Тест-система “кардиотест” для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина i в образце цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда

ТЕСТ-СИСТЕМА "КАРДИОТЕСТ" ДЛЯ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРДЕЧНОГО БЕЛКА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ, И ТРОПОНИНА I В ОБРАЗЦЕ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ИНФАРКТА МИОКАРДА Изобретение относится к устройствам для иммунохроматографического одновременного определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и белка тропонин I в цельной венозной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда и может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и здравоохранении. Техническим результатом изобретения является создание простой и надежной "прикроватной" комбинированной иммунохроматографической тестсистемы для одновременного определения сБСЖК и тропонина I. Тест-система содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов,внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови,пористая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем на подушке с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (16A11), на пористой мембране, поперек последней, сформированы конкурирующая полоса, содержащая слой адсорбированных первых моноклональных мышиных антител (F9), специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела(F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса, содержащая адсорбированные моноклональные антитела к тропонину I (19C7), и контрольная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ НАУЧНОПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ 013943 Изобретение относится к устройствам для иммунохроматографического одновременного выявления сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и белка тропонин I в цельной венозной крови, для экспресс-диагностики инфаркта миокарда и может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и здравоохранении. Сердечный БСЖК - кардиоспецифический цитоплазматический низкомолекулярный белок (15 кДа), в большом количестве содержащийся в кардиомиоцитах, осуществляет связывание и транспортировку жирных кислот внутри клетки и при некрозе миокарда быстро попадает в кровоток. Достоинством сБСЖК является высокая кардиоспецифичность вследствие максимальной концентрации сБСЖК именно в ткани миокарда. Сердечный БСЖК является ранним маркером некроза миокарда, он обладает сходной с миоглобином кинетикой, однако имеет большую специфичность. Диагностически значимое повышение уровня сБСЖК наблюдается через 1 ч от начала болевого синдрома. Уровень сБСЖК в крови достигает максимальных значений через 6 ч после повреждения миокарда и возвращается к нормальному значению через 16-24 ч. Количество сБСЖК в крови увеличивается пропорционально обширности и глубине зоны инфаркта и достигает уровня более 200-300 нг/мл при верхней границе нормы 15 нг/мл. Таким образом, кардиомаркер сБСЖК является наиболее ранним из всех маркеров некроза миокарда, что особенно актуально, учитывая стремительность событий, развивающихся при ОКС, и высокий уровень неблагоприятных исходов именно первые его сутки. Тестсистема по определению сБСЖК оказывает существенную помощь в диагностике ОКС, особенно в ситуациях с нетипичной клинической картиной и отсутствием значимых диагностических изменений электрокардиограммы. Кроме того, повышение уровня сБСЖК является предиктором неблагоприятных событий у больных с ОКС (инфаркт миокарда и сердечно-сосудистая смерть) в течение 1 года. Определение содержания сБСЖК в крови больных с подозрением на ОКС с целью раннего выявления некроза миокарда рекомендовано решением ежегодного конгресса Европейского кардиологического общества в 2000 г. Тропонин I - белок, входящий в тропониновый комплекс, различие изоформ которого в миокарде и скелетных мышцах составляет около 90%. Благодаря этому сердечный тропонин I (сТн-I) является высокочувствительным и высокоспецифичным маркером повреждения миокарда. В норме тропонин I в кровотоке не обнаруживаются. При ишемическом повреждении миокарда тропонины поступают в периферический кровоток, где могут определяться через 6-8 ч. Максимальная концентрация отмечается через 14-28 ч и сохраняется в течение 3-7 суток, образуя длительное "диагностическое окно". Процесс освобождения тропонина I имеет однофазный характер, что обусловлено большим содержанием его цитоплазменной фракции. Если растворенный в цитозоле сБСЖК относительно быстро вымывается из зоны некроза, деструкция сократительного аппарата кардиомиоцитов более продолжительна по времени, поэтому увеличение уровня тропонинов определяется до 3-7 дней после начала ИМ. Этот длительный период выхода тропонинов в кровь увеличивает вероятность того, что положительный результат его определения был правильным, особенно в подострой фазе ИМ. Специфичность и чувствительность методов определения тропонинов в крови при ИМ составляет 92-95%. Известно устройство для хроматографического анализа для обнаружения аналита в образце (патент РФ 2124729, МПК G01N 33/53, опубл. 