши, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает ANGPTL4 мыши,- 20016185 включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает фрагмент ANGPTL4 мыши. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает фрагмент SEQ ID NO: 1 от остатка 21 до остатка 174. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает фрагмент SEQ ID NO: 50 от остатка 21 до остатка 174. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает любой пептид из примерно 10-20 смежных аминокислот от остатка 21 до остатка 174 из SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает любой пептид из примерно 10-20 смежных аминокислот от остатка 21 до остатка 174 из SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает пептид, выбранный из любых последовательностей от SEQ ID NO: 40 до SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает пептид, выбранный из последовательностей SEQ ID NO: 40, 41, 42 и 43. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает пептид, включающий одну или несколько аминокислотных последовательностей, выбранных из SEQ ID NO: 40, 41, 42 и 43. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает пептид, включающий SEQ ID NO: 41, 42 и 43. В некоторых таких вариантах осуществления пептид выбирается таким образом, чтобы он с большой вероятностью был иммуногенным. В некоторых таких вариантах осуществления пептид выбирается таким образом, что он предсказан как гидрофильный и/или с большой вероятностью экспонирован на поверхности нативного ANGPTL4 мыши в его свернутом состоянии. Примерное руководство для выбора иммуногенных пептидов представлено, например, вLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 5 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY). Некоторые типичные алгоритмы для предсказания того, является ли пептидный участок белка гидрофильным и, следовательно, с большой вероятностью экспонирован на поверхности белка, известны специалистам в данной области. Некоторые такие алгоритмы используют информацию о первичной последовательности белка для генерации таких предсказаний. Некоторые такие алгоритмы основаны на способе, например, Норр and Woods (1981) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:3824-3828 или Kyte and Doolittle(1982) J. Mol. Biol. 157:105-132. Некоторые типичные алгоритмы для предсказания вторичной структуры белка, основанные на знании о первичной аминокислотной последовательности белка, известны специалистам в данной области, см., например, Corrigan et al. (1982) Comput. Programs Biomed. 3:163-168. Некоторые такие алгоритмы основаны на способе, например, Chou and Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:25-276. В некоторых вариантах осуществления пептидные участки, которые были предсказаны как формирующие -поворот и, таким образом, которые с высокой вероятностью экспонированы на поверхности белка, могут быть выбраны в качестве иммуногенов. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает ANGPTL4 человека. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает ANGPTL4 человека, включающий аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает фрагментSEQ ID NO: 2 от остатка 21 до остатка 169. В некоторых вариантах осуществления иммуноген включает любой пептид из примерно 10-20 смежных аминокислот от остатка 21 до остатка 169 из SEQ ID NO: 2. В некоторых таких вариантах осуществления пептид выбирается таким образом, чтобы он с большой вероятностью был иммуногенным. В некоторых таких вариантах осуществления пептид выбирается таким образом, что он предсказан как гидрофильный и/или с большой вероятностью экспонирован на поверхности нативного ANGPTL4 человека в его свернутом состоянии. Типовое руководство для выбора иммуногенных пептидов представлено, например, в Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular BiologySpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). В некоторых вариантах осуществления животное иммунизируют иммуногеном и одним или несколькими адъювантами. В некоторых вариантах осуществления адъювант используется для увеличения иммунного ответа в зависимости от вида организма-хозяина. Некоторые типичные адъюванты включают, но не ограничиваются следующим списком: адъювант Фрейнда (полный или неполный), минеральные соли, такие как гидроксид алюминия или фосфат алюминия, поверхностно-активные вещества, хитозан, лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, и потенциально полезные адъюванты для человека, такие как BCG (бацилла Кальмет-Герена) и Corynebacterium parvum. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ на иммуноген, например пептидный иммуноген,усиливается при присоединении иммуногена к другой иммуногенной молекуле или "белку-носителю". Некоторые типичные белки-носители включают, но не ограничиваются следующим списком: гемоцианин морского блюдечка (KLH), токсин тетануса, дифтерийный токсин, овальбумин, холерный токсин и их иммуногенные фрагменты. Для примерного введения в связывание пептидных иммуногенов с белковыми носителями, см., например, Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology Ch. 11.15(John WileySons, NY) и Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual Ch. 5 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). В некоторых вариантах осуществления любой из вышеперечисленных иммуногенов может быть получен с использованием стандартных рекомбинантных способов. Например, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий ANGPTL4 мыши или человека, может быть клонирован в- 21016185 подходящий экспрессионный вектор. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид включает последовательность нуклеиновых кислот из SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный вектор в дальнейшем вводится в подходящую клетку-хозяин. В некоторых вариантах осуществления полипептид потом выделяется из клетки-хозяина стандартными способами. Для некоторых типичных способов экспрессии рекомбинантных белков см., например, Ausubel et al.F. Некоторые анализы. 