Антитела к плацентарному фактору роста и способы их применения

АНТИТЕЛА К ПЛАЦЕНТАРНОМУ ФАКТОРУ РОСТА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Настоящее изобретение относится к новым моноклональным антителам, нацеленным на плацентарный фактор роста (PLGF), и их фрагментам и производным, более конкретно, к гуманизированным антителам и их фрагментам для применения в лечении и/или профилактике патологического ангиогенеза.(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ТРОМБОДЖИНИКС Н.В.; ЛАЙФ САЙЕНСИЗ РИСЕРЧ ПАРТНЕРЗ ВЗВ; ВЛАМС ИНТЕРЮНИВЕРСИТАЙР ИНСТИТЮТ ВОР БИОТЕХНОЛОГИ ВЗВ 013970 Область изобретения Настоящее изобретение относится к новым антителам и их фрагментам и производным, в частности, пригодным для ингибирования ангиогенеза при патологических состояниях. Изобретение также относится к линиям клеток, продуцирующим специфические антитела. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитела, фрагменты и/или производные по изобретению,и относится к способам профилактики и лечения ангиогенеза и/или сосудистого кровотечения там, где они являются нежелательными как, например, при формировании опухоли, заболеваниях глаза, легочной гипертензии и воспалительных расстройствах, и способам профилактики и лечения костных нарушений,таких как остеопороз. Предпосылки изобретения Патологическое формирование кровеносных сосудов вносит вклад в патогенез множества заболеваний с высокой заболеваемостью и смертностью. Выявление механизмов, лежащих в основе роста сосудов, могло бы позволить разработать терапевтические стратегии для стимулирования роста сосудов в ишемизированных тканях или для подавления их образования в опухолях. В недавних исследованиях по направленному воздействию на гены в эмбрионах идентифицировали некоторые механизмы, вовлеченные в начальное формирование эндотелиальных каналов (ангиогенез) и их последующее созревание посредством покрытия гладкомышечными клетками (артериогенез). Появляются данные о том, что разные молекулярные механизмы могут опосредовать рост кровеносных сосудов при патологических состояниях, но молекулярные участники остаются в значительной степени неизвестными. Установлено, что фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) вовлечен в развитие и патологический рост сосудистой сети (Ferrara N. et al, 1999, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 237, 1-30). Более того, также показано, что плацентарный фактор роста (PlGF), гомолог VEGF, является специфическим модуляторомVEGF при многих патологических состояниях, таких как ишемическая ретинопатия, образование опухолей, воспалительные расстройства и отек. Показано, что мыши PlGF-/- обладают нарушенным ангиогенезом и артериогенезом при заболевании (Carmeliet P. et al., 2000, J. Pathol. 190, 387-405), в то время как физиологический ангиогенез у нормальных здоровых животных остается незатронутым. Таким образом,ингибиторы PlGF обладают огромным потенциалом для лечения заболеваний, при которых ангиогенез или артериогенез вносят вклад в патогенез заболевания. В данной области известны ингибиторы PlGF, такие как козьи поликлональные антитела противPlGF человека (RD Pharmaceuticals, Abingdon, UK) и куриные поликлональные антитела (Gassmann etal., 1990, Faseb J. 4, 2528). Эти антитела применяют для исследований с помощью вестерн-блоттинга,гистохимии и иммунопреципитации. В WO 01/85796 описано применение ингибиторов PlGF, включая моноклональные анти-PlGF антитела, для лечения или профилактики заболеваний, таких как образование опухолей. Более конкретно, описано получение мышиных моноклональных антител, которые полностью ингибируют связывание PlGF-2 мыши со своим рецептором Flt-1, где антитело Mab-PL5D11 отобрано, как обладающее наиболее эффективной ингибиторной активностью. Описано применение антител в моделях патологического ангиогенеза на животных. Антитела, полученные у животных, обладают характеристиками, которые могут значительно ограничивать их применение для лечения человека. Как чужеродные белки, они могут вызывать ответ на иммуноглобулины, (который для мышиных антител обозначают как человеческие антитела против мыши или НАМА), который снижает или нейтрализует их терапевтическую эффективность и/или провоцирует аллергические или гиперчувствительные реакции у пациентов, как показано в Jaffers et al., 1986 (Transplantation 1986 41:572). В то время как применение человеческих моноклональных антител могло бы разрешить это ограничение, оказалось трудным получить большие количества человеческих антител против человека с помощью общепринятой технологии гибридом. Таким образом, в данной области применили рекомбинантную технологию для конструирования гуманизированных антител, которые сохраняют высокую аффинность связывания моноклональных антител животного происхождения, таких как мышиные, но обладают пониженной иммуногенностью у человека. В частности, предложены химерные антитела, у которых вариабельную область (V) не относящихся к человеку антител соединяли с константной(С) областью антител человека. Способы получения таких химерных иммуноглобулинов подробно описаны в патенте США 5770198. В других попытках снизить иммуногенность мышиных антител, на антитела человека переносили только область, определяющую комплементарность (CDR), т.е. области гипервариабельности в V-областях, а не полный V-домен. Такие гуманизированные антитела известны какCDR-привитые антитела. Конструирование CDR-привитых антител, распознающих более сложные антигены, дало в результате антитела, обладающие активностью связывания значительно более низкой, чем у нативных негуманизированных антител. Во многих случаях показано, что единственного введения CDR,не относящихся к человеку, в остов человеческих антител недостаточно для сохранения полной активности связывания. Несмотря на то, что для идентификации ключевых аминокислот, рассматриваемых в конструировании гуманизированных антител, требуется усложненная компьютерная модель мышиных антител, представляющих интерес и для такого конструирования предложены общие теоретические принципы, во всех случаях способ необходимо адаптировать и оптимизировать для конкретных не относящихся к человеку антител, представляющих интерес.-1 013970 Следовательно, сохраняется потребность в (моноклональных) антителах, которые оптимально ингибируют связывание PlGF человека со своим рецептором. Более того, такие антитела также должны являться неиммуногенными в том смысле, что они не могут вызывать НАМА (или обладают небольшой склонностью к этому). Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к новым моноклональным антителам и их производным, нацеленным на PlGF и способным ингибировать связывание PlGF со своим рецептором. Настоящие лиганды являются первыми, для которых показали ингибирование PlGF человека при патологическом состоянииin vivo. Более конкретно, антитела и их производные согласно настоящему изобретению способны уменьшать размер опухоли и васкуляризацию ткани опухоли человека in vivo. Антитела по настоящему изобретению предоставляют альтернативу антиангиогенным способам лечения, нацеленным на используемый в настоящее время VEGF, с тем важным преимуществом, что побочные эффекты, вызываемые ингибированием физиологического ангиогенеза, связанные с данными способами лечения, значительно снижены. Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам, в частности моноклональным антителам, их фрагментам или производным, включая гуманизированные антитела и фрагменты антител, которые связываются с тем же эпитопом PlGF, что и антитела, обозначенные здесь как 16D3. Первой целью настоящего изобретения является предоставление новых моноклональных антител,способных связываться с PlGF и обладающих способностью ингибировать функционирование PlGF, более конкретно, антител, отличающихся тем, что их вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность SEQ ID NO:2 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, более конкретно по меньшей мере 90%, наиболее конкретно 95% идентичностью последовательности с ней в пределах областей CDR, и/или тем, что их вариабельная область легкой цепи содержит последовательностьSEQ ID NO:4 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно по меньшей мере 90%, наиболее конкретно по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с ней в пределах областей CDR, как, например, антитело 16D3 или его производные. Дополнительно или альтернативно, в другом варианте осуществления, антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению обладают идентичностью последовательности в вариабельных областях тяжелой и/или легкой цепей за пределами областей CDR, которые по меньшей мере на 70%, в частности, по меньшей мере на 80%, более конкретно по меньшей мере на 90%, наиболее конкретно по меньшей мере на 95% идентичны последовательностям SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, соответственно. Согласно конкретному варианту осуществления изобретения, антитело является гуманизированным антителом, более конкретно, гибридным антителом, наиболее конкретно, мышиным/человеческим гибридным антителом, более конкретно, гибридным мышиным 16D3/человеческим IgGl или IgG4. Альтернативно, гуманизированное антитело является тем, которое содержит области CDR мышиного антитела 16D3 по настоящему изобретению, способные связываться с PlGF, встроенные в остов человеческих антител. Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к антигенсвязывающим фрагментам мышиного антитела 16D3 или его производным, таким как его гуманизированное антитело, такие как, в качестве неограничивающих примеров, Fab, Fab' или F(ab')2, сочетание по меньшей мере двух определяющих комплементарность областей (CDR), растворимая или заякоренная в мембране одноцепочечная вариабельная область, или одиночный вариабельный домен. Конкретные варианты осуществления таких антигенсвязывающих фрагментов включают фрагменты, которые содержат по меньшей мере две CDR 16D3 или их производные, или, более конкретно, по меньшей мере две CDR, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:17 (GYTFTDYY), SEQ ID NO:18 (IYPGSGNT), SEQ ID NO:19(VRDSPFFDY), SEQ ID NO:20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NO:21 (WAS) и SEQ ID NO:22 (KQSYHLFT),или которые содержат по меньшей мере две последовательности, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно по меньшей мере 90%, наиболее конкретно по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с ними. Конкретный вариант осуществления изобретения относится к предоставлению одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) мышиного антитела 16D3 и гуманизированных scFv, которые способны ингибировать активность PlGF. Наиболее конкретно, настоящее изобретение относится к scFv, содержащим аминокислотную последовательность SEQID NO:24 или SEQ ID NO:26, или последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, в частности,по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с ней в пределах CDR, способных связываться с PlGF. Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление линий клеток, продуцирующих моноклональные антитела по настоящему изобретению, более конкретно, линии клеток 16D3, которая продуцирует антитело 16D3, а также других линий клеток, которые способны продуцировать антигенсвязывающие молекулы, происходящие из 16D3 или его фрагментов, например, в результате рекомбинантной технологии. Еще одной целью настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции для профилактики или лечения (нежелательного) ангиогенеза при патологических состояниях или нару-2 013970 шениях у млекопитающих, или для профилактики или лечения резорбции кости, которая содержит антитело против PlGF, которое является 16D3 или фрагментом или производным, более конкретно, гуманизированной версией 16D3 или его антигенсвязывающим фрагментом в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Конкретный вариант осуществления изобретения является фармацевтической композицией, которая содержит антигенсвязывающий фрагмент 16D3 или его производное, которое выбрано из группы, состоящей из Fab, Fab' или F(ab')2, растворимой или заякоренной в мембране одноцепочечной вариабельной части или одиночного вариабельного домена. Наиболее конкретные варианты осуществления настоящего изобретения относятся к фармацевтическим композициям, содержащим антигенсвязывающий фрагмент, который содержит по меньшей мере две CDR, выбранные из группы, состоящей из(QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NO:21 (WAS) и SEQ ID NO:22 (KQSYHLFT), или по меньшей мере двеCDR, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно по меньшей мере 90%, наиболее конкретно по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с двумя разными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO:17-22. Конкретный вариант осуществления этих композиций относится к фармацевтическим композициям, содержащимscFv антитела 16D3 по изобретению, более конкретно, содержащим scFV, который содержит по меньшей мере две CDR, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:17 (GYTFTDYY), SEQ ID NO:18SEQ ID NO:22 (KQSYHLFT) или по меньшей мере две последовательности, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно по меньшей мере 90%, наиболее конкретно по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с двумя разными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO:17-22, как, например, scFv, содержащий SEQ IDNO:24. Наиболее конкретно, фармацевтическая композиция содержит гуманизированный scFv 16D3,такой как, в качестве неограничивающих примеров, гуманизированный scFv, содержащий SEQ ID NO:26 или последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с ней в пределах CDR, способной связываться с PlGF. В еще одном конкретном варианте осуществления фармацевтической композиции согласно изобретению терапевтически эффективное количество другого антиангиогенного средства включено в дополнение к антигенсвязывающей молекуле, способной связываться с PlGF по изобретению. Наиболее конкретно, в связи с этим предусмотрены антиангиогенные средства, такие как ингибиторы VEGF и bFGF,наиболее конкретно, анти-VEGF антитела. Другой целью настоящего изобретения является предоставление нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигенсвязывающие фрагменты антител, связывающихся с описанным здесь PlGF,более конкретно, нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей 16D3, продуцируемого линией клеток 16D3. Наиболее конкретно, предусмотрена нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельные области SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4. Кроме того,полинуклеотидные последовательности, кодирующие антигенсвязывающие фрагменты, содержащие по меньшей мере две CDR 16D3, более конкретно, полинуклеотиды, кодирующие, по меньшей мере, двеNO:22 (KQSYHLFT), или кодирующие последовательности, содержащие по меньшей мере две CDR, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:17-22. Конкретные варианты осуществления нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению предоставлены в SEQ ID NO:1, 3, 5 и 6. Другие конкретные варианты осуществления включают нуклеотидные последовательности, кодирующие scFv 16D3 и его гуманизированные версии, наиболее конкретно, последовательность SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:25, и последовательности, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с ними, наиболее конкретно, в пределах областей, кодирующих области CDR scFv. Однако будет принято во внимание, что существует множество нуклеотидных последовательностей, которые попадают в объем настоящего изобретения в результате вырожденности генетического кода. Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа лечения и/или профилактики нежелательного (или патологического) ангиогенеза при патологическом состоянии у млекопитающего, где способ включает введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, терапевтически эффективного количества активного ингредиента, который является антителом 16D3 по настоящему изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом или производным, наиболее конкретно, scFv, как здесь описано. В частности, подходящими для способов по настоящему изобретению являются гуманизированные антитела и фрагменты антител, такие как scFv 16D3 или их производные. Конкретный вариант осуществления способа по изобретению относится к лечению и/или профилактике патологических состояний, таких как, в качестве неограничивающих примеров, рак, воспале-3 013970 ние, заболевания глаза, легочная гипертензия и сосудистое кровотечение. Конкретной целью настоящего изобретения является предоставление эффективного и безопасного лечения (т.е. без побочных эффектов) патологического ангиогенеза, более конкретно, при росте опухоли, воспалении, заболеваниях глаза или сосудистом кровотечении у млекопитающих, более конкретно, у человека. Наиболее конкретно, способ по настоящему изобретению пригоден для лечения и/или профилактики солидных опухолей, более конкретно, для лечения и/или профилактики рака толстой кишки, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и меланом. Другие применения антител и антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению относятся к иммунологическому детектированию PlGF в образцах из человека в качестве меченых направляющих групп в способах диагностики и для скрининга соединений с дополнительным эффектом ингибирования PlGF при лечении рака. Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии новых лигандов, а именно, новых мышиных и гуманизированных моноклональных антител и их фрагментов, производных и гомологов, которые очень эффективно ингибируют PlGF. Наиболее конкретно, настоящее изобретение относится к лигандам, способным уменьшать рост опухоли, наиболее конкретно, способных уменьшать размер опухоли на 20-50%. Краткое описание чертежей Следующее описание, не предполагающее ограничение изобретения описанными здесь конкретными вариантами осуществления, можно понять в связи с сопроводительными фигурами, приведенными здесь в качестве ссылки, в которых: фиг. 1 - связывание антитела 16D3 (А) или гуманизированного антитела 16D3 (hu16D3) (В) с PlGF-2 человека (полученного в Pichia) в анализе ELISA в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; фиг. 2 - ингибирование связывания PlGF-2 с рецептором Flt-1 человека с помощью антитела 16D3(квадраты) или гуманизированного антитела 16D3 (треугольники) в анализе ELISA в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; фиг. 3 - результаты экспериментов на Biacore, где rhuPlGF-2 иммобилизован на чипе СМ 5 для изучения ингибирующей способности антитела 16D3 и его Fab-фрагмента, тестируемых в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; фиг. 4 - моноклональное антитело 16D3 ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы DanG человека. Лечение мышей nu/nu с опухолями приблизительно 60 мм 3 с помощью анти-tPA (контрольный IgG) (1C8; 50 мг/кг массы тела; n=10), анти-hPlGF 16D3 (анти-hPlGF) (50 мг/кг массы тела; n=10), анти-mPlGF (PL5D11D4 (полученных, как описано вWO 01/85796; 50 мг/кг массы тела; n=10), сочетания анти-hPlGF 16D3 и анти-mPlGF PL5D11D4 (антиhPlGF/анти-mPlGF)(каждое 25 мг/кг массы тела; n=10) и носителя (n=10) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. (А) Размер опухоли; (В) масса опухоли на 18 сутки после инокуляции опухоли; фиг. 5 - моноклональное антитело 16D3 ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы DanG человека дозозависимым образом. Лечение мышей nu/nu с опухолями приблизительно 60 мм 3 с помощью анти-hPlGF 16D3 (50 мг/кг = 1000 мкг/С, 37,5 мг/кг = 750 мкг/D, 25 мг/кг = 500 мкг/Е, 12,5 мг/кг = 250 мкг/F; n=10 для каждой концентрации), контрольного IgG (1C8/B; 50 мг/кг) и носителя/А (n=10) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. А: Изменение среднего размера опухоли после инокуляции опухолевых клеток; В: средний размер опухоли на 20 сутки; фиг. 6 - моноклональное антитело 16D3 ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли молочной железы MDA-MB человека. Лечение мышей nu/nu с опухолями приблизительно 60 мм 3 с помощью анти-hPlGF 16D3 (50 мг/кг массы тела; n=10) или носителя три раза в неделю в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. А: масса опухоли и В: объем опухоли, как определяли на 32 сутки после инокуляции; фиг. 7 - моноклональное антитело 16D3 ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли толстой кишки LOVO человека. Лечение мышей nu/nu с опухолями приблизительно 60 мм 3 с помощью анти-hPlGF 16D3 (50 мг/кг массы тела; n=10) или носителя три раза в неделю в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. А: масса опухоли и В: объем опухоли, как определяли на 30 сутки после инокуляции; фиг. 8 - Моноклональное антитело 16D3 ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли меланомы Меl2 а человека. Лечение мышей nu/nu с опухолями приблизительно 60 мм 3 с помощью анти-hPlGF 16D3 (50 мг/кг массы тела; n=10) или носителя три раза в неделю в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Масса опухоли, как определяли на 53 сутки после инокуляции; фиг. 9 - моноклональное антитело 16D3 предотвращает снижение массы тела на модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы DanG человека. Лечение мышей nu/nu с опухолями-4 013970 приблизительно 60 мм 3 с помощью анти-hPlGF 16D3 (50 мг/кг массы тела; n=10), контрольного IgG, сочетания анти-hPlGF и анти-mPlGF (каждое 25 мг/кг массы тела; n=10) и носителя (n=10) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Массу опухоли вычитали из массы тела перед вычислением процентной доли снижения массы тела. Светлые столбики: масса тела на первые сутки лечения; темные столбики: масса тела на последние сутки лечения; фиг. 10 - моноклональное антитело 16D3 и авастин обладают дополнительным эффектом на ингибирование роста опухоли на подкожной опухоли поджелудочной железы DanG человека. Лечение мышей nu/nu с опухолями приблизительно 60 мм 3 с помощью анти-hPlGF 16D3 (37,5 мг/кг, 25 мг/кг, 12,5 мг/кг массы тела; n=10 для каждой концентрации), контрольным IgG (1C8; 50 мг/кг), авастином (15 мг/кг и 5 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно два раза в неделю, n=10 для каждой) и сочетанием анти-hPlGF(12,5 мг/кг массы тела) и авастина (5 мг/кг массы тела; n=10) в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. Мышей умерщвляли после 20 суток инокуляции опухоли, и определяли объем опухоли; фиг. 11 - нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных частей мышиного антитела 16D3 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. А. Нуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную часть тяжелой цепи; В. Нуклеотидная последовательность,кодирующая вариабельную часть легкой цепи; С. Аминокислотная последовательность вариабельной части тяжелой цепи; D. Аминокислотная последовательность вариабельной части легкой цепи. Подчеркнуты нуклеотиды или аминокислоты, которые можно модифицировать для целей гуманизации согласно одному из вариантов осуществления изобретения; фиг. 12 - нуклеотидные и аминокислотные последовательности гуманизированных вариабельных частей 16D3 в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения. А. Нуклеотидная последовательность, кодирующая гуманизированную вариабельную часть тяжелой цепи; В. Нуклеотидная последовательность, кодирующая гуманизированную вариабельную часть легкой