Моноклональное антитело к миостатину и способы его применения

(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ЭЛИ ЛИЛЛИ ЭНД КОМПАНИ (US) Заявлены варианты моноклонального антитела к миостатину (GDF-8), которые специфично связываются или распознают аминокислотную последовательность из зрелой формы миостатина. Антитела могут быть химерными или гуманизированными либо их фрагментами. Также предложена фармацевтическая композиция на основе указанных антител. Антитела по изобретению полезны для увеличения мышечной массы, повышения плотности костей или для лечения различных расстройств у млекопитающих. 014112 Область изобретения Данное изобретение относится к области медицины, конкретно - к области моноклональных антител против миостатина. Более конкретно, изобретение относится к нейтрализующим антимиостатиновым моноклональным антителам, которые связываются с новым эпитопом, идентифицированным на зрелой форме миостатина. Антитела по изобретению могут быть мышиными, химерными или гуманизированными антителами, иммуноконъюгатами антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Антитела по изобретению полезны для млекопитающих для увеличения мышечной массы, увеличения плотности костей или для лечения состояний, при которых присутствие миостатина вызывает или способствует нежелательному патологическому действию, или состояний, при которых снижение уровней миостатина способствует желательному терапевтическому действию. Уровень техники Члены суперсемейства белков трансформирующего фактора роста бета (TGF-) участвуют в развитии эмбриона и гомеостазе взрослой ткани. Члены суперсемейства TGF- разделяют общую структуру,которая включает короткую пептидную сигнальную последовательность, необходимую для секреции белка, и аминоконцевой фрагмент, который протеолитически отщепляется приблизительно через 105-140 аминокислот от карбоксильного конца большого белка-прекурсора ("пробелок") с образованием зрелого белка. Зрелый белок характеризуется в значительной мере сохранением остатков цистеина, тогда как активная форма белка представляет собой связанный дисульфидными связями димер зрелого белка(Gray, A., and Maston, A., Science, 247:1328, 1990). Обнаружено, что гетеродимеры членов суперсемейства TGF- также, по-видимому, обладают биологическими свойствами, отличными от гомодимеров. Миостатин, который также называют фактором-8 дифференциации роста (GDF-8), является членом суперсемейства TGF- белков. Миостатин экспрессируется главным образом в развивающих и взрослых скелетных мышцах и действует как отрицательный регулятор скелетной мышцы. Структура миостатина является в высокой степени константной у разных видов; аминокислотная последовательность зрелой формы миостатина у человека, мыши, крысы и коровы является идентичной на 100%. Иммуногенный эпитоп, идентифицированный в данном изобретении, является на 100% идентичным у человека, мыши,крысы, цыпленка, собаки, лошади, козы, овцы, коровы и свиньи. Фактор-11 дифференциации роста, который также называют GDF-11 или ВМР-11, является членом суперсемейства TGF- белков, которые являются наиболее гомологичными в отношении миостатина. Человеческий миостатин и GDF-11 являются на 90% идентичными на уровне аминокислот в рамках зрелой цепи. Патент США 5827833 раскрывает последовательность полинуклеотида и последовательность аминокислот человеческого миостатина, тогда как патент США 6096506 заявляет антитело, которое специфически реагирует с полипептидом GDF-8 или его эпитопом. Патентная заявка США 2003/0138422 заявляет антитело, которое специфически связывается с белком GDF-8, включающим конкретный пептид. Патент США 6468535 заявляет способ увеличения мышечной массы у животного путем введения антитела анти-GDF-8. Патент США 6368597 раскрывает применение антитела против GDF-8 для лечения диабета. В настоящее время существует ограниченное количество эффективных средств для лечения расстройств или состояний, которые могут выигрывать от увеличения мышечной массы и/или силы мышц, в том числе мышечная дистрофия, дряхлость, реанимационная миопатия и кахексия в результате рака или другие расстройства, которые включают, не ограничиваясь ими, ВИЧ-инфекцию, неотложные состояния и миопатии. Вследствие роли миостатина как отрицательного регулятора роста скелетных мышц он является желательной мишенью для терапевтического вмешательства при таких расстройствах. Существует большая терапевтическая потребность в средствах для специфического ингибирования активности миостатина при отсутствии ингибирования или минимальном ингибировании активности других белков суперсемейства TGF-. Существует также терапевтическая потребность в специфическом снижении уровня миостатина у пациента при отсутствии одновременного снижения уровня других белков суперсемейства TGF-. Конкретно, моноклональное антитело, специфически реагирующее с миостатином (например, специфически связывающее или распознающее миостатин или его часть) и значительно в меньшей степени реагирующее или не реагирующее с другими членами суперсемейства белков TGF- (например, GDF-11), может обеспечить особенно полезную терапию для увеличения мышечной массы и/или силы мышцы. Особенную терапевтическую ценность имеют химерные или гуманизированные формы такого моноклонального антитела. Структура и функция миостатина являются в высокой степени константными в различных видах; следовательно, такое антитело может быть полезным не только для лечения таких расстройств у человека, но также у других млекопитающих, включая, например, домашних животных (например, собака и кошка), спортивных животных (например, лошадь) и сельскохозяйственных животных (например, бык, свинья, птица и овца), особенно если каркасные и константные участки антитела в значительной мере происходят из видов животных, у которых антитело будет применяться в лечебных целях. Антимиостатиновые антитела по изобретению также могут быть полезны для лечения расстройств или состояний, когда пациенты получают пользу от снижения уровня миостатина, включая,не ограничиваясь ими, такие, где пациенты получают пользу от увеличения плотности костей (например,-1 014112 остеопороз), диабет II типа, метаболический синдром, остеоартрит, сепсис, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ) и расстройства, связанные с мышечным истощением, такие как заболевание почек, сердечная недостаточность или заболевание сердца и заболевание печени. Антимиостатиновые антитела по данному изобретению часто обладают преимуществами по сравнению с другими антимиостатиновыми антителами из уровня техники. Изобретение представляет нейтрализующие антимиостатиновые моноклональные антитела, способные связываться с полипептидом,состоящим из аминокислот с остатками 40-64 (например, SEQ ID NO: 46 для человеческого миостатина) зрелой формы миостатина, и нейтрализовать активность миостатина in vitro, in vivo или in situ. Поскольку члены семейства TGF- обладают высокой степенью гомологии (например, миостатин приблизительно на 90% гомологичен с GDF-11), антиомиостатиновые антитела, такие как раскрытые в настоящем изобретении, которые перекрестно не реагируют или минимально реагируют перекрестно с GDF-11, играющем важную роль в формировании скелета (McPherron, A., et al., Nature Genetics, 22:260-265, 1999), являются предпочтительными для терапевтического применения при сравнении с антителами, которые перекрестно реагируют с GDF-11 в более высокой степени. Краткое описание изобретения Антимиостатиновые моноклональные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты,которые специфично связываются или распознают полипептид, состоящий из аминокислот 40-64 зрелой формы миостатина из млекопитающего животного-источника, предпочтительно человека,ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA (SEQ ID NO: 46) или полипептида, состоящего из последовательности ANYCSGESEFVFLQKYPHTHLVHQA (SEQ ID NO: 43), описаны в данном изобретении. Такие антитела в данном описании называются "моноклональными антителами по изобретению" или "антителами по изобретению". Моноклональные антитела по изобретению могут быть мышиными, химерными или гуманизированными антителами, иммуноконъюгатами таких антител или их антигенсвязывающими фрагментами. Предпочтительно моноклональное антитело по изобретению существует в виде гомогенной или в значительной мере гомогенной популяции. Предпочтительно моноклональное антитело по изобретению связывает миостатин (пробелок зрелой формы или белок, мономерный или димерный) в домене, охватывающем аминокислоты/ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVHQA (SEQ ID NO: 46), и, таким образом, осуществляет антагонизм или нейтрализует in vitro, in vivo или in situ по крайней мере один вид биологической активности или свойство миостатина. Моноклональные антитела по изобретению преимущественно связываются или распознают миостатин в сравнении с GDF-11, членом суперсемейства TGF-, зрелая форма которого обладает приблизительно 90% гомологичностью аминокислот со зрелой формой миостатина. Предпочтительно указанные антитела связываются с миостатином с большим сродством или специфичностью, чем они связываются сGDF-11, что определяется, например, с помощью пробы ELISA, конкурентной пробы ELISA или значений KD пробы BIAcore (например, см. пример 4). Кроме того, моноклональные антитела по изобретению могут иметь более благоприятные значенияKon, Koff или Ka для миостатина в сравнении со связыванием GDF-11. Предпочтительно антитело по изобретению не реагирует перекрестно с GDF-11 или перекрестно реагирует с GDF-11 на уровне 5, 4, 3, 2,1% или меньше. В одном воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению включает вариабельный участок легкой цепи ("LCVR") полипептида с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 11. В другом воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению включает вариабельный участок тяжелой цепиSEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 и 17. В другом воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению включает полипептид HCVR с SEQ ID NO: 12 с заменой аминокислот 26-37 на SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54. Последовательности, связанные с каждым номером SEQ ID, показаны в табл. 1 и 2 и на фиг. 4 и 5 в данном описании. В другом воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению включает (а) полипептид LCVR с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, которая состоит изSEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 11; и (b) полипептид HCVR с последовательностью аминокислот, выбранной из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16 и 17, или полипептид HCVR сSEQ ID NO: 12 с заменой аминокислот 26-37 на SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54. Рассматривается антитело по изобретению, которое включает любую комбинацию описанных выше LCVR и HCVR полипептидов, но антитела, которые включают следующие комбинации LCVR и HCVR, являются предпочтительными:(xi) SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 12 с заменой аминокислот 26-37 на SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51,52, 53 или 54. В другом воплощении моноклональное антитело по изобретению является таким, которое может конкурировать за связывание с человеческим миостатином или частью человеческого миостатина с конкурирующим антителом, которое включает два полипептида с последовательностями, показанными в группе, состоящей из(xi) SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 12 с заменой аминокислот 26-37 на SEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51,52, 53 или 54. В другом воплощении LCVR антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению включает 1, 2 или 3 пептида, выбранных из группы, которая состоит из пептидов с последовательностью,показанной в SEQ ID NO: 38, 23 и 56 (см. табл. 1). Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 38, если присутствует в указанном антителе, находится в LCVR CDR1. Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 23, если присутствует в указанном антителе, находится в LCVR CDR2. Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной вSEQ ID NO: 56, если присутствует в указанном антителе, находится в LCVR CDR3. В другом воплощении HCVR антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению включает 1, 2 или 3 пептида, выбранных из группы, которая состоит из пептидов с последовательностью,показанной в SEQ ID NO: 55, 41 и 42 (см. табл. 2). Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 55, если присутствует в указанном антителе, находится в HCVR CDR1. Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 41, если присутствует в указанном антителе, находится в HCVR CDR2. Предпочтительно пептид с последовательностью, показанной вSEQ ID NO: 42, если присутствует в указанном антителе, находится в HCVR CDR3. В гуманизированном антителе для терапевтического применения у людей каркасная последовательность может быть в значительной мере человеческого происхождения. В антителе каркасная последовательность может в значительной мере происходить из генома животного, для которого предусмотрено терапевтическое применение. Антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению может дополнительно включать константный участок тяжелой цепи, выбранный из группы, которая состоит из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA,IgE, IgM и IgD. Антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению может дополнительно включать константный участок каппа или лямбда легкой цепи. Если антитело представляет собой такое,которое планируется применять как лечебное для человека, предпочтительно константный участок в значительной мере имеет человеческое происхождение. Если антитело представляет собой такое, которое планируется использовать в качестве терапевтического для животного, кроме человека, константный участок предпочтительно в значительной мере происходит из животного, для которого предусмотрено терапевтическое применение антитела. Антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению может включать или состоять из интактного антитела (т.