1. Некоторые анализы на связывание. В некоторых вариантах осуществления антитела скринируются на связывание с ANGPTL4 с использованием некоторых стандартных способов, которые определяют связывание антитела с антигеном. Например, в некоторых вариантах осуществления способность моноклонального антитела связыватьANGPTL4 определяется стандартными способами иммуноблоттинга, такими как вестерн-блот, см., например, Ausubel et al. (1992) Current Protocols in Molecular Biology Ch. 10.8 (John WileySons, NY); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY). В некоторых вариантах осуществления ANGPTL4, который используется в таких анализах, может быть выделен отдельно или может присутствовать в сложной смеси белков и/или макромолекул. В некоторых вариантах осуществления способность моноклонального антитела связыватьANGPTL4 оценивается способом конкурентного связывания, который определяет способность антителакандидата конкурировать с известным анти-ANGPTL4 антителом за связывание ANGPTL4. В некоторых таких вариантах осуществления известное анти-ANGPTL4 антитело является любым из моноклональных антител, описанных в части VI.J. В некоторых вариантах осуществления способ конкурентного связывания может быть осуществлен с помощью ELISA, см., например, Harlow and Lane (1988) Antibodies: ALaboratory Manual Ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). В некоторых вариантах осуществления анализ связывания используется для количественной оценки кинетики связывания (например, константы скорости) или аффинности связывания (например, константа ассоциации или диссоциации) антитела против ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления кинетика или аффинность связывания определяется в "твердой фазе" путем иммобилизации антигена (например, ANGPTL4) на твердой подложке. Иммобилизованный антиген "захватывает" антитела из раствора. В некоторых вариантах осуществления кинетика связывания или аффинность связывания определяются способами, основанными на ELISA. В некоторых вариантах осуществления кинетика связывания или аффинность связывания определяются при помощи технологии, основанной на биосенсорах, такой как технология поверхностного плазменного резонанса Biacore (Biacore, Piscataway, NJ). Некоторые такие способы известны специалистам в данной области, см., например, McCafferty et al. (eds.) (1996) Antibody Engineering: A Practical Approach (IRL, Oxford, UK); Goldberg et al. (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:278-281; Karlsson et al. (1991) J. Immunol. Methods 145:229-240; Malmqvist (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:282-286; для обзора см. Hoogenboom, Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications, from Methods in Molecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 at 19 (O'Brien and Aitken, eds., Human Press, Totowa, NJ). В некоторых вариантах осуществления определяется кинетика связывания или аффинность связывания Fab-фрагмента, который специфически связывается с ANGPTL4. В некоторых случаях Fabфрагменты имеют свойства не мультимеризоваться. В некоторых случаях мультимеризация может осложнять измерение кинетики связывания и аффинности связывания в "твердофазных" способах, см., например, Hoogenboom, Overview of Antibody Phage-Display Technology and Its Applications, from Methods inMolecular Biology: Antibody Phage Display: Methods and Protocols (2002) 178:1-37 at 19 (O'Brien and Aitken,eds., Human Press, Totowa, NJ). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления Fab-фрагмент, который специфически связывается с ANGPTL4, является подходящим для использования в анализе связывания, в котором антиген иммобилизован на твердой подложке, как, например, в способе, основанном на ELISA или Biacore-способе. В некоторых вариантах осуществления Fab-фрагменты получают из интактного антитела, которое специфически связывается с ANGPTL4, с использованием энзиматических способов. В некоторых вариантах осуществления Fab-фрагменты получают путем экспрессии нуклеиновых кислот, кодирующих Fab-фрагменты в рекомбинантной экспрессионной системе, такой как те, которые описаны выше, часть V.D.3. В некоторых вариантах осуществления кинетика связывания или аффинность связывания антитела против ANGPTL4 определяется с использованием способов "жидкой фазы". В таких способах кинетика или аффинность связывания измеряется для комплекса антиген-антитело в растворе. Некоторые такие способы известны специалистам в данной области. Неограничивающим примером такого способа является "способ кинетического исключения" или "KinExA", см., например, Blake et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:27677-27685; Drake et al. (2004) Anal. Biochem. 328:35-43 (сравнивающий "твердофазный" Biacore и"жидкофазный" KinExA способы). В некоторых вариантах осуществления оборудования для проведенияKinExA предоставляется Sapidyne Instruments, Inc. (Boise, ID). В некоторых вариантах осуществления кинетика связывания или аффинность связывания мультивалентного антитела или антитела, которое мультимеризуется, может быть определена, используя способ- 22016185 жидкой фазы. В некоторых случаях, измерение кинетики связывания или аффинности связывания мультивалентного антитела или антитела, которое мультимеризуется, подлежит анализу в жидкой фазе. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания анти-ANGPTL4 антитела, измеренная через его KD, примерно равна 10-6 М или меньше. В некоторых вариантах осуществления аффинность связывания анти-ANGPTL4 антитела примерно равна 10-7 М, примерно равна 10-8 М, примерно равна 10-9 М или меньше. В некоторых таких вариантах осуществления анти-ANGPTL4 антитело может быть использовано как терапевтическое антитело, см., например, Hudson et al. (2003) Nature Med. 9:129-134. В некоторых вариантах осуществления достижимы аффинности связывания меньше чем 10-9 М (например,аффинности связывания начиная от примерно 500 до примерно 0,5 пМ, включая, но не ограничиваясь аффиностями связывания от примерно 100 до примерно 5 пМ), например, используя способы созревания сродства, см., например, Boder et al. (2000) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:10701-10705. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое было индуцировано против ANGPTL4 мыши, скринируется на специфическое связывание с ANGPTL4 человека с использованием некоторых стандартных способов детектирования, например те, которые здесь описаны. Способность моноклонального антитела связывать ANGPTL4 как мыши, так и человека (т.