Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний

013752 Предпосылки создания изобретения Патология головного мозга, ассоциированная с -синуклеином (альфа-SN), является характерной чертой некоторых нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (PD, от англ. Parkinson's Disease), деменцию с тельцами Леви (DLB, Dementia with Lewy Bodies), вариант болезни Альцгеймера с образованием телец Леви (LVBAD, от англ. Lewy Body Variant of Alzheimer's Disease), множественную системную атрофию (MSA, от англ. Multiply Systems Atrophy) и нейродегенерацию с отложением железа в головном мозге типа-1 (NBLA-1, от англ. Neurodegeneration with Brain IronAccumulation Type-1). Общей чертой всех указанных заболеваний, обозначаемых термином синуклеинопатии, является образование белковых нерастворимых включений в нейронах и клетках глии, которые состоят главным образом из альфа-SN. Тельца Леви и нейриты Леви представляют собой интранейрональные включения, сформированные главным образом из альфа-SN. Тельца Леви и нейриты Леви являются нейропатологическим маркером болезни Паркинсона (PD). PD и другие синуклеинопатические заболевания объединены общим термином "заболевания с тельцами Леви" (LBD, от англ. Lewy Body Disease). LBD характеризуются дегенерацией дофаминергической системы, моторными нарушениями, когнитивными расстройствами и формированием телец Леви (LBs) (McKeith et al., Clinical and pathological diagnosis of dementia with Lewy bodiesLBD являются диффузные заболевания с тельцами Леви (DLBD, от англ. Diffuse Lewy Body Disease),вариант болезни Альцгеймера с образованием телец Леви (LVBAD), сочетание болезни Паркинсона (PD) и болезни Альцгеймера (AD) и множественная системная атрофия. Деменция с тельцами Леви (DLB) термин, используемый для нивелирования различий в терминологии LBD. Заболевания, сопровождающиеся образованием LBs, часто являются причиной двигательных нарушений и когнитивных расстройств у пожилых людей (Galasko et al., Clinical-neuropathological correlationsin Alzheimer's disease and related dimensions. Arch. Neurol. (1994), 51:888-95). Несмотря на то что частота возникновения этих заболеваний увеличивается, что представляет серьезную проблему для общественного здоровья, к настоящему моменту данные заболевания являются инкурабельными и предотвратить их развитие невозможно, поэтому существует необходимость в изучении причин и патогенеза PD, что позволит разработать новые способы лечения (Tanner et al., Epidemiology of Parkinson's disease andakinetic syndromes. Curr. Opin. Neurol. (2000) 13:427-30). Причины PD являются спорными, многие факторы предположительно играют роль в развитии данного заболевания, включая различные нейротоксические факторы и генетическую предрасположенность. В последние годы появилась новая надежда в понимании патогенеза PD. В частности, некоторые исследования показали, что центральную роль в патогенезе PD играет синаптический белок альфа-SN,поскольку (1) именно этот белок откладывается в LBs (Spillantini et al., Nature (1997), 388:839-40; Takedaet al., AM. J. Pathol. (1998), 152:367-72; Wakabayashi et al., Neurosci. Lett. (1997), 239:45-8); (2) мутации в гене альфа-SN ассоциированы с редкими семейными формами паркинсонизма (Kruger et al., Nature Gen.(1998), 18:106-8; Polymeropoulos M.H., et al., Science (1997) 276:2045-7) и (3) наблюдается гиперэкспрессия указанного белка у трансгенных мышей (Masliah et al., Science (2000), 287:1265-9), а у мух видаDrosophila (Feany et al., Nature (2000), 404:394-8) удается воспроизвести некоторые патологические аспекты PD. Таким образом, тот факт, что аккумуляция альфа-SN в головном мозге ассоциирована с одинаковыми морфологическими и неврологическими изменениями у различных видов животных, таких как люди, мыши и мухи, позволяет сделать предположение о том, что именно эта молекула лежит в основе патогенеза PD. Фрагмент альфа-SN, первоначально считавшийся составляющим элементом AD амилоидных бляшек, обозначался термином неамилоидный-бета (не-А) компонент AD амилоида (NAC, от англ.Pathol. (1996), 148:201-10; Ueda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993), 90:11282-6). Несмотря на то что функция NAC до настоящего времени не установлена, он может играть важную роль в событиях, происходящих на уровне синапса, таких как нейрональная пластичность во время развития, а также формирование и дегенерация нервных окончаний в патологических условиях при LBD, AD и других заболеваниях (Hasimoto et al., Alpha-Synuclein in Lewy body disease and Alzheimer's disease, Brain Pathol. (1999),9:707-20; Masliah et al. (2000).AD, PD и деменция с тельцами Леви (DLB) являются наиболее часто встречающимися нейродегенеративными заболеваниями у пожилых людей. Несмотря на то что распространенность указанных заболеваний увеличивается, что представляет собой серьезную проблему современного здравоохранения, к настоящему времени данные заболевания являются инкурабельными и не подлежат профилактике. Последние эпидемиологические исследования показали, что существует стойкая клиническая ассоциация между AD и PD, поскольку около 30% пациентов с болезнью Альцгеймера также страдают PD. По сравнению с остальной популяцией пожилых людей у пациентов с болезнью Альцгеймера с большей вероятностью развивается сопутствующая PD. Кроме того, у пациентов с PD, у которых развилась деменция,обычно также развивается классическая клиническая картина AD. Несмотря на то что при каждом ней-1 013752 родегенеративном заболевании в патологический процесс вовлекаются специфические участки головного мозга и популяции клеток, что проявляется различными клиническими особенностями, PD, AD, DLB и LBD имеют общие патологические маркеры. У пациентов с семейной AD, синдромом Дауна и спорадической AD LBs появляются в мозжечковых миндалинах, что является классическим нейропатологическим маркером PD. Кроме того, каждое заболевание ассоциировано с дегенерацией нейронов, межнейрональных синаптических контактов и последующей смертью клеток, истощением запасов нейромедиаторов и патологической аккумуляцией белков с неправильной укладкой цепей, предшественники которых обеспечивают нормальное функционирование центральной нервной системы. Биохимические исследования подтвердили связь между AD, PD и DLB. Нейритные бляшки, которые являются классическим патологическим маркером AD, содержат бетаамилоидный (А) пептид и не-бета-амилоидный компонент (NAC). А образуется из большого белка предшественника, обозначаемого как белок предшественник амилоида (АРР, от англ. Amyloid PrecursorPeptide). NAC образуется из большого белка предшественника, обозначаемого как не-бета-амилоидный компонент АРР, в настоящее время наиболее часто используется название альфа-SN. NAC включает аминокислотные остатки 60-87 или 61-95 альфа-SN. Оба белка, А и NAC, впервые были обнаружены в амилоидных бляшках в виде протеолитических фрагментов соответствующих полноразмерных белков,для которых полноразмерные молекулы кДНК были идентифицированы и клонированы. Альфа-SN принадлежит к большому семейству белков, включая бета- и гамма-синуклеин и синоретин. Альфа-SN экспрессируется в норме в синапсе и отвечает, как считается, за нервную пластичность,обучение и память. Были идентифицированы мутации в альфа-SN человека (h), которые приводят к усилению аккумуляции альфа-SN (Ala30Pro и Ala53Thr), и ассоциированы с редкими формами аутосомнодоминантных форм PD. Механизм, по которому указанные мутации усиливают склонность альфа-SN к агрегации, неизвестен. Несмотря на то что в популяции можно обнаружить множество мутаций в генах АРР и альфа-SN,большинство случаев AD являются спорадическими. Наиболее часто встречающиеся спорадические формы заболеваний ассоциированы с патологической аккумуляцией А и альфа-SN соответственно. Однако причины такой избыточной аккумуляции указанных белков неизвестны. А секретируется нейронами и аккумулируется во внеклеточных амилоидных бляшках. Кроме того, А может быть обнаружен и внутри нейронов. Альфа-SN аккумулирует во внутринейрональных включениях, называемых LBs. Несмотря на то что оба белка обычно вместе обнаруживаются во внеклеточных нейритных AD бляшках, их также иногда определяют вместе и во внутриклеточных включениях. Механизм, по которому аккумуляция альфа-SN приводит к нейродегенерации и развитию характерных симптомов PD, неясен. Однако идентификация основных факторов, способствующих и/или препятствующих агрегации альфа-SN, является ключевым моментом для понимания патогенеза LBD и разработки новых способов ассоциированных с ними заболеваний. Исследования в этой области и разработка способов лечения направлены на поиск соединений, которые уменьшают агрегацию альфа-SN(Hashimoto, et al.), а также на изучение факторов роста, которые будут способствовать регенерации и/или выживанию дофаминергических нейронов, клеток, которые, в первую очередь, вовлекаются в патологический процесс (Djaldetti et al., New therapies for Parkinson's disease, J. Neurol. (2001), 248: 357-62; Kirik etintranigral transduction promotes functional regeneration in the lesioned nigrostriatal system, J. Neurosci (2000),20:4686-4700). Последние исследования на трансгенных мышиных моделях AD показали, что антитела к А 1-42 усиливают и стимулируют исчезновение амилоида из головного мозга, улучшают AD-подобную симптоматику, что, в свою очередь, приводит к улучшению когнитивного поведения (Schenk et al.,Immunization with amyloid- attenuates Alzheimer-disease-like pathology in PDAPP mouse, Nature (1999),408: 173-177; Morgan et al., A-beta peptide vaccination prevents memory loss in animal model of Alzheimer'sand plaques in a model of Alzheimer's disease, Nature (2000), 408:979-82). В отличие от внеклеточных амилоидных бляшек, обнаруживаемых в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера, тельца Леви представляют собой внутриклеточные образования, а антитела обычно не проникают внутрь клеток. Удивительно, что, принимая во внимание внутриклеточную природу LBs в мозговой ткани, исследователям удалось добиться уменьшения числа включений у трансгенных мышей, иммунизированных синуклеином. Настоящее изобретение наряду с