е. с полной длиной), в значительной мере интактного антитела, фрагмента Fab,фрагмента F(ab')2 или одноцепочечного фрагмента Fv. В предпочтительном воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению представляет собой химерное антитело. В более предпочтительном воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело, где последовательность каркасной области и последовательность константного участка, присутствующие в антителе, в значительной мере имеют человеческое происхождение. Гуманизированное антитело предпочтительно представляет собой антитело полной длины. Альтернативно, каркасная область или ее часть и любой константный участок, присутствующие в антителе, могут в значительной мере происходить из генома животного, для которого предусмотрено терапевтическое применение антитела, например домашние-3 014112 животные (например, собака, кошка), спортивные животные (например, лошадь) и сельскохозяйственные животные (например, бык, свинья, птица и овца). В другом воплощении изобретение обеспечивает выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает нуклеиновую кислоту, кодирующую LCVR антитела по изобретению, HCVR антитела по изобретению или антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению. Примерный полинуклеотид, кодирующий LCVR по изобретению, имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 44. Примерный полинуклеотид, кодирующий HCVR по изобретению, имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 45. В другом воплощении изобретение обеспечивает вектор, предпочтительно (не ограничиваясь ими) плазмиду, рекомбинатный вектор экспрессии, дрожжевой вектор экспрессии или ретровирусный вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, который кодирует антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению. Альтернативно, вектор по изобретению включает полинуклеотид, кодирующийLCVR, и/или полинуклеотид, кодирующий HCVR по изобретению. Когда обе последовательности, кодирующие LCVR и HCVR, присутствуют в одном и том же векторе, они могут быть транскрибированы от одного промотора, с которым они функционально связаны, или они могут быть транскрибированы независимо, каждая от отдельного промотора, с которым она функционально связана. Если последовательности, кодирующие LCVR и HCVR, присутствуют в одном векторе и транскрибированы от одного промотора, с которым они функционально связаны, LCVR может находиться в положении 5' по отношениюHCVR или LCVR может находиться в положении 3' по отношению HCVR, кроме того, участок, кодирующий LCVR и HCVR в векторе, может быть отделен последовательностью линкера любого размера или содержания; предпочтительно такой линкер, если он присутствует, представляет собой полинуклеотид, кодирующий внутренний сайт входа в рибосому. В другом воплощении изобретение обеспечивает клетку-хозяин, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Предпочтительно клетка-хозяин по изобретению включает один или больше векторов или конструктов, которые включают молекулу нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Клетка-хозяин по изобретению представляет собой клетку, в которую введен вектор по изобретению (например, путем трансформации, трансдукции, инфицирования), причем указанный вектор включает полинуклеотид, кодирующий LCVR антитела по изобретению, и/или полинуклеотид,кодирующий HCVR по изобретению. Изобретение также обеспечивает клетку-хозяин, в которую введены два вектора по изобретению; один включает полинуклеотид, кодирующий LCVR антитела по изобретению, и один включает полинуклеотид, кодирующий HCVR, присутствующий в антителе по изобретению, и каждый из них функционально связан с последовательностью промотора. Типы клеток-хозяева включают клетки млекопитающих, бактерий, растений и дрожжей. Предпочтительно клетка-хозяин представляет собой клетку СНО, клетку COS, клетку SP2/0, клеткуNS0, дрожжевую клетку или производное или потомство любого предпочтительного вида клеток. В другом воплощении изобретение обеспечивает способ приготовления антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению, включающий поддержание клетки-хозяина по изобретению (т.е. клетка-хозяин трансформирована, трансдуцирована или инфицирована вектором (или векторами) по изобретению) в условиях, подходящих для экспрессии моноклонального антитела по изобретению, посредством чего такое антитело экспрессируется. Способ может дополнительно включать стадию выделения моноклонального антитела по изобретению из клетки или предпочтительно из среды культивирования,где выращена указанная клетка. Изобретение воплощает процесс производства антитела по изобретению путем инъекционного введения животному, кроме человека, предпочтительно грызуну, более предпочтительно мыши (i) иммуногенного пептида, состоящего из пептида с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 46 или 43; или (ii) иммуногенного пептида, состоящего из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8,7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 46 или 43,предпочтительно указанный иммуногенный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд выбраны из группы, которая состоит из аминокислот с номерами остатков 46, 49, 50, 52 и 62 зрелого миостатина, где аминокислота с указанным номером остатка отличается от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении GDF-11 (см. фиг. 3); или (iii) иммуногенного пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего; или (iv) иммуногенного пептида, состоящего из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12,11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего; предпочтительно указанный иммуногенный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд представляют собой аминокислоты, которые отличаются от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положенииGDF-11 в том же млекопитающем. Антимиостатиновые моноклональные антитела производятся иммунизированными животными с применением любого способа, известного из уровня техники, предпочтительно путем синтеза гибридомы. Антимиостатиновые моноклональные антитела подвергают скринингу любым методом, доступным из уровня техники (например, фаговый дисплей, рибосомальный дисплей,дрожжевой дисплей, бактериальный дисплей, проба ELISA), на предмет связывания со зрелым миоста-4 014112 тином или его частью, включающей иммуногенный пептид, или с иммуногенным пептидом. Антимиостатиновые поликлональные антитела необязательно подвергают скринингу любым методом, доступным из уровня техники для связывания со зрелым GDF-11 или его частью. Отобраны антимиостатиновые моноклональные антитела, которые специфично или преимущественно связываются с миостатином по сравнению с GDF-11. Изобретение далее воплощает моноклональное антитело, приготовленное с помощью такого процесса. Предпочтительно указанное моноклональное антитело связывается с миостатином по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз больше, чем оно связывается с GDF-11; более предпочтительно по меньшей мере в 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,550 или 600 раз больше, чем оно связывается с GDF-11, что определяют по методу, известному специалисту в данной области из уровня техники, например, с помощью пробы ELISA, конкурентной пробыELISA или значений KD в пробе BIAcore. Наиболее предпочтительно моноклональные антитела не связываются с GDF-11 выше фоновых уровней в любой пробе связывания, доступной из уровня техники. Изобретение также воплощает способ получения антитела по изобретению путем инъекционного введения животному, кроме человека, предпочтительно грызуну, более предпочтительно мыши (i) иммуногенного пептида, включающего последовательность, показанную в SEQ ID NO: 46 или 43; или (ii) иммуногенного пептида, включающего 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из последовательности, показанной в SEQ ID NO: 46 или 43,предпочтительно указанный иммуногенный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд выбраны из группы, которая состоит из аминокислот с номерами остатков 46, 49, 50, 52 и 62 зрелого миостатина, где аминокислота с указанным номером остатка отличается от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении GDF-11 (см. фиг. 3); или (iii) иммуногенного пептида, включающего аминокислоты в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего; или (iv) иммуногенного пептида, включающего 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13,12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего, предпочтительно указанный иммуногенный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд представляют собой аминокислоты, которые отличаются от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положенииGDF-11 в том же млекопитающем. Антимиостатиновые моноклональные антитела производятся с использованием иммунизированных животных с применением любого способа, известного из уровня техники, предпочтительно путем синтеза гибридомы. Антимиостатиновые моноклональные антитела подвергают скринингу любым способом,доступным из уровня техники (например, фаговый дисплей, рибосомальный дисплей, дрожжевой дисплей, бактериальный дисплей, проба ELISA) для связывания с (i) антигенным пептидом, состоящим из последовательности, показанной в SEQ ID NO: 46 или 43; или (ii) антигенного пептида, состоящего из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из последовательности, показанной в SEQ ID NO: 46 или 43, предпочтительно указанный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд выбраны из группы, которая состоит из аминокислот с номерами остатков 46, 49, 50, 52 и 62 зрелого миостатина, где аминокислота с указанным номером остатка отличается от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении GDF-11 (см. фиг. 3); или (iii) антигенного пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего; или (iv) антигенного пептида,состоящего из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего, предпочтительно указанный иммуногенный пептид охватывает остатки аминокислот, где 1, 2,3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд представляют собой аминокислоты, которые отличаются от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении GDF-11 в том же млекопитающем. Антимиостатиновые поликлональные антитела необязательно подвергают скринингу любым способом, доступным из уровня техники, на предмет связывания со зрелым GDF-11 или его частью. Отбирают антимиостатиновые моноклональные антитела, которые специфично или преимущественно связываются с миостатином по сравнению с GDF-11. Изобретение далее воплощает моноклональное антитело, приготовленное с помощью такого процесса. Предпочтительно указанное моноклональное антитело связывается с миостатином по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз больше, чем оно связывается с GDF-11; более предпочтительно по меньшей мере в 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,550 или 600 раз больше, чем оно связывается с GDF-11, что определяют по методу, известному специалисту в данной области из уровня техники, например, с помощью пробы ELISA, конкурентной пробыELISA или значений KD в пробе BIAcore. Наиболее предпочтительно моноклональные антитела не связываются с GDF-11 выше фоновых уровней в любой пробе связывания, доступной из уровня техники. Считается, что указанное антитело, изготовленное с помощью любого процесса по изобретению,может быть далее изменено в химерное антитело, где по меньшей мере часть каркаса и/или константного участка происходит из млекопитающего, отличного от того, которое иммунизировали для создания моноклонального антитела и которое все еще охватывают рамками изобретения. Антитела по изобретению-5 014112 могут быть гуманизированы, т.е. мышиные участки CDR существуют внутри в значительной мере человеческого каркасного участка и константный участок, до той степени, в которой он присутствует в антителе, также в значительной мере имеет человеческое происхождение. Антитела по изобретению могут быть такими, что мышиные участки CDR существуют внутри каркасной области и константный участок(до той степени, в которой он присутствует в антителе) происходит из последовательности зародышевой линии животного, где антитело представляет собой такое, которое используется терапевтически. В данном описании рассматриваются различные формы антител по изобретению. Например, антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению может быть антителом с полной длиной (например, содержащим константный участок иммуноглобулина) или фрагментом антитела (например,F(ab')2). Понятно, что все такие формы антител охватываются в данном описании в рамках термина "антитело". Кроме того, антитело может быть помечено меткой, которая поддается обнаружению, иммобилизировано на твердой фазе и/или конъюгировано с гетерологичным соединением (например, фермент или токсин) в соответствии со способами, известными из уровня техники. Рассматривается диагностическое применение моноклональных антител по изобретению. В одном виде диагностического применения изобретение обеспечивает способ определения присутствия белка миостатина, который включает контакт исследуемого образца, где предполагается наличие белка миостатина, с антимиостатиновым антителом по изобретению и определение специфического связывания антитела с образцом. Антимиостатиновое антитело по изобретению может использоваться для определения уровней миостатина в исследуемых образцах путем сравнения значений исследуемого образца со стандартной кривой, полученной связыванием указанного антитела с образцами, содержащими известные количества миостатина. Изобретение далее обеспечивает набор, включающий антитело по изобретению, и предпочтительно инструкции по применению антитела для обнаружения белка миостатина, например, в исследуемом образце. В другом воплощении изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, которая включает антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению. Фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. В указанной фармацевтической композиции антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению представляет собой активный ингредиент. Предпочтительно фармацевтическая композиция включает гомогенную или в значительной степени гетерогенную популяцию антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению. Композиция для терапевтического применения является стерильной и может быть лиофилизирована. Изобретение обеспечивает способ ингибирования активности миостатина у млекопитающего, предпочтительно человека, нуждающегося в этом, который включает введение терапевтически эффективного количества или профилактически эффективного количества антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению указанному млекопитающему. Изобретение далее обеспечивает способ лечения или профилактики заболевания или уменьшения расстройства путем ингибирования преобразования сигнала в результате связывания миостатина с его рецептором, который включает введение пациенту (например,человек), нуждающемуся в таком лечении или профилактике, терапевтически или профилактически эффективного количества моноклонального антитела по изобретению. В данном описании "лечение или профилактика" относится к расстройству или заболеванию, связанному с аномальными уровнями миостатина, или такому, при котором пациент получает пользу от ингибирования активности миостатина, или такому, при котором пациент получает пользу от изменения существующего уровня миостатина. Заболевания или расстройства, которые лечат или предупреждают антителом по изобретению, включают, не ограничиваясь ими, дряхлость, кахексию, возрастную саркопению, мышечное истощение, миопатию, мышечную дистрофию, остеопороз, ожирение, ХОЗЛ, почечную недостаточность или заболевание почек, печеночную недостаточность или заболевание печени, сердечную недостаточность или заболевание сердца, метаболический синдром и диабет II типа. Изобретение далее обеспечивает способ увеличения мышечной массы, повышения мышечной силы и повышение плотности костей у млекопитающего, предпочтительно человека, которое нуждается в этом, путем введения терапевтически эффективного количества антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению. Изобретение воплощает антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению для применения при получении лекарственного средства для введения млекопитающему, предпочтительно человеку, для лечения, например, дряхлости, кахексии, возрастной саркопении, мышечного истощения, миопатии, мышечной дистрофии, остеопороза, ожирения, ХОЗЛ, почечной недостаточности или заболевания почек, печеночной недостаточности или заболевания печени, сердечной недостаточности или заболевания сердца, метаболического синдрома и диабета II типа у млекопитающего, предпочтительно человека,которое нуждается в этом, путем введения указанному млекопитающему терапевтически эффективного или профилактически эффективного количества антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению.-6 014112 Изобретение воплощает промышленное изделие, включающее упаковочный материал и антитело по изобретению, которое содержится в указанном упаковочном материале, и где упаковочный материал включает листок-вкладыш, в котором указано, что антитело специфично нейтрализует активность миостатина или снижает уровень миостатина. В листке-вкладыше, который вкладывают в упаковку, необязательно дополнительно указано, что антитело преимущественно нейтрализует активность миостатина в сравнении с активностью GDF-11 или преимущественно снижает уровень миостатина в сравнении со снижением уровня GDF-11 путем преимущественного связывания с миостатином в сравнении со связыванием с GDF-11. Таблица 1 Последовательности вариабельного участка CDR легкой цепи (LCVR) Х 29 представляет собой гидрофобную аминокислоту, Х 30 представляет собой-7 014112 Таблица 2 Последовательности вариабельного участка CDR тяжелой цепи (HCVR) Краткое описание чертежей Фиг. 1 показывает последовательность аминокислот человеческого промиостатина с подчеркнутой сигнальной последовательностью и выделенной полужирным шрифтом частью белка на карбоксильном конце, которая образует мономер зрелой формы миостатина. Фиг. 2 показывает последовательность аминокислот зрелого миостатина человека. Подчеркнут антигенный эпитоп по данному изобретению. Фиг. 3 показывает выравнивание последовательности аминокислот зрелой формы человеческого миостатина и человеческого GDF-11 с подчеркнутым антигенным эпитопом по данному изобретению,полужирным шрифтом показаны остатки в пределах антигенного эпитопа, которые различаются между миостатином и GDF-11. Символ (+) указывает на консервативные различия аминокислот между миостатином и GDF-11 в обозначенном положении, тогда как символ (-) указывает на не консервативное различие аминокислот между миостатином и GDF-11 в данном положении. Фиг. 4 показывает выравнивание Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 и 15 с доменами CDR LCVR, обозначенными полужирным шрифтом. Символуказывает на остаток аминокислоты, где присутствуют вариации между различными Fab.-8 014112 Фиг. 5 показывает выравнивание Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 и 15 HCVR с доменами CDR, обозначенными полужирным начертанием. Символуказывает на остаток аминокислоты, где присутствуют вариации между различными Fab. Подробное описание изобретения Данное изобретение относится к моноклональным антителам или их функциональным фрагментам(например, антигенсвязывающий фрагмент), которые специфично связываются с миостатином млекопитающих или его частью. Антигенный эпитоп, с которым связываются моноклональные антитела по изобретению, расположен в пределах остатков 40-64 зрелого миостатина. В одном воплощении моноклональное антитело по изобретению блокирует связывание с лигандом (например, рецептор миостатина),миостатином или ингибирует биологическую активность миостатина. Антитела по изобретению специфично связываются со зрелым миостатином или его частью со сродством по меньшей мере около 110-7 М, предпочтительно со сродством по меньшей мере около 910-8 или 710-8 М и более предпочтительно по меньшей мере около 510-8 М. Предпочтительно антитела по изобретению не связываются с GDF-11 на уровне выше фоновых уровней любой стандартной пробы связывания, известной из уровня техники. В одном воплощении антитела по изобретению демонстрируют ингибирование биологической активности миостатина in vitro или in vivo при концентрации менее чем 150 мкг/мл, предпочтительно менее чем 100 мкг/мл, более предпочтительно менее чем 90, 80,70, 60 или 50 мкг/мл, даже более предпочтительно менее чем около 20 мкг/мл, и даже более предпочтительно менее чем около 2 или 0,2 или 0,02 мкг/мл. В данном описании термин "зрелый миостатин" может означать мономерную или димерную форму,предпочтительно гомодимерную, белка, полученного протеолитическим расщеплением пробелковой формы миостатина. Антитело полной длины, которое встречается в природе, представляет собой молекулу иммуноглобулина, включающую четыре пептидные цепи, две тяжелые (Н) цепи (около 50-70 кДа при наличии полной длины) и две легкие (L) цепи (около 25 кДа при наличии полной длины), связанные между собой дисульфидными связями. Аминоконцевой участок каждой цепи включает вариабельный участок длиной около 100-110 или больше аминокислот, который в основном ответственен за распознавание антигена. Карбоксильный константный участок каждой цепи определяет константный участок, который в основном ответственен за эффекторную функцию. Легкие цепи классифицируются как каппа или лямбда и характеризуются специфическим константным участком. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или ипсилон и определяют изотип антитела как IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. Каждый вид тяжелой цепи характеризуется конкретным константным участком. Каждая тяжелая цепь включает вариабельный участок тяжелой цепи (в данном описании "HCVR") и константный участок тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи включает три домена (CH1,CH2 и СН 3) для IgG, IgD и IgA и 4 домена (CH1, CH2, СН 3 и СН 4) для IgM и IgE. Каждая легкая цепь включает вариабельный участок легкой цепи (в данном описании "LCVR") и константный участок легкой цепи. Константный участок легкой цепи включает один домен CL. Участки HCVR и LCVR могут дополнительно подразделяться на участки гиперизменчивости, которые называют определяющими комплементарность участками (CDR), перемежающиеся с более консервативными участками, которые называют каркасными областями (FR). Каждый HCVR и LCVR состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных в направлении от аминного конца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1, CDR1,FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Назначение аминокислот в каждом домене соответствует хорошо известным соглашениям [например, Kabat, "Sequences of proteins of Immunological Interest," National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991) или схема нумерации Chothia, которая описана в Al-Lazikani et al., J. Mol.Biol. 273:927-948, 1997, см. также интернет-сайт http:www.rubic.rdg.ас.uk/andrew/bioinf.org/abs]. Функциональная способность антитела связываться с конкретным антигеном коллективно определяется шестью CDR. Однако даже один изменчивый домен, содержащий только три CDR, специфичных для антигена, может обладать способностью распознавать антиген и связываться с ним, хотя и с более низким сродством, чем полный Fab. Термин "антитело" для обозначения антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению (или просто "моноклональное антитело по изобретению") в данном описании означает моноклональное антитело. "Моноклональное антитело" в данном описании обозначает антитело грызуна, предпочтительно мыши, химерное антитело, приматизированное антитело или гуманизированное антитело. Моноклональные антитела по изобретению могут быть получены с использованием, например, техник гибридомы, хорошо известных из уровня техники, а также с помощью рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или сочетания таких технологий, хорошо известных из уровня техники.-9 014112 Термин "моноклональное антитело" в данном описании не ограничивается антителами, произведенными по технологии гибридомы. "Моноклональное антитело" означает антитело, полученное из одной копии или клона, включая, например, любой эукариотный, прокариотный или фаговый клон, а не способ, по которому оно произведено. "Моноклональное антитело" может быть интактным (полным или с полной длиной) антителом, в значительной мере интактным антителом или частью либо фрагментом антитела, который включает антигенсвязывающую часть, например фрагмент Fab, фрагмент Fab' или фрагмент F(ab')2 мышиного антитела, или химерного антитела, или гуманизированного антитела. В данном описании термины "антигенсвязывающая часть", или "антигенсвязывающий участок",или "антигенсвязывающий домен" используются взаимозаменяемым образом для обозначения той части молекулы антитела, которая содержит аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и обеспечивающие антителу специфичность и сродство к антигену. Часть антитела включает "каркасные" остатки аминокислот, необходимые для сохранения правильной конформации антигенсвязывающих остатков. Предпочтительно CDR антигенсвязывающего участка антител по изобретению будут иметь мышиное происхождение. В других воплощениях антигенсвязывающий участок может происходить из других видов, кроме человека, в том числе, не ограничиваясь ими, кролика, крысы или хомяка. Кроме того, термин "моноклональное антитело" в данном описании может означать одноцепочечный фрагмент Fv, который может быть создан для соединения ДНК, кодирующей LCVR и HCVR, с последовательностью линкер (см. Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburgand Moore eds., Springer-Verlag, New York, p. 269-315, 1994). Следует понимать, что независимо от того,указаны или нет фрагменты, термин "антитело" в данном описании включает такие фрагменты, а также одноцепочечные формы. До тех пор пока белок сохраняет способность специфично или преимущественно связываться с целевой мишенью (т.е. эпитопом или антигеном), он охватывается термином "антитело". Антитела могут быть или не быть гликозилированными и все еще включены в рамки изобретения. Популяция "моноклональных антител" означает гомогенную или в значительной мере гомогенную (или чистую) популяцию антител (т.е. по меньшей мере около 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96%, более предпочтительно по меньшей мере около 97 или 98% или наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% антител в популяции являются идентичными и в пробе ELISA будут конкурировать за связывание с одним и тем же антигеном или эпитопом). Термины "специфично связывается" или "преимущественно связывается" в данном описании означают ситуацию, в которой один член специфически связывающейся пары не связывается в значительной мере с другими молекулами, кроме специфичного партнера(ов) по связыванию. Термин также применяется, если, например, антигенсвязывающий домен антитела по изобретению является специфичным для конкретного эпитопа, который несут на себе различные антигены, и в этом случае специфичное антитело, несущее антигенсвязывающий домен, будет способно связываться с различными антигенами, несущими эпитоп. Соответственно моноклональное тело по изобретению специфично связывается и/или преимущественно связывается с миостатином и в то же время не связывается специфично или преимущественно с GDF-11. В одном воплощении моноклональное антитело по изобретению обладает менее чем 20% перекрестной реактивности (более предпочтительно 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1% перекрестной реактивности) с немиостатиновым белком или пептидом (таким как, например, GDF11) или белком, который не включает 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд последовательности, показанной в SEQ ID NO: 46 или 43 по стандартной методике уровня техники, такой как проба ELISA, конкурентная проба ELISA или значения KD, измеренные в пробе BIAcore. Предпочтительно антитело по изобретению связывается с миостатином по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60,70, 80, 90 или 100 раз больше, чем оно связывается с GDF-11; более предпочтительно по меньшей мере в 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 раз больше, чем оно связывается с GDF-11, что определяют, например, конкурентной пробой ELISA или пробой BIAcore. Наиболее предпочтительно антитела по изобретению не связываются с GDF-11 на уровне, более высоком, чем базовые уровни любой пробы связывания, доступной из уровня техники. Моноклональное антитело по изобретению может связываться с мономерной или димерной формой миостатина или его частью. Фразы биологическое свойство" или "биологическая характеристика" или термины "активность" или "биологическая активность" ("биоактивность") для обозначения антитела по данному изобретению в данном описании применяются взаимозаменяемым образом и включают, не ограничиваясь ими, сродство и специфичность в отношении эпитопа/антигена (например, связывание антимиостатинового моноклонального антитела с миостатином или пептидом, состоящим из последовательности, показанной вSEQ ID NO: 46 или 43), способность к антагонизму в отношении активности миостатина in vivo, in vitro,или in situ, стабильность антитела in vivo и иммуногенные свойства антитела. Другие биологические свойства или характеристики антитела, которые поддаются определению, признанные в уровне техники,включают, например, перекрестную реактивность (т.е. с нечеловеческими гомологами целевого пептида или с другими белками или тканями в общем) и способность сохранять высокие уровни экспрессии белка- 10014112 в клетках млекопитающих. Вышеуказанные свойства или характеристики могут наблюдаться или быть измерены или оценены с использованием признанных в уровне техники методик, которые включают, не ограничиваясь ими, пробу ELISA, конкурентную пробу ELISA, анализ резонанса поверхности плазмонаBIAcore, пробы нейтрализации in vitro и in vivo без ограничений, связывания рецептора, выработки и/или секреции цитокина или фактора роста, развитие анимального полюса Xenopus, преобразование сигнала и иммуногистохимию с секциями ткани из разных источников, включая человека, примата, или любой другой источник, который может потребоваться. Термин "ингибировать" или "нейтрализовать" в данном описании, если он используется для обозначения активности антитела по изобретению, обозначает способность в значительной мере осуществлять антагонизм, запрещать, предупреждать, ограничивать, замедлять, разрушать, устранять, останавливать или обращать, например, прогресс или выраженность того явления, которое подлежит ингибированию, в том числе, не ограничиваясь ими, биологическую активность или свойство, заболевание или состояние. Термин "изолированный" ("выделенный"), если он используется для обозначения нуклеиновой кислоты или белка (например, антитела), означает последовательность нуклеиновой кислоты или белок,который идентифицирован и отделен по меньшей мере от одного загрязняющего компонента, который обычно сопровождает его в природном источнике. Предпочтительно "изолированное антитело" ("выделенное антитело") представляет собой антитело, которое является в значительной мере свободным от других антител, обладающих другими видами антигенной специфичности (например, фармацевтические композиции по изобретению включают выделенное антитело, которое специфично связывается с миостатином и является в значительной мере свободным от антител, которые специфично связываются с другими антигенами, кроме миостатина). Термины "нумерация Rabat" и "маркировка Kabat" в данном описании используются взаимозаменяемым образом. Эти термины, которые приняты в уровне техники, обозначают систему нумерации аминокислотных остатков, которые являются более изменчивыми (например, гиперизменчивыми), чем другие аминокислотные остатки в изменчивых участках тяжелой и легкой цепи антитела (Kabat, et al.,Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Kabat, et al., Sequences of proteins of Immunological Interest, FifthEdition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication,91-3242 (1991. Полинуклеотид "функционально связан", если он размещен в функциональном взаимодействии с другим полинуклеотидом. Например, промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности. Термины "особь", "субъект" или "пациент" в данном описании используются взаимозаменяемым образом и обозначают млекопитающих, в том числе, не ограничиваясь ими, мышей, обезьян, людей,сельскохозяйственных млекопитающих животных, спортивных млекопитающих животных и домашних млекопитающих животных; предпочтительно термин обозначает людей. Термин "вектор" включает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана, в том числе, не ограничиваясь ими, плазмиды и вирусные векторы. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены, в то время как другие векторы при введении в клетку-хозяина могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы называют "рекомбинантными векторами экспрессии" (или просто "векторами экспрессии"), и примеры таких векторов хорошо известны из уровня техники. Термин "клетка-хозяин" включает отдельную клетку или культуру клеток, которая является реципиентом любого выделенного нуклеотида по изобретению или любого рекомбинантного вектора(ов),включающего HCVR, LCVR или моноклональное антитело по изобретению. Клетки-хозяева включают потомство одиночной клетки-хозяина, и потомство не обязательно должно быть полностью идентичным(с точки зрения морфологии и полной комплементарности ДНК) исходной оригинальной родительской клетке из-за природной случайной мутации или мутации высвобождения и/или изменения. Клеткахозяин включает трансформированные, трансдуцированные или инфицированные in vivo, in situ или invitro рекомбинантные векторы или полинуклеотиды, экспрессирующие моноклональное антитело по изобретению или легкой цепи, или тяжелой цепи. Клетка-хозяин, которая включает рекомбинантный вектор по изобретению (стабильно инкорпорированного в хромосому хозяина или нет), также может обозначаться как "рекомбинантная клетка-хозяин". Предпочтительные клетки-хозяева для использования в изобретении представляют собой клетки СНО (например, АТСС CRL-9096), клетки NS0, клетки SP2/0 и клетки COS (АТСС, например, CRL-1650, CRL-1651), HeLa (АТСС CCL-2). Дополнительные клеткихозяева для использования в изобретении включают клетки растений, дрожжевые клетки, другие клетки млекопитающих и прокариотические клетки.- 11014112 Данное изобретение относится к выделенным, моноклональным антителам, которые связываются со зрелой формой миостатина, охватывающего аминокислоты 40-64. Кроме того, антитела по изобретению нейтрализуют биологическую активность миостатина in vivo, in vitro или in situ. Специфичное связывание антимиостатиновых моноклональных антител по изобретению (включая их антигенсвязывающие части и гуманизированные моноклональные антитела с подобной специфичностью) с миостатином позволяет использовать указанные антитела в качестве терапевтических или профилактических средств при связанных с миостатином заболеваниях и расстройствах, т.е. заболеваниях или расстройствах, при которых пациент получает пользу от снижения уровней миостатина или ингибирования биологической активности миостатина. Эпитоп, с которым связываются антитела по изобретению ("эпитоп миостатина по изобретению"),расположен в пределах пептида, охватывающего аминокислоты 40 и 64 зрелого миостатина любого вида млекопитающих, предпочтительно человека. Антитела, которые связываются с указанным эпитопом,специфично или преимущественно связываются с миостатином в сравнении с их связыванием с GDF-11. Термин "эпитоп" обозначает часть молекулы, способной к распознаванию и связыванию с антителом в одном или более антигенсвязывающих участков антитела. Эпитопы часто состоят из химически активной поверхностной группы молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи сахаров, и обладают специфическими трехмерными структурными характеристиками, такими как специфические характеристики заряда. Термины "ингибируюший эпитоп" и/или "нейтрализующий эпитоп" предназначены для обозначения эпитопа, который в контексте интактной молекулы (в данном случае миостатина) и при связывании с антителом приводит к утрате или снижению биологической активности молекулы или содержащего ее организма in vivo, in vitro или in situ. Термин "эпитоп" в данном описании дополнительно относится к части пептида, обладающего антигенной и/или иммуногенной активностью у животного, предпочтительно млекопитающего, например мыши или человека. Термин "антигенный эпитоп" в данном описании определяется как часть пептида, с которой может специфично связываться антитело, что определяют с помощью любого метода, хорошо известного из уровня техники, например с помощью традиционных иммунопроб. Антигенные эпитопы не обязательно должны быть иммуногенными, но могут быть иммуногенными."Иммуногенный эпитоп" в данном описании определяется как часть пептида, которая вызывает иммунный ответ в виде антител у животного, что определяют по способу, известному из уровня техники(см., например, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983. Антигенный эпитоп человеческого миостатина данного изобретения имеет последовательность аминокислот, которая показана вSEQ ID NO: 43 и 46. Антигенный эпитоп миостатина данного изобретения для любого вида млекопитающих существует в рамках пептида, состоящего из аминокислот 40-64 зрелой формы миостатина. Антимиостатиновые моноклональные антитела по изобретению связываются с антигенным эпитопом, расположение которого обнаружено в области аминокислот 40-64 зрелого миостатина. Иммуногенный и/или антигенный эпитоп миостатина по изобретению состоит из последовательности, показанной вSEQ ID NO: 46 или 43, или состоит из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из последовательности, показанной в SEQ ID NO: 46 или 43,предпочтительно иммуногенный эпитоп охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд выбраны из группы, которая состоит из аминокислот с номерами остатков 46, 49,50, 52 и 62 зрелого миостатина, т.е. где аминокислота с указанным номером остатка отличается от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении GDF-11 (см. фиг. 3). Кроме того, иммуногенный эпитоп миостатина по изобретению находится в пределах положений 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего или состоит из 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7,6 или 5 аминокислот подряд пептида, состоящего из аминокислот в положениях 40-64 зрелой формы миостатина любого млекопитающего, предпочтительно указанный иммуногенный эпитоп охватывает остатки аминокислот, где 1, 2, 3, 4 или 5 указанных аминокислот подряд представляют собой аминокислоты, которые отличаются от аминокислоты, присутствующей в эквивалентном положении GDF-11 в том же млекопитающем. Иммуногенный эпитоп по изобретению также рассматривается как антигенный эпитоп. Антигенный эпитоп может включать дополнительные остатки миостатина вне аминокислот 40-64 зрелого миостатина, но моноклональные антитела по изобретению не требуют этих дополнительных остатков для специфического связывания с миостатином. Кроме того, остатки миостатина вне аминокислот 40-64 (т.е. антигенного эпитопа) могут влиять на конформационную структуру антигенного домена и в связи с этим изменять связывание антитела по изобретению с антигенным эпитопом. Моноклональные антитела по изобретению связываются с миостатином по меньшей мере в 5, 10, 20, 30, 40, 50,60, 70, 80, 90 или 100 раз больше (например, более высокое сродство или более высокая специфичность),чем они связываются с GDF-11; более предпочтительно по меньшей мере в 150, 200, 250, 300, 350, 400,450, 500, 550 или 600 раз больше, чем они связываются с GDF-11, что определяют, например, с помощью пробы ELISA, конкурентной пробы ELISA или значений KD в пробе Biacore.- 12014112 Домен, охватывающий аминокислоты 40-64 (включительно) зрелого миостатина, или любой пептид, состоящий из иммуногенного эпитопа, раскрытого в данном описании, может использоваться как иммуногенный пептид, предпочтительно конъюгированный с белком-носителем, например KLH, для создания моноклональных антител по изобретению. Иммуногенный пептид может использоваться для иммунизации животного, кроме человека, предпочтительно млекопитающего, более предпочтительно мыши. Затем антимиостатиновые антитела выделяют из иммунизированных животных и подвергают скринингу способами, хорошо известными из уровня техники, для выделения тех антител, которые специфически связываются с аминокислотами 40-64 миостатина. В целом, гибридома может быть получена путем слияния подходящей бессмертной линии клеток(например, клеточной линии миеломы, такой как SP2/0) с клетками иммунизированного животного, вырабатывающими антитело. Клетку, вырабатывающую антитело предпочтительно из селезенки или лимфатических узлов, получают из животного, иммунизированного интересующим антигеном. Слитые клетки (гибридомы) могут быть выделены с применением условий избирательного культивирования и клонированы с помощью ограничивающего разведения. Клетки, которые вырабатывают антитела с желательными связывающими свойствами, могут быть отобраны с помощью подходящей пробы. Способы такого выделения и скрининга хорошо известны из уровня техники. Выбор фрагментов антитела из библиотек с применением технологий обогащения, такого как фаговый дисплейAcad. Sci. (USA), 95:14130-5, 1998), бактериальный дисплей (Samuelson P., et al., Journal of Biotechnology. 96:129-54, 2002) или дрожжевой дисплей (Kieke MC, et al., Protein Engineering, 10:1303-10, 1997), которые доказано являются успешными альтернативами классической технологии гибридомы (недавние обзор:Little M. et al., Immunology Today, 21:364-70, 2000). Антитела по изобретению могут быть изменены до химерной или гуманизированной формы с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Могут применяться другие подходящие способы выработки или выделения антител, которые связываются с аминокислотами 40-64 зрелого миостатина, включая человеческие или искусственные антитела, в том числе, например, способы, которые отбирают рекомбинантное антитело (например, одноцепочечный Fv или Fab) из библиотеки или которые основываются на иммунизации трансгенных животных (например, мышей), способных вырабатывать набор человеческих антител (см., например, Jakobovitsal., патент США 5545806; Surani et al., патент США 5545807). Одноцепочечные антитела, а также химерные, гуманизированные или приматизированные (с пересаженным CDR) антитела, такие как химерные или одноцепочечные антитела с пересаженным CDR и т.п., включающие части, происходящие из разных видов, также охватываются данным изобретением и термином "антитело". Различные части таких антител могут быть соединены вместе химически с помощью традиционных техник, синтетически или могут быть приготовлены как беспрерывный белок с применением техник генной инженерии. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие химерную или гуманизированную цепь, могут быть экспрессированы для получения беспрерывного белка. См., например,патент США 4816567; Европейский патент 0125023 В 1; патент США 4816397; Европейский патент 0120694 B1; WO 86/01533; Европейский патент 0194276 В 1; патент США 5225539; Европейский патент 0239400 B1 и патенты США 5585089 и 5698762, см. также Newman, R. et al.BioTechnology, 10:1455-1460, 1993, в отношении приматизированного антитела, и Ladner et al., патент США 4946778 и Bird, R.E. et al., Science, 242:423-426, 1988, относительно одноцепочечных антител. Кроме того, могут быть получены функциональные фрагменты антител, в том числе фрагменты химерных, гуманизированных, приматизированных или одноцепочечных антител. Функциональные фрагменты перечисленных антител сохраняют по меньшей мере одну связывающую функцию или биологическую функцию антитела с полной длиной, из которого они произошли. Предпочтительные функциональные фрагменты сохраняют антигенсвязывающую функцию соответствующего антитела с полной длиной (например, способность связываться со зрелой формой миостатина млекопитающего). Особенно предпочтительные функциональные фрагменты сохраняют способность ингибировать одну или более функций или видов биологической активности, характерных для зрелого миостатина млекопитающего,таких как связывающая активность, сигнальная активность и/или стимуляция клеточного ответа. Например, в одном воплощении функциональный фрагмент может ингибировать взаимодействие зрелого миостатина с одним или более из его лигандов и/или может ингибировать одну или более опосредованных рецептором функций. Фрагменты антитела, способные связываться со зрелым миостатином млекопитающего или его частью, включают, не ограниваясь ими, фрагменты Fv, Fab, Fab' и F(ab')2, которые охватываются изобретением. Такие фрагменты могут быть получены с помощью ферментного расщепления или рекомбинантных техник. Например, расщепление папаином или пепсином может давать фрагменты Fab или F(ab')2 соответственно. Антитела также могут быть образованы в разнообразных обрезанных формах с применением генов антител, в которых один или более останавливающих кодонов введены выше природного останавливающего сайта. Например, химерный ген, кодирующий часть тяжелой цепи F(ab')2, может быть спроектирован включающим последовательности ДНК, кодирующие домен CH1 и петлевой участок тя- 13014112 желой цепи. В предпочтительном воплощении изобретение обеспечивает антимиостатиновое моноклональное антитело, полученное с помощью описанного процесса, которое предпочтительно связывается со зрелым миостатином или его частью со сродством по меньшей мере около 110-7 М, предпочтительно по меньшей мере около 910-8 или 710-8 М и более предпочтительно по меньшей мере около 510-8 М (что определяют, например, с помощью твердофазного анализа поверхностого плазмонного резонансаBIAcore) и обладает способностью противодействовать биологической активности зрелого миостатина. Предпочтительное моноклональное антитело по изобретению включает LCVR, содержащий пептид с последовательностью, выбранной из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и 11,и/или HCVR, содержащий пептид с последовательностью, выбранной из группы, которая состоит изSEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54 (см. табл. 1 и 2 и фиг. 4 и 5 в данном описании относительно последовательностей и их расположения в Fab). Кроме того, моноклональное антитело по изобретению является таким, связывание которого со зрелым человеческим миостатином (или его частью) полностью ингибируется моноклональным антителом, которое включает два полипептида с последовательностями,показанными в группе, состоящей изSEQ ID NO: 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 или 54. В другом воплощении LCVR антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению включает 1, 2 или 3 пептида, выбранных из группы, которая состоит из пептидов с последовательностью,показанной в SEQ ID NO: 38, 23 и 56 (см. табл. 1). HCVR антимиостатинового моноклонального антитела по изобретению включает 1, 2 или 3 пептида, выбранные из группы, которая состоит из пептидов с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 55, 41 и 42 (см. табл. 2). В предпочтительном воплощении антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело. Альтернативно, каркас и любой константный участок, присутствующие в антителе, могут в значительной мере происходить из генома животного, где антитело представляет собой такое, которое используется в качестве терапевтического. Предпочтительное антитело представляет собой антитело с полной длиной. Данное изобретение также направлено на линии клеток, которые экспрессируют антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению или его часть. Создание и выделение клеточных линий,вырабатывающих моноклональное антитело по изобретению, может быть осуществлено с использованием стандартных методик, известных из уровня техники. Предпочтительные линии клеток включают COS,CHO, SP2/0, NS0 и дрожжевые (доступны из публичных репозиториев, таких как АТСС, American TypeCulture Collection, Manassas, VA). Широкое разнообразие систем-хозяев экспрессии может использоваться для экспрессии антитела по данному изобретению, включая прокариотические (бактериальные) и эукариотические системы экспрессии (такие как клетки дрожжей, бакуловирусов, растений, млекопитающих и других животных,трансгенные животные и клетки гибридомы), а также системы экспрессии фагового дисплея. Примером подходящего вектора бактериальной экспрессии является pUC119 и примером подходящего эукариотического вектора экспрессии является модифицированный вектор pUC119 с ослабленной системой селекции DHFR. Другие системы экспрессии антител также известны из уровня техники и рассматриваются в данном описании. Антитело по изобретению может быть приготовлено путем рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для экспрессии антитела рекомбинантным способом клетку-хозяин трансформируют, трансдуцируют, инфицируют и т.