е. демонстрировать перекрестное взаимодействие), показывает наличие одного и того же эпитопа в ANGPTL4 мыши и человека. В некоторых вариантах осуществления способов детектирования, которые используют денатурирующие условия (например, вестерн-блот), перекрестное взаимодействие показывает, что моноклональное антитело мыши связывается с тем же самым "линейным" эпитопом в ANGPTL4 мыши и человека. В некоторых вариантах осуществления способов детектирования, которые используют неденатурирующие условия (например, вестерн-блот), перекрестное взаимодействие показывает, что моноклональное антитело мыши связывается с тем же самым эпитопом (например, линейным эпитопом или конформационным эпитопом) в ANGPTL4 мыши и человека. 2. Некоторые способы картирования эпитопа. В различных вариантах осуществления эпитоп, с которым связывается моноклональное антитело,определяется любым из некоторого числа анализов. Некоторые типичные анализы описаны, например, вMorris, Methods in Molecular Biology, vol. 66: Epitope Mapping Protocols (1996) (Humana Press, Totowa,NJ). Например, картирование эпитопа может быть получено через анализы экспрессии генных фрагментов или способы, основанные на пептидах. В некоторых вариантах осуществления анализа экспрессии генных фрагментов, например нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты ANGPTL4, экспрессируются в прокариотических клетках и выделяются. В некоторых таких вариантах осуществления оценивается способность моноклонального антитела связывать эти фрагменты, например, путем иммунопреципитации или иммуноблоттинга. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты ANGPTL4, транскрибируются и транслируются in vitro в присутствии радиоактивных аминокислот. Радиоактивно меченные фрагменты ANGPTL4 после этого тестируют на связывание с моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления фрагменты ANGPTL4 получают путем протеолитической фрагментации. В некоторых вариантах осуществления эпитоп идентифицируют с использованием библиотек случайных пептидов, находящихся на поверхности фага или дрожжевой клетки. В некоторых вариантах осуществления эпитоп идентифицируют путем тестирования библиотеки перекрывающихся синтетических пептидных фрагментов ANGPTL4 на связывание с моноклональным антителом. В некоторых вариантах осуществления эпитоп идентифицируют, используя конкурентный способ, такой как те, которые описаны ниже. 3. Некоторые способы, основанные на конкуренции. В некоторых вариантах осуществления идентифицируют моноклональные антитела, которые связываются с тем же эпитопом ANGPTL4, что и интересующее моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления такие моноклональные антитела идентифицируют путем картирования эпитопа, например, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления такие моноклональные антитела идентифицируют путем стандартных способов, основанных на конкуренции, см., например, Harlow andLane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,NY). В типовом неограничивающим примере конкурентного способа ANGPTL4 или его фрагмент иммобилизуют в лунках многолуночного планшета. В некоторых вариантах осуществления интересующее моноклональное антитело стандартными способами метят флуоресцентной меткой (в некоторых вариантах осуществления - флуоресцеин изотиоцианатом). В некоторых таких вариантах осуществления смеси меченого интересующего моноклонального антитела и немеченого тестируемого моноклонального антитела добавляют в лунки. В некоторых таких вариантах осуществления определяется флуоресценция в каждой лунке для определения того, насколько немеченое тестируемое моноклональное антитело блокирует связывание меченого интересующего моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления решают, что моноклональные антитела имеют общий эпитоп, если каждое антитело блокирует связывание другого антитела на 50% или больше. Типичные способы, основанные на конкуренции, также описаны, например, в Morris, Methods in Molecular Biology, vol. 66: Epitope Mapping Protocols (1996)- 23016185 4. Некоторые способы для идентификации нейтрализующих антител. В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела скринируются на те из них, которые являются нейтрализующими антителами, т.е. те, которые уменьшают активность ANGPTL4 in vitro и/или in vivo. В некоторых вариантах осуществления активностью ANGPTL4 является способностьANGPTL4 ингибировать LPL. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело идентифицируют по его способности увеличивать активность LPL в присутствии ANGPTL4. В некоторых таких вариантах осуществления нейтрализующее антитело увеличивает активность LPL по меньшей мере примерно на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% относительно контрольного антитела. Некоторые типичные анализы для измерения активности LPL in vitro и in vivo представлены ниже, частиVI.D и VI.I соответственно. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело, которое уменьшает активностьANGPTL4 in vivo, определяется по его способности уменьшать уровень по меньшей мере одного липида сыворотки. Некоторые типичные липиды сыворотки включают, но не ограничены триглицеридами, холестерином и свободными жирными кислотами. В некоторых таких вариантах осуществления нейтрализующее антитело уменьшает уровень по меньшей мере одного липида сыворотки по меньшей мере примерно на 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 95% относительно контрольного антитела. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело, которое уменьшает активность ANGPTL4 in vivo, определяют по его способности препятствовать некоторым эффектам жиросодержащей диеты или обеспечивать защиту от таких эффектов. Некоторые типичные эффекты включают, но не ограничены набором веса,ожирением, непереносимостью глюкозы (гипергликемия), нечувствительность к инсулина (гиперинсулинемия), стеатоз при гепатите (жировая печень) и накопление липида в миоцитах. Некоторые типичные анализы для измерения таких эффектов представлены ниже, часть VI.С, VI.Е и VI.F.G. Некоторые фармацевтические композиции и способы лечения с использованием нейтрализующих моноклональных антител. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело может быть использовано в качестве лекарственного антитела. Например, определенные нейтрализующие антитела, которые могут применяться как лекарственные антитела, включают в себя, но не ограничиваются ими, химерные антитела,гуманизированные антитела и человеческие антитела. Специалисты в этой области науки хорошо осведомлены о способах использования определенных антител как терапевтических агентов. Например, более дюжины антител были одобрены FDA для использования в качестве лекарственных агентов с середины 80-х, см., например, Hudson et al. (2003) Nature Med. 9:129-134; Gura (2002) Nature 417:584-586;Brekke et al. (2002) Nature Reviews 2:52-62. Некоторые антитела, одобренные FDA, включают в себя такие, которые используют для лечения различных форм рака, воспаления и вирусных инфекций, а также для предотвращения реакции отторжения трансплантата, см., например, Gura (2002) Nature 417:584-586;Brekke et al. (2002) Nature Reviews 2:52-62. Кроме того, более дюжины антител проходят в настоящее время клинические испытания, см., например, Brekke et al. (2002) Nature Reviews 2:52-62. В некоторых вариантах осуществления способы используют для лечения нарушений жирового обмена, в том числе введение эффективных количеств нейтрализующих антител против ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления способы используют для лечения острых нарушений жирового обмена,в том числе введение эффективных количеств нейтрализующих антител против ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления способы используют для лечения хронических нарушений жирового обмена, в том числе введение эффективных количеств нейтрализующих антител против ANGPTL4. Используемый здесь термин "нарушения жирового обмена" включает в себя, но не ограничивается ими, нарушения, которые могут вести к вторичной гиперлипидемии (включающей в себя гипертриглицеридемию и гиперхолестеринемию). Некоторые нарушения жирового обмена, например, включают в себя,но не ограничиваются ими, атеросклероз, дислипидемию, гипертриглицеридемию (включающую в себя гипертриглицеридемию, вызванную лекарствами, гипертриглицеридемию, вызванную мочегонными средствами, гипертриглицеридемию, вызванную алкоголем, гипертриглицеридемию, вызванную бетаадренергическими блокирующими агентами, гипертриглицеридемию, вызванную эстрогенами, гипертриглицеридемию, вызванную глюкокортикоидами, гипертриглицеридемию, вызванную ретиноидами,гипертриглицеридемию, вызванную циметидином, и наследственную гипертриглицеридемию), острый панкреатит, связанный с гипертриглицеридемией, хиломикронный синдром, хиломикронемию, дефицит Апо-Е, дефицит или низкую активность ЛПЛ, гиперлипидемию (включающую в себя наследственную смешанную гиперлипидемию), гиперхолестеринемию, подагру, связанную с гиперхолестеринемией,ксантоматоз (подкожные отложения холестерина), болезнь коронарных артерий (также называемую ишемической болезнью сердца), воспаление, связанное с болезнью коронарных артерий, рестеноз, заболевания периферических сосудов и инсульт. Некоторые нарушения жирового обмена, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, нарушения, связанные с весом тела, такие как ожирение, метаболический синдром, включающий в себя независимые компоненты метаболического синдрома (например, общее ожирение, FBG/преддиабет/диабет, гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию и гипертензию), гипотиреоидизм, уремию и другие состояния, связанные с увеличением веса (включающие в себя быстрое увеличение веса), потерю веса, поддержание сниженного веса или риск увеличения веса- 24016185 после потери веса. Некоторые нарушения жирового обмена, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, нарушения уровня сахара в крови, такие как диабет, гипертензию и синдром поликистоза яичников, связанный с инсулинорезистентностью. Некоторые нарушения жирового обмена, например,включают в себя, но не ограничиваются ими, трансплантацию почки, нефротический синдром, синдром Кушинга, акромегалию, системную красную волчанку, дисглобулинемию, липодистрофию, гликогеноз I типа и болезнь Аддисона. Нарушения жирового обмена включают в себя, но не ограничиваются ими, вторичную гипертриглицеридемию (ГТГ, включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, типы I, V и IV), включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, ГТГ, связанную с питанием (включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, избыточное потребление алкоголя, увеличение веса и ожирение), лекарствами (включающими в себя, но не ограничивающимися ими, экзогенные эстрогены, тамоксифен, ретиноиды, тиазиды, хлорталидон, бета-блокаторы, ингибиторы протеаз (включающие в себя, но не ограничивающиеся им, ритонавир), инфузионный пропофол и парентеральные инфузии липидов), нарушения метаболизма(включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, диабет, беременность, хроническую почечную недостаточность, гипотиреоидизм, наследственную гиперлипидемию и панкреатит). Нарушения жирового обмена включают в себя, но не ограничиваются ими, нарушения жирового обмена, связанные с дисфункцией сосудов, связанные с нарушением кровоснабжения, нарушения жирового обмена, связанные с пролиферативными заболеваниями, включающими в себя, но не ограничивающимися ими, неоплазию (включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, рак предстательной железы, рак почки, печени, груди, яичника, легкого и рак поджелудочной железы), нарушения, возникающие в ответ на воспаление, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, такие как связанные, например, с инфекционными заболеваниями, лечением повреждений, иммунодефицитными синдромами(СПИД и другие, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, синдромы, связанные с нарушением развития), образование шрамов, атеросклероз, рестеноз и отторжение трансплантата, аутоиммунные нарушения и хронические воспалительные заболевания и нарушения, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, заболевания, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, и нарушения, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, болезнь