прочим относится к способам лечения PD и других заболеваний, ассоциированных с LBs, заключающимся во введении пациентам синуклеина, фрагментов синуклеина, антигенов, которые имитируют синуклеин или его фрагменты, или антител к определенным эпитопам синуклеина при условиях, которые способствуют генерированию благоприятного иммунного ответа у пациента. Исследователи также неожиданно достигли успехов в снижении количества включений у трансгенных мышей, иммунизированных А. Настоящее изобретение также, помимо прочего, относится к способам лечения PD и других заболеваний, ассоциированных с LBs, заключающимся во введении пациентам А, фрагментов А, антигенов, имитирующих А или его фрагменты, или антител к определенным эпитопам А при условиях, которые способствуют генерированию благоприятного им-2 013752 мунного ответа у пациента. Таким образом, изобретение удовлетворяет длительно существующую необходимость в создании лечебных режимов для профилактики или уменьшения нейропатологии и у некоторых пациентов когнитивных расстройств, ассоциированных с PD и другими заболеваниями, связанными с образованием LBs. Краткое описание изобретения Согласно одному своему аспекту настоящее изобретение относится к способам профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией альфа-SN в головном мозге. Указанные способы заключаются в индукции иммунного ответа против альфа-SN. Такая индукция может быть достигнута путем активного введения иммуногена или пассивного введения антитела или производного антитела к синуклеину. Согласно некоторым способам у пациента отсутствуют симптомы заболевания. Согласно некоторым способам у пациента имеется заболевание, но отсутствуют симптомы. Согласно некоторым способам у пациента имеется фактор риска развития заболевания и нет симптомов. Согласно некоторым способам заболевание представляет собой болезнь Паркинсона. Согласно некоторым способам заболевание представляет собой болезнь Паркинсона и введение агента способствует улучшению двигательных функций у пациента. Согласно некоторым способам заболевание представляет собой болезнь Паркинсона и введение агента предотвращает ухудшение двигательных функций у пациента. Согласно некоторым способам у пациента нет болезни Альцгеймера. Для лечения пациентов, страдающих от наличия телец Леви или агрегации альфа-SN в головном мозге, один лечебный режим включает введение пациенту дозы альфа-SN или его активного фрагмента с целью индукции иммунного ответа. Согласно некоторым способам альфа-SN или его активный фрагмент вводится во множественных дозах в течение периода времени, составляющего по крайней мере 6 месяцев. Альфа-SN или его активный фрагмент может вводиться, например, периферически, интраперитонеально, перорально, подкожно, интракраниально, внутримышечно, местно, интраназально или внутривенно. Согласно некоторым способам альфа-SN или его активный фрагмент вводится вместе с адъювантом, который усиливает иммунный ответ к альфа-SN или его активному фрагменту. Согласно некоторым способам индукция иммунного ответа включает образование антител к альфа-SN или его активному фрагменту. Согласно некоторым способам активный агент представляет собой аминокислоты 35-65 альфа-SN. Согласно некоторым способам активный агент включает аминокислоты 130-140 альфа-SN и в целом содержит менее 40 аминокислот. Согласно некоторым способам активный агент включает аминокислоты 130-136 альфа-SN и в целом состоит менее чем из 40 аминокислот. Согласно некоторым способам С-концевые участки аминокислот в составе агента представляют собой С-концевые участки альфа-SN. Согласно некоторым из описанных выше способов альфа-SN или его активный фрагмент связан с носителем на N-концевом участке альфа-SN или его активного фрагмента. Согласно некоторым способам активный агент включает аминокислоты 1-10 альфа-SN и в целом состоит менее чем из 10 аминокислот Согласно некоторым способам N-концевые участки аминокислот агента представляют собой N-концевые участки аминокислот альфа-SN. Согласно некоторым из описанных выше способов альфа-SN или его активный фрагмент связан с носителем на С-концевом участке альфа-SN или его активного фрагмента. Согласно некоторым из описанных выше способов альфа-SN или его активный фрагмент связан с молекулой носителя с формированием конъюгата. Согласно некоторым способам агент вводится пациенту путем введения полинуклеотида, который кодирует полипептид, включающий фрагмент альфа-SN. Для лечения пациентов, страдающих от наличия телец Леви или агрегации альфа-SN в головном мозге, один из лечебных режимов включает введение пациенту дозы антитела к альфа-SN или его активному фрагменту с целью индукции иммунного ответа. Используемое антитело может представлять собой человеческое, гуманизированное, химерное или поликлональное антитело, а также может быть моноклональным или поликлональным. Согласно некоторым способам изотип антитела представляет собой IgG1 человека. Согласно некоторым способам антитело получают путем иммунизации человека пептидом альфа-SN, при этом человек может быть пациентом, который подлежит лечению с помощью антитела. Согласно некоторым способам антитело связывается с наружной поверхностью нейрональных клеток,содержащих тельца Леви, что способствует их разрушению. Согласно некоторым способам антитело проникает во внутреннее пространство нейрональных клеток с тельцами Леви, что способствует разрушению последних. Согласно некоторым способам антитело вводится совместно с фармацевтическим носителем в составе фармацевтической композиции. Согласно некоторым способам антитело вводится в дозировке от 0,0001 до 100 мг/кг, предпочтительно в дозировке, составляющей по крайней мере 1 мг/кг антитела на 1 кг веса больного. Согласно некоторым способам антитело вводится в множественных дозировках в течение длительного периода времени, например в течение 6 месяцев. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитела могут вводиться в составе фармацевтической композиции с замедленным высвобождением. Антитело может вводиться, например, периферически, интрапериотеально, перорально, подкожно, интракраниально, внутримышечно, местно, интраназально или внутривенно. Согласно некоторым способам во время лечения пациенту осуществляется мониторинг уровня антитела в крови.-3 013752 Согласно некоторым способам антитело вводится путем введения пациенту полинуклеотида, кодирующего по крайней мере одну цепь антитела. Полинуклеотид в организме пациента экспрессируется с образованием антительной цепи. Необязательно полинуклеотид кодирует тяжелую и легкую цепи антитела и экспрессируется в организме пациента с образованием тяжелой и легкой цепей антитела. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим любое из антител к альфа-SN, описанных в настоящем изобретении, а также фармацевтически доступный носитель. Согласно другому своему аспекту настоящее изобретение относится к способам профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией альфа-SN в головном мозге, заключающимся во введении агента, который индуцирует иммунный ответ против альфа-SN,а также во введении второго агента, который индуцирует иммунный ответ против A у пациента. Согласно некоторым способам агент представляет собой А или его активный фрагмент. Согласно некоторым способам агент представляет собой антитело к А. Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способам профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви и агрегацией альфа-SN в головном мозге,заключающимся во введении пациенту агента, индуцирующего иммунный ответ против А. Согласно некоторым способам агент представляет собой А или его активный фрагмент. Согласно некоторым способам агент представляет собой антитело к А. Согласно некоторым способам заболевание представляет собой болезнь Паркинсона. Согласно некоторым способам пациент не страдает болезнью Альцгеймера и не имеет факторов риска ее развития. Некоторые способы также включают дополнительный мониторинг проявлений или симптомов болезни Паркинсона у пациентов. Согласно некоторым способам болезнь представляет собой болезнь Паркинсона и введение агента приводит к улучшению клинической картины и уменьшению симптомов и проявлений заболевания. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим агент,эффективный для индукции иммунного ответа против компонента телец Леви у пациента, как описано выше, а также фармацевтически доступный адъювант. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения агент представляет собой альфа-SN или его активный фрагмент, например NAC,или любой из С-концевых фрагментов, описанных в данном изобретении. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим специфическое антитело к компоненту телец Леви. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, включающим агент,эффективный для индукции иммунного ответа против NAC компонента синуклеина амилоидной бляшки у пациента. Согласно некоторым способам осуществления настоящего изобретения агент представляет собой альфа-SN или его активный фрагмент, например NAC, или любой из С-концевых фрагментов-синуклеина, описанных в данном изобретении, и, необязательно, адъювант. Согласно другим вариантам осуществления настоящего изобретения агент представляет собой антитело или его фрагмент, которое специфически связывается с альфа-SN или его фрагментом, и, необязательно, фармацевтический носитель. Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способам изучения активности антитела при профилактике и лечении заболевания, ассоциированного с тельцами Леви. Указанные способы включают обеспечение контакта нейрональной клетки, экспрессирующей синуклеин, с антителом. Затем устанавливают, насколько указанное взаимодействие приводит к уменьшению депозитов синуклеина в клетках по сравнению с контрольными клетками, не контактирующими с антителом. Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способам изучения активности антитела при профилактике и лечении заболевания, ассоциированного с тельцами Леви, у пациента. Указанные способы заключаются в обеспечении контакта антитела с полипептидом, содержащим по крайней мере пять последовательных аминокислот альфа-SN. Затем устанавливают, происходит ли специфическое связывание антитела с полипептидом, наличие такого связывания указывает на активность антитела для лечения заболевания. Настоящее изобретение также относится к способам эффективной профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией-синуклеина в головном мозге. Способ заключается во введении пациенту, имеющему факторы риска развития заболевания или страдающему от заболевания, полипептида, содержащего иммуногенный фрагмент -синуклеина, эффективного для индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 70-140 -синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1, что обеспечивает эффективную профилактику и лечение заболевания. Необязательно, иммуногенный фрагмент -синуклеина не содержит остатки 1-69 -синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Необязательно, иммунный ответ включает образование антител, которые специфически связываются с -синуклеином человека по эпитопу, выбранному из группы, включающей SN83-101, SN107-125,SN110-128 и SN124-140, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Необязательно, в им-4 013752 мунный ответ не вовлекаются антитела, специфически связывающиеся с остатками -синуклеина человека, не входящими в состав эпитопа. Необязательно, иммуногенный фрагмент имеет от 5 до 20 последовательных аминокислот из положений 70-140 -синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Необязательно, иммуногенный фрагмент имеет от 5 до 20 последовательных аминокислот из положений 120-140 -синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Необязательно, иммуногенный фрагмент включает сегмент -синуклеина человека, выбранный из группы, включающей SN87-97, SN111-121, SN114-124 и SN126-136, и содержит в целом не более 40 последовательных аминокислотных остатков -синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии сSEQ ID NO:1. Необязательно, иммуногенный фрагмент включает SN125-140 и в целом содержит не более 40 последовательных аминокислот -синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Необязательно, иммуногенный фрагмент включает SN130-140 и содержит в целом не более 40 последовательных аминокислотных остатков -синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии сSEQ ID NO:1. Необязательно, иммуногенный фрагмент включает SN83-140, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Необязательно, иммуногенный фрагмент выбран из группы, включающей SN124-140, SN125-140,SN126-140, SN127-140, SN128-140, SN129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140,SN134-140, SN135-140, SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139,SN128-139, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN129-139, SN130-139,SN131-139, SN131-139, SN132-139, SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139,SN124-138, SN124-138, SN125-138, SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN129-138, SN130-138,SN131-138, SN132-138, SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136-138, SN124-137, SN125-137,SN126-137, SN127-137, SN128-137, SN129-137, SN130-137, SN131-137, SN132-137, SN133-137,SN134-137, SN135-137, SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN129-136,SN130-136, SN131-136, SN132-136, SN133-136, остатки пронумерованы согласно SEQ ID NO:1. Необязательно, иммунный ответ включает образование антител, которые специфически связываются с -синуклеином человека по эпитопу, выбранному из группы, включающей SN1-20, SN-21, SN2-23 иSN1-14, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Необязательно, в иммунный ответ не вовлекаются антитела, которые специфично связываются с остатками -синуклеина человека в пределах участка SN25-69, SN25-140, SN40-69, SN40-140 илиSN70-140. Необязательно, иммуногенный фрагмент имеет от 5 до 20 последовательных аминокислот из положений 1-40 -синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Необязательно, иммуногенный фрагмент имеет от 5 до 20 последовательных аминокислот из положений 1-20 и от 5 до 20 аминокислот из положений 120-140 -синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Необязательно, иммуногенный фрагмент в целом содержит не более 40 последовательных остатков-синуклеина, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Необязательно, иммунный ответ включает образование антител, которые специфически связываются с -синуклеином человека по эпитопу в пределах остатков 1-20 -синуклеина человека и по эпитопу в пределах остатков 70-140 -синуклеина человека. Необязательно, иммунный ответ включает образование антител, которые специфически связываются с -синуклеином человека по эпитопу в пределах остатков 1-20 -синуклеина человека и по эпитопу в пределах остатков 120-140 -синуклеина человека. Необязательно, в иммунный ответ не вовлекаются антитела, которые специфически связываются с-синуклеином человека по эпитопу в пределах остатков 41 и 119 -синуклеина человека. Необязательно, иммуногенный фрагмент связан с носителем с формированием конъюгата. Необязательно, полипептид включает иммуногенный фрагмент, слитый с носителем. Необязательно, иммуногенный фрагмент связан с молекулой переносчика на С-концевом участке фрагмента -синуклеина. Необязательно, множественные копии фрагмента связаны с множественными копиями носителя. Необязательно, иммуногенный фрагмент вводится вместе с адъювантом. Желательно, этапное введение приводит к рассасыванию, по крайней мере, некоторых телец Леви. Желательно, этапное введение приводит к дезагрегации телец Леви. Желательно, этапное введение приводит к уменьшению уровней олигомеров -синуклеина в синапсах. Желательно, этапное введение приводит к рассасыванию синуклеина путем активации лизосомального пути. Желательно, иммунный ответ индуцируется введением единичного полипептида или белка слияния.-5 013752 Желательно, иммунный ответ индуцируется введением более чем одного полипептида (например,двух полипептидов). Желательно иммунный ответ индуцируется введением первого полипептида, включающего первый иммуногенный фрагмент -синуклеина, эффективный в отношении индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека, а также введением второго полипептида, включающего второй иммуногенный фрагмент-синуклеина, эффективный в отношении индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 70-140, предпочтительно по остаткам 120-140-синуклеина человека. Необязательно, иммунный ответ индуцируется введением двух или более полипептидов в комбинации. Необязательно, указанные два и более полипептида вводятся совместно и находятся в составе одной лекарственной композиции. Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к композиции, содержащей первый полипептид, включающий первый иммуногенный фрагмент -синуклеина, и второй полипептид, включающий второй иммуногенный фрагмент -синуклеина, при этом первый иммуногенный фрагмент эффективно индуцирует иммунный ответ с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека, а второй иммуногенный фрагмент -синуклеина эффективно индуцирует иммунный ответ с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 120-140 -синуклеина человека. Необязательно, композиция не содержит иммуногенный фрагмент -синуклеина, включающий остатки 25-69 -синуклеина. Первый и второй иммуногенные фрагменты могут быть физически связаны (например, в форме конъюгата или белка слияния). Первый и второй иммуногенные фрагменты могут находиться в составе одной лекарственной композиции. Настоящее изобретение также относится к способам эффективной профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения указанные способы заключаются во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от заболевания, антитела в эффективном режиме, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения указанные способы заключаются во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от заболевания,антитела в эффективном режиме, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-40-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения указанные способы заключаются во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от заболевания,первого антитела, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-40 -синуклеина человека, и второго антитела, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 -синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. В том случае, когда антитело специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140-синуклеина человека, остатки нумеруются в соответствии с SEQ ID NO:1, антитело может также специфически связываться с эпитопом по остаткам 83-140 -синуклеина человека, остатки нумеруются в соответствии с SEQ ID NO:1. Антитело может также специфически связываться с эпитопом по остаткам 120-140 -синуклеина человека. Антитело может также связываться с эпитопом в пределах сегмента-синуклеина человека, выбранного из группы, включающей SN83-101, SN107-125, SN110-128, SN124140, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. В том случае, когда антитело специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-70 -синуклеина человека, остатки нумеруются в соответствии с SEQ ID NO:1, антитело может также специфически связываться с эпитопом по остаткам 1-20 или по остаткам 1-10 -синуклеина человека, остатки нумеруются в соответствии с SEQ ID NO:1. Когда первое антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-40-синуклеина человека, и второе антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 -синуклеина человека, остатки нумеруют в соответствии с SEQ ID NO:1, второе антитело также может специфически связываться с эпитопом по остаткам 120-140 -синуклеина человека. Первое и второе антитело могут вводиться одновременно. Первое и второе антитела могут вводиться во время одного курса лечения. Антитело может представлять собой моноклональное антитело. Возможно антитело относится к популяции поликлональных антител, неспособных специфически связываться с остатками -синуклеина человека, расположенными вне эпитопа.