цепи; С. Аминокислотная последовательность гуманизированной вариабельной части тяжелой цепи; D. Аминокислотная последовательность гуманизированной вариабельной части легкой цепи. Подчеркнуты нуклеотиды или аминокислоты, модифицированные для целей гуманизации; фиг. 13 - изображение вектора для экспрессии гуманизированных 16D3 scFv в клетках 293; фиг. 14 - А: Связывание scFv16D3 и гуманизированных scFv16D3 с PlGF; В: Ингибирование связывания huPlGF-2 со своим рецептором huFlt-1 с помощью scFv16D3 и гуманизированных scFv16D3 (В); фиг. 15 - А: Аминокислотная последовательность scFv мышиного антитела 16D3; В: Аминокислотная последовательность гуманизированного scFv антитела 16D3. Подчеркнуты области за пределами вариабельной области тяжелой и легкой цепей; фиг. 16 - Изображение вектора для экспрессии гуманизированного 16D3 Fab в клетках 293 в соответствии с вариантом осуществления изобретения; фиг. 17 - А: Связывание гуманизированного Fab16D3 с huPlGF в анализе ELISA в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения; В: Ингибирование связывания huPlGF-2 со своим рецептором huFlt-1 с помощью гуманизированного Fab16D3. Определения Термин 16D3, как применяют здесь, относится к моноклональному антителу против P1GF, продуцируемому линией клеток, депонированных в BCCM/LMBP под номером LMBP 6399CB. Термин фрагмент антитела относится к компоненту части молекулы антитела, который один или в сочетании с другими фрагментами способен связываться с антигеном, против которого получено соответствующее антитело. Типичными фрагментами антитела являются Fab, Fab', F(ab')2, Fv или scFv, которые часто сохраняют аффинность к антигену, которая сравнима с полным антителом. Фрагменты меньшего размера содержат определяющие комплементарность области или CDR, такие как CDR1, CDR2 иCDR3 тяжелой или легкой цепи и/или двух или более их сочетаний. Термин производное применяют здесь для обозначения антигенсвязывающей молекулы, которая соответствует модификации исходного антитела (например того, которое продуцируется гибридомной линией клеток) или его фрагмента, без значительного нарушения связывания с антигеном. Типичные модификации включают модификации аминокислотной последовательности исходного антитела или модификации функциональных групп, присутствующих в аминокислотной последовательности, например, в контексте гуманизации, для связывания антитела или его фрагмента с другими молекулами, такими как метки или бусы, или для модификации гликозилирования. Таким образом, производные включают в себя в качестве неограничивающих примеров гуманизированные антитела, гибридные антитела,антитела или другие антигенсвязывающие молекулы, которые получены посредством пересадки или введения одной или нескольких вариабельных областей и/или CDR исходного антитела на остов другого антитела или фрагмента из того же или другого вида. Производные антитела содержат альтернативные структуры одной или нескольких CDR антитела, что дает антигенсвязывающую молекулу, такую как синтетический полипептид. Гуманизированное антитело или фрагмент антитела, как применяют здесь, относится к молекуле-5 013970 антитела или его фрагменту, в которых, по сравнению с исходным антителом, аминокислоты замещены для того, чтобы иметь большее сходство с антителом человека. Большинство этих замещений будут находиться в остове антитела или фрагмента антитела, т.е. в областях, которые не связываются с антигеном. Однако предусмотрено, что в пределах CDR также можно заместить аминокислоты, которые не принимают или, скорее всего, не принимают участие в связывании с антигеном. Реконструированное антитело или фрагмент антитела или гибридное антитело, как применяют здесь, относится к антителу, которое содержит части по меньшей мере двух разных антител, которые могут, не обязательно, происходить из того же или различных видов. Как правило, гибридное антитело человека может представлять собой человеческую константную область одного антитела, связанную с гуманизированной вариабельной областью другого антитела (которые направлены против интересующего антигена), или остов человеческого антитела из одного антитела, в котором аминокислотные последовательности в антигенсвязывающих областях замещены последовательностями другого антитела, например, антитела, не относящегося к человеку, направленного против интересующего антигена человека. Более конкретно, антигенсвязывающие области одного (обычно не относящихся к человеку) антитела,обладающие аффинностью к интересующему антигену, такие как одна или несколько CDR или их вариабельные области или части, вводят в остов другого (обычно человеческого) антитела (например, CDRпривитых антител). Термин гомология или гомологичный, как применяют здесь со ссылкой на две или более антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, относится к способности антигенсвязывающих молекул связываться с одним и тем же антигеном, более конкретно, с одним и тем же эпитопом. Способность двух антигенсвязывающих молекул связываться с одним и тем же эпитопом можно оценить определением того, могут ли антигенсвязывающие молекулы конкурировать друг с другом за связывание с одним и тем же антигеном, например, в конкурентно-связывающем анализе. Связывание с антигеном гомологичных антигенсвязывающих молекул должно осуществляться со сходной специфичностью. Идентичность последовательности двух последовательностей, как применяют здесь, относится к количеству положений с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, деленному на количество нуклеотидов или аминокислот в более коротких последовательностях при выравнивании двух последовательностей. Предпочтительно указанная идентичность последовательностей выше чем 70-80%, предпочтительно 81-85%, более предпочтительно 86-90%, особенно предпочтительно 91-95%, наиболее предпочтительно 96-100%, более конкретно, является 100%. Ввиду, как правило, ограниченного вклада остова вариабельных областей в связывание с антигеном, идентичность последовательности чаще всего определяют здесь по отношению к последовательности в определяющих комплементарность областях или CDR, т.е. по отношению к кодирующим нуклеотидным последовательностям и аминокислотным последовательностям, которые образуют CDR. Таким образом, когда последовательность, как определяют, обладает, например, 80% идентичностью последовательности на протяжении специфической последовательности в пределах CDR, это предназначено для определения идентичности последовательностей между двумя последовательностями только по отношению к последовательностям, образующимCDR. Термин PlGF применяют здесь для обозначения плацентарного фактора роста. PlGF, как обнаружили, в основном существует в виде двух сплайсированных вариантов или изоформ, PlGF-1 из 149 аминокислот и PlGF-2 из 170 аминокислот, который содержит вставку из 21 аминокислоты в С-концевой области, но также обнаружены другие изоформы. Термин ингибиторный при ссылке на антитело к PlGF или его фрагмент или производное применяют, чтобы указать, что антитело, фрагмент или производное способны ингибировать связывание PlGF со своим рецептором Flt-1. Подробное описание Настоящее изобретение будет описано со ссылкой на определенные варианты осуществления и на определенные фигуры, но настоящее изобретение этим не ограничено, а ограничено только формулой изобретения. Настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам, в частности, моноклональным антителам, их фрагментам или производным, которые связываются с тем же эпитопом PlGF, что и антитело, обозначенное здесь как антитело 16D3. Антитело 16D3, продуцируемое линией клеток LMBP 6399CB, вырабатывается против PlGF человеческого происхождения и связывает PlGF человека (обе изоформы PlGF-1 и PlGF-2). Антитело 16D3 ингибирует связывание PlGF человека со своим рецепторомflt-1, ингибируя активность PlGF. Само антитело 16D3 и его фрагменты или производные, а также нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело, фрагменты или производные, можно, таким образом, применять для ингибирования PlGF как в терапевтическом контексте, так и на модели у животных для целей тестирования или скрининга. Альтернативно, антитело можно применять для детектирования и/или определения количества PlGF или in vivo, ex vivo или in vitro. Таким образом, настоящее изобретение относится к разным применениям антигенсвязывающих молекул по изобретению и нуклеотидных последовательностей, кодирующих их. Изобретение, далее, относится к способам получения антигенсвя-6 013970 зывающих молекул по изобретению и к линиям клеток, способных продуцировать эти антигенсвязывающие молекулы. Первый аспект настоящего изобретения относится к линиям клеток, продуцирующим антигенсвязывающие молекулы по изобретению, более конкретно, линиям клеток, продуцирующим моноклональные антитела, способные связываться с тем же антигеном, что и 16D3 или их фрагменты или производные. Конкретный вариант осуществления этого аспекта изобретения представляет собой гибридомную линию клеток, также обозначаемую как линия клеток 16D3, которая продуцирует моноклональное антитело 16D3 и которая депонирована в BCCM/LMBP (Belgian Coordinated Collections of Microorganisms/Plasmid Collection Laboratorium voor Moleculaire Biologie, University of Ghent K.L. Ledeganckstraat 35,B-9000 Ghent, BE by Thromb-X on March 29th, 2005) под инвентарным номером LMBP 6399CB. Настоящее изобретение, далее, относится к линиям клеток, продуцирующим моноклональные антитела, происходящие из моноклонального антитела 16D3. Такие линии клеток можно получить модификацией последовательности, кодирующей моноклональное антитело 16D3, наиболее конкретно, кодирующей последовательности, кодирующей несвязывающие антиген области 16D3. Здесь описаны способы для определения природы модификаций, которые следует получить, и примеры подходящих модификаций. Второй аспект изобретения относится к антигенсвязывающим молекулам, способным связываться с тем же антигеном, что и антитело 16D3. Более конкретно, изобретение относится к антителу, обозначенному 16D3, продуцируемому линией клеток 16D3, описанной выше, и их гомологам, фрагментам и производным, способным к связыванию с PlGF и ингибированию активности PlGF. Таким образом, конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к антителу против PlGF человека, моноклональному антителу 16D3, как те, которые продуцирует линия клетокLMBP 6399CB, и фрагментам этого антитела. Моноклональное антитело 16D3 характеризуется аминокислотной последовательностью вариабельных областей тяжелой и легкой цепей, как описано в SEQ IDNO:2 и SEQ ID NO:4, соответственно. Согласно конкретному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к фрагментам,более конкретно, антигенсвязывающим фрагментам антитела 16D3. Такие фрагменты включают в себя в качестве неограничивающих примеров Fab, Fab', F(ab')2, CDR, пептиды с последовательностью части антитела или его CDR, одиночные вариабельные домены и их сочетания. Фрагменты Fab, Fab' и F(ab')2 можно получить протеолитическим расщеплением моноклональных антител с использованием способов,хорошо известных в данной области, таких как описанные в Stanworth et al., Handbook of ExperimentalImmunology (1978), vol. 1 chapter 8 (Blackwell Scientific Publications). Такие фрагменты, которые сохраняют способность связываться с антигеном, утратили ряд свойств родительских антител, таких как активация комплемента или способность связываться с рецепторами Fc-гамма. Более конкретно, настоящее изобретение относится к фрагментам, содержащим вариабельные области тяжелых и легких цепей 16D3,соответствующих SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4,-соответственно. Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к фрагментам, содержащим определяющие комплементарность области(CDR) 16D3 и их производные. Два чаще всего используемых способа идентификации CDR представляют собой IMGT и KABAT, и фрагменты, содержащие более одной CDR любого типа из 16D3, предусмотрены в контексте изобретения, а также производные 16D3, содержащие эти фрагменты или CDR. Согласно идентификации CDR с помощью IMGT, области CDR внутри вариабельных областей 16D3 соответствуют SEQ ID NO:17 (GYTFTDYY), SEQ ID NO:18 (IYPGSGNT), SEQ ID NO:19 (VRDSPFFDY),SEQ ID NO:20 (QSLLNSGMRKSF), SEQ ID NO:21 (WAS) и SEQ ID NO:22 (KQSYHLFT). Таким образом,настоящее изобретение относится к фрагментам антитела 16D3, содержащим одну или несколько CDR 16D3, как представлено на SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:22. Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к фрагментам 16D3, которые являются растворимыми или заякоренными в мембране одноцепочечными вариабельными частями 16D3. Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) является генетически сконструированным фрагментом антитела, который обычно состоит из вариабельной тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (VL) иммуноглобулина, или его частей, соединенных вместе гибким пептидным линкером. Необязательно, scFv содержат области CDR антитела, представляющего интерес и каркасные области другого антитела. Аминокислотная последовательность областей каркаса scFv и/или CDR, необязательно гуманизирована для снижения антигенности для применения в качестве лекарственного средства у людей. Изобретение относится кscFv 16D3 и его гуманизированной версии, содержащей SEQ ID NO:24 и SEQ ID NO:26, соответственно. Способы получения одноцепочечных вариабельных частей антител известны специалисту и описаны здесь в примере 6. Например, способ может включать амплификацию последовательностей ДНК вариабельных частей тяжелых и легких цепей человека в отдельных реакциях и клонирование с последующей вставкой линкерной последовательности из пятнадцати аминокислот, например (Gly4 Ser)3, между VH иVL с помощью двустадийной полимеразной цепной реакции (PCR) (см., например, Dieffenbach andDveksler, "PCR Primer, a laboratory manual" (1995), Cold Spring Harbour Press, Plainview, NY, USA). Полученный фрагмент можно затем вставить в подходящий вектор для экспрессии одноцепочечного вариабельного фрагмента в виде растворимого или экспонированного на фаге полипептида. Этого можно достичь способами, хорошо известными специалистам в данной области, такими как описано в Gilliland etal., Tissue Antigens (1996). 47:1-20. Настоящее изобретение также относится к фрагментам 16D3, которые являются антигенсвязывающими пептидами, характерными для гипервариабельных областей антитела 16D3 или их сочетаний. Такие пептиды можно получить синтезом с использованием прикладного синтезатора биосистем, например, синтезатора полипептидов, такого как модель 9050, доступная от Milligen (USA) или модель сходного уровня техники. Другой вариант осуществления изобретения относится к производным антитела 16D3 или их фрагментам. Более конкретно, изобретение относится к антителам, содержащим вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи, как показано на SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, соответственно, но константные области которых отличаются от константных областей 16D3. Дополнительно или альтернативно, производные антитела 16D3 по настоящему изобретению содержат по меньшей мере, две CDR 16D3, как представлено на SEQ ID NO:17 (GYTFTDYY) , SEQ ID NO:18 (IYPGSGNT), SEQ(KQSYHLFT), в то время как каркасные области между CDR и/или константные области отличаются. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения производные антитела 16D3 или их фрагменты предоставлены обладающими по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с вариабельной областью тяжелой и легкой цепи 16D3, представленной на SEQ ID NO:2 иSEQ ID NO:4, соответственно. Наиболее конкретно, настоящее изобретение относится к производным антитела 16D3 или его фрагментам, содержащим вариабельную область тяжелой цепи и/или область легкой цепи, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности кSEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, соответственно, в пределах области CDR. Идентичность последовательности внутри каркасных областей может составлять, без ограничения, менее 80%. Также предусмотрены производные, содержащие по меньшей мере две CDR, которые обладают по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с последовательностями SEQ ID NO:17-22, соответственно. Согласно другому варианту осуществления изобретение относится к производному scFv 16D3, содержащему последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%,более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:24, и последовательность, обладающую по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:26, наиболее конкретно внутри областиCDR. Согласно другому варианту осуществления изобретение относится к производным 16D3 или их фрагментам, которые являются гуманизированными. Такие гуманизированные производные 16D3 являются гомологами в том, что они сохраняют аффинность связывания с PlGF. Согласно конкретному варианту осуществления гуманизированные производные 16D3 также сохраняют способность ингибировать активность PlGF. Гуманизации антител, не относящихся к человеку, достигают заменой одной или нескольких аминокислот в остове антитела, т.е. тех аминокислот, которые не вовлечены в связывание антитела с антигеном, чтобы иметь большее сходство с остовом антитела человека. Предусмотрены разные типы или уровни гуманизации. Конкретные варианты осуществления изобретения относятся к антителам или фрагментам, в которых целые области, более конкретно, константная(ые) область(и) антитела, не относящегося к человеку, или фрагмента заменена(ы) константной(ыми) областью(ями) антитела человека для того, чтобы получить химерные (например, человеческие/мышиные) антитела или фрагменты. Другие конкретные варианты осуществления являются антителами, в которых антигенсвязывающие аминокислоты (например, две или более CDR) антитела против PlGF, не относящегося к человеку, введены в остов антитела человека (например, CDR-привитые антитела). Способы соединения области, определяющей комплементарность связывания (CDR), из не относящегося к человеку моноклонального антитела с каркасными областями человека, в частности, константной С-областью гена человека - известны специалисту, как, например, описанные Jones et al. в Nature (1986) 321:522 или Riechmann в Nature (1988) 332:323. Альтернативно, также предусмотрена замена более ограниченного количества аминокислот не относящихся к человеку анти-PlGF антител по изобретению. Конкретные варианты осуществления изобретения относятся к антителам, содержащим гуманизированные вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи фиг. 9, или их частям и антителам, содержащим по меньшей мере две, более конкретно, три-пять, наиболее конкретно, все шесть CDR SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:22. Другие варианты осуществления изобретения относятся к гуманизированным антителам, содержащим вариабельные области тяжелой и/или легкой цепи, обладающие по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:8, соответственно. Альтернативно, настоящее изобретение относится к гуманизированным антителам, содержащим по меньшей мере две, более конкретно,-8 013970 три-пять, наиболее конкретно, шесть CDR, обладающих по меньшей мере 80%, в частности, по меньшей мере, 85%, более конкретно, по меньшей мере 90%, наиболее конкретно, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO:17-22, соответственно. Настоящее изобретение, таким образом, относится к. гуманизированным и/или химерным или гибридным антителам, полученным из мышиного антитела 16D3. В конкретном варианте осуществления конкретные аминокислоты мышиного антитела 16D3 изменены мутацией для удаления иммуногенных аминокислот. Таким образом, в конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам, содержащим аминокислотную последовательность вариабельной части тяжелой цепи согласно SEQ ID NO:2, где изменены одна или несколько из следующих аминокислот:I2V, Р 9 А, K40 А и/или T111L. Дополнительно или альтернативно, гуманизированные антитела, полученные из антитела 16D3, являются антигенсвязывающими молекулами, содержащими аминокислотную последовательность вариабельной части легкой цепи согласно SEQ ID NO:4, где изменены, одна или несколько из следующих аминокислот: S5T, S9D, A15L, K18R, R22N и/или L89V. Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления, изобретение относится к антигенсвязывающим молекулам, содержащим как аминокислотную последовательность вариабельной части тяжелой цепи согласно SEQ IDNO:2, где изменены одна или несколько из следующих аминокислот: I2V, P9 А, K40 А и/или T111L, так и аминокислотную последовательность вариабельной части легкой цепи SEQ ID NO:4, где изменены одна или несколько из следующих аминокислот: S5T, S9D, A15L, K18R, R22N и/или L89V. В другом варианте осуществления антитело является дополнительно гуманизированным в том, что(гуманизированные) вариабельные легкая и/или тяжелая цепи мышиного антитела 16D3 встроены в каркас иммуноглобулина человека или соединены с константной областью антитела человека, более конкретно, с константной областью IgG человека. В частности, подходящими в связи с этим IgG являютсяIgGl (IgGl-каппа), которые способны активировать естественные киллерные клетки в организме. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение, таким образом, относится к гибриднымHu16D3 - IgGlK. Альтернативный вариант осуществления настоящего изобретения является гибриднымиHu16D3 - гибридными IgG4. IgG-антитела человека (и, таким образом, также гибридные антитела, полученные с использованием остова и/или константных областей IgG человека) обладают увеличенным временем полужизни, таким образом, обеспечивая очень стабильные уровни в плазме и давая возможность существенно уменьшить частоту введения. Далее, применение гуманизированных антител или производных несет минимальный риск вызывания иммунных ответов. Другие варианты осуществления настоящего изобретения относятся к антигенсвязывающим молекулам, которые гомологичны антителу 16D3 или их фрагментам, т.е. антигенсвязывающим молекулам,которые связываются с тем же эпитопом, что и антитело 16D3. В одном из вариантов осуществления гомологичные антигенсвязывающие молекулы получают специально иммунизацией животных, более конкретно, мыши, например, инъекцией PlGF мышам и затем слиянием лимфоцитов селезенки с линией клеток миеломы мыши, с последующей идентификацией культур клеток, продуцирующих анти-PlGF антитела (например, скринингом на связывание с PlGF), и их клонированием. Необязательно, дальнейшую селекцию антител осуществляют на основе реактивности по отношению к эпитопу для 16D3, или конкуренции с антителом 16D3 или его фрагментом. Еще один аспект изобретения, таким образом, относится к способам получения антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Эти способы включают в себя в качестве неограничивающих примеров способы гуманизации антитела 16D3, как представлено здесь в разделе примеров. Еще один аспект настоящего изобретения относится к предоставлению нуклеотидных последовательностей, кодирующих антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, наиболее конкретно, их антигенсвязывающие области. Конкретные варианты осуществления изобретения относятся к нуклеотидным последовательностям, кодирующим вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, определяемыми SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:4, соответственно, как, например, в качестве неограничивающих примеров, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:3,соответствующие последовательностям линии клеток 16D3, кодирующим область тяжелой и легкой цепей антитела 16D3. Также в контексте настоящего изобретения представлены нуклеотидные последовательности, которые кодируют одну или несколько областей CDR моноклонального антитела 16D3, как идентифицированные на SEQ ID NO:17-22. Конкретные варианты осуществления изобретения включают последовательность, кодирующую scFv и гуманизированный scFv 16D3, как, например, в качестве неограничивающих примеров, SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:25, соответственно. Изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, кодирующим описанные здесь производные 16D3 и их фрагменты. Настоящее изобретение также относится к зондам и праймерам, способным специфически гибридизоваться с указанными выше нуклеотидными последовательностями, как, например, в качестве неограничивающих примеров, праймерам, описанным в разделе примеров. Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые комплементарны последовательностям, кодирующим описанные здесь моноклональные антитела, их фрагменты или производные.-9 013970 Еще один аспект настоящего изобретения относится к терапевтическому применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Настоящее изобретение, таким образом, относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению в качестве лекарственного средства. В этом отношении, изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим одну или несколько антигенсвязывающих молекул по изобретению, для профилактики или лечения заболеваний или расстройств, в которых ангиогенез вносит вклад в патологию заболевания или расстройства. Следовательно, способы лечения и/или профилактики заболеваний, в которых ангиогенез вносит вклад в патологию заболевания или расстройства, включают введение млекопитающему, нуждающемуся в таком лечении или профилактике, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей одну или несколько описанных здесь антигенсвязывающих молекул. При таких заболеваниях ангиогенез также обозначают как патологический ангиогенез. Примеры такого патологического ангиогенеза включают ангиогенез, наблюдаемый при патологии кровеносных сосудов (атеросклероз, гемангиома, гемангиоэндотелиома), кости и суставов (ревматоидный артрит, синовиит, костно-хрящевая деструкция, остеомиелит, образование паннуса, образование остеофитов, новообразования и метастазы), кожи (бородавки, пиогенные гранулемы, рост волос, саркома Капоши, келоидные рубцы, аллергический отек, новообразования), печени, почек, легких, уха и других эпителиев(воспалительные и инфекционные процессы, включая гепатит, гломерулонефрит, пневмонию, астму,назальные полипы, отит и трансплантацию, регенерация, новообразования и метастазы в этих органах),при определенных патологиях матки, яичника и плаценты (дисфункциональное маточное кровотечение,например, вследствие внутриматочных противозачаточных устройств, образования фолликулярных кист,синдрома гиперстимуляции яичников, эндометриоза, новообразований), патологий мозга или нервов (новообразования и метастазы), определенных повреждений сердечной и скелетной мускулатуры (например, вследствие работы с перегрузкой), патологических состояний жировой ткани (ожирение) и эндокринных органов (тиреоидит, увеличение щитовидной железы, пересадка поджелудочной железы). Патологический ангиогенез может также вносить вклад в заболевания гематопоэза (СПИД, саркома Капоши), гематологические опухоли (лейкозы и т.п.). При ряде заболеваний глаза патологический ангиогенез, как предполагают, является важным фактором, и, таким образом, предусмотрено лечение антигенсвязывающими молекулами по настоящему изобретению. При ишемических заболеваниях сетчатки снижено снабжение сетчатки кровью и кислородом, периферические части сетчатки утрачивают источник питания и перестают нормально функционировать. Общими причинами ретинопатии являются окклюзия центральных вен сетчатки, стеноз сонной артерии, диабет (диабетическая ретинопатия) и анемия (серповидноклеточная ретинопатия). Ретинопатию также наблюдают у недоношенных детей (ретролентальная фиброплазия). Диабетическая ретинопатия является главной причиной потери зрения у пациентов с диабетом. В ишемизированной сетчатке происходит образование новых кровеносных сосудов (неоваскуляризация). Эти сосуды часто образуются на поверхности сетчатки, у зрительного нерва или в передней части глаза на радужной оболочке. Новые сосуды не могут восстановить приток необходимых питательных веществ и, вместо этого, могут вызывать множество проблем, таких как кровоизлияние в стекловидное тело, отслоение сетчатки и неконтролируемая глаукома. Эти проблемы возникают вследствие того, что новые сосуды являются ломкими и склонными к кровотечению. При обнаружении на начальных стадиях пролиферативную диабетическую ретинопатию можно иногда остановить панретинальной фотокоагуляцией. Однако в некоторых случаях хирургическая витрэктомия является единственным средством выбора. Другие заболевания глаза, при которых ангиогенез, как предполагают, играет ключевую роль, представляют собой хориоидальные и другие внутриглазные расстройства, лейкомаляцию и новообразования, и метастазы. Хориоидальная неоваскуляризация представляет собой образование новых кровеносных сосудов, которые прорастают из сосудистой оболочки через разрыв мембраны Бруха в пигментный эпителий сетчатки (sub-RPE) или субретинальное пространство. Локализация, характер роста и тип (1 или 2) CNV зависят от возраста пациента и лежащего в основе заболевания. Кровотечение и образование экссудата происходят при дальнейшем росте, являясь причиной зрительных симптомов. Хориоидальная неоваскуляризация (CNV) является главной причиной потери зрения. Подсчитано, что CNV возникает в 5-10% близорукости и возникает практически при всех перфорациях сосудистой оболочки в ходе фазы излечения; большинство проходят спонтанно, но у 1530% пациентов CNV может рецидивировать и приводить к геморрагическому или серозному отслоению желтого пятна с сопутствующей потерей зрения. Термин легочная гипертензия относится к расстройству, при котором кровяное давление в легочных артериях является патологически высоким. В отсутствие других заболеваний сердца или легких ее называют первичной легочной гипертензией. Диффузное сужение легочных артериол возникает в результате патологического артериогенеза с последующей легочной гипертензией в качестве реакции на повышенное сопротивление кровотоку. Частота возникновения составляет 8 на 100000 человек. Однако легочная гипертензия может также возникать как осложнение хронических обструктивных заболеваний легких (COPD), таких как эмфизема, хронический бронхит или диффузный интерстициальный фиброз, и у пациентов с астматическим COPD. Частота возникновения COPD составляет приблизительно 5 на- 10013970 10000 человек. Еще одним примером заболевания, при котором ангиогенез вносит вклад в патологию заболевания и при котором предусмотрено лечение антигенсвязывающими молекулами по настоящему изобретению,является группа воспалительных расстройств. Воспаление, как применяют здесь, означает местную неконтролируемую реакцию на повреждение (т.е. физическое, химическое или в результате инфекции) живых тканей, особенно местную реакцию небольших кровеносных сосудов, их содержимого и связанных с ними структур. Прохождение компонентов крови через стенки сосудов в ткани является отличительным признаком воспаления, и таким образом образующееся скопление в ткани называют экссудатом или отеком. Любой патологический процесс, который повреждает живую ткань, как, например, в качестве неограничивающих примеров, инфекция бактериями, перегрев, холод, механическое повреждение,такое как размозжение, кислоты, щелочи, излучение или инфекция вирусами может вызывать воспаление безотносительно к вовлеченному органу или ткани. Такие воспалительные заболевания включают реакции, варьирующие от ожогов до пневмонии, проказы, туберкулеза и ревматоидного артрита. Образование спаек после операции (РОА) является частым хирургическим осложнением в гинекологической, тазовой и кардиологической хирургии. Хирургическое повреждение тканей часто вызывает образование постоянного рубца, который соединяет поврежденную ткань с другим органом. Таким образом, на месте такого повреждения внутренние ткани, которые в норме остаются разделенными, часто становятся соединенными друг с другом. Осложнения, возникающие в результате образования спаек,представляют собой непроходимость кишечника, непроходимость тонкой кишки, хроническую тазовую боль и бесплодие у женщин. Термин образование спаек в медицинском смысле относится к срастанию,процессу плотного соединения или объединения двух поверхностей или частей, например, объединение противоположных поверхностей раны или противоположных поверхностей брюшины. Также спайки во множественном числе, могут обозначать воспаленные связки, которые соединяют противоположные серозные поверхности. Термин спайка, как применяют здесь, также включает фибринозные спайки, которые представляют собой спайки, которые состоят из тонких нитей фибрина, возникающих из экссудата плазмы или лимфы, или экстравазации крови. Келоид, гладкое разрастание фибробластной ткани, которая возникает в области повреждения или иногда спонтанно, является также формой спайки. Показано,что ингибирование плацентарного фактора роста (PlGF) приводит к примечательному подавлению постоперативного образования спаек (WO03063904). Более того, показано, что ингибирование P1GF может оказывать благоприятное действие(WO2004002524) при заболеваниях, отличающихся резорбцией кости, как, например, в качестве неограничивающих примеров, остеопороз. Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, в особенности, подходят для лечения и/или профилактики роста опухоли и метастазов, заболеваний глаза, воспаления, образования спаек и легочной гипертензии. Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению для профилактики и/или лечения рака, такого как, в качестве неограничивающих примеров, рака молочной железы, легкого, предстательной железы, мозга, печени, поджелудочной железы, толстой кишки, почки, матки или костного мозга. Более конкретно, изобретение относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению для профилактики и/или лечения солидных опухолей, таких как, в качестве неограничивающих примеров, рака толстой кишки, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и меланом. Более конкретно, здесь представлены данные, которые показывают, что антитела по настоящему изобретению, в особенности,подходят для получения регрессии опухолей поджелудочной железы человека. Показано, что антитела по настоящему изобретению значительно уменьшают размер опухоли in vivo; таким образом, показаны уменьшения размера вплоть до приблизительно 50%. Таким образом, настоящее изобретение относится к способам и фармацевтическим композициям для уменьшения размера опухоли по меньшей мере на 20%,более конкретно, по меньшей мере на 30%, наиболее конкретно, по меньшей мере на 50%. Другой конкретный вариант осуществления изобретения относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению в лечении или профилактике костных расстройств и, более конкретно, для лечения состояний, при которых происходит усиленная резорбция кости, такая как, например, остеопороз или остеомаляция. Следовательно, настоящее изобретение относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения вышеупомянутых заболеваний. Важный аспект настоящего изобретения состоит в том, что антитела, их фрагменты и производные дают возможность лечения и/или профилактики вышеупомянутых заболеваний без побочных эффектов,относимых на счет или ожидаемых от других антиангиогенных способов лечения, более конкретно, альтернативных способов лечения с использованием ангиогенных факторов, таких как VEGF. Доклинические безопасные испытания рекомбинантных человеческих антител анти-VEGF показали, еще в 1999, что ингибирование VEGF приводит к ингибированию физиологического ангиогенеза, более конкретно, не- 11013970 оваскуляризации при росте костей в длину и формировании желтых тел (Ryan et al., 1999 Toxicologic pathology 27(1):78-86) . В последних исследованиях описывают, что ингибиторы VEGF вызывают регрессию сосудов в здоровой трахее и щитовидных железах, которая может приводить к органной дисфункции (Baffert et al., 2004 Circ Res 94:984-992; Inai et al., 2004 Am. J. Pathol. 