Применение sdf-1 для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента Изобретение относится к применению SDF-1 или агониста активности SDF-1 для лечения и/или профилактики неврологического заболевания. 015716 Область изобретения Настоящее изобретение, главным образом, относится к области неврологических заболеваний, обусловленных нейровоспалением. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применениюSDF-1 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания. Предпосылки изобретения Неврологические заболевания, обусловленные нейровоспалением. Нейровоспаление является общим признаком большинства неврологических заболеваний. Нейровоспаление, которое может быть индуцировано нейрональным или олигодендроглиальным нарушением,запускается множеством стимулов или оно может быть следствием травмы, повреждения центрального или периферического нерва или вирусной или бактериальной инфекции. Основными следствиями нейровоспаления являются: (i) секреция различных воспалительных хемокинов астроцитами, клетками микроглии и (ii) привлечение дополнительных лейкоцитов, которые далее стимулируют астроциты или микроглию. Полагают, что при хронических нейродегенеративных заболеваниях, таких как рассеянный склероз (MS), болезнь Альцгеймера (AD) или боковой амиотрофический склероз (ALS), наличие постоянного нейровоспаления участвует в прогрессировании заболевания. Неврологические заболевания, обусловленные нейровоспалением, также могут называться неврологическими воспалительными заболеваниями. Хронические нейродегенеративные заболевания. При хронических нейродегенеративных заболеваниях патология ассоциирована с воспалительным ответом. Последние данные позволяют предположить, что системное воспаление может влиять на местное воспаление в головном мозге при заболевании, что приводит к повышенному синтезу воспалительных цитокинов и других медиаторов в головном мозге, которые, в свою очередь, влияют на поведение(Perry, 2004). Хронические нейродегенеративные заболевания включают в себя, помимо прочих, рассеянный склероз (MS), болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Гентингтона (HD),боковой амиотрофический склероз (ALS), множественную системную атрофию (MSA), прионное заболевание и синдром Дауна. Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой нарушение, вовлекающее нарушение психических функций вследствие изменений в ткани головного мозга. Оно ассоциировано с сокращением объема тканей головного мозга, не вызванным нарушениями кровеносных сосудов, первичной дегенеративной деменцией и диффузной атрофией головного мозга. Болезнь Альцгеймера также называют старческим слабоумием по типу болезни Альцгеймера (SDAT). Большое количество данных, полученных за последнее десятилетие, подтвердило вывод, что с патологией при болезни Альцгеймера (AD) ассоциировано нейровоспаление (Tuppo and Arias, 2005). Болезнь Паркинсона (PD) представляет собой нарушение головного мозга, характеризующееся дрожанием и проблемами с хождением, движениями и координацией. Заболевание обусловлено повреждением части головного мозга, которая контролирует движение мышц. Также его называют paralysisagitans, или дрожательным параличом. Накапливающиеся данные из исследований на животных и у человека позволяют предположить, что нейровоспаление является важным участником потери нейронов при PD (Gao et al., 2003). Болезнь Гентингтона (HD) представляет собой наследственное аутосомно-доминантное неврологическое заболевание. Обычно заболевание клинически не выявляется до пятого десятилетия жизни и приводит к психиатрическому нарушению, связанному с непроизвольными движениями и когнитивному отклонению, обусловленному неизбежным прогрессированием до самой смерти, которая наступает, как правило, через 17 лет после начала. Боковой амиотрофический склероз (ALS) представляет собой нарушение, вызывающее прогрессирующую потерю нервного контроля произвольных мышц вследствие разрушения нервных клеток в головном и спинном мозге. Боковой амиотрофический склероз, также называемый болезнью Лу Геринга,представляет собой нарушение со снижением контроля мышц и их использованием. Нервы, контролирующие эти мышцы, уменьшаются в размере и исчезают, что приводит к уменьшению мышечной ткани вследствие отсутствия нервной стимуляции. Несмотря на то что основная причина ALS остается неизвестной, нейровоспаление при ALS может играть ключевую роль (Consilvio et al., 2004). Множественная системная атрофия (MSA) представляет собой спорадическое нейродегенеративное заболевание неизвестной этиологии с началом во взрослом возрасте. Состояние может быть уникальным среди хронических нейродегенеративных заболеваний вследствие основной, если не главной роли, которую играют олигодендроглиальные клетки в патогенетическом процессе. Данные подтверждают роль связанных с воспалением генов в риске MSA (Infante et al., 2005). Основное отличие от болезни Паркинсона состоит в том, что пациенты с MSA не отвечают на лечение посредством L-допа. Рассеянный склероз (PC) представляет собой воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), которое имеет ремитирующее или прогрессирующее течение. PC является не единственным демиелинизирующим заболеванием. Его аналогом в периферической нервной системе (ПНС) является хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия(CIDP). Кроме того, существуют острые монофазные нарушения, такие как воспалительная демиелини-1 015716 зирующая полирадикулоневропатия, называемая синдромом Гийена-Барре (GBS), в ПНС и острый диссеминированный энцефаломиелит (ADEM) в ЦНС. Как PC, так и GBS являются гетерогенными синдромами. При PC различные экзогенные влияния совместно с генетическими факторами могут приводить к течению заболевания, которое в итоге соответствует диагностическим критериям. При обоих заболеваниях к первичному демиелинизирующему очагу может добавляться аксональное повреждение и вызывать длительный неврологический дефицит. PC представляет собой аутоиммунное нарушение, при котором лейкоциты иммунной системы атакуют белое вещество центральной нервной системы (ЦНС). Серое вещество также может быть вовлечено. Несмотря на то что точная этиология PC не известна, способствующие ему факторы могут включать генетику, бактериальную и вирусную инфекцию. В своих классических проявлениях (85% от всех случаев) он характеризуется чередующимися фазами обострения/ремиссии, которые соответствуют эпизодам неврологической дисфункции, длящейся несколько недель, за которыми следует значительное или полное восстановление (Noseworthy, 1999). С течением времени периоды ремиссии укорачиваются. Затем у многих пациентов начитается конечная стадия заболевания, характеризующаяся постепенным снижением неврологической функции с частичным восстановлением или без восстановления. Ее называют вторичным прогрессирующим PC. Небольшая доля (15% от всех пациентов с PC) страдает постепенным и непрерывным снижением неврологической функции после начала заболевания (первично-прогрессирующий PC). Также было показано, что нейровоспаление вовлечено в прионное заболевание и синдром Дауна(Eikelenboom et al., 2002; Hunter et al., 2004). Неврологические воспалительные заболевания после инфекции. Некоторые невропатии, например, такие как острый диссеминированный энцефаломиелит, как правило, возникают после вирусной инфекции или противовирусной вакцинации (или, очень редко, противобактериальной вакцинации), подтверждая иммунологическую этиологию заболевания. Острые воспалительные невропатии после противовирусной вакцинации или синдрома Гийена-Барре сходны с демиелинизирующими нарушениями с одинаковым предполагаемым иммунопатогенезом, однако они поражают только периферические структуры. Обусловленная HTLV миелопатия, медленно прогрессирующее заболевание спинного мозга, обусловленное инфекцией T-клеточного лимфотропного вируса, характеризуется спастической слабостью в обеих ногах. Инфекции центральной нервной системы представляют собой крайне тяжелые инфекции; менингит поражает мембраны, окружающие головной и спинной мозг; энцефалит поражает непосредственно головной мозг. Вирусы, которые инфицируют центральную нервную систему (головной и спинной мозг) включают вирусы герпеса, арбовирусы, вирусы коксаки, echo-вирусы и энтеровирусы. Некоторые из этих инфекций, главным образом, поражают менингеальные оболочки (ткани, покрывающие головной мозг) и приводят к менингиту; другие инфекции в основном поражают головной мозг и приводят к энцефалиту; многие инфекции поражают как менингеальные оболочки, так и головной мозг и приводят к менингоэнцефалиту. Менингит значительно более распространен у детей, чем энцефалит. Вирусы поражают центральную нервную систему двумя способами. Они прямо инфицируют и разрушают клетки в ходе острого заболевания. После выздоровления от инфекции иммунный ответ организма на инфекцию иногда приводит к вторичному повреждению клеток вокруг нервов. Это вторичное повреждение (постинфекционный энцефаломиелит) приводит к симптомам у детей через несколько недель после выздоровления от острого заболевания. Неврологические заболевания после повреждений. Повреждение в ЦНС, индуцируемое острыми повреждениями, включая травму, гипоксию и ишемию, может поражать как серое, так и белое вещество. В повреждение ЦНС вовлечено нейровоспаление. Например, лейкоцитарная инфильтрация в ЦНС после травмы или воспаления запускается частично посредством активации хемокина MCP-1 в астроцитах (Panenka et al., 2001). Травма представляет собой повреждение или дефект нерва. Она может представлять собой травму спинного мозга, которая представляет собой повреждение спинного мозга, поражающее все нервные функции, которые контролируются на уровне повреждения и ниже его, включая мышечный контроль и чувствительность, или травму головного мозга, такую как травма, вызываемая закрытым повреждением головного мозга. Гипоксия головного мозга представляет собой нехватку кислорода, конкретно, в полушариях головного мозга, и более конкретно, этот термин используют для обозначения нехватки кислорода во всем головном мозге. В зависимости от тяжести гипоксии симптомы могут варьировать от помрачнения сознания до необратимого повреждения головного мозга, комы и смерти. Инсульт, как правило, является следствием сниженного кровотока (ишемии) в головном мозге. Также его называют церебро-сосудистым заболеванием или повреждением. Он представляет собой группу нарушений головного мозга, вовлекающих снижение функций головного мозга, которое происходит при прекращении кровоснабжения любой части головного мозга. Головной мозг требует приблизительно 20% от кровотока организма. Основное кровоснабжение головного мозга происходит через 2 артерии в шее (сонные артерии), которые затем разветвляются в головном мозге на множество артерий, каждая из-2 015716 которых снабжает кровью конкретную область головного мозга. Даже кратковременная остановка кровотока может вызывать снижение функций головной мозга (неврологический дефицит). Симптомы варьируют в зависимости от площади поражения головного мозга и обычно включают такие проблемы, как изменение зрения, изменение речи, снижение подвижности или чувствительности в части тела или изменение уровня сознания. Если кровоток снижается более чем на несколько секунд, клетки головного мозга в этой области разрушаются (подвергаются инфаркту), вызывающему постоянное повреждение этой области головного мозга или даже смерть. Травматическое повреждение нерва может охватывать как ЦНС, так и ПНС. Травматическое повреждение головного мозга, также называемое просто травмой головы или закрытой травмой головы,относится к повреждению, когда происходит поражение головного мозга вследствие удара по голове снаружи. Наиболее часто оно происходит в ходе автомобильных аварий или аварий на велосипедах, однако также оно может происходить в результате состояния, близкого к утоплению, сердечного приступа,инсульта и инфекций. Этот тип травматического повреждения головного мозга, как правило, происходит вследствие нехватки кислорода или кровоснабжения головного мозга, и, таким образом, он может быть обозначен как "аноксическое повреждение". Травма головного мозга или закрытая травма головы происходят при ударе по голове, например, в случае дорожно-транспортного происшествия или падения. Сразу после травмы может происходить период бессознательного состояния, который может длиться минуты, недели или месяцы. Первичное повреждение головного мозга происходит во время повреждения,главным образом в областях воздействия, в частности при наличии перелома черепа. Крупные ушибы могут быть ассоциированы с интрацеребральным кровотечением или они могут сопровождаться разрывами коры. Диффузные аксональные повреждения происходят в результате срезывающего усилия и растягивающего усилия нейрональных отростков, вызываемых вращательными движениями головного мозга в черепе. Могут происходить небольшие геморрагические повреждения или диффузное повреждение аксонов, которые можно выявить только микроскопически. Вторичное повреждение головного мозга происходит в результате осложнений, развивающихся после момента травмы. Они включают внутричерепное кровотечение, травматическое повреждение экстрацеребральных артерий, внутричерепное образование грыжи, гипоксическое повреждение головного мозга или менингит. Повреждения спинного мозга составляют большую часть случаев поступления людей в лечебные заведения с параплегией и тетраплегией. Свыше 80% случаев происходит в результате дорожнотранспортных происшествий. Клинически выделяют две основные группы повреждений: открытые повреждения и закрытые повреждения. Открытые повреждения вызывают прямую травму спинного мозга и корешков нервов. Перфорирующие повреждения могут вызывать обширное разрушение и кровотечение. Закрытые повреждения составляют большинство повреждений спинного мозга, и, как правило, они ассоциированы с переломом/смещением в позвоночнике, которые обычно выявляют радиологическими способами. Повреждение спинного мозга зависит от выраженности костных повреждений, и в них можно рассматривать две основные стадии: первичные повреждения, которые представляют собой ушибы, рассечения нервного волокна и геморрагический некроз, и вторичные повреждения, которые представляют собой экстрадуральную гематому, инфаркт, инфекцию и отек. Травма является наиболее распространенной причиной локализованного повреждения одного нерва. Резкая мышечная активность или принудительное чрезмерное растяжение в суставе может приводить к фокальной невропатии, которая может повторяться при небольших травмах (например, сильное сжатие небольших инструментов, чрезмерная вибрация от пневматического молотка). Паралич вследствие сдавления или ущемления обычно поражает поверхностные нервы (локтевой, лучевой, малоберцовый) на костных выступах (например, в процессе крепкого сна или в процессе анестезии у худых или истощенных лиц и часто у алкоголиков) или в узких каналах (например, при туннельном синдроме запястья). Паралич вследствие сдавления также может быть следствием опухолей, гиперостоза кости, повязок, костылей или длительных стесненных поз (например, при садоводстве). Травматические повреждения также могут происходить в процессе хирургических операций. Периферическая невропатия. Периферическая невропатия представляет собой синдром с потерей чувствительности, мышечной слабостью и атрофией, сниженным глубоким сухожильным рефлексом и вазомоторными симптомами,отдельно или в любом сочетании. Периферическая невропатия ассоциирована с аксональной дегенерацией, процессом, также называемым уоллеровским перерождением. В уоллеровском перерождении участвует нейровоспаление (Stoll et al., 2002). Заболевание может поражать один нерв (мононевропатия), два или более нервов в отдельных областях (множественная мононевропатия) или множество нервов одновременно (полиневропатия). Могут поражаться, главным образом, аксон (например, при сахарном диабете, болезни Лайма, уремии или посредством токсических агентов), или миелиновая оболочка, или шванновская