10.01.1999 г.). Устройство включает в себя: (1) по меньшей мере два строго плоских противоблока, один из которых содержит на своей поверхности хроматографическую среду; и (2) средство для установки противоблоков друг против друга и приложения туда давления,достаточного для переноса жидкости с одного противоблока на другой в направлении строго перпендикулярном к противоблоку с целью нанесения образца на хроматографическую среду для обнаружения и/или определения вслед за тем аналита. Устройство может также включать: (1) по меньшей мере три строго плоских противоблока, отличающихся тем, что один из них содержит на своей поверхности хроматографическую среду, имеющую первый и второй концы; (2) средство для установки противоблоков друг против друга по меньшей мере в двух различных комбинациях и приложения туда давления, достаточного для переноса жидкости с одного противоблока к другому в направлении строго перпендикулярном к противоблокам так, что образец прикладывается к хроматографической среде и перетекает через нее от первого конца ко второму концу для обнаружения и/или определения аналита на хроматографической среде; и (3) по меньшей мере один аппликатор и один абсорбер, локализованные на одном из противоблоков и расположенные таким образом, что когда противоблок с аппликатором и абсорбером на нем устанавливается напротив противоблока, содержащего хроматографическую среду, на последнюю наносится жидкость, которая перетекает через нее от второго конца к первому, вследствие чего направление движения потока через хроматографическую среду изменяется на обратное с целью обнаружения и/или определения аналита, осуществляемого после реверса потока через хроматографическую среду. Однако данное устройство имеет достаточно сложную конструкцию, включает в себя источник повышенного давления для обеспечения прохождения жидкого образца вдоль пористых его элементов, а также не содержит компонентов для обеспечения обнаружения сБСЖК и тропонина I в образцах крови. Известна тест-система для иммунохроматографического определения сердечного тропонина I для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (патент Китая 101059519, МПК G01N 33/558, опубл. 24.10.2007 г.), содержащая иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для про-1 013943 смотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом наночастиц коллоидного золота (размер 15-25 нм) с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному тропонину I, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши. Изобретение имеет простую подготовку, действие и высокую чувствительность (1,0 нг/мл) с устойчивым результатом. Повышение концентрации тропонина I при инфаркте миокарда отмечается через 4-6 ч. Кинетика его выхода в кровь может представлять двухфазную кривую с начальным пиком через 15-20 ч и менее высоким вторым пиком через 60-80 ч после развития инфаркта миокарда. Однако данная тест-система не позволяет выявлять ранний маркер сБСЖК, уровень которого значительно превышает (до 15 нг/мл и выше) по сравнению со здоровыми людьми в первые 1-6 ч после инфаркта миокарда. Уровень сБСЖК в крови достигает максимальных значений через 6 ч после повреждения миокарда и возвращается к нормальному значению через 16-24 ч. Известна тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (патент Китая 1704757, МПКG01N 33/558, опубл. 07.12.2005 г.), содержащая иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши. Кардиомаркер сБСЖК присутствует в крови здоровых людей. Индивидуальная норма содержания белка варьирует от 2 до 6 нг/мл. Диагностически значение (уровень патологических значений) сБСЖК варьирует от 10 до 15 нг/мл. В результате таких особенностей белка возникает неспецифическое выявление маркера. В этой связи предлагаемый в данном аналоге иммунохроматографический тест позволяет выявлять ранний маркер сБСЖК в количестве 5 нг/мл, т.е. обладает слишком высокой чувствительностью, что приводит к появлению большого количества ложноположительных результатов и, как следствие, к низкой специфичности и низкой точности теста, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста. Кроме того, данная тест-система не позволяет выявлять поздний маркер тропонин I, что сужает ее функциональные возможности. Известна тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (патент РФ на полезную модель 87262, МПК G01N 33/558, опубл. 