165:35-52) . Тем не менее, бевацизумаб, антитела против VEGF человека, в настоящее время находится на рынке в качестве супрессора ангиогенеза, несмотря на наблюдаемые для него эффекты на заживление ран, кровяное давление и риск тромбоза, вследствие общей эффективности данного антиангиогенного способа регрессии опухолей. Антитела анти-PlGF и производные по настоящему изобретению позволяют ингибировать нежелательный ангиогенез без этих наблюдаемых побочных эффектов на кровяное давление, заживление ран, риск тромбоза и регрессию сосудов в здоровых органах. Конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим, в качестве активного ингредиента, моноклональное антитело 16D3 или его фрагмент или производное, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит терапевтически эффективное количество одной или нескольких антигенсвязывающих молекул. Сходным образом, настоящее изобретение относится к способам лечения и/или профилактики, которые включают введение терапевтически эффективного количества одной или нескольких антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Терапевтически эффективное количество, как применяют здесь, означает количество в диапазоне от приблизительно 0,5 мг на килограмм массы тела (мг/кг) до приблизительно 50 мг/кг, более предпочтительно от приблизительно 1 до приблизительно 10 мг/кг млекопитающего, подлежащего лечению. Следует принимать во внимание, что ввиду большого времени полужизни большинства человеческих антител IgG антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, которые являются моноклональными антителами данного класса, обеспечат периодичность лечения, что вносит вклад в удобство для пациента. Согласно еще одному аспекту изобретения предоставлены фармацевтические композиции, которые содержат антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению и другое антиангиогенное средство, а также способы лечения, включающие одновременное или последовательное введение антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению и другого антиангиогенного средства. Действительно,для настоящего изобретения показан аддитивный эффект антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению и других антиангиогенных средств, таких как антитела анти-VEGF, на ингибирование роста опухоли. Более конкретно, показано, что сочетанное применение антитела 16D3 по настоящему изобретению и Avastm способно уменьшить размер опухоли вплоть до приблизительно 70%, в то время как повышенные дозировки или одного Avastin, или анти-PlGF антител не приводят к уменьшению размера опухоли более чем на 55% в тех же условиях. Другие подходящие антиангиогенные средства, а также их обычная дозировка в зависимости от класса, к которому они принадлежат, хорошо известны специалистам в данной области. Примеры антиангиогенных средств включают ингибиторы VEGF, действующие непосредственно на VEGF, такие как антитела, направленные против VEGF, продаваемые под названиемAvastin, или действующие на рецепторы VEGF. Антитела по настоящему изобретению дают возможность снизить дозировку, например, ингибирующих VEGF антиангиогенных средств, о которых известно, что они вызывает ряд побочных эффектов, как описано выше. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать терапевтически эффективное количество других соединений/лекарственных средств, действующих на заболевание, подлежащее лечению, более конкретно, других соединений/лекарственных средств, эффективных при лечении роста опухоли, воспаления, заболеваний глаза и легочной гипертензии. Подходящие фармацевтические носители для применения в фармацевтических композициях по изобретению описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th ed. (1980), и их состав хорошо известен специалистам в данной области. Они включают все без исключения растворители, дисперсные среды, вещества для покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства (например, фенол,сорбиновую кислоту, хлорбутанол), изотонические вещества (такие как сахара или хлорид натрия) и т.п. Дополнительные ингредиенты можно включать для контроля продолжительности действия активного ингредиента моноклональных антител в композиции. Композиции с контролируемым высвобождением можно, таким образом, получать отбором подходящих полимерных носителей, таких как, например,сложные полиэфиры, полиаминокислоты, поливинилпирролидон, сополимеры этилен-винилацетата, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, сульфат протамина и т.п. Скорость высвобождения лекарственного средства и продолжительность действия можно также контролировать включением активного ингредиента моноклональных антител в частицы, например, микрокапсулы, из полимерного вещества,такого как гидрогели, полимолочная кислота, гидроксиметилцеллюлоза, полиметилметакрилат и другие вышеописанные полимеры. Такие способы включают системы доставки коллоидного лекарственного средства, такие как липосомы, микросферы, микроэмульсии, наночастицы, нанокапсулы и т.д. В зависимости от способа введения для фармацевтической композиции, содержащей активный ингредиент, могут потребоваться защитные покрытия. Фармацевтическая форма, пригодная для инъекционного примене- 12013970 ния, включает стерильные водные растворы или коллоидные растворы и стерильные порошки для ее экстратемпорального приготовления. Типичные носители, таким образом, включают биосовместимые водные буферы, этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и их смеси. Антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению можно вводить пациенту любыми способами, которые хорошо известны в данной области, т.е. перорально, интраназально, подкожно,внутримышечно, внутрикожно, внутривенно, внутриартериально, парентерально или через катетер. Согласно конкретному аспекту настоящего изобретения антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению вводят с помощью генотерапии. Основанная на антителах генотерапия дает возможность преодолеть ряд потенциальных ограничений, связанных с введением антител, как например,крупномасштабное производство, биораспределение, быстрый клиренс крови и плохое удерживание моновалентных антител. Выработка in vivo делает антитела менее иммуногенными и лучше переносимыми и дает эффективные и устойчивые уровни антигенсвязывающих молекул или их фрагментов. Более того,генетические способы дают возможность предоставить антигенсвязывающие молекулы с новыми функциями. Возможность выработки in vivo и системной доставки моноклональных антител разными клетками/тканями показали с использованием переноса генов in vivo вирусными векторами (Pelegrin et al., 2004,Gene Ther 4:347-356). Также показано уменьшение роста опухоли in vitro и in vivo генной модификацией клеток фибросаркомы с помощью антител к ламинину с антиангиогенной активностью (Sanz et al., 2001,Cancer Immunol. Immunother 50:557-565). Таким образом, согласно этому варианту осуществления настоящее изобретение относится к нуклеотидам, кодирующим антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в генотерапии при лечении заболеваний, отличающихся описанным здесь патологическим ангиогенезом. В частности, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи, определяемую SEQ ID NO:2, и/или нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область легкой цепи, определяемую SEQ ID NO:4,для применения в генотерапии. Более конкретно, настоящее изобретение относится к композициям, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:3, соответствующую последовательностям линии клеток 16D3, кодирующим область тяжелой и легкой цепей антитела 16D3. Также в контексте настоящего изобретения предоставлены композиции, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют одну или несколько областей CDR моноклональных антител 16D3,как идентифицированные на SEQ ID NO:17-22. Конкретные варианты осуществления изобретения включают последовательность, кодирующую scFv и гуманизированный scFv 16D3, такую как, в качестве неограничивающих примеров, SEQ ID NO:23 и SEQ ID NO:25, соответственно. Способ лечения и/или профилактики согласно изобретению может включать далее лечение или профилактику такого же состояния патологического ангиогенеза введением, предпочтительно последовательным введением пациенту терапевтически эффективного количества антиангиогенного или противоопухолевого средства, такого как вышеописанное, под заголовком фармацевтических композиций. Последовательно, как применяют здесь, означает, что лиганд по настоящему изобретению и известное антиангиогенное средство вводят пациенту последовательно, а не одновременно. Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антигенсвязывающих молекул по изобретению для иммунологического детектирования PlGF в образцах из человека и в качестве компонентов наборов, пригодных для такого детектирования. Способы иммунологического детектирования антигена известны в данной области и включают в себя в качестве неограничивающих примеров EIA,ELISA и RIA, и иммуногистохимические способы. Связывание мышиных антител по настоящему изобретению с антигеном PlGF можно детектировать опосредованно, например, с помощью меченых антител против мыши. Альтернативно, антитела или их фрагменты можно метить непосредственно. Конкретный вариант осуществления этого аспекта изобретения относится к применению антител против PlGF и их антигенсвязывающих фрагментов в выявлении пациентов, восприимчивых к лечению с помощью анти-PlGF. Это представляет особенный интерес при лечении рака. Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению в качестве диагностического средства. Показано в данной области, что в ряде патологических состояний усилена экспрессия PlGF. Более конкретно, для ряда опухолей показана сверхэкспрессия PlGF. Гуманизированные антитела или фрагменты антител по настоящему изобретению можно применять в диагностике этих патологических состояний, например, способами визуализации, в которых антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению метят и визуализируют in vivo. В данной области известно множество меток для визуализации связывания антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению in vivo, и они включают в себя в качестве неограничивающих примеров оптические (например, флуоресцентные), металлические и магнитные метки, для каждой из которых требуются специфические (радиация и) устройства для детектирования. Конкретный вариант осуществления этого аспекта изобретения относится к применению антител по изобретению в предсказании прогноза заболевания и выборе принятого лечения. Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению в моделях на животных при скрининге соединений для применения в соче- 13013970 тании с лечением анти-PlGF. Такие модели включают в себя в качестве неограничивающих примеров модели опухолей, где исследуют рост и развитие опухолевых клеток человека на мышах nu/nu. Сочетанное введение соединения, подлежащего тестированию, и антител или фрагмента по настоящему изобретению дает возможность определить, обладает ли соединение аддитивным эффектом по сравнению с эффектом, наблюдаемым при введении одних антител или фрагментов по изобретению. Также, таким образом можно определить другие аспекты, такие как обратная эффективность или токсичность соединения в сочетании с антителами анти-PlGF. Кроме описанного выше терапевтического применения, нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению, описанные выше, применимы в получении антител и других антигенсвязывающих фрагментов, например, рекомбинантными способами. Таким образом, настоящее изобретение далее относится к способам получения рекомбинантных антител и фрагментов антител, включая клонирование и манипуляцию с генами антител, получение scFv и других антигенсвязывающих фрагментов с использованием описанных здесь нуклеотидных последовательностей. Описание этих способов доступно в данной области. Кроме того, зонды, специфически гибридизующиеся с нуклеотидными последовательностями по настоящему изобретению, можно применять для скрининга на экспрессию антител и фрагментов антител по настоящему изобретению. Настоящее изобретение далее описано с помощью следующих примеров, которые приведены только с иллюстративными целями. Примеры Пример 1. Получение и характеризация мышиных антител против PlGF человека (16D3) 1. Иммунизация мышей и слияние Моноклональные антитела против PlGF человека получали по существу, как описано в Galfre andMilstein (Galfre F., Milstein C. Preparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures. Method Enzymol. 1981; 73:3-46). Вкратце, мышей с нокаутом PlGF (Luttun et al. , 2002, Biochem Biophys Res. Comm. 295 (2): 428-34, Carmeliet et al., 2001, Nat. Med. 7:575-593 или WO 01/857 96) иммунизировали подкожной инъекцией 50 мкг рекомбинантного PlGF-2 человека (продуцированного в Pichia) в полном адъюванте Фрейнда, две недели спустя иммунизировали подкожной инъекцией 50 мкг рекомбинантного PlGF человека в неполном адъюванте Фрейнда. Образцы крови (приблизительно 100 мкл) отбирали из хвостов . мышей после 10 суток. Сыворотки тестировали на антитела анти-huPlGF посредством ELISA с использованием планшетов для микротитрования, покрытых иммобилизованным PlGF человека, использованием разведенных сывороток (от 1/500 до 1/8000) и козьих IgG против мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP), для мечения. Спустя промежуток по меньшей мере 6 недель мышей (с высокими положительными ответами) повторно иммунизировали внутрибрюшинно 50 мкг рекомбинантного PlGF человека в солевом растворе на 4 и 2 сутки перед слиянием клеток. Клетки селезенки выделяли и подвергали слиянию с клетками миеломы Sp2/0-Ag14. После селекции на среде с гипоксантином, аминоптерином, тимидином положительные клоны отбирали с использованием супернатантов культур в ELISA, как описано выше. 2. Очистка антител на ProSep vA Ultra Антитела очищали от супернатанта культуры клеток аффинной хроматографией на ProSep vA Ultra(Millipore) согласно описанию производителя. Вкратце, 150 мМ NaCl добавляли к супернатанту и супернатант наносили на колонку ProSep vA Ultra, которую предварительно уравновешивали PBS. Колонку промывали PBS и связавшийся белок элюировали 0,1 М глицином рН 2,8. Элюированный белок диализовали ON против PBS. Чистоту элюированного белка проверяли в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях посредством SDS-PAGE. 3. Связывание 16D3/hu16D3 (полученного, как описано в примере 2) с PlGF (см. фиг. 1) Планшеты для ELISA покрывали ON 1 мкг/мл huPlGF-2 (Pichia) в PBS, 100 мкл/лунка, 4 С. После забивки 1% BSA, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения 16D3/hu16D3, 100 мкл/лунка, антитела оставляли связываться 1 ч, комнатная температура. Связавшиеся 16D3 детектировали козьими IgG-HRP против человека или козьими IgG-HRP против мыши (Sigma), 100 мкл/лунка, 1 ч,комнатная температура. Анализ детектировали посредством OPD. 4. Ингибирование связывания PlGF с рецептором huFlt-1 (см. фиг. 2) Планшеты для ELISA покрывали ON 1 мкг/мл huFlt-1 (RD Systems), 200 мкл/лунка, ON, 4C. После забивки 1% BSA, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения 16D3/hul6D3, 100 мкл/лунка, и добавляли дополнительно 100 мкл/лунка huPlGF-2. После инкубации 2 ч при комнатной температуре связавшийся PlGF детектировали козьими анти-huPlGF (RD Systems), 180 мкл/лунка, 1 ч,комнатная температура, с последующей инкубацией с RAG-HRP (DAKO), 1 ч, комнатная температура. Анализ детектировали посредством OPD. 5. Дальнейшая характеризация 16D3 и Fab 16D3 в экспериментах с Biacore Ингибирование: rhuPlGF-2 (Pichia, TX) иммобилизовали на чипе СМ 5 с использованием химииEDC/NHS (набор для присоединения аминов, Biacore), давая 412 RU. 16D3 впрыскивали с последующим впрыскиванием химерного rhuFlt-1/Fc (RD Systems). Это также осуществляли с буфером вместо мыши- 14013970 ных антител. Их также впрыскивали в канал потока для отрицательного контроля, и эти величины уже вычли. Этот анализ осуществляли в фосфатном буфере при рН 9,6. По сравнению с максимальным связыванием rhuFlt-1 с rhuPlGF-2, сигнал rhuFlt-1 снижен, если сначала впрыскивают 16D3 или 16D3Fab (фиг. 3). 6. Клонирование и секвенирование вариабельных областей 16D3 мыши Выделение мРНК: мРНК гибридомных клеток 16D3 выделяли с использованием QuickPrep MicromRNA Purification Kit (Amersham Biosciences). Эту мРНК использовали для получения кДНК с использованием First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences) с праймера pd(N)6, присутствующего в наборе.PCR: Последовательности вариабельных частей тяжелой и легкой цепи получили с помощью PCR с набора праймеров: 8 праймеров, начинающихся в лидерной последовательности, и 2 в константной области тяжелой цепи, 11 праймеров, начинающихся в лидерной последовательности, и 1 в константной области легкой цепи. Осуществляли 8 и 11 реакций PCR с разными сочетаниями праймеров. Праймеры, используемые для тяжелой цепи антитела 16D3: MHVR35'-ATG GRA TGG AGC TGK АТС WTT НТС-3' (SEQ ID NO:9) MHCR15'-CAS AYM CAG GGG CCA GTG GAT AGA C-3' (SEQ IDNO:10) Праймеры, используемые для легкой цеши антитела 16D3: MKVR35'-ATG RAG ТСА CAK ACYNO:12) Протокол PCR: денатурация 10 мин 94 С, денатурация 30 с 94C, отжиг 30 с 55 С, элонгация 1 мин 72 С, элонгация 5 мин 72 С, количество циклов 30. Вырожденность последовательности SEQ ID NO:9-11 указана с использованием общепринятых сокращений R=A или G, K=G или Т, W=A или Т, Н=А или С или Т, S=C или G, Y=C или Т, М=А или С. Клонирование и секвенирование: продукты PCR наносили на агарозный гель, правильные полосы отбирали, очищали (QIAquick Gel Extraction kit, Qiagen GmbH) и клонировали в вектор pCR4BluntTOPO, поставляемый в Zero Blunt ТОРО PCR Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen life technologies). Плазмидную ДНК получали с использованием High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche DiagnosticsGmbH), и вставки секвенировали с использованием обратных праймеров Т 7 и М 13 на ABI PRISM 310(РЕ Applied Biosystems). Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей антитела 16D3 показаны на SEQ ID NO:1, 2, 3 и 4 (см. фиг. 11). Пример 2. Получение и характеризация гуманизированных антител против PlGF человека (16D3) 1. Конструирование гуманизированных 16D3 Гуманизация вариабельных областей Мутации: Получены следующие мутации для гуманизации вариабельных частей мышиного антитела 16D3:(Stratagene). В 1 PCR могли использовать от 1 до 5 праймеров, содержащих мутации. После трансформации колонии отбирали, и ДНК секвенировали для определения клона с наибольшим количеством точечных мутаций. Этот клон отбирали для повторения этой процедуры до получения всех мутаций в последовательности. Соединение вариабельных областей с константной областью IgG человека: С помощью PCR получили гуманизированные вариабельные части тяжелой и легкой цепей, к которым добавили подходящие участки рестрикции. Праймеры для вариабельной части легкой цепи: Праймер 1:5'-CCACCGGT GAC ATT GTG CTG ACC CAG TCT CC-3' (SEQ ID NO:13) Праймер 2:5'-CACCGTACGTTTTAT TTC CAA CTT TGT CCC CGA G-3' (SEQ ID NO:14)- 15013970 Праймеры для вариабельной части тяжелой цепи: Праймер 3:5'-CAG GTC CAG CTG CAG CAG TCT G-3' (SEQ ID NO:15) Праймер 4:5'-GATGGGCCCTTGGTCGACGC TGA GGA GAC TGT GAG CAG GG-3' (SEQ IDNO:16) Протокол PCR: денатурация 5 мин 94 С, денатурация 30 с 94C, отжиг 30 с 60 С, элонгация 30 с 72 С, элонгация 5 мин 72 С, количество циклов 25. Продукты PCR наносили на агарозный гель, полосы отбирали и очищали (QIAquick Gel Extractionkit, Qiagen GmbH). Продукт PCR вариабельной части тяжелой цепи 16D3 расщепляли SalI, векторpKANEO-MCS50-Hleu-var24, содержащий полную константную часть тяжелой цепи человеческих антител (IgG4), расщепляли Есо 47III и SalI и лигировали. Продукт PCR вариабельной части легкой цепи сначала клонировали в вектор pCR4Blunt-TOPO, поставляемый в Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kitfor Sequencing (Invitrogen life technologies). Вариабельную часть легкой цепи отщепляли с помощьюAgeI и BsiWI и клонировали в вектор pKANEO-CM30-L-var7, который уже содержал константную часть легкой каппа-цепи человека. Оба вектора объединяли в один вектор выщеплением экспрессирующей кассеты легкой цепи из вектора с использованием PmeI и PacI и присоединением ее к вектору, содержащему тяжелую цепь. Нуклеотидные и аминокислотные: последовательности вариабельных частей тяжелой и легкой цепей гуманизированных антител 16D3 представлены на SEQ ID NO:5, 6, 7 и 8 (см. фиг. 12). 2. Кратковременная экспрессия hu16D3Expression System (Invitrogen) согласно инструкции производителя. Hul6D3 очищали от супернатанта с использованием аффинной хроматографии на proSep vA Ultra. Чистоту очищенного hu16D3 проверяли с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. Hu16D3 далее тестировали на связывание с huPlGF и на ингибирование связывания HuPlGF/huFLT-1 с помощью ELISA (см. фиг. 1 и 2). Пример 3. Исследование in vivo ингибирования роста опухоли антителами анти-PlGF 1. Общее описание материалов и методов Культура клеток Линии клеток Panc02 поджелудочной железы мыши и линия клеток DanG поджелудочной железы человека любезно предоставлены S. Rosewicz (Charite-Universitatsmedizin Berlin, Germany). Линии клетокMDA-MB молочной железы, LOVO толстой кишки и Ме 12 а меланомы человека получены из AmericanType Culture Collection (АТСС; Manassas, VA, USA) . Все клетки культивировали согласно рекомендациям. Мышиные антитела 16D3 анти-PlGF использовали для всех экспериментов in vivo, чтобы избежать иммунного ответа на антитела. Эксперименты на животных Все процедуры на животных полностью одобрены институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию. Самок мышей NMRI nu/nu содержали в полустерильных условиях и, как общепринято, использовали их в возрасте 8-10 недель (приблизительная масса 25 г). Для получения источника опухоли опухолевые клетки обрабатывали трипсином для получения суспензии из одиночных клеток, которую промывали PBS. Осадок после центрифугирования повторно ресуспендировали в 200 мкл PBS и подкожно инъецировали мышам в правый бок. Для ортотопической модели опухоли поджелудочной железы, 1 х 106 опухолевых клеток в 30 мкл PBS инъецировали в головку поджелудочной железы с помощью брюшной лапаротомии самок мышей С 57 В 16 в возрасте 9-10 недель. Перед процедурами мышей анестезировали кетамином (90 мг/кг массы тела) и ксилазином (9 мг/кг массы тела). Введение лекарственных средств (т.е. антител, носителя и т.