Крона, колит, воспалительное заболевание кишечника, реактивный артрит, включающий в себя болезнь Лайма, инсулин-зависимый диабет, органоспецифичные аутоиммунные реакции, рассеянный склероз, тиреоидит Хашимото и болезнь Грейвса, синдром Шегрена, контактный дерматит, псориаз,склеродермию, болезнь "трансплантат против хозяина", саркоидоз, малярию, сепсис, панкреатит, атопические состояния, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, астму и аллергию, включающую в себя, но не ограничивающуюся ими, аллергический ринит, гастроинтестинальные аллергии, включающие в себя, но не ограничивающиеся ими, пищевые аллергии, эозинофилию, конъюнктивит и гломерулонефрит, нарушения свертываемости крови, эндотоксический шок и другие нарушения, опосредованные воспалением, такие как ночное апноэ и сонливость. В некоторых вариантах осуществления способы используют для лечения нарушений жирового обмена, включая в себя введение эффективных количеств антител к ANGPTL4 и других терапевтических агентов. В некоторых таких вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент вводят в эффективном количестве. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент является другим антителом к ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент не является антителом. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент является агентом, снижающим уровень одного или более сывороточных липидов. Некоторые дополнительные терапевтические агенты, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, ингибиторы синтеза холестерина (статины), такие как ингибиторы ГМГ-КоА-редуктазы (например,ловастатин, симвастатин, правастатин и флювастатин); секвестранты желчных кислот, такие как холестирамин и другие смолы; ингибиторы секреции ЛПОНП, такие как ниацин; стимуляторы липопротеинлипазы, такие как производные фиброевой кислоты; липофильные антиоксиданты, такие как пробукол; ингибиторы ацил-КоА-холестеринацилтрансферазы; антагонисты рецепторов фарнезоида X; активаторы белка, активирующего расщепление регуляторного связывающего стеролы белка (SCAP); ингибиторы микросомального белка переноса триглицеридов (МТР) и АпоЕ-связанный белок. В некоторых вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент является агентом, повышающим уровень липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). Неограниченные примеры таких агентов включают в себя,но не ограничиваются ими, ингибиторы белка, переносящего эфиры холестерина (СЕТР). В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать эффективное количество антитела к ANGPTL4 и фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель, растворитель, эмульгатор, консервант и/или адъювант. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать эффективное количество антитела к ANGPTL4 и эффективное количество по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем, растворителем, эмульгатором, консервантом и/или адъювантом. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент отбирают из агентов, описанных выше.- 25016185 В некоторых вариантах осуществления материалы прописи, используемые в фармацевтических композициях, являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит материалы прописи для модификации, сохранения или консервации, например рН, осмолярности, вязкости, прозрачности,цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, уровня растворимости или высвобождения,абсорбции или проницаемости композиции. В некоторых вариантах осуществления приемлемые материалы прописи включают в себя, но не ограничиваются ими, аминокислоты (например, глицин, глутамин, аспарагин, аргинин и лизин); антимикробные вещества; антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту, сульфит натрия и гидросульфит натрия); буферы (например, бораты, бикарбонаты, Tris-HCl,цитраты, фосфаты и другие органические кислоты); агенты-наполнители (например, маннит и глицин); хелатообразующие агенты (например, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА); комплексообразующие агенты (например, кофеин, поливинилпиролидон, бета-циклодекстрин и гидроксипропил-бетациклодекстрин); наполнители; моносахариды, дисахариды и другие углеводороды (например, глюкозу,маннозу и декстрины); белки (например, сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулины); красящие, ароматизирующие и разбавляющие агенты; эмульгирующие агенты; гидрофильные полимеры(например, натрий); консерванты (например, хлорид бензалкония, бензойную кислоту, салициловую кислоту, тимерозал, фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновую кислоту и пероксид водорода); растворители (например, глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль); сахарные спирты (например, маннит и сорбит); суспендирующие агенты; сурфактанты или увлажняющие агенты (например, поверхностно-активные вещества, ПЭГ, эфиры сорбитана, полисорбаты (например, полисорбат 20 и полисорбат 80), тритон, трометамин, лецитин, холестерин и тилоксапал); агенты,повышающие стабильность (например, сахарозу и сорбит); агенты, повышающие тонус (например, галогениды щелочных металлов (например, хлорид натрия или калия), маннит и сорбит); средства доставки; разбавители; наполнители и фармацевтические адъюванты, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990). В некоторых вариантах осуществления антитело к ANGPTL4 или другая терапевтическая молекула связаны с переносчиком, увеличивающим время полувыведения. Некоторые такие переносчики, увеличивающие время полувыведения, известны в науке. Некоторые такие переносчики включают в себя, но не ограничиваются ими, домен Fc, полиэтиленгликоль и декстран. Некоторые такие переносчики описаны, например, в опубликованной заявке РСТWO 99/25044. В некоторых вариантах осуществления оптимальная фармацевтическая композиция может быть определена специалистом в этой области науки в зависимости, например, от намеченного пути введения,способа доставки и желательной дозировки, см., например, вышеуказанный Remington's PharmaceuticalSciences. В некоторых вариантах осуществления такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, уровень высвобождения in vivo или уровень клиренса нейтрализующего антитела invivo. В некоторых вариантах осуществления первичный переносчик или носитель в фармацевтической композиции может быть как водной, так и неводной природы. Например, в некоторых вариантах осуществления приемлемый переносчик или носитель может быть водой для инъекций, физиологическим солевым раствором или искусственной цереброспинальной жидкостью, возможно, дополненными другими материалами, обычно используемыми в композициях для парентерального введения. Некоторые, приведенные для примера, переносчики включают в себя, но не ограничиваются ими, нейтральные буферные соли или соли, смешанные с сывороточным альбумином. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат буфер Tris с уровнем рН примерно 7,0-8,5 или ацетатный буфер с уровнем рН примерно 4,0-5,5, которые могут, кроме того, включать в себя сорбит или его приемлемый заменитель. В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая антитело к ANGPTL4, вместе или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, может быть получена путем смешивания выбранной композиции, имеющей желательный уровень чистоты, с дополнительными агентами прописи (Remington's Pharmaceutical Sciences, см. выше) в форме лиофилизированного порошка или водного раствора. В некоторых вариантах осуществления композиция, содержащая антитело к ANGPTL4, вместе или в отсутствие по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, может быть получена в виде лиофилизата с использованием обычного наполнителя, такого как сахароза. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию выбирают для парентерального применения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию выбирают для ингаляции или для введения через пищеварительный тракт, то есть орально. Некоторые, приведенные для примера, способы получения фармацевтически приемлемых композиций хорошо известны специалистам в этой области науки. В некоторых вариантах осуществления компоненты композиции представлены в концентрациях,приемлемых для места введения. В некоторых вариантах осуществления используют буферы для поддержания композиции на физиологическом уровне рН или на немного более низком уровне рН, обычно в- 26016185 диапазоне рН от примерно 5 до примерно 8. В некоторых вариантах осуществления, когда предусмотрено парентеральное введение, фармацевтическая композиция может быть в форме апирогенного, приемлемого для парентерального введения водного раствора, содержащего желательное антитело к ANGPTL4, с или без дополнительного терапевтического агента в фармацевтически приемлемом переносчике. В некоторых вариантах осуществления переносчиком для парентеральных инъекций является стерильная вода, в которой присутствует антитело к ANGPTL4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента и которую получают в виде стерильного изотонического раствора, должным образом хранящегося. В некоторых вариантах осуществления препарат может состоять из прописи желательной молекулы и агента, такого как приемлемые для инъекции микросферы, биоэродируемые частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, которые могут применяться для контролируемого или длительного высвобождения продукта и которые могут затем быть доставлены с помощью инъекционных депо. В некоторых вариантах осуществления может быть также использована гиалуроновая кислота, которая может вызывать эффект замедленного высвобождения в циркуляции. В некоторых вариантах осуществления для введения желательной молекулы могут быть использованы имплантируемые средства доставки лекарств. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может быть получена в форме, предназначенной для ингаляции. В некоторых вариантах осуществления антитело к ANGPTL4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента может быть получено в виде сухого порошка для ингаляции. В некоторых вариантах осуществления ингаляционный раствор, содержащий антитело к ANGPTL4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, может содержать пропеллент для доставки в виде аэрозоля. В некоторых вариантах осуществления растворы можно распылять. В некоторых вариантах осуществления пропись можно вводить орально. В некоторых вариантах осуществления антитело к ANGPTL4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, которое вводят таким способом, может быть изготовлено с или без носителей, обычно используемых в приготовлении твердых форм дозирования, таких как таблетки и капсулы. В некоторых вариантах осуществления капсулы могут предназначаться для высвобождения активного компонента прописи в том месте желудочно-кишечного тракта, где биодоступность максимальна, а разрушение до попадания в системный кровоток минимально. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный агент может быть добавлен для облегчения всасывания антитела к ANGPTL4 с или без каких-либо других дополнительных терапевтических агентов. В некоторых вариантах осуществления разбавители, ароматизаторы, легкоплавкие воски, растительные масла, лубриканты, суспендирующие агенты, агенты, способствующие дезинтеграции таблеток, и/или связывающие агенты также могут использоваться. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество антитела к ANGPTL4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, используется в смеси с нетоксичным эксципиентом, пригодным для производства таблеток. В некоторых вариантах осуществления путем растворения таблеток в стерильной воде или другом обычном носителе могут быть получены растворы в форме дозированных единиц. Некоторые эксципиенты,например, включают в себя, но не ограничиваются ими, инертные разбавители (например, карбонат кальция, карбонат натрия, бикарбонат натрия, лактозу и фосфат кальция); связывающие агенты (например, крахмал, желатин и акацию) и увлажняющие агенты (например, стеарат магния, стеариновую кислоту и тальк). Дополнительные фармацевтические композиции очевидны специалисту в этой области науки,включая в себя прописи, содержащие антитело к ANGPTL4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, в формах с длительным или контролируемым высвобождением. Некоторые формы с длительным или контролируемым высвобождением, например, включают в себя, но не ограничиваются ими, липосомные носители, биоэродируемые микрочастицы, пористые гранулы и