клетка (например, при острой или хронической воспалительной полиневропатии, лейкодистрофиях или синдроме Гийена-Барре). Повреждение немиелинизированных и миелинизированных волокон приводит, главным образом, к снижению температурной и болевой чувствительности; повреждение крупных миелинизированных волокон приводит к двигательным или проприоцептивным дефектам. Некоторые невропатии (например, вследст-3 015716 вие вызванной свинцом токсичности, применения дапзона, болезни Лайма (вызываемой укусом клеща),порфирии или синдрома Гийена-Барре) в основном поражают двигательные волокна; другие невропатии(например, вследствие ганглионита заднего корешка при злокачественной опухоли, лепре, СПИД, сахарном диабете или хронической интоксикации пиридоксином) в основном поражают ганглии задних корешков, вызывая сенсорные симптомы. Иногда также вовлекаются черепные нервы (например, при синдроме Гийена-Барре, болезни Лайма, сахарном диабете и дифтерии). Идентификация механизмов помогает определить причину. Множественная мононевропатия обычно является вторичной при связанных с коллагеном сосудистых нарушениях (например, узелковом полиартериите, SLE, синдроме Шегрена, RA), саркоидозе, метаболических заболеваниях (например, диабете, амилоидозе) или инфекционных заболеваниях (например,болезни Лайма, ВИЧ-инфекции). Микроорганизмы могут вызывать множественную мононевропатию прямой инвазией в нерв (например, при лепре). Полиневропатия вследствие острых лихорадочных заболеваний может быть следствием токсина(например, при дифтерии) или аутоиммунной реакции (например, при синдроме Гийена-Барре); полиневропатия, которая иногда следует после иммунизации, также, вероятно, является аутоиммунной. Токсические агенты, как правило, вызывают полиневропатию, однако иногда они вызывают мононевропатию. Они включают эметин, гексобарбитал, барбитал, хлорбутанол, сульфонамиды, фенитоин,нитрофурантоин, алкалоиды барвинка, тяжелые металлы, монооксид углерода, триортокрезила фосфат,ортодинитрофенол, многие растворители, другие промышленные яды и определенные лекарственные средства против СПИД (например, зальцитабин, диданозин). Индуцируемая химиотерапией невропатия представляет собой значительный и тяжелый побочный эффект нескольких часто применяемых химиотерапевтических лекарственных средств, включая алкалоиды барвинка (винбластин, винкристин и виндезин), содержащие платину лекарственные средства(цисплатин) и таксаны (паклитаксел). Индукция периферической невропатии является частым фактором ограничения терапии химиотерапевтическими лекарственными средствами. К полиневропатии могут приводить недостаточность питательных веществ и метаболические нарушения. Часто причиной является дефицит витаминов B (например, при алкоголизме, болезни берибери, пернициозной анемии, индуцируемом изониазидом дефиците пиридоксина, синдромах мальабсорбции и неукротимой рвоте беременных). Также полиневропатия встречается при гипотиреозе, порфирии, саркоидозе, амилоидозе и уремии. Сахарный диабет может вызывать сенсомоторную дистальную полиневропатию (наиболее часто), множественную мононевропатию и фокальную мононевропатию (например, глазодвигательного или отводящего черепно-мозговых нервов). Полиневропатия вследствие метаболических нарушений (например, сахарного диабета) или почечной недостаточности развивается медленно, часто в течение месяцев или лет. Часто она начинается с чувствительных нарушений в нижних конечностях, которые часто являются более тяжелыми дистально,чем проксимально. Часто преобладают периферическое покалывание, онемение, жгучая боль или дефицит проприорецепции в суставе и вибрационной чувствительности. Боль часто усиливается ночью, и она может отягощаться при прикосновении к пораженной области или при изменениях температуры. В тяжелых случаях имеются объективные признаки потери чувствительности, как правило, с распределением по типу "чулок и перчаток". Ахиллов и другие глубокие сухожильные рефлексы снижаются или отсутствуют. Когда потеря чувствительности является выраженной, могут развиваться безболезненные язвы на пальцах или суставы Шарко. Чувствительный или проприоцептивный дефицит может приводить к нарушению походки. Двигательное вовлечение приводит к слабости дистальных мышц и атрофии. Дополнительно или селективно может вовлекаться автономная нервная система, что приводит к ночной диарее,недержанию мочи или кала, импотенции или постуральной гипотензии. Вазодвигательные симптомы варьируют. Кожа может быть более бледной и более сухой, чем в норме, иногда с темноватой нарушенной окраской кожи; потение может быть избыточным. Трофические изменения (гладкая и блестящая кожа, изъязвленные или образующие борозды ногти, остеопороз) являются частыми при тяжелых длительных случаях. Алиментарная полиневропатия является частой среди алкоголиков и у лиц с недостаточным питанием. Первичная аксонопатия может приводить к вторичной демиелинизации и разрушению аксонов в наиболее длинных и наиболее крупных нервах. Остается неясным, является ли ее причиной дефицит тиамина или дефицит другого витамина (например, пиридоксина, пантотеновой кислоты, фолиевой кислоты). Невропатия вследствие дефицита пиридоксина обычно происходит только у лиц, принимающих изониазид от туберкулеза; у детей, дефицитных по пиридоксину или зависимых от пиридоксина, могут быть судороги. Истощение и симметричная слабость в дистальных конечностях обычно развиваются без явных симптомов, однако они могут быстро прогрессировать, иногда сопровождаясь потерей чувствительности, парестезиями и болью. Боль, спазмы, похолодание, жжение и онемение в икроножных мышцах и ступнях могут усиливаться при прикосновении. Когда этиология неясна, может быть назначено множество витаминов, однако они не приводят к улучшениям.-4 015716 Наследственные невропатии классифицируют как сенсомоторные невропатии или сенсорные невропатии. Болезнь Шарко-Мари-Тута является наиболее распространенной наследственной сенсомоторной невропатией. Менее распространенные сенсомоторные невропатии начинаются при рождении и приводят к более значительной нетрудоспособности. При сенсорных невропатиях, которые являются редкими, снижения дистальной болевой и температурной чувствительности являются более выраженными, чем потеря вибрационной чувствительности и чувствительности положения. Основной проблемой является повреждение ног вследствие отсутствия болевой чувствительности, с частыми инфекциями и остеомиелитом. Наследственные невропатии также включают гипертрофическую интерстициальную невропатию и болезнь Дежерина-Сотта. Также полиневропатию может вызывать злокачественная опухоль посредством моноклональной гаммапатии (при множественной миеломе, лимфоме), амилоидной инвазии или дефицитах питательных веществ или в виде паранеопластического синдрома. Несмотря на различную этиологию, такую как инфекционные патогены или аутоиммунные атаки,все неврологические воспалительные заболевания вызывают снижение неврологической функции и могут приводить к параличу и смерти. Несмотря на то что доступно несколько лекарственных средств,снижающих воспалительные атаки при некоторых воспалительных заболеваниях, существует необходимость в разработке новых лекарственных средств, которые могут приводить к восстановлению неврологической функции.SDF-1. Хемокины (хемотаксические цитокины) составляют суперсемейство небольших (8-10 кДа) цитокинов, которые активируют семикратно трансмембранные сопряженные с G-белком рецепторы, которые вовлечены как в направленную миграцию через базальную мембрану, так и в воспалительные ответы,действуя, главным образом, в качестве хемоаттрактантов и активаторов лейкоцитов. Фактор стромальных клеток-1, SDF-1 и его 2 изоформы (, ) представляют собой небольшие хемотаксические цитокины, которые относятся к семейству интеркринов, члены которого активируют лейкоциты и часто индуцируются провоспалительными стимулами, такими как липополисахарид, TNF или IL-1. Интеркрины характеризуются наличием 4 консервативных цистеинов, которые образуют 2 дисульфидные связи. Их можно подразделить на 2 подсемейства. В CC-подсемействе, которое включает бета-хемокин, остатки цистеина являются соседними между собой. В CXC-подсемействе, которое включает альфа-хемокин, они разделены находящейся между ними аминокислотой. Белки SDF-1 относятся к последней группе. SDF-1 представляет собой природный лиганд рецептора для хемокинов CXCR4(LESTR/фузин). Изоформы ,иявляются следствием альтернативного сплайсинга общего гена. форма образована из экзонов 1-3, в то время как -форма содержит дополнительную последовательность из экзона 4. Первые три экзона SDF-1 являются идентичными экзонам SDF-1 и SDF-1. Четвертый экзон SDF-1 расположен на 3200 п.н. ниже третьего экзона на локусе SDF-1 и находится между третьим экзоном и четвертым экзоном SDF-1. Недавно было описано три новые изоформы SDF-1: SDF-1, SDF-1 и SDF-1 (Yu et al., 2006). Изоформа SDF-1 является альтернативно сплайсированной по последнему кодону открытой рамки считывания SDF-1, что приводит к интрону из 731 пар оснований с терминальным экзоном SDF-1, расщепленным на две части. Первые три экзона SDF-1 и SDF-1 на 100% идентичны первым трем экзонам изоформ SDF-1 и SDF-1. Ген SDF-1 экспрессируется повсеместно, за исключением клеток крови, он действует на лимфоциты и моноциты, но не на нейтрофилы in vitro и является очень мощным хемоаттрактантом для мононуклеарных клеток in vivo. In vitro и in vivo, SDF также действует в качестве хемоаттрактанта для гемопоэтических клеток-предшественников человека, экспрессирующих CD34.SDF-1 и его рецептор CXCR4 выполняют важные функции в гемопоэтической системе и нервной системе, поскольку удаление либо лиганда, либо рецептора является летальным у эмбриона вследствие аномального развития ЦНС (Ма et al., 1998; Zou et al., 1998).SDF-1 через взаимодействия с его рецептором CXCR4 может прямо индуцировать гибель клетки посредством апоптоза в нейрональной клеточной линии человека hNT, которая сходна с незрелыми постмитотическими холинергическими нейронами и обладает множеством нейрональных признаков(Hesselgesser et al., 1998). Роль SDF-1 в развитии и созревании центральной нервной системы рассмотрена Lazarini et al.(Lazarini et al., 2003). Хемокины, несомненно, вовлечены в нейровоспаление в ЦНС, однако их активность сводится к их роли в качестве биологически важных пептидов непосредственно в нейроэпителиальных клетках (включая нейроны, астроциты и олигодендроциты). В частности, хемокины влияют на пролиферацию предшественников олигодендроцитов (OLP), как проиллюстрировано посредством GRO-/CXCL1 (Robinson etal., 1998), образование лаброцитов в мозжечке, в случае SDF-1 (Zhu et al., 2002), и состояние активации микроглии, как проиллюстрировано посредством фракталкин/CX3CL1 (Zujovic et al., 2000), чтобы назвать некоторые из них. Таким образом, в случае как иммунной системы, так и нервной системы хемоки-5 015716 ны могут выполнять широкий диапазон сходных видов активности, включая регуляцию пролиферации,миграции, активации и дифференцировки. Множество хемокинов и рецепторов хемокинов экспрессируется в ЦНС либо конститутивно, либо посредством индукции медиаторами воспаления. Они вовлечены во множество нейропатологических процессов, включая рассеянный склероз (PC) (Bajetto et al., 2001; Sorensen et al., 2002). Было показано, что экспрессия SDF-1 в эндотелиальных клетках головного мозга способствует привлечению иммунных клеток в ишемизированную ЦНС (Stumm et al., 2002), подтверждая неблагоприятную роль SDF-1 при нейровоспалении. В отношении СПИД-деменции было описано, что SDF-1 индуцирует нейротоксичность посредством стимуляции продукции TNF- активированной микроглией и высвобождение глутамата астроцитами в модели индуцированного gp120 нейровоспаления in vitro (Bezzi etal., 2001; Sorensen et al., 2002). В недавней публикации описана экспрессия SDF-1 в астроцитах в очагах повреждения при PC (Ambrosini et al., 2005). Индукция экспериментального аллергического энцефаломиелита (EAE) у крыс сопровождалась повышением уровней различных рецепторов для хемокинов, включая CXCR4 (Jiang et al., 1998). В WO 00/09152 описано, что антагонисты CXCR4 пригодны для лечения аутоиммунного заболевания, лечения рассеянного склероза, лечения злокачественной опухоли и ингибирования ангиогенеза. В WO 99/50461 описаны способы лечения нарушений, в которые вовлечена аберрантная пролиферация или недостаточная клеточная пролиферация посредством введения соединений, которые стимулируют или ингибируют активность CXCR4. Ингибиторы функции CXCR4 были заявлены для лечения злокачественных опухолей и применение агонистов рецепторов было заявлено для лечения нарушений, в которых клеточная пролиферация является недостаточной или желательной. Нарушения, в которых клеточная пролиферация является недостаточной, включают демиелинизирующие повреждения нервной системы, при которых часть нервной системы разрушается или повреждается демиелинизирующим заболеванием, включая, например, рассеянный склероз и очаги повреждения в периферической нервной системе. Также было предложено терапевтическое применение антагонистов CXCR4/SDF-1 при неврологических заболеваниях. В EP 657468 B1 предложено применение SDF-1 для лечения заболеваний, связанных с недостаточным ростом или аномальной пролиферацией кроветворных клеток, нейрональным усилением или подавлением, профилактикой или лечением нейронального повреждения. В WO 03/062273 описан ингибитор каскада передачи сигнала SDF-1 для лечения воспаления. Описанные способы терапевтического применения включают воспаление, обусловленное аутоиммунными заболеваниями, или состояниями, или нарушениями, где может быть благоприятным подавление иммунной системы и/или воспаления либо в ЦНС, либо в любом другом органе, хроническую невропатию или синдром Гийена-Барре.Gleichmann et al. описали небольшое временное повышение экспрессии мРНК SDF-1 после повреждения периферического нерва. Они заключили, что их открытие впервые показывает дифференциальный характер экспрессии изоформы SDF-1 в различных физиологических условиях, таких как развитие и повреждение нервной системы (Gleichmann et al., 2000).SDF-1 может взаимодействовать с гликозаминогликанами (GAG), высоковариабельными, разветвленными группами сахаров, добавляемыми посттрансляционно к некоторым белкам, в общем называемым протеогликанами (PG). Такие белки находятся на клеточной мембране, во внеклеточном матриксе и в кровотоке, где также могут быть представлены изолированные GAG. PG, или изолированные GAG,могут образовывать комплекс с растворимыми молекулами, вероятно, для защиты этой молекулы от протеолиза во внеклеточном окружении. Также было предположено, что GAG могут способствовать правильному представлению молекул клеточной передачи сигнала специфичному для них рецептору и, в итоге, также к модулированию активации клетки-мишени. В случае хемокинов концентрирование в фиксированные градиенты в области воспаления и, таким образом, взаимодействие с клеточными рецепторами и их состояние активации, по-видимому, модулируются различными формами GAG (Hoogewerf et al., 1997). Таким образом, было предположено, что модулирование таких взаимодействий может представлять собой терапевтический подход при воспалительном заболевании (Schwarz and Wells, 1999). Модифицированный SDF-1, SDF-1 3/6, был получен комбинированной заменой основного кластера остатков Lys24, His25 и Lys27 на Ser (Amara et al., 1999). Эта мутантная форма неспособна связывать гепарансульфат, однако в ней сохранена способность связывать и активировать CXCR4. В другом исследовании изучали эффект единичных мутаций в том же домене и охарактеризованном комплексе SDF-1 и гепарина (Sadir et al., 2001). Sadir et al. также сделали предположение о вовлечении остатков Arg41 и-6 015716 Сущность изобретения Целью настоящего изобретения является предоставление новых способов лечения и/или профилактики неврологического заболевания. В рамках настоящего изобретения было обнаружено, что введение SDF-1, Met-SDF-1 или варианта