Антитела к миостатину и способы их применения

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента Изобретение относится к антителам, включающим человеческие антитела и их антигенсвязывающие части, которые связываются с миостатином и ингибируют миостатин. Изобретение также описывает человеческие антитела против миостатина и их антигенсвязывающие части. Также данное изобретение относится к антителам, которые являются химерными, биспецифичными, производными, одноцепочечными антителами или частями слитых белков. Изобретение также относится к выделенным тяжелым и легким цепям иммуноглобулинов,происходящих из человеческих антител против миостатина, и молекулам нуклеиновой кислоты,кодирующим такие иммуноглобулины. Настоящее изобретение также описывает способы получения человеческих антител против миостатина, композиций, содержащих эти антитела,и способы применения этих антител и композиций для диагностики и лечения. Данное изобретение также предлагает способы генной терапии с применением молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих тяжелые и/или легкие иммуноглобулиновые молекулы, которые включают человеческие антитела против миостатина. Также данное изобретение описывает трансгенных животных или трансгенные растения, которые содержат молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. 015534 Уровень техники изобретения Растущее количество данных указывает на то, что миостатин (mstn, фактор роста и дифференциации-8 или GDF-8) подавляет рост скелетной мышцы. Например, у детей нуль-мутация по миостатину была связана с поразительной мышечной гипертрофией, без каких бы то ни было явных отклоненийMed. 350:2 682-8). Также была продемонстрирована отрицательная корреляция между уровнями белка мышечного миостатина и массой скелетной мышцы (Schulte, J.N. and Yarasheski, K.E. (2001). Effects ofhealthy men. Med Sci Sports Exerc. 36(5):787-93). Например, с возрастом увеличивается экспрессия уровней мышечного миостатина, и было показано, что повышенная экспрессия миостатина способствует потере мышечной массы у ВИЧ-инфицированных больных (Gonzalez-cadavid et al. (1998) Organization of thehuman myostatin gene and expression in healthy men and HIV-infected men with muscle wasting. PNAS 95:14938-4321). К тому же повышенные уровни миостатина обнаруживаются у пожилого населения.and men with muscle wasting. J Nutr. Health Aging. 6(5):343-8). Миостатин также влияет на массу кости,так например, у мышей без миостатина возрастает минеральная плотность кости (Hamrick et al., (2003)Bone Architecture and Disc Degeneration in the Lumbar Spine of Mice Lacking GDF-8 (Myostatin). J. Orthopaedic Res. 21: 1025-1032 (включены здесь в качестве ссылок). На мышиных моделях сахарного диабета 2 типа было показано, что антитела к циркулирующему миостатину вызывают увеличение мышечной массы и улучшают гомеостаз глюкозы. Ингибирование миостатина посредством внутрибрюшинной инъекции нейтрализующего антитела увеличивает массу скелетной мышцы, уменьшает уровень глюкозы в крови натощак и улучшает восприимчивость глюкозы у страдающих ожирением мышей с диабетом (Li X. et al. (2002) Inhibition of myostatin increases muscleMellitus: Molecular Mechanisms, Genetics and New Therapies). Кроме того, известно, что у мышей Ау/а развивается устойчивость к инсулину, и они используются в качестве модели для диабета 2 типа. Если мыши Ау/а лишены миостатина посредством делеции локуса миостатина, то они имеют нормальные уровни глюкозы после кормления и инсулина, и чрезвычайно низкие уровни глюкозы после экзогенного введения глюкозы по сравнению с обычными мышами Ау/а (McPherron et al. (2002) J. Clin. Invest. 109:595-601). Учитывая нежелательные дефекты мышцы, кости и метаболические дефекты, связанные с миостатином, существует крайняя необходимость в антителах в качестве терапевтических средств, которые специфичны к миостатину и которые предотвращают или лечат состояния посредством снижения активности миостатина, а также в антителах в качестве диагностических средств для распознавания индивидуумов, которые нуждаются в лечении для снижения активности миостатина. Сущность изобретения Данное изобретение предоставляет антитела против миостатина, кодирующие их нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева для выработки данных антител, композиции и наборы, содержащие антитела и способы производства и применения данных антител. Различные варианты осуществления данного изобретения описаны в нижеследующих пронумерованных пунктах, но не ограничены ими. 1. Химерное, человеческое или гуманизированное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть, которые специфически связываются с миостатином, где указанное антитело или часть ингибируют связывание миостатина с рецептором активина типа I или типа II, и где указанное антитело представляет собой не конкурирующее нейтрализующее антитело, содержащее по крайней мере CDR1,CDR2 и CDR3 тяжелой цепи или указанные CDR, имеющие менее 8 консервативных аминокислотных замен, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи или указанные CDR, имеющие менее 3 консервативных аминокислотных замен, из следующих последовательностей:(c) SEQ ID NO: 115 и SEQ ID NO: 117 соответственно. 2. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из:(a) антитела, содержащего аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей SEQ ID(b) антитела, содержащего аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей SEQ ID(c) антитела, содержащего аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей SEQ IDNO: 115 и SEQ ID NO: 117 соответственно. 3. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из:(a) антитела, содержащего вариабельные домены последовательностей тяжелой и легкой цепей SEQ(b) антитела, содержащего вариабельные домены последовательностей тяжелой и легкой цепей SEQ(c) антитела, содержащего вариабельные домены последовательностей тяжелой и легкой цепей SEQID NO: 115 и SEQ ID NO: 117 соответственно. 4. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащее аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 115 и аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 117. 5. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, содержащее вариабельные домены в составе последовательностей тяжелой и легкой цепей SEQ ID NO: 115 и SEQ ID NO: 117 соответственно. 6. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, где указанное антитело содержит последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи, содержащиеся в SEQ ID NO: 115 и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, содержащиеся в SEQ ID NO:117. 7. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, которые связываются с пептидом 1 и пептидом 5 миостатина, причем пептид 1 содержит аминокислотную последовательностьSEQ ID NO: 103 и пептид 5 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 107. 8. Моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть по п.1, продуцируемые клеткой,выбранной из группы, включающей АТСС РТА-6574, АТСС РТА-6575 и АТСС РТА-6576. 9. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель. 10. Способ увеличения мышечной массы, активизации развития скелетной мышцы, лечения заболевания, истощающего мышцу, или усиления роста скелетной мышцы, включающий введение субъекту,нуждающемуся в этом, антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8 или фармацевтической композиции по п.9, которые ингибируют активность миостатина. 11. Выделенная клеточная линия, которая продуцирует антитело или его антигенсвязывающую часть по любому из пп.1-8 или тяжелую цепь или легкую цепь указанного антитела или указанной антигенсвязывающей части. 12. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, включающая нуклеотидную последовательность,которая кодирует тяжелую цепь или ее антигенсвязывающую часть или легкую цепь или ее антигенсвязывающую часть антитела по любому из пп.1-8. 13. Способ улучшения гомеостаза глюкозы; уменьшения жировой массы; увеличения чувствительности к инсулину; улучшения функции почки; уменьшения накопления жира; лечения, профилактики или подавления заболевания или состояния, характеризующегося разрушением кости, причем указанное заболевание или состояние включает остеопороз, остеопению, остеоартрит и переломы кости; лечения метаболического синдрома или противодействия мышечному истощению от длительного введения глюкокортикоидного или стероидного гормона в то время, когда субъект проходит лечение глюкокортикоидным или стероидным гормоном; включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп. 1-8, которые ингибируют активность миостатина. 14. Способ снижения активности миостатина у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8, которые ингибируют активность миостатина. 15. Способ устранения связанного с возрастом сокращения мышечной массы у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение указанному субъекту антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8, которые ингибируют активность миостатина. 16. Линия клеток-хозяев млекопитающих, содержащая полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи человеческого, химерного или гуманизированного моноклонального антитела или его антигенсвязывающей части, где антитело продуцируется гибридомной клеточной линией, выбранной из группы, включающей АТСС РТА-6574, АТСС РТА-6575 и АТСС РТА-6576. 17. Способ стимуляции роста мышцы или увеличения веса или предотвращения слабости у крупного рогатого скота, свиней, овец, цыплят, индюков, лошадей, рыб, собак и кошек, нуждающихся в этом,включающий введение животному антитела или его антигенсвязывающей части по любому из пп.1-8,которые ингибируют активность миостатина. Краткое описание чертежей Фиг. 1 демонстрирует результаты исследования миостатинзависимого репортерного гена. Как показано, нейтрализующие антитела против миостатина ингибируют индуцируемую миостатином активность люциферазы в клетках А 204. Варианты человеческого антитела 11161L-Q45K; 1257-1L-L21I; 13141 Н-Т 92 А и 21121H-I12V, L-F 58I, I85V ингибировали активность люциферазы в той же степени, что и антитела дикого типа. Фиг. 2 демонстрирует результаты исследования бета-лактамазы в L6 Aurora. Как показано, нейтрализующие антитела против миостатина ингибируют индуцируемую миостатином активность беталактамазы в миобластах крысы линии L6. Варианты человеческого антитела 11161L-Q45K; 1257-1LL21I; 13141 Н-Т 92 А и 21121H-I12V, L-F58I, I85V ингибировали активность бета-лактамазы в той же-2 015534 степени, что и антитела дикого типа. Фиг. 3 демонстрирует результаты вестерн-блота. Как показано посредством вестерн-блота, нейтрализующие антитела против миостатина согласно данному изобретению ингибируют индуцируемое миостатином фосфорилирование smad2 в клетках HepG2. Фиг. 4 демонстрирует результаты исследований экспрессии мРНК myf5. (А) Нейтрализующие антитела против миостатина 12681, 21771 и 21121 восстанавливали экспрессию гена myf5, ингибированную миостатином в миобластах мыши C2 С 12, тогда как антитело 11591, не являющееся нейтрализующим, не могло восстановить экспрессию. Уровень мРНК myf5 детектировали посредством TaqManPCR. (В) 11161 восстанавливало экспрессию гена myf5 в зависимости от дозы. Фиг. 5 демонстрирует результаты исследования дифференциации мышечной клетки C2 С 12. (А) Нейтрализующие антитела против миостатина 2431, 13141 и 12571 восстанавливали блокированную миостатином дифференциацию мышцы в клетках мышцы мыши С 2 С 12. Уровень белка тяжелой цепи эмбрионального миозина (МНС) использовали в качестве маркера для оценки дифференциации С 2 С 12. (В) Антитела 21121, 1461 и 11161 восстанавливали блокированную миостатином дифференциацию мышцы С 2 С 12. На фиг. 6 (А) изображены пептиды, полученные из зрелого GDF8 (SEQ ID NO: 89) для проверки связывания антитела против миостатина. Аминокислоты, указанные строчными буквами, представляют собой аминокислоты, которые отличаются от GDF11. (В) Сводные данные о связывании пептида. Как показано на фигуре, некоторые антитела не связываются ни с одним из пептидов. Некоторые антитела связываются с неродственными пептидами. (С) Предсказанная структура GDF8 с иллюстрацией пептидного связывания человеческими антителами против миостатина. Структура GDF8 была получена при применении SWISS-MODEL, полностью автоматизированного сервера по моделированию структурной гомологии белков, который доступен через веб-сервер ExPASy или из программы DeepView (Swiss PdbViewer). В предсказанной структуре были пропущены первые семь аминокислот. Зрелый GDF8 представляет собой гомодимерный белок. Показана только одна субъединица. Описанные здесь антитела связываются с гомодимером GDF8. Как показано на фигуре, человеческие моноклональные антитела 2431, 21121 и 21771 связываются с обоими пептидами 1 и 5. Пептиды 1 и 5 пространственно сближены, но не в первичной структуре. Фиг. 7 демонстрирует аминокислотные последовательности пептидов 1-11 и соответствующие идентификаторы последовательности (SEQ ID NO: 103-113). На фиг. 8 изображено связывание эпитопа. Связывание эпитопа человеческих антител против миостатина согласно данному изобретению картировали посредством экспериментов по конкурентному связыванию, применяя прибор BIAcoreTM 3000. Антитела изображены как помеченные ячейки. Антитела в одном круге конкурируют с антителами в перекрывающихся кругах. Например, антитело 1461 конкурирует с антителом 11363, но антитело 1461 не конкурирует с антителом 12681. Если два или более антител находятся в одном и том же круге, соответствующее им связывание нельзя различить. Фиг. 9 демонстрирует результаты исследования иммунопреципитации для оценки способности человеческих антител против миостатина согласно данному изобретению связывать зрелый GDF8 и латентный комплекс зрелого GDF8 и пропептида. Использовали кондиционированную среду, содержащую клетки 293 Т, трансфицированные GDF8. Как показано на фигуре, антитела 21121, 2431 и 21771 связывали зрелый GDF8, комплекс зрелого GDF8 и пропептида и непроцессированный GDF8; антитело 1661 связывало зрелый GDF8 и комплекс зрелого GDF8 и пропептида; ни одно другое антитело не связывало зрелый GDF8, пропептид или непроцессированный GDF8. Дорожка 4 - это контроль заполнения среды (1/10) и дорожка 7 - это контроль иммунопреципитации, только со средой. Фиг. 10 демонстрирует результаты исследования иммунопреципитации для оценки способности антител против миостатина согласно данному изобретению связывать зрелый GDF8 из мышиной сыворотки. Как показано на фигуре, антитела 21121, 2431 и 21771 связывали зрелый GDF8 из мышиной сыворотки, тогда как антитела 11161 и 1661 не могли этого сделать. Фиг. 11 представляет собой выравнивание последовательности зрелых человеческих GDF8 иGDF11. Зрелые GDF8 (SEQ ID NO: 89) и GDF11 (SEQ ID NO: 90) показали приблизительно 90% идентичность аминокислотных последовательностей. И зрелый GDF8, и GDF11 образуют гомодимеры. И зрелый GDF8, и GDF11 имеют девять остатков цистеина, которые образуют четыре внутренние дисульфидные связи и одну межмолекулярную дисульфидную связь. Как видно на фигуре, остатки цистеина,которые образуют друг с другом дисульфидную связь, помечены одинаковыми точками или плюсом. Один цистеин (cys73), который образует межмолекулярную дисульфидную связь, пометили звездочкой. Структура GDF8 была предсказана при применении SWISS-MODEL (смотрите фиг. 6 С). Фиг. 12 представляет собой таблицу, резюмирующую данные исследования in vitro. Фиг. 13 представляет собой таблицу, резюмирующую использование гена, связывание эпитопа и связывание пептида. Фиг. 14 и 15 демонстрируют влияние лечения in vivo антителами против миостатина на мышечную массу у мышей в сравнении с носителем для мышц gastrocnemius-plantaris-soleus (GPS), tibilalis anterior-3 015534 Фиг. 16 демонстрирует влияние лечения in vivo антителом против миостатина на мышечную массу и силу у мышей SCID (2112K). Фиг. 17 иллюстрирует влияние лечения in vivo различными дозами антитела против миостатина на мышечную массу у мышей SCID (2112K). Фиг. 18 представляет собой исследование ответа на различные дозы (А) и концентрации (В) антитела против миостатина (2112K), и их влияние на мышечную массу. Фиг. 19 представляет собой выравнивание вариабельных участков тяжелой и легкой цепи антител 21121 (тяжелая цепь: SEQ ID NO: 77; легкая цепь: SEQ ID NO: 79) и 2112K (тяжелая цепь: SEQ IDNO: 118; легкая цепь: SEQ ID NO:120). Фиг. 20 демонстрирует влияние на мышечную массу (А) и жировую массу (В) у мышей лечения invivo кортизоном с антителом против миостатина (2112K) по сравнению с носителем для мышц gastrocnemius-plantaris-sloeus (GPS), tibilalis anterior (ТА) и quadriceps (Quads) (фиг. 20 А) и паховой, эпидидимальной и абдоминальной жировой прослойки (фиг. 20 В). Подробное описание изобретения Определения и общие методики Если здесь не оговорено иначе, научные и технические термины, использованные в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, которые обычно понимаются простыми специалистами в данной области. Кроме того, если по контексту не требуется иначе, термины в единственном числе должны включать формы во множественном числе, и термины во множественном числе должны включать формы единственного числа. Как правило, использованная номенклатура и описанные здесь технические приемы, касающиеся выращивания клеток и ткани, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетики и химии и гибридизации белков и нуклеиновых кислот являются общеизвестными и обычно используемыми в данной области. Способы и технические приемы согласно настоящему изобретению обычно выполняются в соответствии со стандартными способами, общеизвестными в данной области, и как описано в различных общих и более специфических ссылках, которые цитируются и рассматриваются в настоящем описании,если не указано иначе. См., например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) и Ausubel et al., Current Protocols InMolecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), и Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), включенные в настоящее описание в виде ссылок. Ферментативные реакции и очистку проводят согласно инструкциям производителя, как обычно выполняется в данной области или как описано здесь. Использованная номенклатура, лабораторные методики и технические приемы, касающиеся аналитической химии, синтетической органической химии и медицинской и фармацевтической химии, описанные здесь, являются общеизвестными и обычно используемыми в данной области. Стандартные способы применяются для химического синтеза, химического анализа, фармацевтического приготовления, разработки состава и доставки, и лечения больных. Следующие термины, если не указано иначе, должны пониматься следующим образом: Термин "полипептид" включает природные или искусственные белки, фрагменты белка и полипептидные аналоги белковой последовательности. Полипептид может быть мономерным или полимерным. Термин "выделенный белок", "выделенный полипептид" или "выделенное антитело" относится