Изолированное антитело к фактору роста нервов (ngf) и способы его применения
Номер патента: 13614
Опубликовано: 30.06.2010
Авторы: Иноу Хизер, Хуан Хайчунь, Мартин Франк, Уайлд Кеннет Д., Тринор Джеймс Дж.С., Чжан Те Дж.
Формула / Реферат
1. Изолированное антитело, которое специфично связывается с фактором роста нервов (NGF), содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
2. Антитело по п.1, где вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
3. Антитело по п.1, где легкая цепь содержит первую область, определяющую комплементарность (CDR1), легкой цепи антитела человека, которая имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
4. Антитело по п.1, где легкая цепь содержит третью область, определяющую комплементарность (CDR3), легкой цепи антитела человека, которая имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
5. Антитело по п.1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, включающую в себя аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
6. Антитело по п.1, где тяжелая цепь содержит вторую область, определяющую комплементарность (CDR2), тяжелой цепи антитела человека, которая имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
7. Антитело по п.1, которое содержит:
а) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
б) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность CDR3 SEQ ID NO: 14, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность CDR3 SEQ ID NO: 16, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
в) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность CDR2 SEQ ID NO: 18, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность CDR3 SEQ ID NO: 16, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент; либо
г) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность CDR1 SEQ ID NO: 22, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность CDR3 SEQ ID NO: 16, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент,
д) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность CDR3 SEQ ID NO: 14, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность CDR1 SEQ ID NO: 24, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент,
е) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность CDR3 SEQ ID NO: 14, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность CDR2 SEQ ID NO: 20, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
8. Антитело по п.1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, а легкая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
9. Антитело по п.1, где тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область, причем вариабельная область содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, или его антигенсвязывающий или иммуногенный фрагмент.
10. Антитело по п.9, где тяжелая цепь содержит любую аминокислотную последовательность CDR3 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 18) или CDR1 (SEQ ID NO: 22) или его антигенсвязывающий или иммуногенный фрагмент.
11. Антитело по п.1, где легкая цепь содержит вариабельную область и константную область, причем вариабельная область содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или его антигенсвязывающий или иммуногенный фрагмент.
12. Антитело по п.11, где легкая цепь содержит аминокислотную последовательность CDR3 (SEQ ID NO: 16), или его антигенсвязывающий или иммуногенный фрагмент.
13. Изолированное антитело, которое связывается с фактором роста нервов (NGF), содержащее:
а) каркасные участки тяжелой цепи, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 (SEQ ID NO: 22), CDR2 (SEQ ID NO: 18) и CDR3 (SEQ ID NO: 14) последовательности SEQ ID NO: 10; и
б) каркасные участки легкой цепи, вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 (SEQ ID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 20) и CDR3 (SEQ ID NO: 16) последовательности SEQ ID NO: 12.
14. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, которое диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 1´10-8 М или менее.
15. Антитело по п.14, которое диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-10или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 1´10-9 М или менее.
16. Антитело по п.15, которое диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-11или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 0,2´10-9 М или менее.
17. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, где тяжелая цепь и легкая цепь соединены подвижным линкером с образованием одноцепочечного антитела.
18. Антитело по п.17, которое представляет собой одноцепочечное Fv-антитело.
19. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, которое представляет собой Fab-антитело.
20. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, которое представляет собой Fab'-антитело.
21. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, которое представляет собой (Fab')2-антитело.
22. Антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, представляющее собой полностью человеческое антитело.
23. Антитело по любому из пп.1, 2, 8, 13 или 77-81, ингибирующее передачу сигнала NGF.
24. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией NGF или повышенной чувствительностью к NGF, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество антитела по п.23.
25. Способ обнаружения NGF в биологическом образце in vitro, при котором:
а) образец приводят в контакт с антителом по пп.1, 2, 8 или 13 в условиях, обеспечивающих возможность связывания антитела с NGF; и
б) измеряют уровень связанного антитела в образце.
26. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь включает в себя вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85 или SEQ ID NO: 87, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
27. Антитело по п.26, где тяжелая цепь включает в себя вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 91% идентична любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87 или SEQ ID NO: 79, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
28. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь включает в себя вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91 или SEQ ID NO: 131, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
29. Изолированное антитело по п.28, где легкая цепь включает в себя вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 86% идентична любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86 или SEQ ID NO: 131, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
30. Антитело по п.28, где легкая цепь включает в себя вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, которая:
а) по меньшей мере на 89 или на 94% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 80 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
б) по меньшей мере на 91 или на 94% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 88 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
в) по меньшей мере на 86 или на 87% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 89 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
г) по меньшей мере на 87, 91 или 94% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 90 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
д) по меньшей мере на 86, 94, 96 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
е) по меньшей мере на 91, 95 или 96% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 82 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному иммуноглобулиновому фрагменту;
ж) по меньшей мере на 86, 94, 95, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 84 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту;
з) по меньшей мере на 86, 94, 95, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 86 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту; или
и) по меньшей мере на 86, 89, 91 или 96% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 131 или ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту.
31. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична аминокислотной последовательности CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 14, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 18, CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 22, CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 92, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 93, CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 94, CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 98, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 99, CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 100, CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 104, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 105, CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 106, CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 110, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 111, CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 112, CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 116, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 117 или CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 118, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
32. Изолированное антитело по п.31, где тяжелая цепь содержит CDR2 тяжелой цепи антитела человека с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 81% идентична любой аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 111, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
33. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична аминокислотной последовательности CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 16, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 20, CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 24, CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 95, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 96, CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 97, CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 101, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 102, CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 103, CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 107, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 108, CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 109, CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 113, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 114, CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 115 или любой из области CDR легкой цепи SEQ ID NO: 119 - SEQ ID NO: 134, либо его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
34. Изолированное антитело по п.33, содержащее CDR1 легкой цепи человека, где CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 86% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 107 или SEQ ID NO: 113, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
35. Изолированное антитело по п.33, содержащее CDR3 легкой цепи человека, где CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 86% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 115 или SEQ ID NO: 134, или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
36. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее CDR3, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 134, или вариант указанной последовательности, где указанный вариант содержит не более одной аминокислотной замены, инсерции или делеции.
37. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF и содержит любую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательности вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 10, последовательности вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 12, последовательности CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 14, последовательности CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 16, последовательности CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 18, последовательности CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 20, последовательности CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и последовательности CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 24, или их вариантов, где указанные варианты содержат не более одной аминокислотной замены, инсерции или делеции.
38. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, где тяжелая цепь и легкая цепь соединены подвижным линкером с образованием одноцепочечного антитела.
39. Антитело по п.38, которое представляет собой одноцепочечное Fv-антитело.
40. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, которое представляет собой Fab-антитело.
41. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, которое представляет собой Fab'-антитело.
42. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, которое представляет собой (Fab')2-антитело.
43. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, которое представляет собой полностью человеческое антитело.
44. Антитело по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37, ингибирующее передачу сигнала NGF.
45. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией NGF или повышенной чувствительностью к NGF, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество антитела по пп.26, 28, 31, 33, 36, 37 или 44.
46. Способ обнаружения NGF в биологическом образце in vitro, при котором:
а) образец приводят в контакт с антителом по пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37 в условиях, обеспечивающих возможность связывания антитела с NGF; и
б) измеряют уровень связанного антитела в образце.
47. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело по пп.26, 28, 31,33, 36 или 37.
48. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.47.
49. Изолированная клеточная линия, которая продуцирует антитело по любому из пп.26, 28, 31, 33, 36 или 37.
50. Агент, специфично связывающий NGF, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 10, вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 12, области CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 14, области CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 16, области CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 18, области CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 20, области CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 22 и любой из вариабельных областей или CDR тяжелой и легкой цепи SEQ ID NO: 79-130, причем этот специфичный связывающий агент может связываться с NGF.
51. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, вызванного повышенной экспрессией NGF или повышенной чувствительностью к NGF, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и терапевтически эффективное количество связывающего агента по п.50.
52. Связывающий агент по п.50, который представляет собой белок.
53. Молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует связывающий агент по п.50.
54. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.53.
55. Изолированная клеточная линия, которая продуцирует связывающий агент по п.54.
56. Способ обнаружения NGF в биологическом образце in vitro, при котором:
а) образец приводят в контакт со связывающим агентом по п.50 в условиях, обеспечивающих возможность его связывания с NGF; и
б) измеряют уровень связанного агента в образце.
57. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, которая кодирует любую аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 10, вариабельной области легкой цепи SEQ ID NO: 12, CDR 3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 14, CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: 16, CDR2 тяжелой цепи SEQ ID NO: 18, CDR2 легкой цепи SEQ ID NO: 20, CDR1 тяжелой цепи SEQ ID NO: 22, CDR1 легкой цепи SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 или любую из SEQ ID NO: 79 - SEQ ID NO: 134.
58. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, которые специфично связываются с NGF, где указанное антитело или фрагмент содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя:
а) область CDR1, содержащую аминокислотную последовательность формулы
б) область CDR2, содержащую аминокислотную последовательность формулы
в) область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность формулы
где а1 представляет собой Ser, Asp или Thr;
а2 представляет собой Tyr;
а3 представляет собой Ala, Ser, Trp или Gly;
а4 представляет собой Met или Ile;
а5 представляет собой His, Gly или Asn;
b1 представляет собой Tyr, Gly, Ile или Asp;
b2 представляет собой Ile;
b3 представляет собой Ser, Thr, Tyr или Asn;
b4 представляет собой Trp, Arg или Pro;
b5 представляет собой Ser, Asn или Gly;
b6 представляет собой Ser, Arg, Asp или Gly;
b7 представляет собой Ser, His или Gly;
b8 представляет собой Ser, Ile, Asp или Thr;
b9 представляет собой Leu, Ile или Thr;
b10 представляет собой Gly, Lys или Phe;
b11 представляет собой Tyr;
b12 представляет собой Ala или Ser;
b13 представляет собой Asp, Gly или Pro;
b14 представляет собой Ser;
b15 представляет собой Val или Phe;
b16 представляет собой Lys или Gln;
b17 представляет собой Gly;
с1 отсутствует или представляет собой Gly;
с2 отсутствует или представляет собой Tyr;
с3 и с4независимо отсутствуют, представляют собой Tyr, Asn, Val или Glu;
с5 отсутствует или представляет собой Ser, Gly или Trp;
с6 представляет собой Ser, Gly, Glu или Leu;
с7 представляет собой Gly, Arg или Asp;
с8 представляет собой Trp, Pro, Ser или Thr;
с9 представляет собой His, Gly или Tyr;
с10 представляет собой Val, Tyr или Arg;
c11-c13 независимо представляют собой Ser, Tyr, Phe, Asp или Asn;
с14 представляет собой Phe, Val или Gly;
с15 представляет собой Met или Asp;
с16 отсутствует или представляет собой Asp или Asn и
с17 представляет собой Tyr или Val, и
причем указанное антитело или фрагмент диссоциируют от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-9или менее и нейтрализуют биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 1´10-8 М или менее.
59. Изолированное антитело или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, которые специфично связываются с NGF, где указанное антитело или фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи, включающую в себя:
а) область CDR1, содержащую аминокислотную последовательность формулы
б) область CDR2, содержащую аминокислотную последовательность формулы
в) область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность формулы
где а1, а3, а4 и а7 представляют собой Arg, Ser, Gln и Ser соответственно;
а2 представляет собой Ala;
а5 представляет собой Gly или Ser;
а8 представляет собой Ser или Ile;
а9 отсутствует, представляет собой Ser или Gly;
а10 представляет собой Ala, Tyr, Trp или Phe;
b1 представляет собой Asp, Gly, Ala или Val;
b2 и b3представляют собой Ala и Ser соответственно;
b4 представляет собой Ser или Asn;
b5 представляет собой Leu или Arg;
b6 представляет собой Glu, Ala или Gln;
b7 представляет собой Ser или Thr;
с1 и с2представляют собой Gln;
с3 представляет собой Phe, Tyr, Arg или Ala;
с4 представляет собой Asn, Gly или Ser;
с5 представляет собой Ser или Asn;
с6 представляет собой Tyr, Ser, Trp или Phe;
с7 отсутствует, представляет собой Pro или His;
с8 представляет собой Leu, Trp, Tyr или Arg;
с9 представляет собой Thr; и
причем указанное антитело или фрагмент диссоциируют от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-9или менее и нейтрализуют биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 1´10-8 М или менее.
60. Полинуклеотид, кодирующий антитело или фрагмент по любому из пп.58 или 59.
61. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.60.
62. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор по п.61.
63. Клетка-хозяин по п.62, которая представляет собой эукариотическую клетку.
64. Клетка-хозяин по п.63, где эта клетка представляет собой клетку СНО.
65. Лекарственное средство для лечения болезненного расстройства или состояния, связанного с повышенной экспрессией NGF или с повышенной чувствительностью к NGF, содержащее фармацевтически эффективное количество антитела или его иммунологически функционального фрагмента или фармацевтически приемлемые соли указанного моноклонального антитела или фрагмента, где указанное моноклональное антитело представляет собой антитело по любому из пп.1, 2, 8 или 13, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
66. Лекарственное средство по п.65, где указанное антитело содержит тяжелую цепь, содержащую вариабельную область с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10, или ее антигенсвязывающий либо иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, содержащую вариабельную область с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 12, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
67. Лекарственное средство по п.65, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 1´10-8 М или менее.
68. Лекарственное средство по п.65, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-10 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 1´10-9 М или менее.
69. Лекарственное средство по п.65, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-11 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 0,2´10-9 М или менее.
70. Применение фармацевтически эффективного количества антитела по любому из пп.1, 2, 8, 13, 26, 28, 31, 33, 36, 37, 50 или 75-81 для производства лекарственного средства, пригодного для лечения болезненного расстройства или состояния, связанного с повышенной экспрессией NGF или с повышенной чувствительностью к NGF.
71. Применение по п.70, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 1´10-8 М или менее.
72. Применение по п.70, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-10 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 1´10-9 М или менее.
73. Применение по п.70, где указанное антитело диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-11 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 0,2´10-9 М или менее.
74. Применение по п.73, где указанное болезненное расстройство или состояние выбрано из группы, состоящей из состояния, представляющего собой острую боль, зубную боль, боль в результате травмы, операционную боль, боль в результате ампутации или абсцесса, каузалгию, демиелинизирующие заболевания, невралгию тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, удар, таламический болевой синдром, диабет, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), токсины, химиотерапию, общую головную боль, мигрень, кластерную головную боль, смешанно-васкулярные или неваскулярные синдромы, головную боль напряжения, общее воспаление, артрит, ревматические заболевания, волчанку, остеоартрит, воспалительные кишечные расстройства, синдром раздраженной кишки, воспалительные глазные расстройства, воспалительные или нестабильные расстройства мочевого пузыря, псориаз, кожные жалобы с воспалительными компонентами, солнечный ожог, кардит, дерматит, миозит, неврит, сосудистые коллагенозы, хронические воспалительные состояния, воспалительную боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию, невропатологическую боль и сочетанную гипералгезию или аллодинию, боль при диабетической невропатии, симпатически поддерживаемую боль, синдромы деафферентации, астму, повреждение или дисфункцию эпителиальной ткани, простой герпес, расстройства двигательной функции внутренних органов в районе дыхательной, мочеполовой, желудочно-кишечной или сосудистой систем, раны, ожоги, аллергические кожные реакции, зуд, витилиго, общие желудочно-кишечные расстройства, колит, язву желудка, язвы двенадцатиперстной кишки, вазомоторный или аллергический ринит или бронхиальные расстройства, дисменорею, диспепсию, желудочно-пищеводный рефлюкс, панкреатит или висцералгию.
75. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее:
(а) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
(б) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
(в) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 84, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
(г) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 86, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент;
(д) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент, и легкую цепь, имеющую вариабельную область, содержащую любую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 или SEQ ID NO: 91, или ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент.
76. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, включающую SEQ ID NO: 10.
77. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее вариабельную область легкой цепи, включающую SEQ ID NO: 12.
78. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее легкую цепь, включающую SEQ ID NO: 44.
79. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее тяжелую цепь, включающую SEQ ID NO: 40.
80. Изолированное антитело, которое специфично связывается с NGF, содержащее легкую цепь, включающую SEQ ID NO: 44, и тяжелую цепь, включающую SEQ ID NO: 40.
81. Антитело по любому из пп.76-80, которое диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 1´10-8 М или менее.
82. Антитело по любому из пп.76-80, которое диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-10 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 1´10-9 М или менее.
83. Антитело по любому из пп.76-80, которое диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 1´10-11 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro с IC50 примерно 0,2´10-9 М или менее.
84. Антитело по п.76 или 79, где тяжелая цепь и легкая цепь соединены подвижным линкером с образованием одноцепочечного антитела.
85. Антитело по п.77 или 78, где тяжелая цепь и легкая цепь соединены подвижным линкером с образованием одноцепочечного антитела.
86. Антитело по п.84 или 85, которое представляет собой Fab-антитело.
87. Антитело по п.84 или 85, которое представляет собой Fab'-антитело.