SDF-1 оказывает благоприятный эффект в моделях периферических неврологических заболеваний на животных in vivo. Также было показано, что SDF-1 и его вариант ингибирует TNF- и IL-6 в модели индуцируемого LPS высвобождения TNF- на животных, которая представляет собой модель воспаления. Экспериментальные данные, представленные в настоящем описании, таким образом, предусматривают новую возможность лечения неврологических заболеваний, в частности заболеваний, связанных с функцией нейрональных и глиальных клеток и нейровоспалением. Таким образом, настоящее изобретение относится к применению SDF-1 или агониста активностиSDF-1 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания. В соответствии с настоящим изобретением SDF-1 также можно применять для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний в сочетании с интерфероном, или остеопонтином, или кластерином. Применение молекул нуклеиновых кислот, экспрессирующих векторов, содержащих SDF-1, и клеток, экспрессирующих SDF-1, для лечения и/или профилактики неврологического заболевания также относится к настоящему изобретению. Кроме того, это изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим SDF-1 и интерферон, или остеопонтин, или кластерин необязательно совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлено содержание TNF- и IL-6 (в пг/мл) в смешанных кортикальных культурах,преинкубированных на 14 сутки культивирования клеток с 0,001, 0,1 и 10 нг/мл SDF-1 (фиг. 1A) или варианта SDF-1 (фиг. 1B) в течение 3 ч при 37C, с последующим добавлением 5 нг/мл LPS на 48 ч. Супернатанты собирали на 16 сутки и уровни TNF- и IL-6 определяли посредством специфичныхELISA. В качестве положительных контролей культуры обрабатывали 25 пМ дексаметазоном (Dexa),10 нг/мл IL-10 или не обрабатывали. В качестве отрицательного контроля культуры обрабатывали толькоLPS. На фиг. 2 представлено среднее общее количество клеток 106s.e., привлеченных в брюшную полость через 4 ч после внутрибрюшинной инъекции 200 мкл NaCl (0,9%, без LPS; исходный уровень) или 4 мкг SDF-1 или варианта SDF-1, разбавленных в 200 мкл NaCl (0,9%, без LPS). На фиг. 3 представлено содержание SDF-1 (пг/мг общего белка) в экстрактах спинного мозга, извлеченного из мышей, пораженных EAE в хронической фазе, по сравнению с не подвергавшимися воздействию мышами (контроль). На фиг. 4 представлены электрофизиологические записи от мышей после повреждения седалищного нерва сдавлением, которым вводили носитель (физиологический раствор/0,02% BSA), 3, 10, 30 или 100 мкг/кг SDF-1 подкожно и 30 мкг/кг соединения эталонного (положительного) контроля (IL-6). Исходный уровень: значения, зарегистрированные на противоположной стороне животных, которым вводили носитель. Регистрацию проводили на 7, 15 и 22 сутки после повреждения (dpl). На фиг. 4A представлена амплитуда (в мВ) смешанного потенциала мышечного действия. На фиг. 4B представлена латентность (в мс) смешанного потенциала мышечного действия. На фиг. 5 представлены электрофизиологические записи от мышей после повреждения седалищного нерва сдавлением, которым вводили носитель (физиологический раствор/0,02% BSA) или 30 мкг/кг варианта SDF-1 подкожно. Исходный уровень: значения, зарегистрированные на противоположной стороне животных, которым вводили носитель. Регистрацию проводили на 7 и 22 сутки после повреждения (dpl). На фиг. 5A представлена амплитуда (в мВ) смешанного потенциала мышечного действия. На фиг. 5B представлена латентность (в мс) смешанного потенциала мышечного действия. На фиг. 5C представлена длительность (в мс) смешанного потенциала мышечного действия. На фиг. 6 представлены электрофизиологические записи от мышей после повреждения седалищного нерва сдавлением, которым вводили носитель (физиологический раствор/0,02% BSA) или 100, 30,10 мкг/кг Met-SDF-1 подкожно. Исходный уровень: значения, зарегистрированные на противоположной стороне животных, которым вводили носитель. Регистрацию проводили на 7 и 14 сутки после повреждения (dpl). На фиг. 6A представлена латентность (в мс) смешанного потенциала мышечного действия. На фиг. 7 представлены результаты введения 100, 30, 10 мкг/кг SDF-1 подкожно в модели диабетической невропатии со стрептозотоцином (STZ). Молекула положительного контроля представляет собой IL-6 в количестве 10 мкг/кг подкожно. На фиг. 7A представлены показатели массы тела начиная с 11 до 40 суток.-7 015716 На фиг. 7 В представлены уровни гликемии на 7 сутки после STZ. На фиг. 7C представлена латентность смешанного потенциала мышечного действия, определенная на 24 и 40 сутки после STZ. На фиг. 7D представлен эффект SDF-1 на скорость проведения по чувствительному нерву. На фиг. 7E представлена относительная толщина миелина на 40 сутки после STZ с введениемSDF-1 и без него, выраженная в качестве g-соотношения. На фиг. 7F представлено количество подвергшихся дегенерации волокон в седалищном нерве на 40 сутки после STZ. На фиг. 7G представлена плотность интраэпидермальных нервных волокон на 40 сутки после STZ. На фиг. 8 представлены результаты введения 100, 30, 10 мкг/кг SDF-1 подкожно на механические и термические данные аллодинии в модели диабетической невропатии со стрептозотоцином (STZ). На фиг. 8A представлено пороговое давление, измеренное в тесте с нитью Von Frey на 20 сутки после STZ На фиг. 8B представлены показатели латентности в анализе с нагретым до 52C планшетом на 40 сутки после STZ. На фиг. 9 представлен оцененный показатель ложных результатов в коллекции первичнопрогрессирующего PC у итальянцев в зависимости от количества положительных маркеров R для R100. На фиг. 10 представлен SNPA-2185631 в гене SDF-1. На фиг. 11 представлены предсказанные аминокислотные последовательности вариантов по сплайсингу SDF-1 человека. На фиг. 12 представлено, что SNPA-2185631 находится в гене SDF-1, в последнем интроне SDF-1 и SDF-1. Подробное описание изобретения В рамках настоящего изобретения было выявлено, что введение SDF-1 оказывает благоприятный эффект in vivo в модели периферических неврологических заболеваний на животных. В модели, индуцированной повреждением посредством сдавления седалищного нерва невропатии у мышей, введениеSDF-1, Met-SDF-1 или варианта SDF-1 оказывало положительное влияние на все физиологические параметры, связанные с регенерацией нервов, целостностью и жизнеспособностью. Было показано, что SDF-1 и вариант SDF-1 ингибируют TNF- и IL-6 в модели индуцируемогоLPS высвобождения TNF- на животных, которая представляет собой типичную модель нейровоспаления. В настоящем изобретении показан защитный эффект SDF-1 при диабетической невропатии и невропатической боли. Кроме того, была выявлена генетическая ассоциация между геном SDF-1 и первичнопрогрессирующим PC. Таким образом, экспериментальные данные, представленные в настоящем описании, обеспечивают новую возможность лечения неврологических заболеваний, в частности заболеваний, связанных с функцией нейрональных и глиальных клеток и нейровоспалением. Таким образом, это изобретение относится к применению SDF-1 или агониста активности SDF-1 для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания. Как используют в настоящем документе, термин "SDF-1" относится к полноразмерному зреломуSDF-1 человека или его фрагменту, обладающему активностью SDF-1, например, такой как его связывание с рецептором CXCR4. Аминокислотная последовательность SDF-1 человека приведена в настоящем описании в качестве SEQ ID NO:1 в прилагаемом списке последовательностей. Как используют в настоящем документе, термин "SDF-1" далее относится к любому SDF-1, источником которого являются животные, такому как мышиный, бычий или крысиный SDF-1, при условии наличия идентичности, достаточной для сохранения активности SDF-1. Как используют в настоящем документе, термин "SDF-1" далее относится к биологически активным мутеинам и фрагментам, таким как встречающиеся в природе изоформы SDF-1. Описано шесть альтернативно сплайсированных вариантов транскриптов гена, кодирующего различные изоформы SDF-1SDF-1 человека описаны в настоящем документе в качестве SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:16 соответственно прилагаемого списка последовательностей. Как используют в настоящем документе, термин "SDF-1" далее включает изоформы, мутеины, слитые белки, функциональные производные, активные фракции, фрагменты или их соли. Эти изоформы,мутеины, слитые белки или функциональные производные, активные фракции или фрагменты сохраняют биологическую активность SDF-1. Предпочтительно они обладают биологической активностью, которая является улучшенной по сравнению с SDF-1 дикого типа.-8 015716 Термин "SDF-1", в частности, включает изоформу зрелого SDF-1 человека, определяемогоSEQ ID NO:1, зрелого SDF-1 человека, определяемого SEQ ID NO:2, зрелого SDF-1 человека, определяемого SEQ ID NO:3, зрелого SDF-1 человека, определяемого SEQ ID NO:14, зрелого SDF-1 человека,определяемого SEQ ID NO:15, и зрелого SDF-1 человека, определяемого SEQ ID NO:16; изоформу зрелого SDF-1 человека, имеющего дополнительный N-концевой метионин и определяемого SEQ ID NO:7; укороченные формы SDF-1, такие как форма, соответствующая аминокислотным остаткам 4-68 зрелогоSDF-1 человека и определяемая SEQ ID NO:8, форма, соответствующая аминокислотным остаткам 3-68 зрелого SDF-1 человека и определяемая SEQ ID NO:9, и форма, соответствующая аминокислотным остаткам 3-68 зрелого SDF-1 человека, имеющая дополнительный N-концевой метионин и определяемая SEQ ID NO:10. Также термин SDF-1 охватывает слитые белки, содержащие полипептид SDF-1, как определено выше, функционально связанный с гетерологичным доменом, например одной или несколькими аминокислотными последовательностями, которые можно выбирать среди следующих: внеклеточный домен мембрано-связанного белка, константные участки иммуноглобулинов (Fc-участок), домены мультимеризации, сигналы на экспорт и маркерные последовательности (такие как последовательности, упрощающие аффинную очистку: НА-маркер, гистидиновый маркер, GST, FLAAG-пептиды или MBP). Предпочтительными являются слитые с Fc белки SDF-1, определяемые SEQ ID NO:13. Как используют в настоящем документе, термин "вариант SDF-1" относится к мутантной формеSDF-1, имеющей сниженную активность в отношении связывания GAG. Выражение "сниженная активность в отношении связывания GAG" или "дефектный по связыванию GAG" означает, что мутантные СС-хемокины обладают сниженной способностью связываться с GAG, т.е. сниженной процентной долей каждой из этих мутантных форм, связывающихся с GAG (таким как гепаринсульфат) относительно соответствующей молекулы дикого типа, как определяют с помощью анализов в цитированных ниже более ранних описаниях таких мутантных форм. В частности, такая мутантная форма представляет собой форму, которая уже описана ранее, с заменами Lys24 His25 и Lys27 на Ser (Amara et al. J. Biol. Chem. 1999Aug 20; 274 (34):23916-25) или на Ala (SEQ ID NO:4). Другие дефектные по связыванию GAG мутантные формы можно получать комбинированной заменой в основном кластере из остатков Lys24, His25 и Lys27 и заменой любых других остатков, вовлеченных в связывание гликозаминогликана, например Arg41 иLys43 на Ser и/или Ala. Возможные сочетания могут представлять собой, например, Lys24 Lys27, Lys24Arg41 Lys43. Термин "вариант SDF-1", в частности, охватывает мутантную форму SDF-1, имеющую сниженную активность связывания GAG и определяемую SEQ ID NO:4 (тройная мутантная форма SDF-1,имеющая Lys24Ala, His25Ala, Lys27Ala); мутантную форму SDF-1, имеющую дополнительный начальный остаток метионина и имеющую тройную мутацию Lys25Ala, His26Ala, Lys28Ala, определяемуюSEQ ID NO:11; и мутантную форму SDF-1 со сниженной активностью в отношении связывания GAG,имеющую одну мутацию Lys27Cys и определяемую SEQ ID NO:12. Варианты SDF-1, как определено в настоящем документе, в частности вариант SDF-1, определяемый SEQ ID NO:12, могут быть модифицированы посредством PEG (полиэтиленгликоля), с помощью процесса, известного как "пегилирование". Пегилирование можно проводить посредством любой из реакций пегилирования, известных в данной области (см., например, EP 0154316).C-концевой аминокислоты, также относятся к этому изобретению. Особенно предпочтительные формы SDF-1, имеющие делецию C-концевой аминокислоты, представляют собой укороченные формы SDF-1, такие как форма, соответствующая аминокислотным остаткам 3-67 зрелого SDF-1 человека и определяемая SEQ ID NO:17, и форма, соответствующая аминокислотным остаткам 3-67 зрелого SDF-1 человека, имеющая дополнительный N-концевой метионин и определяемая SEQ ID NO:18. Как используют в настоящем документе, термин "агонист активности SDF-1" относится к молекуле,стимулирующей или имитирующей активность SDF-1, такой как антитела-агонисты к рецептору дляSDF-1 или низкомолекулярные агонисты, активирующие передачу сигнала через рецептор для SDF-1,например рецептор CXCR4. Как используют в настоящем документе, термин "агонист активности SDF-1" также относится к средствам, усиливающим опосредуемую SDF-1 активность, такую как обеспечение прикрепления клеток к компонентам внеклеточного матрикса, морфогенез клеток ростка олигоденроцитов в продуцирующие миелин клетки, обеспечение привлечения, пролиферации, дифференцировки или созревания клеток ростка олигодендроцитов (таких как клетки-предшественники или родительские клетки) или обеспечение защиты клеток ростка олигодендроцитов от апоптоза и повреждения клеток. Сходные виды активностиSDF-1 также обеспечиваются для шванновских клеток.-9 015716 В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения SDF-1 представляет собойSDF-1. В следующем предпочтительном варианте осуществления этого изобретения SDF-1 представляет собой вариант SDF-1. Как используют в настоящем документе, термины "лечение" и "профилактика" следует понимать как предотвращение, ингибирование, ослабление, смягчение или обращение одного или нескольких симптомов или причины (причин) неврологического заболевания, а также симптомов, заболеваний или осложнений, сопровождающих неврологическое заболевание. При "лечении" неврологического заболевания вещество в соответствии с этим изобретением вводят после начала заболевания, "профилактика" относится к введению вещества до того, как у пациента могут быть выявлены признаки заболевания. Как используют в настоящем документе, термин "неврологические заболевания" охватывает все известные неврологические заболевания или нарушения либо повреждения ЦНС или ПНС, включая повреждения, подробно описанные в разделе "Предпосылки изобретения". Неврологические заболевания включают нарушения, связанные с дисфункцией ЦНС или ПНС, такие как заболевания, связанные с нейротрансмиссией, головной болью, травмой головы, инфекциями ЦНС, нейроофтальмологическими нарушениями и нарушениями черепно-мозговых нервов, функцией и дисфункцией долей головного мозга, нарушениями движений, ступором и комой, демиелинизирующими заболеваниями, делирием и деменцией, аномалиями кранио-цервикального сочленения, нарушениями сознания, нарушениями спинного мозга, нарушениями сна, нарушениями периферической нервной системы, цереброваскулярным заболеванием или мышечными нарушениями. Для определений этих нарушений см., например, The Merck Manual for Diagnosis and Therapy, Seventeenth Edition, published by MerckResearch Laboratories, 1999. Нейровоспаление происходит при различных неврологических заболеваниях. Нейровоспаление, которое может быть индуцировано нейрональным или олигодендроглиальным нарушением, запускается множеством стимулов или оно может быть следствием травмы, повреждения центрального или периферического нерва или вирусной или бактериальной инфекции. Основными следствиями нейровоспаления являются: (i) секреция различных воспалительных хемокинов астроцитами, клетками микроглии и (ii) привлечение дополнительных лейкоцитов, которые далее стимулируют астроциты или микроглию. Полагают, что при хронических нейродегенеративных заболеваниях, таких как рассеянный склероз (PC),болезнь Альцгеймера (AD) или боковой амиотрофический склероз (ALS), наличие постоянного нейровоспаления участвует в прогрессировании заболевания. Неврологические заболевания, обусловленные нейровоспалением, также могут называться неврологическими воспалительными заболеваниями. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения неврологическое заболевание ассоциировано с воспалением, в частности нейровоспалением. Предпочтительно неврологические заболевания по этому изобретению выбирают из группы, состоящей из травматического повреждения нерва, инсульта, демиелинизирующих заболеваний ЦНС или ПНС, невропатий и нейродегенеративных заболеваний. Травматическое повреждение нерва может быть связано с ПНС или ЦНС, оно может представлять собой травму головного мозга или спинного мозга, включая параплегию, как описано выше в разделе"Предпосылки изобретения". В предпочтительных вариантах осуществления этого изобретения травматическое повреждение нерва включает травму периферического нерва или травму спинного мозга. Инсульт может быть вызван гипоксией или ишемией головного мозга. Также его называют церебро-васкулярным заболеванием или повреждением. Инсульт может вовлекать снижение функций головного мозга (неврологический дефицит), вызываемое снижением кровотока в областях головного мозга. Снижение кровотока может быть следствием сгустков крови, которые могут образовываться в головном мозге (тромб), или фрагментов атеросклеротической бляшки или другого материала, которые переносятся в головной мозг из другой области (эмболы). Кровотечение (геморрагия) в головном мозге может вызывать симптомы, которые имитируют инсульт. Наиболее частой причиной инсульта является вторичный инсульт после атеросклероза (церебрального тромбоза), и, таким образом, это изобретение также относится к лечению атеросклероза. Периферическая невропатия может быть связана с синдромом потери чувствительности, мышечной слабостью и атрофией, сниженным глубоким сухожильным рефлексом и вазомоторными симптомами,отдельно или в любом сочетании. Периферическая невропатия может поражать один нерв (мононевропатия), два или более нервов в отдельных областях (множественная мононевропатия) или множество нервов одновременно (полиневропатия). Могут поражаться, главным образом, аксон (например, при сахарном диабете, болезни Лайма, уремии или посредством токсических агентов), или миелиновая оболочка,или шванновская клетка (например, при острой или хронической воспалительной полиневропатии, лейкодистрофиях или синдроме Гийена-Барре). Следующие невропатии, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, могут возникать вследствие вызванной свинцом токсичности, применения дапзона, укуса клеща, порфирии или синдрома Гийена-Барре, и они могут поражать в основном дви- 10015716 гательные волокна. Другие невропатии, такие как невропатии вследствие ганглионита заднего корешка при злокачественной опухоли, лепре, СПИД, сахарном диабете или хронической интоксикации пиридоксином, могут поражать в основном ганглии задних корешков или чувствительные волокна, вызывая сенсорные симптомы. Также могут быть вовлечены черепные нервы, например, как в случае синдрома Гийена-Барре, болезни Лайма, сахарного диабета и дифтерии. Болезнь Альцгеймера представляет собой нарушение, вовлекающее ухудшение психических функций вследствие изменений в ткани головного мозга. Оно может включать сокращение объема тканей головного мозга, вызываемое не нарушениями кровеносных сосудов, первичную дегенеративную деменцию и диффузную атрофию головного мозга. Болезнь Альцгеймера также называют старческим слабоумием по типу болезни Альцгеймера (SDAT). Болезнь Паркинсона представляет собой нарушение головного мозга, характеризующееся дрожанием и проблемами с хождением, движениями и координацией. Заболевание обусловлено повреждением части головного мозга, которая контролирует движение мышц, и его также называют paralysis agitans,или дрожательным параличом. Болезнь Гентингтона (HD) представляет собой наследственное аутосомно-доминантное неврологическое заболевание. Генетическое нарушение состоит в избытке количества тандемно повторяющихся нуклеотидных последовательностей CAG. Другие заболевания с повторами CAG включают, например,спинальные мышечные атрофии (SMA), такие как болезнь Кеннеди, и большинство аутосомнодоминантных мозжечковых атаксий (ADCA), которые известны в генетической номенклатуре как спинально-церебеллярные атаксии (SCA). Боковой амиотрофический склероз (ALS) представляет собой нарушение, вызывающее прогрессирующую потерю нервного контроля произвольных мышц, включающую разрушение нервных клеток в головном и спинном мозге. Боковой амиотрофический склероз, также называемый болезнью Лу Геринга,представляет собой нарушение, вовлекающее снижение использования и контроля мышц. Рассеянный склероз (PC) представляет собой воспалительное демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), которое принимает ремитирующее или прогрессирующее течение.PC является не единственным демиелинизирующим заболеванием. Его аналогом в периферической нервной системе (ПНС) является хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия (CIDP). Кроме того, существуют острые монофазные нарушения, такие как воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия, называемая синдромом Гийена-Барре (GBS) в ПНС, и острый диссеминированный энцефаломиелит (ADEM) в ЦНС. Следующие неврологические нарушения включают невропатии с аномальной миелинизацией, такие как нарушения, представленные выше в разделе"Предпосылки изобретения", а также туннельный синдром запястья. Травматическое повреждение нерва может сопровождаться ортопедическими осложнениями в позвоночнике, и они также относятся к заболеваниям в соответствии с настоящим изобретением. Также в объеме настоящего изобретения находятся менее известные неврологические заболевания,такие как нейрофиброматоз или множественная системная атрофия (MSA). Следующие нарушения, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, подробно описаны выше в разделе"Предпосылки изобретения". В следующем предпочтительном варианте осуществления неврологическое заболевание представляет собой периферическую невропатию, наиболее предпочтительно диабетическую невропатию. Также предпочтительными в соответствии с настоящим изобретением являются ассоциированные с химиотерапией/индуцированные химиотерапией невропатии. Термин "диабетическая невропатия" относится к любой форме диабетической невропатии или к одному или нескольким симптому(ам) или нарушению(ям), сопровождающим диабетическую невропатию или вызываемым диабетической невропатией, или к осложнениям диабета, поражающим нервы, как подробно описано выше в разделе "Предпосылки изобретения". Диабетическая невропатия может представлять собой полиневропатию. При диабетической полиневропатии одновременно поражается множество нервов. Диабетическая невропатия также может представлять собой мононевропатию. При фокальной мононевропатии, например, заболевание поражает один нерв, такой как глазодвигательный или отводящий черепно-мозговой нерв. Также это заболевание может представлять собой множественную мононевропатию, когда два или более нервов поражаются в отельных областях. В следующем предпочтительном варианте осуществления неврологическое нарушение представляет собой демиелинизирующее заболевание. Демиелинизирующие заболевания предпочтительно включают демиелинизирующие состояния ЦНС, такие как острый диссеминированный энцефаломиелит(ADEM) и рассеянный склероз (PC), а также демиелинизирующие заболевания периферической нервной системы (ПНС). Последние включают заболевания, такие как хроническая воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия (CIDP), и острые монофазные нарушения, такие как воспалительная демиелинизирующая полирадикулоневропатия, называемая синдромом Гийена-Барре (GBS). В следующем предпочтительном варианте осуществления демиелинизирующее заболевание представляет собой рассеянный склероз.- 11015716 В особенно предпочтительном варианте осуществления этого изобретения демиелинизирующее заболевание представляет собой первично-прогрессирующий рассеянный склероз. В другом особенно предпочтительном варианте осуществления этого изобретения демиелинизирующее заболевание представляет собой вторично-прогрессирующий рассеянный склероз. В следующем предпочтительном варианте осуществления демиелинизирующее заболевание выбрано из хронического воспалительного рассеянного склероза, демиелинизирующей полиневропатии (CIDP) и синдрома Гийена-Барре (GBS). Следующий предпочтительный вариант осуществления этого изобретения относится к лечению и/или профилактике нейродегенеративного заболевания. Нейродегенеративное заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, болезни Гентингтона и ALS. Предпочтительно SDF-1 выбирают из пептида, полипептида или белка, выбранного из группы, состоящей из:(d) полипептида согласно (a)-(c), дополнительно содержащего сигнальную последовательность предпочтительно аминокислоты SEQ ID NO:5;(e) мутеина согласно любому из (a)-(d), где аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90%-ной идентичностью по меньшей мере одной из последовательностей согласно (a)-(d);(f) мутеина согласно любому из (a)-(d), который кодируется последовательностью ДНК, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с последовательностью, комплементарной нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (a)-(d);(g) мутеина согласно любому из (a)-(d), где любые замены в аминокислотной последовательности представляют собой консервативные аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях согласно (a)-(d);(h) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного или активной фракции согласно любому из (a)-(d). Активные фракции или фрагменты могут включать любую часть или домен любой из изоформSDF-1, такие как N-концевая часть или С-концевая часть, или любую из изоформ SDF-1. Специалист в данной области поймет, что даже части SDF-1 меньших размеров могут быть достаточными для осуществления его функции, такие как активный пептид, содержащий незаменимые аминокислотные остатки, требуемые для функции SDF-1, например, такой как связывание с рецепторомCXCR4. Связывание рецептора, например, можно определять, подвергая иммобилизованный рецептор воздействию его меченого лиганда и немеченого тестируемого белка, в результате которого снижение связывания меченого лиганда по сравнению с контролем указывает на рецепторсвязывающую активность тестируемого белка. В другом анализе поверхностной плазмонной резонансной спектроскопии,рецептор или белок, подлежащие анализу, иммобилизуют на плоском сенсорном чипе в проточной камере, после чего раствор, содержащий предполагаемый взаимодействующий партнер, пропускают через первый белок в виде постоянного потока, свет направляют через чип под определенным углом и измеряют резонансный угол отраженного света; формирование белок-белкового взаимодействия приводит к изменению угла (например, BIACore, Biacore International AB). Другие способы, пригодные для анализа белок-белковых взаимодействий (например, аффинная хроматография, аффинный блоттинг и коиммунопреципитация) или для оценки аффинности связывания (например, белковая аффинная хроматография,осаждение, гель-фильтрация, флуоресцентные способы, твердофазный отбор образцов равновесных растворов и поверхностный плазмонный резонанс), рассмотрены Phizicky E.M. и Fields S. (Phizicky andFields, 1995; Sadir et al., 2001). Далее, специалист в данной области поймет, что мутеины, соли, изоформы, слитые белки, функциональные производные или активные фракции SDF-1 будут сохранять сходную биологическую активность или даже проявлять улучшенную биологическую активность SDF-1. Биологическую активностьSDF-1 и его мутеинов, изоформ, слитых белков или функциональных производных, активных фракций или фрагментов или солей можно определять в биологическом анализе с использованием клеточной системы. Предпочтительные активные фракции обладают активностью, равной активности полноразмерногоSDF-1 или лучшей, чем эта активность, или активностью, которая обладает дополнительными преимуществами, такими как улучшенная стабильность или более низкая токсичность или иммуногенность, или их проще получать в больших количествах, или их проще очищать. Специалист в данной области поймет, что мутеины, активные фрагменты и функциональные производные можно получать посредством клонирования соответствующей кДНК в пригодные плазмиды и тестирования их в клеточном анализе,как упомянуто выше.- 12015716 Белки в соответствии с настоящим изобретением могут быть гликозилированными или негликозилированными, они могут быть получены из природных источников, таких как жидкости организма, или предпочтительно они могут быть продуцированы рекомбинантно. Рекомбинантную экспрессию можно проводить в прокариотических экспрессирующих системах, таких как E.coli, или в эукариотических системах, таких как клетки насекомых, и предпочтительно в экспрессирующих системах млекопитающих,таких как клетки CHO или клетки HEK. Более того, белки по этому изобретению могут быть модифицированными, удлиненными или укороченными, посредством удаления или вставки N-концевого а метионина (Met) или аминооксипентана (AOP) при условии сохранения нейропротективных эффектов. Как используют в настоящем документе, термин "мутеины" относится к аналогам SDF-1, в которых один или несколько аминокислотных остатков природного SDF-1 заменены отличающимися аминокислотными остатками или удалены или один или несколько аминокислотных остатков вставлены в природную последовательность SDF-1 без значительного изменения активности полученных продуктов по сравнению с SDF-1 дикого типа. Эти мутеины получают известным способом синтеза и/или способами сайт-направленного мутагенеза или любым другим способом, пригодным для этого. Мутеины SDF-1, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, или кодирующие их нуклеиновые кислоты включают конечный набор, по существу, аналогичных последовательностей в виде пептидов или полинуклеотидов с заменами, которые специалист в данной области может получать общепринятыми способами без излишнего экспериментирования, исходя из указаний и рекомендаций, представленных в настоящем описании. Мутеины в соответствии с настоящим изобретением включают белки, кодируемые нуклеиновой кислотой, такой как ДНК или РНК, которая гибридизуется с ДНК или РНК, которые кодируют SDF-1, в соответствии с настоящим изобретением, в условиях умеренной или высокой жесткости. кДНК, кодирующая SDF-1, описана в качестве SEQ ID NO:6. Термин "жесткие условия" относится к условиям гибридизации и последующего промывания, которые специалисты в данной области обычно называют "жесткими". См. Ausubel et al., Current Protocols inMolecular Biology, выше, Interscience, N.Y.,6.3 и 6.4 (1987, 1992) и Sambrook et al. (Sambrook, J.C.,Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Не ограничиваясь этим, примеры жестких условий включают условия промывания на 12-20C ниже вычисленной Tm гибрида при исследовании, например, в 2SSC и 0,5% SDS в течение 5 мин, 2SSC и 0,1% SDS в течение 15 мин; 0,1SSC и 0,5% SDS при 37C в течение 30-60 мин, а затем 0,1SSC и 0,5%SDS при 68C в течение 30-60 мин. Специалисты в данной области понимают, что жесткость условий также зависит от длины последовательностей ДНК, олигонуклеотидных зондов (такой как 10-40 оснований) или смешанных олигонуклеотидных зондов. Если используют смешанные зонды, предпочтительным является применение хлорида тетраметиламмония (ТМАС) вместо SSC. См. Ausubel, выше. В предпочтительном варианте осуществления любой такой мутеин обладает по меньшей мере 40% идентичностью или гомологией с последовательностями SEQ ID NO:1-4 прилагаемого списка последовательностей. Более предпочтительно он обладает по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80 или наиболее предпочтительно по меньшей мере 90%-ной идентичностью или гомологией с ним. Идентичность отражает взаимосвязь между двумя или более полипептидными последовательностями