инъекционные депо. Некоторые, приведенные для примера, способы получения определенных прописей известны специалистам в этой области науки. В некоторых вариантах осуществления препараты с замедленным высвобождением могут включать в себя полупроницаемые полимерные матрицы определенной формы, например пленки или микрокапсулы. Некоторые, приведенные для примера, матрицы с замедленным высвобождением включают в себя, но не ограничиваются ими, полиэфиры, гидрогели, полилактиды (см., например, патент США 3773919 и Европейский патент 058481), кополимеры Lглутаминовой кислоты и гамма этил-L-глутамат (см., например, Sidman et al. (1983) Biopolymers 22:547556), поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) (см., например, Langer et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167277 и Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105), этиленвинилацетат (Langer et al., выше) и поли-D(-)-3 оксимасляную кислоту (Европейский патент 133988). В некоторых вариантах осуществления композиции с замедленным высвобождением могут включать в себя липосомы, которые могут быть получены в некоторых вариантах осуществления любым из нескольких известных в науке способов, см., например,Eppstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82:3688-3692; Европейский патент 036676; Европейский- 27016185 патент 088046 и Европейский патент 143949. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, предназначенная для введения in vivo, обычно является стерильной. В некоторых вариантах осуществления это может быть достигнуто путем фильтрации через стерильные фильтрационные мембраны. В некоторых вариантах осуществления, когда композиция лиофилизирована, стерилизация с использованием этого способа может проводиться как до, так и после лиофилизации и восстановления. В некоторых вариантах осуществления композиция для парентерального введения может храниться в лиофилизованном виде или в виде раствора. В некоторых вариантах осуществления парентеральные композиции обычно помещают в контейнер,имеющий стерильный доступ, например контейнер или флакон для внутривенных растворов, имеющий крышку, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций. В некоторых вариантах осуществления после получения фармацевтической композиции ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензий, геля, эмульсии, сухого вещества или обезвоженного или лиофилизированного порошка. В некоторых вариантах осуществления такие прописи можно хранить как в форме, готовой к применению, так и в форме, требующей предварительного восстановления перед введением (например, в лиофилизированной форме). В некоторых вариантах осуществления используют наборы для получения единиц введения с разовой дозой. В некоторых вариантах осуществления каждый такой набор может содержать первый контейнер с сухим белком и второй контейнер, содержащий водную композицию. В некоторых вариантах осуществления наборы включают в себя предварительно наполненные одно- или многокамерные шприцы(например, шприцы с жидким или лиофилизированным содержимым). В некоторых вариантах осуществления эффективное количество фармацевтической композиции,содержащей антитело к ANGPTL4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента и предназначенной для использования в лечебных целях, будет зависеть, например, от обстоятельств и объективных факторов лечения. Специалист в этой области науки должен учитывать, что применяемые для лечения уровни дозировки в соответствии с некоторыми вариантами осуществления будут варьировать в зависимости, в частности, от доставки молекулы, которая является показанием к применению антитела к ANGPTL4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента,пути введения и параметров (вес тела, поверхность тела или размер органа) и/или состояния (возраст и общее здоровье) пациента. В некоторых вариантах осуществления лечащий врач может изменять дозу и путь введения для достижения оптимального терапевтического эффекта. В некоторых вариантах осуществления обычная дозировка может меняться от примерно 0,1 мкг/кг веса тела пациента до примерно 100 мкг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. В некоторых вариантах осуществления дозировка может меняться от 0,1 до примерно 100 мкг/кг; от 1 до примерно 100 мкг/кг или от 5 до примерно 100 мкг/кг, включая в себя все промежуточные значения (и доли) между любыми вышеупомянутыми конечными точками. В некоторых вариантах осуществления может использоваться дозировка от примерно 10 мкг/кг веса тела до примерно 60 мкг/кг веса тела. В некоторых вариантах осуществления может использоваться дозировка примерно 10 мкг/кг веса тела, примерно 20 мкг/кг веса тела, примерно 30 мкг/кг веса тела, примерно 40 мкг/кг веса тела, примерно 50 мкг/кг веса тела или примерно 60 мкг/кг веса тела. В некоторых вариантах осуществления приемлемая дозировка может быть определена на основе исследований на животных, таких как приведенные ниже, например, в частях VI.Р, R и от Т до Y. В некоторых вариантах осуществления для определения частоты дозирования должны быть учтены фармакокинетические параметры антитела к ANGPTL4 и в случае применения любого дополнительного терапевтического агента, используемого в композиции. В некоторых вариантах осуществления лечащий врач должен вводить композицию до достижения дозировки, позволяющей получить желаемый эффект. В некоторых вариантах осуществления, таким образом, композицию можно вводить в виде единичной дозы или в виде двух или более доз (которые могут содержать, а могут и не содержать равные количества желательной молекулы) через определенные промежутки времени или в виде длительной инфузии через имплантат или катетер. В некоторых вариантах осуществления специалистом в этой области науки обычно проводится дальнейшая оптимизация общепринятой дозы в рамках тех задач, которые обычно им преследуются. В некоторых вариантах осуществления общепринятые дозы могут быть индивидуализированы путем применения обычного способа доза-ответ. В некоторых вариантах осуществления пациент получает одну дозу фармацевтической композиции, содержащей антитело к ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления пациент получает одну, две, три или четыре дозы