88. Антитело по п.84 или 85, которое представляет собой (Fab')2-антитело.
89. Антитело по любому из пп.76-80, представляющее собой полностью человеческое антитело.
90. Антитело по любому из пп.76-80, которое ингибирует передачу сигнала NGF.
91. Полинуклеотид, кодирующий антитело по любому из пп.76-80.
92. Экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п.91.
93. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор по п.92.
94. Клетка-хозяин по п.93, которая представляет собой эукариотическую клетку.
95. Клетка-хозяин по п.94, где эта клетка представляет собой клетку СНО.
96. Лекарственное средство для лечения болезненного расстройства или состояния, связанного с повышенной экспрессией NGF или с повышенной чувствительностью к NGF, содержащее фармацевтически эффективное количество антитела или его иммунологически функционального фрагмента или фармацевтически приемлемые соли указанного моноклонального антитела или фрагмента, где указанное моноклональное антитело представляет собой антитело по любому из пп.76-80, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или эксципиент.
97. Применение фармацевтически эффективного количества антитела по любому из пп.76-80 для производства лекарственного средства, пригодного для лечения болезненного расстройства или состояния, связанного с повышенной экспрессией NGF или с повышенной чувствительностью к NGF.
98. Применение по п.97, где указанное болезненное расстройство или состояние выбрано из группы, состоящей из состояния, представляющего собой острую боль, зубную боль, боль в результате травмы, операционную боль, боль в результате ампутации или абсцесса, каузалгию, демиелинизирующие заболевания, невралгию тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, удар, таламический болевой синдром, диабет, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), токсины, химиотерапию, общую головную боль, мигрень, кластерную головную боль, смешанно-васкулярные или неваскулярные синдромы, головную боль напряжения, общее воспаление, артрит, ревматические заболевания, волчанку, остеоартрит, воспалительные кишечные расстройства, синдром раздраженной кишки, воспалительные глазные расстройства, воспалительные или нестабильные расстройства мочевого пузыря, псориаз, кожные жалобы с воспалительными компонентами, солнечный ожог, кардит, дерматит, миозит, неврит, сосудистые коллагенозы, хронические воспалительные состояния, воспалительную боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию, невропатологическую боль и сочетанную гипералгезию или аллодинию, боль при диабетической невропатии, симпатически поддерживаемую боль, синдромы деафферентации, астму, повреждение или дисфункцию эпителиальной ткани, простой герпес, расстройства двигательной функции внутренних органов в районе дыхательной, мочеполовой, желудочно-кишечной или сосудистой систем, раны, ожоги, аллергические кожные реакции, зуд, витилиго, общие желудочно-кишечные расстройства, колит, язву желудка, язвы двенадцатиперстной кишки, вазомоторный или аллергический ринит или бронхиальные расстройства, дисменорею, диспепсию, желудочно-пищеводный рефлюкс, панкреатит или висцералгию.
Текст
013614 Данная заявка является родственной временной заявке США 60/487431, поданной 15 июля 2003 г.,по которой и испрашивается приоритет и описание которой включено сюда путем ссылки. Область изобретения Изобретение относится к человеческим моноклональным антителам, которые связывают фактор роста нервов (NGF). Также раскрыты композиции и способы лечения боли и расстройств, связанных с болью. Предшествующий уровень техники Ежедневно более двух миллионов человек в США теряют трудоспособность по причине хронической боли (Jessell and Kelly, 1991, "Pain and Analgesia" in PRINCIPLES OF NEURAL SCIENCE, 3rd Ed.(Kandel, Schwartz, and Jessell, ed.), Elsevier, New York). К сожалению, современные варианты терапевтического лечения боли эффективны лишь отчасти, и многие из этих методов сами по себе вызывают расстройства или дают вредные побочные эффекты. Так, несмотря на то, что нестероидные противовоспалительные лекарства (НСПВЛ), такие как аспирин, ибупрофен и индометацин, являются умеренно эффективными против воспалительной боли, они также токсичны для почек и в высоких дозах имеют тенденцию вызывать желудочно-кишечное раздражение, язвы, кровотечение, а также спутанность сознания. Пациенты, которых лечат опиоидами, также часто испытывают спутанность сознания, а долгосрочное применение опиоидов связано с толерантностью и зависимостью. Местные анестетики, такие как лидокаин и мексилетин, ингибируют боль и одновременно вызывают потерю нормальной чувствительности. Боль представляет собой восприятие, основанное на сигналах, полученных из окружающей среды и передаваемых и интерпретируемых нервной системой (в качестве обзора см. Millan, 1999, Prog.Neurobiol. 57: 1-164). Повреждающие стимулы, такие как тепло и прикосновение, заставляют специализированные сенсорные рецепторы в коже посылать сигналы в центральную нервную систему (ЦНС). Этот процесс называется ноцицепцией, и периферические сенсорные нейроны, которые опосредуют его,представляют собой ноцицепторы. В зависимости от силы сигнала от ноцицептора(ов) и абстрагирования и обработки этого сигнала ЦНС человек может воспринимать или не воспринимать повреждающий стимул как болезненный. Когда чье-либо восприятие боли точно калибровано по интенсивности стимула,боль выполняет предназначенную ей защитную функцию. Однако некоторые типы повреждения ткани вызывают явление, известное как гипералгезия или проноцицепция, при котором относительно безвредные стимулы воспринимаются как интенсивно болезненные, поскольку болевые пороги человека снижены. Как воспаление, так и повреждение нерва может вызвать гипералгезию. Лица, пораженные воспалительными состояниями, такими как солнечный ожог, остеоартрит, колит, кардит, дерматит, миозит, неврит, сосудистые коллагенозы (которые включают ревматоидный артрит и волчанку) и тому подобное,часто испытывают повышенную чувствительность к боли. Подобным образом, травма, операция, ампутация, абсцесс, каузалгия, сосудистые коллагенозы, демиелинизирующие заболевания, невралгия тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, удар, таламический болевой синдром, диабет, инфекционный герпес, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), токсины и химиотерапия вызывают повреждения нервов, которые приводят к обширной боли. Поскольку механизмы, посредством которых ноцицепторы передают внешние сигналы в нормальном состоянии и в состоянии гипералгезии, становятся более понятными, процессы, вовлеченные в гипералгезию, могут быть мишенями ингибирования снижения болевого порога и посредством этого уменьшить количество испытываемой боли. Показано, что нейротрофические факторы играют значительные роли в передаче физиологической и патологической боли. Фактор роста нервов (NGF) оказывается особенно важным (в качестве обзора см.(Lewin et al., 1994, Eur. J. Neurosci. 6: 1903-1912). Внутривенная инфузия NGF приводит у людей к миалгии всего тела, тогда как местное введение вызывает гипералгезию и аллодинию места инъекции помимо системных эффектов (Apfel et al., 1998, Neurology 51: 695-702). Существует также значительная масса данных о вовлечении эндогенного NGF в состояния, при которых боль является существенным признаком. Например, NGF положительно регулируется в Шванновских клетках спинного корневого ганглия (DRG, dorsal root ganglion) в течение по меньшей мере 2 месяцев после повреждения периферического нерва, и сообщалось о повышенных уровнях в суставах животных, страдающих рядом моделей артрита (например, Aloe et al., 1993, Growth Factors 9: 149-155). Что касается людей, уровни NGF повышены в синовиальной жидкости у пациентов с ревматоидным или другими типами артрита (например, Aloe et al.,1992. Arthritis and Rheumatism 35: 351-355). Кроме того, продемонстрировано, что антагонизм функции NGF предупреждает гипералгезию и аллодинию в моделях невропатологической и хронической воспалительной боли. Например, в животных моделях невропатологической боли (например, лигирование нервного ствола или спинно-мозгового нерва) системная инъекция нейтрализующих антител к NGF предупреждает как аллодинию, так и гипералгезию (Ramer et al.,1999, Eur. J. Neurosci. 11: 837-846 и Ro et al., 1999, Pain 79: 265-274). Примеры антител к NGF, известных в данной области, включают, например, РСТ публикации WO 01/78698, WO 01/64247, WO 02/096458 иL17077. Понятно, что существует необходимость в новых безопасных и эффективных методах терапии боли, в частности, направленных на низкомолекулярные медиаторы или агенты, обостряющие боль, такие как NGF. Краткое изложение сущности изобретения В данном изобретении предложены новые человеческие моноклональные антитела, которые являются терапевтически полезными для устранения боли. Конкретно, согласно изобретению, предложены моноклональные антитела, которые связываются с фактором роста нервной ткани (NGF). Предпочтительно эти моноклональные антитела представляют собой человеческие моноклональные антитела и нейтрализуют биологическую активность NGF, а также являются полезными для облегчения эффектовNGF-опосредованных болевых ответов. Также изобретением предложены клетки, которые продуцируют и наиболее предпочтительно секретируют в клеточную культуральную среду моноклональные антитела по изобретению. Помимо их применения для лечения и устранения боли, антитела по изобретению полезны для лечения невропатологических и воспалительных ответов, связанных с болью. Далее согласно изобретению предложены слитые белки, содержащие последовательность Fcучастка антитела и одну или более чем одну последовательность, идентифицированную как SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22 иSEQ ID NO: 79-130. Такие молекулы могут быть получены методами, описанными, например, в заявкеWO 00/24782, которая включена сюда путем ссылки. Такие молекулы можно экспрессировать, например,в клетках млекопитающих (например, в клетках яичника китайского хомячка) или в бактериальных клетках (например, в клетках E. coli). В некоторых аспектах изобретения предложены антитела, предпочтительно моноклональные антитела, наиболее предпочтительно человеческие антитела и человеческие моноклональные антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 6, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, а вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Предпочтительно тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 4. В некоторых аспектах изобретения предложены антитела, предпочтительно человеческие антитела и более предпочтительно моноклональные антитела, наиболее предпочтительно человеческие моноклональные антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит константную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из константных областей тяжелой цепи IgG1,IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA и IgE или любых их аллельных вариантов (как раскрыто в Kabat et al., 1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U. S. Department of Health and HumanServices, NIH Publication No. 91-3242), включенной сюда путем ссылки, а вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Предпочтительно антитело по изобретению содержит аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепиIgG2, показанной SEQ ID NO: 4, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В некоторых аспектах изобретения предложены антитела, предпочтительно человеческие антитела и более предпочтительно моноклональные антитела, наиболее предпочтительно человеческие моноклональные антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 8, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, а вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 12, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В некоторых аспектах антитела по изобретению содержат тяжелую цепь и легкую цепь, где вариабельная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ IDNO: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В других аспектах вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 12, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В дополнительных аспектах тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В следующих дополнительных аспектах легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO: 16, 20, 24, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Изобретением также предложены антитела, которые специфично связываются с NGF, где тяжелая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, показанную вSEQ ID NO: 10, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкая цепь содержит вариабельную область, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 12, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Далее согласно изобретению предложены изолированные человеческие антитела, которые специфично связываются с NGF, содержащие:(а) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 79, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 80, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина;(б) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 81, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 82, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина;(в) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 83, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 84, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина; либо(г) тяжелую цепь, имеющую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 86, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкую цепь, имеющую вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 87, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В некоторых аспектах изобретения также предложены антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, причем эта вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность, которая по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, и где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, причем эта вариабельная область легкой цепи включает в себя последовательность,которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, причем указанное антитело специфично связывается с NGF. В изобретении также предложены антитела, которые специфично связываются с NGF, в которых тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO: 14, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO: 16, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. В некоторых аспектах в изобретении также предложены антитела, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, причем эта вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность, которая по меньшей мере на 75%, предпочтительно на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 22, и где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, причем эта вариабельная область легкой цепи содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 и наиболее предпочтительно примерно на 99% идентична аминокислотной последовательности, показанной в SEQ IDNO: 16, где это антитело специфично связывается с NGF. В изобретении также предложены одноцепочечные антитела, одноцепочечные Fv-антитела, F(ab)антитела, F(ab)'-антитела и (Fab')2-антитела. В конкретных аспектах изобретения предложена легкая цепь, содержащая аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Кроме того, в изобретении предложена тяжелая цепь, содержащая аминокислотную последовательность, показанную в любой из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 22, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Изобретение также относится к изолированным человеческим антителам, которые специфично свя-3 013614 зывают NGF, содержащим: (а) каркасные участки тяжелой цепи человека, CDR1 область тяжелой цепи человека, CDR2 область тяжелой цепи человека и CDR3 область тяжелой цепи человека; и (б) каркасные участки легкой цепи человека, CDR1 область легкой цепи человека, CDR2 область легкой цепи человека и CDR3 область легкой цепи человека. В некоторых аспектах CDR1 область тяжелой цепи человека может представлять собой CDR1 область тяжелой цепи моноклонального антитела (mAb), обозначенную как 4D4, показанную в SEQ ID NO: 22, и CDR1 область легкой цепи человека может представлять собойCDR1 область легкой цепи mAb 4D4, показанную в SEQ ID NO: 24. В других аспектах CDR2 область тяжелой цепи человека может представлять собой CDR2 область тяжелой цепи mAb 4D4, показанную вSEQ ID NO: 18, и CDR2 область легкой цепи человека может представлять собой CDR2 область легкой цепи mAb 4D4, показанную в SEQ ID NO: 20. В некоторых других аспектах CDR3 область тяжелой цепи человека представляет собой CDR3 область тяжелой цепи mAb 4D4, показанную в SEQ ID NO: 14, иCDR3 область легкой цепи человека представляет собой CDR3 область легкой цепи mAb 4D4, показанную в SEQ ID NO: 16. В изобретении также предложены изолированные человеческие антитела, которые специфично связывают фактор роста нервов, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь включает в себя вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85 или SEQ ID NO: 87, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Далее в изобретении предложены изолированные человеческие антитела, которые специфично связывают NGF, содержащие тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь включает в себя вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ IDNO: 90, SEQ ID NO: 91 или SEQ ID NO: 131, либо ее антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Антитела по изобретению характеризуются способностью антагонизировать по меньшей мере одну активность in vitro и/или in vivo, связанную с полипептидами NGF. Предпочтительно в изобретении предложены изолированные человеческие антитела к человеческому NGF с высоким аффинитетом связывания с этими полипептидами NGF, причем указанные антитела связываются с человеческим полипептидом NGF и диссоциируют от человеческого полипептида NGF с константой диссоциации (KD) примерно 5010-12 М или менее, как определено с помощью KinExA, или антитела, которые ингибируют индуцированное NGF выживание в анализе нейтрализации in vitro при IC50 примерно 110-8 М или менее. В предпочтительном воплощении изобретения предложено изолированное человеческое антитело к человеческому NGF, которое имеет приведенные ниже характеристики: а) ингибирует индуцированное NGF выживание в анализе нейтрализации in vitro при IC50 примерно 110-9 М или менее; б) имеют CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и в) имеют CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В изобретении также предложены изолированные человеческие антитела или их антигенсвязывающие или иммунологически функциональные фрагменты иммуноглобулина, которые специфично связываются с NGF с высоким аффинитетом, прчием указанные антитела или фрагменты диссоциируют от человеческого полипептида NGF при KD примерно 110-9 или менее и нейтрализуют биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro при IC50 примерно 110-8 М или менее, и где указанные антитела или фрагменты содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую в себя: а) область CDR1, содержащую аминокислотную последовательность формулы где а 1 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а 2 представляет собой ароматический аминокислотный остаток; а 3 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный,ароматический аминокислотный остаток; а 4 представляет собой нейтральный гидрофобный или алифатический аминокислотный остаток и а 5 представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; б) область CDR2, содержащую аминокислотную последовательность формулы где b1 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; b2 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; b3 представляет собой полярный гидрофильный или ароматический аминокислотный остаток; b4 представляет собой полярный гидрофильный, гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; b5-b9 независимо представляют собой полярные гидрофильные или алифатические аминокислотные остатки; b10 представляет собой полярный гидрофильный, ароматический или алифатический аминокислотный остаток; b11 представляет собой ароматический или гидрофобный аминокислотный остаток; b12 представляет собой-4 013614 алифатический гидрофобный или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; b13 представляет собой алифатический, гидрофобный или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; b14 и b16 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; b15 представляет собой алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток и b17 представляет собой алифатический кислый аминокислотный остаток и в) область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность формулы где с 1 отсутствует или представляет собой алифатический аминокислотный остаток; с 2 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с 3 и с 4 независимо отсутствуют или представляют собой полярные гидрофильные, ароматические гидрофобные или алифатические аминокислотные остатки; с 5 