п. с помощью одного или более рекомбинантных векторов экспрессии, несущих фрагменты ДНК, которые кодируют легкие и/или тяжелые цепи иммуноглобулинового антитела таким образом, что легкие и/или тяжелые цепи экспрессируются в клетке-хозяине. Тяжелая цепь и легкая цепи могут экспрессироваться независимо от различных промоторов, с которыми они функционально связаны в одном векторе или, альтернативно, тяжелая и легкая цепи могут экспрессироваться независимо от различных промоторов, к которым они оперативно присоединены, в двух векторах - один экспрессирует тяжелую цепь и один экспрессирует легкую цепь.- 14014112 Тяжелая и легкая цепи необязательно могут экспрессироваться в различных клетках-хозяевах. Предпочтительно рекомбинантные антитела секретируются в среду культивирования клеток-хозяев, из которой антитела могут быть извлечены или очищены. Стандартные методологии рекомбинантных ДНК применяются для получения генов тяжелой и легкой цепей антигена, для инкорпорации данных генов в векторы рекомбинантной экспрессии и введения векторов в клетки-хозяева. Такие стандартные рекомбинантные технологии ДНК описаны, например, в Sambrook, Fritsch, and Maniatis (Eds.), Molecular Cloning; AMolecular Biology, Greene Publishing Associates, 1989. Изолированная ДНК, кодирующая участок HCVR, может быть превращена в ген тяжелой цепи полной длины путем действующего присоединения ДНК, кодирующей HCVR, к другой молекуле ДНК, кодирующей константные участки тяжелой цепи (CH1, CH2 и СН 3). Последовательности человеческих генов константного участка тяжелой цепи известны из уровня техники. См., например, Cabat, et al.,Sequences of proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services,NIH Publication,91-3242 (1991). Фрагменты ДНК, охватывающие данные участки, могут быть получены, например, с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константный участок тяжелой цепи может быть константным участком любого типа (например, IgG, IgA, IgE, IgM или IgD), класса (например, IgG1,IgG2, IgG3 и IgG4) или подкласса и любым его аллотипическим вариантом, как описано у Rabat (выше). Альтернативно, антигенсвязывающий участок может быть фрагментом Fab, фрагментом Fab', фрагментом F(ab')2, Fd или одноцепочечным фрагментом Fv (scFv). Для гена фрагмента Fab тяжелой цепи ДНК,кодирующая HCVR, может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константный участок СН 1 тяжелой цепи. Изолированная ДНК, кодирующая участок LCVR, может быть превращена в ген легкой цепи с полной длиной (а также в ген Fab легкой цепи) путем функционального связывания ДНК, кодирующейLCVR, с другой молекулой ДНК, кодирующей константный участок легкой цепи CL. Последовательности человеческих генов константного участка легкой цепи известны из уровня техники. См., например,Kabat, выше. Фрагменты ДНК, охватывающие данные участки, могут быть получены путем стандартной ПЦР-амплификации. Константный участок легкой цепи может быть константным участком каппа или лямбда. Для создания гена scFv кодирующие HCVR и LCVR фрагменты ДНК функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например кодирующим аминокислотную последовательность (Gly4-Ser)3, таким образом, что последовательности HCVR и LCVR могут быть экспрессированы в виде беспрерывного одноцепочечного белка с участками LCVR и HCVR, соединенными с помощью гибкого линкера. См., например, Bird, et al., Science, 242:423-6, 1988; Huston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 85:5879-83, 1988; McCafferty, et al., Nature, 348:552-4, 1990. Для экспрессии антитела по изобретению ДНК, кодирующую легкую и/или тяжелую цепь с полной длиной, получают, как описано выше, вставляют в вектор экспрессии таким образом, что ген был функционально связан с контрольными последовательностями транскрипции и трансляции. Вектор экспрессии и контролирующие экспрессию последовательности выбирают совместимыми с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в отдельные векторы или, более типично, оба гена вставляют в один вектор экспрессии. Гены антитела вставляют в вектор экспрессии с помощью стандартных способов. Кроме того, рекомбинантный вектор экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который облегчает секрецию легкой и/или тяжелой цепи антимиостатинового моноклонального антитела клеткой-хозяином. Ген легкой и/или тяжелой цепи антимиостатинового моноклонального антитела может быть клонирован в вектор таким образом, что сигнальный пептид функционально связывается в рамке с аминным концом гена цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом. В дополнение к гену(ам) тяжелой и/или легкой цепи антитела рекомбинантный вектор экспрессии по изобретению несет регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию гена(ов) цепи антитела в клетке-хозяине. Термин "регуляторная последовательность" предназначен для включения промоторов, энхансеров и других элементов, контролирующих экспрессию (например, сигналов полиаденилирования), которые при необходимости контролируют транскрипцию или трансляцию гена(ов) цепи антитела. Дизайн вектора экспрессии, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов,как выбор клетки-хозяина, которая подлежит трансформации, уровня экспрессии целевого белка. Предпочтительные регуляторные последовательности для экспрессии в клетке-хозяине млекопитающего включают вирусные элементы, которые направляют высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих, таких как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (ЦМВ),обезьяньего вируса 40 (SV40), аденовируса (например, основной поздний промотор аденовируса- 15014112 Кроме генов тяжелой и/или легкой цепи антитела и регуляторных последовательностей, рекомбинантные векторы экспрессии по изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию векторов в клетках-хозяевах (например, источники репликации) и один или более маркерных генов, которые обеспечивают отбор. Маркерный ген,который обеспечивает отбор, облегчает отбор клеток-хозяев, в которые вводят вектор. Например, типично маркерный ген обеспечивает устойчивость к действию медикаментов, таких как G418, гигромицин или метотрексат, для клетки-хозяина, в которую введен вектор. Предпочтительные маркерные гены, которые обеспечивают отбор, включают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в DHFRминус клетках-хозяевах с метотрексатным отбором/амплификацией), ген neo (для отбора G418), а также глутаминсинтетазы (GS) в GS-отрицательной клетке (такой как NS0) для отбора/амплификации. Для экспрессии тяжелых и/или легких цепей вектор(ы) экспрессии, кодирующие тяжелые и/или легкие цепи, вводят в клетку-хозяин с помощью стандартных методик, например электрокорпорации,осаждения с кальция фосфатом, трансфекции DEAE-декстраном, трансдукции, инфекции и т.п. Хотя теоретически возможно экспрессировать антитела по изобретению как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах, предпочтительны эукариотические клетки и наиболее предпочтительны клетки-хозяева млекопитающих, поскольку такие клетки с большей вероятностью собирают и секретируют надлежащим образом свернутое и иммунологически активное антитело. Предпочтительные клеткихозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител по изобретению включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО), включая DHFR-CHO клетки, описанные в Urlaub and Chasin,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216-20, 1980, которые используются с маркером DHFR, обеспечивающим отбор, например, как описано в Kaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159:601-21, 1982, клетки миеломы NS0,клетки COS и клетки SP2/0. Если рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева млекопитающих, антитела вырабатываются культивируемыми клетками-хозяевами,или более предпочтительно секреция антитела осуществляется в среду культивирования, где выращены клетки-хозяева. Антитела могут быть извлечены из клетки-хозяина и/или среды культивирования с применением стандартных методов очистки. Клетки-хозяева также могут быть использованы для выработки частей или фрагментов интактных антител, например фрагментов Fab или молекул scFv, с помощью методик, которые сами по себе являются традиционными. Следует понимать, что вариации вышеописанной методики находятся в рамках данного изобретения. Например, может быть желательным трансфицировать клетку-хозяина с помощью ДНК, кодирующей легкую цепь или тяжелую цепь антитела по данному изобретению. Технология рекомбинантной ДНК также может применяться для удаления части или всей ДНК, кодирующей одну или обе цепи (легкую и тяжелую), которые не являются необходимыми для связывания с миостатином. Молекулы, которые экспрессируются такими обрезанными молекулами ДНК, также охватываются антителами по изобретению. В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела по изобретению рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий тяжелую цепь антитела и легкую цепь антитела, вводят в клетки DHFR-CHO путем, например, опосредованной карбонатом кальция трансфекции. В пределах рекомбинантного вектора экспрессии гены тяжелой и легкой цепи антитела функционально связаны с энхансерными/промоторными регуляторными элементами (например, полученными из SV40,ЦМВ, аденовируса и т.п., такими как регуляторный элемент ЦМВ энхансер/AdMLP промотор или регуляторный элемент SV40 энхансер/AdMLP промотор) для обеспечения высоких уровней транскрипции генов. Рекомбинантный вектор экспрессии также несет ген DHFR, который позволяет осуществить отбор клеток СНО, трансфицированных вектором, с использованием метотрексатного отбора/амплификации. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для обеспечения возможности экспрессии тяжелой и легкой цепей антитела и интактное антитело извлекают из среды культивирования. Стандартные методики молекулярной биологии применяют для изготовления рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицирования клеток-хозяев, отбора трансформированных клеток, культивирования клеток-хозяев и извлечения антитела из среды культивирования. Антитела или их антигенсвязывающие части по изобретению могут быть экспрессированы в животном (например, мыши), которое является трансгенным для генов человеческого иммуноглобулина (см., например, Taylor, et al., Nucleic Acids Res. 20:6287-95, 1992). Сразу после экспрессии интактные антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или их иммуноглобулиновые формы по данному изобретению могут быть очищены в соответствии со стандартными методиками из уровня техники, в том числе методиками осаждения аммония сульфатом, ионного обмена, аффинной, обращенно-фазной, колоночной хроматографией гидрофобного взаимодействия,гель-электрофореза и т.п. Предпочтительными являются в значительной мере чистые иммуноглобулины по меньшей мере с гомогенностью около 90, 92, 94 или 96%, наиболее предпочтительными с гомогенностью 98-99% или более для фармацевтических целей. После частичной очистки или до очистки желательной гомогенности пептиды могут использоваться в терапевтических или профилактических целях, как описано в данном описании.- 16014112 В данном описании термин "химерное антитело" включает моновалентные, двухвалентные или поливалентные иммуноглобулины. Одновалентное химерное антитело представляет собой димер, образованный химерной тяжелой цепью, связанной через дисульфидные мостики с химерной легкой цепью. Двухвалентное химерное антитело представляет собой тетрамер, образованный двумя димерами "легкая цепь-тяжелая цепь", связанными с помощью по меньшей мере одного дисульфидного мостика. Химерная тяжелая цепь антитела для применения у людей включает антигенсвязывающий участок,происходящий из тяжелой цепи нечеловеческого антитела, специфичного по отношению к миостатину,который связан с по меньшей мере одной частью константного участка человеческой тяжелой цепи, такой как СН 1 или СН 2. Химерная легкая цепь антитела для применения у людей включает антигенсвязывающий участок, происходящий из легкой цепи нечеловеческого антитела, специфичный в отношении миостатина, связанный по меньшей мере с частью константного участка человеческой тяжелой цепи(CL). Антитела, фрагменты или производные, имеющие химерные тяжелые цепи и легкие цепи с одинаковой или различной связывающей специфичностью изменчивого участка, также могут быть приготовлены путем соответствующего сочетания отдельных полипептидных цепей, в соответствии со стадиями известного способа. При таком подходе хозяев, экспрессирующих тяжелые цепи, культивируют отдельно от хозяев,экспрессирующих легкие цепи, и цепи иммуноглобулина извлекают по отдельности, а затем соединяют. Альтернативно, хозяева могут культивироваться совместно, и цепям позволяют связываться спонтанно в среде культивирования с последующим извлечением собранного иммуноглобулина или фрагмента. Способы образования химерных антител известны из уровня техники (см., например, патенты США 6284471; 5807715; 4816567 и 4816397). В предпочтительном воплощении создается ген, который включает первый сегмент ДНК, который кодирует по меньшей мере один антигенсвязывающий участок нечеловеческого происхождения (например, Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 или 15, как в табл. 1, 2 и на фиг. 4 и 5 данного описания), например функционально реконструированный вариабельный (V) участок с соединяющим (J) сегментом, присоединенным ко второму сегменту ДНК, кодирующему по меньшей мере часть человеческого константного(С) участка, как описано в патенте США 6284471. Предпочтительно антитело по изобретению для использования в терапевтических целях имеет такую последовательность каркасной области и константного участка, которая существует в антителе,происходящем из млекопитающего, для которого предусмотрено терапевтическое применение антитела,таким образом, чтобы уменьшить возможность возникновения у млекопитающего иммунной реакции против лечебного антитела. Особенный интерес представляют гуманизированные антитела, поскольку они рассматриваются как ценные с точки зрения терапевтического применения и позволяют избежать у человека реакции против мышиных антител, которая часто наблюдается при использовании антител грызунов. Термин "гуманизированное антитело" в данном описании обозначает иммуноглобулин, который включает части антител различного происхождения, где по меньшей мере одна часть имеет человеческое происхождение. Например, гуманизированное антитело может включать части, происходящие из антитела нечеловеческого происхождения с требуемой специфичностью, такого как мышиное, и из антитела человеческого происхождения, соединенные вместе химически с помощью традиционных методик (например, синтетических) или приготовленные как беспрерывный полипептид с применением генно-инженерных методик. Предпочтительно "гуманизированное антитело" включает участки CDR, происходящие из нечеловеческого антитела (предпочтительно мышиного моноклонального антитела), тогда как каркасная область и константный участок до той степени, в которой они присутствуют (или их значительная или существенная часть, т.