или двумя или более полинуклеотидными последовательностями, определенную посредством сравнения последовательностей. Как правило, идентичность относится к точному соответствию нуклеотида нуклеотиду или аминокислоты аминокислоте в двух полинуклеотидных или двух полипептидных последовательностях соответственно на протяжении длины сравниваемых последовательностей. В случае последовательностей, где соответствие является неполным, можно определять "% идентичность". Как правило, две последовательности, подлежащие сравнению, выравнивают для обеспечения максимальной корреляции между последовательностями. Выравнивание может включать встраивание"разрывов" в любую одну или обе последовательности для повышения степени выравнивания. % идентичность можно определять на протяжении всей длины каждой из сравниваемых последовательностей(так называемое глобальное выравнивание), что является особенно пригодным для последовательностей одинаковой или сходной длины, или на протяжении более коротких определенных длин (так называемое локальное выравнивание), что является более пригодным для последовательностей с неравной длиной. Способы сравнения идентичности и гомологии двух или более последовательностей хорошо известны в данной области. Таким образом, для определения % идентичности между двумя полинуклеотидами и % идентичности и % гомологии между двумя полипептидными последовательностями можно использовать, например, программы, доступные в Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9,1(Devereux et al., 1984), например программы BESTFIT и GAP. BESTFIT использует алгоритм "локальной гомологии" Smith и Waterman (Smith and Waterman, 1981) и находит один участок наибольшего сходства между двумя последовательностями. Также в данной области известны другие программы для определения идентичности и/или сходства между последовательностями, например семейство программ BLAST(Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997), доступное через домашнюю страницу NCBI наwww.ncbi.nlm.nih.gov) и FASTA (Pearson, 1990; Pearson and Lipman, 1988). Предпочтительные изменения для мутеинов в соответствии с настоящим изобретением представляют собой замены, известные как "консервативные" замены. Консервативные аминокислотные замены полипептидов SDF-1 могут включать синонимические аминокислоты в группе, которые обладают достаточно сходными физико-химическими свойствами, чтобы замена между членами группы сохраняла биологическую функцию молекулы (Grantham, 1974). Очевидно, что вставки и делеции аминокислот также можно проводить в указанных выше последовательностях без изменения их функции, в частности, если вставки и делеции вовлекают только несколько аминокислот, например менее 30 и предпочтительно менее 10, и не удаляют или не вытесняют аминокислоты, которые являются важными для функциональной конформации, например остатки цистеина. Белки и мутеины, получаемые посредством таких делеций и/или вставок, находятся в рамках настоящего изобретения. Предпочтительно группы синонимических аминокислот представляют собой группы, определенные в табл. I. Более предпочтительно группы синонимических аминокислот представляют собой группы, определенные в табл. II; и наиболее предпочтительно группы синонимических аминокислот представляют собой группы, определенные в табл. III. Таблица I Предпочтительные группы синонимических аминокислот- 14015716 Таблица II Более предпочтительные группы синонимических аминокислот Таблица III Наиболее предпочтительные группы синонимических аминокислот- 15015716 Примеры внесения аминокислотных замен в белки, которые могут приводить к получению мутеинов SDF-1, полипептидов или белков, для применения в настоящем изобретении включают любые известные стадии способов, такие как представлено в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462, выданных Mark et al.; 5116943, выданном Koths et al.; 4965195, выданном Namen et al.; 4879111, выданномChong et al.; и 5017691, выданном Lee et al.; и замещенные лизином белки представлены в патенте США 4 904584 (Shaw et al.). Термин "слитый белок" относится к полипептиду, содержащему SDF-1, или его мутеину или фрагменту, слитому с другим белком, который, например, обладает увеличенным временем нахождения в жидкостях организма. Таким образом, SDF-1 может быть слитым с другим белком, полипептидом или сходными с ними, например иммуноглобулином или его фрагментом. Как используют в настоящем документе, "функциональные производные" охватывают производныеSDF-1 и их мутеины и слитые белки, которые можно получать из функциональных групп, встречающихся в качестве боковых цепей на остатках N- или С-концевых групп, способами, известными в данной области, и они относятся к этому изобретению при условии, что они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не нарушают активность белка, которая, по существу, сходна с активностью SDF-1, и не придают токсичных свойств содержащим им композициям. Эти производные, например, могут включать боковые цепи полиэтиленгликоля, которые могут скрывать антигенные участки и повышать время нахождения SDF-1 в жидкостях организма. Другие производные включают алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп,полученные посредством реакции с аммиаком или с первичными или вторичными аминами, N-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с ацильными группами(например, алканоильной или карбоциклической ароильной группами), или O-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, гидроксильных групп остатков серила или треонила), образованные с ацильными группами. В качестве "активных фракций" SDF-1, мутеинов и слитых белков настоящее изобретение охватывает любой фрагмент или предшественников полипептидных цепей молекулы белка отдельно или совместно с ассоциированными ней молекулами или связанными с ней остатками, например остатками сахара или фосфата, или агрегатами самой молекулы белка или остатков сахаров, при условии, что указанная фракция обладает активностью, по существу, сходной с SDF-1. Термин "соли" в настоящем документе относится как к солям карбоксильных групп, так и к кислотно-аддитивным солям аминогрупп молекулы SDF-1 или ее аналогов. Соли карбоксильной группы могут быть образованы способами, известными в данной области, и они включают неорганические соли, например соли натрия, кальция, аммония, железа или цинка и т.п., и соли с органическими основаниями,такие как соли, образованные, например, с аминами, такими как триэтаноламин, аргинин или лизин, пиперидин, прокаин и т.п. Кислотно-аддитивные соли включают, например, соли с минеральными кислотами, например, такими как хлористо-водородная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами, например, такими как уксусная кислота или щавелевая кислота. Безусловно, любые такие соли должны сохранять биологическую активность SDF-1, относящуюся к настоящему изобретению, т.е. нейропротективный эффект при неврологическом заболевании. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения SDF-1 является слитым с молекулой носителя, пептидом или белком, которые обеспечивают прохождение через гематоэнцефалический барьер ("ГЭБ"). Эта молекула носителя служит для надлежащего нацеливания молекулы в область действия в тех случаях, когда в заболевание вовлечена ЦНС. Способы доставки лекарственного средства через ГЭБ вовлекают нарушение ГЭБ либо осмотическими способами, либо биохимически посредством применения вазоактивных веществ, таких как брадикинин. Другие стратегии для проникновения через ГЭБ могут вовлекать применение эндогенных транспортных систем, включая опосредуемые переносчиком транспортеры, такие как переносчики глюкозы и аминокислот; рецептор-опосредуемый трансцитоз для инсулина или трансферрина; и активные транспортеры для выхода, такие как р-гликопротеин; пенетратин, 16-мерный пептид (pAntp), образованный из третьего спирального домена гомеопротеинаAntennapedia, и его производные. Стратегии для доставки лекарственных средств через ГЭБ далее включают имплантацию внутрь головного мозга. В целях улучшения свойств белка, таких как стабильность, время полужизни, биодоступность, переносимость организмом человека или иммуногенность, функциональные производные SDF-1 могут быть конъюгированы с полимерами. Для достижения этой цели SDF-1 может быть связан, например, с полиэтиленгликолем (PEG). Пегилирование можно проводить любыми способами, описанными вWO 92/13095. Например, SDF-1 может быть пегилированным по остаткам, вовлеченным в связывание гликозаминогликана, например Lys24, His25, Lys27, Arg41 или Lys43. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения SDF-1 является пегилированным.- 16015716 В следующем предпочтительном варианте осуществления этого изобретения слитый белок содержит слитый иммуноглобулин (Ig). Слияние может быть прямым или через короткий линкерный пептид,который может обладать длиной от 1 до 3 аминокислотных остатков или более, например он может обладать длиной 13 аминокислотных остатков. Указанный линкер может представлять собой, например,трипептид с последовательностью E-F-M (Glu-Phe-Met) или линкерную последовательность из 13 аминокислот, содержащую Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, например, встроенную между последовательностью SDF-1 и последовательностью иммуноглобулина. Полученный слитый белок обладает улучшенными свойствами, такими как увеличенное время нахождения в жидкостях организма(время полужизни) или повышенная специфичная активность, повышенный уровень экспрессии. Слияние с Ig также может упрощать очистку слитого белка. В другом предпочтительном варианте осуществления SDF-1 является слитым с константным участком молекулы Ig. Предпочтительно он является слитым с участками тяжелых цепей, например, такими как домены CH2 и CH3 IgG1 человека. Другие изоформы молекул Ig также пригодны для получения слитых белков в соответствии с настоящим изобретением, такие как изоформы IgG2 или IgG4, или другие классы Ig, например, такие как IgM. Слитые белки могут быть мономерными или мультимерными, гетеро- или гомомультимерными. Часть иммуноглобулина в слитом белке может быть далее модифицирована таким образом, чтобы не она активировала связывание комплемента или каскад комплемента или чтобы она не связывалась с Fc-рецепторами. Следующие слитые белки SDF-1 можно получать посредством слияния доменов, выделенных из других белков, обеспечивающих образование димеров, тримеров и т.д. Примеры белковых последовательностей, обеспечивающих мультимеризацию полипептидов по этому изобретению, представляют собой домены, выделенные из белков, таких как hCG (WO 97/30161), коллаген X (WO 04/33486), C4BP(WO 04/20639), белки Erb (WO 98/02540) или двухспиральные пептиды (WO 01/00814). Далее, это изобретение относится к применению сочетания SDF-1 и иммунодепрессанта в целях изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических нарушений для одновременного, последовательного или раздельного применения. Иммунодепрессанты могут представлять собой стероиды, метотрексат, циклофосфамид, антилейкоцитарные антитела (такие какCAMPATH-1) и т.п. Далее, это изобретение относится к применению сочетания SDF-1 и интерферона, и/или остеопонтина, и/или кластерина в целях изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических нарушений для одновременного, последовательного или отдельного применения. Подразумевают, что термин "интерферон", как используют в настоящем изобретении, включает любую молекулу, определенную таким образом в литературе, включающую, например, IFN любого типа,упомянутого выше в разделе "Предпосылки изобретения". Интерферон предпочтительно может быть человеческим, а также полученным из других видов при условии, что его биологическая активность является сходной с интерферонами человека, и молекула не является иммуногенной у человека. В частности, к приведенному выше определению относятся любые типы IFN-, IFN- и IFN-.IFN- представляет собой предпочтительный IFN в соответствии с настоящим изобретением. Подразумевают, что термин "интерферон-бета (IFN-)", как используют для настоящего изобретения, включает интерферон фибробластов человека, получаемый выделением из биологических жидкостей или получаемый способами рекомбинантных ДНК из прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, а также его соли, функциональные производные, варианты, аналоги и фрагменты. Особую важность представляет белок, который преобразован или комбинирован с образующим комплексы соединением для длительного действия. Например, в соответствии с настоящим изобретением можно использовать пегилированные варианты, как упомянуто выше, или белки, полученные способами генетической инженерии, чтобы они проявляли активность в отношении длительности действия в организме. Подразумевают, что термин "производные" включает только те производные, которые не заменяют одну аминокислоту другой из двадцати обычно встречающихся природных аминокислот. В целях повышения стабильности белков интерфероны также могут быть конъюгированы с полимерами. Конъюгат между интерферономи полиолем полиэтиленгликоля (PEG) описан, например, вWO 99/55377. В другом предпочтительном варианте осуществления этого изобретения интерферон представляет собой интерферон- (IFN-) и более предпочтительно IFN-1a.SDF-1 предпочтительно применяют одновременно, последовательно или раздельно с интерфероном. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения SDF-1 применяют в количестве приблизительно от 0,001 до 1 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела или приблизительно 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,1 до 1 мг/кг массы тела.- 17015716 Далее, это изобретение относится к применению молекулы нуклеиновой кислоты для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологического заболевания, где молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:6 или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:(d) полипептида согласно (a)-(c), дополнительно содержащего сигнальную последовательность предпочтительно аминокислоты SEQ ID NO:5;(e) мутеина согласно любому из (a)-(d), где аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 40, или 50, или 60, или 70, или 80, или 90%-ной идентичностью по меньшей мере одной из последовательностей согласно (a)-(c);(f) мутеина согласно любому из (a)-(d), который кодируется последовательностью ДНК, которая в условиях высокой жесткости гибридизуется с последовательностью, комплементарной нативной последовательности ДНК, кодирующей любой из (a)-(c);(g) мутеина согласно любому из (a)-(d), где любые замены в аминокислотной последовательности представляют собой консервативные аминокислотные замены в аминокислотных последовательностях согласно (a)-(c);(h) соли или изоформы, слитого белка, функционального производного или активной фракции согласно любому из (a)-(d). Например, нуклеиновую кислоту можно вводить в качестве "голой" молекулы нуклеиновой кислоты, например, посредством внутримышечной инъекции. Кроме того, она может включать последовательности векторов, такие как вирусная последовательность, пригодная для экспрессии гена, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты в организме человека, предпочтительно в пригодных клетках или тканях. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты далее содержит последовательность экспрессирующего вектора. Последовательности экспрессирующих векторов хорошо известны в данной области, они содержат дополнительные элементы, служащие для экспрессии представляющего интерес гена. Они могут содержать регуляторную последовательность, такую как последовательности промоторов и энхансеров, последовательности селективных маркеров, ориджины для многократной репликации и т.