к белку, полипептиду или антителу, которые в силу их происхождения или источника происхождения (1) не связаны с природными компонентами, которые сопутствуют им в их природном состоянии, (2) не содержат других белков того же самого типа, (3) экспрессируются клетками различных видов или (4) не встречаются в природе. Таким образом, полипептид, который синтезируется химически или синтезируется в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит в природе, будет "отделен" от его связанных с ним в природе компонентов. Белок также может быть получен, по существу, без природно-связанных с ним компонентов посредством выделения, при применении методов очистки белка, общеизвестных в данной области. В различных вариантах осуществления выделенное антитело против миостатина - это антитело, которое очищено посредством protein А (см., например, пример XVI), антитело, синтезированное гибридомой или иной клеточной линией in vitro, и/или человеческое антитело против миостатина, полученное от трансгенной мыши. Белок или полипептид является "в значительной степени чистым", "в значительной степени гомогенным" или "в значительной степени очищенным", если по меньшей мере примерно от 60 до 75% образца обнаруживает единственный тип полипептида. Полипептид или белок могут быть мономерными или мультимерными. Полипептид или белок, чистые в значительной степени, обычно будут содержать около 50, 60, 70, 80 или 90% мас./мас. образца белка, чаще приблизительно 95% и предпочтительно будут иметь 99% чистоты. Чистота белка или гомогенность могут быть показаны несколькими способами,хорошо известными в данной области, как, например, электрофорез образца белка в полиакриламидном геле с последующей визуализацией полосы одиночного полипептида посредством окрашивания геля красителем, общеизвестным в данной области. Для некоторых целей более высокое разрешение может-4 015534 быть обеспечено посредством применения ВЭЖХ или других способов, хорошо известных в данной области для очистки. Используемый здесь термин "трансгенный организм, не являющийся организмом человека" относится к любому отдельному трансгенному живому существу, не являющемуся человеком, включая трансгенное животное, не являющееся человеком, растение, бактерию, простейшее или гриб. Используемый здесь термин "полипептидный фрагмент" относится к полипептиду, который имеет делецию на N-конце и/или карбоксильном конце, но в котором остальная аминокислотная последовательность идентична соответствующим позициям в природной последовательности. В некоторых вариантах осуществления длина фрагментов составляет по меньшей мере 5, 6, 8 или 10 аминокислот. В других вариантах осуществления длина фрагментов составляет по меньшей мере 14, по меньшей мере 20, по меньшей мере 50 или по меньшей мере 70, 80, 90, 100, 150 или 200 аминокислот. Используемый здесь термин "полипептидный аналог" относится к полипептиду, содержащему участок, который, существенно идентичен части аминокислотной последовательности и который имеет по меньшей мере одно из следующих свойств: (1) специфическое связывание с миостатином при подходящих для связывания условиях, (2) способность ингибировать или активировать миостатин. Для полипептидных аналогов является типичным то, что они содержат консервативную аминокислотную замену (или инсерцию, или делецию) по отношению к природной последовательности. Для аналогов характерная длина составляет по меньшей мере 20 или 25 аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 50, 60, 70,80, 90, 100, 150 или 200 аминокислот или более, и часто аналоги могут быть такими же длинными, как и полноразмерный полипептид. Некоторые воплощения данного изобретения включают полипептидные фрагменты или полипептидные аналоги антител с 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 заменами в исходной аминокислотной последовательности. В определенных вариантах осуществления аминокислотные замены в антителе против миостатина или его антигенсвязывающей части представляют собой те замены, которые: (1) уменьшают склонность к протеолизу, (2) уменьшают склонность к окислению, (3) изменяют аффинность связывания при формировании белковых комплексов и (4) дают или изменяют другие физико-химические или функциональные свойства подобных аналогов, но все еще сохраняют специфическое связывание с миостатином. Аналоги могут включать различные мутеины последовательности, отличной от обычно встречающейся пептидной последовательности. Например, единичные или множественные аминокислотные замены, предпочтительно консервативные аминокислотные замены, могут создаваться в обычной последовательности,предпочтительно в области внешнего домена (доменов) полипептида, образующего межмолекулярные связи. Консервативная аминокислотная замена не должна в значительной степени изменять структурные характеристики родительской последовательности; например, замещение аминокислоты не должно изменять антипараллельный -слой, который создает встречающийся в родительской последовательности домен, связывающий иммуноглобулин, или не должно разрушать другие типы вторичной структуры,которая характеризует родительскую последовательность. Как правило, глицин и пролин не используются в антипараллельном -слое. Примеры технологически распознаваемых полипептидных вторичных и третичных структур описаны в Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. FreemanPublishing, New York, N.Y. (1991; и Thornton et al., Nature 354:105 (1991), включенных в настоящее описание в виде ссылок. Непептидные аналоги широко используются в фармацевтической промышленности в качестве лекарственных препаратов со свойствами, аналогичными свойствам эталонного пептида. Эти типы непептидного соединения называются "пептидные миметики" или "пептидомиметики." Fauchere, J. Adv. DrugRes. 15:29 (1986); Veber and Freidinger, TINS p.392 (1985); и Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987),включенные в настоящее описание в виде ссылок. Такие соединения часто разрабатываются с помощью компьютерного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые сходны по структуре с применяемыми в терапии пептидами, могут использоваться для получения эквивалентного терапевтического или профилактического эффекта. Обычно пептидомиметики имеют структуру, сходную со структурой полипептида-образца (то есть полипептида, который имеет желаемое биохимическое свойство или фармакологическую активность), такого как, человеческое антитело, но имеет одну или несколько пептидных связей, необязательно замещенных связью, выбранной из группы, состоящей из CH2NH,CH2S,CH2-СН 2,СН=СН(циси транс-),СОСН 2,СН(ОН)СН 2-иCH2SO, посредством общеизвестных в данной области способов. Направленная замена одной или нескольких аминокислот консенсусной последовательности D-аминокислотой того же типа (например, Dлизин вместо L-лизина) также может применяться для создания более стабильных пептидов. Помимо всего прочего, связанные пептиды, содержащие консенсусную последовательность или, по существу,идентичную разновидность консенсусной последовательности, могут быть получены посредством способов, известных в данной области (Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), включенные в настоящее описание в виде ссылки); например, посредством присоединения внутреннего остатка цистеина, способного формировать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые делают пептид цик-5 015534 лическим. В тех случаях, когда идет речь об "антителе" согласно данному изобретению, обычно подразумевается, что также может применяться его антигенсвязывающая часть. Антигенсвязывающая часть конкурирует с целым антителом за специфическое связывание. См. Fundamental Immunology. Ch. 7 (Paul, W.,ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989 (полностью включенную в виде ссылки для всех целей) . Антигенсвязывающие части могут создаваться посредством методов с применением рекомбинантной ДНК или посредством ферментативного или химического расщепления целых антител. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие части включают Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb и фрагменты участка комплементарности (CDR), одноцепочечные антитела (scFv), химерные антитела, димерные антитела и полипептиды, которые содержат по меньшей мере часть антитела, что является достаточным для специфического связывания антигена с полипептидом. От N-конца до С-конца вариабельные домены зрелой легкой и тяжелой цепей содержат, последовательно, участки FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Распределение аминокислот в каждом домене находится в соответствии с определениями Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (NationalChothia et al., Nature 342:878-883 (1989). В настоящем описании антитело, на которое ссылаются по номеру, представляет собой то же самое моноклональное антитело, что получено из гибридомы с тем же номером. Например, моноклональное антитело 2112 является тем же антителом, что и антитело, полученное из гибридомы 2112 или ее субклона, такого как 21121, 21122 и им подобного. Единственное исключение представляет собой гибридома 11363, которая отличается от субклонов 113 61 и 113 62. В настоящем описании Fd-фрагмент подразумевает фрагмент антитела, который состоит из доменов VH и CH1; Fv-фрагмент состоит из доменов VL и VH единственного плеча антитела; и фрагмент dAb(Ward et al., Nature 341:544-546 (1989 состоит из домена VH. В некоторых вариантах осуществления антитело является одноцепочечным антителом (scFv), в котором домены VL и VH спарены для образования моновалентных молекул с помощью синтетического линкера, который дает им возможность быть одной белковой цепью. (Bird et al., Science 242:423-426(1988) и Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988. В некоторых вариантах осуществления антитела представляют собой димерные антитела, то есть являются бивалентными антителами, в которых домены VH и VL экспрессированы на единственной полипептидной цепи, но используется линкер, который является слишком коротким, чтобы допускать спаривание между двумя данными доменами на одной и той же цепи, таким образом принуждая домены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антигенсвязывающих сайта. (См., например, Holliger P. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993), и Poljak R. J. et al., Structure 2:1121-1123 (1994. В некоторых вариантах осуществления один или несколько CDR-участков антитела согласно данному изобретению могут быть объединены в молекулу либо ковалентно, либо нековалентно, чтобы создать иммуноадгезин,который специфически связывается с миостатином. В таких вариантах осуществления CDR может (могут) включаться, как часть, в большую полипептидную цепь, может (могут) ковалентно связываться с другой полипептидной цепью или может (могут) объединяться нековалентно. Более того каркасные участки (FR) могут происходить из одного из антител против миостатина, из которого взяты один или несколько CDR, или из одного или нескольких различных антител человека. В вариантах осуществления, имеющих один или несколько участков связывания, участки связывания могут быть идентичны один другому или могут различаться. Используемый здесь термин "человеческое антитело" подразумевает любое антитело, в котором последовательности вариабельного и константного доменов являются последовательностями человека. Термин включает антитела с последовательностями, полученными с генов человека (то есть, с кодирующих генов), но которые были изменены, например, чтобы уменьшить возможную иммуногенность, увеличить аффинность, удалить цистеиновые остатки, которые могут вызывать нежелательный фолдинг и так далее. Термин включает такие антитела, создаваемые рекомбинантно в клетках, не являющихся клетками человека, которые могли бы привнести гликозилирование, не свойственное клеткам человека. Эти антитела могут быть получены различными способами, как описано ниже. Применяемый здесь термин "химерное антитело" подразумевает антитело, которое содержит участки двух или более различных антител. В одном варианте осуществления один или несколько CDR химерного антитела происходят из человеческого антитела против миостатина. В другом варианте осуществления все CDR получены из человеческих антител против миостатина. В еще одном воплощенииCDR-участки более чем из одного человеческого антитела против миостатина объединены в химерное антитело. Например, химерное антитело может включать CDR1 из легкой цепи первого человеческого антитела против миостатина, CDR2 из легкой цепи второго человеческого антитела против миостатина иCDR3 из легкой цепи третьего человеческого антитела против миостатина, и CDR-участки тяжелой цепи могут происходить из одного или нескольких других антител против миостатина. Более того, каркасные участки могут происходить из одного из антител против миостатина, из которого взяты один или несколько CDR-участков, либо из одного или нескольких различных человеческих антител.-6 015534 В некоторых вариантах осуществления химерное антитело согласно данному изобретению является гуманизированным антителом против миостатина. Гуманизированное антитело против миостатина согласно изобретению включает аминокислотную последовательность одного или нескольких каркасных участков и/или аминокислотную последовательность из по меньшей мере части константной области одного или нескольких человеческих антител против миостатина согласно данному изобретению и дополнительно содержит последовательности, например последовательности CDR, полученные из антитела против миостатина, не являющегося антителом человека. Фрагменты или аналоги антител или молекул иммуноглобулина могут быть легко получены простым специалистом в данной области после изучения настоящего описания. Предпочтительные N-концы и карбоксильные концы фрагментов или аналогов встречаются близ границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут распознаваться посредством сравнения данных о нуклеотидной и/или аминокислотной последовательности с опубликованными или патентованными базами данных по последовательностям. Предпочтительным является применение компьютерных методов сравнения для распознавания мотивов последовательности или предсказанных конформационных доменов белка, которые встречаются в других белках с известной структурой и/или функцией. Способы распознавания белковых последовательностей, которые сворачиваются в известную трехмерную структуру, известны. См. Bowie et al., Science 253:164 (1991). Используемый здесь термин "поверхностный плазмонный резонанс" относится к оптическому явлению, которое предусматривает исследование биоспецифических взаимодействий в реальном времени посредством выявления изменений концентраций белка на биосенсорной матрице, например, используя систему BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.). Для дальнейших описаний смотрите Jonsson U. et al., Ann. Biol. Clin. 51:19-26 (1993); Jonsson U. et al., Biotechniques 11:620-627 (1991); Jonsson B. et al., J. Mol. Recognit. 8:125-131 (1995); и Jonsson B. et al., Anal. Biochem. 198:268-277 (1991). Термин "KD" подразумевает равновесную константу диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Термин "скорость диссоциации" означает константу скорости диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Термин "эпитоп" включает любой белковый определяющий элемент, способный специфически связываться с иммуноглобулиновым или Т-клеточным рецептором или иначе - взаимодействовать с молекулой. Эпитопные детерминанты, как правило, состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи углевода или сахара и обычно имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Эпитоп может быть "линейным" или "конформационным". В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) встречаются линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе все точки взаимодействия встречаются поперек аминокислотных остатков белка, то есть отделены один от другого. Считается, что антитело специфически связывается с антигеном, если константа диссоциации составляет 1 мМ, предпочтительно 100 нМ и наиболее предпочтительно 10 нМ. В определенных вариантах осуществленияKD составляет от 1 до 500 пМ. В других вариантах осуществления KD находится между 500 пМ и 1 мкМ. В других вариантах осуществления KD составляет от 1 мкМ до 100 нМ. В других вариантах осуществления KD находится между 100 мМ и 10 нМ. После того как желаемый эпитоп на антигене найден, можно производить антитела к тому эпитопу, например, применяя способы, описанные в настоящем изобретении. Альтернативно, во время обнаружения, получения и определения характеристик антител может появиться информация о желательных эпитопах. Затем, исходя из этой информации, можно сортировать антитела по результатам конкурентного связывания с одним и тем же эпитопом. Подход для достижения этого заключается в проведении исследований конкурентного связывания для обнаружения антител, которые конкурентно связываются друг с другом, например, антитела конкурируют за связывание с антигеном. Технологический процесс с высокой производительностью для "связанных" антител, основанный на их конкурентном связывании, описан в международной патентной заявкеWO 03/48731. В настоящем изобретении двадцать обычных аминокислот и их аббревиатуры применяются в стандартном обращении. См. Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., SinauerAssociates, Sunderland, Mass. (1991, включенную в настоящее описание в виде ссылки. Применяемый здесь термин "полинуклеотид" подразумевает полимерную форму из нуклеотидов длиной по меньшей мере 10 оснований, либо из рибонуклеотидов, либо из дезоксинуклеотидов, либо модифицированную форму из любого типа нуклеотидов. Термин включает одноцепочечные и двухцепочечные формы. Применяемый здесь термин "выделенный полинуклеотид" подразумевает полинуклеотид, происходящий из генома, из кДНК или имеющий синтетическое происхождение или какую-либо их комбинацию; в силу своего происхождения "выделенный полинуклеотид" (1) не связан со всеми полинуклеотидами или с их частью, с которыми "выделенный полинуклеотид" встречается в природе, (2) функцио-7 015534 нально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или (3) не встречается в природе в качестве части большей последовательности. Используемый здесь термин "встречающиеся в природе нуклеотиды" включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Используемый здесь термин "модифицированные нуклеотиды" включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными группами сахаров и тому подобное. Термин "олигонуклеотидные связи", на который здесь ссылаются, включает олигонуклеотидные связи, такие как фосфоротиоатные, фосфородитиоатные, фосфороселеноатные, фосфородиселеноатные, фосфороанилотиоатные, фософораниладатные, фосфороамидатные и им подобные. См., например, LaPlanche et al., Nucl.Patent No. 5151510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), раскрытие которых включено в настоящее описание в виде ссылок. Если требуется, олигонуклеотид может содержать метку для детекции."