п.) Лечение антителами или носителем, в качестве контроля, начинали при достижении опухолями размера приблизительно 60 мм 3. Антитела P15D11D4 (WO 01/85796), 16D3, 1 С 8 или носитель вводили в указанных дозах внутрибрюшинно через каждые сутки. Авастин инъецировали в указанных дозах внутрибрюшинно два раза в неделю. Измерения опухолей Подкожно растущие опухоли измеряли через каждые сутки с использованием измерительного инструмента, и объемы опухолей вычисляли с использованием формулы р/6 (w1w2w2), где w1 иw2 представляют собой наибольший и наименьший диаметр опухоли, соответственно. Когда мышей забивали, ортотопически растущие опухоли поджелудочной железы измеряли после брюшной лапаротомии с использованием того же способа. Статистический анализ Статистический анализ осуществляли с помощью двустороннего критерия Стьюдента для парных наблюдений с использованием статистического программного обеспечения GraphPad (GraphPad SoftwareInc., San-Diego, CA) . Все данные представлены в виде среднего значенияSEM, если не указано иначе. р 0,5, р 0,01, если не указано иначе.- 16013970 2. Ингибирование роста опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы DanG человека мышиными анти-hPlGF антителами 16D3 1106 опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей NMRI nu/nu в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм 3 начинали лечение с помощью анти-hPlGF (16D3, 50 мг/кг массы тела; n=10), анти-mPlGF (PL5D11D4 (полученных, как описано в WO01/85796) 50 мг/кг массы тела; n=10), контрольными IgG (1C8; 50 мг/кг массы тела; n=10), сочетанием анти-hPlGF и анти-mPlGF (каждые 25 мг/кг массы тела; n=10) и носителем (n=10). Антитела инъецировали внутрибрюшинно через каждые сутки. (А) Опухоли измеряли через каждые сутки и объем опухолей вычисляли с использованием формулы W1W2W2p/2, где W1 представляет собой наибольший и W2 - наименьший диаметр. (В) Мышей забивали на 18 сутки после инокуляции опухоли, опухоли извлекали и взвешивали. Средний объем опухолей: носитель: 915+90 мм 3, IgG: 89 мм 3, PL5D11D4: 832118 мм 3, 16D3: 52183 мм 3, PL5D11D4 + 16D3: 49786 мм 3. Результаты, как показано на фиг. 4, показывают, что введение антитела 16D3 против PlGF человека обладает отчетливым влиянием на массу и размер опухоли. 3. Анти-hPlGF ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы DanG человека дозозависимым образом. 1106 опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей NMRI nu/nu в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм 3 начинали лечение с помощью анти-hPlGF, IgG (1C8; 50 мг/кг) , 16D3 (50 мг/кг, 37,5 мг/кг, 25 мг/кг, 12,5 мг/кг массы тела; n=10 для каждой концентрации) и носителем (n=10). (В) Мышей забивали на 18 сутки после инокуляции опухоли. Результаты показаны на фиг. 5. Средний объем опухолиSEM: 16D3, 50 мг/кг массы тела: 45037 мм 3; 37,5 мг/кг массы тела: 46997 мм 3; 25 мг/кг массы тела: 493107 мм 3; 12,5 мг/кг массы тела: 6931107 мм 3; 1 С 8: 865109 мм 3; носитель: 889100 мм 3. 4. Анти-huPlGF ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли молочной железы MDA-MB человека. 1107 опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей NMRI nu/nu в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм 3, начинали лечение с помощью анти-hPlGF, 16D3 (50 мг/кг массы тела; n=10) и носителем (n=10). Результаты показаны на фиг. 6 (и в табл. 1 ниже). Таблица 1 5. Анти-huPlGF ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли толстой кишки LOVO человека. 1107 опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей NMRI nu/nu в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм 3 начинали лечение с помощью анти-hPlGF, 16D3 (50 мг/кг массы тела; n=10) и носителем (n=10). Результаты показаны на фиг. 7 и в табл. 2 ниже. Таблица 2 6. Анти-huPlGF ингибирует рост опухоли на модели подкожного трансплантата опухоли меланомы Ме 12 а человека. 4106 опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей NMRI nu/nu в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм 3, начинали лечение с помощью анти-hPlGF, 16D3 (50 мг/кг массы тела; n=10) и носителем (n=10). Результаты показаны на фиг. 8 и в табл. 3 ниже. Пример 4. Исследование in vivo эффекта лечения антителами 16D3 на снижение массы Материалы и методы представляли собой, как описано в примере 3. 1106 опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей NMRI nu/nu в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм 3 начинали лечение с помощью анти-hPlGF (16D3, 50 мг/кг массы тела; n=10), анти-mPlGF (PL5D11D4; 50 мг/кг массы тела;n=10), контрольными IgG (1C8; 50 мг/кг массы тела; n=10), сочетанием анти-hPlGF и анти-mPlGF (каждые 25 мг/кг массы тела; n=10) и носителем (n=10). Антитела инъецировали внутрибрюшинно через каждые сутки. Массу тела мышей измеряли на первые и последние сутки лечения антителами. Массу опухоли вычитали из массы тела перед вычислением процентной доли снижения массы тела. Результаты показаны на фиг. 9. Показано, что анти-hPlGF предотвращает снижение массы тела в этой модели подкожного трансплантата опухоли поджелудочной железы DanG человека. Пример 5. Сочетание анти-hPlGF антител и анти-VEGF антител для лечения роста опухоли Материалы и методы представляли собой, как описано в примере 3. 1106 опухолевых клеток инъецировали подкожно в правый бок самкам мышей NMRI nu/nu в возрасте 11 недель. После достижения опухолями размера приблизительно 60 мм 3 начинали лечение с помощью анти-hPlGF (16D3, 50 мг/кг, 37,5 мг/кг, 12,5 мг/кг массы тела внутрибрюшинно через каждые сутки; n=10 для каждой концентрации), авастином (15 мг/кг и 5 мг/кг массы тела, внутрибрюшинно два раза в неделю, n=10 для каждой) и сочетанием анти-hPlGF (12,5 мг/кг массы тела) и авастином (5 мг/кг массы тела; n=10). Мышей забивали после 20 суток инокуляции опухоли. Результаты показаны на фиг. 10. Средний объем опухолиSEM: 1C8, 37; 37,5 мг/кг массы тела: 954164 мм 3; 12,5 мг/кг массы тела: 1398236 мм 3; IgG: 1789231 мм 3; авастин: 15 мг/кг массы тела: 828186 мм 3; 5 мг/кг массы тела: 926202 мм 3; авастин + 16D3: 56994 мм 3. Наблюдали, что анти-hPlGF и авастин обладают дополнительным эффектом на ингибирование роста опухоли для подкожной опухоли поджелудочной железы DanG человека. Пример 6. Получение scFv16D3 Последовательности вариабельных частей тяжелой и легкой цепи (SEQ ID NO:2 и 4, соответственно, полученные, как описано в примере 1) амплифицировали с помощью PCR с использованием праймеров с подходящими участками рестрикции и линкера. После SOE PCR (сплайсинг генов с помощью перекрывающегося удлинения) scFv клонировали в рЕЕ 14.4 (участки клонирования HindIII-EcoRI) (фиг. 12). Данным scFvhp16D3/pEE14.4 трансфицировали клетки СНО-KI после линеаризации BamHI с использованием Fugene 6 (Boehringer Mannheim) и дважды субклонировали посредством разведения. Моноклональный scFv hp16D3, 6C5D4, получали и нарабатывали. Этот клон также кратковременно трансфицировали в клетки 293 с помощью Producell в параллели с scFv hp16D3/pKANEO-MCS50-dhfrl (участки клонирования Nhel-NotI) (фиг. 13). Нуклеотидная и аминокислотная последовательность 16D3 scFv представлена как SEQ ID NO:23 иSEQ ID NO:24, соответственно. Аминокислотная последовательность, обладающая вариабельными областями тяжелой и легкой цепей, линкерной последовательностью НА-маркером и His-маркером также представлена на фиг. 15. Пример 7. Гуманизация scFv16D3 Гуманизацию вариабельных областей scFv осуществляли, как описано в примере 2. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности гуманизированного scFv 16D3 представлены на SEQ ID NO:25 иSEQ ID NO:26, соответственно. Аминокислотная последовательность, обладающая вариабельными областями тяжелой и легкой цепей, линкерной последовательностью, НА-маркером и His-маркером гуманизированного scFv, также представлена на фиг. 15. Пример 8. Получение гуманизированного Fab16D3 1. Амплификация VH- и VL-фрагментов гуманизированного scFv16D3 Праймеры для амплификации VH-фрагмента гуманизированного scFv16D3 16D3Vhbackblunt 5'-CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTG-3' (SEQ ID NO:27) 16D3VhforSalI 5'-GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACTGTGAGCAGGG-3' (SEQ ID NO:28) Праймеры для амплификации VL-фрагмента гуманизированного scFvl6D3 16D3VLBackAgeI 5'-CCACCGGTGACATTGTGCTGACCCAGTCTCC-3' (SEQ ID NO:29) 16D3VLForBsiWI 5'-CACCGTACGTACCAACGTCCCCGAG-3' (SEQ ID NO:30) 2. Конструирование векторов для тяжелой и легкой цепи Продукт PCR легкой цепи сначала клонировали в вектор pCR4blunt-TOPO. После секвенирования легкую цепь удаляли расщеплением AgeI и BsiWI и клонировали в вектор pKANEO-CM30-Lvar7.- 18013970 Продукт PCR тяжелой цепи после расщепления клонировали в pKANEO-MCS50-Fabvar3. 3. Соединение конструкций тяжелой и легкой цепи Оба вектора (описанные выше), содержащие легкий и тяжелый сегмент, соединяли вместе удалением кассеты, содержащей легкий сегмент и добавлением ее к вектору, содержащему тяжелый сегмент, с использованием ферментов PmeI и PacI для получения окончательной конструкции,hpl6D3mutcmplFab/pKANEO-MCS50-Fabvar3 (см. фиг. 16). Пример 9. Анализ связывания антигена и ингибирования взаимодействия PlGF/flt-1 посредствомscFv 16D3 и гуманизированного scFv 16D3 (фиг. 14) 1. ELISA связывания антигена Планшеты для ELISA покрывали ON 1 мкг/мл huPlGF-1 в PBS, 200 мкл/лунка, 4 С. После забивки 1% BSA, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения scFv16D3/гуманизированногоscFv16D3, 200 мкл/лунка, фрагмент антител оставляли связываться 1 ч, комнатная температура. Связавшийся scFv16D3 детектировали мышиными анти-НА (180 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура) с последующей инкубацией с козьими IgG-HRP против мыши (Sigma), 170 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура. Анализ детектировали посредством OPD. 2. Ингибирование взаимодействия PlGF/Flt-1 в ELISA Планшеты для ELISA покрывали ON 1 мкг/мл huFlt-1 (RD Systems), 200 мкл/лунка, ON, 4 С. После забивки 1% BSA, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведенияhuPlGF-2. После инкубации 2 ч при комнатной температуре связавшийся PlGF детектировали козьими анти-huPlGF (RD Systems), 180 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура, с последующей инкубациейRAG-HRP (DAKO), 1 ч, комнатная температура. Анализ детектировали посредством OPD. Пример 10. Анализ связывания антигена и ингибирования взаимодействия PlGF/Flt-1 посредством гуманизированного Fab16D3 1. ELISA связывания антигена Планшеты для ELISA покрывали ON 1 мкг/мл huPlGF-1 в PBS, 100 мкл/лунка, 4 С. После забивки 1% BSA, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения гуманизированного Fab16D3, 100 мкл/лунка, фрагмент антител оставляли связываться 1 ч, комнатная температура. Связавшийся гуманизированный Fab16D3 детектировали с помощью анти-huIgG-HRP (специфичного к Fab) (100 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура). Анализ детектировали посредством OPD. Результаты представлены на фиг. 17 А. 2. Ингибирование взаимодействия PlGF/Flt-1 в ELISA Планшеты для ELISA покрывали ON 1 мкг/мл huFlt-1 (RD Systems), 200 мкл/лунка, ON, 4 С. После забивки 1% BSA, 1 ч, комнатная температура, добавляли серийные разведения гуманизированногоFab16D3, 100 мкл/лунка, и добавляли дополнительно 100 мкл/лунка huPlGF-2. После инкубации 2 ч при комнатной температуре связавшийся P1GF детектировали козьими анти-huPlGF (RD Systems), 180 мкл/лунка, 1 ч, комнатная температура, с последующей инкубацией RAG-HRP (DAKO), 1 ч, комнатная температура. Анализ детектировали посредством OPD. Результаты представлены на фиг. 17 В. Пример 11. Определение величин KD Величины KD для 16D3, гуманизированного 16D3 IgG4, гуманизированного scFv16D3 и гуманизированного Fab16D3 определяли с помощью Biacore. Результаты представлены в табл. 4 ниже. Таблица 4. Суммарная таблица величин KD