е. по меньшей мере около 90, 92, 94, 96, 98 или 99%), кодируются информационной последовательностью нуклеиновой кислоты, которая встречается в участке иммуноглобулина зародышевой линии человека (см., например, the International ImMunoGeneTics Database), или существуют в их рекомбинантных или мутантных формах, независимо от того, вырабатываются ли указанные антитела в человеческой клетке. Гуманизированное антитело может быть интактным антителом, в значительной мере интактным антителом, частью антитела, включающей антигенсвязывающий сайт, или частью антитела,включающей фрагмент Fab, фрагмент Fab', фрагмент F(ab')2 или одноцепочечный фрагмент Fv. Считается, что в процессе создания гуманизированного антитела аминокислота на любом конце CDR (см., например, табл. 1 и 2) может быть замещена аминокислотой, которая встречается в зародышевой линии человека для такого сегмента присоединенной каркасной последовательности. Гуманизированные антитела могут поддаваться мутагенезу in vitro с применением рутинных способов, известных из уровня техники (или, если используется животное, трансгенное для последовательностей человеческого Ig соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, последовательности аминокислот каркасной области участков HCVR и LCVR гуманизированных рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, будучи происходящими от последовательностей, родственных последовательностям HCVR и LCVR зародышевой линии человека, могут не встречаться в природе в пределах набора антител зародышевой линии человека in vivo. Считается, что такие последовательности аминокислот каркасных участков HCVR и LCVR гуманизированных рекомбинантных антител- 17014112 являются по меньшей мере на 90, 92, 94, 96, 98% или наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентичными последовательности зародышевой линии человека. Гуманизирование антитела обладают по меньшей мере тремя потенциальными преимуществами перед негуманизированными и химерными антителами при применении их для лечения человека:(i) эффекторная часть является человеческой, она может лучше взаимодействовать с другими частями иммунной системы человека (например, разрушать целевые клетки более эффективно с помощью комплемент-зависимой цитотоксичности или зависимой от антител клеточной цитотоксичности);(ii) иммунная система человека не должна распознавать каркасную область или константный участок гуманизированного антитела как чужеродные, и, следовательно, иммунный ответ в виде антител против такого антитела, введенного инъекционным способом, должен быть меньше, чем против полностью чужеродного нечеловеческого антитела или частично чужеродного химерного антитела; и(iii) сообщалось, что период полувыведения из кровотока человека для введенных инъекционным способом нечеловеческих антител намного короче, чем период полувыведения человеческих антител. Введенные инъекционным способом гуманизированные антитела могут иметь период выведения, который намного ближе к периоду полувыведения встречающихся в природе человеческих антител, что дает возможность вводить меньшие дозы и делать это реже. Гуманизация в некоторых случаях может оказать побочное влияние на связывание антитела с антигеном. Предпочтительно гуманизированное антимиостатиновое моноклональное антитело по данному изобретению будет обладать сродством связывания для миостатина не менее приблизительно 50%, более предпочтительно не менее чем около 30% и наиболее предпочтительно не менее чем около 25, 20, 15, 10 или 5% связывающей активности исходного антитела, предпочтительно Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 или 15 для миостатина (см. фиг. 4 и 5 в данном описании). Предпочтительно гуманизированное антитело по данному изобретению будет связываться с тем же эпитопом, что и Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 или 15,раскрытые в данном описании. Указанное антитело может быть идентифицировано по его способности конкурировать с Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 или 15 за связывание со зрелым миостатином или пептидом с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 46 или 43. В целом, гуманизированные антитела получают путем получения последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих HCVR и LCVR антитела, которые связываются с эпитопом миостатина по изобретению, идентификацией участков CDR в указанных HCVR и LCVR (нечеловеческих) и пересадки таких кодирующих CDR последовательностей нуклеиновой кислоты в выбранные последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие человеческий каркас. Предпочтительно последовательности аминокислот человеческого каркаса выбираются таким образом, что полученное антитело, вероятно, будет пригодным для введения in vivo людям. Это может быть определено, например, на основе предварительного применения антител, содержащих такую последовательность человеческого каркаса. Предпочтительно последовательность человеческого каркаса сама по себе не будет в значительной степени иммуногенной. Альтернативно, аминокислотные последовательности каркасов для антитела, подлежащего гуманизации (например, Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 или 15), будут сравниваться с таковыми известных последовательностей человеческого каркаса последовательности человеческого каркаса, подлежащие использованию для пересадки CDR, будут выбираться на базе включенных последовательностей, в большой степени сходных с последовательностями исходного антитела, например мышиного антитела, которое связывается с миостатином. Выделены многочисленные последовательности человеческого каркаса и их последовательности раскрыты в уровне техники. Это повышает вероятность того, что полученное гуманизированное антитело с пересаженным CDR, которое содержит участки CDR исходного (например,мышиного) антитела, пересаженные на выбранные человеческие каркасы (и возможно также на константный участок человека), будут в существенной мере сохранять антигенсвязывающую структуру и,таким образом, сохранять связывающую способность исходного антитела. Для сохранения в значительной мере антигенсвязывающей способности выбранные человеческие каркасные области предпочтительно будут такими, что ожидается, что они будут пригодными для введения in vivo, т.е. неиммуногенными. В любом способе получают последовательность ДНК, кодирующую участки HCVR и LCVR предпочтительно мышиного антимиостатинового антитела. Способы клонирования последовательностей нуклеиновой кислоты, кодирующих иммуноглобулины, хорошо известны из уровня техники. Такие способы могут, например, включать амплификацию кодирующих иммуноглобулины последовательностей, которые подлежат клонированию, с использованием подходящих праймеров путем полимеразной цепной реакции (ПЦР). Праймеры, пригодные для амплификации последовательностей нуклеиновой кислоты иммуноглобулина и, конкретно, последовательностей мышиных HCVR и LCVR, опубликованы в литературе. После клонирования таких кодирующих иммуноглобулин последовательностей они будут секвенированы способами, хорошо известными из уровня техники.- 18014112 Как только идентифицированы последовательности ДНК, кодирующие участки CDR и каркасные области антитела, подлежащего гуманизации, то идентифицируют последовательности аминокислот,кодирующие участки CDR (методом дедукции на базе последовательностей нуклеиновой кислот и генетического кода, а также путем сравнения с предыдущими последовательностями антитела), и последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие CDR, пересаживают на выбранные последовательности,кодирующие человеческий каркас. Это может осуществляться с использованием соответствующих праймеров и линкеров. Способы выбора подходящих праймеров и линкеров для праймирования для лигирования целевых последовательностей нуклеиновой кислоты входят в рамки навыков среднего специалиста в данной области. После того как кодирующие CDR последовательности пересажены на выбранные последовательности, кодирующие человеческий каркас, полученные последовательности ДНК, кодирующие "гуманизированные" последовательности вариабельной легкой и вариабельной тяжелой цепей далее экспрессируют для получения гуманизированного Fv или гуманизированного антитела, которое связывается с миостатином. Типично, гуманизированные HCVR и LCVR экспрессируют как часть целой молекулы антимиостатинового антитела, т.е. как белок слияния с последовательностями константного участка человека,для которых кодирующие их последовательности ДНК были получены из коммерчески доступной библиотеки или которые были получены с применением, например, одного из описанных выше способов получения последовательностей ДНК или описанных в уровне техники. Однако последовательностиHCVR и LCVR также могут экспрессироваться в отсутствие константных последовательностей для выработки гуманизированного антимиостатинового Fv. В любом случае слияние человеческих константных последовательностей потенциально является желательным, поскольку полученное гуманизированное антимиостатиновое антитело может обладать человеческими эффекторными функциями. Способы синтеза ДНК, кодирующей белок с известной последовательностью, хорошо известны из уровня техники. С применением таких способов синтезируют последовательности ДНК, кодирующие субъект гуманизированные последовательности HCVR и LCVR (с константными участками или без них),и затем экспрессируют в системе вектора, подходящей для экспрессии рекомбинантных антител. Это может быть осуществлено любой системой векторов, которая обеспечивает экспрессию субъекта гуманизированных последовательностей HCVR и LCVR как белков слияния с человеческими последовательностями константного домена и связывание для получения функциональных (антигенсвязывающих) антител или фрагментов антител. Человеческие последовательности константного домена хорошо известны из уровня техники и описаны в литературе. Предпочтительные последовательности константной легкой цепи включают последовательности константной легкой цепи каппа и лямбда. Предпочтительные человеческие последовательности константной тяжелой цепи включают человеческую гамма 1, человеческую гамма 2, человеческую гамма 3, человеческую гамма r и их мутантные версии, которые обеспечивают измененный эффект или функцию, например увеличивают период полувыведения in vivo, уменьшают связывание с рецепторомFc и т.п. Человеческие каркасные области, если они присутствуют, предпочтительно происходят из вариабельного участка человеческого антитела, имеющего последовательность, сходную с аналогичным или эквивалентным участком антигенсвязывающего участка донора. Другие источники каркасных областей для участков гуманизированного антитела человеческого происхождения включают человеческие вариабельные консенсусные последовательности (см., например, Kettleborough, С.A. et al. Protein Engineering 4:773-783 (1991); Carter et al., WO 94/04679). Например, последовательность антитела или изменчивого участка, которая используется для получения нечеловеческого участка, может сравниваться с человеческими последовательностями, как описано в Kabat et al. Sequences белков of Immunological Interest, FifthEdition, NIH, U.S. Government Printing Office (1991). В особенно предпочтительном воплощении каркасные области цепи гуманизированного антитела происходят из человеческого вариабельного участка, обладающего по меньшей мере 60% идентичностью общей последовательности, предпочтительно по меньшей мере 70% идентичностью общей последовательности и более предпочтительно по меньшей мере 85% идентичностью общей последовательности, с вариабельным участком нечеловеческого донора. Человеческий участок также может происходить из человеческого антитела, которое обладает по меньшей мере около 65% идентичностью последовательности и предпочтительно по меньшей мере 70% идентичностью последовательности в рамках конкретного участка (например, FR), которая должна быть использована, при сравнении с эквивалентным участком (например, FR) нечеловеческого донора. В некоторых случаях гуманизированные антитела, образованные пересадкой участков CDR (из антитела, которое связывается с миостатином), на выбранные человеческие каркасы, могут давать гуманизированные антитела с желательным сродством к миостатину. Однако может быть необходимым или желательным далее модифицировать конкретные остатки выбранного человеческого каркаса с целью усиления связывания с антигеном. Предпочтительно такие каркасные остатки исходного (например,мышиного) антитела, которые поддерживают или влияют на структуры объединяющего сайта, будут сохранены. Данные остатки могут быть идентифицированы путем рентгеновской кристаллографии исходного антитела или фрагмента Fab, таким образом идентифицируя трехмерную структуру антигенсвя- 19014112 зывающего сайта. В следующих ссылках описаны способы, задействованные в гуманизации мышиного антитела, которые могут применяться: Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869, 1991; патент США 5693761; патент США 4816397; патент США 5225539; компьютерные программы ABMOD и ENCAD, как описано в Levitt, M., J. Mol. Biol. 168:595-620, 1983. Антитела по настоящему изобретению полезны в терапевтических, диагностических и исследовательских приложениях, как описано в данном описании. Антитело по изобретению может применяться для диагностики расстройства или заболевания, связанного с экспрессией человеческого миостатина. Подобным образом, антитело по изобретению может применяться в пробе для контроля уровней миостатина у субъекта, получающего лечения в связи со связанным с миостатином состоянием. Диагностические пробы включают способы использования антитела по изобретению и метки для обнаружения миостатина в образце, например, в биологической жидкости человека или в клетке или в экстракте ткани. Связывающие композиции, такие как, например, антитела, применяют с модификацией или без нее и метят ковалентным или нековалентным присоединением фрагмента, который поддается обнаружению. Фрагмент, который поддается обнаружению, может быть любым, который способен вырабатывать прямо или непрямо сигнал, который поддается обнаружению. Например, фрагмент, который поддается обнаружению, может представлять собой радиоизотоп, такой как, например, 3 Н, 14 С, 32 Р, 35S или 125I, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцеин изотиоцианат, родамин или люциферин; или фермент, такой как щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза или пероксидаза хрена. Может применяться любой способ, известный из уровня техники, для отдельного конъюгирования антитела с фрагментом, который поддается обнаружению, в том числе методы, описанные в Hunter, et al., Nature 144:945, 1962; David, et al., Biochemistry 13: 1014, 1974; Pain, et al., J. Immunol. Meth. 40: 219, 1981 иNygren, J. Histochem. And Cytochem. 