Функционально связанные" последовательности включают и регулирующие экспрессию последовательности, которые прилегают к представляющему интерес гену, и регулирующие экспрессию последовательности, которые действуют в транс-положении или регулируют активность интересующего гена на расстоянии. Применяемый здесь термин "регулирующая экспрессию последовательность" подразумевает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для влияния на экспрессию и процессинг кодирующих последовательностей, с которыми они связаны. Регулирующие экспрессию последовательности включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, последовательности промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые увеличивают эффективность трансляции (то есть консенсусную Козак-последовательность); последовательности, которые увеличивают стабильность белка; и если требуется, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Свойства таких управляющих последовательностей различаются в зависимости от организма-хозяина; у прокариот такие регулирующие последовательности обычно содержат промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, как правило, такие управляющие последовательности включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Термин "регулирующие последовательности" предназначен для охвата, как минимум, всех компонентов, присутствие которых является необходимым для экспрессии и процессинга, и может также включать дополнительные компоненты, присутствие которых благоприятно, например, лидерные последовательности и последовательности, участвующие при слиянии. Используемый здесь термин "вектор" подразумевает молекулу нуклеиновой кислоты, способную переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой плазмиду, то есть кольцевой двухцепочечный участок ДНК, в который могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В одних воплощениях вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в геном вируса. В других вариантах осуществления векторы способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они вводятся (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих). В прочих вариантах осуществления векторы (например,неэписомные векторы млекопитающих) могут интегрировать в геном клетки-хозяина через введение в клетку-хозяина, и таким образом реплицироваться вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы обозначены здесь как "рекомбинантные экспрессионные векторы" (или просто "экспрессионные векторы"). Используемый здесь термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") подразумевает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что "рекомбинантная клетка-хозяин" и "клетка-хозяин" подразумевают не только отдельную клетку, о которой идет речь, но также потомство такой клетки. Поскольку определенные модификации могут встречаться в последующих поколениях вследствие либо мутации, либо воздействий окружающей среды, такое потомство в действительности может быть не идентичным родительской клетке, но все еще будет охвачено рамками используемого здесь термина "клетка-хозяин". Применяемый здесь термин "избирательно гибридизовать" подразумевает связываться специфически и с возможностью детектировать. Полинуклеотиды, олигонуклеотиды и их фрагменты в соответствии с данным изобретением избирательно гибридизуются с цепями нуклеиновой кислоты при условиях гибридизации и промывки, которые сводят к минимуму значительные количества детектируемого связывания с неспецифическими нуклеиновыми кислотами. "Высокая строгость" или "очень строгие" условия могут применяться для достижения условий избирательной гибридизации, как известно в данной области и обсуждается здесь. Одним примером "высокой строгости" или "очень строгих" условий является инкубация полинуклеотида с другим полинуклеотидом, где один полинуклеотид может быть прикреплен к-8 015534 твердой поверхности, такой как мембрана, в буфере для гибридизации 6 Х SSPE или SSC, 50% формамиде, 5 Х растворе Денхардта, 0,5% SDS, 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре гибридизации 42 С в течение 12-16 ч с последующей двукратной промывкой при 55 С с применением буфера для промывки 1X SSC, 0,5% SDS. Смотрите также Sambrook et al. ,supra, стр. 9.50-9.55. Термин "процент идентичности последовательности" в контексте последовательностей нуклеиновой кислоты подразумевает остатки в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании на максимальное соответствие. Длина сравниваемого участка последовательности может составлять по меньшей мере около девяти нуклеотидов, обычно - по меньшей мере около 18 нуклеотидов, чаще - по меньшей мере около 24 нуклеотидов, типично - по меньшей мере порядка 28 нуклеотидов,более типично - по меньшей мере примерно 32 нуклеотида и предпочтительно по меньшей мере приблизительно 36, 48 или более нуклеотидов. Существует несколько различных алгоритмов, известных в данной области, которые могут применяться для измерения идентичности нуклеотидной последовательности. Например, полинуклеотидные последовательности могут сравниваться при помощи FASTA, Gap илиBestfit, являющихся программами в Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG),Madison, Wisconsin. FASTA, которая включает, например, программы FASTA2 и FASTA3, обеспечивает выравнивание и процент идентичности последовательности участков наилучшего совпадения между запрашиваемыми последовательностями и перебираемыми последовательностями (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); включенные в настоящее описание в виде ссылок). Если не оговорено иначе, используются параметры по умолчанию для конкретной программы или алгоритма. Например, процент идентичности последовательности нуклеиновых кислот может быть определен при использовании FASTA с ее параметрами по умолчанию (размер группы символов равен 6, и используется коэффициент NOPAM для матрицы сходства) или при использовании Gap с ее параметрами по умолчанию, как предложено в GCG Version 6.1, представленными здесь в виде ссылок. Ссылка на нуклеотидную последовательность включает и комплементарную ей последовательность, если не оговорено иначе. Таким образом, упоминание нуклеиновой кислоты, имеющей конкретную последовательность, подразумевает описание ее комплементарной цепи с ее комплементарной последовательностью. Используемые здесь термины "процент идентичности последовательности" и "процент гомологии последовательности" являются взаимозаменяемыми. Термин "значительное сходство" или "значительное сходство последовательности", относящийся к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту, подразумевает, что при оптимальном выравнивании с подходящими нуклеотидными инсерциями или делециями, идентичность нуклеотидной последовательности другой нуклеиновой кислоте (или ее комплементарной цепи) составляет по меньшей мере около 85%, предпочтительно по меньшей мере около 90% и более предпочтительно по меньшей мере около 95, 96, 97, 98 или 99% нуклеотидных оснований, что определяется посредством любого известного алгоритма для оценки идентичности последовательности, как например, FASTA, BLAST или Gap, как описано выше. При употреблении термина "значительное сходство" в отношении полипептидов подразумевается,что для двух пептидных последовательностей при оптимальном выравнивании, как например, посредством программ GAP или BESTFIT при использовании плотностей с интервалом по умолчанию, который поставляется с программами, характерна по меньшей мере 70, 75 или 80% идентичность последовательности, предпочтительно по меньшей мере 90 или 95% идентичность последовательности и более предпочтительно по меньшей мере 97, 98 или 99% идентичность последовательности. В определенных вариантах осуществления остатки, которые не являются идентичными, различаются вследствие консервативных аминокислотных замен. "Консервативная аминокислотная замена" - это замена, при которой аминокислотный остаток замещен другим аминокислотным остатком, имеющим боковую R-группу со схожими химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). Как правило, консервативная аминокислотная замена не изменяет значительно функциональные свойства белка. В случаях, когда две или более аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, процент идентичности последовательности может быть увеличен, чтобы скорректировать консервативную природу замены. Способы для осуществления такого регулирования хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серии и треонин; 3) боковые цепи, содержащие амидную группу: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислотные боковые цепи: аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и 7) боковые цепи, содержащие серу: цистеин и метионин. Группы консервативных аминокислотных замен это: валинлейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагинглутамин. Альтернативно, консервативная замена представляет собой любое изменение, имеющее положи-9 015534 тельное значение в логарифмической матрице правдоподобия РАМ 250, описанной у Gonnet и др., Science 256:1443-45 (1992), включенного в настоящее описание в виде ссылки. "Умеренно консервативная" замена представляет собой любое изменение, не имеющее негативного значения в РАМ 250 логарифмической матрице правдоподобия. Идентичность последовательности для полипептидов обычно оценивается при применении программного обеспечения для анализа последовательностей. Компьютерные программы для анализа белков сравнивают последовательности, используя критерии сходства, приписанные различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные аминокислотные замены. Например, GCG включает программы, такие как "Gap" и "Bestfit", которые можно использовать с предусмотренными программами параметрами по умолчанию, для определения гомологии последовательности или идентичности последовательности близкородственных полипептидов, таких как гомологичные полипептиды различных видов организмов или белок дикого типа и его мутеин. См., например, GCG Version 6.1 (University of Wisconsin, WI). Также полипептидные последовательности можно сравнивать, применяяFASTA с параметрами по умолчанию или рекомендованными параметрами, смотрите GCG Version 6.1.FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивание и процент идентичности последовательности участков наилучшего перекрывания между запрашиваемыми и перебираемыми последовательностями (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219(2000. Другой предпочтительный алгоритм при сравнении последовательности согласно данному изобретению с базой данных, содержащей большое количество последовательностей различных организмов,представляет собой компьютерная программа BLAST, в особенности blastp или tblastn, при использовании параметров по умолчанию, которые поставляются с программами. См., например, Altschul et al., J.Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997). Длина полипептидных последовательностей, проверяемых на гомологию, как правило, составляет по меньшей мере около 16 аминокислотных остатков, обычно по меньшей мере около 20 остатков, чаще по меньшей мере около 24 остатков, характерно по меньшей мере около 28 остатков и предпочтительно более чем около 35 остатков. При поиске базы данных, содержащей последовательности большого количества различных организмов, предпочтительным является сравнение аминокислотных последовательностей. Используемые здесь термины "метка" или "меченый" говорят о введении еще одной молекулы в антитело. В одном варианте осуществления данная метка представляет собой детектируемый маркер, например, введение аминокислоты с радиоактивной меткой или присоединение к полипептиду биотинилированных частей, которые можно детектировать помеченным авидином (например, стрептавидин, содержащий флуоресцентный маркер, или ферментативную активность, которые можно детектировать оптическими или колориметрическими способами). В другом воплощении метка или маркер могут быть терапевтическим средством, например, лекарственным конъюгатом или токсином. В данной области известны и могут использоваться различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов. Примеры меток для полипептидов включают, но не ограничиваются ими, следующее: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3 Н, 14 С, 15N, 35S, 90Y, 99 Тс, 111In, 125I, 131I), флуоресцентные метки (например, FITC,родамин, лантаноидные люминесцирующие вещества), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, -галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфотаза), хемилюминесцентные маркеры, биотинилированные группы, заранее установленные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности "лейциновая застежка", сайты связывания вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки), магнитоактивные вещества, такие как хелаты гадолиния, токсины, такие как токсин коклюша, таксол, цитохаластин В, грамицидин D, бромистый этидий,эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон,глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи. В некоторых вариантах осуществления метки прикрепляются посредством "ножек" различной длины для уменьшения потенциальной стерической преграды. Следует понимать, что во всем данном подробном изложении и в формуле изобретения слово"включает" или вариации, такие как "включают" или "включающие", подразумевают включение заявленного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Человеческие антитела против миостатина и их описание Изобретение предлагает антитела против миостатина. В одних вариантах осуществления данные антитела являются антителами человека. В других вариантах осуществления антитела представляют собой гуманизированные антитела. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела против миостатина получают посредством иммунизации трансгенного животного, не являющегося человеком,например, грызуна, чей геном содержит гены иммуноглобулина человека, так что у трансгенного животного вырабатываются антитела человека. Антитело против миостатина согласно данному изобретению может содержать человеческую легкую цепь каппа-типа или лямбда-типа или аминокислотную последовательность, производную от них. В некоторых вариантах осуществления, включающих легкую цепь каппа-типа, вариабельный домен легкой- 10015534 цепи (VL) кодируется геном человека А 30, A3 или L2 VK. В одних вариантах осуществления VL антитела против миостатина содержит одну или несколько аминокислотных замен, делеций или инсерций (вставок) относительно исходной аминокислотной последовательности VK. В других вариантах осуществления VL антитела против миостатина содержит 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замен относительно исходной аминокислотной последовательности VK. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько замен исходной последовательности находятся вCDR-участках легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены в VK относительно исходной последовательности находятся в одной или нескольких тех же самых позициях, что и замены относительно исходной последовательности, обнаруженные в любом одном или более VL антител, предлагаемых здесь. Например, VL антитела против миостатина согласно изобретению может содержать одну или несколько аминокислотных замен относительно исходной последовательности, обнаруженных в VL антител 12571. Также может существовать одна или несколько аминокислотных замен относительно исходной последовательности, обнаруженных в VL антитела 1 116 1, которое кодируется тем же самым геном VK, что и антитело 12571. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены находятся в одной или более тех же самых положениях, но приводят к разным заменам, по сравнению с упоминаемым антителом. Во всех случаях при упоминании клона антитела с черточками он является равносильным тому же самому клону антитела с точками (например, 12571=1.257.1). В одних вариантах осуществления аминокислотные замены относительно исходной последовательности встречаются в одной или более тех же самых положениях, что и замены в исходной последовательности в любом из VL антител 11161, 11363, 12571, 1461, 21121, 13141, 1661, 2431,21771, 11321, 12681, 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141 Н-Т 92 А; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121H-L81M, L-I85V или 21121H-L81M, L-F58I, I85V, но замены могут представлять собой консервативные аминокислотные замены в подобном положении (подобных положениях) относительно аминокислот в упоминаемом антителе. Например, если определенное положение в одном из этих антител меняется относительно исходной последовательности и представляет собой глутамат, он может заместить аспартат в том же положении. Подобным образом, если аминокислотная замена, сравненная с исходной последовательностью в иллюстративном антителе, представляет собой серии, она может консервативно заменить в том положении треонин на серии. Консервативные аминокислотные замены рассматривались supra в этом заявлении. В других вариантах осуществления антитело против миостатина содержит аминокислотную последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32,36, 30, 40 и 44. В других вариантах осуществления легкая цепь включает аминокислотную последовательность легкой цепи антитела 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 21121L-F58I; 21121L-I85V или 21121L-F58I, I85V. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь человеческого антитела против миостатина содержит аминокислотную последовательность VL антитела 11161 (SEQ ID NO: 4); 11363 (SEQ ID NO: 12); 12571 (SEQ ID NO: 16); 1461 (SEQ ID NO: 24); 21121 (SEQ ID NO: 28); 13141 (SEQ ID NO: 20); 1661 (SEQ ID NO: 36); 2431 (SEQ ID NO: 44); 21771 (SEQ ID NO: 40); 11321 (SEQ ID NO: 8) или 12681 (SEQ ID NO: 32), или указанную аминокислотную последовательность, имеющую до 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен и/или в итоге до 3 неконсервативных аминокислотных замен. В других вариантах осуществления легкая цепь человеческого антитела против миостатина содержит аминокислотную последовательность VL антитела 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 21121L-F58I; 21121L-I85V или 21121L-F58I, 185V. В некоторых вариантах осуществления легкая цепь включает аминокислотную последовательность от начала CDR1 до конца CDR3 любого из вышеприведенных антител. В других вариантах осуществления легкая цепь может содержать аминокислотные последовательности участков CDR1, CDR2 и CDR3, независимо выбранных из участков легкой цепи CDR1, CDR2 иCDR3, соответственно, двух или более моноклональных антител, выбранных из 11161 (SEQ ID NO: 4); 11363 (SEQ ID NO: 12); 12571 (SEQ ID NO: 16); 1461 (SEQ ID NO: 24); 21121 (SEQ ID NO: 28); 13141 (SEQ ID NO: 20); 1661 (SEQ ID NO: 36); 2431 (SEQ ID NO: 44); 21771 (SEQ ID NO: 40); 11321 (SEQ ID NO: 8) или 12681 (SEQ ID NO: 32), или указанные CDR-участки, каждый имеющий менее, чем 3 или менее чем 2 консервативные аминокислотные замены и/или всего три или менее неконсервативных аминокислотных замен. В определенных вариантах осуществления легкая цепь антитела против миостатина содержит аминокислотные последовательности легкой цепи участков CDR1, CDR2 и CDR3 антитела, выбранного из 11161 (SEQ ID NO: 4); 11363 (SEQ ID NO: 12); 12571 (SEQ ID NO: 16); 1461 (SEQ ID NO: 24); 21121 (SEQ ID NO: 28); 13141 (SEQ ID NO: 20); 1661 (SEQ ID NO: 36); 2431 (SEQ ID NO: 44); 21771 (SEQ ID NO: 40); 11321 (SEQ ID NO: 8) или 12681 (SEQ ID NO: 32), или указанные участкиCDR, каждый имеющий менее чем 3 или менее чем 2 консервативные аминокислотные замены и/или всего три или менее неконсервативных аминокислотных замен. В отношении тяжелой цепи в некоторых вариантах осуществления вариабельный домен (VH) кодируется человеческим геном VH 1-02, VH 3-21 или VH 3-23. В других вариантах осуществления последовательность VH антитела против миостатина содержит одну или более аминокислотных замен, делеций или- 11015534 инсерций (вставок), обобщенно - "мутаций", относительно исходной аминокислотной последовательности VH. В одних вариантах осуществления вариабельный домен тяжелой цепи содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10 или 11 мутаций по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью VH. В других вариантах осуществления мутация (мутации) являются неконсервативными заменами относительно исходной аминокислотной последовательности. В иных воплощениях мутации находятся в CDR-участках тяжелой цепи. В одних вариантах осуществления аминокислотные замены находятся в одном или более тех же самых положениях, что и замены в исходной последовательности любого одного или более VH антител 11161, 11363, 12571, 1461, 21121, 13141, 1661, 2431, 21771, 11321, 12681,11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141 Н-Т 92 А; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121H-L81M, L-I85V или 21121H-L81M, L-F58I, I85V. В других вариантах осуществления аминокислотные замены находятся в одном или более тех же самых положениях, но включают иные замены, чем в указанном антителе. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 и 42. В других вариантах осуществления тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела 13141 Н-Т 92 А, 1461H-L81M или 21121H-I12V. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность VH антитела 11161 (SEQ ID NO: 2),11363 (SEQ ID NO: 10), 12571 (SEQ ID NO: 14), 1461 (SEQ ID NO: 22), 21121 (SEQ ID NO: 26),13141 (SEQ ID NO: 18), 1661 (SEQ ID NO: 34), 2431 (SEQ ID NO: 42), 21771 (SEQ ID NO: 38),11321 (SEQ ID NO: 6) и 12681 (SEQ ID NO: 30); или указанную аминокислотную последовательность VH, имеющую до 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10 или 11 консервативных аминокислотных замен и/или всего до 3 неконсервативных аминокислотных замен. В других вариантах осуществления тяжелая цепь включает аминокислотную последовательность VH антитела 13141 Н-Т 92 А, 1461H-L81M или 21121H-I12V. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность от начала CDR1 до конца CDR3 любого из указанных антител. В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь содержит участки CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи антитела 11161, 11363, 12571, 1461, 21121, 13141, 1661, 2431, 21771,11321, 12681, 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141 Н-Т 92 А; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121H-L81M, L-I85V или 21121H-L81M,L-F58I, I85V или указанные CDR-участки, каждый имеющий менее чем 8, менее чем 6, менее чем 4, или менее чем 3 консервативные аминокислотные замены и/или всего три или менее неконсервативных аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления CDR-участки тяжелой цепи независимо выбраны из CDRучастков двух или более антител, выбранных из антител 11161, 11363, 12571, 1461, 21121,13141, 1661, 2431, 21771, 11321, 12681, 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141H-T92A; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121HL81M, L-I85V или 21121H-L81M, L-F58I, I85V. В другом варианте осуществления антитело содержит легкую цепь, как описано выше, и тяжелую цепь, как описано выше. В еще одном варианте осуществления CDR-участки легкой цепи и CDR-участки тяжелой цепи взяты из одного и того же антитела. В различных вариантах осуществления антитела против миостатина имеют полноразмерную аминокислотную последовательность (последовательности) тяжелой цепи и легкой цепи, аминокислотные последовательности VH и VL, аминокислотные последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи иCDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи или аминокислотную последовательность тяжелой цепи от началаCDR1 до конца CDR3 и аминокислотную последовательность легкой цепи от начала CDR1 до концаCDR3 предлагаемого здесь антитела против миостатина. Один тип аминокислотной замены, который можно произвести, это заменить один или более цистеинов в антителе, которое может быть химически реактивным, на другой остаток, такой как, без ограничений, аланин или серин. В одном воплощении представлена замена неканонического цистеина. Данную замену можно произвести в CDR-участке или каркасном участке вариабельного домена или в константной области антитела. В некоторых вариантах осуществления цистеин является каноническим. Еще один тип аминокислотной замены, который можно осуществить, это удаление потенциальных протеолитических сайтов в антителе. Такие сайты могут встречаться в CDR-участке или каркасном участке вариабельного домена или в константном домене антитела. Замена цистеиновых остатков и удаление протеолитических сайтов может уменьшить опасность гетерогенности при продукции антител и таким образом увеличить их гомогенность. Другой тип аминокислотной замены представляет собой исключение пар аспарагин-глицин, которые образуют потенциальный сайт дезаминирования, посредством изменения одного или обоих остатков. В некоторых вариантах осуществления С-терминальный лизин тяжелой цепи антитела против миостатина согласно данному изобретению гидролизован. В различных вариантах осуществления изобретения тяжелая и легкая цепи антител против миостатина могут необязательно включать сигнальную последовательность.- 12015534 В одном аспекте данное изобретение предлагает одиннадцать подавляющих человеческих моноклональных антител против миостатина и гибридомные клеточные линии, которые их продуцируют. Табл. 1 отображает идентификаторы последовательности (SEQ ID NO) нуклеиновых кислот, кодирующих полноразмерные тяжелые и легкие цепи и вариабельный домен, содержащий части этих цепей, и соответствующие выведенные полноразмерные аминокислотные последовательности. Таблица 1 Изобретение также предоставляет варианты тяжелой и/или легкой цепи определенных ранее указанных человеческих антител против миостатина, содержащих одну или более аминокислотных модификаций. Для обозначения вариантов первая буква представляет собой однобуквенное обозначение аминокислоты встречающейся в природе цепи антитела, цифра относится к положению аминокислоты (где позиция один является N-терминальной аминокислотой FRI), и вторая буква представляет собой однобуквенное обозначение модификации аминокислоты. Данное изобретение предлагает модификацию легкой цепи моноклонального антитела 11161, названного 11161L-Q45K, у которого лизин находится в позиции 45 в SEQ ID NO: 4. Другой модификацией легкой цепи является 12571L-L21I, которая несет остаток изолейцина в положении 21 в SEQ ID NO: 16. Модификация тяжелой цепи моноклонального антитела 13141, названная 13141 Н-Т 92 А, в которой остаток аланина находится в положении 92 в SEQ ID NO: 18. Кроме того, изобретение предлагает модификацию тяжелой цепи моноклонального антитела 1461, названного 1461H-L81M, которая несет метионин в положении 81 в SEQ ID NO: 22. Данное изобретение предоставляет модификацию тяжелой цепи (I12V) и две модификации легкой цепи (F58I и I85V) моноклонального антитела 21121. Модификация тяжелой цепи, называемая 21121H-I12V, несет валин в положении 12 в SEQ ID NO: 26. У одного варианта легкой цепи,21121L-F85I, изолейцин находится в положении 85 в SEQ ID NO: 28. В другом варианте легкой цепи,обозначаемой 21121L-I85V, валин находится в положении 85 в SEQ ID NO: 28. Также изобретение предлагает модификацию легкой цепи, включающую обе мутации, то есть 21121L-F85I, I85V. Также изобретение включает антитела, содержащие модификацию тяжелой цепи либо с одной, либо с обеими мутациями легкой цепи, то есть 21121H-I12V, L-F58I; 21121 Н-I12V, L-I85V и 21121H-I12V, LF58I, I85V. В других вариантах осуществления данное изобретение включает антитела, содержащие аминокислотные последовательности вариабельного домена более чем с 80%, более чем с 85%, более чем с 90%,более чем с 95%, более чем с 96%, более чем с 97%, более чем с 98% или более чем с 99% идентичностью аминокислотной последовательности вариабельного домена любого указанного ранее человеческого антитела против миостатина. Класс и подкласс антител против миостатина Класс и подкласс антител против миостатина может быть определен посредством любого способа,известного в данной области. Как правило класс и подкласс антитела может быть установлен при применении антител, характерных для определенного класса и подкласса антител. Такие антитела доступны коммерчески. Класс и подкласс можно определить посредством ELISA или вестерн-блота, также как и другими способами. Альтернативно класс и подкласс можно установить посредством секвенирования целых константных доменов, или части, тяжелой и/или легкой цепей антител, сравнивая их аминокис- 13015534 лотные последовательности с известными аминокислотными последовательностями различных классов и подклассов иммуноглобулинов, и определяя класс и подкласс антител. В некоторых вариантах осуществления антитело против миостатина является моноклональным антителом. Антитело против миостатина может быть молекулой IgG, IgM, IgE, IgA или IgD. В предпочтительном варианте осуществления антитело против миостатина является IgG и представляет собой подкласс IgG1, IgG2, IgG3, IgG4. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело представляет собой подкласс IgG2. Распознавание эпитопов миостатина, распознаваемых антителами против миостатина Данное изобретение предоставляет человеческое моноклональное антитело против миостатина, которое связывается с миостатином и конкурирует или конкурентно связывается с и/или связывается с тем же самым эпитопом, что и: (а) антитело, выбранное из 11161, 11363, 12571, 1461, 21121,13141, 1661, 2431, 21771, 11321, 12681, 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141H-T92A; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121HL81M, L-I85V или 21121H-L81M, L-F58I, I85V; (b) антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность домена VH любой из SEQ ID NO: 2, 6, 10,14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 или 85, (с) антитело, которое содержит вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность домена VL любой изSEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 или 87, (d) антитело,которое включает и вариабельный домен тяжелой цепи, как оговорено в пункте (b), и вариабельный домен легкой цепи, как описано в пункте (с). Определить, связывается ли антитело с тем же самым эпитопом или конкурирует за связывание с антителом против миостатина можно посредством применения способов, известных в данной области. В одном варианте осуществления специалист связывает антитело против миостатина согласно данному изобретению с миостатином при насыщающих условиях и затем измеряет способность тестируемого антитела связываться с миостатином. Если тестируемое антитело способно связываться с миостатином одновременно с контрольным антителом против миостатина, тогда тестируемое антитело связывается с иным эпитопом, чем контрольное антитело против миостатина. Однако, если тестируемое антитело не может связаться с миостатином в то же самое время, значит, тестируемое антитело связывается с тем же самым эпитопом, перекрывающимся эпитопом, или с эпитопом, который находится в близком соседстве с эпитопом, связываемым антителом против миостатина согласно данному изобретению. Этот эксперимент можно провести посредством ELISA, RIA, BIACORE или проточной цитометрии. Для того чтобы тестировать конкурирует ли антитело против миостатина с другим антителом против миостатина, специалист может использовать метод сравнения, описанный ранее в двух руководствах, то есть определяя блокирует ли известное антитело тестируемое антитело и наоборот. В предпочтительном варианте осуществления эксперимент проводится посредством ELISA. Подавление активности миостатина антителами против миостатина Проведя несколько испытаний, специалист может распознать моноклональные антитела против миостатина, которые ингибируют связывание миостатина. Например, нейтрализующие антитела против миостатина можно идентифицировать по их способности блокировать вызываемую миостатином активность люциферазы в А 204 клетках, трансфицированных конструкцией Smad-чувствительные элементы/люцифераза, как описано в примере III. Предпочтительные антитела против миостатина имеют IC50 не более чем 500, 250, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 1, 0,5 или 0,1 нМ. Специалист также может определить способность антитела против миостатина блокировать индуцируемую миостатином активацию Smad-белка посредством контакта клеток миобластов крысы линииL6, трансфицированных конструкцией Smad 2/3-связывающий элемент/бета-лактамаза, с антителом против миостатина, как описано в примере IV. В различных вариантах осуществления антитело против миостатина имеет IC50 в этом испытании не более чем 500, 250, 100, 75, 50, 40, 30, 20, 10, 1, 0,5 или 0,1 нМ. Альтернативно, нейтрализующие антитела против миостатина можно распознать по их способности ингибировать фосфорилирование Smad 2 или 3 в вестерн-блоте, как описано в примере V. В иных вариантах осуществления антитело против миостатина согласно данному изобретению модулирует экспрессию генов, связанных с пролиферацией и дифференциацией мышечной клетки. Такое модулирование включает, но не ограничивается этим, уменьшение экспрессии белка-ингибитора клеточного цикла Р 21 и проапоптического белка-Вах, увеличение фосфорилирования Rb и увеличение экспрессии Cdk2. В некоторых вариантах осуществления антагонистичные антитела против миостатина согласно изобретению увеличивают экспрессию MyoD, миогенина и Myf5. Влияние антитела против миостатина на экспрессию гена можно определить, применяя любой из рутинных способов. (См., например, пример VI). В некоторых вариантах осуществления нейтрализующее антитело против миостатина согласно изобретению усиливает дифференциацию миобластов. Способность антитела увеличивать такую пролиферацию и дифференциацию можно определить посредством исследований с применением, например, клеток С 2 С 12, как описано в примере VII.- 14015534 Конкурирующие человеческие антитела против миостатина в сравнении с неконкурирующими Человеческие антитела против миостатина согласно данному изобретению можно распределить по категориям, как конкурирующие и неконкурирующие с другими подавляющими, связывающими миостатин белками, применяя эксперименты по иммунопреципитации. Например, пропептид, который образует комплекс со зрелым GDF8 является белком-ингибитором. Кондиционированная среда клеток 293 Т, экспрессирующих GDF8, содержит зрелый GDF8, комплекс зрелого GDF8 и пропептида и непроцессированный GDF8. Применяя эту кондиционированную среду, проводили исследования иммунопреципитации для определения связывания человеческих антител против миостатина согласно изобретению с комплексом зрелого GDF8 и пропептида. Как описано в примере X, антитела 21121, 2431 и 21771 связывали и иммунопреципитировали зрелый GDF8, комплекс зрелого GDF8 и пропептида и непроцессированный GDF8. Антитело 1661 связывало и иммунопреципитировало зрелый GDF8 и комплекс зрелогоGDF8 и пропептида. Ни одно из других антител не иммунопреципитировало зрелый GDF8, пропептид или непроцессированный GDF8. Таким образом, антитела 21121, 2431 и 21771 являются неконкурирующими антителами, и антитело 1661 также является неконкурирующим антителом, но оно связывается с другим эпитопом миостатина. Неконкурирующее нейтрализующее антитело, то есть антитело,которое связывает миостатин в присутствии других белков-ингибиторов, будет иметь лучшую эффективность in vivo, чем конкурирующее антитело. В других вариантах осуществления антитело против миостатина согласно изобретению иммунопреципитировало зрелый GDF8 из сыворотки мыши. Как описано в примере XI, моноклональные антитела 2112, 2431 и 2177 меньше связываются со зрелым GDF8, чем 11161 и 1661. Видоспецифичность и молекулярная селективность В еще одном аспекте изобретения антитела против миостатина демонстрируют и видоспецифичность, и молекулярную селективность. В некоторых вариантах осуществления антитело против миостатина связывается с миостатином человека, мыши, Rattus norvegicus (норвежской крысы), cynomolgus macaque (обезьяны), Масаса fascicularis (макаки-крабоеда), Meleagris gallopavo (индюка), Sus scrofa (свиньи), Gallus gallus (цыпленка), Canis famillaris (собаки), Equus caballus (лошади), Coturnix chinensis (перепела), Coturnix coturnix (перепела обыкновенного) и Columba livia (домашнего голубя). После обучения по данной спецификации специалист может определить видоспецифичность антитела против миостатина, применяя способы, хорошо известные в данной области. Например, специалист может определить видоспецифичность, применяя вестерн-блот, поверхностный плазмонный резонанс, например, BIAcore,ELISA, иммунопреципитацию или RIA. В других вариантах осуществления антитело против миостатина характеризуется большей селективностью по отношению к миостатину по сравнению с GDF11 по меньшей мере в 50 раз или по меньшей мере в 100 раз. GDF11 - член близкого миостатину семейства, который проявляет девяностопроцентную идентичность с его зрелым белком. В некоторых вариантах осуществления антитело против миостатина не проявляет какого-либо значительного специфического связывания с любым другим белком отличным от миостатина. После обучения по спецификации специалист может определить селективность антитела против миостатина по отношению к миостатину, применяя способы хорошо известные в данной области. Например, он может определить селективность, применяя вестерн-блот, проточную цитометрию, ELISA, иммунопреципитацию или RIA. В других вариантах осуществления согласно данному изобретению антитело против миостатина не имеет этого высокого уровня селективности к GDF8 по сравнению с GDF11. Способы получения антител и клеточные линии, продуцирующие антитело Иммунизация В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела продуцируются иммунизированным антигеном миостатина трансгенным животным, не являющимся человеком, содержащим в своем геноме некоторые или все локусы тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина человека. В предпочтительном варианте осуществления животное, не являющееся человеком, - это животное XENOMOUSE (Abgenix,Inc., Fremont, CA). Мыши XENOMOUSE- это мышиные генно-инженерные линии, которые содержат большие фрагменты локусов тяжелой цепи и легкой цепи человеческого иммуноглобулина и у которых отсутствует продукция мышиного антитела. См., например, Green и др., Nature Genetics 7:13-21 (1994) и патенты США 5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598, 6130364, 6162963 и 6150584. Смотрите также WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893,WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 и WO 00/037504. В еще одном аспекте данное изобретение предлагает способ выработки антител против миостатина у животных, не являющихся человеком или мышью, посредством иммунизации антигеном миостатина трансгенных животных, не являющихся человеком, у которых есть локусы человеческого иммуноглобулина. Специалист может создать таких животных, применяя способы, описанные в документах, приведенных ранее. Способы, раскрытые в этих документах, можно модифицировать, как описано в патенте США 5994619, который включен в настоящее изобретение в виде ссылки. Патент США 5994619 описывает способы продукции новых клеток с культивируемой внутриклеточной массой (CICM) и клеточных- 15015534 линий, полученных от свиней и коров, и трансгенных клеток CICM, в которые внесена гетерологичная ДНК. Трансгенные клетки CICM можно использовать для производства клонированных трансгенных эмбрионов, плодов и потомков. Патент '619 также описывает способы получения трансгенных животных,которые способны передавать гетерологичную ДНК своему потомству. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения животные, не являющиеся человеком, - это млекопитающие, в частности крысы, овцы, свиньи, козы, крупные рогатый скот, лошади или цыплята. Мыши XENOMOUSE продуцируют набор полностью человеческих антител, подобный набору взрослого человека, и вырабатывают антигенспецифические человеческие антитела. В некоторых вариантах осуществления мыши XENOMOUSE несут приблизительно 80% набора V-генов человеческого антитела вследствие введения больших фрагментов исходных локусов человеческой тяжелой цепи и локусов легкой цепи каппа-типа в искусственную хромосому дрожжей (YAC). В других вариантах осуществления мыши XENOMOUSE сверх того несут практически весь локус человеческой легкой цепи лямбда-типа. См. Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998) и WO 98/24893, описание которых включено в настоящее изобретение в виде ссылок. В некоторых вариантах осуществления не являющиеся человеком животные, несущие гены человеческого иммуноглобулина, представляют собой животных, которые имеют "минилокус" человеческого иммуноглобулина. При таком подходе экзогенный локус Ig имитируется вследствие включения отдельных генов локуса Ig. Таким образом, один или более генов VH, один или более генов DH, один или более генов JH, константная область мю и вторая константная область (предпочтительно - константная область гамма) образуют конструкцию для введения животному. Этот подход описан, inter alia, в патентах США 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425, 5661016, 5770429, 5789650, 5814318, 5591669,5612205, 5721367, 5789215 и 5643763, включенных в настоящее описание в виде ссылок. В еще одном аспекте данное изобретение предлагает способ получения гуманизированных антител против миостатина. В некоторых вариантах осуществления животные, не являющиеся человеком, иммунизированы антигеном миостатина, как описано ниже, при условиях, которые позволяют продуцировать антитело. Из животных выделены клетки, продуцирующие антитело, и нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи представляющего интерес антитела против миостатина, выделены из выделенных продуцирующих антитело клеток или из иммортализованной клеточной линии, полученной из таких клеток. Впоследствии эти нуклеиновые кислоты сконструированы при применении технических приемов, известных специалистам в данной области, и как описано ниже, для уменьшения размера последовательности, не являющейся человеческой, то есть чтобы гуманизировать антитело для уменьшения иммунного ответа у людей. В одних вариантах осуществления антиген миостатина - это выделенный и/или очищенный миостатин. В других вариантах осуществления антиген миостатина является человеческим миостатином. Несмотря на это, поскольку С-терминальная часть зрелого миостатина одинакова у людей, мышей, крысы,собаки, перепела, цыпленка, индюка, свиньи, лошади и обезьян и не гликозилирована в клетках, миостатин этих видов животных и других видов, имеющих такую же последовательность зрелого белка, также можно использовать в качестве иммуногена. В других вариантах осуществления антиген миостатина представляет собой клетку, которая экспрессирует или сверхэкспрессирует миостатин. В других вариантах осуществления антиген миостатина - это рекомбинантный белок, экспрессированный дрожжами,клетками насекомых, бактериями, такими как E.Coli, или полученный другими способами посредством технологии рекомбинирования. Иммунизация животных может осуществляться посредством любого способа, известного в данной области. См., например, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. New York: Cold Spring HarborPress, 1990. Способы иммунизации животных, не являющихся человеком, таких как мыши, крысы, овцы,козы, свиньи, крупный рогатый скот и лошади, хорошо известны в данной области. См., например, Harlow and Lane supra и патент США 5994619. В предпочтительном варианте осуществления антиген миостатина вводится с адъювантом, чтобы стимулировать иммунный ответ. Иллюстративные адъюванты включают полный или неполный адъювант Фрейнда, RIBI (мурамиловые дипептиды) или ISCOM (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защищать полипептид от быстрого распада посредством связывания его в локальное отложение, или они могут содержать субстанции, которые стимулируют хозяина секретировать факторы, которые являются хемотаксичными для макрофагов и других компонентов иммунной системы. При введении полипептида предпочтительно, чтоб план иммунизации включал два или более введений полипептида, распределенных на несколько недель. Пример I иллюстрирует способ продукции моноклональных антител против миостатина в мышах XENOMOUSE. Продукция антител и клеточные линии, продуцирующие антитело После иммунизации животного антигеном миостатина, у животного могут быть взяты антитела и/или клетки, продуцирующие антитело. В некоторых вариантах осуществления сыворотку, содержащую антитело против миостатина, берут у животного посредством кровопускания или умерщвления животного. Когда сыворотка получена от животного, ее можно использовать, из сыворотки можно получить фракцию иммуноглобулина или из сыворотки можно очистить антитела против миостатина.- 16015534 В некоторых вариантах осуществления клеточные линии, продуцирующие антитело, готовят из клеток, выделенных у иммунизованного животного. После иммунизации животное забивают и В-клетки лимфатического узла и/или селезенки иммортализуют посредством любого известного в данной области способа. Способы иммортализации клеток включают, но не ограничиваются этим, трансфицирование их онкогенами, инфицирование их онкогенным вирусом и культивирование их в условиях, которые подобраны для иммортализованных клеток, обработку клеток канцерогенными или вызывающими мутации соединениями, слияние их с иммортализованной клеткой, например, клеткой миеломы, и инактивацию гена опухолевого супрессора. См., например, Harlow and Lane, supra. Если применяется слияние с клетками миеломы, предпочтительно, чтобы клетки миеломы не секретировали полипептиды иммуноглобулина (несекретирующая клеточная линия). Иммортализованные клетки отбирают, применяя миостатин или его часть. В предпочтительном варианте осуществления проводят первоначальное скринирование,применяя ферментативное иммунологическое исследование (ELISA) или радиологическое иммунологическое исследование. Пример отбора с помощью ELISA приведен в WO 00/37504, включенном в настоящее изобретение в виде ссылки. Клетки, продуцирующие антитело против миостатина, например гибридомы, отбирают, клонируют и затем скринируют на присутствие желаемых характеристик, включая устойчивый рост, высокую продукцию антитела и желаемые характеристики антитела, как описано ниже. Гибридомы можно наращивать in vivo в сингенных животных, в животных без иммунной системы, например, в мышах линии nude,или в клеточной культуре in vitro. Способы отбора, клонирования и наращивания гибридом хорошо известны простым специалистам в данной области. В предпочтительном варианте осуществления иммунизированное животное - это животное, не являющееся человеком, у которого экспрессируются гены человеческого иммуноглобулина, и В-клетки селезенки слиты с миеломной клеточной линией того же вида животных, к которому относится животное, не являющееся человеком. В более предпочтительном варианте осуществления иммунизированное животное - это мышь XENOMOUSE, и клеточная линия миеломы - несекретирующая мышиная миелома. В еще более предпочтительном варианте осуществления клеточная линия миеломы - это Р 3-Х 63Ag8.653 (American Type Culture Collection). См., например, пример I. Таким образом, в одном варианте осуществления данное изобретение предоставляет способы получения клеточной линии, которая продуцирует человеческое моноклональное антитело или его фрагмент,ориентированные на миостатин, включающие (а) иммунизацию описанного здесь трансгенного животного, не являющегося человеком, миостатином, частью миостатина или клеткой или тканью, экспрессирующей миостатин; (b) предоставление возможности трансгенному животному сформировать иммунный ответ на миостатин; (с) выделение у трансгенного животного клеток, продуцирующих антитело; (d) иммортализацию клеток, продуцирующих антитело; (е) создание отдельных моноклональных популяций иммортализованных клеток, продуцирующих антитело; и (f) скрининг иммортализованных клеток, продуцирующих антитело, для выявления антитела, ориентированного против миостатина. В еще одном аспекте данное изобретение предлагает клеточную линию, которая продуцирует человеческое антитело против миостатина. В некоторых вариантах осуществления клеточная линия является гибридомной клеточной линией. В некоторых вариантах осуществления гибридомы представляют собой мышиные гибридомы, как описано выше. В других вариантах осуществления гибридомы продуцируются у представителей биологических видов отличных от человека и мыши, таких как крысы, овцы, свиньи,козы, крупный рогатый скот или лошади. В еще одном варианте осуществления гибридомы являются человеческими гибридомами. В еще одном варианте осуществления трансгенное животное иммунизируют антигеном миостатина,у иммунизированного трансгенного животного выделяют исходные клетки, например В-клетки селезенки или периферической крови, и распознают отдельные клетки, продуцирующие специфичные к желаемому антигену антитела. Выделяют полиаденилированные мРНК из каждой отдельной клетки и проводят обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) с применением senseпраймеров, которые отжигаются на последовательностях вариабельного домена, например вырожденные праймеры, которые распознают большинство или все FR1-участки человеческих генов вариабельного домена тяжелой и легкой цепи, и anti-sense-праймеры, которые отжигаются на последовательностях константной или примыкающей области. Затем кДНК вариабельного домена тяжелой и легкой цепей клонируют и экспрессируют в любой подходящей клетке-хозяине, например, в клетке миеломы, как химерные антитела с соответствующими константными областями иммуноглобулина, такими как тяжелая цепь и константные доменыили . См. Babcook, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48, 1996, включенную в настоящее изобретение в виде ссылки. Затем антитела против миостатина могут быть идентифицированы и выделены, как здесь описано. В еще одном варианте осуществления для формирования библиотек, содержащих набор антител с различной аффинностью к миостатину, может быть применен метод фагового дисплея. Для получения таких наборов не нужно иммортализовывать В-клетки иммунизированного животного. Предпочтительнее, чтобы исходные В-клетки можно было использовать непосредственно в качестве источника мРНК.- 17015534 Смесь кДНК, полученную из В-клетки, например, извлеченной из селезенок, используют для приготовления экспрессионной библиотеки, например библиотеки в формате фагового дисплея, трансфицированной в E.coli. Клетки, получающиеся в результате, тестируют на иммунореактивность к миостатину. Способы выявления высокоаффинных человеческих антител в таких библиотеках описаны Griffiths et al.,EMSO J., 13:3245-3260 (1994); Nissim et al., ibid, pp. 692-698 и Griffiths et al., ibid, 12:725-734, которые включены в настоящее изобретение в виде ссылок. В итоге из библиотеки выявлены клоны, которые дают по отношению к антигену аффинности связывания желаемую величину, и выделены и обработаны для стандартной экспрессии рекомбинантные ДНК, кодирующие продукт, отвечающий за такое связывание. Библиотеки в формате фагового дисплея также могут быть созданы при применении ранее обработанных и скринированных сходным образом нуклеотидных последовательностей. Обычно кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, независимо поставляются или соединяются для образования Fvаналогов для создания фаговой библиотеки. Затем фаговая библиотека скринируется на наличие антител с наибольшей аффинностью к миостатину, и из соответствующего клона выделяется генетический материал. Последующие циклы скринирования могут увеличить аффинность исходного выделенного антитела. Нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и способы создания антител,связанные с рекомбинированием Нуклеиновые кислоты Настоящее изобретение также включает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против миостатина или его антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления различные молекулы нуклеиновой кислоты кодируют тяжелую цепь и легкую цепь иммуноглобулина против миостатина. В других вариантах осуществления одна и та же молекула нуклеиновой кислоты кодирует тяжелую цепь и легкую цепь иммуноглобулина против миостатина. В некоторых вариантах осуществления в молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей вариабельный домен легкой цепи (VL) , используется ген человеческого A3, А 30 или L2 VK, и ген человеческогоJK1, JK3 или JK4. В других вариантах осуществления в молекуле нуклеиновой кислоты используется ген человеческого А 30, A3 или L2 VK и ген человеческого JK4. В некоторых вариантах осуществления в молекуле нуклеиновой кислоты используется ген человеческого А 30, A3 или L2 и ген человеческого JK1. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь, кодирует аминокислотную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 замен в сравнении с исходной аминокислотной последовательностью (последовательностями). В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность VL, содержащую 1, 2, 3, 4 или 5 консервативных аминокислотных замен и/или 1, 2 или 3 неконсервативных замены в сравнении с исходными последовательностями VK и JK. Замены могут быть в CDR-участках, каркасных участках или в константном домене. В одних вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VL, содержащую одну или более мутаций по сравнению с исходной последовательностью, которые идентичны мутациям в исходной последовательности, обнаруженным в VL любого из антител 11161, 11363, 12571, 1461, 21121, 13141, 1661, 2431, 21771, 11321, 12681,11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141 Н-Т 92 А; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121H-L81M, L-I85V или 21121H-L81M, L-F58I, I85V. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует по меньшей мере три аминокислотные замены по сравнению с исходной последовательностью, обнаруживаемой в VL любого из антител 11161, 11363, 12571, 1461, 21121, 13141, 1661, 2431, 21771, 11321,12681, 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141H-T92A; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121LF58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121H-L81M, L-I85V или 21121H-L81M, L-F58I,I85V. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность VL моноклонального антитела 11161 (SEQ ID NO: 4); 11363 (SEQ ID NO: 12); 12571 (SEQ ID NO: 16); 1461 (SEQ ID NO: 24); 21121 (SEQ ID NO: 28); 13141 (SEQ ID NO: 20-); 1661 (SEQ ID NO: 36); 2431 (SEQ ID NO: 28); 21771 (SEQ ID NO: 40); 11321 (SEQ ID NO: 8) или 12681 (SEQ ID NO: 32) или его модификацию или его часть. В одних вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность, содержащую CDR-участки легкой цепи одного из перечисленных выше антител. В других вариантах осуществления указанная часть представляет собой непрерывную часть, содержащуюCDR1-CDR3. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность одного из SEQ ID NO: 4, 8,12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 или 87. В одних вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность из SEQ ID NO: 3, 7,11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 48, 52, 56, 60, 68, 72, 80, 64, 76, 84 или 88 или его часть. В других вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует аминокислотную последовательность одного, двух- 18015534 или всех трех CDR-участков легкой цепи указанного антитела. В некоторых вариантах осуществления указанная часть кодирует непрерывный участок CDR1-CDR3 легкой цепи антитела против миостатина. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VL, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности VL любого из антител 11161, 11363, 12571, 1461, 21121,13141, 1661, 2431, 21771, 11321, 12681, 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141 Н-Т 92 А; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; или 21121H-L81M, L-F58I; 21121H-L81M, L-I85V или 21121H-L81M, L-F58I, I85V или аминокислотной последовательности участка VL любой одной из SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75,79, 83 или 87. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению включают нуклеиновые кислоты,которые гибридизуются при чрезвычайно жестких условиях, таких как те, что описаны выше, или которые по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичны нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность VL-участка, из SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36,40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 или 87 или нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность VL-участка, с SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 48, 52, 56, 60, 68, 72,80, 64, 76, 84 или 88. В другом предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует вариабельный домен тяжелой цепи (VH) , которая несет последовательность человеческого гена VH 1-02, 321 или 3-23 или происходящую из него последовательность. В различных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты несет человеческий ген VH 1-02, ген D4-23 и человеческий ген JH6b; человеческий ген VH3-21, человеческий ген D3-16 или D5-12 и человеческий ген JH6b; человеческий ген VH 321, человеческий ген D1-26 или D5-5 и человеческий ген JH4b; человеческий ген VH 3-23, человеческий ген D1-7 и человеческий ген JH3b. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность, содержащую 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 мутаций в сравнении с исходной аминокислотной последовательностью генов человека V, D или J. В некоторых вариантах осуществления указанные мутации находятся в VH-участке. В некоторых вариантах осуществления указанные мутации находятся в CDR-участках. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует последовательность VH, содержащую одну или несколько аминокислотных мутаций в сравнении с исходной последовательностью VH, которые идентичны аминокислотным мутациям, обнаруженным в VH моноклонального антитела 11161, 11363, 12571, 1461, 21121, 13141, 1661, 2431, 21771, 11321,12681, 11161L-Q45K; 12571L-L21I ; 13141 Н-Т 92 А; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121LF58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121H-L81M, L-I85V или 21121H-L81M, L-F58I,I85V. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует по меньшей мере три аминокислотные мутации в сравнении с исходными последовательностями, которые идентичны по меньшей мере трем аминокислотным мутациям, обнаруженным в одном из приведенных выше моноклональных антител. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует по меньшей мере часть аминокислотной последовательности VH моноклонального антитела, выбранного из 11161 (SEQ ID NO: 2); 11363 (SEQ ID NO: 10); 12571(SEQ ID N0: 34); 2431 (SEQ ID NO: 42); 21771 (SEQ ID NO: 38); 11321 (SEQ ID NO: 6) или 12681 (SEQ ID NO: 30), ее модификацию, или указанную последовательность, имеющую консервативные аминокислотные мутации и/или всего три или менее неконсервативных аминокислотных замен. В различных вариантах осуществления данная последовательность кодирует один или более CDRучастков, предпочтительно CDR3-участок, все три CDR-участка, непрерывную часть, включающуюCDR1-CDR3, или всю область VH приведенных выше антител против миостатина. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует аминокислотную последовательность одного SEQ ID NO: 2, 6, 10,14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 или 85. В различных предпочтительных вариантах осуществления данная молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности из SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 46, 50, 54, 58, 62, 66,70, 74, 78, 82 или 86. В некоторых вариантах осуществления указанная часть кодирует область VH,CDR3-участок, все три CDR-участка или непрерывный участок, включающий CDR1-CDR3. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует аминокислотную последовательность VH, которая по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности VH в любой из SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45,49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 или 85. Молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению включают нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются при чрезвычайно строгих условиях, как те, что описаны выше, или которые по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичны нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38- 19015534 или 42 или их области VH, или нуклеиновой кислоте, содержащей нуклеотидную последовательность изSEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 или 41 или нуклеотидную последовательность, которая кодирует их область VH. В еще одном варианте осуществления нуклеиновая кислота кодирует полноразмерную тяжелую цепь антитела, выбранного из 11161, 11363, 12571, 1461, 21121, 13141, 1661, 2431,21771, 11321, 12681, 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141 Н-Т 92 А; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121H-L81M, L-I85V или 21121H-L81M, L-F58I, I85V, или тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность изSEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 или 42. Кроме того, нуклеиновая кислота может содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 или 41. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую или легкую цепь антитела против миостатина или их части, может быть выделена из любого источника, который продуцирует такое антитело. В различных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты выделены из В-клетки, которая экспрессирует антитело против миостатина, выделенное у животного, иммунизированного миостатином,или из иммортализованной клетки, полученной из такой В-клетки. Способы выделения нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, хорошо известны в данной области. См., например, Sambrook и др. мРНК может быть выделена и использована для получения кДНК для применения в полимеразной цепной реакции (ПЦР) или для получения кДНК, клонирующей гены антитела. В предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты выделена из гибридомы, которая имеет, в качестве одного из агентов при слиянии, клетку трансгенного животного, не являющегося человеком, указанная клетка продуцирует человеческий иммуноглобулин. В еще более предпочтительном варианте осуществления клетка, продуцирующая человеческий иммуноглобулин выделена из животного XENOMOUSE. В еще одном варианте осуществления клетка, продуцирующая человеческий иммуноглобулин, выделена из трансгенного животного, не являющегося человеком, не являющегося мышью, как описано ранее. В другом варианте осуществления нуклеиновая кислота выделена из нетрансгенного животного, не являющегося человеком. Молекулы нуклеиновой кислоты, выделенные у не являющегося человеком нетрансгенного животного, можно использовать, например, для гуманизированных антител, которые содержат одну или более аминокислотных последовательностей человеческого антитела против миостатина согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела против миостатина согласно изобретению, может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую домен VH согласно изобретению, объединенная в рамке с нуклеотидной последовательностью,кодирующей константный домен тяжелой цепи из любого источника. Аналогично молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь антитела против миостатина согласно изобретению, может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую домен VL согласно изобретению, объединенную в рамке с нуклеотидной последовательностью, кодирующей константный домен легкой цепи из любого источника. В дополнительном аспекте согласно изобретению молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельный домен тяжелой (VH) и/или легкой (VL) цепей, "преобразованы" в полноразмерные гены антитела. В одном варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие домены VH или VL, преобразованы в полноразмерные гены антитела посредством введения в экспрессионный вектор, уже кодирующий константные домены тяжелой цепи (CH) или легкой цепи (CL) , соответственно, так что сегмент VH физически связан в данном векторе с сегментом (сегментами) CH, и/или сегмент VL физически связан в векторе с сегментом CL. В другом варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие домены VH и/или VL, преобразованы в полноразмерные гены антитела посредством связывания, например, лигирования, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей домены VH и/или VL с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей домен CH и/или CL, при применении стандартных молекулярно-биологических технических приемов. Нуклеотидные последовательности генов константного домена тяжелой и легкой цепи человеческого иммуноглобулина известны в данной области. См., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. Затем молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие полноразмерные тяжелую и/или легкую цепи, могут быть экспрессированы в клетках, в которые они были введены, и может быть выделено антитело против миостатина. Молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для рекомбинантной экспрессии большого количества антител против миостатина. Молекулы нуклеиновой кислоты также можно использовать для получения химерных антител, биспецифичных антител, одноцепочечных антител, иммуноадгезинов, димерных антител, мутантных антител и производных антитела, как описано далее. Если молекулы нуклеиновой кислоты получены от нетрансгенного животного, не являющегося человеком, молекулы нуклеиновой кислоты могут использоваться для гуманизации антител, также как описано ниже. В еще одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты согласно изобретению применяется в качестве зонда или праймера для ПЦР для отдельной последовательности антитела. Например, нуклеиновая кислота может использоваться в качестве зонда в диагностических процедурах или в- 20015534 качестве праймера для ПЦР для амплификации участков ДНК, которые могут использоваться, inter alia,для выделения дополнительных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих вариабельные домены антител против миостатина. В некоторых вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты являются олигонуклеотидами. В одних воплощениях олигонуклеотиды из чрезвычайно вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела представляют интерес. В других вариантах осуществления данные олигонуклеотиды кодируют все или часть одного или нескольких CDR-участков антител 11161,11363, 12571, 1461, 21121, 13141, 1661, 2431, 21771, 11321, 12681, 11161LQ45K; 12571L-L21I; 13141 Н-Т 92 А; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I или 21121H-L81M, L-I85V, или 21121H-L81M, L-F58I, I85V или их модификации, которые здесь описаны. Векторы Данное изобретение предоставляет векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют тяжелую цепь антитела против миостатина согласно изобретению или его антигенсвязывающую часть. Изобретение также предлагает векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, которые кодируют легкую цепь таких антител или их антигенсвязывающей части. Кроме того, изобретение предоставляет векторы, содержащие молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитые белки, модифицированные антитела, фрагменты антител и их зонды. В некоторых вариантах осуществления антитела против миостатина согласно изобретению или антигенсвязывающие части экспрессированы посредством введения ДНК, кодирующих неполные или полноразмерные легкую и тяжелую цепи, полученные, как описано ранее, в экспрессионные векторы такие,что гены физически связаны с необходимыми регулирующими экспрессию последовательностями, такими как последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию. Экспрессионные векторы включают плазмиды, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирусы растений, такие как мозаичный вирус цветной капусты, мозаичный вирус табака, космиды, YAC, эписомы,производные EBV, и им подобные. Ген антитела лигирован в вектор так, что последовательности, регулирующие транскрипцию и трансляцию в векторе, соответствуют их запланированному назначению, т.е. регулируют транскрипцию и трансляцию гена антитела. Экспрессионный вектор и регулирующие экспрессию последовательности выбраны таким образом, чтобы они были совместимы с используемой экспрессионной клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела может быть введен в независимые векторы. В предпочтительном варианте осуществления оба гена введены в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антитела введены в экспрессионный вектор посредством стандартных приемов (например, лигирование комплементарных сайтов рестрикции фрагмента гена антитела и вектора, или лигирование тупых концов, если отсутствуют сайты рестрикции). Подходящий вектор - это вектор, который кодирует функционально полную последовательность человеческого иммуноглобулина CH или CL, с соответствующими сайтами рестрикции, сконструированными так, что любую последовательность VH или VL можно легко ввести и экспрессировать, как описано выше. В таких векторах обычно наблюдается соединение между донорным сайтом сплайсинга во встраиваемом J-участке и акцепторным сайтом сплайсинга, предшествующим человеческому С-домену, и также в областях сплайсинга, которые встречаются в экзонах человеческого CH. Полиаденилирование и терминация транскрипции имеет место в природных сайтах хромосомы ниже кодирующих участков. Рекомбинантный экспрессионный вектор также может кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор такой, что сигнальный пептид встроен в рамку с N-концом цепи иммуноглобулина. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом(то есть сигнальным пептидом белка, не являющегося иммуноглобулином). В дополнение к генам цепи антитела рекомбинантные экспрессионные векторы согласно изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клетке-хозяине. Специалисты в данной области оценят по достоинству тот факт, что конструкция экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка и так далее. Предпочтительная регуляторная последовательность для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающих включает вирусные элементы, которые управляют высокими уровнями экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из ретровирусных LTR, цитомегаловируса (CMV) (как например промотор/энхансер CMV), полиомавирус (вирус обезъян 40, SV40) (как например промотор/энхансер SV40), аденовируса, (например, основной поздний промотор аденовируса(AdMLP, полиомы и сильных промоторов млекопитающих, таких как природные промоторы иммуноглобулина и актина. Для дальнейшего описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см. например, патент США No. 5168062, патент США No. 4510245 и патент США No. 4968615. Способы экспрессии антител в растениях, включая описание промоторов и векторов, также как и трансформация растений, известны в данной области. См., например, патент Соединенных Штатов 6517529,включенный в настоящее изобретение в виде ссылки. Способы получения полипептидов в бактериальных клетках или клетках грибов, например, в дрожжевых клетках, также хорошо известны в данной об- 21015534 ласти. В дополнение к генам цепи антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные экспрессионные векторы согласно данному изобретению могут нести дополнительные последовательности,как например, последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и селективные маркерные гены. Селективный маркерный ген облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см. например, патенты США No. 4399216,4634665 и 5179017, включенные в настоящее описание в виде ссылок). Например, типичный селективный маркерный ген дает клетке-хозяину, в которую был введен вектор, устойчивость к лекарственным препаратам, таким как G418, гигромицин или метотрексат. Предпочтительные селективные маркерные гены включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в dhfr-клетках-хозяевах с селекцией по метотрексату и амплификацией), ген пео (для селекции по G418) и ген глутаматсинтетазы. Негибридомные клетки-хозяева и способы производства белка, связанные с рекомбинированием Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела против миостатина, и векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновой кислоты, могут быть использованы для трансфекции подходящей клетки-хозяина млекопитающих, растений, бактерий или дрожжей. Трансформация может быть осуществлена посредством любого известного способа для введения полинуклеотидов в хозяйскую клетку. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки животных хорошо известны в данной области и включают опосредованную декстраном трансфекцию, преципитацию с фосфатом кальция, опосредованную полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(полинуклеотидов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядро. Кроме того, молекулы нуклеиновой кислоты могут быть введены в клетки млекопитающих посредством вирусных векторов. Способы трансформации клеток хорошо известны в данной области. См., например, патенты США No. 4399216,4912040, 4740461 и 4959455, включенные в настоящее изобретение в виде ссылок. Способы трансформации клеток растений хорошо известны в данной области, включая, например, трансформацию, опосредованную Agrobacterium, биолистическую трансформацию, прямую инъекцию, электропорацию и вирусную трансформацию. Способы трансформации бактериальных и дрожжевых клеток также хорошо известны в данной области. Клеточные линии млекопитающих, пригодные в качестве хозяев для экспрессии, хорошо известны в данной области и включают множество иммортализованных клеточных линий, доступных в AmericanType Culture Collection (ATCC). Они включают, inter alia, клети яичника китайского хомячка (СНО),клетки NSO, клетки SP2, клетки НЕК-293 Т, клетки NIH-3T3, клетки HeLa, клетки почки детеныша хомяка (ВНК), клетки почки африканской зеленой мартышки (COS), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, HepG2), клетки А 549 и другие клеточные линии. Особенно предпочтительные клеточные линии выбраны посредством определения, какие клеточные линии имеют наибольшие уровни экспрессии. Также могут быть использованы клеточные линии, отличные от клеточных линий, происходящих от млекопитающих. Они включают клеточные линии насекомых (такие как клетки Sf9 или Sf21), клетки растений (включая клетки Nicotiana, Arabldopsis, ряски, кукурузы, пшеницы, картофеля и так далее), бактериальные клетки (включая E.coli и Streptomyces) и дрожжевые клетки (включая Schizosaccharomycespombe, Saccharomyces cerevlslae и Pichia pastoris). Если рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие гены антитела, вводятся в клеткихозяева, антитела продуцируются посредством культивирования клеток-хозяев в течение временного периода, достаточного, чтобы дать возможность экспрессировать антитело в клетках-хозяевах или, более предпочтительно, секретировать антитело в культуральную среду, в которой выращиваются клеткихозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды при применение стандартных способов очистки белка. Экспрессия антител согласно данному изобретению в продуцирующих клеточных линиях может быть усилена при применении различных известных способов. Например, система экспрессии глутаминсинтетазы (GS-система) представляет собой общий подход для усиления экспрессии при определенных условиях. GS-система описывается целиком или частями в связи с Европейскими патентами No. 0216846,0256055, 0323997 и 0338841. Вероятно антитела, экспрессированные в различных клеточных линиях или трансгенных животных,будут иметь различное гликозилирование. Тем не менее, все антитела кодируемые молекулами нуклеиновой кислоты, предлагаемой здесь, или содержащие аминокислотные последовательности, предлагаемые здесь, являются частью настоящего изобретения, несмотря на гликозилирование