в день фармацевтической композиции, содержащей антитело к ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления пациент получает одну, две, три, четыре, пять или шесть доз в неделю фармацевтической композиции, содержащей антитело к ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления пациент получает одну или две дозы в месяц фармацевтической композиции, содержащей антитело к ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления путь введения фармацевтической композиции определяют в соответствии с известными способами, например оральный, путем внутривенной инъекции, интраперитонеальный, интрацеребральный, (интрапаренхимальный), интрацеребровентрикулярный, внутримышечный, внутриглазной, интраартериальный, интрапортальный или путь введения внутрь пораженных- 28016185 тканей; с помощью систем с замедленным высвобождением или с помощью имплантатов. В некоторых вариантах осуществления композиции можно вводить путем болюсной инъекции или длительной инфузии, или с помощью имплантатов. В некоторых вариантах осуществления композиции можно вводить местно путем имплантации мембраны, губки или другого общепринятого материала, на котором желаемая молекула абсорбируется или инкапсулируется. В некоторых вариантах осуществления при применении имплантатов их можно имплантировать в любой подходящий орган или ткань, и доставка желаемой молекулы может осуществляться путем диффузии, в виде болюса с определенным временем высвобождения или путем длительного введения. В некоторых вариантах осуществления может быть необходимым использование фармацевтической композиции, содержащей антитело к ANGPTL4, по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента способом ех vivo. В таких случаях, клетки, ткани и/или органы, полученные от пациента, обрабатывают фармацевтической композицией, содержащей антитело к ANGPTL4, по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента, после чего клетки, ткани и/или органы имплантируют обратно пациенту. В некоторых вариантах осуществления антитело кANGPTL4 по меньшей мере с или без одного дополнительного терапевтического агента доставляют путем имплантации определенных клеток, которые были генетически изменены с использованием описанных здесь способов, для экспрессирования и секретирования полипептидов. В некоторых вариантах осуществления эти клетки могут быть животными или человеческими, аутологичными, гетерологичными или ксеногенными. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть иммортализированными. В некоторых вариантах осуществления с целью снижения вероятности иммунологического ответа клетки могут быть инкапсулированы для того, чтобы избежать инфильтрации окружающих тканей. В некоторых вариантах осуществления инкапсулирующие материалы обычно являются биосовместимыми,полупроницаемыми полимерными пленками или мембранами, которые позволяют высвобождаться белковому(ым) продукту(ам), но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими повреждающими факторами окружающих тканей. Н. Некоторые способы выявления и диагностики. В некоторых вариантах осуществления антитела против ANGPTL4 используют для определения присутствия ANGPTL4 in vivo или in vitro. В некоторых вариантах осуществления уровень ANGPTL4 invivo коррелирует с медицинским состоянием, таким как нарушение жирового обмена, позволяя таким образом диагностировать медицинское состояние. Некоторые, приведенные для примера, медицинские состояния, которые могут быть диагностированы с помощью антител против ANGPTL4, указаны выше. Некоторые, приведенные для примера, способы выявления известны в науке и включают в себя, но не ограничиваются ими, ELISA, радиоиммунный анализ, иммуноблотинг, вестерн-блот, иммунофлюоресцентный анализ и иммунопреципитацию. В некоторых вариантах осуществления антитела противANGPTL4 модифицируют таким образом, что их можно определять непосредственно, например, путем связывания антитела с меткой. Некоторые, приведенные для примера, метки включают в себя, но не ограничиваются ими, флюорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы, электроноплотные реагенты, ферменты и лиганды. В некоторых вариантах осуществления антитела против ANGPTL4 определяют с использованием меченых "вторичных" антител, связывающихся с антителами определенного класса (например, антимышиные антитела козы).I. Некоторые способы скрининга антагонистов и агонистов ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления может быть применен способ скрининга агента, связывающего ANGPTL4. В некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает в себя взаимодействие ANGPTL4 с одним или более кандидатными агентами при подходящих условиях и изучение связывания ANGPTL4 с одним или более кандидатными агентами. В некоторых вариантах осуществления способ скрининга включает в себя использование антитела против ANGPTL4 в анализе конкурентного связывания. В некоторых таких вариантах осуществления используют первую связывающую смесь, содержащую антитело против ANGPTL4 и ANGPTL4. Измеряют величину связывания между ANGPTL4 и антителом в первой связывающей смеси (М 0). Также используют вторую связывающую смесь, содержащую антитело, ANGPTL4 и исследуемый агент. Измеряют величину связывания между ANGPTL4 и антителом в второй связывающей смеси (M1). Величину связывания в первой связывающей смеси сравнивают с величиной связывания во второй связывающей смеси, например, путем вычисления соотношенияM1/M0. Агент признается способным связывать ANGPTL4, если величина связывания антитела сANGPTL4 во второй связывающей смеси меньше, чем величина связывания антитела с ANGPTL4 в первой связывающей смеси. В некоторых вариантах осуществления агент, связывающий ANGPTL4, уменьшает связывание антитела с ANGPTL4 по меньшей мере на примерно 10% (например, M1/M00,9), по меньшей мере на примерно 30% (например, M1/M00,7), по меньшей мере на примерно 50% (например,M1/M00,5), по меньшей мере на примерно 70% (например, M1/M00,3), по меньшей мере на примерно 80% (например, M1/M00,2), по меньшей мере на примерно 90% (например, M1/M00,1) или по меньшей мере на примерно 95% (например, M1/M00,05). В некоторых вариантах осуществления ANGPTL4, используемое в любых описанных выше спосо- 29