27.09.2009 г.), содержащая иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, на пористой мембране,поперек последней и параллельно друг другу сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела, и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши. На пористой мембране, поперек последней,сформирована конкурирующая полоса, расположенная вдоль края подушки для нанесения конъюгата и содержащая слой адсорбированных первых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты. Данная тест-система лишена недостатков предыдущего аналога. Однако тест-система не позволяет выявлять поздний маркер тропонин I, что сужает ее функциональные возможности. Кроме того, на момент подачи настоящей заявки на евразийский патент в соответствии с правилом 3 Патентной инструкции к ЕАПК заявитель имеет льготный срок (6 месяцев), в течение которого информация по патенту РФ на ПМ 87262 не порочит новизну заявляемого изобретения и не включается в уровень техники. Наиболее близким аналогом (прототипом) является комбинированный тест-микрочип для диагностики восьми сердечно-сосудистых заболеваний (патент Китая 2783324, МПК G01N 33/543, опубл. 24.05.2006 г.) и содержит антитела типа anti-crp, anti-Myoglobin, anti-cTnI (сердечный troponin I), anticTnT (сердечный troponin T), anti-nt-probnp, anti-ck-mb (creatine kinase isozymes-MB), anti-h-fabp (сердеч-2 013943 ный белок, связывающий жирные кислоты), anti-GPBB (glycogen phosphorylase isoenzyme BB). Однако такой тест является дорогостоящим, требует специального оборудования для прочтения результатов, что не обеспечивает требованиям "прикроватной" экспресс-диагностики. Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание простой и надежной "прикроватной" комбинированной иммунохроматографической тест-системы для одновременного определения сБСЖК и тропонина I. Указанный технический результат достигается тем, что в тест-системе для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда согласно изобретению, она содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем на подушке с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (16A11), на пористой мембране, поперек последней, сформированы конкурирующая полоса, содержащая слой адсорбированных первых моноклональных мышиных антител (F9), специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса, содержащая адсорбированные моноклональные антитела к тропонину I (19C7), и контрольная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). Полосы на подушке с конъюгатами и на пористой мембране сформированы путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги. Полосы на подушке с конъюгатами и на пористой мембране сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга. Конкурирующая полоса на пористой мембране расположена вдоль края фильтрационной подушки для сепарации исследуемого образца крови. Подушка для нанесения конъюгата выполнена из целлюлозы, или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна длиной 15 мм с размером пор 20-25 мкм, толщиной 350 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см 2. Фильтрационная подушка выполнена из пористого материала полисульфона длиной 20 мм, толщиной 600-650 мкм и размером пор 55-57 мкл/см 2. Пористая мембрана выполнена из нитроцеллюлозы или полиэфирсульфона длиной 20 мм, толщиной 125-155 мкм, абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см 2, скоростью течения 90-110 с/40 мм. Абсорбционная подушка выполнена из пористого материала хлопкового пуха или стеклоцеллюлозного волокна длиной 15 мм и толщиной 400-450 мкм. Подложка для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала длиной 60 мм, толщиной 230-270 мкм. Указанные технические характеристики элементов тестсистемы позволяют надежно функционировать, снижать количество ложноположительных результатов путем повышения специфичности и точности теста и одновременно определять сБСЖК и тропонина I. На фиг. 1 приведена схема внешнего вида тест-системы, выполненной в виде иммунологической планшеты, а на фиг. 2 - схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете. Тест-система "Кардиотест" для проведения иммунохроматографического анализа содержит иммунологическую планшету 1 с приемным овальным окном 2 для внесения образца цельной крови и прямоугольным окном 3 для просмотра результатов. Внутри иммунологической планшеты 1 размещена подложка 4 для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка 5 с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка 6 для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана 7 для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка 8 для создания тока жидкости. На подушке 5 с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса 9 конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами (F9), специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса 10 конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (16A11). На пористой мембране 7, поперек последней,сформированы конкурирующая полоса 11, содержащая слой адсорбированных первых моноклональных мышиных антител (F9), специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса 12, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, вторая тестовая полоса 13, содержащая адсорбированные моноклональные антитела к тропонину I (19C7), и контрольная полоса 14, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM).-3 013943 Полосы 9 и 10 на подушке 5 с конъюгатами и полосы 11, 12, 13 и 14 на пористой мембране 7 сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги. Конкурирующая полоса 11 на пористой мембране 7 расположена вдоль края фильтрационной подушки 6 для сепарации исследуемого образца крови. Участок 15 для нанесения образца цельной крови на подложке 5 расположен перед полосами 9 и 10 конъюгатов частиц коллоидного золота с моноклональными антителами. Причем овальное окно 2 планшеты 1 расположено над участком 15 на подложке 5. Конструкция иммунологической планшеты 1 обеспечивает контакт подушек 5 и 6, пористой мембраны 7 и абсорбционной подушки 8 друг с другом и позволяет образцу крови свободно проходить все пористые материалы за счет действия капиллярных сил. В табл. 1 приведена характеристика материалов, из которых изготовлены элементы тест-системы. Таблица 1 Характеристика материалов тест-системы Ниже приведена характеристика антител, используемых в тест-системе для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты и тропонина I в цельной крови. 1. Мышиные моноклональные антитела, специфичные к белку сБСЖК. 1.1. Моноклон F9 специфичен к целой молекуле сердечного FABP, тип IgG1 (применяется в полосе 9 с конъюгатом и конкурирующей полосе 11). 1.2. Моноклон F10 специфичен к целой молекуле сердечного FABP, тип IgG1 (наносится на первую тестовую полосу 12). 2. Мышиные моноклональные антитела, специфичные к белку тропонину I. 2.1. Моноклон 1 (16 А 11) cTnI, тип IgG1, эпитопы 87-91 а.а.r., получен иммунизацией молекулой тропонина I, специфичен к части молекулы с устойчивой антигенной детерминантой, расположенной в центральной части молекулы, защищенной от протеолитической деградации (применяется в полосе 10 с конъюгатом). 2.2. Моноклон 2 (19 С 7) cTnI , тип IgG2b, эпитопы 41-49 a.a.r., получен иммунизацией молекулой тропонина I, специфичен к центральной части молекулы с устойчивой антигенной детерминантой, протестированный от протеолитической деградации антигена (наносится на тестовую полосу 13). 3. Моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). Аффинно-очищенная фракция иммуноглобулинов кроличьей антисыворотки против Fc-фрагментов иммуноглобулинов мыши. Применяется для связывания конъюгатов мышиных моноклональных антител на контрольной полосе 14. Заявляемая тест-система "КардиоБСЖК" работает следующим образом. Кровь в объеме 100 мкл (5-6 капель) наносится через приемное окно 2 на подложку 5 с конъюгатами. Образец крови, пройдя через подложку 5, под действием капиллярных сил пропитывает полосы 9 и 10, где присутствующие в крови белки-маркеры (сБСЖК и/или тропонин I) вступают в реакцию с соответствующими белку моноклональными антителами, меченными коллоидным золотом, образуя окрашенный иммунный комплекс антиген-антитело. Далее иммунный комплекс впитывается фильтрационной подушкой 6, где происходит сепарация крови (отделение эритрацитарной массы). При определении-4 013943 тропонина I требуется высокая чувствительность тест-системы - 1 нг/мл и выявление как цельной молекулы, так и различных ее фрагментов. Предельная способность маркера коллоидного золота выявлять вещество колеблется от 0,5 до 1 нг/мл выявляемого агента. В предлагаемой конструкции по сравнению с известными аналогами повышение чувствительности теста для определения тропонина I и сБСЖК обеспечивается за счет увеличения времени контакта антител и антигена для образования комплекса антиген + антитело меченое, который формируется сразу на конъюгатной подушке 5, и, тем самым, увеличивается время этого контакта и снижается вероятность гидролиза лабильных молекул белка тропонина I. Проходя через конъюгатную подушку 5 и фильтрационную подушку 6, связанный комплекс в некоторой степени концентрируется, не распадается и не оседает на них вместе с эритроцитами, свободно проходит с потоком плазмы на нитроцеллюлозную мембрану 7. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс(состоящий из одного иммунного комплекса или двух комплексов) движется под действием капиллярных сил вдоль пористой мембраны 7, пересекает конкурирующую полосу 11 и взаимодействует с нанесенными на ней адсорбированными моноклональными мышиными антителами F9, специфичными к сБСЖК. Функцией полосы 11 является снижение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл за счет конкурентного связывания сБСЖК с моноклональными антителами F9, иммобилизованными на этой полосе 11. Линия не окрашивается. Поскольку диагностически значимым считается повышение уровня сБСЖК в крови до 15 нг/мл, то уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности. Далее иммунный комплекс, перемещаясь под действием капиллярных сил, пересекает первую тестовую полосу 12 и взаимодействует с иммобилизованными на ней моноклональными мышиными антителами F10 к БСЖК. В результате при наличии сБСЖК в образце крови выше порогового значения первая тестовая полоса 12 окрашивается в пурпурный цвет. Если образец крови не содержит сБСЖК в концентрации выше пороговой, первая тестовая полоса 12 остается не окрашенной. Далее не связавшийся на первой тестовой полосе 12 комплекс движется далее вдоль пористой мембраны 7 до второй тестовой полосы 13 с нанесенными антителами 2 к тропонину I. Если в образце тропонин I содержится в концентрации 1,1 нг/мл и выше, то вторая тестовая полоса 13 окрашивается в пурпурный цвет (вторая окрашенная полоса). Если же тропонин I в пробе ниже порогового значения (ниже 1,1 нг/мл), то тестовая полоса 13 не окрашивается. Далее не связавшиеся конъюгаты доходят до контрольной полосы 14 и взаимодействуют с иммобилизованными кроличьими поликлональными антителами к иммуноглобулинам мыши. В результате контрольная полоса 14 также окрашивается в пурпурный цвет (третья окрашенная полоса). Контрольная полоса 14 является внутренним контролем теста и, если анализ проведен правильно, должна проявляться всегда, независимо от присутствия сБСЖК и тропонина I в образце крови. Результаты определяются визуально в течение 5-30 мин. При положительном результате тестирования сБСЖК и тропонина I появляются три окрашенные полосы - две тестовых и контрольная. Если в образце присутствует только ранний маркер сБСЖК, то окрашивается первая линия. Это происходит во временном промежутке от 1 до 24 ч от начала заболевания. Если в образце присутствует более поздний маркер тропонин I, то окрашивается вторая тестовая линия. Временной промежуток от 6 до 48 ч от начала болевого синдрома. Если образец взят в промежутке от 6 до 24 ч от начала заболевания, то проявляются все три полосы. Интенсивность цвета контрольной и тестовых полос может быть различной. При отрицательном результате появляется только одна полоса - контрольная. Если контрольная полоса не проявилась, результаты теста считаются недействительными. Данные исследований, подтверждающие эффективность заявляемой тест-системы. Являясь эффективным средством диагностирования, экспресс-тесты позволяют визуально в течение нескольких минут определить и оценить содержание антигенов. Качество работы теста и, соответственно, показатели чувствительности и специфичности зависят от качества используемых в тесте моноклональных антител и индивидуальных особенностей исследуемого маркера. Как отмечалось выше, кардиомаркер сБСЖК присутствует в крови здоровых людей. Индивидуальная норма содержания белка варьирует от 5 до 15 нг/мл. Диагностически значение (уровень патологических значений) сБСЖК и варьирует от 10 до 20 нг/мл. В результате таких особенностей белка возникает неспецифическое выявление маркера. При использовании теста для экспресс-диагностики высокая чувствительность не всегда необходима, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста. Конкурирующая полоса 11 обеспечивает снижение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл за счет конкурентного связывания БСЖК с моноклональными антителами F9, иммобилизованными на этой полосе 11. Поскольку диагностически значимым считается повышение уровня БСЖК в крови до 15 нг/мл, то уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности. Действительно,применение конкурирующей полосы 11 позволяет значительно уменьшить количество ложноположительных результатов, при этом не увеличивая количество ложноотрицательных, и, таким образом, при сохранении прежнего уровня диагностической чувствительности была увеличена специфичность и, как следствие, точность теста. В табл. 2 приведены данные диагностических показателей заявляемой тестсистемы.