п. Таким образом, для лечения и/или профилактики заболевания используют подход генной терапии. Предпочтительно экспрессия SDF-1 затем будет происходить in situ. В предпочтительном варианте осуществления экспрессирующий вектор представляет собой образованный из лентивируса вектор. Было показано, что лентивирусные векторы являются очень эффективными в отношении переноса генов, особенно в ЦНС. Другие общепринятые вирусные векторы, такие как образованные из аденовируса векторы, также можно использовать в соответствии с этим изобретением. В целях усиления прохождения SDF-1 через гематоэнцефалический барьер можно использовать нацеленный вектор. Такие векторы могут быть нацелены, например, на рецептор трансферрина или другие механизмы эндотелиального транспорта. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения экспрессирующий вектор можно вводить внутримышечной инъекцией. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции SDF-1 в клетке, в которой в норме подавлена экспрессия SDF-1 или которая экспрессирует недостаточные количества SDF-1,также предусмотрено в соответствии с этим изобретением. Вектор может содержать регуляторные последовательности, функциональные в клетках, в которых желательна экспрессия SDF-1. Такие регуляторные последовательности могут представлять собой, например, промоторы или энхансеры. Затем посредством гомологичной рекомбинацией регуляторную последовательность можно встраивать в соответствующий локус генома, таким образом функционально связывая регуляторную последовательность с геном, экспрессию которого необходимо индуцировать или усилить. Эту технологию обычно называют"эндогенной активацией гена" (EGA), и она описана, например, в WO 91/09955. Кроме того, это изобретение относится к применению клетки, которая является генетически модифицированной в целях продукции SDF-1, для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний. Кроме того, это изобретение относится к клетке, генетически модифицированной в целях продукции SDF-1, для изготовления лекарственного средства для лечения и/или профилактики неврологических заболеваний. Таким образом, в целях доставки лекарственного средства в соответствующие области организма человека можно использовать подход клеточной терапии.- 18015716 Кроме того, это изобретение относится к фармацевтическим композициям, особенно пригодным для профилактики и/или лечения неврологических заболеваний, которые содержат терапевтически эффективное количество SDF-1 и терапевтически эффективное количество интерферона, и/или остеопонтина, и/или кластерина и, кроме того, необязательно терапевтически эффективное количество иммунодепрессанта. Подразумевают, что определение "фармацевтически приемлемый" охватывает любой носитель, который не препятствует эффективности биологической активности активного ингредиента и который не является токсичным для хозяина, которому его вводят, или который может повышать активность. Например, для парентерального введения активный белок (белки) может быть изготовлен в единичной дозированной форме для инъекции в носителях, таких как физиологический раствор, раствор декстрозы,сывороточный альбумин и раствор Рингера. Активные ингредиенты фармацевтической композиции в соответствии с этим изобретением можно вводить индивиду множеством способов. Способы введения включают внутрикожный, чрескожный (например, в составах с замедленным высвобождением), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, местный, интратекальный, ректальный и интраназальный способы. Можно использовать любой другой эффективный способ введения, например всасывание через эпителиальные или эндотелиальные ткани или введение посредством генной терапии, где пациенту вводят молекулу ДНК, кодирующую активное средство (например, через вектор), что приводит к экспрессии и секреции активного средства in vivo. Кроме того, белок (белки) в соответствии с этим изобретением можно вводить совместно с другими компонентами биологически активных средств, такими как фармацевтически приемлемые поверхностноактивные вещества, эксципиенты, носители, разбавители и носители. Для парентерального (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) введения активный белок (белки) можно изготавливать в виде раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка совместно с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем (например, водой, физиологическим раствором, раствором декстрозы) и добавками, которые поддерживают изотоничность(например, маннит) или химическую стабильность (например, консерванты и буферы). Состав стерилизуют широко используемыми способами. Биодоступность активного белка(белков) в соответствии с этим изобретением также можно повышать с использованием способов конъюгации, которые повышают время полужизни молекулы в организме человека, например, посредством связывания молекулы с полиэтиленгликолем (PEG), как описано в патентной заявке PCT WO 92/13095. Терапевтически эффективные количества активного белка(ов) будут зависеть от многих факторов,включая тип белка, аффинность белка, любую остаточную цитотоксическую активность, проявляемую антагонистами, способ введения, клиническое состояние пациента (включая желательность поддержания нетоксичного уровня эндогенной активности SDF-1)."Терапевтически эффективное количество" является таким, что при введении SDF-1 оказывает благоприятный эффект на неврологическое заболевание. Вводимые индивиду дозировки, в качестве однократных или многократных доз, будут варьировать в зависимости от множества факторов, включая фармакокинетические свойства SDF-1, способ введения, состояние и характеристики пациента (пол, возраст,масса тела, здоровье, размер тела), выраженность симптомов, сопутствующее лечение, частота введения и требуемый эффект. Как упоминалось выше, SDF-1 предпочтительно можно применять в количестве приблизительно от 0,001 до 1 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,01 до 10 мг/кг массы тела или приблизительно 9, 8,7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,1 до 1 мг/кг массы тела. Способ введения, который является предпочтительным в соответствии с этим изобретением, представляет собой введение подкожным способом. Кроме того, в соответствии с этим изобретением внутримышечное введение является предпочтительным. В следующих предпочтительных вариантах осуществления SDF-1 вводят один раз в сутки или один раз в двое суток. Суточные дозы, как правило, вводят в виде разделенных доз или в форме с замедленным высвобождением, эффективной для достижения требуемых результатов. Второе или последующие введения можно проводить в дозировках, которые являются такими же, более низкими или превышающими первоначальную или предшествующую дозу, вводимую индивиду. В соответствии с этим изобретением SDF-1 можно вводить индивиду профилактически или терапевтически до, одновременно или после других терапевтических схем или средств (например, схем с несколькими лекарственными средствами) в терапевтически эффективном количестве, в частности с интерфероном. Активные средства, которые вводят одновременно с другими лекарственными средствами,можно вводить в одной композиции или в различных композициях. Кроме того, это изобретение относится к способу лечения неврологического заболевания, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества SDF-1 или агониста активности SDF-1, необязательно совместно с фармацевтически приемлемым носителем.- 19015716 Способ лечения неврологического заболевания, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества SDF-1 или агониста активности SDF-1 и интерферона, необязательно совместно с фармацевтически приемлемым носителем, также относится к настоящему изобретению. Способ лечения неврологического заболевания, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества SDF-1 или агониста активности SDF-1 и остеопонтина, необязательно совместно с фармацевтически приемлемым носителем, также относится к настоящему изобретению. Способ лечения неврологического заболевания, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества SDF-1 или агониста активности SDF-1 и кластерина, необязательно совместно с фармацевтически приемлемым носителем, также относится к настоящему изобретению. Все цитированные в настоящем описании ссылки, включая статьи или рефераты в журналах, опубликованные или неопубликованные патентные заявки США или других стран, выданные патенты США или других стран или любые другие ссылки, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме, включая все данные, таблицы, фигуры и текст, представленный в цитированных ссылках. Кроме того, полное содержание ссылок, цитированных в ссылках, приведенных в настоящем документе,также включено в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме. Указание на стадии известных способов, стадии общепринятых способов, известные способы или общепринятые способы никоим обрезом не является допущением, что любой аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения описан, указан или предложен в данной области. Предшествующее описание конкретных вариантов осуществления настолько полностью раскрывает общий характер этого изобретения, что с использованием знаний данной области (включая содержание ссылок, цитированных в настоящем документе) можно легко модифицировать и/или адаптировать для различных применений такие конкретные варианты осуществления, без излишнего экспериментирования, без отклонения от основных принципов настоящего изобретения. Таким образом, подразумевают,что такие адаптации и модификации охватываются значением диапазона эквивалентов описанных вариантов осуществления, исходя из указаний и рекомендаций, представленных в настоящем документе. Следует понимать, что формулировки или терминология в настоящем документе предназначены для целей описания, а не для ограничения, так что специалисту в данной области следует интерпретировать терминологию и формулировки настоящего описания с учетом указаний и рекомендаций, представленных в настоящем описании, в сочетании со знанием специалиста в данной области. После описания этого изобретения оно будет более понятным с учетом следующих примеров, которые представлены в качестве иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения. Примеры Рекомбинантные человеческие хемокины SDF-1 и вариант SDF-1 получали в собственной лаборатории. Кодирующие последовательности (SEQ ID NO:1 для SDF-1 и SEQ ID NO:4 для вариантаSDF-1) клонировали в участок Nde1/BamHI вектора pET20b+ и экспрессировали в клетках E.coli. Пример 1. Активность SDF-1 и варианта SDF-1 в смешанных кортикальных культурах, обработанных посредством LPS. Введение. Несмотря на то что ЦНС считают иммунологически привилегированной областью, ЦНС может проявлять значительные воспалительные ответы, которые могут участвовать во множестве неврологических заболеваний. Микроглия, по-видимому, является особенно важной для инициации и поддержания воспаления в ЦНС. В нормальной ЦНС эти клетки существуют в покоящейся форме, однако после стимуляции посредством инфекции или T-клеток они приобретают подобные макрофагам свойства (включая активный фагоцитоз, активацию белков, необходимых для представления антигена и продукции провоспалительных цитокинов). Это воспалительное окружение in vitro и in vivo может быть имитировано липополисахаридом(LPS), компонентом наружных мембран грамотрицательных бактерий. LPS представляет собой наиболее охарактеризованный пример врожденного распознавания, которое приводит к сильному воспалительному ответу фагоцитирующих клеток через Toll-рецептор 4. LPS широко использовали в данной области для активации микроглии в чистых культурах, кокультурах или смешанных культурах. Низкие уровниLPS индуцируют высвобождение цитокинов без индукции клеточной гибели, более высокие дозы могут индуцировать дегенерацию олигодендроцитов или нейронов in vitro (Lehnardt et al., 2002; Sadir et al.,2001) и in vivo (Lehnardt et al., 2003; Sadir et al., 2001). Материалы и способы. Получение первичных смешанных кортикальных культур. Культивирование первичных клеток проводили, как описано (Lubetzki et al., 1993), с использованием ткани головного мозга из эмбрионов, полученных от мышей NMRI на 16 сутки после спаривания. Полушария головного мозга извлекали из головного мозга эмбрионов, подвергали диссоциации с помощью расщепления трипсином и суспензию отдельных клеток высевали в количестве 5104 клеток в 50 мкл миелинизирующей среды на лунку в покрытых поли-L-лизином 96-луночных планшетах BioCoat(356516, Becton Dickinson). Миелинизирующая среда состояла из среды Bottenstein-Sato (Bottenstein and(Seromed) и рекомбинантным тромбоцитарным фактором роста AA (PDGF-AA, RD Systems) в концентрации 10 нг/мл. Обработка первичных смешанных кортикальных культур посредством LPS: схема анализа. Для обеспечения высвобождения цитокинов из первичных смешанных кортикальных культур, стимулированных LPS, культуры выращивали при 37C и 10% CO2 в течение 14 суток, а затем стимулировали в течение 48 ч возрастающими концентрациями LPS (0, 0,5, 1, 2,5, 5 нг/мл). Через 48 ч после стимуляции LPS 80 мкл супернатантов собирали и замораживали при -80C до анализа содержания в отношении: высвобождения цитокинов (TNF- и IL-6), анализированного посредством набора для воспаления у мышей CBA (BD Biosciences 552364) SDF-1;Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, который измеряет митохондриальную активность через образование нерастворимой соли формазана, которая, как было показано, коррелирует с клеточной плотностью)."Сэндвич-ELISA для количественного определения уровней SDF-1 в смешанных кортикальных культурах проводили в собственной лаборатории. Для покрытия использовали 100 мкл/лунка моноклональных антител против SDF-1 мыши (1:500 RD Systems Inc, Minneapolis, USA), 100 мкл/лунка биотинилированного поликлонального противомышиного IgG (1:400 RD Systems Inc, Minneapolis, USA) использовали в качестве вторичного антитела и 100 мкл/лунка конъюгированной с экстравидином пероксидазы хрена (1:5000 Sigma, St. Louis, MO, USA). Рекомбинантный SDF-1 мыши (от 2000 до 10 нг/млRD Systems Inc, Minneapolis, USA) использовали для получения стандартной кривой. Для визуализации использовали 100 мкл/лунка смеси стабилизированного пероксида водорода и тетраметилбензидина из упаковки с реагентом субстрата (RD Systems Inc, Minneapolis, USA). Оптическую плотность определяли с использованием флуоресцентного устройства для считывания планшетов (Labsystems Multiskan EX) при 450 нм. Эффекты SDF-1 и варианта SDF-1 на экспрессию цитокинов в стимулированных посредствомLPS культурах. Для тестирования эффектов SDF-1 и варианта SDF-1 (как определено в SEQ ID NO:4) на стимулированные посредством LPS культуры клеткам позволяли расти в течение 2 недель. На 14 сутки клетки преинкубировали с возрастающими концентрациями (0,001, 0,1 и 10 нг/мл) соответствующих белков в 25 мкл среды в течение 3 ч при 37C и 10% CO2. Затем к клеткам добавляли LPS в концентрации 5 нг/мл в 25 мкл среды с получением конечного объема 100 мкл и инкубировали в течение 48 ч. Супернатанты собирали на 16 сутки и уровни TNF- и IL-6 (основных цитокинов, высвобождаемых микроглией) определяли посредством специфичных ELISA, приобретенных от RD (DuoSet ELISA DY410 для TNFмыши, ELISA DY406 для IL-6 мыши). Использовали две контрольные молекулы, дексаметазон и IL-10 мыши, для которого было показано, что он ингибирует высвобождение цитокинов из активированной микроглии. Анализ данных. Глобальный анализ данных проводили с использованием одностороннего ANOVA. Далее использовали тест Dunnett и данные сравнивали с данными для "необработанных клеток". Был установлен следующий уровень значимости: p0,001; b или : p0,01; с или : p0,05; d: p0,1. Результаты выражали в качестве среднего значениястандартная ошибка среднего значения (s.e.m.). Результаты. Схема анализа. Секрецию TNF-, IL-6 индуцировали посредством LPS в концентрации 2,5 и 5 нг/мл, и обе дозы были нетоксичными в комплексных культурах. Кроме того, различные концентрации LPS (0, 0,5, 1, 2,5,5 нг/мл) не влияли на уровни эндогенного SDF-1 (результаты не представлены).IL-6 по сравнению с необработанными клетками. Как SDF-1, так и вариант SDF-1 значительно снижали уровни секреции TNF- и IL-6 в смешанных кортикальных культурах после стимуляции посредством- 21015716 Заключение. Смешанные