антител. Трансгенные животные и растения Антитела против миостатина согласно изобретению также могут трансгенно продуцироваться через создание млекопитающих или растений, которые являются трансгенными по последовательностям тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина, представляющего интерес, и продукцию антитела в восстанавливаемом виде. В связи с трансгенной продукцией у млекопитающих антитела против миостатина могут продуцироваться и выделяться из молока коз, коров или других млекопитающих. См., например, патенты США No. 5827690, 5756687, 5750172 и 5741957, включенные в настоящее изобретение в виде ссылок. В- 22015534 некоторых вариантах осуществления трансгенные животные, не являющиеся человеком, содержащие локусы человеческого иммуноглобулина, иммунизированы миостатином или его иммуногенной частью,как описано выше. Способы создания антител в растениях описаны, например, в патентах США 6046037 и 5959177, включенных в настоящее изобретение в виде ссылок. В некоторых вариантах осуществления не являющиеся человеком трансгенные животные или растения получены посредством введения животному или растению одной или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело против миостатина согласно данному изобретению, посредством стандартных трансгенных способов. См. патент Hogan и Соединенных Штатов 6417429, supra. Трансгенные клетки, использованные для получения трансгенного животного, могут быть эмбриональными стволовыми клетками или соматическими клетками или оплодотворенным яйцом. Трансгенные, не являющиеся человеком организмы могут быть химерными, нехимерными гетерозиготами и нехимерными гомозиготами. Смотрите, например, Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold(1999), все включены в настоящее изобретение в виде ссылок. В некоторых вариантах осуществления трансгенные не являющиеся человеком животные имеют целевое нарушение и замещение ввиду введения целевой конструкции, которая кодирует тяжелую цепь и/или легкую цепь, представляющие интерес. В предпочтительном варианте осуществления трансгенные животные содержат и экспрессируют молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие тяжелую и легкую цепи, которые специфически связываются с миостатином, предпочтительно с человеческим миостатином. В некоторых вариантах осуществления трансгенные животные содержат молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие модифицированное антитело, как, например, одноцепочечное антитело, химерное антитело или гуманизированное антитело. Антитела против миостатина могут быть получены в любом трансгенном животном. В предпочтительном варианте осуществления животные, не являющиеся человеком, - это мыши, крысы, овцы, свиньи,козы, крупный рогатый скот или лошади. Трансгенные животные, не являющиеся человеком, экспрессируют указанные кодируемые полипептиды в крови, молоке, моче, слюне, слезах, слизи и в других жидкостях тела. Библиотеки в формате фагового дисплея Данное изобретение предоставляет способ создания антитела против миостатина или его антигенсвязывающей части, включающий стадии синтеза библиотеки человеческих антител в фаге, скринирование библиотеки с миостатином или его частью, связывающей антитело, выделение фага, который связывает миостатин, и получение антитела из фага. В качестве примера один способ получения библиотеки антител для использования в методах фагового дисплея включает стадии иммунизации животного, не являющегося человеком, содержащего локусы человеческого иммуноглобулина, с миостатином или его антигенной частью для создания иммунного ответа, извлечение продуцирующих антитело клеток из иммунизированного животного; выделение из извлеченных клеток РНК, кодирующей тяжелую и легкую цепи антител согласно изобретению, обратная транскрипция РНК для получения кДНК, амплификация данной кДНК с применением праймеров и встраивание кДНК в вектор фагового дисплея, такой, что антитела экспрессируются фагом. Рекомбинантные антитела против миостатина согласно изобретению могут быть получены этим способом. Рекомбинантные человеческие антитела против миостатина согласно изобретению могут быть выделены посредством скринирования рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител. Предпочтительно, чтобы такая библиотека была scFv-фаговой библиотекой, созданной с применением кДНК человеческих VL и VH, приготовленных с мРНК, выделенной из В-клеток. Способы приготовления и скрининга таких библиотек известны в данной области. Наборы для создания библиотек в формате фагового дисплея доступны коммерчески (например, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog no. 279400-01; и Stratagene SurfZAP phage display kit, catalog no. 240612). Также существуют другие способы и реактивы, которые могут применяться при создании и скрининге библиотек антител (см., например,патент США No. 5223409; публикации РСТ No. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679,WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al.,Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 24 6:1275-1281 (1989); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896(1991); и Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991), все включены в настоящее изобретение в виде ссылок. В одном варианте осуществления для выделения и производства человеческих антител против миостатина с желаемыми свойствами, человеческое антитело против миостатина, которое описано здесь,сначала используется для отбора человеческих последовательностей тяжелой и легкой цепи, имеющих сходную активность связывания по отношению к миостатину, применяя способы импринтинга эпитопа,описанные в публикации РСТ No. WO 93/06213, включенной в настоящее изобретение в виде ссылки. Предпочтительно, чтобы библиотеки антител, используемые в этом способе, были scFv-библиотеками,- 23015534 приготовленными и скринированными, как описано в публикации РСТ No. WO 92/01047, McCafferty etal., Nature 348:552-554 (1990) и Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993), все включены в настоящее изобретение в виде ссылок. Предпочтительно, чтобы scFv-библиотеки антител скринировались с применением человеческого миостатина в качестве антигена. Когда выбраны исходные человеческие домены VL и VH, проводятся эксперименты "mix and match",в которых различные пары изначально отобранных сегментов VL и VH скринируются на связывание миостатина, чтобы выбрать предпочтительные комбинации пар VL/VH. Дополнительно для дальнейшего улучшения качества антитела, сегменты VL и VH предпочтительной пары (предпочтительных пар) VL/VH могут быть случайно мутированы, предпочтительно в CDR3-участке VL и/или VH, посредством процесса,аналогичного процессу соматической мутации in vivo, отвечающему за развитие аффинности антител во время естественного иммунного ответа. Это развитие аффинности in vitro может быть завершено посредством амплификации доменов VH и VL при применении праймеров для ПЦР, комплементарных CDR3 участку VH или CDRS-участку VL, соответственно, где праймеры были обработаны случайной смесью четырех нуклеотидных оснований в определенных положениях, так, что итоговые ПЦР-продукты кодируют сегменты VH и VL, в которые введены случайные мутации в CDR3-участки VL и/или VH. Эти сегменты VH и VL со случайными мутациями могут заново скринироваться на связывание с миостатином. После скринирования и выделения антитела против миостатина согласно данному изобретению из библиотеки рекомбинантных иммуноглобулинов, нуклеиновые кислоты, кодирующие выбранное антитело, могут быть выделены из упаковки (например, из фагового генома) и субклонированы в другие экспрессионные векторы посредством стандартных способов обращения с рекомбинантной ДНК. Затем,если нужно, нуклеиновая кислота может быть обработана для создания форм антитела согласно изобретению, как описано ниже. Для экспрессии рекомбинантного человеческого антитела, выделенного посредством скринирования комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонировали в рекомбинантный экспрессионный вектор и вводили в клетки-хозяева млекопитающих, как описано выше. Переключение классов Еще один аспект согласно данному изобретению предлагает способ преобразования класса или субкласса антитела против миостатина в другой класс или субкласс. В некоторых вариантах осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую VL или VH, которые не содержат последовательностей, кодирующих CL или CH, выделяют, применяя способы, хорошо известные в данной области. Затем молекула нуклеиновой кислоты физически сшивается с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей CL или CH желаемого класса или субкласса иммуноглобулина. Этого можно достигнуть, используя вектор или молекулу нуклеиновой кислоты, которые содержат цепь CL или CH, как описано ранее. Например, антитело против миостатина, которое первоначально было IgM, может изменить класс наIgG. Также, переключение класса может использоваться для превращения одного субкласса IgG в другой, например, IgG1 в IgG2. Еще один способ производства антитела согласно изобретению, включающего желаемый изотип, содержит стадии выделения нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела против миостатина, и нуклеиновой кислоты, кодирующей легкую цепь антитела против миостатина, выделение последовательности, кодирующей область VH, лигирование последовательности VH с последовательностью, кодирующей константный домен тяжелой цепи желаемого изотипа, экспрессию гена легкой цепи и конструкции тяжелой цепи в клетке и сбор антитела против миостатина с желаемым изотипом. Деиммунизированные антитела В еще одном аспекте согласно изобретению антитело может быть деиммунизировано для уменьшения его иммуногенности при применении способов, описанных, например, в публикациях РСТ No. WO 98/52976 и WO 00/34317 (включены в настоящее изобретение в виде ссылки). Мутантные антитела В еще одном варианте осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, векторы и клетки-хозяева могут использоваться для получения мутантных антител против миостатина. Данные антитела могут быть мутантными в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепей, например, для изменения связывающего свойства антитела. Например, мутация может быть получена в одном или более CDR-участках для увеличения или уменьшения KD антитела к миостатину, для увеличения или уменьшения koff или для изменения специфичности связывания с антителом. Способы сайт-направленного мутагенеза хорошо известны в данной области. См., например, Sambrook и др. и Ausubel и др., supra. В другом варианте осуществления созданы одна или более мутаций аминокислотного остатка, о котором известно, что он изменен в сравнении с исходной последовательностью в моноклональном антителе 11161, 11363,12571, 1461, 21121, 13141, 1661, 2431, 21771, 11321, 12681, 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141H-T92A; 1461H-L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121H-L81M, L-I85V или 21121H-L81M, L-F58I, I85V. Мутации могут быть получены в CDR-участке или каркасном участке вариабельного домена или в константном домене. В предпочтительном варианте осуществления мутации получены в вариабельном домене. В некоторых вариантах осуществления получены одна или несколько мутаций аминокислотного остатка, о котором известно, что он изменен в сравнении с исходной последовательностью в CDR-участке или каркасном- 24015534 участке вариабельного домена аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8,10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67,69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 или 87, или чья последовательность нуклеиновой кислоты присутствует вSEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52, 54, 56,58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 или 88. В другом варианте осуществления в каркасный участок введены мутации таким образом, что получающийся в результате каркасный участок (участки) имеет аминокислотную последовательность соответствующего исходного гена. Мутация может быть получена в каркасном участке или константном домене для увеличения времени полувыведения антитела против миостатина. См., например, публикацию РСТ No. WO 00/09560, включенную в настоящее изобретение в виде ссылки. Также мутация в каркасном участке или константном домене может быть создана для изменения иммуногенности антитела, чтобы предусмотреть сайт для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой, или для изменения таких свойств, как фиксация комплемента, FcR-связывание и антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC). В соответствии с данным изобретением отдельное антитело может иметь мутации в любом одном или нескольких CDR-участках или каркасных участках вариабельного домена или в константном домене. В некоторых вариантах осуществления существует от 1 до 8 аминокислотных мутаций, включая любое количество между ними, либо в домене VH, либо в домене VL мутантного антитела против миостатина в сравнении с антителом против миостатина до мутации. В любом из вышеуказанных вариантов мутации могут встречаться в одном или более CDR-участках. Кроме того, любая из мутаций может быть консервативной аминокислотной заменой. В некоторых вариантах осуществления существует не более чем 5, 4, 3, 2 или 1 аминокислотная замена в константных доменах. Модифицированные антитела В еще одном варианте осуществления может быть создано слитое антитело или иммуноадгезин, которые содержат целое антитело или часть антитела против миостатина согласно изобретению, связанное с другим полипептидом. В предпочтительном варианте осуществления только вариабельные домены антитела против миостатина связаны с полипептидом. В другом предпочтительном варианте осуществления домен VH антитела против миостатина соединен с первым полипептидом, тогда как домен VL антитела против миостатина соединен со вторым полипептидом, который связан с первым полипептидом таким образом, что домены VH и VL могут взаимодействовать друг с другом для образования антигенсвязывающего сайта. В еще одном предпочтительном воплощении домен VH отделен от домена VL посредством линкера, такого, что домены VH и VL могут взаимодействовать друг с другом (смотрите ниже под одноцепочечными антителами). Кроме того, антитело VH-линкер-VL связано с полипептидом, представляющим интерес. Дополнительно могут быть созданы слитые антитела, в которых два (или более) одноцепочечных антитела связаны одно с другим. Это является пригодным, когда специалист хочет создать дивалентное или поливалентное антитело на одной полипептидной цепи, или когда специалист хочет создать биспецифичное антитело. Для создания одноцепочечного антитела (scFv) фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL, физически связывают с другим фрагментом, кодирующим подвижный линкер, например, с кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3 (SEQ ID NO: 122), такую, что VH и VL последовательности можно экспрессировать как непрерывный одноцепочечный белок, с доменами VL и VH, объединенными подвижным линкером. См., например, Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). Одноцепочечное антитело может быть моновалентным, если используются только единственные VH и VL, бивалентным, если используются два VH и VL, или поливалентным, если используются более чем два VH и VL. Могут быть созданы биспецифичные или поливалентные антитела, которые специфически связываются с миостатином и еще одной молекулой. В других вариантах осуществления прочие модифицированные антитела могут быть приготовлены при применении антитела против миостатина, кодируемого молекулами нуклеиновой кислоты. Например, могут быть приготовлены "Каппа-тела" (III et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997, "Минитела" (MartinCancer (Suppl.) 7:51-52 (1992 при применении стандартных молекулярно-биологических технических приемов после обучения по данной спецификации. Биспецифичные антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены различными способами, включая слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов. См., например, SongsivilaiLachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Кроме того, биспецифичные антитела могут быть образованы в виде "димерных антител" или "Janusins". В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело связывается с двумя различными эпитопами миостатина. В других вариантах осуществления биспецифичное антитело имеет первую тяжелую цепь и первую легкую цепь моноклонального антитела 11161, 11363, 12571, 1461, 21121, 13141,1661, 24 31, 21771, 11321, 12681, 11161L-Q45K; 12571L-L21I; 13141H-T92A; 1461H- 25015534L81M; 21121H-I12V; 21121L-F58I; 21121L-I85V; 21121H-L81M, L-F58I; 21121H-L81M, LI85V или 21121H-L81M, L-F58I, I85V и дополнительную тяжелую цепь, и легкую цепь антитела. В некоторых вариантах осуществления дополнительная легкая цепь и тяжелая цепь также образуют одно из ранее идентифицированных моноклональных антител, но отличаются от первой тяжелой и легкой цепей. В некоторых вариантах осуществления модифицированные антитела, описанные ранее, получены при использовании одного или более вариабельных доменов или CDR-участков человеческого моноклонального антитела против миостатина, предлагаемого здесь. Преобразованные и меченые антитела Антитело против миостатина или антигенсвязывающая часть согласно изобретению может быть преобразовано или связано с еще одной молекулой (например, с другим пептидом или белком). Как правило, антитела или их части преобразуются так, что вследствие преобразования или мечения связывание миостатина не затрагивается неблагоприятным образом. Соответственно, подразумевается, что антитела и части антител согласно данному изобретению включают и интактную, и модифицированную формы человеческих антител против миостатина, описанных здесь. Например, антитело или часть антитела согласно изобретению могут быть функционально связаны (посредством химического спаривания, генетического слияния, нековалентного соединения или иначе) с одним или более другими молекулярными объектами, такими как другое антитело (например, биспецифичное антитело или димерное антитело),детектирующее вещество, фармацевтическое вещество и/или белок или пептид, который может опосредовать связь антитела или части антитела с еще одной молекулой (такой как активная часть стрептавидина или полигистидиновая метка). Один тип преобразованного антитела получается посредством сшивания двух или более антител(того же самого типа или других типов, например, чтобы создать биспецифичные антитела). Подходящие кросс-линкеры включают те, которые являются гетеробифункциональными, имеющими две отдельные реактивные группы, разделенные посредством подходящего спейсера (например, эфир ммалеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида) или гомобифункциональными (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры доступны в Pierce Chemical Company, Rockford, II. Еще один тип преобразованного антитела - это меченое антитело. Пригодные детектирующие