30: 407, 1982. Из уровня техники известно множество традиционных протоколов измерения миостатина, включая,например, пробы ELISA, RIA и FACS, которые обеспечивают основу для диагностики измененных или аномальных уровней экспрессии миостатина. Нормальные или стандартные значения экспрессии определяют с применением любой известной из уровня техники методикий, например комбинируя образец,включающий миостатиновый полипептид, например, с антителами в условиях, пригодных для образования комплекса антиген/антитело. Антитело прямо или косвенно метят субстанцией, поддающейся обнаружению, для облегчения обнаружения связанного или несвязанного антитела. Пригодные субстанции,поддающиеся обнаружению, включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, -галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламинфлуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; примеры люминесцентного материала включает люминол и примеры радиоактивного материала включают 125I,131(1987. Количество образовавшегося стандартного комплекса измеряют с помощью различных методов,таких как, например, фотометрические средства. Количества миостатинового полипептида, которые экспрессируются в субъекте, контролируют и образцы (например, из биопсированной ткани) затем сравнивают со стандартными значениями. Отклонение между стандартными и установленными для субъекта значениями параметров для корреляции конкретного расстройства, состояния, синдрома или заболевания с определенным уровнем экспрессии (или ее отсутствия) миостатинового полипептида. Как только установлено присутствие расстройства, состояния, синдрома или заболевания и начата схема лечения, пробы повторяют на регулярной основе для контроля уровня экспрессии миостатина. Результаты, полученные для удовлетворительных проб, используют для демонстрации эффективности лечения в течение периода, который длится от нескольких дней до месяцев. С учетом конкретных расстройств (например, дряхлость или кахексия) присутствие измененного количества миостатина в биопсии ткани или жидкости (например, сыворотка или моча) от субъекта может показывать предрасположенность к развитию расстройства, состояния, синдрома или заболевания, или может обеспечивать средства для обнаружения такого расстройства, состояния, синдрома или заболевания до появления фактических клинических симптомов, или может определять популяцию, которая с большей вероятностью будет отвечать терапевтически на антитело по изобретению. Более определяющее начальное обнаружение может дать возможность более раннего лечения и, таким образом, предупреждения и/или уменьшения дальнейшего прогресса пролиферации клеток. Антитело по изобретению может быть введено в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту. Соединения по изобретению могут вводиться отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем и/или эксципиентами, в виде однократной или множественных доз. Фармацевтические композиции для введения разрабатываются подходящими для выбран- 20014112 ного способа введения с надлежащим использованием фармацевтически приемлемых разбавителей, носителя и/или эксципиентов, таких как диспергирующие агенты, буферы, сурфактанты, консерванты, солюбилизирующие агенты, агенты для создания изотоничности, стабилизаторы и т.п. Указанные композиции разрабатываются в соответствии с традиционными методами, как, например, описанные вRemington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995, который обеспечивает исчерпывающее руководство по методам создания препаратов, в целом известных практикующим специалистам. Фармацевтическая композиция, которая включает антимиостатиновое моноклональное антитело по данному изобретению, может вводиться субъекту, для которого существует риск появления патологии,как описано в данном описании, с применением стандартных методик введения, в том числе перорально,внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутрилегочно, трансдермально, внутримышечно, интраназально, буккально, сублингвально или в виде свечей. Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно представляет собой "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела по изобретению. "Терапевтически эффективное количество" означает количество, эффективное с точки зрения доз и необходимых периодов времени для достижения желательного терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела может варьировать в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и масса тела индивидуума, а также способность антитела или части антитела вызывать у индивидуума желательный ответ. Терапевтически эффективное количество также представляет собой такое, при котором польза от терапевтического воздействия перевешивает любые токсические или вредное действия антитела. "Профилактически эффективное количество" означает количество, эффективное в дозах и с точки зрения необходимых периодов времени для достижения желательного профилактического результата. Типично, поскольку профилактическая доза применяется у субъекта до начала или на ранней стадии заболевания, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество. Терапевтически эффективное количество представляет собой, по меньшей мере, минимальную дозу, но меньше токсической дозы, активного ингредиента, которая необходима для оказания терапевтического действия у субъекта. Иначе говоря, терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое у млекопитающих, предпочтительно людей, увеличивает мышечную массу, увеличивает костную плотность или лечит состояния, при которых присутствие миостатина вызывает или способствует нежелательному патологическому действию или уменьшение уровней миостатина ведет к благоприятному терапевтическому воздействию у млекопитающего, предпочтительно человека, в том числе,не ограничиваясь ими, мышечное истощение, дряхлость, возрастная саркопения, остеопороз, ожирение,мышечная дистрофия любого типа, реанимационная миопатия, сепсис, кахексия (например, связанная с раком или вызванная ВИЧ), ХОЗЛ, остеоартрит, почечная недостаточность, печеночная недостаточность,сердечная недостаточность или заболевания сердца, метаболический синдром и диабет II типа. Способ введения антитела по данному изобретению может быть пероральным, парентеральным,ингаляционным или местным. Предпочтительно антитела по изобретению могут быть введены в фармацевтическую композицию, пригодную для парентерального введения. Термин "парентеральный" в данном описании включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшинное введение. Периферическая системная доставка путем внутривенной или внутрибрюшинной или подкожной инъекции является предпочтительной. Походящие растворители для таких инъекций понятны из уровня техники. Фармацевтическая композиция типично должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения в предусмотренном контейнере, в том числе, например, укупоренный флакон или шприц. Таким образом, фармацевтические композиции могут быть стерилизованы фильтрацией после приготовления рецептуры или другим способом сделаны приемлемыми с микробиологической точки зрения. Типичная композиция для внутривенной инфузии будет иметь объем жидкости 260-1000 мл, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический солевой раствор, раствор декстрозы или раствор Хенкса, и терапевтически эффективную дозу (например, от 1 до 100 мг/мл или более) концентрации антитела. Доза может варьировать в зависимости от вида и выраженности заболевания. Как хорошо известно в медицинской области, дозы для любого конкретного субъекта зависят от многих факторов, в том числе размера пациента, площади поверхности тела, возраста, а также от конкретного соединения, которое будет вводиться, пола, времени и способа введения, общего состояния здоровья и одновременного введения других медикаментов. Типичная доза может находиться, например, в интервале от 0,001 до 1000 мкг; однако дозы могут быть выше или ниже представленного примерного интервала, особенно с учетом перечисленных выше факторов. Схема ежедневного парентерального введения может составлять около 0,1 до приблизительно 100 мг/кг общей массы тела, предпочтительно от 0,3 до приблизительно 10 мг/кг и более предпочтительно от приблизительно 1 до 1 мкг/кг, даже более предпочтительно от 0,5 до 10 мкг/кг массы тела в день. Прогресс может контролироваться с помощью периодической оценки. Для повторного введения на протяжении нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение повторяют до достижения желательного угнетения заболевания. Однако другие схемы ле- 21014112 чения могут быть полезными и не исключаются. Желательная схема дозирования может вводиться путем введения однократного болюса, введения множественных болюсов или беспрерывной инфузией антител,в зависимости от образца фармакокинетического разрушения, которого хочет достигнуть врач. Эти рекомендованные количества антител в большой степени подлежат терапевтической оценке. Ключевым фактором в выборе подходящей дозы и схемы введения является полученный результат. Факторы, которые следует рассматривать в данном контексте, включают конкретное расстройство, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние конкретного пациента, причину расстройства, область введения антитела, конкретный тип антитела, способ введения,расписание введения и другие факторы, известные специалистам в области медицины. Терапевтические агенты по изобретению могут быть заморожены или лиофилизированы для хранения и растворения в подходящем стерильном носителе перед использованием. Лиофилизация и растворение могут вести к различной степени потери активности антитела. Может возникнуть потребность в коррекции доз для компенсации этого явления. В целом, предпочтительным является рН от 6 до 8. Терапевтическое применение. Миостатин играет роль в развитии мышц и множества родственных расстройств и заболеваний (см.,например, патентные заявки США 2003/0074680 и 2003/0082181). У взрослых мРНК миостатина в основном обнаружена в скелетной мускулатуре, хотя более низкие концентрации также найдены в жировой ткани и ткани сердца (Sharma, М., et al, J. Cell Physiol. 180:1, 1999). Лишенные миостатина мыши имеют в 2-3 раза большую мышечную массу, чем их однопометные сородичи дикого типа. Увеличение мышечной массы является результатом гипертрофии и гиперплазии волокон (McPherron, A., et al. Nature 387:8390, 1997 и Zhu, X. et al., FEBS Letters 474:71). Кроме того, лишенные миостатина мыши накапливают меньше жира, чем их дикие однопометные сородичи, но в других отношениях выглядят нормальными и здоровыми. Недавно показано также, что миостатин является важным регулятором образования жировой ткани (Rebbapragada, A., et al., Mol. and Cell. Bio. 23:7230-7242, 2003). Кроме того, недавно исследована структура и содержание костной ткани у миостатин-дефицитных мышей (Hamrick M.W., et al., J.Orthopaedic Research 21:1025, 2003; Hamrick, M.W., et al., Calcif Tissue Int. 71:63, 2002). Таким образом, фармацевтическая композиция, включающая антимиостатиновое моноклональное антитело по изобретению, может использоваться для увеличения мышечной массы, повышения плотности костей или может быть полезна для лечения состояний, где присутствие миостатина вызывает или способствует нежелательному патологическому действию или снижение уровней миостатина оказывает терапевтическое действие у млекопитающих, в том числе, не ограничиваясь ими, состояния мышечного истощения, дряхлости, возрастной сарколении, остеопороза, ожирении, мышечной дистрофии, миопатии,кахексии, сепсиса, остеоартрита, ХОЗЛ, почечной недостаточности, печеночной недостаточности, сердечной недостаточности или заболевания сердца, метаболического синдрома и диабета II типа. В данном описании рассматривается применение антимиостатинового моноклонального антитела по данному изобретению для лечения или профилактики по меньшей мере одного из перечисленных выше расстройства, где активность миостатина наносит ущерб или пациент получит пользу от сниженных уровней биологически активного миостатина. Кроме того, рассматривается применение антимиостатинового моноклонального антитела по данному изобретению для получения лекарственного средства для лечения по меньшей мере одного из перечисленных выше расстройств. В данном описании термины "лечение", "лечить" и т.п. обозначают достижение желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предупреждения заболевания или его симптома и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения заболевания и/или побочного действия, связанного с заболеванием. "Лечение" в данном описании включает введение соединения по данному изобретению для лечения заболевания или состояния у млекопитающего, особенно человека, и обеспечивает:(а) предупреждение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но данное заболевание еще не диагностировано у субъекта;(с) облегчение заболевания, т.е. вызов регрессии заболевания или расстройства или облегчение его симптомов или осложнений. Схемы лечения могут корректироваться для обеспечения оптимального желательного ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, может вводиться однократный болюс, могут вводиться несколько разделенных доз в течение периода времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена, как определяется конкретной терапевтической ситуацией. Следующие примеры предлагаются исключительно для целей иллюстрации и не предназначены для ограничения каким-либо способом рамок данного изобретения.- 22014112 Примеры Пример 1. Синтез антимиостатинового Fab. Клоны антимиостатиновых Fab изолировали из библиотеки Fab, созданной путем иммунизации диких мышей С 57 В 1/6 с применением технологии антител Omniclonal (Biosite, San Diego, CA). Мышей иммунизировали иммуногенным полипептидом с последовательностью аминокислотANYCSGESEFVFLQKYPHTHLVHQA (SEQ ID NO: 43). Данная последовательность идентична последовательности, которая охватывает аминокислоты 40-64 зрелой формы человеческого миостатина(SEQ ID NO: 2), за исключением того, что остаток Cys в положении 47 в зрелом человеческом миостатине дикого типа (подчеркнуты в SEQ ID NO: 43 выше) заменен на остаток Ser для предупреждения связывания носителя или неполный антиген с пептидом около этого остатка. Для улучшения иммуногенных свойств данного пептида белок-носитель, гемоцианин лимфы улитки и хелперный пептид Т-клетки конъюгированы с иммуногенным пептидом в соответствии со стандартными способами. HCVR и LCVRCDR, а также аминокислотные последовательности каркаса, раскрытые в данном описании (табл. 1 и 2,фиг. 4 и 5), идентифицируют как последовательности Fab из библиотеки, которые связываются со зрелым миостатином (например, SEQ ID NO: 2), а также связываются с иммуногенным пептидом и нейтрализуют активность миостатина. Репрезентативные последовательности нуклеотида, кодирующего LCVR и HCVR Fab, приведены в табл. 3. Таблица 3 Репрезентативные последовательности нуклеотида, кодирующего Fab LCVR и HCVR Пример 2. Анализ ELISA. А. Антимиостатиновые Fab преимущественно связываются со зрелым миостатином. Мышиные антимиостатиновые Fab по настоящему изобретению (см. фиг. 4 и 5) исследовали в анализе ELISA, в котором измеряли связывание Fab со зрелым миостатином (димерная форма), которым в различных концентрациях покрыта 96-ячейковая пластина. Также исследовали связывание Fab с GDF-11. Каждую ячейку 96-ячеичных планшетов покрывали 70 мкл рекомбинантного мышиного миостатина (системы RD, кат.788-G8/CF, свободный от носителя, 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6) или 70 мкл рекомбинантного человеческого GDF-11 (Peprotech, Inc. кат.120-11, свободный от носителя 1 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6). Планшеты инкубируют при 4 С в течение ночи. Содержимое ячеек извлекают аспирацией и дважды промывают промывающим буфером (20 мМ трис(гидроксиметил)аминометана, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,1% Tween-20). Планшеты блокируют 200 мкл блокирующего буфера на ячейку (5% Carnation Instant milk в вышеуказанном промывочном буфере) в течение 5 ч.Fab исследовали разведенными в блокирующем буфере при 10, 2, 0,4, 0,08 и 0,016 мкг/мл; 50 мкл каждого раствора Fab добавляли к ячейкам, покрытым GDF-8 и GAF-11 в двойном повторении. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Ячейки затем промывают трижды промывочным буфером. Конъюгированное с пероксидазой вторичное антитело (50 мкл козьего антимышиного каппа-HRP(Southern Biotech), разведенного 1:2000 в блокирующем буфере) добавляют в каждую ячейку и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Ячейки затем промывают трижды промывочным буфером; 50 мкл хромогенного субстрата (т.е. субстрата OPD) добавляли в каждую ячейку и оставляли при комнатной температуре на 13 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 н. HCl в каждую ячей- 23014112 ку. Поглощение ячеек измеряют при длине волны 490 нм. Определяли среднее поглощение ячеек в двух повторениях. Полученные данные демонстрируют, что Fab 3, 5 и 7 по изобретению (фиг. 4 и 5) связываются со связанным с пластиной зрелым миостатином человека и преимущественно связываются с миостатином в сравнении со связыванием GDF-11. В. Антимиостатиновые Fab связываются с пептидным иммуногеном миостатина (1). Мышиные антимиостатиновые Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 и 15 исследовали при помощи анализаELISA, в котором измеряли связывание Fab с полипептидом, который использовали для иммунизации мышей ("пептидный иммуноген"). Данный полипептид охватывает аминокислоты 40-64 зрелого миостатина и имеет последовательность аминокислот ANYCSGESEFVFLQKYPHTHLVHQA (SEQ ID NO: 43),как раскрыто в данном описании. Каждую ячейку двух 96-ячеичных планшетов покрывали 70 мкл пептидного иммуногена, который использовали для создания Fab (2 мкг/мл) в карбонатном буфере, рН 9,6. Планшеты инкубировали в сухой печи при 37 С в течение ночи с удаленными крышками. Содержимое ячеек извлекали аспирацией и дважды промывали промывочным буфером (20 мМ трис-(гидроксиметил)аминометана, рН 7,4, 0,15 МNaCl, 0,1% Tween-20). Планшеты блокировали с помощью 200 мкл блокирующего буфера на ячейку (5% молоко BioRad для блоттинга в указанном выше промывочном буфере) в течение 2,5 ч.Fab разбавляли блокирующим буфером до концентрации при 10, 2, 0,4, 0,08 и 0,016 мкг/мл. Крысиное антимиостатиновое моноклональное антитело (RD Systems, кат.МАВ 788, клон 84214) и поликлональное антимиостатиновое антитело (RD Systems, кат.AF788) использовали в качестве контроля при указанных выше концентрациях и также разбавляли блокирующим буфером; 50 мкл каждого раствора антитела добавляли к ячейкам, покрытым пептидом в двойном повторении. Планшеты инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Затем ячейки трижды промывали промывочным буфером. Конъюгированное с пероксидазой вторичное антитело (50 мкл козьего антимышиного каппа-HRP(Southern Biotech) для Fab, 50 мкл мышиного антикрысиного (Jackson ImmunoResearch) для моноклонального, 50 мкл кроличьего антикозьего (Jackson ImmunoResearch) для поликлонального, все разведены 1:2000 в блокирующем буфере, добавляли в каждую ячейку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем ячейки трижды промывали промывочным буфером. 50 мкл хромогенного субстрата(т.е. субстрата OPD) добавляли в каждую ячейку и оставляли при комнатной температуре на 10 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 н. HCl в каждую ячейку. Поглощение ячеек измеряли при 490 нм. Определяли среднее поглощение ячеек в двойном повторении; полученные значения приведены в табл. 4.Fab связываются со связанным с планшетом пептидным иммуногеном. Поликлональное антитело также связывается с пептидным иммуногеном в меньшей степени, чем Fab. Связывание моноклонального антитела RD соответствует базовым уровням, что согласуется с тем, что моноклональное тело RD распознает другой эпитоп, чем тот, который охватывается иммуногенным пептидом. С. Связывание антимиостатиновых Fab с различными членами суперсемейства TGF-. Мышиные антимиостатиновые Fab 3, 5, 7 (см. фиг. 4 и 5) и поликлональное антимиостатиновое антитело (RD Systems) исследовали при помощи анализа ELISA, где измеряли связывание Fab и антитела с членами семейства антигена (GDF-8/миостатин), которым покрыта ячейка. Исследовали связываниеFab со следующей панелью членов суперсемейства TGF-: GDF-11, ВМР-2, ВМР-5, ВМР-6, ВМР-7,Активин А, Активин В, TGF-, TGF-1 и TGF-2. Также тестировали IGF-1 как отрицательный контроль. Каждую ячейку 96-ячеичного планшета покрывали 70 мкл одного из перечисленных выше факторов роста (10 мкг/мл в карбонатном буфере, рН 9,6) в двойном повторении. См. табл. 5 ниже относительно источников и номеров в каталоге. Планшеты инкубировали в течение 4 С в течение ночи. Содержимое ячеек извлекали аспирацией и дважды промывали промывочным буфером (20 мМ трис(гидроксиметил)аминометана, рН 7,4, 0,15 М NaCl, 0,1% Tween-20). Планшеты блокируют 200 мкл блокирующего буфера на ячейку (5% быстрорастворимого молока Carnation в вышеуказанном промывочном буфере) в течение 3 ч. Антитела разводили в блокирующем буфере до 10 мкг/мл; 50 мкл каждого раствора антитела добавляли к ячейкам, покрытым фактором роста. Планшеты инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем ячейки трижды промывают промывочным буфером. Конъюгированное с пероксидазой вторичное антитело (50 мкл козьего антимышиного каппа-HRP(Southern Biotech) для Fab, 50 мкл кроличьего антикозьего (Jackson ImmunoResearch) для поликлонального, разведенного 1:2000 в блокирующем буфере, добавляли в каждую ячейку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем ячейки трижды промывали промывочным буфером; 50 мкл хромогенного субстрата (т.е. субстрата OPD) добавляли в каждую ячейку и оставляли при комнатной температуре на 10 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 н. HCl в каждую ячейку. Поглощение ячеек измеряли при 490 нм. Определяли среднее поглощение ячеек в двойном повторении, полученные- 24014112 значения приведены в табл. 6. Полученные данные демонстрируют, что Fab 3, 5 и 7 преимущественно связываются с миостатином в сравнении с другими исследованными белками. Отсутствие связывание или незначительное связывание в сравнении с фоновыми значениями обнаружены для Fab и любого из других членов суперсемейства TGF- при этих условиях, за исключением очень небольшого связывания Fab 3 с GDF-11. ОднакоRD антимиостатиновое поликлональное антитело также связывается с GDf-11 (см. табл. 6). Таблица 5 Пример 3. Проба нейтрализации миостатина. Эктодермальные эксплантаты извлекали из стадии 8-9 бластулы эмбрионов Xenopus с помощью стандартных процедур и культивировали в 0,5 Х MBS (1X MBS: 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 0,7 мМ CaCl2,1 мМ MgSO4, 5 мМ HEPES, 2,5 мМ NaHCO3, 1:1000 об./об. гентамицина, 0,1% бычьего сывороточного альбумина) с добавлением фактора роста (GDF8 или GDF11), плюс или показано, в течение 18 часов при 18 С, к этому моменту контрольные эмбрионы достигают стадии ранней неврулы (стадия 15-16). Эксплантаты фотографировали и длину каждого эксплантата измеряли с использованием алгоритма анализа изображений, разработанного для количественного определения анимального полюса. Экспланты, не обработанные ни фактором роста, ни Fab (контроль), погружали в шарики эпидермиса. Миостатин иGDF-11 индуцирует мезодерм в данных эктодермальных эксплантатах, что вызывает удлинение эксплантатов и формирование гантелеподобных структур. Антитела к Fab, при тестировании на предмет нейтрализующей активности, добавляли к среде культивирования, содержащей миостатин, на всем протяжении периода культивирования и оценивали их способность ингибировать вызванные фактором роста движения продления. Миостатин добавляли к эксплантату в концентрации 25 нг/мл. Антитела к Fab добавляли в концентрации 20 мкг/мл. Fab34 представляет собой Fab, созданное с посторонним антигеном. Также исследовали коммерчески доступное антимиостатиновое поликлональное антитело; данное антитело вырабатывали козы, иммунизированные очищенным мышиным GDF8 и производителем, была продемонстрирована их способность нейтрализовать продление анимальных полюсов Xenopus, вызванное 25 нг/мл мышиного GDF8, если они присутствовали в концентрации около 10-50 мкг/мл (RD Systems,Inc. кат.AF788). Коммерчески доступные моноклональные антимышиные GDF8 исследовали, производителем продемонстрировано, что данное антитело нейтрализует удлинение анимальных полюсовXenopus, вызванное 25 нг/мл мышиного GDF8, если они присутствуют в концентрации около 10-20 мкг/мл (RD Systems кат.МАВ 788). Следует отметить, что данные пробы ELISA в примере 2- 25014112 данного описания показывают, что данные RD антитела связываются с другим участком миостатина,чем Fab по данному изобретению. Для обработки изображений использовали ImagePro (v 4.5.1.22, от Media Cybernetics). Для автоматизации обработки изображений был написан макрос. Данный макрос обрабатывает изображение и записывает длину в единицах битов. Могут применяться альтернативные способы измерения, как известно из уровня техники. Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 и 15 способны в значительной степени нейтрализовать активность GDF8 в пробе анимального полюса. Пример 4. Измерение сродства моноклональных Fab. Сродство значений (KD) и Kon и Koff антимиостатиновых Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15 измеряли с использованием устройства BIAcore 2000, содержащего сенсорный чип СМ 5. Устройство BIAcore использует оптические свойства поверхностного плазмонного резонанса для определения изменений концентрации белка взаимодействующих молекул в декстрановой биосенсорной матрице. За исключением оговоренных случаев, все реактивы и материалы покупали у BIAcore AB (Upsala, Sweden). Все измерения проводили при 25 С. Образцы, содержащие крысиный или человеческий миостатин,растворяли в буфере HBS-EP (150 мМ натрия хлорид, 3 мМ ЭДТА, 0,0005% (мас.) сурфактанта Р-20 и 10 мМ HEPES, рН 7,4). Захватывающее антитело, козье антимышиное каппа-антитело (SouthernBiotechnology, Inc) иммобилизировали на проточных клетках с использованием химии аминного присоединения. Проточные ячейки (1-4) активировали в течение 7 мин смесью 0,1 М N-гидроксисукцинимида и 0,1 М 3-(N,N-диметиламино)пропил-N-этилкарбодиимида 1:1 при скорости потока 10 мкл/мин. Козье антимышиное каппа-антитело (30 мкг/мл в 10 мМ раствора натрия ацетата, рН 4,5) вручную вводили инъекционно во все проточные ячейки при скорости потока 10 мкл/мин. Поверхностную плотность контролировали и при необходимости осуществляли инъекцию дополнительного количества козьего антимышиного каппа-антитела в отдельную клеточную ячейку для тех проточных ячеек, в которых поверхностная плотность достигла значений 4500-500 единиц эквивалента (RESPONSE UNITS, RU). Поверхность блокировали в течение 7 мин инъекцией 1 М этаноламина-HCl, рН 8,5 (10 мкл/мин). Для того чтобы убедиться в полном удалении козьих антимышиных каппа-антител, не связанных ковалентно, 15 мкл 10 мМ раствора глицина, рН 1,5 вводили дважды. Буфер пробы, который использовали для кинетических экспериментов, содержал 10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,005% Р-20. Сбор данных кинетики связывания осуществляли при максимальной скорости потока (100 мкл/мин) при низкой плотности поверхности для минимизации массовых транспортных эффектов. Каждый цикл анализа состоит из(i) захвата 300-350 RU Fab (BioSite) путем инъекции 5-10 мкл раствора 5 мкг/мл в проточные ячейки 2, 3 и 4 для различных Fab при скорости потока 10 мкл/мин;(ii) инъекции 200 мкл (2 минуты) человеческого миостатина (интервал концентрации от 50 до 1,56 нМ с двукратными разведениями) во все 4 проточные ячейки с проточной ячейкой 1 как проточной ячейкой сравнения;(iv) регенерации поверхности козьих антимышиных каппа-антител с помощью 15 с инъекции 10 мМ раствора глицина, рН 1,5;(v) 30 с холостой инъекции буфера пробы и(vi) 2 мин стабилизации перед началом следующего цикла. Сигнал контролировали как "проточная ячейка 2 минус проточная ячейка 1", "проточная ячейка 3 минус проточная ячейка 1" и "проточная ячейка 4 минус проточная ячейка 1". Инъекции образцов и холостого буфера осуществляли в двукратном повторении в случайном порядке. Данные обрабатывали с использованием программного обеспечения BIAevaluation 3.1 и данные адаптировали к модели связывания 1:1 в программном обеспечении CLAMP global analysis.Fab 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14 и 15 демонстрируют значения KD между 710-6 и 4,010-8. Пример 5. Мышиная модель скелетно-мышечной эффективности in vivo. Мышей-самцов ICR (в возрасте 8 недель, Taconic NY) кастрировали (гонадэктомия, GDX) в соответствии с зарегистрированными процедурами и позволяли гормонам вымываться из организма в течение 10 недель. Также получали ложно оперированных (ложных) мышей соответствующего возраста. Ложно оперированные мыши обработаны таким же способом, как и кастрированные, за исключением того, что их яички не удаляли. Животных содержали в комнате с контролируемой температурой (24 С) с обращенным 12-часовым циклом света и темноты и со свободным доступом к воде и пище. Для демонстрации эффективности in vivo соединение по данному изобретению вводили каждую вторую неделю подкожной инъекцией кастрированным мышам в возрасте 18 недель (масса тела около 48-50 г) и ложным мышам соответствующего возраста. Исследуемое соединение вводили животным в фосфатном буферном солевом растворе (ФБР). Кастрированным мышам вводили только согласованный изотип IgG1 в качестве негативного контроля лечения. Исследуемым животным (12 мышей в каждой группе) вводили дозы на протяжении 15-недельного периода подкожно, приблизительно 60 мг/кг/каждые 2 недели соединения по данному изобретению. В каждой временной точке введения дозы дозу для вве- 26014112 дения корректировали в соответствии с массой тела каждого животного. Следующие измерения проводили в начале и в конце исследования: масса тела, мышечная масса тела (анализ с помощью количественного магнитного резонанса, QMR, Echo Medical Systems, TX) и GRIP-STRENGTH тела (ColumbusInstruments, ОН). После 15 недель лечения в качестве показателя мышечной активности определяли влажную массу скелетной мышцы (квадрицепс) в исследуемых группах и сравнивали с массой в группе кастрированных животных, получавших только IgG. В качестве показателя активности скелета костную массу (минеральная плотность кости, BMD, мг/см 3) бедренных костей исследуемых животных подобным образом сравнивали с костной массой бедренных костей в группе кастрированных животных, получавших только IgG,с помощью микрокомпьютерной томографии (QMR, Echo Medical Systems, TX) и прочности хватки(body grip-strength, Columbus Instruments, OH). Антимиостатиновое антитело, включающее Fab 3, в описанных условиях оказывало анаболическое действие как на мышцы, так и на кости.