-5 013943 Таблица 2 Данные диагностических показателей заявляемой тест-системы Диагностические показатели рассчитывались по формулам ЧувствительностьACC = (TP + TN)/N,где ТР - достоверно положительный результат,FN - достоверно отрицательный результат,FP - ложноположительный результат,FN - ложноотрицательный результат,N - количество всех пациентов. Комбинация в заявляемой тест-системе специфичного сБСЖК и тропонина I позволяет обеспечить надежный и быстрый диагноз и увеличить временной интервал диагностики до 48 ч. Комбинация этих маркеров позволяет избежать недостатки тестов, содержащих только один из указанных маркеров сБСЖК ранний маркер, и не позволяет определять некроз миокарда после первых суток заболевания, а использование позднего маркера тропонина I не позволяет диагностировать заболевание в первые часы ИМ. При наличии почечной недостаточности у пациента позволит избежать неспецифических (ложноположительных) реакций. Применение теста позволит врачу при отсутствии у пациента четко выраженной клинической картины инфаркта миокарда и отсутствии четких признаков в кардиограмме независимо от временного интервала от начала болевого синдрома принять решение о срочной госпитализации больного. По тем же причинам необходимо иметь комбинированные тесты для диагностики инфаркта миокарда в фельшерско-акушерских пунктах. Положительный результат анализа позволит обоснованно вызвать скорую помощь или бригаду санавиации из ближайшего райцентра. Малые размеры и вес иммунохроматографических тестов позволяют использовать их участковым врачом или врачом общей практики при посещении больного на дому. Комбинированный тест "Кардиотест" с использованием сБСЖК можно применять при ранней диагностике инфаркта миокарда, оценке реперфузии и реинфаркта, инфаркта миокарда после электроимпульсной терапии в комбинации с тропонином I для выявления малого повреждения миокарда и позднего подтверждения инфаркта миокарда. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты, и тропонина I в цельной крови для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, характеризующаяся тем, что она содержит иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены подушка с конъюгатами для нанесения исследуемого образца крови, фильтрационная подушка для сепарации исследуемого образца крови, пористая мембрана для проведения иммунохроматографической реакции и абсорбционная подушка для создания тока жидкости, причем на подушке с конъюгатами и поперек последней сформированы первая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами (F9),специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, и вторая полоса конъюгата частиц коллоидного золота с мышиными моноклональными антителами, специфичными к тропонину I (16 А 11),на пористой мембране, поперек последней, сформированы конкурирующая полоса, содержащая слой адсорбированных первых моноклональных мышиных антител (F9), специфичных к сердечному белку,связывающему жирные кислоты, первая тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела (F10), специфичные к сердечному белку, связывающему жирные кисло-6 013943 ты, вторая тестовая полоса, содержащая адсорбированные моноклональные антитела к тропонину I(19C7), и контрольная полоса, содержащая адсорбированные моноспецифичные поликлональные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши (RAM). 2. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что полосы на подушке с конъюгатами и на пористой мембране сформированы путем пропитки соответствующими реагентами с последующим удалением влаги. 3. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что полосы на подушке с конъюгатами и на пористой мембране сформированы параллельно и на расстоянии друг от друга. 4. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что конкурирующая полоса на пористой мембране расположена вдоль края фильтрационной подушки для сепарации исследуемого образца крови. 5. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что подушка для нанесения конъюгата выполнена из целлюлозы, или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна длиной 15 мм с размером пор 20-25 мкм, толщиной 350 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см 2. 6. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что фильтрационная подушка выполнена из пористого материала полисульфона длиной 20 мм, толщиной 600-650 мкм и размером пор 55-57 мкл/см 2. 7. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что пористая мембрана выполнена из нитроцеллюлозы или полиэфирсульфона длиной 20 мм, толщиной 125-155 мкм, абсорбционной емкостью не менее 30 мг/см 2, скоростью течения 90-110 с/40 мм. 8. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что абсорбционная подушка выполнена из пористого материала хлопкового пуха или стеклоцеллюлозного волокна длиной 15 мм и толщиной 400-450 мкм. 9. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что подложка для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала длиной 60 мм, толщиной 230-270 мкм.