вещества, с помощью которых антитело или антигенсвязывающая часть согласно изобретению могут быть преобразованы, включают флуоресцирующие соединения, включая флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталенсульфонилхлорид, фикоэритрин, лантаноидные люминесцирующие вещества и им подобные. Также антитело может быть мечено ферментами, пригодными для детекции, такими как пероксидаза хрена, -галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза, глюкозоксидаза и им подобными. Когда антитело помечено детектируемым ферментом, оно детектируется посредством добавления дополнительных реактивов, которые фермент использует для образования продукта реакции, который можно различить. Например, если присутствует реактив пероксидаза хрена, добавление перекиси водорода и диаминобензидина приводит к образованию детектируемого окрашенного продукта реакции. Также антитело может быть мечено биотином и детектироваться посредством непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина. Также антитело может быть мечено заранее определенным полипептидным эпитопом, распознаваемым вторичным репортером (например, парными последовательностями "лейциновой застежки", сайты связывания вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки). В некоторых вариантах осуществления метки прикрепляются посредством "ножек" различной длины, чтобы уменьшить потенциальную стерическую преграду. Также антитело против миостатина может быть преобразовано химической группой, такой как полиэтиленгликоль (PEG), метильной или этильной группой или углеводной группой. Эти группы пригодны для улучшения биологических характеристик антитела, например, для увеличения периода полужизни сыворотки. Фармацевтические композиции и наборы Данное изобретение также затрагивает композиции, содержащие человеческое антитело против миостатина со свойствами ингибиторов. Противодействующие антитела против миостатина согласно изобретению применимы для предотвращения или лечения широкого диапазона состояний и заболеваний, при которых желательно увеличить массу скелетной мышцы и/или кость. В некоторых случаях такие состояния и заболевания могут быть связаны с возрастом или с заболеванием. Противодействующее антитело против миостатина согласно данному изобретению может применяться для лечения, предотвращения или сдерживания связанной с возрастом потери мышечной массы и силы, включая мышечную атрофию, которая, например,является результатом постельного режима. Кроме того, противодействующее антитело против миостатина согласно изобретению пригодно для лечения или предотвращения потери мышечной массы при изнурительных заболеваниях или других заболеваниях или состояниях, связанных с потерей мышечной массы, включая, но не ограничиваясь этим,травму (включая травму мышцы, нерва и кости), ожоги, СПИД, рак, переломы бедра (особенно у пожилых людей), замену сустава, сильные ушибы колена, артрит, хроническую почечную недостаточность(CRF), закупорку сердечных сосудов (CHF) , хроническое обструктивное легочное заболевание (COPD),рассеянный склероз (MS), болезнь Паркинсона, хроническое критическое заболевание, повреждение центральной нервной системы (CNS), паралич, катехсию, синдром мышечной дистрофии, хирургию и повреждение сустава. Противодействующие антитела против миостатина согласно изобретению также пригодны для лечения метаболических состояний. Такие состояния включают сахарный диабет типа 2, метаболические синдромы, как например, синдром Х-хромосомы, устойчивость к инсулину, слабая переносимость глюкозы и ожирение. Кроме того, противодействующее антитело против миостатина согласно изобретению пригодно для лечения или предотвращения заболеваний, связанных с потерей кости, включая, но не ограничиваясь этим, связанные с возрастом или гормонами остеопороз, остеопению, остеоартрит и переломы при остеопорозе. Лечение может включать введение одного или более подавляющих моноклональных антител против миостатина согласно изобретению или их антигенсвязывающих фрагментов, одних или с фармацевтически приемлемым носителем. Подавляющие антитела против миостатина согласно изобретению и содержащие их композиции могут быть введены в комбинации с одним или более другими терапевтическими, диагностическими или профилактическими агентами. Дополнительные терапевтические агенты включают агенты против дистрофии (включая стероиды, такие как преднизон, дефлазакорт) и анаболические стероиды, альбутерол, пищевые добавки, как например креатин, и антибиотики, такие как гентамицин. Дополнительные терапевтические агенты также включают агенты против диабета, включая, но не ограничиваясь этим, метформин, сульфонилмочевину, инсулин, прамлинтид (SYMLIN), TZD, такие как росиглитазон (Avandia) и пиоглитазон (Actos), аналоги GLP-1, такие как эксенитид, и ингибиторыDPP-IV, такие как LAF237. Кроме того, дополнительные терапевтические агенты включают агенты против остеопороза включая, но неограничиваясь этим, бисфосфонаты, как например, алендронат(Fosamax) и ризедронат (Actonel), кальцитонин (Miacalcin), ралоксифен (Evista), гормональные агенты, такие как эстроген и паратиреоидный гормон. Такие дополнительные агенты могут быть включены в одну и ту же композицию или введены раздельно. Используемый здесь термин "фармацевтически приемлемый носитель" подразумевает любые и все растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и задерживающие абсорбцию агенты и им подобные, которые физиологически совместимы. Некоторые примеры фармацевтически приемлемых носителей составляют вода, соляной раствор, забуференный фосфатом соляной раствор, декстроза, глицерин,этанол и им подобные, а также их комбинации. Во многих случаях предпочтительно включить в композицию изотонические агенты, например сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Дополнительные примеры фармацевтически приемлемых субстанций представляют смачивающие агенты или незначительные количества вспомогательных субстанций, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность антител. Композиции этого изобретения могут быть в различных состояниях, например в жидком, полутвердом и твердом в дозированных формах, таких как жидкие растворы (например, впрыскиваемые и вливаемые растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от намеченного способа введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции - это композиции в форме впрыскиваемых или вливаемых растворов, такие как композиции, подобные используемым для пассивной иммунизации людей. Предпочтительным способом введения является парентеральный (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления антитело вводится посредством внутривенной инфузии или инъекции. В еще одном предпочтительном воплощении антитело вводится посредством внутримышечной или подкожной инъекции. Терапевтические композиции должны быть стерильным и стабильными в условиях производства и хранения. Данная композиция может быть разработана как раствор, микроэмульсия, дисперсия, липосома или другая упорядоченная структура, подходящая для высокой концентрации лекарственного препарата. Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены посредством объединения антитела против миостатина в необходимом количестве в соответствующем растворителе с одним ингредиентом или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизацией фильтрованием,если требуется. Как правило, дисперсии готовятся посредством введения активного соединения в стерильный растворитель, который включает основную дисперсионную среду и остальные необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае со стерильными порошками для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофильная сушка, которые дают порошкообразный активный ингредиент плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из раствора, стерилизованного ранее фильтрованием. Присущая раствору текучесть может поддерживаться, например, посредством использования оболочки, такой как лецитин,посредством поддержания необходимого размера частицы в случае с дисперсией и при применении по- 27015534 верхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть осуществлена посредством включения в композицию агента, который замедляет абсорбцию, например,моностеаратов и желатина. В одном варианте осуществления антитело вводится в композиции как стерильный водный раствор,имеющий рН, который колеблется в пределах от примерно 5,0 до примерно 6,5, и содержит от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 200 мг/мл антитела, от примерно 1 миллимоля до примерно 100 миллимолей гистидинового буфера, от приблизительно 0,01 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл полисорбата 80, от примерно 100 миллимолей до примерно 400 миллимолей трегалозы и от приблизительно 0,01 миллимолей до приблизительно 1,0 миллимолей динатрия EDTA дигидрата. Антитела согласно настоящему изобретению могут быть введены посредством различных способов, известных в данной области, хотя для многих случаев терапевтического применения предпочтительным местом/способом введения является подкожный, внутримышечный способ или внутривенная инфузия. Специалисты в данной области оценят по достоинству тот факт, что место и/или способ введения будут изменяться в зависимости от желаемых результатов. В определенных вариантах осуществления активное соединение композиции антитела может быть получено с носителем, который защитит антитело от быстрого высвобождения, как в композиции с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут применяться биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолиевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы приготовления таких композиций запатентованы или, как правило, известны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems(J. R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., New York, 1978). В определенных вариантах осуществления антитело против миостатина согласно изобретению может вводиться пероральным путем, например, с инертным разбавляющим веществом или усвояемым съедобным носителем. Состав (и прочие ингредиенты, если требуется) также может быть заключен в твердую или мягкую желатиновую капсулу, спрессован в таблетки или введен непосредственно в рацион субъекта. Для перорального терапевтического введения антитела против миостатина могут быть объединены с инертными наполнителями и использоваться в виде проглатываемых таблеток, рассасываемых таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, пластинок и им подобных. Для введения композиции согласно изобретению способом, отличным от парентерального, может быть необходимо нанести на состав покрытие или ввести состав совместно с веществом для предотвращения его инактивации. Дополнительные активные соединения также могут быть введены в композиции. В определенных вариантах осуществления подавляющее антитело против миостатина согласно изобретению рецептируется совместно и/или вводится совместно с одним или более дополнительными терапевтическими агентами. Эти агенты включают, без ограничения, антитела, которые связывают другие мишени, антинеопластические агенты, противоопухолевые агенты, химиотерапевтические агенты, аналоги пептидов, которые ингибируют миостатин, или антитела или другие молекулы, которые связываются с мембранными рецепторами типа II и предотвращают их связывание или активацию миостатином. Для таких видов комбинированной терапии могут быть необходимы более низкие дозировки подавляющих антител против миостатина, а также совместно вводимых агентов, чтобы таким образом уклониться от возможных токсичностей или сложностей, связанных с различными вариантами монотерапии. Подавляющие антитела против миостатина согласно данному изобретению и содержащие их композиции также могут быть введены в сочетании с другими терапевтическими режимами, в частности в комбинации с упражнениями и/или добавками к рациону (включая диетологические). В определенных вариантах осуществления подавляющее антитело против миостатина согласно изобретению рецептируется совместно и/или вводится совместно с одним или более дополнительными терапевтическими агентами, описанными supra. Эти агенты включают те, которые подавляют миостатин. Кроме того, такие виды комбинированной терапии также могут применяться для лечения, предотвращения или подавления любого из указанных заболеваний и состояний. Для таких комбинированных видов терапии необходимы более низкие дозировки подавляющих антител против миостатина, а также совместно вводимых агентов, чтобы таким образом уклониться от возможных токсичностей или сложностей,связанных с различными вариантами монотерапии. Композиции согласно изобретению могут содержать "терапевтически эффективное количество" или"профилактически эффективное количество" антитела или антигенсвязывающей части согласно изобретению. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение времени, необходимого для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или части антитела может изменяться в соответствии с факторами, такими как статус заболевания, возраст, пол и вес индивидуума, и в соответствии со способностью антитела или части антитела вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество - это количество, в котором терапевтические полезные эффекты превосходят любые токсические или нежелательные эффекты антитела или части антитела. "Профилактически эффективное количе- 28015534 ство" относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение времени, необходимого для достижения желаемого профилактического результата. Характерно, что, поскольку профилактическая доза применяется у людей до заболевания или на ранних стадиях заболевания, профилактически эффективное количество может быть меньше, чем терапевтически эффективное количество. Режим дозировки может быть скорректирован для обеспечения оптимального желаемого ответа(например, терапевтического или профилактического ответа). Например, может быть прописан единственный шарик, в течение времени может быть введено несколько отдельных доз или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, что указывается потребностью терапевтической ситуации. Особенно благоприятно рецептировать парентеральные композиции в дозированных единицах для легкого введения и единообразия дозировки. Дозированная форма, которая используется здесь, относится к физически обособленным единицам, применимым в качестве однократных доз для лечения млекопитающих; каждая единица, содержащая заранее определенное количество активного соединения, рассчитанного для получения желаемого терапевтического эффекта в связи с указанным фармацевтическим носителем. Спецификация для дозированных форм согласно данному изобретению продиктована и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик антитела против миостатина или его части и достигаемого специфического терапевтического или профилактического эффекта, и (b) от ограничений, неотъемлемых в области составления рецептуры такого антитела для лечения восприимчивости индивидуумов. Иллюстративный, не ограничивающий диапазон для терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или части антитела согласно изобретению составляет от 0,025 до 50 мг/кг,более предпочтительно от 0,1 до 50 мг/кг, более предпочтительно 0,1-25, от 0,1 до 10 или от 0,1 до 3 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит 5 мг/мл антитела в буфере: 20 мМ цитрата натрия, рН 5,5, 140 мМ NaCl и 0,2 мг/мл полисорбата 80. Стоит отметить, что значения дозировки могут меняться вместе с типом и серьезностью облегчаемого состояния. Кроме того, следует понимать, что для любого отдельного субъекта специфический режим дозировки должен быть скорректирован со временем в соответствии с индивидуальной потребностью и профессиональной оценкой лица,вводящего или наблюдающего за введением композиции, и что определенный здесь диапазон дозировки является только иллюстративным и не ограничивает область действия или применения заявленной композиции. Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет наборы, содержащие антитело против миостатина или антигенсвязывающую часть согласно изобретению, или композицию, содержащую такое антитело или его часть. Набор может включать, в дополнение к антителу или композиции, диагностические или терапевтические агенты. Набор также может содержать инструкции по применению в диагностической или терапевтической процедуре. В предпочтительном варианте осуществления данный набор включает антитело или содержащую его композицию и диагностическое вещество, которое может быть использовано в процедуре, описанной ниже. В другом предпочтительном воплощении данный набор включает антитело или содержащую его композицию и один или более терапевтических агентов, которые могут быть использованы в процедуре, описанной ниже. Эффективные диагностические методы В еще одном аспекте изобретение предлагает способы диагностики. Антитела против миостатина могут использоваться для обнаружения миостатина в биологическом образце in vitro или in vivo. Антитела против миостатина могут быть использованы в стандартном иммунологическом исследовании, включая, без ограничений, ELISA, RIA, проточную цитометрию, тканевую иммуногистохимию,вестерн-блот или иммунопреципитацию. Антитела против миостатина согласно изобретению могут быть применены, чтобы детектировать миостатин у людей. В еще одном варианте осуществления антитела против миостатина могут использоваться для обнаружения миостатина, например, у мышей, обезьян cynomolgus, крысы, собаки, перепела, цыпленка, индюка, свиньи и лошади. Данное изобретение предоставляет способ обнаружения миостатина в биологическом образце,включающий соприкосновение биологического образца с антителом против миостатина согласно изобретению и детекцию связанного антитела. В одном варианте осуществления антитело против миостатина непосредственно помечено детектируемой меткой. В другом варианте осуществления антитело против миостатина (первое антитело) не мечено, и второе антитело или другая молекула, которые могут связывать антитело против миостатина, помечены. Как хорошо известно любому специалисту в данной области, второе антитело выбрано таким образом, что оно способно специфически связываться с конкретными видами и классом первого антитела. Например, если антитело против миостатина представляет собой человеческий IgG, тогда вторичное антитело могло бы быть антителом против человеческого IgG. Другие молекулы, которые могут связываться с антителами, включают, без ограничения, Protein А и Protein G, оба доступные коммерчески, например, в Pierce Chemical Co. Подходящие метки для антитела или вторично антитела описаны ранее supra и включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцирующие вещества, люминесцирующие вещества и радиоактивные вещества. Примеры пригодных ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, -галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры пригодных комплексов простетической группы включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцирующих ве- 29