кортикальные культуры представляют собой комплексную систему, которая включает несколько типов нейроэпителиальных клеток, включая астроциты, микроглию, нейроны и олигодендроциты. Не связывающая GAG мутантная форма SDF-1, вариант SDF-1-, приводила к снижению TNFи IL-6 аналогично SDF-1, что указывает на то, что мутация GAG не влияет на связывание SDF-1 с его рецептором CXCR4. Ингибирование цитокинов, наблюдаемое для SDF-1 и варианта SDF-1 в обработанных LPS смешанных кортикальных культурах, может быть следствием прямого действия SDF-1 на микроглию или непрямого эффекта на рецептор CXCR4, экспрессирующий астроциты или нейроны. В соответствии с его клиническим течением PC можно классифицировать на несколько категорий,стратифицирующих пациентов PC с различным характером активности заболевания. Пациентов с редкими обострениями, за которыми следует восстановление после их заболевания, считают имеющими доброкачественный PC. Ремитирующий PC (RRMS), наиболее распространенную форму PC, выявляют у 8590% пациентов с PC, и он характеризуется повторяющимися обострениями, за которыми следуют фазы восстановления с остаточными нарушениями. Атаки, вероятно, вызываются движением реактивных к миелину T-клеток в ЦНС, вызывающих острое воспаление. С течением времени степень восстановления после обострений снижается и повышается базовая неврологическая нетрудоспособность. В конечном итоге, приблизительно у 40% пациентов с RRMS более не происходит атак, а развивается прогрессирующее нейродегенеративное вторичное нарушение, связанное с хроническим воспалением в ЦНС, известное как вторично-прогрессирующий PC (SPMS) (Confavreux et al., 2000). Развитие в эту вторичнопрогрессирующую форму заболевания ассоциировано со значительно менее активными очагами повреждения и снижением объема паренхимы головного мозга. Несмотря на то что ранний RRMS является чувствительным к иммуносупрессии, способность отвечать на иммунотерапию снижается при SPMS и может даже исчезать при поздних формах. Таким образом, можно предположить, что RRMS и SPMS являются последовательными, а не представляют собой два заболевания, где процессы острого воспаления на раннем этапе приводят к вторичной индукции нейродегенеративного процесса. Первично-прогрессирующая форма PC (PPMS) характеризуется отсутствием с самого начала острых атак, а вместо этого вовлекает постепенное клиническое ухудшение. Клинически, эта форма заболевания ассоциирована с отсутствием ответа на любую форму иммунотерапии. О патологии первичнопрогрессирующего рассеянного склероза известно мало, однако посмертные исследования позволяют предположить, что у этих пациентов нейродегенерация преобладает над воспалением. Интересно, что повреждение серого вещества предсказывает развитие первично-прогрессирующего PC, являясь наиболее значительным параклиническим прогнозирующим фактором для последующего ухудшения нетрудоспособности (Rovaris 2006). Активация микроглии в сером веществе может приводить к ускоренной нейрональной потере и развитию атрофии головного мозга. Таким образом, SDF-1 и варианты SDF-1 могут обладать потенциалом для лечения первично-прогрессирующего PC вследствие их потенциала в отношении регуляции активации микроглии и выживания нейронов. Некоторые из патофизиологических механизмов, ведущих к нейрональной потере, могут совпадать при первичной и вторичных формах PC. Пример 2. Эффект варианта SDF-1 на привлечение лейкоцитов в модели привлечения перитонеальных клеток in vivo. Основной ролью хемокинов является контроль миграции определенных популяций лейкоцитов в процессе воспалительных ответов и иммунного надзора. Хемокины оказывают их биологические эффекты посредством связывания с семикратно трансмембранными сопряженными с G белком рецепторами. Также они могут связывать на клеточных поверхностях как растворимые гликозаминогликаны (GAG),так и GAG, которые повышают локальные концентрации хемокинов, обеспечивая их олигомеризацию и способствуя их представлению рецепторам. Недавно было показано, что взаимодействие хемокинов сGAG требуется для их хемотаксической функции in vivo. Материалы и способы. Самкам мышей Balb/C в возрасте 8-12 недель (Janvier, France) инъецировали внутриперитонеальноSEQ ID NO:4, разбавленные в 200 мкл NaCl (0,9%, без LPS). На 4 сутки после инъекции WT или мутантного SDF-1 мышей умерщвляли посредством удушения с помощью CO2, брюшную полость промывали 35 мл ледяного PBS и общий лаваж объединяли для отдельных мышей. Общее количество полученных клеток подсчитывали посредством гемоцитометра (Neubauer, Germany). Результаты.SDF-1, инъецированный внутрибрюшинно, привлекает лейкоциты. Вариант SDF-1 не привлекает лейкоциты, указывая на то, что активность связывания GAG in vivo утрачивается посредством мутации в варианте SDF-1 (см. фиг. 2). Заключение. Вариант SDF-1 (дефектная по связыванию GAG мутантная форма SDF-1) не показывает активности привлечения лейкоцитов in vivo.- 22015716 Пример 3. Количественное определение SDF-1 в спинном мозге при EAE (хроническом). Введение. Экспрессию SDF-1 количественно определяли в спинном мозге, извлеченном из мышей, пораженных EAE, индуцированном пептидом MOG в хронической фазе. Модель экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (EAE) представляет собой хроническую модель демиелинизации у мышей и общепризнанную модель рассеянного склероза (PC) на животных. Используемый способ для индукцииEAE у мыши адаптирован из протокола, опубликованного Sahrbacher et al. (Sahrbacher et al., 1998). Материалы и способы. Получение образцов спинного мозга. Спинной мозг извлекали из мышей, пораженных EAE через 4 недели после начала заболевания, т.е. появления паралича хвоста в качестве клинического признака. Мышам проводили перфузию холоднымPBS и спинной мозг извлекали в буфер с тремя детергентами (50 мМ Tris, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 0,02%NaN3, 0,1% SDS, 1% Nonidet P-40, 0,5% дезоксихолат натрия), содержащий коктейль из ингибиторов протеаз (Roche Molecular Biochemicals, 1836170, 1 таблетка на 10 мл буфера). Использовали 100 мкл буфера на 1 мг полученной ткани. Перед получением препарата посредством гомогенизации и последующим анализом образцы ткани хранили в пластмассовых пробирках eppendorf при -20C. Анализ содержания SDF-1 в спинном мозге. Спинной мозг размораживали и гомогенизировали в буфере с тремя детергентами с использованием polytron. Уровни белка в образцах количественно определяли посредством анализа содержания белкаBCA (Pierce Biotechnology, Rockford IL61 105, USA) перед анализом содержания SDF-1 с использованием ELISA, описанным в разделе "Материалы и способы" примера 1, выше. Результаты. На фиг. 3 представлена активация SDF-1 в ткани спинного мозга животных с EAE при хронической фазе EAE. Заключение. Активация белка SDF-1 в экстрактах спинного мозга при EAE из MOG EAE в хронической фазе подтверждает роль SDF-1 в нейровоспалении, отличную от привлечения воспалительных клеток. Пример 4. Защитный эффект SDF-1 на невропатию, индуцируемую повреждением седалищного нерва сдавлением. Введение. Настоящее исследование проводили для оценки регенерации и ремиелинизации нерва у мышей, которым вводили SDF-1 в различных дозах. Положительный эффект SDF-1 на выживание и регенерацию нейронов и аксонов (чувствительных и двигательных нейронов) или на миелинизацию или макрофагальное воспаление может приводить к восстановлению двигательной функции. Регенерацию можно определять по восстановлению сенсорно-моторных функций, которые можно оценивать посредством электрофизиологической регистрации. Материалы и способы. Животные. Использовали 30 самок мышей C57bl/6 RJ в возрасте 8 недель (Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle,France). Их разделяли на 6 групп (n=6):(f) сдавление нерва/IL-6 (30 мкг/кг). Животных содержали по группам (6 животных в клетке) и их содержали в комнате с контролируемой температурой (21-22C) и при обратном цикле свет-темнота (12 ч/12 ч) с едой и водой, доступными без ограничений. Все эксперименты проводили в соответствии с установленными правилами. Повреждение седалищного нерва. Животным проводили анестезию посредством ингаляции 3% Isofluran (Baxter). Правый седалищный нерв хирургически обнажали на уровне середины бедра и повреждали на 5 мм выше трифуркации седалищного нерва. Нерв сдавливали два раза в течение 30 с посредством гемостатических щипцов(толщина 1,5 мм; Koenig; Strasbourg; France) с вращением на 90 при каждом сдавлении. Планирование экспериментов и фармакологического лечения. Электрографическое (EMG) тестирование проводили один раз перед днем операции и каждую неделю в течение 3 недель после операции. Сутки хирургической операции по сдавлению нерва считали как dpl 0 (dpl = сутки после сдавления). В течение 4 суток после сдавления никаких тестов не проводили.- 23015716 Начиная со дня сдавления нерва до конца исследования SDF-1, IL-6 или носитель вводили каждые сутки способом подкожных (s.c.) инъекций, 5 дней в неделю. Электрофизиологическая регистрация. Электрофизиологическую регистрацию проводили с использованием электромиографа Neuromatic 2000M (EMG) (Dantec, Les UNs, France). Мышам проводили анестезию посредством ингаляции 3%Isofluran (Baxter). Нормальную температуру тела поддерживали с использованием нагретого операционного стола (Minerve, Esternay, France). Потенциал смешанного мышечного действия (СМАР) определяли в икроножной мышце после однократной стимуляции в течение 0,2 мс седалищного нерва с супрамаксимальной интенсивностью(12,8 мА). Амплитуду (мВ) и латентность (мс) потенциала действия измеряли на оперируемой лапе. Также измерение проводили на противоположной (неповрежденной) лапе у животных, которым вводили носитель (исходный уровень). Амплитуда указывает на количество активных двигательных единиц, в то время как дистальная латентность косвенно отражает проводимость по двигательному нерву и скорость нервно-мышечной передачи, которые частично зависят от степени миелинизации. Анализ данных. Глобальный анализ данных проводили с использованием одностороннего ANOVA. Кроме того, использовали тест Dunnett и данные сравнивали с контролем в виде "носителя". Уровень значимости был установлен как а: p0,001; b или : p0,01; с или : p0,05; d: p0,1. Результаты выражали в качестве среднего значениястандартная ошибка среднего значения (s.e.m.). Получение электрофизиологических данных. Амплитуда смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 4A). Не было выявлено значимых отличий амплитуды CMAP на протяжении исследования на противоположных (не поврежденных) лапах животных, которым вводили носитель (исходный уровень). В противоположность этому, сдавление седалищного нерва индуцировало значительно снижение амплитудыCMAP, снижающееся в группе носителя приблизительно на 80% на dpl7 и dpl15, по сравнению с соответствующими исходными уровнями. Когда мышам вводили SDF-1 в количестве 30 мкг/кг или мкг/кг,или IL-6 в количестве 30 мкг/кг, они демонстрировали повышение (приблизительно в 1,5 раза) амплитуды CMAP, по сравнению с уровнями у мышей, которым не проводили введения, и этот эффект был значимым на 15 dpl и 22 dpl. Латентность смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 4B). На протяжении исследования не происходило ухудшения латентности CMAP на противоположных(неповрежденных) лапах у животных, которым на протяжении исследования вводили носитель. В противоположность этому, в мышцах на поврежденной стороне была показана большая латентность CMAP,чем на исходном уровне. У мышей, которым вводили SDF-1, показатель латентности CMAP был значительно снижен по сравнению с показателем у мышей, которым вводили носитель. На 7 сутки этот эффект мог наблюдаться после введения 30 и 100 мкг/кг SDF-1, но не 30 мкг/кг IL-6. На 15 и 22 dpl значительный эффект все еще наблюдали при 30 и 100 мкг/кг (но не при 3 или 10 мкг/кг) SDF-1. SDF-1(30 мкг/кг) является более эффективным, чем IL-6 (30 мкг/кг). Заключение. Модель сдавления нервов является очень эффективной моделью травматического повреждения нерва и периферической невропатии. Непосредственно после сдавления нерва большинство волокон,имеющих большой диаметр, утрачивается вследствие механического повреждения, что приводит к устойчивому снижению амплитуды CMAP. Латентность CMAP не сразу нарушается, однако снижается через 15 суток вследствие дополнительной дегенерации волокон небольшого диаметра посредством вторичной опосредуемой иммунной системы дегенерации (макрофаги, гранулоциты). Длительность CMAP повышается на 7 dpl и достигает пика на 15 dpl.SDF-1 сохраняет функцию после сдавления периферического нерва (латентность СМАР). Также он показал защитный эффект в модели сдавления нерва у мышей по всем определяемым параметрам. В заключение, SDF-1 был настолько же эффективен, как и эталонная молекула, используемая в этом исследовании, IL-6. Пример 5. Защитный эффект варианта SDF-1 на невропатию, индуцируемую сдавлением седалищного нерва. Модель сдавления седалищного нерва, описанную в примере 4, проводили для тестирования варианта SDF-1, как определено в SEQ ID NO:4, и мышей разделяли на следующие 2 группы (n=6):(b) сдавление нерва/вариант SDF-1 в количестве 30 мкг/кг подкожно. Показатели, зарегистрированные на противоположной лапе животных, которым вводили носитель,рассматривали как исходные показатели. Вариант SDF-1, используемый в этом примере и кодируемый SEQ ID NO:4, экспрессировался с дополнительным N-концевым метионином. Также регистрировали длительность CMAP (время, требуемое для деполяризации и реполяризации).- 24015716 Результаты. Получение электрофизиологических данных. Амплитуда смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 5A). Значительное повышение амплитуды CMAP было показано на 22 dpl, когда мышам вводили вариант SDF-1. Латентность смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 5B). У мышей, которым вводили вариант SDF-1, величина латентности CMAP была значительно снижена по сравнению с одной из мышей, которым вводили носитель, особенно на 7 dpl. Положительный эффект все еще получали на 22 dpl. Длительность смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 5C). У мышей, которым вводили вариант SDF-1, величина длительности CMAP была снижена по сравнению с одной из мышей, которым вводили носитель, на 7 dpl и 22 dpl. Заключение. Было показано, что вариант SDF-1 восстанавливает функцию после сдавления периферического нерва (латентность CMAP). Также он показал защитный эффект в модели сдавления нерва на мышах по всем измеряемым параметрам. Пример 6. Защитный эффект Met-SDF-1 на невропатию, индуцированную сдавлением седалищного нерва. Модель сдавления седалищного нерва, описанную в примере 4, проводили для тестированияMet-SDF-1 (как определено в SEQ ID NO:7) и мышей разделяли на следующие 2 группы (n=6):(b) сдавление нерва/вариант Met-SDF-1 в количестве 100, 30 и 10 мкг/кг подкожно. Показатели, зарегистрированные на противоположной лапе животных, которым вводили носитель,рассматривали в качестве исходных показателей. Также регистрировали длительность CMAP (время, требуемое для деполяризации и реполяризации). Результаты. Регистрация электрофизиологических данных. Латентность смешанного потенциала мышечного действия (фиг. 6). У мышей, которым вводили Met-SDF-1, показатель латентности CMAP был значительно снижен на 7 сутки и 14 сутки после сдавления по сравнению с одной из мышей, которой вводили носитель. Заключение. Было показано, что Met-SDF-1 восстанавливает функцию после сдавления периферического нерва(латентность CMAP), а также SDF-1. Пример 7. Защитный эффект SDF-1 при диабетической невропатии. Введение. Диабетическая невропатия представляет собой наиболее распространенное хроническое осложнение диабета. В ее основе лежит множество механизмов, и, по-видимому, они вовлекают несколько взаимосвязанных метаболических нарушений, являющихся следствием гипергликемии и дефицита инсулина и C-пептида. Наиболее распространенным ранним нарушением, указывающим на диабетическую невропатию является бессимптомная дисфункция