-6 013752 Антитело может представлять собой гуманизированное антитело. Антитело может представлять собой человеческое антитело. Антитело может представлять собой антитело человека, имеющее изотипIgG1. Антитело может вводиться вместе с фармацевтическим носителем в форме фармацевтической композиции. Желательно, антитело вводится в дозировке, составляющей от 0,0001 до 100 мг/кг, предпочтительно по крайней мере 1 мг на 1 кг веса пациента. Антитело может вводиться множественными дозами в течение 6 месяцев. Антитело может вводиться в составе фармацевтической композиции с замедленным высвобождением. Антитело может вводиться интраперитонеально, перорально, подкожно,интракраниально, внутримышечно, местно, интраназально или внутривенно. Антитело может проникать во внутреннее пространство нейрональных клеток, содержащих тельца Леви, что приводит к рассасыванию последних. Антитело может связываться с -синуклеином на наружной поверхности нейрональных клеток, что обеспечивает перекрестное связывание с -синуклеином, при этом этапное введение антитела приводит к дезагрегации телец Леви. Этапное введение антитела приводит к снижению уровней олигомеров -синуклеина в синапсах. Этапное введение антитела может приводить к выведению-синуклеина человека путем активации лизосомального пути. Согласно некоторым способам заболевание представляет собой болезнь Паркинсона. Антитело специфически связывается с денатурированным-синуклеином, что определяется с помощью иммуноблоттинга. Антитело связывается с денатурированным -синуклеином человека с аффинностью, составляющей по крайней мере 109 М-1. Желательно, антитело специфически связывается с синапсом, что определяется с помощью иммуноцитохимических исследований. Настоящее изобретение также относится к композиции для профилактики и лечения заболевания,характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге, включающей первое моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека, и второе моноклональное антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 (и предпочтительно остаткам 120-140) -синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Настоящее изобретение также относится к набору для профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге, включающему первый контейнер, содержащий антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека, и второй контейнер, содержащий антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 (и предпочтительно по остаткам 120-140) -синуклеина человека,остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Настоящее изобретение также относится к способам эффективной профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге. Указанные способы заключаются во введении пациенту, страдающему от заболевания или имеющему факторы риска развития заболевания, агента в эффективном режиме, который индуцирует иммунный ответ с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 70-140-синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1, что способствует эффективной профилактике и лечению заболевания. В иммунный ответ могут не вовлекаться антитела, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-69 -синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. В иммунный ответ могут также вовлекаться антитела, которые специфически связываются с сегментом -синуклеина человека, выбранным из группы, включающейSN83-101, SN107-125, SN110-128 и SN124-140, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Настоящее изобретение также относится к способам контролирования активности агента, полезного для лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви. Указанные способы включают обеспечение контакта агента с трансгенным животным (не человеком), предрасположенным к развитию заболевания, характеризующегося образованием телец Леви; и определение, насколько агент влияет на распространенность или показатель развития телец Леви по сравнению с контрольным трансгенным животным (не человеком). Агент представляет собой (i) фрагмент -синуклеина, который индуцирует образование антител, которые специфически связываются по крайней мере с одним эпитопом по остаткам 70-140 -синуклеина человека; или (ii) антитело, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 -синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Трансгенное животное (не человек) может содержать трансген, экспрессирующий -синуклеин человека. Указанный способ может также заключаться в исследовании множества тестируемых антител на предмет связывания с денатурированным -синуклеином человека и отборе в качестве агента того антитела, которое обладает наивысшей связывающей способностью. Указанный способ может также заключаться в исследовании множества тестируемых антител на предмет связывания с отложениями синуклеина в срезах тканей с помощью иммуногистохимических методов и отбор в качестве агента того антитела, которое обладает наивысшей связывающей способностью.-7 013752 Настоящее изобретение также относится к способу гуманизирования моноклонального антитела 8 А 5 или 6 Н 7, который заключается в определении аминокислотной последовательности CDR участков моноклонального антитела; отборе акцепторного антитела и получении гуманизированного антитела,содержащего CDRs из моноклонального антитела и каркасные вариабельные участки из акцепторного антитела. Настоящее изобретение также относится к способу получения химерных форм моноклонального антитела 6 А 5 или 6 Н 7, который заключается в определении аминокислотной последовательности вариабельных участков легких и тяжелых цепей моноклонального антитела; выборе константных участков легких и тяжелых цепей; получении химерного антитела, содержащего легкую цепь, включающую вариабельный участок легкой цепи, слитый с константным участком тяжелой цепи, и тяжелую цепь, включающую вариабельный участок тяжелой цепи, слитый с константным участком тяжелой цепи. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность альфа-SN (SEQ ID NO:1) в сопоставлении с двумя аминокислотными последовательностями NAC: SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 соответственно. На фиг. 2 представлены иммунологически окрашенные гистологические срезы головного мозга нетрансгенных мышей (панели А, Е и I), альфа-SN трансгенных мышей, иммунизированных только адъювантом (панели В, F и J), и альфа-SN трансгенных мышей, иммунизированных альфа-SN, с образованием низких титров (панели С, G и K) и высоких титров (панели D, Н и I) антител к альфа-SN. Срезы обрабатывают антителом к -синуклеину для определения уровней синуклеина (панели Е-Н), анти-IgG антителом для определения общего уровня IgG в срезах (панели Е-Н), а также определяют в них наличие глиального фибриллярного кислого протеина (GFAP, от англ. Glial Fibrillary Acidic Protein) - маркера астроглиальных клеток. На фиг. 3 представлено влияние анти-mSYN поликлонального антитела на агрегацию синуклеина в трансфецированных GT1-7 клетках, определяемое с помощью световой микроскопии. На фиг. 4 представлены уровни синуклеина в цитоплазме (С) и мембранах (Р) GT1-7 -syn клеток,обработанных предварительно иммунизированной сывороткой и антителом 67-10 в концентрации (1:50) за 48 ч до анализа, осуществленного с помощью вестерн-блоттинга. На фиг. 5 представлены результаты анализа влияния иммунизации А 1-42 на отложение амилоида в головном мозге нетрансгенных, SYN, АРР и SYN/APP трансгенных мышей. Определяемые уровни амилоида, обнаруженные у АРР и SYN/APP мышей, снижаются после иммунизации А 1-42. На фиг. 6 представлены результаты анализа влияния иммунизации А 1-42 на формирование включений синуклеина в головном мозге нетрансгенных, SYN, АРР и SYN/APP трансгенных мышей. Включения синуклеина, обнаруживаемые в головном мозге SYN и SYN/APP мышей, снижаются после иммунизации А 1-42. На фиг. 7 представлены прямой и непрямой механизмы блокирования антителами агрегации альфа-SN. На фиг. 8 представлено картирование эпитопов антител. Антитела, полученные от мышей в высоком титре и с высокой аффинностью к -синуклеину человека, картируют с помощью методики ELISA. В большинстве образцов антисыворотки, полученных от вакцинированных мышей, распознанные эпитопы располагаются в пределах С-концевых участков -синуклеина человека. В сыворотке от контрольных животных, обработанных CFA, эпитопы не определяются. На фиг. 9 представлен визуальный анализ уровней иммунореактивности -синуклеина человека и других маркеров нейродегенерации: А - среднее количество h-синуклеин-позитивных включений в височной коре головного мозга. Вакцинация -синуклеином человека приводит к значительному уменьшению количества включений по сравнению с контролем. Указанный эффект более выражен у мышей из II группы по сравнению с I группой; В - процентное содержание нейропилей, имеющих синаптофизин-иммунореактивные участки, в лобной коре головного мозга. У трансгенных мышей (tg), получавших только CFA, количество синаптофизин-иммуномеченых участков уменьшилось на 20%, в то время как уровень синаптофизиниммунореактивности на синапс остался неизменным; С - уровни CD45 иммунореактивности (маркер микроглии) в височной коре незначительно выше в головном мозге мышей, вакцинированных -синуклеином;D - процентное содержание нейропилей, имеющих иммунореактивные участки к -синуклеину человека, в височной коре головного мозга. У tg-мышей, вакцинированных -синуклеином человека, отмечается уменьшение аккумуляции -синуклеина в синаптофизин-иммунореактивных участках.= значительные различия по сравнению -синуклеин tg-мышами, обработанными только CFA(линии 4-6) уровни как олигомеров, так и мономеров -синуклеина человека снижались (верхняя панель), при этом уровни иммунореактивности синаптофизина снижались в последней группе (нижняя панель). На фиг. 11 представлен анализ интранейрональных агрегатов -синуклеина после внутримозговой инъекции антисинуклеиновых антител. С-концевое антитело 8 А 5 и N-концевое антитело 6 Н 7 оказывают "рассасывающее" действие. IgG1, IgG2a и IgG2b представляют собой контроли изотипа. Горизонтальные черточки указывают на средние величины. На фиг. 12 представлены гистологические срезы головного мозга с контрлатеральной (левая панель; круглые коричневые точки внутри среза представляют собой агрегаты -синуклеина) и ипсилатеральной стороны (правая панель) у мышей, которым вводили моноклональное антитело 8 А 5. Иммунологическое окрашивание осуществляют поликлональным антителом к -синуклеину. Интранейрональные агрегаты-синуклеина на контрлатеральной стороне обведены. Определения Термин "полная идентичность" означает, что две пептидные последовательности, при условии их оптимального сопоставления, такого, которое достигается, например, при применении программ GAP или BESTFIT с заданными по умолчанию весовыми интервалами, по крайней мере на 65% идентичны,предпочтительно по крайней мере на 80 или 90% идентичны, более предпочтительно по крайней мере на 95% или более идентичны (например, идентичны на 99% или более). Предпочтительно положения остатков, которые не являются идентичными, различаются за счет консервативных аминокислотных замен. Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность выступает как контрольная, с которой сравниваются тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемая и контрольная последовательности вводятся в компьютер, задаются координаты последовательностей и, если это необходимо, программные параметры алгоритма по сравнению последовательностей. Затем алгоритм сравнения последовательностей подсчитывает процентную идентичность тестируемой последовательности (последовательностей) по отношению к контрольной последовательности, основываясь на заданных программных параметрах. Оптимальное сопоставление последовательностей для их сравнения может быть осуществлено, например, с помощью локального гомологичного алгоритма SmithWaterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981), с помощью гомологичного алгоритма сопоставления NeedlemanWunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970), с помощью способа поиска идентичности PearsonLipman, Proc. Natl Acad. Set USA. 85:2444(1988), с помощью компьютеризованных воплощений указанных алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA иTFASTA в базе Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 578 Science Dr., Madison,WI) или же путем визуального сопоставления (см. Ausbel et al., supra). Одним примером алгоритма, который подходит для определения процентной идентичности и аналогичности последовательностей является алгоритм BLAST, который описан у Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Программное обеспечение для осуществления BLAST анализа является общедоступным и выложено на сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBL от англ. National Center for BiotechnologyInformation). Обычно для осуществления сравнения последовательностей могут быть использованыdefault программные параметры, хотя параметры производителя также могут использоваться. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP использует в качестве заданных параметров длину кода (W), равную 3, математическое ожидание (Е), равное 10, и подсчитывающую матрицу BLOSUM62(см. Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89, 10915 (1989. Для того чтобы классифицировать аминокислотные замены как консервативные и неконсервативные, аминокислоты группируют следующим образом: группа I (гидрофобные боковые цепи): норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): Cys, Ser, Thr; группа III (кислые боковые цепи): Asp, Glu; группа IV (основные боковые цепи): Asn, Gln, His, Lys, Arg; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): Glu, Pro; группа VI (ароматические боковые цепи): Trp, Tyr, Phe. Консервативные замены включают замены аминокислот из одной группы. Неконсервативные замены подразумевают замены аминокислоты одной из трех групп на аминокислоту из другой группы. Терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, обычно полностью очищены от нежелательных побочных продуктов. Это означает, что агент по крайней мере на 50% в/в(вес./вес.) очищен, а также полностью свободен от нежелательных белков и загрязнителей. Иногда агенты очищены по крайней мере на 80% в/в и более предпочтительно по крайней мере на 90 или на 95% в/в. Однако при использовании стандартных методик очистки белков могут быть получены белки, очищенные по крайней мере на 99% в/в.-9 013752 Фраза о том, что молекула "специфически связывается" с мишенью, означает, что связывание молекулы происходит при условиях присутствия гетерогенной популяции других биологических веществ. Таким образом, при заданных иммуннологических условиях специфическая молекула связывается преимущественно с определенной мишенью и не связывается с другими биологическими веществами, присутствующими в образце, даже если присутствует в избыточном количестве. Специфическое связывание антитела с мишенью при таких условиях требует, чтобы антитело было отобрано на основании своей специфичности по отношению к мишени. Для отбора антител, которые специфически иммунологически реагируют с определенными белками, могут использоваться различные форматы иммунологических исследований. Например, для отбора моноклональных антител, которые специфическим образом вступают в иммунологические реакции с белком, обычно используют твердофазный иммунологический анализ с помощью ELISA. См., например, Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual., Cold SpringHarbor Publications, New York, где описаны форматы иммунологических исследований и условий, которые могут быть использованы для определения специфической иммунореактивности. Специфическое связывание между двумя молекулами означает, что аффинность составляет по крайней мере 106, 107, 108,109 или 1010 М-1. Аффинность более 108 М-1 является предпочтительной. Термином "антитело" или "иммуноглобулин" обозначается интактное антитело и его связывающие фрагменты. Обычно фрагменты конкурируют с интактным антителом, из которого они были получены,за специфическое связывание с антигеном. К фрагментам относятся отдельные тяжелые цепи, легкие цепи, Fab, Fab'F(ab')2, Fabc и Fv. Фрагменты получают с помощью рекомбинантных ДНК технологий или путем ферментативного или химического разделения интактных иммуноглобулинов. Термин "антитело" также относится к одной или более иммуноглобулиновым цепям, которые химически конъюгированы с белками слияния или же экспрессируются как белки слияния. Термин "антитело" также относится к биспецифическому антителу. Биспецифическое или бифункциональное антитело представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различные пары тяжелых/легких цепей и два различных участка связывания. Биспецифические антитела могут быть получены с помощью различных способов, включая слияние гибридом или связывание Fab' фрагментов. См., например, SongsivilaiLachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). Термин "антитело" также относится к одноцепочечным антителам, в которых вариабельные домены тяжелых и легких цепей связаны посредством спейсера. АРР 695, АРР 752 и АРР 770 относятся к полипептидам, имеющим длину соответственно 695, 751 и 770 аминокислотных остатков и кодируемым геном АРР человека. См. Kang. et al., Nature 325, 773 (1987);Ponte et al., Nature 331, 525 (1988); и Kitaguchi et al., Nature 331, 530 (1988). Аминокислотам в составе белка предшественника амилоида человека (АРР) присваивают номера в соответствии с последовательностью его изоформы АРР 770. Такие термины, как А 39, A340, A41, A42 и А 43 относятся к А-пептиду, имеющему в своем составе аминокислотные остатки 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 и 1-43. Термин "антиген" относится к веществу, с которым специфически связывается молекула. Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к участку антигена, с которым взаимодействуют В- и/или Т-клетки. Эпитопы В-клеток могут быть сформированы как смежными, так и несмежными аминокислотами, которые накладываются друг на друга при образовании третичной структуры белка. Эпитопы, сформированные смежными аминокислотами, обычно сохраняются при экспозиции денатурирующих растворителей, в то время как эпитопы, образованные при формировании третичной белковой структуры, обычно разрушаются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп обычно имеет в своем составе по крайней мере 3 и более часто по крайней мере 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения spatial конформации эпитопов включают, например, рентгенокристаллографию и двумерный ядерно-магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, Glenn E. Morris. Ed. (1996). Антитела, которые распознают один и тот же эпитоп, могут быть идентифицированы с помощью простого иммунологического анализа, выявляющего способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с заданным антигеном. Т-клетки распознают эпитопы, включающие около 9 аминокислот для CD8 клеток или около 13-15 аминокислот для CD4 клеток. Т-клетки, которые распознают эпитоп,могут быть идентифицированы с помощью in vitro исследований, которые позволяют измерить антигензависимую пролиферацию, которая определяется включением 3 Н-тимидина первичными Т-клетками в ответ на взаимодействие с эпитопом (Burke, et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19 (1994, с помощью антигензависимого киллинга (цитотоксическое Т-клеточное иммунное исследование, Tigges et al., J. Immunol. 156,3901-3910) или с помощью секреции цитокинов. Термин "иммунологический" или "иммунный" ответ означает развитие благоприятного гуморального (опосредованного антителами) и/или клеточного (опосредованного антигенспецифическими Т-клетками или продуктами их секреции) ответа, направленного против амилоидного пептида или пассивного ответа, индуцированного введением антитела или праймированных Т-клеток. Клеточный иммунный ответ индуцируется презентацией полипептидных эпитопов в ассоциации с молекулами МНСI или II класса для активации антигенспецифичных CD4+ Т-хелперных клеток и/или CD8+ цитотоксиче- 10013752 ских клеток. Иммунный ответ также может включать активацию моноцитов, макрофагов, NK-клеток,базофилов, дендритных клеток, астроцитов, микроглиальных клеток, эозинофилов или других компонентов естественного иммунитета. Клеточно-опосредованный иммунный ответ может быть установлен с помощью исследований пролиферации (CD4+ Т-клеток) или CTL (цитотоксические Т-клетки), см. Burke,supra; Tigges, supra. Относительный вклад гуморального или клеточного иммунного ответа в защитный или терапевтический эффект иммуногена может быть определен путем выделения антител и Т-клеток из организма иммунизированного сингенного животного и измерения защитного или терапевтического эффекта у второго субъекта. Термин "иммуногенный агент" или "иммуноген" относится к агенту, способному индуцировать иммунологический ответ против самого себя при его введении в организм млекопитающего, предпочтительно вместе с адъювантом. Термин "полностью D" относится к пептиду, у которого 75, 80, 90, 95 и 100% аминокислот имеют D-конфигурацию. Термин "оголенный полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, который не связан с коллоидными материалами. Оголенные полинуклеотиды иногда клонируют в плазмидном векторе. Термин "адъювант" относится к соединению, которое при введении совместно с антигеном усиливает иммунный ответ против антигена, но при введении отдельно не генерирует иммунный ответ, направленный против антигена. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ с помощью нескольких механизмов, включая рекрутинг лимфоцитов, стимуляцию В- и/или Т-клеток и стимуляцию макрофагов Термин "пациент" относится к человеку или другому млекопитающему, получающему профилактическое или терапевтическое лечение. Конкуренцию между антителами определяют с помощью исследования, в котором иммуноглобулин, подлежащий анализу, ингибирует специфическое связывание контрольного антитела с известным антигеном, таким как альфа-SN. Известно несколько типов исследований конкурентного связывания,например твердофазный прямой или непрямой радиоиммунологический анализ (RIA), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (EIA), сэндвич-конкурентный анализ (см. Stahli et al.,Methods in Enzymology, 9:242-253 (1983; твердофазный прямой биотин-авидин EIA (см. Kirkland et al.,J. Immunol. 137:3614-3619; твердофазный прямой анализ с меткой, твердофазный прямой сэндвичанализ с меткой (см. Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Press (1988; твердофазный прямой RIA с меткой с использованием 1-125 (см. Morel et al., Molec. Immunol. 25(1):715(1988 и прямой RIA с меткой (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990. Обычно такое исследование включает использование очищенного антигена, связанного с твердой поверхностью или клетками, несущими как немеченый тестируемый иммуноглобулин так и меченый контрольный иммуноглобулин. Конкурентное связывание измеряют путем определения количества метки, связавшейся с твердой поверхностью, или клетками в присутствии тестируемого иммуноглобулина. Обычно тестируемый иммуноглобулин присутствует в избытке. Антитела, идентифицированные с помощью исследования конкурентного связывания (конкурирующие антитела), включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и контрольное антитело, и антитела, связывающиеся с прилежащим эпитопом, расположенным достаточно проксимально по отношению к эпитопу, с которым связывается контрольное антитело, за счет стерического несоответствия. Обычно в том случае, если конкурирующее антитело присутствует в избытке, оно будет ингибировать специфическое связывание контрольного антитела с известным антигеном по крайней мере на 50 или 75%. Термин "симптом" или "клинический симптом" относится к субъективному проявлению заболевания, например, такому как нарушение походки, ощущаемому пациентом. Термин "признак" относится к субъективному проявлению заболевания, наблюдаемому врачом. Термин "в комбинации", при использовании его по отношению к введению двух или более антител к -синуклеину человека (т.е. каждое антитело распознает разный эпитоп) или к введению двух или более полипептидов или иммуногенов, которые индуцируют антительный ответ к -синуклеину человека,подразумевает их одновременное введение или введение во время одного курса лечения. Одновременное введение агентов подразумевает их введение в форме белка слияния или конъюгата (например, когда они физически связаны между собой) в составе одной композиции (например, в которой агенты скомбинированы или объединены в одной лекарственной форме, например композиции с замедленным высвобождением или депо), введение в составе различных композиций с интервалом от нескольких минут до 2 ч (совместное введение) либо введение в составе различных композиций, но в один день. Введение во время одного курса лечения означает, что оба агента вводятся пациенту для лечения или профилактики одного состояния. Каждый агент может вводиться однократно или несколько раз. Например, один агент вводится первым, а второй агент вводится на следующий день или на следующей неделе. Аналогично, два агента могут вводиться более чем однократно, например, каждый день, или через день, или через неделю,или согласно другому режиму (например, таким образом, что благоприятный для пациента эффект оказывается лучше, чем при введении только одного агента).- 11013752 Фрагмент, обозначаемый как SNx-y, означает фрагмент -синуклеина, который начинается с аминокислоты X и заканчивается аминокислотой Y. Такой фрагмент может быть связан с гетерологичным полипептидом, но не с другими аминокислотами -синуклеина, таким образом, что фрагмент начинается до X и заканчивается после Y. Аминокислотные остатки -синуклеина или его фрагменты нумеруются согласно SEQ ID NO:1, при этом -синуклеин или фрагмент максимально соответствует SEQ ID NO:1, как описано выше при использовании default параметров. Композиции или способы, "включающие" один или более recited элементов, могут также включать и другие элементы, специфически не recited. Например, композиция, включающая альфа-SN-пептид, содержит изолированный пептид альфа-SN и пептид альфа-SN в составе большей полипептидной последовательности. Детальное описание изобретенияI. Общие положения. Настоящее изобретение относится к способам профилактики и лечения некоторых заболеваний и патологических состояний, характеризующихся наличием отложений пептида альфа-SN, агрегированных в нерастворимые образования, в головном мозге пациента, в форме телец Леви. Указанные заболевания обозначаются общим термином заболевания с тельцами Леви (LBD) и включают болезнь Паркинсона(PD). Указанные заболевания характеризуются наличием агрегатов альфа-SN, которые имеют-складчатую конформацию, и окрашиваются тиофлавином-S и конго-красным (см. Hasimoto, Ibid). Настоящее изобретение также относится к способам лечения указанных заболеваний, заключающимся в использовании агента, который может генерировать иммунный ответ к альфа-SN. Иммунногенный ответ способствует предотвращению формирования или исчезновению депозитов -синуклеииа в клетках головного мозга. Хотя понимание механизма не является существенным для осуществления практической части изобретения, иммунный ответ может индуцировать исчезновение агрегатов в результате образования антител к синуклеину, которые захватываются клетками как сами по себе, так и вместе с-синуклеину при их периферическом введении проходят гематоэнцефалический барьер и попадают внутрь клеток, содержащих агрегаты -синуклеина, как сами по себе, так и вместе с -синуклеином. Антитела, попавшие внутрь клеток, могут способствовать дезагрегации -синуклеина посредством активации липосомального пути. Антитела внутри клеток с аффинностью к -синуклеину в денатурированной форме также могут стабилизировать молекулы в дезагрегированной форме. Альтернативно или дополнительно, антитела могут препятствовать агрегации синуклеина на наружной поверхности клеток. Например, антитела к -синуклеину могут распознавать и перекрестно связывать белки с неправильной конформацией на поверхности нейрональных клеток. Согласно некоторым способам "очищающий" эффект может быть достигнут частично с помощью фагоцитоза, опосредованного Fc-рецептором. Иммунизация синуклеином может снижать аккумуляцию синуклеина в синапсах и нейрональных клетках в головном мозге. Хотя понимание механизма не является существенным для осуществления практической части изобретения, результат может быть объяснен захватом антител к синуклеину нейрональными клетками(например, с помощью синаптических везикул). Возможно агенты, генерирующие иммунный ответ к альфа-SN, могут использоваться в комбинации с агентами, которые генерируют иммунный ответ к А. Иммунный ответ способствует исчезновению депозитов А у пациентов, имеющих такие депозиты (например, у пациентов, страдающих от болезни Альцгеймера и болезни Паркинсона одновременно); однако иммунный ответ также способствует исчезновению депозитов синуклеина. Таким образом, настоящее изобретение подразумевает использование таких агентов отдельно или в комбинации с агентами, генерирующими иммунный ответ в -синуклеину,у пациентов с LBD, но не страдающих от болезни Альцгеймера и не имеющих факторов риска ее развития. Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям и способам профилактики и лечения амилоидогенных заболеваний. Было показано, что альфа- и бета-синуклеин вовлечены в образование депозитов амилоида при определенных амилоидогенных заболеваниях, в частности при болезни Альцгеймера (Clayton, D.F., et al., TINS, 21(6):249-255, 1998). Более специфично, фрагмент NAC домена альфа- или бета-синуклеина (остатки 61-95) был выделен из амилоидных бляшек у пациентов,страдающих болезнью Альцгеймера; указанный фрагмент составляет около 10% бляшки и остается нерастворимым после растворения додецилсульфатом натрия (SDS), George, J.M. et al., Neurosci. News 1: 12-17, 1995. Кроме того, сообщается, что полноразмерный альфа-SN и его NAC фрагмент усиливает агрегацию -амилоидного пептида в нерастворимый амилоид in vitro (Cayton, supra). NAC-компонент амилоидных бляшек является мишенью для иммунологической терапии, заявленной в соответствии с настоящим изобретением, что уточняется ниже. Согласно одному варианту своего осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим агенты, эффективные для индуцирования иммунного ответа к синуклеин-NAC компоненту амилоидных бляшек у пациента. Указанные композиции могут быть эффективны для профилактики, замедления или уменьшения отложения амилоида в головном мозге при амилоидных заболеваниях.II. Агенты, генерирующие иммунный ответ к -синуклеину. Иммунный ответ может быть активным, когда иммуноген вводится для индуцирования образования антител, взаимодействующих с альфа-SN у пациента, или пассивным, когда вводится антитело, которое само связывает альфа-SN в организме пациента. 