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный, алифатический или ароматический аминокислотный остаток; с 6 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с 7 представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с 8 представляет собой полярный гидрофильный, гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; с 9 представляет собой полярный гидрофильный, алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с 10 представляет собой полярный гидрофильный, ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с 11-с 13 независимо представляют собой полярные гидрофильные или ароматические гидрофобные аминокислотные остатки; с 14 представляет собой алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с 15 представляет собой полярный гидрофильный или нейтральный гидрофобный аминокислотный остаток; с 16 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток и с 17 представляет собой ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток. В одном аспекте а 1 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а 2 представляет собой ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; а 3 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; а 4 представляет собой нейтральный гидрофобный аминокислотный остаток; а 5 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; b1 представляет собой алифатический или ароматический аминокислотный остаток; b2 представляет собой Ile; b3 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; b4 представляет собой полярный гидрофильный или ароматический аминокислотный остаток; b5-b9 независимо представляют собой полярные гидрофильные или алифатические аминокислотные остатки; b10 представляет собой алифатический аминокислотный остаток; b11 представляет собой Tyr; b12 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; b13 представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; b14 и b16 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; b15 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; b17 представляет собой алифатический кислый аминокислотный остаток; с 1 отсутствует или представляет собой алифатический аминокислотный остаток; с 2 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с 3 и с 4 независимо отсутствуют или представляют собой полярные гидрофильные, ароматические гидрофобные или алифатические аминокислотные остатки; с 5 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; с 6 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с 7 представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; с 8 представляет собой полярный гидрофильный, гидрофобный или ароматический аминокислотный остаток; с 9 представляет собой полярный гидрофильный, алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с 10 представляет собой полярный гидрофильный, ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с 11-с 13 независимо представляют собой полярные гидрофильные или ароматические гидрофобные аминокислотные остатки; с 14 представляет собой алифатический или ароматический гидрофобный аминокислотный остаток; с 15 представляет собой полярный гидрофильный или нейтральный гидрофобный аминокислотный остаток; с 16 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток и с 17 представляет собой ароматический гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток. В конкретном аспекте а 1 представляет собой Ser, Asp или Thr; a2 представляет собой Tyr; а 3 представляет собой Ala, Ser, Trp или Gly; a4 представляет собой Met или Ile; а 5 представляет собой His, Gly или Asn; b1 представляет собой Tyr, Gly, Ile или Asp; b2 представляет собой Ile; b3 представляет собой Ser,Thr, Tyr или Asn; b4 представляет собой Trp, Arg или Pro; b5 представляет собой Ser, Asn или Gly; b6 представляет собой Ser, Arg, Asp или Gly; b7 представляет собой Ser, His или Gly; b8 представляет собойSer, Ile, Asp или Thr; b9 представляет собой Leu, Ile или Thr; b10 представляет собой Gly, Lys или Phe; b11 представляет собой Tyr; b12 представляет собой Ala или Ser; b13 представляет собой Asp, Gly или Pro; b14 представляет собой Ser; b15 представляет собой Val или Phe; b16 представляет собой Lys или Gln; b17 представляет собой Gly; с 1 отсутствует или представляет собой алифатический аминокислотный остаток; с 2 отсутствует или представляет собой Tyr; с 3 и с 4 независимо отсутствуют, представляют собой Tyr, Asn,Val или Glu; с 5 отсутствует, представляет собой Ser, Gly или Trp; с 6 отсутствует, представляет собой Ser,-5 013614Gly, Glu или Leu; с 7 представляет собой Gly, Arg или Asp; с 8 представляет собой Trp, Pro, Ser или Thr; с 9 представляет собой His, Gly или Tyr; с 10 представляет собой Val, Tyr или Arg; c11-c13 независимо представляют собой Ser, Phe, Tyr, Asp или Asn; с 14 представляет собой Phe, Val или Gly; с 15 представляет собой Met или Asp; с 16 отсутствует, представляет собой Asp или Asn и с 17 представляет собой Tyr или Val. В другом конкретном аспекте а 1 представляет собой Ser или Asp; a2 представляет собой Tyr; а 3 представляет собой Ala или Ser; а 4 представляет собой Met или Ile; а 5 представляет собой His или Asn; b1 представляет собой Tyr или Gly; b2 представляет собой Ile; b3 представляет собой Ser, Thr, Tyr или Asn;b16 представляет собой Lys или Gln; b17 представляет собой Gly; с 1 отсутствует или представляет собойGly; с 2 отсутствует или представляет собой Tyr; с 3 и с 4 независимо отсутствуют, представляют собой Tyr,Gly или Val; с 5 отсутствует или представляет собой Ser; с 6 представляет собой Ser или Gly; с 7 представляет собой Gly или Arg; с 8 представляет собой Trp или Pro; с 9 представляет собой His, Gly или Tyr; с 10 представляет собой Val или Tyr; с 11-с 13 независимо представляют собой Ser, Tyr, Phe или Asp; с 14 представляет собой Phe или Val; с 15 представляет собой Met или Asp; с 16 отсутствует или представляет собойAsp и с 17 представляет собой Tyr или Val. В других конкретных аспектах изобретения: а) CDR1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 22;CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 18; и CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 14; б) CDR1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 92;CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 93; и CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 94; в) CDR1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 98;CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 99; и CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 100; г) CDR1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 104;CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 105; и CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 106; д) CDR1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 110;CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 111; и CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 112; и е) CDR1 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 116;CDR2 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 117; и CDR3 тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 118. В изобретении также предложено изолированное человеческое антитело или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, которое специфично связывается с NGF, причем указанное антитело или фрагмент содержит вариабельную область легкой цепи,включающую в себя: а) область CDR1, содержащую аминокислотную последовательность формулы где а 1 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а 2, а 11 и а 12 независимо представляют собой алифатические или гидрофобные аминокислотные остатки; а 3, а 5, а 7 и а 8 независимо представляют собой алифатические, полярные гидрофильные или гидрофобные аминокислотные остатки; а 4 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а 6 представляет собой алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; а 9 отсутствует или представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток и а 10 представляет собой алифатический,ароматический или гидрофобный аминокислотный остаток; б) область CDR2, содержащую аминокислотную последовательность формулы где b1 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный или гидрофобный аминокислотный остаток; b2 представляет собой алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; b3 и b4 независимо представляют собой полярные гидрофильные, алифатические или гидрофобные аминокислотные остатки; b5 представляет собой полярный гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; b6 представляет собой полярный гидрофобный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток и b7 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток и в) область CDR3, содержащую аминокислотную последовательность формулы где с 1 и с 2 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; с 3 пред-6 013614 ставляет собой полярный гидрофильный, алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; с 4,с 5 и с 6 независимо представляют собой алифатические, полярные гидрофильные или гидрофобные аминокислотные остатки; с 7 отсутствует или представляет собой полярный гидрофильный или алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с 8 представляет собой полярный гидрофильный или гидрофобный аминокислотный остаток и с 9 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток, и где указанное антитело или фрагмент диссоциирует от человеческого полипептида NGF с KD примерно 110-9 или менее и нейтрализует биологическую активность человеческого NGF в стандартном анализе in vitro при IC50 примерно 110-8 М или менее. В одном аспекте а 1, а 3, а 4, а 7 и а 8 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; а 2, а 6, а 11 и а 12 независимо представляют собой алифатические гидрофобные аминокислотные остатки; а 5 представляет собой полярный гидрофильный или алифатический аминокислотный остаток; а 9 отсутствует или представляет собой алифатический или полярный гидрофильный аминокислотный остаток; а 10 представляет собой алифатический или ароматический аминокислотный остаток; b1 представляет собой алифатический, полярный гидрофобный или гидрофобный аминокислотный остаток;b2 представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; b3, b4 и b7 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; b5 и b6 независимо представляют собой полярные гидрофильные или алифатические гидрофобные аминокислотные остатки; с 1 и с 2 независимо представляют собой полярные гидрофильные аминокислотные остатки; с 3 представляет собой полярный гидрофильный, алифатический или гидрофобный аминокислотный остаток; с 4, с 5 и с 6 независимо представляют собой алифатические, полярные гидрофильные или гидрофобные аминокислотные остатки; с 7 отсутствует или представляет собой алифатический гидрофобный аминокислотный остаток; с 8 представляет собой гидрофобный аминокислотный остаток и с 9 представляет собой полярный гидрофильный аминокислотный остаток. В частности, а 1, а 3, а 4 и а 7 представляют собой Arg, Ser, Gln и Ser соответственно; а 2 представляет собой Ala; а 5 представляет собой Gly или Ser; а 8 представляет собой Ser или Ile; а 9 отсутствует, представляет собой Ser или Gly; а 10 представляет собой Ala, Tyr, Trp или Phe; b1 представляет собой Asp, Gly, Ala или Val; b2 и b3 представляют собой Ala и Ser соответственно; b4 представляет собой Ser или Asn; b5 представляет собой Leu или Arg; b6 представляет собой Glu, Ala или Gln; b7 представляет собой Ser илиAsn, Gly или Ser; с 5 представляет собой Ser или Asn; с 6 представляет собой Tyr, Ser, Trp или Phe; с 7 отсутствует, представляет собой Pro или His; с 8 представляет собой Leu, Trp, Tyr или Arg и с 9 представляет собой Thr. В другом частном случае а 1, а 2, а 3, а 4 и а 7 представляют собой Arg, Ala, Ser, Gln и Ser соответствен 5 но; а представляет собой Gly или Ser; a8 представляет собой Ser или Ile; а 9 отсутствует, представляет собой Ser или Gly; а 10 представляет собой Ala или Tyr; b1 представляет собой Asp или Gly; b2 и b3 представляют собой Ala и Ser, соответственно; b4 представляет собой Ser или Asn; b5 представляет собой Leu или Arg; b6 представляет собой Glu, Ala или Gln; b7 представляет собой Ser или Thr; с 1 и с 2 представляют собой Gln; с 3 представляет собой Phe, Tyr, Arg или Ala; с 4 представляет собой Asn, Gly или Ser; с 5 представляет собой Ser или Asn; с 6 представляет собой Tyr, Ser, Trp или Phe; с 7 отсутствует, представляет собой Pro или His; с 8 представляет собой Leu, Trp, Tyr или Arg и с 9 представляет собой Thr. В других частных случаях изобретения: а) CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 24;CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 20; и CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 16; б) CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 95;CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 96; и CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 97; в) CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 101;CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 102; и CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 103; г) CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 107;CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 108; и CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 109; д) CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 113;CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 114; и CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 115; е) CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 119;CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 120; и CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 121; ж) CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 122;CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 123; и CDR3-7 013614 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 124; з) CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 125;CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 126; и CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 127; и) CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 128;CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 129; и CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 130 и к) CDR1 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 132;CDR2 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 133; и CDR3 легкой цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 134. Часть изобретения также составляют полинуклеотидные последовательности, которые кодируют новые человеческие антитела к человеческому NGF, векторы, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие человеческие антитела к человеческому NGF, клетки-хозяева, трансформированные векторами, включающими полинуклеотиды, которые кодируют человеческие антитела к человеческому NGF, препараты, содержащие человеческие антитела к человеческому NGF, и способы их получения и применения. В изобретении также предложены способы определения уровня NGF в биологическом образце, при котором этот образец приводят в контакт с антителом по изобретению или его антигенсвязывающим фрагментом. Антитело анти-NGF по изобретению можно использовать в любом известном способе анализа, таком как конкурентные анализы связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы, анализы иммунопреципитации и твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) (см. Sola, 1987, MonoclonalAntibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.) для обнаружения и количественного определения NGF. Указанные антитела могут связывать NGF с аффинитетом, который соответствует используемому способу анализа. Кроме того, в изобретении предложены способы лечения заболевания, связанного с повышенным продуцированием NGF или с повышенной чувствительностью к NGF, при которых индивидууму, нуждающемуся в этом, вводят фармацевтически эффективное количество фармацевтической композиции,содержащей по меньшей мере одно антитело по изобретению или его антигенсвязывающий или иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина. Конкретные предпочтительные воплощения изобретения станут очевидны из приведенного ниже более подробного описания конкретных предпочтительных воплощений и формулы изобретения. Краткое описание графических материалов На фиг. 1 представлены графики, которые демонстрируют нейтрализацию активности NGF в основанном на нейронах DRG количественном определении биологической активности моноклональными антителами 4D4, очищенными из кондиционированной среды гибридомы. На фиг. 2 представлены графики, которые демонстрируют экспрессию VR1, стимулированную активностью человеческого NGF, и нейтрализацию активности NGF в основанном на нейронах DRG количественном определении биологической активности моноклональным антителом к NGF (4D4), очищенным из кондиционированной среды гибридомы. На фиг. 3 представлены графики, которые демонстрируют нейтрализацию активности NGF в основанном на нейронах DRG количественном определении биологической активности транзитно экспрессирующимися рекомбинантными моноклональными антителами анти-NGF 4D4, экспрессированными либо в виде IgG1, либо в виде IgG2, в клетках, выращенных либо в роллерной культуре (R), либо в спинкультуре (с постоянным перемешиванием) (S). На фиг. 4 представлено сопоставление последовательностей нейротрофинов. Цифры и элементы вторичной структуры над последовательностью относятся к зрелому человеческому NGF. Консервативные остатки отмечены звездочками, а области с низкой гомологией последовательности затемнены. NGF человека представляет собой SEQ ID NO: 135; NGF мыши представляет собой SEQ ID NO: 136; BDNF представляет собой SEQ ID NO: 137; NT3 представляет собой SEQ ID NO: 138. На фиг. 5 показано сопоставление CDR1 тяжелой цепи антитела к NGF и процент идентичности для антител 14D10 (SEQ ID NO: 98), 6 Н 9 (SEQ ID NO: 104), 7H2 (SEQ ID NO: 110), 4G6 (SEQ ID NO: 116),14D11 (SEQ ID NO: 92) и 4D4 (SEQ ID NO: 22). На фиг. 6 показано сопоставление CDR2 тяжелой цепи анти-NGF и процент идентичности для антител 14D10 (SEQ ID NO: 99), 6 Н 9 (SEQ ID NO: 105), 7H2 (SEQ ID NO: 111), 4G6 (SEQ ID NO: 117),14D11 (SEQ ID NO: 93) и 4D4 (SEQ ID NO: 18). На фиг. 7 показано сопоставление CDR3 тяжелой цепи анти-NGF и процент идентичности для антител 14D10 (SEQ ID NO: 100), 6 Н 9 (SEQ ID NO: 106), 7H2 (SEQ ID NO: 112), 4G6 (SEQ ID NO: 118),14D11 (SEQ ID NO: 94) и 4D4 (SEQ ID NO: 14). На фиг. 8 показано сопоставление CDR1 легкой цепи анти-NGF и процент идентичности для антител 14D10 (SEQ ID NO: 95), 6 Н 9 (SEQ ID NO: 107), 7H2 (SEQ ID NO: 113), 4G6a (SEQ ID NO: 119), 4G6bID NO: 95) и 4D4 (SEQ ID NO: 24) (4G6a обозначен на различных фигурах как 20031028340; 4G6b обо-8 013614 значен на различных фигурах как 20031028351; 4G6c обозначен на различных фигурах как 20031071526; 4G6d обозначен на различных фигурах как 20031028344; 4G6e обозначен на различных фигурах как 20031000528). На фиг. 9 показано сопоставление CDR2 легкой цепи анти-NGF и процент идентичности для антител 14D10 (SEQ ID NO: 96), 6 Н 9 (SEQ ID NO: 108), 7H2 (SEQ ID NO: 114), 4G6a (SEQ ID NO: 120), 4G6bID NO: 96) и 4D4 (SEQ ID NO: 20) (4G6a обозначен на разных фигурах как 20031028340; 4G6b обозначен на разных фигурах как 20031028351; 4G6c обозначен на разных фигурах как 20031071526; 4G6d обозначен на разных фигурах как 20031028344; 4G6e обозначен на разных фигурах как 20031000528). На фиг. 10 показано сопоставление CDR3 легкой цепи анти-NGF и процент идентичности для антител 14D10 (SEQ ID NO: 97), 6 Н 9 (SEQ ID NO: 109), 7 Н 2 (SEQ ID NO: 115), 4G6a (SEQ ID NO: 121), 4G6bID NO: 97) и 4D4 (SEQ ID NO: 16) (4G6a обозначен на разных фигурах как 20031028340; 4G6b обозначен на разных фигурах как 20031028351; 4G6c обозначен на разных фигурах как 20031071526; 4G6d обозначен на разных фигурах как 20031028344; 4G6e обозначен на разных фигурах как 20031000528). На фиг. 11 показано сопоставление легкой цепи анти-NGF и процент идентичности для антител 14D10 (SEQ ID NO: 82), 6 Н 9 (SEQ ID NO: 84), 7H2 (SEQ ID NO: 86), 4G6a (SEQ ID NO: 88), 4G6b (SEQID NO: 89), 4G6c (SEQ ID NO: 90), 4G6d (SEQ ID NO: 91), 4G6e (SEQ ID NO: 131), 14D11 (SEQ ID NO: 80) и 4D4 (SEQ ID NO: 12) (4G6a обозначен на разных фигурах как 20031028340; 4G6b обозначен на разных фигурах как 20031028351; 4G6c обозначен на разных фигурах как 20031071526; 4G6d обозначен на разных фигурах как 20031028344; 4G6e обозначен на разных фигурах как 20031000528). На фиг. 12 показано сопоставление тяжелой цепи анти-NGF и процент идентичности для антител 4D4 (SEQ ID NO: 10), 4G6 (SEQ ID NO: 87), 14D10 (SEQ ID NO: 81), 14D11 (SEQ ID NO: 79), 7H2 (SEQID NO: 85) и 6 Н 9 (SEQ ID NO: 83). Подробное описание определенных предпочтительных воплощений Заголовки разделов, используемые здесь, предназначены только для целей организации текста и не должны рассматриваться как ограничивающие сущность предложенного изобретения. Все документы,цитируемые в данной заявке, включены сюда путем ссылки. Определения. Для работы с рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, для работы с культурой тканей, а также трансформации (например, электропорации, липофекции) могут быть применены традиционные методики. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить согласно указаниям фирмыпроизводителя, либо как их обычно выполняют в данной области или как описано в данной заявке. Вышеуказанные методики и процедуры можно, как правило, проводить хорошо известными в данной области способами и как описано в различных общих и более конкретных источниках, которые цитируются и обсуждаются на протяжении всего настоящего описания. См., например, Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 3d ed Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSprinp Harbor, N. Y., которое включено сюда путем ссылки для любой цели. Если не приведены конкретные определения, номенклатура, а также лабораторные процедуры и методики аналитической химии,органического синтеза, а также медицинской и фармацевтической химии, описанные здесь, хорошо известны и общепринято используются в данной области. Подобным образом, традиционные методики можно использовать для химических синтезов, химических анализов, приготовления и доставки фармацевтических препаратов, а также для лечения пациентов. В настоящем описании изобретения приведенные ниже термины, если не указано иное, следует понимать как имеющие приведенные ниже значения. Выражения "биологическое свойство", "биологическая характеристика" и термин "активность" в отношении антитела по настоящему изобретению используют здесь взаимозаменяемо, и они включают, но не ограничены этим, эпитопный аффинитет и специфичность (например: человеческое антитело к человеческому NGF, связывающееся с человеческимNGF), способность оказывать антагонистическое действие в отношении активности целевого полипептида (например, активность NGF), стабильность антитела in vivo и иммуногенные свойства антитела. Другие идентифицируемые биологические свойства или характеристики антитела, признанные в данной области, включают, например, перекрестную реактивность (то есть с не человеческими гомологами целевого полипептида или с другими белками или тканями в целом) и способность к сохранению высоких уровней экспрессии белка в клетках млекопитающих. Вышеупомянутые свойства или характеристики можно наблюдать или измерять, используя признанные в данной области методики, включая, но не ограничиваясь ими, ELISA, конкурентный ELISA, анализ поверхностного плазмонного резонанса, анализы нейтрализации in vitro и in vivo (см., например, пример 2) и иммуногистохимию с тканевыми срезами из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник по мере необходимости. Конкретные активности и биологические свойства человеческих антител к человеческому NGF более подробно описаны в приведенных ниже примерах. Термин "изолированный полинуклеотид", как его используют здесь, означает полинуклеотид ге-9 013614 номного, кДНК- или синтетического происхождения или некоторую их комбинацию, где по своему происхождению изолированный полинуклеотид (1) не связан ни с целым полинуклеотидом, в котором этот изолированный полинуклеотид находится в природе, ни с его участком, (2) связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе или (3) не встречается в природе как часть большей последовательности. Термин "изолированный белок", используемый здесь, означает, что обсуждаемый белок (1) свободен, по меньшей мере, от нескольких других белков, с которыми он должен в норме находиться, (2) по существу, свободен от других белков из того же источника, например из того же вида, (3) экспрессируется клеткой из другого вида, (4) отделен по меньшей мере от примерно 50% полинуклеотидов, липидов,углеводов или других веществ, с которыми он связан в природе, (5) не связан (ковалентным или нековалентным взаимодействием) с участками белка, с которыми "изолированный белок" связан в природе, (6) оперативно связан (ковалентным или нековалентным взаимодействием) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (7) не встречается в природе. Такой изолированный белок может кодироваться геномной ДНК, кДНК, мРНК или другими РНК, иметь синтетическое происхождение, либо представлять собой любую их комбинацию. Предпочтительно изолированный белок по существу свободен от белков или полипептидов или других загрязнений, которые находятся в его природном окружении, которые препятствовали бы его применению (терапевтическому, диагностическому, профилактическому, исследовательскому или другому)."Изолированное" антитело представляет собой антитело, которое было идентифицировано и отделено от и/или выделено из компонента его природного окружения. Загрязняющими компонентами его природного окружения являются вещества, которые препятствовали бы диагностическим или терапевтическим применениям этого антитела, и они могут включать ферменты, гормоны и другие подобные или не подобные белку растворенные вещества. В предпочтительных воплощениях антитело будет очищено(1) более чем до 95% мас./мас. антитела, как определено методом Лоури, и наиболее предпочтительно более чем до 99% мас./мас., (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков Nконцевой или внутренней аминокислотной последовательности, с использованием секвенатора с вращающимися лунками (spinning cup sequenator), либо (3) до гомогенности по ДСН-ПААГ электрофорезу в восстанавливающих или в невосстанавливающих условиях, используя окрашивание Кумасси голубым или, предпочтительно, серебром. К изолированным антителам относится антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, поскольку по меньшей мере один компонент природного окружения этого антитела не будет присутствовать. Термины "полипептид" или "белок" означают молекулы, имеющие последовательность нативных белков, то есть белков, продуцируемых природными, а именно нерекомбинантными клетками, либо полученных генно-инженерным путем или с использованием рекомбинантных клеткок, и включают молекулы, имеющие аминокислотную последовательность нативного белка, или молекулы, имеющие делеции, добавления и/или замены одной или более чем одной аминокислоты нативной последовательности. Термины "полипептид" и "белок", конкретно, охватывают антитела к NGF или последовательности, которые имеют делеции, добавления и/или замены одной или более чем одной аминокислоты антитела кNGF. Термин "полипептидный фрагмент" относится к полипептиду, который имеет амино-концевую делецию, карбокси-концевую делецию и/или внутреннюю делецию. В некоторых воплощениях фрагменты имеют длину по меньшей мере от 5 до примерно 500 аминокислот. Должно быть понятно, что в некоторых воплощениях фрагменты имеют длину по меньшей мере 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200,250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот. В частности, полезные полипептидные фрагменты включают функциональные домены, в т.ч. связывающие домены. В случае антитела к NGF полезные фрагменты включают, но не ограничены ими, область CDR, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи, участок цепи антитела или именно ее вариабельную область, включающую две CDR, и тому подобное. Термин "специфичный связывающий агент" относится к природной или неприродной молекуле, которая специфично связывается с мишенью. Примеры специфичных связывающих агентов включают, но не ограничены ими, белки, пептиды, нуклеиновые кислоты, углеводы и липиды. В некоторых воплощениях специфичный связывающий агент представляет собой антитело. Термин "специфичный связывающий агент к NGF" относится к специфичному связывающему агенту, который специфично связывается с любым участком NGF. В некоторых воплощениях специфичный связывающий агент к NGF представляет собой антитело, которое специфично связывается с NGF. Термин "иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина", как его используют здесь, относится к полипептидному фрагменту, который содержит, по меньшей мере, CDR тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина по изобретению способен связываться с антигеном. В предпочтительных воплощениях антиген представляет собой лиганд, который специфично связывается с рецептором. В этих воплощениях связывание иммунологически функционального фрагмента иммуноглобулина по изобретению предотвращает связывание лиганда с его рецептором, прерывая биологический ответ, который произошел бы при связывании лиганда с рецептором. Предпочтительно иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина по изобретению специфично связывается с NGF. Наиболее предпочтительно фрагмент специфично свя- 10013614 зывается с человеческим NGF. Термин "природный", как его используют здесь и применяют к объекту, определяет тот факт, что этот объект может быть обнаружен в природе. Например, речь может идти о полипептидной или полинуклеотидной последовательности, которая присутствует в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из источника в природе и которая не была намеренно модифицирована человеком. Термин "функциональным образом сцепленный" означает, что компоненты, к которым применяют этот термин, находятся во взаимоотношениях, которые дают им возможность осуществлять свойственные им функции в подходящих условиях. Например, регуляторная последовательность, которая "функциональным образом сцеплена" с последовательностью, кодирующей белок, лигирована с ней таким образом, что в условиях, совместимых с транскрипционной активностью регуляторных последовательностей, осуществляется экспрессия последовательности, кодирующей белок. Термин "регуляторная последовательность", как его используют здесь, относится к полинуклеотидным последовательностям, которые могут осуществлять экспрессию, процессинг или внутриклеточную локализацию кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Природа таких регуляторных последовательностей может зависеть от организма-хозяина. В конкретных воплощениях регуляторные последовательности для прокариот могут включать промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции. В других конкретных воплощениях регуляторные последовательности для эукариот могут включать промоторы, содержащие один или множество сайтов распознавания для факторов транскрипции, последовательности транскрипционных энхансеров, последовательности терминации транскрипции и последовательности полиаденилирования. В некоторых воплощениях"регуляторные последовательности" могут включать лидерные последовательности и/или последовательности партнеров слияния. Термин "полинуклеотид" здесь означает однонитевые или двунитевые нуклеиново-кислотные полимеры, имеющие по меньшей мере 10 нуклеотидов в длину. В некоторых воплощениях изобретения нуклеотиды, составляющие полинуклеотид, могут представлять собой рибонуклеотиды, или дезоксирибонуклеотиды, либо модифицированную форму любого типа нуклеотида. Указанные модификации включают модификации оснований, такие как бромуридин, модификации рибозы, такие как арабинозид и 2',3'-дидезоксирибоза, и модификации межнуклеотидной связи, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат и фосфороамидат. Термин "полинуклеотид", конкретно, включает однонитевые и двунитевые формы ДНК. Термин "олигонуклеотид", как он употребляется здесь, включает природные и модифицированные нуклеотиды, сшитые вместе природными и/или неприродными олигонуклеотидными сшивками. Олигонуклеотиды представляют собой подгруппу полинуклеотидов, которые являются однонитевыми и имеют длину 200 нуклеотидов или менее. В некоторых воплощениях изобретения длина олигонуклеотидов составляет от 10 до 60 нуклеотидов. В некоторых воплощениях длина изобретения олигонуклеотидов составляет 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или от 20 до 40 нуклеотидов. Олигонуклеотиды могут быть однонитевыми или двунитевыми, например, для использования при конструировании генетического мутанта. Олигонуклеотиды по изобретению могут представлять собой смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды по отношению к последовательности, кодирующей белок. Термин "природные нуклеотиды" включает дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Термин"модифицированные нуклеотиды" включает нуклеотиды с модифицированными или замещенными сахарными группами и тому подобным. Термин "олигонуклеотидные сшивки" включает олигонуклеотидные сшивки, такие как фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфораниладат, фосфороамидат и тому подобные. См., например, LaPlanche et al., 1986,Nucl. Acids Res., 14: 9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc., 106: 6077: Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res.,16: 3209: Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6: 539: Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES ANDEngland: Stec et al., U. S. Pat. No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90: 543, описания которых включены сюда путем ссылки для любой цели. Олигонуклеотид может включать детектируемую метку, чтобы обеспечить обнаружение олигонуклеотида или его гибридизации. Термин "вектор" обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой вектор сшит. Одним из типов вектора является "плазмида", которая представляет собой двунитевуюй петлю ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клеткехозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации, и эписомные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клеткухозяина и посредством этого реплицируются параллельно с геномом хозяина. Кроме того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно сцеплены. Такие векторы называют здесь "рекомбинантными экспрессионными векторами" (или просто "экспрессионными векторами"). Как правило, экспрессионные векторы, полезные в методиках рекомбинантных ДНК, часто нахо- 11013614 дятся в форме плазмид. В настоящем описании "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее используемой используемой формой вектора. Однако в изобретение следует включать также другие формы экспрессионных векторов, например вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы),которые выполняют эквивалентные функции. Термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин") обозначает клетку, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Специалистам в данной области должно быть понятно, что такие термины следует относить не только к конкретной обсуждаемой клетке, но и к потомству такой клетки. Поскольку некоторые модификации могут встречаться в последующих поколениях либо вследствие мутации, либо воздействий окружающей среды, такое потомство в действительности может не быть идентично родительской клетке, но тем не менее включено в объем термина "клетка-хозяин", как его используют здесь. Для экспрессии антител по настоящему изобретению можно использовать широкий ряд экспрессионных систем-хозяев, включая бактериальные, дрожжевые, бакуловирусные и экспрессионные системы млекопитающих (а также экспрессионные системы фагового дисплея). Примером подходящего бактериального экспрессионного вектора является pUC19. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяина трансфецируют одним или более чем одним рекомбинантным вектором экспрессии, несущим фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина антитела,так что легкая и тяжелая цепи экспрессируются в этой клетке-хозяине и предпочтительно секретируются в среду, в которой культивируют эти клетки-хозяева, причем из этой среды антитела можно выделить. Стандартные методологии рекомбинантных ДНК используют для получения генов тяжелой и легкой цепей антитела, для включения этих генов в рекомбинантные экспрессионные векторы и введения векторов в клетки-хозяева, такие как описаны в Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratories, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Current Protocols in MolecularBiology, Greene Publishing Associates (1989) и в U. S. Patent No. 4,816,397 to Boss et al. Термином "клетка-хозяин" обозначают клетку, которая трансформирована или способна быть трансформированной нуклеиново-кислотной последовательностью, а затем способна к экспрессии выбранного интересующего гена. Этот термин охватывает и потомство родительской клетки, независимо от того, является ли это потомство идентичным по морфологии или по генотипу исходному родителю, если присутствует выбранный ген. Используемым термином "трансдукция" обозначают переносгенов из одной бактерии в другую,обычно посредством фага. "Трансдукция" также относится к приобретению и переносу эукариотических клеточных последовательностей ретровирусами. Используемый термин "трансфекция" применяют к захвату чужеродной или экзогенной ДНК клеткой; клетка "трансфецирована", когда экзогенная ДНК введена внутрь клеточной мембраны. Ряд методик трансфекции хорошо известен в данной области и раскрыт здесь. См., например, Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springal.,1981. Gene 13: 197. Такие методики можно использовать для введения одной или более молекул экзогенной ДНК в подходящие клетки-хозяева. Термин "трансформация", как его используют здесь, относится к изменению в генетических характеристиках клетки, а клетка является трансформированной, если она была модифицирована таким образом, что содержит новую ДНК. Например, клетка является трансформированной, когда она является генетически модифицированной по отношению к ее нативному состоянию. После трансфекции или трансдукции трансформирующая ДНК может рекомбинировать с ДНК клетки посредством физической интеграции в хромосому клетки, либо может сохраняться транзитно в виде эписомного элемента, не реплицируясь, либо может реплицироваться независимо в виде плазмиды. Клетку считают стабильно трансформированной, когда ДНК реплицируется при делении клетки. Термин "природный" или "нативный", когда его используют в связи с биологическими веществами,такими как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и тому подобное, относится к веществам, которые обнаруживаются в природе, а не сконструированы человеком. Подобным образом,термин "неприродный" или "ненативный", как используют здесь, относится к веществу, которое не обнаруживается в природе или которое структурно модифицировано или синтезировано человеком. Термин "антиген" относится к молекуле или к участку молекулы, которые способны связываться с агентом избирательного связывания, таким как антитело, и, кроме того, могут быть использованию у животного для продуцирования антител, способных связываться с эпитопом такого антигена. Антиген может иметь один или более чем один эпитоп. Термин "идентичность", как известно в данной области, относится к соотношению между последовательностями двух или более полипептидных молекул или двух или более молекул нуклеиновой кислоты, определенному путем сравнения их последовательностей. В данной области "идентичность" также означает степень родства последовательности молекул нуклеиновых кислот или полипептидов, при возможном положении, определенной при сопоставлении нитей двух или более нуклеотидных или двух или более аминокислотных последовательностей. "Идентичность" определяет процент идентичных совпаде- 12013614 ний с наименьшей из двух или более последовательностей при выравнивании разрывов (если они есть) с помощью конкретной математической модели или компьютерной программы (то есть "алгоритмов"). Термин "подобие" используют в данной области применительно к родственной концепции, но, в противоположность "идентичности", "подобие" относится к мере родства, которая включает как идентичные совпадения, так и совпадения консервативных замен. Если две полипептидные последовательности имеют, например, 10/20 идентичных аминокислот, а остальные являются неконсервативными заменами, тогда и процент идентичности, и процент подобия будут равны 50%. Если в таком же примере имеется пять дополнительных положений, где существуют консервативные замены, тогда процент идентичности остается 50%, но процент подобия будет равен 75% (15/20). Следовательно, в случаях, когда имеются консервативные замены, процент подобия между двумя полипептидами будет выше, чем процент идентичности между этими двумя полипептидами. Идентичность и подобие родственных нуклеиновых кислот и полипептидов можно легко вычислить известными способами. Такие способы включают, но не ограничены ими, способы, описанные в COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY (Lesk A.