нерва, отражаемая сниженной скоростью проведения по нерву (Dyck and Dyck, 1999). После этих изменений, как правило, происходит снижение вибрационной чувствительности в ногах и снижение ахиллова рефлекса. Регистрация электрофизиологических данных часто очень точно отражает исходную патологию, и изменения проводимости нерва коррелируют с миелинизацией нервных волокон (для обзора, см. Sima, 1994). Крысы с диабетом вследствие стрептозотоцина (STZ) представляют собой наиболее широко изученную модель диабетической невропатии на животных. Она приводит к острому снижению кровоснабжения нерва (40%) и замедлению скорости проведения по нерву (20%) (Cameron et al., 1991), с последующей аксональной атрофией нервных волокон (Jakobsen, 1976). При длительном диабете выявляют демиелинизированные и подвергшиеся дегенерации миелинизированные волокна, а также аксоглиальную дисфункцию (Sima et al., 1988). Главной целью настоящего исследования является изучение потенциального нейропротективного и гиального защитного эффекта SDF-1 на развитие диабетической невропатии у крыс STZ. Материалы и способы. Животные. Самцов крыс Sprague Dawley в возрасте 8 недель (Janvier, Le Genest Saint Isle, France) случайным образом распределяли на 6 экспериментальных групп (n=10), как показано ниже. Их содержали по группам (3 животных на клетку) и содержали в комнате с контролируемой температурой при обратном цикле свет-темнота (12 ч/12 ч) с едой и водой, доступными без ограничений. Все эксперименты проводили в соответствии с установленными правилами. Индукция диабета и фармакологическое лечение. Диабет индуцировали внутривенной инъекцией буферного раствора стрептозотоцина (Sigma, L'Isled'Abeau Chesnes, France) в дозе 55 мг/кг. STZ изготавливали в цитратном буфере с концентрацией 0,1 моль/л, рН 4,5. В контрольной группе вводили эквивалентный объем цитратного буфера. Сутки инъекции STZ рассматривали как D0. На D10 после STZ проводили мониторинг гликемии для каждого животного отдельно. Животных, у которых было показано значение ниже 260 мг/дл, исключали из исследования. Введение SDF-1, IL-6 или соответствующего им носителя проводили каждые сутки от D11 до D40.SDF-1 и IL-6 изготавливали в физиологическом растворе (0,9% NaCl), содержащем 0,02% BSA. Планирование экспериментов: сутки -7: исходный уровень (EMG); сутки 0: индукция стрептозотоцином; сутки 7: мониторинг гликемии; сутки 11: начало введения; сутки 20: тест Von Frey; сутки 25: мониторинг посредством EMG; сутки 40: мониторинг посредством EMG и теста HP 52C; сутки 41: забор образцов биоптатов седалищных нервов и кожи для гистоморфометрического анализа. Электромиография. Электрофизиологическую регистрацию проводили с использованием электромиографа (Keypoint,Medtronic, Boulogne-Billancourt, France). Крысам проводили анестезию посредством внутрибрюшинной инъекции (IP) 60 мг/кг кетамина хлоргидрата (Imalgene 500, Rhne Mrieux, Lyon. France) и 4 мг/кг ксилазина (Rompum 2%, Bayer Pharma, Kiel, Germany). Нормальную температуру организма поддерживали при 30C с помощью нагревательной лампы и контролировали посредством контактного термометра (Quick, Bioblock Scientific, Illkirch, France), помещенного на поверхность хвоста. Смешанный потенциал мышечного действия (CMAP) регистрировали в икроножной мышце после стимуляции седалищного нерва. Контрольный электрод и активную иглу помещали на заднюю лапу. Заземленную иглу вводили в нижнюю часть спины крысы. Седалищный нерв стимулировали однократным импульсом в течение 0,2 мс с супрамаксмиальной интенсивностью. Регистрировали скорость двигательной волны. Регистрировали скорость проведения по чувствительному нерву (SNCV). Электроды на коже хвоста помещали следующим образом: контрольную иглу вводили в основании хвоста и иглу анода вводили на расстоянии 30 мм от контрольной иглы в направлении конца хвоста. Заземленный игольчатый электрод помещали между анодом и контрольными иглами. Хвостовой нерв стимулировали серией из 20 импульсов (по 0,2 мс) с интенсивностью 12,8 мА. Скорость выражали в м/с.- 26015716 Морфометрический анализ. Морфометрический анализ проводили в конце исследования. Животным проводили анестезию посредством внутрибрюшинной инъекции 60 мг/кг Imalgene 500. Для гистологического исследования вырезали 5-мм сегмент седалищного нерва. Ткань фиксировали в течение ночи 4% раствором глутаральдегида (Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, France) в растворе фосфатного буфера (pH 7,4) и содержали в 30% сахарозе при 4C до применения. Образец нерва фиксировали в 2% растворе тетроксида осмия (Sigma) в растворе фосфатного буфера в течение 2 ч, дегидратировали в серийном растворе спирта и погружали в Ероп. Затем погруженные ткани помещали на 70C в течение 3 суток для полимеризации. Поперечные срезы толщиной 1,5 мкм получали с использованием микротома. Их окрашивали 1% раствором толуидина синего (Sigma) в течение 2 мин, дегидратировали и помещали в Eukitt. Анализ проводили по всей поверхности среза нерва с использованием программного обеспечения для полуавтоматического цифрового анализа изображения (Biocom, France). После удаления посторонних объектов программное обеспечение выдает данные об общем количестве миелинизированных волокон. Затем лаборант вручную подсчитывал количество подвергшихся дегенерации волокон. Миелинизированные волокна без аксонов, избыточный миелин и волокна, обладающие оболочками со слишком большой толщиной относительно их аксонального диаметра, рассматривали как волокна, подвергшиеся процессам дегенерации. Количество не подвергшихся дегенерации волокон получали вычитанием количества подвергшихся дегенерации волокон. Морфологический анализ проводили только для волокон, считающихся не подвергшимися дегенерации. Для каждого волокна размеры аксонов и миелина были представлены в виде площади поверхности (мкм 2). Эти два параметра использовали для вычисления эквивалентной площади в видеg-соотношения (аксональный диаметр/диаметр волокна) для каждого волокна (т.е. [A/(A+M)]0,5, A - площадь аксонов, M - площадь миелина), указывающего на относительную толщину миелиновой оболочки. Кроме того, с помощью щипцов получали биопсию участка кожи из задней лапы диаметром 5-10 мм. Образцы кожи сразу фиксировали в течение ночи в параформальдегиде при 4C, инкубировали-80C до разрезания на криотоме. Затем делали криосрезы толщиной 50 мкм перпендикулярно поверхности кожи с помощью криостата. Свободно плавающие срезы инкубировали в течение 7 суток в бане с антителом кролика против белкового продукта гена 9.5 (1:10000; Ultraclone, Isle of Man, UK) при 4C. Затем срезы обрабатывали для выявления иммунореактивности в соответствии со способом с ABC-пероксидазой. В кратком изложении,их инкубировали в течение 1 ч с биотинилированным антителом против антител козы (1:200), а затем в течение 30 мин в биотинилированном комплексе авидина при комнатной температуре. Активность пероксидазы визуализировали с использованием системы DAB. Срезы контрастно окрашивали эозином и гематоксилином. Срезы подвергали дегидратации, очищали посредством bioclear и помещали на eukitt. Фотографии микроскопических полей получали при 20 увеличении с использованием цифровой камерыNikon с фокусным расстоянием 12,9 мм. Количество интраэпидермальных нервов в 3 микроскопических полях с размером каждого 0,22 мкм 2 (544408 мкм) подсчитывались экспериментатором на экране компьютера. Анализ данных. Глобальный анализ данных проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа или дисперсионного анализа с повторяющимися измерениями (ANOVA) и одностороннего ANOVA. Когда ANOVA показывал значимые различия, использовали защищенный критерий наименьших статистических различий Фишера в качестве последующего теста для сравнения экспериментальных групп в группе диабетических крыс, которым вводили носитель. Уровень значимости был установлен как p0,05. Результаты выражают в качестве среднего значениястандартная ошибка среднего значения (s.e.m.). Результаты. Масса тела. В противоположность недиабетическим крысам, демонстрирующим прогрессирующий рост, диабетические крысы демонстрируют значимую остановку роста (фиг. 7A). Введение SDF-1 или IL-6 было ассоциировано с небольшим, но значимым повышением массы тела у диабетических крыс, которым вводили носитель. Гликемия. На 7 сутки после STZ у всех крыс, которым вводили STZ, была показана гликемия, в 5 раз превышающая гликемию контрольных крыс (фиг. 7B).- 27015716 Регистрация электрофизиологических данных. 1. Латентность смешанного потенциала мышечного действия. Латентность CMAP была значимо увеличена по сравнению с диабетическими крысами на D25 по сравнению с латентностью у недиабетических крыс (фиг. 7C). Введение SDF-1 или IL-6 индуцировало значимое снижение латентности CMAP диабетических крыс по сравнению с латентностью у крыс, которым вводили носитель. Сходный профиль результатов наблюдали на D40 после STZ. 2. Скорость проведения по чувствительному нерву. На D25 диабетические крысы, которым вводили носитель, демонстрировали значимо сниженныйSNCV по сравнению с недиабетическими крысами (фиг. 7D). Введение SDF-1 или IL-6 значимо повышает показатели SNCV у диабетических крыс. Наилучший эффект наблюдали при введении доз 10 и 30 мкг/кг, и он был сравним с эффектом, обусловленным введением IL-6. Сходный профиль результатов наблюдали на D40 после STZ. Морфометрический анализ 1. g-соотношение (относительная толщина миелина).g-соотношение для диабетических крыс, которым вводили носитель, было значимо повышено по сравнению с соотношением для недиабетических крыс (фиг. 7E), что подтверждает уменьшение толщины миелиновой оболочки у диабетических крыс. Введение диабетическим крысам SDF-1 значимо снижало g-соотношение по сравнению с группой STZA/носитель, особенно в дозах 10 или 30 мкг/кг. В дозе 100 мкг/кг снижение величины g-соотношения не достигало значимого уровня. Введение IL-6 также индуцировало значимое снижение величины g-соотношения. 2. Количество подвергшихся дегенерации волокон. Диабетические крысы, которым вводили носитель, показывали значимо более высокую долю подвергшихся дегенерации волокон по сравнению с недиабетическими крысами (фиг. 7F). Напротив, доля не подвергшихся дегенерации волокон у диабетических крыс была значимо снижена по сравнению с долей у недиабетических крыс (фиг. 7F). Введение диабетическим крысам SDF-1 показало снижение совокупности подвергшихся дегенерации волокон. Наилучший эффект был ассоциирован с наименьшей применяемой дозой (10 мкг/кг) и достигал уровня значимости. Значимо сниженную совокупность подвергшихся дегенерации волокон также наблюдали у диабетических крыс, которым вводили IL-6. Как представлено на фиг. 7G, диабетические крысы, которым вводили носитель, показывали значимо сниженную плотность интраэпидермальных нервных волокон по сравнению с недиабетическими крысами. Введение диабетическим крысам SDF-1 было ассоциировано со значимо большей плотностью нервных волокон кожи по сравнению с введением носителя. Выявленный эффект был сравним с эффектом, индуцированным введением IL-6. Заключение. В настоящем исследовании авторы изобретения хотели оценить нейральный и глиальный защитный эффекты SDF-1 на связанную с диабетом невропатию. Исследования проводили на индуцированнойSTZ невропатии, сходной с диабетической невропатией, у крыс. Аналогично клиническим условиям диабетической невропатии, проводимость по поврежденному чувствительному нерву, выявляемая уже на 7 сутки после STZ, является первым признаком, указывающим на начало невропатии в этой модели, что согласуется с данными о демиелинизации и/или аксональной дегенерации, выявляемыми в более поздние моменты времени (Andriambeloson et al., 2006). В предшествующем исследовании было показано, что введение STZ-крысам низкой дозы IL-6 препятствовало прогрессированию невропатии в этой модели, не препятствуя развитию гликемии(Andriambeloson et al., 2006). В настоящем исследовании авторы выявили, что длительное введение SDF1 (10, 30 и 100 мкг/кг) повышает сенсорно-моторные показатели у диабетических крыс (показатели латентности SNCV и СМАР) в течение приблизительно 2 недель введения. Наилучший эффект получали в случае дозы для введения 10 или 30 мкг/кг, показывая сравнимую эффективность с 10 мкг/кг IL-6. Кроме того, было выявлено, что введение SDF-1 в этих дозах значительно препятствует потере миелина, ассоциированной с этой моделью. Поскольку качество миелиновой оболочки является важным для оптимального проведения по нерву, сохранение размера миелиновой оболочки может, фактически, частично объяснить улучшения функции нервов у диабетических крыс, которым вводили SDF-1. Более того,также было выявлено, что SDF-1 снижает количество волокон, подвергшихся аксональной дегенерации в седалищном нерве. Аналогично клиническим параметрам диабетической невропатии, показывающим корреляцию между наличием и тяжестью невропатии и дегенерацией интраэпидермальных нервных волокон из биоптата кожи (Herrmann et al., 1999; Smith et al., 2001), индуцированная посредством STZ диабетическая невропатия у крыс также показывает, что клинические признаки невропатии в этой модели на животных строго коррелируют со снижением плотности интраэпидермальных нервных волокон. В соответствии с представленными выше открытиями настоящее исследование показало, что диабетические крысы, кото- 28015716 рым вводили носитель, показывают значительное снижение интраэпидермальной плотности нервных волокон. Этому эффекту заметно препятствовало введение SDF-1 или IL-6 и, таким образом, далее подтверждался нейропротективный эффект SDF-1 относительно индуцируемого диабетом повреждения нерва. Взятые вместе, описанные выше открытия указывают на нейропротективный эффект введенияSDF-1 в модели диабетической невропатии у крыс. SDF-1 является интересным кандидатом для разработки терапии клинической диабетической невропатии. Пример 8. Защитный эффект SDF-1 при невропатической боли. Введение. Наиболее частым отягчающим фактором невропатической боли является диабет, особенно когда контроль глюкозы в крови является слабым. Приблизительно 2-24% пациентов с диабетом испытывают невропатическую боль. Диабетическая невропатическая боль может происходить либо спонтанно, в результате воздействия в норме умеренно болезненных стимулов (т.е. гиперальгезии), или в результате стимулов, которые в норме не воспринимаются как болезненные (т.е. аллодинии). Множество аномалий восприятия боли было показано в модели со стрептозотоцином (Hounsom and Tomlinson, 1997) на ранней стадии диабета. Например, вызываемое формалином вздрагивание усиливается у STZ-крыс по сравнению с контрольными животными. Кроме того, для этой модели диабета на животных описано развитие тактильной аллодинии (Calcutt et al., 1995, 1996). На более поздней стадии, когда гипергликемия продолжается (Bianchi et al., 2004), в качестве аномалии поведения у диабетических крыс описано удлинение порога на нагретой плите. Материалы и способы. Животные. Самцов крыс Sprague Dawley в возрасте 8 недель (Janvier, Le Genest Saint Isle, France) случайным образом распределяли в 6 экспериментальных групп (n=10), как представлено ниже. Таблица V Их содержали по группам (3 животных на клетку) и содержали в комнате с контролируемой температурой (21-22C) и обратным циклом свет-темнота (12 ч/12 ч), с едой и водой, доступными без ограничений. Все эксперименты проводили в соответствии с установленными правилами. Индукция диабета и фармакологическое лечение. Диабет индуцировали посредством внутривенной инъекции буферного раствора стрептозотоцина(Sigma, L'Isle d'Abeau Chesnes, France) в дозе 55 мг/кг. STZ получали в цитратном буфере в концентрации 0,1 моль/л, рН 4,5. В контрольной группе вводили эквивалентный объем цитратного буфера. Сутки инъекции STZ рассматривали как D0. На D10 после STZ проводили мониторинг гликемии для каждого животного отдельно. Животных,показывающих значение ниже 260 мг/дл, исключали из исследования. Введение SDF-1, IL-6 или соответствующего им носителя проводили один раз в сутки с D11 no