М., ed.), 1988, Oxford University Press, New York; BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS (Smith D. W., ed.), 1993, Academic Press, NewPress, New York; Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math., 48: 1073 и Durbin et al., BIOLOGICAL SEQUENCE ANALYSIS. Cambridge University Press. Предпочтительные способы определения идентичности предназначены для получения наибольшего совпадения между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные компьютерные способы определения идентичности между двумя последовательностями включают, но не ограничены ими, пакет программWisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 215: 403-410). Программа BLASTX общедоступна от National Center for Biotechnology Information (NCBI) и из других источников (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., 1990. см. выше). Можно также использовать хорошо известный алгоритм Смита-Ватермана для определения идентичности. Результатом некоторых схем сопоставления для выравнивания двух аминокислотных последовательностей может быть совпадение только короткой области этих двух последовательностей, и эта небольшая выровненная область может иметь очень высокую идентичность последовательности, даже при отсутствии значительного родства между двумя полноразмерными последовательностями. Соответственно, в некоторых воплощениях изобретения результатом выбранного способа сопоставления (программа GAP) будет сопоставление, которое перекрывает по меньшей мере 50 смежных аминокислот целевого полипептида. Например, используя компьютерный алгоритм GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), два полипептида, для которых нужно определить процент идентичности последовательности, сопоставляют с оптимальным совпадением их соответствующих аминокислот ("совпадающий промежуток", как определено с помощью этого алгоритма). В некоторых воплощениях при использовании этого алгоритма применяют штраф на внесение делеции в сопоставление (который вычисляют как трехкратную среднюю диагональ; где "средняя диагональ" представляет собой среднее значение диагонали используемой матрицы сравнения; "диагональ" представляет собой балл или число, приписываемое каждому точному совпадению аминокислот по конкретной матрице сопоставления), и штраф на продолжение делеции (который обычно составляет одну десятую штрафа на внесение делеции в сопоставление), а также матрицу сравнения, такую как РАМ 250 или BLOSUM 62. В некоторых воплощениях в алгоритме также используют стандартную матрицу сравнения (см. Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: 345-352 для матрицы сравнения РАМ 250; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. SciUSA, 89: 10915-10919 для матрицы сравнения BLOSUM 62). В некоторых воплощениях изобретения параметры для сравнения полипептидных последовательностей включают следующие: Алгоритм: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol., 48: 443-453; Матрица сравнения: BLOSUM 62 от Henikoff et al., 1992, см. выше; Штраф на внесение делеции в сопоставление: 12 Штраф на длину делеции: 4 Порог подобия: 0 При использовании вышеуказанных параметров полезно применять программу GAP. В некоторых воплощениях изобретения вышеуказанные параметры являются параметрами по умолчанию для сравнений полипептидов (параллельно с отсутствием штрафа на концевые делеции) с использованием алгоритма GAP. Термин "гомология" относится к степени подобия между последовательностями белков или нук- 13013614 леиновых кислот. Информация по гомологии полезна для понимания генетического происхождения определенных видов белков или нуклеиновых кислот. Гомологию можно определить путем сопоставления и сравнения последовательностей. Обычно, чтобы определить аминокислотную гомологию, последовательность белка сравнивают с базой данных известных последовательностей белков. Гомологичные последовательности имеют общие функциональные идентичности в каком-либо месте на протяжении их последовательностей. Высокая степень подобия или идентичности обычно является показателем гомологии, хотя низкая степень подобия или идентичности не обязательно является показателем отсутствия гомологии. Несколько подходов можно использовать для сравнения аминокислот одной последовательности с аминокислотами другой последовательности с целью определения гомологии. Как правило, эти подходы попадают в две категории: (1) сравнение физических характеристик, таких как полярность, заряд и Вандер-Ваальсов объем, для создания матрицы подобия; и (2) сравнение вероятной замены аминокислоты в последовательности какой-либо другой аминокислотой, которое основано на наблюдении многих белковых последовательностей из известных гомологичных белков и для создания матрицы приемлемых точечных мутаций (Point Accepted Mutation Matrix, РАМ). Процент идентичности можно также вычислить путем с использованием программы needle (пакетEMBOSS) или stretcher (пакет EMBOSS) либо программы align X в качестве можудя программного обеспечения vector NTI suite 9.0.0, используя параметры по умолчанию (например, штраф на делеции - 5,штраф на внесение делеции в выравнивание - 15, штраф на продолжение делеции - 6.6). Здесь используется традиционное обозначение двадцати основных аминокислот и их сокращений. См. IMMUNOLOGY-A SYNTHESIS, 2nd Edition (Е.S. Golub and D.R. Gren, Eds.), Sinauer Associates: Sunderland, MA, 1991), включенную сюда путем ссылки для любой цели. Стереоизомеры (например, Dаминокислоты) двадцати основных аминокислот; неприродные аминокислоты, такие как ,двузамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие неосновные аминокислоты также могут быть пригодными компонентами полипептидов по изобретению. Примеры неосновных аминокислот включают 4-гидроксипролин, -карбокситутамат, -N,N,N-триметиллизин, -Nацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, N-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В обозначении полипептидов, используемом здесь, левое направление представляет собой аминоконцевое направление, а направление направо представляет собой карбоксилконцевое направление в соответствии с общепринятым использованием и соглашением. Природные остатки можно разделить на классы на основании общих свойств боковой цепи: 1) гидрофобные: норлейцин (Nor), Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro; 2) полярные гидрофильные: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr; 3) алифатические: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro; 4) алифатические гидрофобные: Ala, Ile, Leu, Val, Pro; 5) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 6) кислотные: Asp, Glu; 7) основные: His, Lys, Arg; 8) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; 9) ароматические: His, Trp, Tyr, Phe и 10) ароматические гидрофобные: Phe, Trp, Tyr. Консервативные аминокислотные замены могут включать замену представителя одного из этих классов другим представителем того же класса. Консервативные аминокислотные замены могут охватывать неприродные аминокислотные остатки, которые обычно возникают и химическом пептидном синтезе, а не при синтезе в биологических системах. Эти остатки включают пептидомиметики и другие обращенные или инвертированные формы аминокислотных группировок. Неконсервативные замены могут включать замену представителя одного из этих классов представителем другого класса. Такие замещенные остатки можно вводить в области человеческого антитела,которые являются гомологичными нечеловеческим антителам, или в негомологичные области молекулы. При получении таких замен согласно некоторым воплощениям изобретения можно учитывать показатель гидропатичности аминокислот. Каждой аминокислоте присвоен показатель гидропатичности, определенный на основании ее гидрофобности и заряда. Эти показатели следующие: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5). В данной области известна важность показателя гидропатичности аминокислот в приписывании интерактивной биологической функции белку (см., например, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131). Известно, что некоторые аминокислоты могут быть заменены другими аминокислотами, имеющими такой же показатель или балл гидропатичности, поскольку они сохраняют ту же биологическую активность. При создании замен на основании показателя гидропатичности в некоторых воплощениях изобре- 14013614 тения включена замена аминокислот, показатели гидропатичности которых находятся в пределах 2. В некоторые воплощения изобретения включены замены в пределах 1, а в некоторые воплощения включены замены в пределах 0,5. В данной области также известно, что замена подобных аминокислот может быть эффективно произведена на основании гидрофильности, в частности, когда биологически функциональный белок или пептид, сконструированный таким образом, предназначен для применения в иммунологических воплощениях как раскрыто для изобретения. В некоторых воплощениях самая высокая локальная средняя гидрофильность белка, которая определяется гидрофильностью соседних аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, то есть с биологическим свойством этого белка. Этим аминокислотным остаткам приписаны следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,01); глутамат (+3,01); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,51); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). При получении замен на основании подобных значений гидрофильности в некоторые воплощения изобретения включена замена аминокислот, значения гидрофильности которых находятся в пределах 2, в некоторые воплощения включены замены в пределах 1, и в некоторые воплощения включены замены в пределах 0,5. Можно также идентифицировать эпитопы из первичных аминокислотных последовательностей на основании гидрофильности. Эти области также называются "центральными областями эпитопов". Примеры аминокислотных замен приведены в табл. 1. Аминокислотные замены Специалист в данной области сможет определить подходящие варианты полипептида, как изложено здесь, используя хорошо известные методики. В некоторых воплощениях специалист в данной области может идентифицировать подходящие области молекулы, которые могут быть изменены без нарушения активности направленными заменами в этих областях, не считающимися важными для активности. В других воплощениях изобретения специалист в данной области может идентифицировать остатки и участки молекул, которые являются консервативными среди подобных полипептидов. В других воплощениях одинаковые области, которые могут быть важны для биологической активности или для структуры,могут быть предметом консервативных аминокислотных замен без нарушения биологической активности или без вредного влияния на структуру полипептида. Кроме того, специалист в данной области может сделать обзор структурно-функциональных исследований, идентифицирующих остатки в подобных полипептидах, которые являются важными для активности или структуры. В свете такого сравнения специалист в данной области может предсказать важность аминокислотных остатков в белке, которые соответствуют аминокислотным остаткам, важным для активности или структуры в подобных белках. Специалист в данной области может выбрать химически подобные аминокислотные замены для таких предсказанных важных аминокислотных остатков.- 15013614 Специалист в данной области может также провести анализ трехмерной структуры и аминокислотной последовательности структуры в подобных полипептидах. В свете такой информации специалист в данной области может предсказать результат сопоставления аминокислотных остатков антитела в отношении его трехмерной структуры. В некоторых воплощениях специалист в данной области может сделать выбор не производить радикальных изменений в аминокислотных остатках, для которых предсказано, что они находятся на поверхности белка, поскольку такие остатки могут быть вовлечены в важные взаимодействия с другими молекулами. Кроме того, специалист в данной области может создать контрольные варианты, содержащие единственную аминокислотную замену в каждом желаемом аминокислотном остатке. Затем можно провести скрининг этих вариантов, используя анализы на активность, известные специалистам в данной области. Такие варианты можно использовать для сбора информации о подходящих вариантах. Например, если обнаружено, что замена конкретного аминокислотного остатка приводит в результате к нарушенной, нежелательно сниженной или непригодной активности, вариантов с такой заменой можно избежать. Иными словами, на основании информации, собранной в таких рутинных экспериментах, специалист в данной области может легко определить аминокислоты, для которых дополнительных замен следует избегать, либо самих по себе, либо в комбинации с другими мутациями. Ряд научных публикаций посвящен предсказанию вторичной структуры. См. Moult 1996, Curr. Op.in Biotech. 7: 422-427; Chou et al., 1974, Biochemistry 13: 222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113: 211222; Chou et al., 1978, Adv.Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47: 45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276 и Chou et al., 1979, Biophys. J. 26: 367-384. Кроме того, в настоящее время доступны компьютерные программы, помогающие предсказывать вторичную структуру. Один из способов предсказания вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например, два полипептида или белка, которые имеют идентичность последовательности выше 30%, или подобие выше 40%, часто имеют подобные структурные топологии. В последнее время пополнение базы данных структуры белков(PDB, protein structural database) обеспечил повышенную предсказуемость вторичной структуры, включая возможное число складок в пределах структуры полипептида или белка. См. Holm et al., 1999, Nucl. Acid.Res. 27: 244-247. Сделано предположение (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7: 369-376), что существует ограниченное число складок в данном полипептиде или белке, и что, как только критическое число структур разрешено, предсказание структуры станет значительно точнее. Дополнительные способы предсказания вторичной структуры включают "нанизывание" (Jones,1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 377-87; Sippl et al., 1996, Structure 4: 15-19),"профильный анализ" (Bowieet al., 1991, Science 253: 164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183: 146-159; Gribskov et al., 1987,Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 4355-4358) и "эволюционую связь" (см. Holm, 1999, выше и Brenner, 1997, выше). В некоторых воплощениях варианты антител включают варианты гликозилирования, где число и/или тип сайтов гликозилирования изменен по сравнению с аминокислотными последовательностями исходного полипептида. В некоторых воплощениях варианты белка содержат большее или меньшее число сайтов N-гликозилирования, чем нативный белок. Сайт N-гликозилирования характеризуется последовательностью: Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где аминокислотный остаток, обозначенный символом X,может представлять собой любой аминокислотный остаток, кроме пролина. Замена аминокислотных остатков для создания этой последовательности создает новый потенциальный сайт для добавления Nсвязанной углеводной цепи. Или же замены, которые элиминируют эту последовательность, будут удалять существующую N-связанную углеводную цепь. Также предложена перестройка N-связанных углеводных цепей, где один или более чем один сайт N-гликозилирования (обычно тот, который встречается в природе) элиминируется, и один или более сайтов N-гликозилирования образуется. Предпочтительные дополнительные варианты антител включают цистеиновые варианты, где один или более чем один цистеиновый остаток делетирован или заменен другой аминокислотой (например, серином) по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью. Цистеиновые варианты могут быть полезны, когда укладка антител должна быть изменена до биологически активной конформации, как, например, после выделения нерастворимых телец включения. Цистеиновые варианты, как правило, имеют меньше цистеиновых остатков, чем нативный белок, и обычно имеют именно такое число, чтобы свести к минимуму взаимодействия в результате неспаренных цистеинов. В дополнительных воплощениях варианты антител могут включать антитела, содержащие модифицированный Fc-фрагмент или модифицированную константную область тяжелой цепи. "Fc-фрагмент",что означает "фрагмент, который кристаллизуется", или константную область тяжелой цепи, может быть модифицирован за счет мутации для придания антителу измененных характеристик связывания. См.,например, Burton and Woof, 1992. Advances in Immunology 51: 1-84; Ravetch and Bolland. 2001, Annu. Rev.Immunol. 19: 275-90: Shields et al., 2001. Journal of Biol. Chem. 276: 6591-6604; Telleman and Junqhans,2000. Immunology 100: 245-251: Medesan et al., 1998. Eur. J. Immunol. 28: 2092-2100; все включены сюда путем ссылки. Такие мутации могут включать замены, добавления, делеции или любую их комбинацию,и их обычно получают путем сайт-направленного мутагенеза, используя один или более чем один мутагенный олигонуклеотид, способами, описанными здесь, а также способами, известными в данной области (см., например, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL 3rd Ed. 2001,Cold Soring Harbor. N. Y. и Berger and Kimmel. METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Guide to Mo- 16013614lecular Cloning Technigues, 1987. Academic Press, Inc., San Diego, CA, которые включены сюда путем ссылки). Согласно некоторым воплощениям изобретения, аминокислотные замены представляют собой те замены, которые: (1) уменьшают чувствительность к протеолизу, (2) уменьшают чувствительность к окислению, (3) изменяют аффинитет связывания для образования белковых комплексов, (4) изменяют аффинитеты связывания и/или (5) придают или модифицируют другие физико-химические или функциональные свойства таких полипептидов. Согласно некоторым воплощениям одиночные или множественные аминокислотные замены (в некоторых воплощениях консервативные аминокислотные замены) могут быть получены в природной последовательности (в некоторых воплощениях в участке полипептида вне домена(ов), образующего межмолекулярного контакта). В предпочтительных воплощениях консервативная аминокислотная замена обычно не изменяет существенно структурные характеристики исходной последовательности (например, замена аминокислоты не должна иметь склонность к разрыву спирали, которая встречается в исходной последовательности, или к прерыванию других типов вторичной структуры, которая характеризует исходную последовательность). Примеры известных в данной области вторичных и третичных структур полипептидов описаны в PROTEINS, STRUCTURES ANDY.: u Thornton et al., 1991, Nature 354: 105, каждая из этих публикаций включена сюда путем ссылки. Аналоги пептидов обычно используют в фармацевтической промышленности в качестве непептидных лекарств со свойствами, аналогичными свойствам первоначального пептида. Эти типы непептидных соединений обозначены термином "миметики пептидов" или "пептидомиметики". См. Fauchere, 1986,Adv. Drug Res. 15: 29; VeberFreidinger, 1985, TINS p. 392; и Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30: 1229,которые включены сюда путем ссылки для любой цели. Такие соединения часто разрабатывают с помощью компьютеризированного молекулярного моделирования. Пептидные миметики, которые структурно подобны терапевтически полезным пептидам, можно использовать для получения подобного терапевтического или профилактического эффекта. Как правило, пептидомиметики структурно подобны полипептиду-образцу (то есть полипептиду, который обладает биологическим свойством или фармакологической активностью), такому как человеческое антитело, но имеют одну или более чем одну пептидную связь,возможно замещенную связью, выбранной из: -CH2-NH-, -CH2-S-, -CH2-CH2-, -СН=СН- (цис и транс),-СОСН 2-, -СН(ОН)СН 2- и -CH2SO-, способами, хорошо известными в данной области. Систематическую замену одной или более аминокислот согласованной последовательности D-аминокислотой такого же типа (например, D-лизин вместо L-лизина) можно использовать в некоторых воплощениях для создания более стабильных пептидов. Кроме того, искусственные пептиды, содержащие согласованную последовательность или, по существу, идентичный вариант согласованной последовательности, могут быть получены способами, известными в данной области (RizoGierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61: 387,включено сюда путем ссылки для любой цели); например, путем добавления внутренних цистеиновых остатков, способных к образованию межмолекулярных дисульфидных мостиков, которые циклизуют пептид. Термин "антитело" или "антитело-пептид(ы)" относится к интактному антителу или его связывающему фрагменту, который конкурирует с интактным антителом за специфичное связывание. В некоторых воплощениях связывающие фрагменты получают с помощью методик рекомбинантных ДНК. В дополнительных воплощениях связывающие фрагменты получают путем ферментативного или химического расщепления интактных антител. Связывающие фрагменты включают, но не ограничены ими, F(ab),F(ab'), F(ab')2, Fv и одноцепочечные антитела. Термин "тяжелая цепь" включает любой иммуноглобулиновый полипептид, имеющий достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к NGF. Термин "легкая цепь" включает любой иммуноглобулиновый полипептид, имеющий достаточную последовательность вариабельной области для придания специфичности к NGF. Полноразмерная тяжелая цепь включает домен вариабельной области, VH, и три домена константной области, СН 1, СН 2 и СН 3. Домен VH находится при аминоконце полипептида, а домен CH3 находится при карбоксиконце. Термин "тяжелая цепь", как его используют здесь, охватывает полноразмерную тяжелую цепь и ее фрагменты. Полноразмерная легкая цепь включает домен вариабельной области, VL и домен константной области, CL. Подобно тяжелой цепи, домен вариабельной области легкой цепи находится при аминоконце полипептида. Термин "легкая цепь", как его используют здесь, охватывает полноразмерную легкую цепь и ее фрагменты. F(ab) фрагмент состоит из одной легкой цепи и CH1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепьF(ab) молекулы не может образовать связь с другой молекулой тяжелой цепи. F(ab') фрагмент содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит большую часть константной области, между доменами СН 1 и СН 2, так что межцепочечная дисульфидная связь может образоваться между двумя тяжелыми цепями с образованием F(ab')2 молекулы. Область Fv содержит вариабельные области из обеих цепей, тяжелой и легкой, но не содержит константные области. Одноцепочечные антитела представляют собой Fv молекулы, в которых вариабельные области тяжелой и легкой цепи соединены подвижным линкером с образованием единой полипептидной цепи, которая образует антигенсвязывающую область.- 17013614 Одноцепочечные антитела подробно обсуждаются в публикации международной патентной заявкиWO 88/01649 и в патентах США 4946778 и 5260203. Под бивалентным антителом, не являющимся "многоспецифичным" или "многофункциональным" антителом, в некоторых воплощениях понимают как антитело, содержащее сайты связывания, имеющие идентичную антигенную специфичность. При оценке связывания и специфичности антитела по изобретению считают, что антитело, по существу, ингибирует адгезию лиганда к рецептору, когда избыток антитела уменьшает количество лиганда, связанного с рецептором, по меньшей мере примерно на 20, 40, 60, 80, 85% или более (при измереннии, среди прочего, с использованием конкурентного анализа связывания in vitro). Под "нейтрализующим антителом" подразумевают молекулу антитела, которая способна блокировать или существенно снижать эффекторную функцию антигена-мишени, с которым оно связывается. Соответственно, "нейтрализующее" антитело к NGF способно блокировать или существенно снижать эффекторную функцию, такую как связывание рецептора и/или провокацию клеточного ответа NGF. Под понятием "существенно снизить" следует понимать по меньшей мере примерно 60%, предпочтительно по меньшей мере примерно 70%, более предпочтительно по меньшей мере примерно 75%, даже более предпочтительно по меньшей мере примерно 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85%, наиболее предпочтительно по меньшей мере примерно 90% снижение эффекторной функции антигена-мишени (например, человеческого NGF). Термин "эпитоп" включает любой детерминант, предпочтительно полипептидный детерминант,способный к специфичному связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. В некоторых воплощениях эпитопные детерминанты включают химически активные поверхностные группировки молекул, такие как аминокислоты, сахарные боковые цепи, фосфорильные группы или сульфонильные группы, а в некоторых воплощениях могут иметь специфичные структурные трехмерные характеристики и/или специфичные характеристики заряда. Эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается с антителом. В некоторых воплощениях указано, что антитело специфично связывает антиген,когда оно предпочтительно распознает его антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул. В предпочтительных воплощениях указано, что антитело специфично связывает антиген, когда равновесная константа диссоциации составляет 10-8 М, более предпочтительно, когда равновесная константа диссоциации составляет 10-9 М, и наиболее предпочтительно, когда константа диссоциации составляет 10-1 М. Считают, что антитело связывает "по существу тот же эпитоп", что и антитело сравнения, когда эти два антитела распознают идентичные или пространственно перекрывающиеся эпитопы. Наиболее широко используемыми и быстрыми способами определения, связываются ли два антитела с идентичными или пространственно перекрывающимися эпитопами, являются конкурентные анализы, которые проектируют в ряде различных форм, используя либо меченый антиген, либо меченое антитело. Обычно антиген иммобилизуют на субстрате, и способность немеченых антител блокировать связывание меченых антител измеряют, используя радиоактивные или ферментативные метки. Термин "агент" используют здесь для обозначения химического соединения, смесь химических соединений, биологическую макромолекулу или экстракт, полученный из биологических материалов. Как используются здесь, термины "метка" или "меченый" относятся к включению детектируемого маркера, например, путем включения радиоактивно меченой аминокислоты или присоединения к полипептиду биотиновых группировок, которые можно обнаружить с помощью меченого авидина (например,стрептавидина, предпочтительно содержащего детектируемый маркер, такой как флуоресцентный маркер, хемилюминесцентный маркер или ферментативная активность, которые можно обнаружить оптическими или колориметрическими способами). В некоторых воплощениях метка может быть также терапевтической. В данной области известны различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов и они могут быть выгодно использованы в способах, раскрытых в описании изобретения. Примеры меток для полипептидов включают, но не ограничены ими, приведенные ниже радиоактивные изотопы или радионуклиды (например, 3 Н, 14 С, 15N, 35S, 90Y, 99mTc, 111In, 125I, 131I), флуоресцентные метки (например,флуоресцеинизотиоцианат или ФИТЦ, родамин или лантаноидные фосфоры), ферментативные метки(например, пероксидазу хрена, -галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные метки, гаптеновые метки, такие как биотинильные группы, и предопределенные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, парные последовательности лейциновой молнии, сайты связывания для вторичных антител, домены связывания металлов или эпитопные выступы). В некоторых воплощениях метки присоединяют с помощью спейсерных плеч (таких как (СН 2)n, гдеn примерно 20) различной длины для уменьшения возможного стерического препятствия. Термин "биологический образец", как его используют здесь, включает, но не ограничен этим, любое количество вещества из живого организма или прежде жившего организма. Такие живые организмы включают, но не ограничены ими, людей, мышей, обезьян, крыс, кроликов и других животных. Указанные вещества включают, но не ограничены ими, кровь, сыворотку, мочу, клетки, органы, ткани, кость,костный мозг, лимфатические узлы и кожу.- 18013614 Термин "фармацевтический агент или лекарство", как его используют здесь, относится к химическому соединению или композиции, которые способны индуцировать желаемый терапевтический эффект при правильном введении пациенту. Выражение "фармацевтически эффективное количество" в отношении фармацевтической композиции, содержащей одно антитело или множество антител по изобретению,понимают как означающее согласно изобретению количество указанной фармацевтической композиции,которое способно прекратить у рассматриваемого пациента повышение порога чувствительности к внешним стимулам с возвратом порога чувствительности к уровню, сравнимому с уровнем, наблюдаемым у здоровых субъектов."Расстройство" представляет собой любое состояние, для которого будет благоприятным лечение по настоящему изобретению. Термины "расстройство" и "состояние" здесь используют взаимозаменяемо,и они охватывают хронические и острые NGF-опосредованные расстройства или NGF-опосредованные заболевания, включая те патологические состояния, которые предрасполагают млекопитающее к обсуждаемому расстройству. Термины "NGF-опосредованное заболевание" и "NGF-опосредованное расстройство" охватывают любое медицинское состояние или расстройство, связанное с повышенными уровнями NGF или с повышенной чувствительностью к NGF, включая, но не ограничиваясь ими, острую боль, зубную боль, боль в результате травмы, операционную боль, боль в результате ампутации или абсцесса, каузалгию, демиелинизирующие заболевания, невралгию тройничного нерва, рак, хронический алкоголизм, удар, таламический болевой синдром, диабет, синдром приобретенного иммунодефицита ("СПИД"), токсины и химиотерапию, общую головную боль, мигрень, кластерную головную боль, смешанно-васкулярные и неваскулярные синдромы, головную боль напряжения, общее воспаление, артрит, ревматические заболевания,волчанку, остеоартрит, воспалительные кишечные расстройства, синдром раздраженной кишки, воспалительные глазные расстройства, воспалительные или нестабильные расстройства мочевого пузыря, псориаз, кожные жалобы с воспалительными компонентами, солнечный ожог, кардит, дерматит, миозит,неврит, сосудистые коллагенозы, хронические воспалительные состояния, воспалительную боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию, невропатологическую боль и сочетанную гипералгезию и аллодинию, боль при диабетической невропатии, каузалгию, симпатически поддерживаемую боль, синдромы деафферентации, астму, повреждение или дисфункцию эпителиальной ткани, простой герпес, расстройства двигательной функции внутренних органов в районе дыхательной, мочеполовой, желудочнокишечной или сосудистой систем, раны, ожоги, аллергические кожные реакции, зуд, витилиго, общие желудочно-кишечные расстройства, колит, язву желудка, язвы двенадцатиперстной кишки, вазомоторный или аллергический ринит или бронхиальные расстройства, дисменорею, диспепсию, желудочнопищеводный рефлюкс, панкреатит и висцералгию. Как их используют здесь, термины "эффективное количество" и "терапевтически эффективное количество" при использовании в отношении носителя или фармацевтической композиции, которые содержат одно или более чем одно человеческое антитело к человеческому NGF, относятся к количеству или дозировке, которые достаточны для получения желаемого результата (то есть когда для терапии антителом с носителем или человеческими антителами к человеческому NGF по настоящему изобретению желаемым результатом является желаемое уменьшение воспаления и/или боли, например) или для поддержания наблюдаемого снижения уровня одной или более чем одной биологической активности NGF. Более конкретно, терапевтически эффективное количество представляет собой количество человеческого антитела (человеческих антител) к человеческому NGF, достаточное для ингибирования в течение некоторого периода времени одного или более клинически определенных патологических процессов, связанных с обсуждаемым состоянием, например, воспаления или боли, у субъекта, которого лечат in vivo этим агентом. В настоящем изобретении "эффективное количество" антитела к NGF может предупреждать,останавливать, регулировать или уменьшать восприятие боли, связанное с каким-либо болезненным медицинским состоянием. В способах по настоящему изобретению термин "регулировать" и его грамматические варианты используют для обозначения предупреждения, частичного или полного ингибирования,уменьшения, задержки или замедления нежелательного события, например боли. Эффективное количество может варьировать в зависимости от конкретного выбранного антитела с носителем или человеческого антитела (человеческих антител) к человеческому NGF, а также зависит от ряда факторов и условий, связанных с субъектом, подлежащим лечению, и от тяжести расстройства. Например, если антитело с носителем или человеческое антитело (человеческие антитела) к человеческому NGF нужно вводить invivo, среди учитываемых факторов будут такие факторы, как возраст, масса и состояние здоровья пациента, а также кривые доза-ответ и данные по токсичности, полученные в доклинической работе на животных. Если агент нужно приводить с клетками в контакт in vitro, можно также разработать ряд доклинических исследований in vitro для оценки таких параметров, как захват, период полураспада, доза, токсичность и т.д. Определение эффективного количества или терапевтически эффективного количества для данного агента хорошо известно в пределах компетенции специалиста в данной области. Как их используют здесь, термины "фактор роста нервной ткани" и "NGF" обозначают все виды нативной последовательности NGF млекопитающих, включая рекомбинантный человеческий NGF 1-120,показанный SEQ ID NO: 30.- 19013614 Как используют здесь, термины "по существу чистый" или "по существу очищенный" означают соединение или тип молекулы, то есть присутствующий преобладающий тип молекулы (то есть молекулярно его больше чем любых других отдельных типов молекул в композиции). В некоторых воплощениях изобретения, по существу, очищенная фракция представляет собой композицию, в которой эти молекулы составляют по меньшей мере примерно 50% (молекулярно) присутствующих типов макромолекул. В некоторых воплощениях, по существу, чистая композиция будет составлять более чем примерно 80,85, 90, 95 или 99% всех типов макромолекул, присутствующих в композиции. В некоторых воплощениях этот тип молекул очищен, по существу, до гомогенности (молекулы примесей невозможно обнаружить в композиции общепринятыми способами обнаружения), где композиция состоит, по существу, из единственного типа макромолекул. Термин "пациент" включает субъектов людей и животных. Термины "лечение" и "лечить" относятся как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или превентивным мерам. К тем, кто нуждается в лечении, относят как тех, кто уже страдает этим расстройством, так и тех, кто склонен к этому расстройству, либо тех, у кого это расстройство нужно предупреждать. Если контекст не требует иного, информация об объектах в единственном числе относится и к объектам во множественном числе, а объекты во множественном числе охватывают и объекты в единственном числе. Согласно некоторым воплощениям изобретения, антитела к NGF могут применяться для лечения невропатологической и воспалительной боли и NGF-опосредованных заболеваний, включающих, но не ограниченных ими, упомянутые выше. В одном аспекте изобретения предложены полностью человеческие моноклональные антитела против человеческого NGF, обладающие биологической и иммунологической специфичностью к его связыванию. В одном аспекте в изобретении предложены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности для тяжелой и легкой цепи молекул иммуноглобулина, в частности, последовательности, соответствующие их вариабельным областям. Конкретными воплощениями данного аспекта изобретения являются последовательности, соответствующие областям, определяющим комплементарность (CDR), конкретно областям CDR1-CDR3 тяжелой и легкой цепей, предложенных изобретением. Еще в одном аспекте изобретения предложены клетки и клеточные линии гибридомы, которые экспрессируют молекулы иммуноглобулина и антитела, предпочтительно моноклональные антитела по изобретению. В изобретении также предложены биологически и иммунологически очищенные препараты антител, предпочтительно моноклональных антител против человеческого NGF, обладающих биологической и иммунологической специфичностью связывания с человеческим NGF. Возможность клонировать и реконструировать человеческий локус размером порядка мегабаз в дрожжевых искусственных хромосомах (YAC) и вводить их в линию зародышевых клеток мыши обеспечивает преимущественный подход к исследованию функциональных компонентов очень больших или приблизительно картированных локусов, а также к созданию полезных моделей заболевания человека. Кроме того, использование такой технологии для замещения мышиных локусов их человеческими эквивалентами обеспечивает уникальную возможность понимания экспрессии и регуляции человеческих генных продуктов в процессе развития, их взаимоотношения с другими системами и их вовлеченность в индукцию и прогрессирование заболевания. Важным практическим применением такой стратегии является "гуманизация" мышиной гуморальной иммунной системы. Введение локусов человеческих иммуноглобулинов (Ig) мышам, у которых эндогенные гены Ig инактивированы, дает возможность исследовать механизмы, лежащие в основе программируемой экспрессии и сборки антител, а также их роли в развитии В-клеток. Кроме того, такая стратегия обеспечивает источник получения полностью человеческих моноклональных антител (MAb). Термин "человеческое антитело" охватывает антитела, имеющие вариабельные и константные области, по существу, соответствующие последовательностям иммуноглобулинов зародышевых клеток человека. В некоторых воплощениях человеческие антитела продуцируют с использованием млекопитающих, не представляющих собой человека, включая, но не ограничиваясь ими, грызунов, таких как мыши и крысы, и зайцеобразных, таких как кролики. В некоторых воплощениях изобретения человеческие антитела продуцируют в клетках гибридомы. В некоторых воплощениях изобретения человеческие антитела продуцируют рекомбинантным путем. Термин "рекомбинантный" применительно к антителу включает антитела, которые получают, экспрессируют, конструируют или выделяют рекомбинантными способами. Репрезентативные примеры включают антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора,трансфецированного в клетку-хозяина; антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител; антитела, выделенные из животного (например мыши), которое является трансгенным по человеческим генам иммуноглобулинов (см., например, Taylor, L.P., et al., Nucl. AcidsRes. 20: 6287-6295 (1992; или антитела, полученные, экспрессированные, сконструированные или выделенные любыми способами, в которые вовлечен сплайсинг последовательностей генов человеческих- 20013614 иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области, имеющие происхождение от последовательностей иммуноглобулина линии зародышевых клеток человека. Человеческие антитела обладают по меньшей мере тремя преимуществами по сравнению с нечеловеческими и химерными антителами для применения в терапии человека: 1) в связи с тем, что эффекторный участок антитела является человеческим, он может лучше взаимодействовать с другими частями иммунной системы человека (например, разрушать клетки-мишени более эффективно посредством комплементзависимой цитотоксичности (CDC) или антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC; 2) иммунная система человека не должна распознавать человеческое антитело как чужеродное и,следовательно, ответ антител против такого инъецированного антитела будет меньше, чем против полностью чужеродного нечеловеческого антитела или частично чужеродного химерного антитела; 3) сообщалось, что инъецированные нечеловеческие антитела обладают значительно более коротким периодом полураспада в системе кровообращения человека чем период полураспада человеческих антител. Инъецированные человеческие антитела будут обладать периодом полураспада, по существу,идентичным природным человеческим антителам, что дает возможность давать меньшие и менее частые дозы. Таким образом, ожидают, что полностью человеческие антитела минимизируют иммуногенные и аллергические ответы, свойственные мышиным MAb или MAb мышиного происхождения, и, следовательно, повышают эффективность и безопасность вводимых антител. Полностью человеческие антитела по изобретению, следовательно, можно применять при лечении хронической и рецидивирующей боли,когда ее лечение требует повторного введения антител. Таким образом, одно из конкретных преимуществ антител к NGF по изобретению состоит в том, что эти антитела являются полностью человеческими и их можно вводить пациентам неострым способом, при этом сводя к минимуму вредные реакции,обычно связанные с антителами человек-против-мыши или другими описанными ранее неполностью человеческими антителами из видов, не представляющих собой человека. Специалист в данной области может сконструировать линии мышей с недостаточным продуцированием мышиных антител с большими фрагментами человеческих локусов Ig таким образом, что эти мыши будут продуцировать человеческие антитела при отсутствии мышиных антител. Большие фрагменты человеческих Ig могут сохранить как большое различие в вариабельных генах, так и правильную регуляцию продуцирования и экспрессии антител. При использовании мышиного клеточного аппарата для диверсификации и отбора антител и при отсутствии иммунологической толерантности к человеческим белкам воспроизводимый спектр человеческих антител в этих линиях мышей дает антитела с высоким аффинитетом против любого интересующего антигена, включая человеческие антигены. Используя гибридомную технологию, можно продуцировать и отбирать антигенспецифичные человеческие MAb с желаемой специфичностью. Можно использовать трансгенных животных (например, мышей), которые способны после иммунизации продуцировать полный спектр человеческих антител без продуцирования эндогенных иммуноглобулинов. Перенос множества генов иммуноглобулинов клеток зародышевой линии человека в клетки зародышевой линии таких мутантных мышей приведет в результате к продуцированию человеческих антител после провокации антигеном (см., например, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 25512555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immun., 7: 33 (1993);(2000) и патенты США 5877397, 5874299, 5814318, 5789650, 5770429, 5661016, 5633425, 5625126,5569825 и 5545806 (каждая из этих публикаций включена сюда путем ссылки в полном объеме для любых целей. Человеческие антитела можно также продуцировать в библиотеках фагового дисплея(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 (1991. Методики Cole et al. и Boerner et al. также доступны для получения человеческих моноклональных антител(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therap, Alan R. Liss, p. 77 (1985) и Boerner et al., J. Immunol.,147(1): 86-95 (1991. Рекомбинантные человеческие антитела можно также подвергать мутагенезу in vitro (или когда используют трансгенное по последовательностям человеческих Ig животное - соматическому мутагенезу invivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности VH И VL областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей, родственных последовательностям VH и VL линии зародышевых клеток человека, могут не существовать в природе в спектре антител линии зародышевых клеток человека in vivo. В некоторых воплощениях специалист в данной области может использовать константные области от видов, иных, чем человек, параллельно с человеческой(ими) вариабельной(ыми) областью(ями) у таких мышей для получения химерных антител. Структура природных антител. Структура природного антитела обычно представляет собой тетрамер. Каждый такой тетрамер обычно состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, где каждая пара имеет одну полнораз- 21013614 мерную "легкую" цепь (обычно имеющую молекулярную массу примерно 25 кДа) и одну полноразмерную "тяжелую" цепь (обычно имеющую молекулярную массу примерно 50-70 кДа). Аминоконцевой участок каждой легкой и тяжелой цепи обычно включает вариабельную область из примерно от 100 до 110 или более аминокислот, которая обычно ответственна за распознавание антигена. Карбоксиконцевой участок каждой цепи обычно определяет константную область, ответственную за эффекторную функцию. Человеческие легкие цепи обычно классифицируют как легкие цепи "каппа" и "лямбда". Тяжелые цепи обычно классифицируют как "мю", "дельта", "гамма", "альфа" или "эпсилон", и изотип антитела определяют как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. IgG имеет несколько подклассов, включающих,но не ограничиваясь ими, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. IgM имеет подклассы, включающие, но не ограниченные ими, IgM1 и IgM2. IgA, подобным образом, подразделяют на подклассы, включающие, но не ограниченные ими, IgA1 и IgA2. Внутри полноразмерных легких и тяжелых цепей обычно вариабельные и константные области соединены областью "J" примерно из 12 или более аминокислот, где тяжелая цепь также включает область "D" примерно из 10 или более аминокислот. См., например, FUNDAMENTALIMMUNOLOGY, Ch. 7, 2nd ed. (Paul. W., ed.), 1989, Raven Press. N. Y. (включена путем ссылки в полном объеме для любой цели). Вариабельные области каждой пары легкая/тяжелая цепь обычно образуют антигенсвязывающий сайт. Вариабельные области обычно имеют такую же общую структуру относительно консервативных каркасных участков (FR, framework regions), соединенных тремя гипервариабельными областями, также называемыми областями, определяющими комплементарность (CDR). CDR от двух цепей каждой пары обычно выровнены по каркасным участкам, которые могут обеспечить связывание со специфичным эпитопом. От N-конца к С-концу вариабельные области как легкой, так и тяжелой цепи обычно содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Распределение аминокислот по каждому домену обычно находится в соответствии с определениями Kabat Sequences of Proteins of Immunolopical Interest(1987 and 1991, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) или ChothiaLesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 878-883. Антитела двойной специфичности или бифункциональные антитела. Антитело двойной специфичности или бифункциональное антитело обычно представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разные пары тяжелая цепь/легкая цепь и два разных сайта связывания. Антитела двойной специфичности могут быть получены с помощью ряда методик, включая,но не ограничиваясь ими, слияние гибридом или сшивку F(ab') фрагментов. См., например, SongsivilaiLachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321: Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148: 1547-1553. Получение антител. В изобретении предложены антитела, которые связываются с человеческим NGF. Эти антитела могут быть получены путем иммунизации полноразмерным NGF или его фрагментами. Антитела по изобретению могут быть поликлональными или моноклональными и/или могут представлять собой рекомбинантные антитела. В предпочтительных воплощениях антитела по изобретению представляют собой человеческие антитела, полученные, например, путем иммунизации трансгенных животных, способных к продуцированию человеческих антител (см., например, публикацию международной патентной заявкиWO 93/12227). Области, определяющие комплементарность (CDR), вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антител к NGF по изобретению, могут быть перенесены в каркасные участки (FR) от того же или другого вида. В некоторых воплощениях CDR вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи антител к NGF могут быть перенесены в согласованные человеческие FR. Для создания согласованных FR человека FR из нескольких аминокислотных последовательностей тяжелой цепи или легкой цепи человека выравнивают, чтобы идентифицировать согласованную аминокислотную последовательность. FR тяжелой цепи или легкой цепи антитела к NGF могут быть замещены FR из другой тяжелой цепи или легкой цепи. Редкие аминокислоты в FR тяжелых и легких цепей антитела к NGF обычно не заменяют,тогда как остальные аминокислоты FR могут быть заменены. Редкие аминокислоты представляют собой специфичные аминокислоты, которые находятся в положениях, в которых они не обязательно находятся в FR. Перенесенные вариабельные области из антител к NGF по изобретению можно использовать с константной областью, которая является отличной от константной области антитела к NGF. Альтернативно перенесенные вариабельные области составляют часть единственной цепи Fv антитела. Перенос CDR описан, например, в патентах США 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101, которые включены сюда путем ссылки для любой цели. Антитела по изобретению предпочтительно получают, используя трансгенных мышей, у которых существенная часть локуса, продуцирующего человеческое антитело, встроена в клетки мышей, продуцирующие антитела, и у которых, кроме того, генно-инженерным путем создана недостаточность продуцирования эндогенных мышиных антител. Такие мыши способны к продуцированию молекул человеческих иммуноглобулинов и антител и не продуцируют или продуцируют значительно сниженные количества молекул мышиных иммуноглобулинов и антител. Технологии, используемые для достижения этого результата, раскрыты в патентах, заявках и ссылках, приведенных здесь в описании. В предпочтитель- 22013614 ных воплощениях специалист в данной области может использовать способы, как описано в публикации международной патентной заявкиWO 98/24893, которая включена сюда путем ссылки для любой цели. См. также Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146-156, которая включена сюда путем ссылки для любой цели. Моноклональные антитела (mAb) по изобретению могут быть получены с помощью ряда методик,включая традиционную технологию моноклональных антител, например стандартную методику гибридизации соматических клеток Kohler and Milstein (1975, Nature 256: 495). Хотя методики гибридизации соматических клеток предпочтительны, в принципе, можно использовать другие методики для получения моноклональных антител, например вирусную или онкогенную трансформацию В-лимфоцитов. Предпочтительной животной системой для получения гибридом является мышь. Получение гибридомы мыши очень хорошо отработано, и протоколы и методики иммунизации для выделения иммунизированных спленоцитов для слияния хорошо известны в данной области. Партнеры слияния (например,клетки миеломы мыши) и методики слияния также известны. В предпочтительном воплощении человеческие моноклональные антитела, направленные противNGF, могут быть получены с использованием трансгенных мышей, несущих части человеческой иммунной системы вероятнее, чем мышиной системы. Эти трансгенные мыши, называемые здесь мышами"HuMab", содержат мини-локус гена иммуноглобулина человека, который кодирует не перестроенные последовательности тяжелых ( и ) и легкой к цепей иммуноглобулина человека вместе с направленными мутациями, которые инактивируют эндогенные локусыицепей (Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-859). Соответственно, эти мыши проявляют сниженную экспрессию мышиных IgM илии в ответ на иммунизацию внедренные трансгены тяжелой цепи и легкой цепи человека претерпевают переключение класса и соматическую мутацию с образованием человеческих моноклональных антител IgGвысокого аффинитета (Lonberg et al., см. выше; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93;Sci 764: 536-546; Fishwild et al., 1996. Nature Biotechnology 14: 845-851; содержание всех этих публикаций включено в данное описание изобретения путем ссылки в полном объеме. См. дополнительно патенты США 5545806; 5569825; 5625126; 5633425; 5789650; 5877397; 5661016; 5814318; 5874299 и 5770429; авторы всех Lonberg и Kay, а также патент США 5545807, авторы Surani et al.; публикации международных патентных заявокWO 93/1227, опубликованной 24 июня 1993; WO 92/22646, опубликованной 23 декабря 1992, и WO 92/03918, опубликованной 19 марта 1992, причем содержание всех вышеуказанных документов включено сюда путем ссылки в полном объеме. Или же трансгенные линии мышей НСо 7, Hco12 и KM, описанные ниже в примерах, можно использовать для создания человеческих антител к NGF. Настоящим изобретением предложены человеческие моноклональные антитела, которые являются специфичными к биологически активным полипептидам человеческого NGF и нейтрализуют их. Предложены также аминокислотные последовательности тяжелых и легких цепей антител, которые являются высокоспецифичными к полипептидам NGF и нейтрализуют их при связывании с ними. Эта высокая специфичность обеспечивает человеческим антителам к человеческому NGF и человеческим моноклональным антителам с подобной специфичностью эффективность при иммунотерапии заболеваний, связанных с NGF. В одном аспекте в изобретении предложены изолированные человеческие антитела, которые связывают такой же или, по существу, такой же эпитоп, что и антитело 4D4, предложенное здесь. В одном аспекте в изобретении предложены изолированные человеческие антитела, содержащие по меньшей мере одну из аминокислотных последовательностей, показанных в SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24 и 79-130, которые связывают эпитоп полипептида NGF с высоким аффинитетом и обладают способностью антагонизировать активность полипептида NGF. Предпочтительно эти антитела связывают такой же или, по существу, такой же эпитоп, что и антитело 4D4, предложенное здесь. В предпочтительных воплощениях изолированные человеческие антитела связываются с полипептидом NGF с константой диссоциации (KD) 110-9 М или менее и ингибируют индуцированное NGF выживание в анализе нейтрализации in vitro при IC50 110-7 М или менее. В более предпочтительных воплощениях изолированные человеческие антитела связываются с полипептидом NGF с константой диссоциации (KD) 110-10 М или менее и ингибируют индуцированное NGF выживание в анализе нейтрализации in vitro при IC50 110-8 М или менее. В еще более предпочтительном воплощении изолированные человеческие антитела связываются с полипептидом NGF с константой диссоциации (KD) 110-11 М или менее и ингибируют индуцированное NGF выживание в анализе нейтрализации in vitro при IC50 110-9 М или менее. Примеры человеческих антител к человеческому NGF, которые соответствуют вышеупомянутым критериям связывания и нейтрализации, приведены здесь.- 23013614 Наиболее предпочтительное человеческое антитело к человеческому NGF по настоящему изобретению называется здесь 4D4 и имеет полипептидные последовательности VL и VH, как показано в SEQ IDNO: 12 и SEQ ID NO: 10 соответственно. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая VL и VH 4D4, показана в SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 9 соответственно. Свойства человеческих антител к человеческому NGF по настоящему изобретению конкретно раскрыты в примерах. Особенно важным является высокий аффинитет к полипептиду NGF и высокая способность антагонизировать активность полипептида NGF, продемонстрированная здесь. Константу диссоциации (KD) человеческого антитела к человеческому NGF можно определить с помощью поверхностного плазмонного резонанса, как в общих чертах описано в примере 9. В общих чертах анализ поверхностного плазмонного резонанса измеряет взаимодействия связывания в реальном времени между лигандом (рекомбинантным полипептидом NGF, иммобилизованном на биосенсорной матрице) и анализируемым веществом (антителами в растворе) с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR, surface plasmon resonance), используя систему BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway,NJ). Поверхностный плазмонный анализ можно также проводить путем иммобилизации анализируемого вещества (антител на биосенсорном матриксе) и презентации лиганда (рекомбинантного V в растворе). Константу диссоциации (KD) человеческого антитела к человеческому NGF можно также определить с использованием методологии KinExA. В некоторых воплощениях изобретения антитела связываются сNGF с KD между примерно 10-8 М и 10-12 М. Термин "KD", как его используют здесь, следует относить к константе диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. Для целей настоящего изобретения KD определяют, как показано в примере 9. В предпочтительном воплощении антитела по изобретению относятся к изотипу IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Предпочтительно антитела относятся к изотипу IgG3. Более предпочтительно антитела относятся к изотипу IgG1. Наиболее предпочтительно антитела относятся к изотипу IgG2. В других воплощениях антитела по изобретению относятся к изотипу IgM, IgA, IgE или IgD. В предпочтительных воплощениях изобретения антитела содержат легкую цепь каппа человека и тяжелую цепь IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека. Экспрессия антител по изобретению, содержащих константную область тяжелой цепи IgG1 или IgG2, описана в приведенных ниже примерах. В конкретных воплощениях вариабельные области антител лигированы с константной областью, иной, чем константная область для изотипа IgG1,IgG2, IgG3 или IgG4. В некоторых воплощениях антитела по изобретению клонированы для экспрессии в клетках млекопитающих. В некоторых воплощениях консервативные модификации тяжелых цепей и легких цепей антител кNGF (и соответствующие модификации кодирующих нуклеотидов) будут давать антитела к NGF, обладающие функциональными и химическими характеристиками, подобными характеристикам антител кNGF, раскрытых здесь. Напротив, существенные модификации в функциональных и/или химических характеристиках антител к NGF можно осуществить путем отбора замен в аминокислотной последовательности тяжелых и легких цепей, которые значительно отличаются по их воздействию на сохранение(а) структуры молекулярного каркаса в области замены, например, в виде листовой или спиральной конформации, (б) изменение гидрофобности молекулы в сайте-мишени или (в) объем боковой цепи. Например, "консервативная аминокислотная замена" может включать замену нативного аминокислотного остатка ненативным остатком, которая оказывает небольшое или не оказывает воздействие на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении. Кроме того, любой нативный остаток в полипептиде может быть также заменен аланином, как описано ранее для "аланинового сканирующего мутагенеза". Желаемые аминокислотные замены (либо консервативные, либо неконсервативные) могут быть определены специалистом в данной области в тот момент, когда такие замены желательны. В некоторых воплощениях аминокислотные замены можно использовать для идентификации важных остатков антитела к NGF, либо для повышения или снижения аффинитета антител к NGF, описанных здесь. Как хорошо известно, минорные изменения аминокислотной последовательности, такие как делеция, добавление или замена одной, немногих или даже нескольких аминокислот, может привести к аллельной форме исходного белка, которая обладает, по существу, идентичными свойствами. Следовательно, в дополнение к антителам, конкретно описанным здесь, можно легко разрабатывать и производить другие "по существу гомологичные" антитела, используя различные методики рекомбинантных ДНК, хорошо известные специалистам в данной области. В целом модификации генов можно легко осуществить с помощью ряда хорошо известных методик, таких как сайт-направленный мутагенез. Поэтому в настоящем изобретении рассмотрены "варианты" или "мутанты" человеческих антител к NGF, обладающие характеристиками, по существу, подобными характеристикам человеческих антител к NGF, раскрытым здесь (см., например, WO 00/56772, которая полностью включена сюда путем ссылки). Таким образом, под термином "вариант" или "мутант" в отношении человеческого антитела к NGF подразумевают любую связывающую молекулу (молекулу X), (i) в которой гипервариабельные области CDR1,CDR2 и CDR3 тяжелой цепи или гипервариабельные области CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи, взятые в целом, по меньшей мере на 80% гомологичны, предпочтительно по меньшей мере на 90% гомологичны,более предпочтительно по меньшей мере на 95% гомологичны гипервариабельным областям, показан- 24013614 ным в SEQ ID NO: 22, 18 и 14 или SEQ ID NO: 24, 20 и 16 соответственно, и (ii) где вариант или мутант способен к ингибированию активности человеческого NGF в той же степени, что и сравнительное человеческое антитело к NGF, имеющего каркасные участки, идентичные каркасным участкам молекулы X. Обычно вариант человеческого антитела к NGF будет иметь CDR легкой и/или тяжелой цепи, при рассмотрении вместе имеющие по меньшей мере примерно 80% идентичности аминокислотной последовательности, предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью,показанной в SEQ ID NO: 14, 18 и 22 и/или SEQ ID NO: 16, 20 и 24 соответственно. Более предпочтительно вариант человеческого антитела к NGF будет иметь вариабельные области легкой цепи, при рассмотрении вместе имеющие по меньшей мере примерно 80% идентичности аминокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 81% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 82% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 83% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 84% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности,еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 86% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 88% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 89% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQID NO: 12, 80, 82, 84, 86, 88, 89, 90 или 91, и/или вариабельную область тяжелой цепи, взятую в целом,которая имеет по меньшей мере примерно 70% идентичности аминокислотной последовательности,предпочтительно по меньшей мере примерно 75% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 81% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 82% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 83% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 84% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 86% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 88% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 89% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности последовательности,еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10, 81, 83, 85 или 87. Термин "вариант" применительно к полинуклеотиду следует относить к молекуле нуклеиновой ки- 25013614 слоты, имеющей по меньшей мере примерно 75% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности с полинуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению. Обычно полинуклеотидный вариант будет иметь по меньшей мере примерно 75% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, более предпочтительно по меньшей мере примерно 80% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 81% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 82% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 83% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 84% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 85% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 86% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 87% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 89% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 91% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 92% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 93% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 94% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 96% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 97% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 98% идентичности нуклеиновокислотной последовательности, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% идентичности нуклеиново-кислотной последовательности с новой нуклеиново-кислотной последовательностью,раскрытой в данной заявке. В конкретных воплощениях изобретения предложены антитела, которые имеют процент идентичности с антителом по изобретению, или антитело, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи, CDR1, CDR2 или CDR3 область, которые имеют процент идентичности с вариабельной областью тяжелой цепи, вариабельной областью легкой цепи, CDR1, CDR2 илиCDR3 областью по изобретению, как показано здесь в примере 10 и на фиг. 5-10. В некоторых воплощениях изобретения предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервов и содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70 или 75% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 10, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 80, 85 или 95% гомологичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 81, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 80, 85 или 95% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 83, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75, 80 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 85, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70,75 или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 87, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 56% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 79, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина. В некоторых воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70, 75, 80 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 12, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 85 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 80, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 74, 90 или 94% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 88, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 80, 85 или 87% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 89, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 85, 90 или 94% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:- 26013614 90, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 85, 90, 95 или 99% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 91, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 80, 90, 95 или 96% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 82, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 85, 90, 95, 98 или 99% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 84, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; или по меньшей мере на 70, 85,90, 95, 98 или 99% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 86, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина. В некоторых других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, который специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит CDR1 тяжелой цепи человека, где CDR1 тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40 или 60% идентична аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 98,SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 110 или SEQ ID NO: 22, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина. В других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит CDR2 тяжелой цепи человека, где CDR2 тяжелой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70, 82 или 94% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 99,либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 76% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ IDNO: 106, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 59% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQID NO: 18, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQID NO: 117, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 70, 75 или 80% идентичной аминокислотной последовательности,показанной в SEQ ID NO: 111, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина. Еще в других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит CDR1 легкой цепи человека, гдеCDR1 легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70 или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 101, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70, 75, 80 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 95, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75, 80 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 119, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75, 80 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 122, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 125, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 75, 80 или 90% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 24, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 107, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 70 или 80% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 113, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина. В дополнительных воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело,которое специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит CDR2 легкой цепи человека, гдеCDR2 легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 102, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ IDNO: 96, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQID NO: 120, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной вSEQ ID NO: 123, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, пока- 27013614 занной в SEQ ID NO: 126, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 129, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 20, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 108, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 133, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 114, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина. В других воплощениях в изобретении предложено изолированное человеческое антитело, которое специфично связывает фактор роста нервной ткани и содержит CDR3 легкой цепи человека, где CDR3 легкой цепи представляет собой аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 103, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ IDNO: 97, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной вSEQ ID NO: 121, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 127, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 130, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 16, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 70 или 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 109, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина; по меньшей мере на 78% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 134, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина или по меньшей мере на 85% идентичной аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO: 115, либо ее антигенсвязывающему или иммунологически функциональному фрагменту иммуноглобулина. Последовательности вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи антитела 4D4 показаны вSEQ ID NO: 10 и 12 соответственно. Однако многие из потенциальных CDR-контактных остатков могут быть заменены другими аминокислотами и все же дают возможность антителу сохранять существенный аффинитет к антигену. Подобным образом многие из структурных остатков, не находящихся в контакте сCDR в тяжелой и легкой цепях, могут приобретать замены аминокислот из соответствующих положений из других человеческих антител согласованными аминокислотами человека или из других мышиных антител без значительной потери аффинитета или неиммуногенности человеческого антитела. Можно использовать разные альтернативные аминокислоты для получения вариантов описанных антител к NGF и их фрагментов, имеющих варьирующие комбинации аффинитета, специфичности, неиммуногенности,простоты производства и других желаемых свойств. В альтернативных воплощениях изобретения антитела по изобретению можно экспрессировать в клеточных линиях, иных, чем клеточные линии гибридомы. В этих воплощениях последовательности,кодирующие конкретные антитела, можно использовать для трансформации подходящей клетки-хозяина млекопитающего. В соответствии с этими воплощениями трансформация может быть достигнута любым известным способом введения полинуклеотидов в клетку-хозяина, включая, например, упаковку полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и трансдукцию клетки-хозяина этим вирусом (или вектором), либо с помощью методик трансфекции, известных в данной области, примеры которых приведены в патентах США 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455 (все источники включены сюда путем ссылки для любой цели). Как правило, используемая методика трансформации может зависеть от хозяина,подлежащего трансформации. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области и включают, но не ограничены ими, трансфекцию, опосредованную декстраном, кальцийфосфатную преципитацию, трансфекцию, опосредованную полибреном,слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра. Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи, вариабельной области тяжелой цепи, константной области легкой цепи или вариабельной области легкой цепи антитела NGF по изобретению, встраивают в подходящий экспрессионный вектор, используя стандартные методики лигирования. В предпочтительном воплощении констант- 28013614 ную область тяжелой цепи или легкой цепи антитела к NGF присоединяют к С-концу соответствующей вариабельной области и лигируют в экспрессионный вектор. Этот вектор обычно выбран как функциональный в конкретной используемой клетке-хозяине (то есть этот вектор является совместимым с аппаратом клетки-хозяина, так чтобы могла проходить амплификация гена и/или экспрессия гена). В качестве обзора экспрессионных векторов см. МЕТН. ENZ. 185 (Goeddel, ed.), 1990, Academic Press. Обычно экспрессионные векторы, используемые в любой из клеток-хозяев, будут содержать последовательности для поддержания плазмид и для клонирования и экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности, все вместе называемые "фланкирующими последовательностями", в некоторых воплощениях будут обычно включать одну или более чем одну из следующих нуклеотидных последовательностей: промотор, одну или более чем одну энхансерную последовательность, точку начала репликации, последовательность терминации транскрипции, полноразмерную интронную последовательность, содержащую донорный и акцепторный сайт сплайсинга, последовательность, кодирующую лидерную последовательность для секреции полипептида, сайт связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, полилинкерную область для встраивания нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, подлежащий экспрессии, и селективный маркерный элемент. Каждая из этих последовательностей обсуждается ниже. Возможно, вектор может содержать последовательность, кодирующую "выступ", то есть олигонуклеотидную молекулу, локализованную при 5' или 3' конце кодирующей последовательности полипептида антитела к NGF; эта олигонуклеотидная последовательность кодирует поли-His (такой как гекса-His) или другой "выступ", такой как FLAG, НА (гемагглютинин вируса гриппа) или myc, для которых существуют имеющиеся в продаже антитела. Этот выступ обычно сливается с полипептидом при экспрессии этого полипептида и может служить в качестве средства для аффинной очистки или обнаружения антителаNGF из клетки-хозяина. Аффинную очистку можно проводить, например, с помощью колоночной хроматографии, используя антитела против выступа в качестве матрицы аффинитета. Возможно, этот выступ можно впоследствии удалить из очищенного полипептида антитела к NGF различными способами,такими как использование некоторых пептидаз для расщепления. Фланкирующие последовательности могут быть гомологичными (то есть из того же вида и/или штамма, что и клетка-хозяин), гетерологичными (то есть из видов, иных, чем вид или штамм клеткихозяина), гибридными (то есть комбинация фланкирующих последовательностей более чем из одного источника), синтетическими или нативными. Как таковой, источник фланкирующей последовательности может представлять собой любой прокариотический или эукариотический организм, любой организм позвоночного или беспозвоночного или любого растения при условии, что фланкирующая последовательность является функциональной в этом организме, и может активироваться аппаратом клеткихозяина. Фланкирующие последовательности, применимые в векторах по данному изобретению, могут быть получены любым из нескольких способов, хорошо известных в данной области. Обычно фланкирующие последовательности, применимые здесь, будут представлять собой идентифицированные ранее путем картирования и/или ферментативного гидролиза эндонуклеазами рестрикции и, таким образом, могут быть выделены из подходящей ткани-источника с использованием соответствующих эндонуклеаз рестрикции. В некоторых случаях полноразмерная нуклеотидная последовательность фланкирующей последовательности может быть известна. Поэтому фланкирующую последовательность можно синтезировать, используя способы, описанные здесь для синтеза или клонирования нуклеиновых кислот. Независимо от того, известна ли вся фланкирующая последовательность или только ее участок, она может быть получена с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или путем скрининга геномной библиотеки подходящим зондом, таким как олигонуклеотид и/или фрагмент фланкирующей последовательности из того же или из другого вида. Где фланкирующая последовательность неизвестна,фрагмент ДНК, содержащий фланкирующую последовательность, можно выделить из большего участка ДНК, который может содержать, например, кодирующую последовательность или даже другой ген или гены. Выделение можно осуществить с помощью гидролиза эндонуклеазами рестрикции с получением верного фрагмента ДНК с последующим выделением, используя очистку из агарозного геля, хроматографию на колонке Qiagen (Chatsworth, CA) или другие способы, известные специалистам в данной области. Выбор подходящих ферментов для осуществления этой цели будет легко очевиден специалисту в данной области. Точка начала репликации обычно представляет собой часть тех прокариотических векторов, которые имеются в продаже, и точка начала репликации способствует амплификации вектора в клеткехозяине. Если выбранный вектор не содержит сайт точки начала репликации, его можно синтезировать химическим путем на основании известной последовательности и лигировать в вектор. Например, точка начала репликации из плазмиды pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) является пригодной для большинства грамотрицательных бактерий, а различные точки начала репликации вирусного происхождения (например, SV40, вируса полиомы, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (VSV) или вирусов папилломы, таких как HPV или BPV) полезна для клонирования векторов в клетках млекопитающих. Как правило, компонент точки начала репликации не требуется для экспрессионных векторов млекопи- 29013614 тающих (например, точку начала репликации SV40 часто используют только потому, что она также содержит ранний промотор этого вируса). Последовательность терминации транскрипции обычно локализована 3' к концу кодирующей области полипептида и служит для терминации транскрипции. Обычно последовательность терминации транскрипции в прокариотических клетках представляет собой G-C богатый фрагмент, за которым следует последовательность поли-Т. Хотя эту последовательность легко клонируют из библиотеки или даже приобретают коммерческим путем в виде части вектора, ее также можно легко синтезировать, используя способы синтеза нуклеиновых кислот, такие как описаны здесь. Селективный маркерный ген кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина,растущей в селективной культуральной среде. Типичные селективные маркерные гены кодируют белки,которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или к другим токсинам, например к ампициллину,тетрациклину или канамицину для прокариотических клеток-хозяев; (б) комлементируют ауксотрофные дефициты клетки или (в) обеспечивают критические питательные вещества, недоступные из комплексной или определенной среды. Предпочтительными селективными маркерами являются ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к тетрациклину. Предпочтительно ген устойчивости к неомицину можно также использовать для селекции как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах. Другие селективные гены можно использовать для амплификации гена, который будет экспрессироваться. Амплификация представляет собой процесс, где гены, которые требуются для продуцирования белка, критичного для роста или выживания клетки, тандемно повторяются в хромосомах последовательных поколений рекомбинантных клеток. Примеры пригодных селективных маркеров для клеток млекопитающих включают гены дигидрофолатредуктазы (DHFR) и беспромоторные гены тимидинкиназ. Трансформанты клеток млекопитающих помещают в условия давления отбора, где трансформанты уникально адаптированы к выживанию только благодаря присутствию селективного гена в векторе. Давление отбора создают путем культивирования трансформированных клеток в условиях, в которых концентрацию селективного агента в среде постепенно повышают, что приводит в результате к амплификации как селективного гена, так и ДНК, которая кодирует другой ген, такой как антитело, связывающееся с полипептидом NGF. В результате с амплифицированной ДНК синтезируются повышенные количества полипептида, такого как антитело к NGF. Сайт связывания рибосомы обычно необходим для инициации трансляции мРНК и характеризуется последовательностью Шайна-Далгарно (прокариоты) или последовательностью Козака (эукариоты). Этот элемент обычно локализован 3' к промотору и 5 к кодирующей последовательности полипептида,подлежащего экспрессии. В некоторых случаях, например, где желательно гликозилирование в экспрессионной системе эукариотической клетки-хозяина, можно манипулировать с различными пре- или пропоследовательностями для улучшения гликозилирования или выхода. Например, можно изменить сайт расщепления пептидазы конкретного сигнального пептида или добавить пропоследовательности, которые могут также влиять на гликозилирование. Конечный белковый продукт может иметь в положении -1 (относительно первой аминокислоты зрелого белка) одну или более чем одну дополнительную аминокислоту, несущественную для экспрессии, которая может не быть полностью удалена. Например, конечный белковый продукт может иметь один или два аминокислотных остатка, находящихся в сайте расщепления пептидазы, присоединенных к аминоконцу. Альтернативно результатом использования некоторых сайтов ферментативного расщепления может быть слегка укороченная форма желаемого полипептида, если фермент режет в такой области внутри зрелого полипептида. Векторы экспрессии и клонирования по изобретению будут обычно содержать промотор, который распознается организмом-хозяином и оперативно сцеплен с молекулой, кодирующей антитело к NGF. Промоторы представляют собой нетранскрибируемые последовательности, локализованные вверх по течению (то есть 5') к стартовому кодону структурного гена (обычно в пределах примерно от 100 до 1000 п.о.), которые регулируют транскрипцию структурного гена. Промоторы общепринято группируют в один из двух классов: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы инициируют повышенные уровни транскрипции с ДНК под их контролем в ответ на некоторое изменение условий культивирования, такое как наличие или отсутствие питательного вещества или изменение температуры. Конститутивные промоторы, с другой стороны, однородно транскрибируют ген, с которым они оперативно сцеплены, то есть при небольшом или при отсутствии контроля над экспрессией гена. Известно большое число промоторов, распознаваемых рядом потенциальных клеток-хозяев. Подходящий промотор оперативно сшивают с ДНК, кодирующей тяжелую цепь или легкую цепь, составляющие антитело к NGF по изобретению, путем удаления промотора из источника ДНК путем гидролиза ферментом рестрикции и встраивания желаемой промоторной последовательности в этот вектор. Подходящие промоторы для использования в дрожжевых хозяевах хорошо известны в данной области. Дрожжевые энхансеры предпочтительно используют с дрожжевыми промоторами. Подходящие промоторы для использования с клетками-хозяевами млекопитающих хорошо известны и включают, но не ограничены ими, те, которые получены из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вируса fowlpox,- 30
МПК / Метки
МПК: C12N 15/68, G01N 33/53, A61P 35/00, A61K 39/395, C07K 16/22, C12N 5/10, A61P 25/00
Метки: роста, применения, фактору, способы, изолированное, ngf, нервов, антитело
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-13614-izolirovannoe-antitelo-k-faktoru-rosta-nervov-ngf-i-sposoby-ego-primeneniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Изолированное антитело к фактору роста нервов (ngf) и способы его применения</a>
Предыдущий патент: Способ слежения за продольной осью рельса при скоростной ультразвуковой дефектоскопии и устройство для его осуществления
Следующий патент: Рекомбинантный онколитический парамиксовирус и его применение
Случайный патент: Композитный материал, обладающий термопластичными свойствами, способ обработки материала и формованное изделие