1. Агенты, индуцирующие активный иммунный ответ. Лекарственные агенты индуцируют иммунный ответ, специфически направленный к определенным эпитопам альфа-SN пептида. Предпочтительными агентами являются сам альфа-SN пептид и его фрагменты. В заявке на патент US60/471929 от 19 мая 2003 г. и заявке РСТ WO 05/013889, обе представлены здесь в качестве ссылок, описаны новые фрагменты -синуклеина, которые могут использоваться в качестве лекарственных средств, возможно, в комбинации с адъювантом. Варианты указанных фрагментов, их аналоги и миметики натурального альфа-SN пептида, которые индуцируют образование антител к предпочтительным эпитопам альфа-SN пептида или перекрестно реагируют с ними, также могут использоваться. В заявке US60/471929 от 19 мая 2003 г. и заявке РСТ WO 05/013889, обе включены в настоящее изобретение в качестве ссылок, описаны новые фрагменты -синуклеина, полезные для лечения и профилактики синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний. Указанные фрагменты могут также использоваться в комбинации с адъювантом. Альфа-синуклеин был первоначально идентифицирован в головном мозге людей как белокпредшественник неамилоидный компонент NAC AD бляшек (Uda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(23):1, 1282-11286 (1993). Альфа-синуклеин, также обозначаемый как предшественник не-А компонента AD амилоида (NACP), представляет собой пептид из 140 аминокислот. Альфа-SN имеет следующую аминокислотную последовательность:-синуклеина, представляет собой пептид, состоящий по крайней мере из 28 аминокислотных остатков(Iwai, et al., Biochemistry, 34:10139-10145). Junsen et al. сообщают, что NAC имеет следующую аминокислотную последовательность:Uda et al. сообщают, что NAC имеет следующую аминокислотную последовательность: Дезагрегированный альфа-SN или его фрагменты, включая NAC, представляют собой мономерные пептидные единицы. Дезагрегированный альфа-SN или его фрагменты в целом являются растворимыми и обладают способностью к самоагрегации с формированием растворимых олигомеров. Олигомеры альфа-SN и его фрагменты обычно являются растворимыми и существуют, главным образом, в форме альфа-спиралей. Мономеры альфа-SN могут быть получены in vitro путем растворения лиофилизированного пептида в чистом DMSO с последующей обработкой ультразвуком. Полученный раствор центрифугируют для удаления всех нерастворенных частиц. Агрегированный альфа-SN или его фрагменты, включаяNAC, представляют собой олигомеры альфа-SN или его фрагменты, которые были ассоциированы в нерастворимые бета-складчатые структуры. Агрегированный альфа-SN или его фрагменты, включая NAC,также представляют собой фибриллярные полимеры. Фибриллы обычно являются нерастворимыми. Некоторые антитела связываются как с растворимым альфа-SN или его фрагментами, так и с агрегированным альфа-SN или его фрагментами. Некоторые антитела связываются с олигомерами -синуклеина с большей силой, чем с его мономерными или фибриллярными формами. Некоторые антитела связываются как с растворимым, так и с агрегированным альфа-SN или его фрагментами и, желательно, также и с его олигомерными формами. Альфа-SN, основной компонент телец Леви, характерных для PD, а также его эпитопные фрагменты, такие как, например, NAC, или отличные от NAC фрагменты, могут использоваться для индукции иммунного ответа. Предпочтительно указанные фрагменты содержат четыре или более аминокислоты альфа-SN или его аналогов. Некоторые активные фрагменты включают эпитоп на С-концевом участке альфа-SN или рядом с ним (например, в пределах аминокислот 70-140, 100-140, 120-140, 130-140 или 135-140). В некоторых активных фрагментах С-концевой остаток эпитопа является С-концевым остатком альфа-SN. Другие компоненты телец Леви, например синфилин-1, паркин, убиквитин, нейрофиламент,бета-кристаллин и их эпитопные фрагменты, также могут использоваться для индукции иммунного ответа.- 13013752 Как было отмечено, определенные предпочтительные фрагменты -синуклеиина выделяют из С-концевой молекулы. Такие фрагменты не содержат остатки 1-69 -синуклеина человека. Иммунизация такими фрагментами генерирует иммунный ответ с образованием антител к одному или нескольким эпитопам по остаткам 70-140 -синуклеина человека. К иммуногенным С-концевым фрагментам относятсяSN85-99, SN109-123, SN112-126 и SN126-138, как показано на фиг. 8, а также другие фрагменты, отличающиеся от одного из указанных наличием вплоть до 2 или нескольких дополнительных аминокислот на каждом конце. Другим предпочтительным фрагментом является SN83-140, который включает все указанные эпитопы. Некоторые фрагменты -синуклеина вызывают образование антител, которые специфически связываются с одним или более из следующих эпитопов:SN83-101,SN107-125, SN110-128 и SN124-140 -синуклеина человека. Некоторые фрагменты вызывают образование антител, которые специфически связываются только с одним из перечисленных выше четырех фрагментов. Например, фрагмент SN83-101 начинается с остатка 83 и заканчивается остатком 101 синуклеина и приводит к образованию антител, которые специфически связываются только с SN83-101. Некоторые фрагменты в общем имеют в своем составе не более 40 последовательных аминокислотных остатков -синуклеина. Некоторые из указанных фрагментов включают SN125-140, SN130-140,SN87, 97, SN111-121, SN114-124 или SN128-136. Некоторые фрагменты имеют в своем составе в целом 5-20 последовательных аминокислот С-концевого участка -синуклеина (т.е. остатки 70-140). Некоторые фрагменты имеют 5-20 последовательных аминокислот, расположенных между остатками 120-140-синуклеина. К наиболее предпочтительным фрагментам относятся SN124-140, SN125-140, SN126-140,SN127-140, SN128-140, SN129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140, SN134-140,SN135-140, SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139,SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN129-139, SN130-139, SN131-139,SN132-139, SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139, SN124-138, SN124-138,SN125-138, SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN129-138, SN130-138, SN131-138, SN132-138,SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136-138, SN124-137, SN125-137, SN126-137, SN127-137,SN128-137, SN129-137, SN130-137, SN131-137, SN132-137, SN133-137, SN134-137, SN135-137,SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN129-136, SN130-136, SN131-136,SN132-136, SN133-136 и SN134-136. Другие фрагменты -синуклеина, полезные для эффективной профилактики и лечения заболеваний,характеризующихся образованием телец Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге (например,болезнь Паркинсона), выделяют из N-концевого участка молекулы. Иммунизация фрагментами генерирует иммунный ответ с образованием антител к одному или более эпитопу по остаткам 1-20 или в некоторых случаях к одному или более эпитопу по остаткам 1-10. Как показано в примере IX, введение 6 Н 7,антитела, которое распознает аминоконцевой участок -синуклеина, приводит к уменьшению агрегации-синуклеина в головном мозге трансгенных мышей, в избытке экспрессирующих -синуклеин человека. Ожидается, что иммунизация фрагментами -синуклеина, имеющими в своем составе аминоконцевой участок -синуклеина, также будет приводить к уменьшению агрегации -синуклеина и/или предотвращать такую агрегацию. Таким образом, согласно одному своему аспекту настоящее изобретение относится к способу эффективной профилактики или лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге, который заключается во введении пациенту, имеющему риск развития заболевания или страдающему от заболевания, полипептида, имеющего в своем составе иммуногенный фрагмент -синуклеина, эффективный для индуцирования иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-40, остаткам 1-20 или остаткам 1-10 -синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения иммуногенный фрагмент -синуклеина не имеет остатков 70-140 -синуклеина. Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения иммуногенный фрагмент не содержит остатки 41-140 -синуклеина. Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения иммуногенный фрагмент не содержит остатков 25-140-синуклеина. К подходящим иммуногенам, эффективным для профилактики и лечения заболевания,характеризующегося тельцами Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге, относятся, без ограничений указанными, фрагменты, имеющие в своем составе от 5 до 20 смежных аминокислотных остатков аминоконцевого участка -синуклеина. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения указанный фрагмент имеет в своем составе первый (аминоконцевой) остаток синуклеина. Таким образом, примерные фрагменты включают последовательность остатков 1-Na последовательности SEQ ID NO:1, где Na равно от 5 до 20 (например, MDVFMKGLSKAKE GVVAAAE;- 14013752 Согласно другим предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения,указанные фрагменты не содержат аминоконцевой участок -синуклеина, но имеют в своем составе второй или третий остаток -синуклеина. Таким образом, примерные фрагменты имеют последовательность от 2 до Nb и 3-Nc последовательности SEQ ID NO:1, где Nb составляет от 6 до 21, a Nc составляет от 7 до 22 (например, DVFMKGLSKAKEGVVAAAEK; DVFM KGLSKAKEGVVAAAE;VFMKGLSKAKEG; VFMKGLSKAK; VFMKGLSKA; VFMKGLSK; VFMKGLS; VFMKG и VFMKG). Как обсуждается ниже, описанные выше фрагменты могут быть связаны с молекулой носителя (например, конъюгатом или белком слияния, см. Sec. II (3. Альтернативно, как описывается ниже, рассмотренные выше фрагменты могут вводиться путем вакцинирования субъекта нуклеиновой кислотой,кодирующей фрагмент (см. Sec. II (4. Ссылки на молекулы альфа-SN включают натуральные аминокислотные последовательности человека, обозначаемые выше как аналоги, включающие аллельные, видовые и искусственные варианты,полноразмерные формы и их иммуногенные фрагменты. Альфа-синуклеин человека, под которым подразумевается белок, имеющий такую же аминокислотную последовательность, как и SEQ ID NO:1, является предпочтительным для всех вариантов осуществления настоящего изобретения. Аналоги обычно отличаются от существующих в природе пептидов по одной, двум или нескольким аминокислотным позициям и создаются путем консервативных аминокислотных замен. Аналоги обычно имеют последовательность, по крайней мере на 80 или 90% идентичную последовательности природных пептидов. Позиции аминокислот в аналогах природного -синуклеина обозначаются номерами соответствующих аминокислот в природном -синуклеине, когда аналог и природный -синуклеин максимально выровнены. Некоторые аналоги также имеют в своем составе синтетические аминокислоты или модификации N- или С-концевых аминокислот по одной, двум или нескольким позициям. Например, природный остаток глутаминовой кислоты в положении 139 альфа-SN может быть замещен изоаспарагиновой кислотой. Примерами синтетических аминокислот являются D, альфа, альфа-дизамещенные аминокислоты,N-алкилированные аминокислоты, молочная кислота, 4-гидроксипролин, гамма-карбоксиглутамат, ипсилон-N,N,N-триметиллизин, ипсилон-N-ацетиллизин, O-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин,3-метилгистидин, 5-гидроксиллизин, омега-N-метиларгинин, бета-аланин, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, тироксин, гамма-аминомасляная кислота, гомосерин, цитруллин и изоаспарагиновая кислота. К терапевтическим агентам также относятся аналоги фрагментов альфа-SN. Примерами некоторых терапевтических агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, являются всеD-пептиды, например все D-альфа-SN или все D-NAC, а также все D-пептидные аналоги. Аналоги специфически связываются с популяцией поликлональных антител к природному -синуклеину человека. Эффективность аналогов и фрагментов в отношении профилактики и лечения может быть изучена на моделях трансгенных животных при сравнении с контрольными животными, не получавшими лечения или получавшими плацебо, как описано ниже. Альфа-SN, его фрагменты и аналоги могут быть синтезированы с помощью твердофазного пептидного синтеза или с помощью рекомбинантной экспрессии или могут быть выделены из природных источников. Способы автоматического пептидного синтеза являются коммерчески доступными и предоставляются многими поставщиками, такими как Applied Biosystems, Foster City, California. Рекомбинантная экспрессия может происходить в организме бактерий, таких как Е.coli, дрожжи, клетки насекомых или млекопитающих. Методики рекомбинантной экспрессии описаны у Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual (C.S.H.P. Press, NY 2nd ed., 1989). Некоторые формы альфа-SN также являются коммерчески доступными, например в компании ВАСНЕМ и American Peptide Company, Inc. К терапевтическим агентам также относятся длинные пептиды, к которым относятся, например, активный фрагмент альфа-SN вместе с другими аминокислотами. Например, к предпочтительным агентам относятся белки слияния, включающие сегмент альфа-SN, слитый с гетерологичной аминокислотной последовательностью, которая индуцирует Т-хелперный ответ, направленный против гетерологичной аминокислотной последовательности, и, как следствие, В-клеточный ответ против сегмента альфа-SN. Профилактическая и терапевтическая активность указанных полипептидов может быть изучена на контрольных животных моделях при сравнении с контрольными животными, не получавшими лечения или получавшими плацебо, как описано ниже. Пептид альфа-SN, его аналог или активный фрагмент или другой полипептид могут вводиться в ассоциированной или мультимерной форме или диссоциированной форме, к терапевтическим агентам также относятся мультимеры мономерных иммуногенных агентов. Терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут также включать полилизиновые последовательности.- 15013752 Согласно еще одному варианту осуществления настоящего изобретения иммуногенный пептид, такой как фрагмент альфа-SN, может быть представлен вирусом или бактерией как часть иммуногенной композиции. Нуклеиновую кислоту, кодирующую иммуногенный пептид, включают в геном или эписому вируса или бактерии. Нуклеиновую кислоту могут включать таким образом, чтобы иммуногенный фрагмент экспрессировался как белок секреции или как белок слияния с белком наружной поверхности вируса или с трансмембранным белком бактерии таким образом, что пептид displayed. Бактерии и вирусы, используемые для таких целей, должны быть непатогенными или аттенуированными. К подходящим вирусам относятся аденовирусы, HSV, вирус венесуэльского энцефалита лошадей и другие альфавирусы, вирус везикулярного стоматита и другие рабдо-вирусы, вирус коровьей оспы и оспы птиц. К подходящим бактериям относятся Salmonella и Shigella. Слияние иммуногенного пептида с HbsAg HBV является особенно предпочтительным. К терапевтическим агентам также относятся пептиды и другие соединения, чьи аминокислотные последовательности необязательно полностью идентичны последовательности альфа-SN, но тем не менее выполняют функцию миметиков альфа-SN и индуцируют аналогичный иммунный ответ. Например,любые пептиды или белки, формирующие альфа-складчатые структуры, могут быть скринированы на предмет возможности их использования. Антиидиотипические антитела к моноклональным антителам к альфа-SN или другим компонентам телец Леви также могут использоваться. Указанные анти-Id антитела мимикрируют антиген и генерируют иммунный ответ к нему (см. Essential Immunology, Roit ed.,Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, CA 6th ed., p. 181). Агенты, отличные от альфа-SN, должны индуцировать иммуногенный ответ к одному или нескольким предпочтительным сегментам альфа-SN,представленным выше (например, NAC). Предпочтительно указанные агенты индуцируют иммунный ответ, который специфически направлен к одному или нескольким из указанных сегментов и при этом не затрагивает другие сегменты альфа-SN. Множественные библиотеки пептидов или других соединений также могут быть изучены на предмет возможности их использования в целях настоящего изобретения. Комбинаторные библиотеки могут быть созданы для многих типов соединений, которые могут быть синтезированы в несколько этапов. К указанным соединениям относятся полипептиды, бета-обратные миметики, полисахариды, фосфолипиды, гормоны, простагландины, стероиды, ароматические соединения, гетероциклические соединения,бензодиазепины, олигомерные N-замещенные глицины и олигокарбаматы. Большие комбинаторные библиотеки соединений могут быть сконструированы с помощью метода кодируемых синтетических библиотек (ESL, от англ. Encoded Synthetic Libraries), описанного Affymax, WO 95/12608, Affymax,WO 93/06121, Columbia University, WO 94/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 и Scripps, WO 95/30642 (все указанные заявки включены в настоящее изобретение в качестве ссылок). Пептидные библиотеки также могут быть созданы с помощью фагово-дисплейного метода. См., например, Devlin, WO 91/18980. Комбинаторные библиотеки и другие соединения первоначально скринируют на их способность связываться с антителами или лимфоцитами (В или Т), специфичными для альфа-SN или других компонентов телец Леви. Например, первоначальные тесты могут быть осуществлены с любым поликлональным сывороточным или моноклональным антителом к альфа-SN или его фрагменту. Предпочтительно библиотеки скринируют на их способность связываться с антителами, которые, в свою очередь, специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 или 70-140 -синуклеина человека. Затем соединения могут быть скринированы на специфическое связывание со специфическими эпитопами альфа-SN (например, SN1-20, SN83-101, SN107-125, SN110-128 и SN124-140). Соединения могут быть тестированы с помощью тех же методик, которые описаны для картирования специфичности эпитопов антител. Соединения, идентифицированные с помощью таких методик, затем дополнительно анализируют на их способность индуцировать образование антител или реактивных лимфоцитов к альфа-SN или его фрагментам. Например, множественные разведения сыворотки могут быть протестированы на планшетах для микротитрования, которые предварительно покрывают альфа-SN или его фрагментами, а для определения реактивных антител к альфа-SN или его фрагментам может быть осуществлена стандартная ELISA. Затем изучают профилактическую и терапевтическую эффективность соединений на трансгенных животных, предрасположенных к развитию заболевания, ассоциированного с наличием телец Леви, как описано в примерах. К указанным трансгенным животным относятся, например, трансгенные мыши, избыточно экспрессирующие альфа-SN или его мутантные формы (например, замена аланина на треонин в положении 53), как описано, например, в заявке WO 98/59050, Masliah, et al., Science 287:1265-1269(2000) и van der Putter, et al., J. Neuroscience 20:6025-6029 (2000), или такие трансгенные мыши, которые также избыточно экспрессируют АРР или его мутантные формы. Наиболее предпочтительными являются такие трансгенные мыши, которые несут 717 мутацию АРР, описанные Games et al., Nature 373, 523(1995), а также трансгенные мыши, несущие Шведскую мутацию 670/671 АРР, как описано McConlogueal., Neuron, 19, 939-945 (1997. Примеры указанных синуклеин/АРР трансгенных животных описаны в заявке WO 01/60794. Дополнительными животными моделями PD являются 6-гидроксидопармин, ротенон и 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МРТР), М. Flint Beal., Nature Reviews Neuroscience,- 16013752 2:325-334 (2001). Аналогичный подход может использоваться для анализа других потенциальных аналогов альфа-SN и более длинных пептидов, включая фрагменты альфа-SN, описанные выше, и другие компоненты телец Леви, а также их аналоги и фрагменты.i) Активная иммунизация для инициации иммунного ответа к эпитопам на обоих концах-синуклеина в головном мозге трансгенных мышей, избыточно экспрессирующих -синуклеин человека (см., например, пример DC). На основании указанного открытия было сделано предположение о том,что индукция иммунного ответа к эпитопам на обоих концевых участках -синуклеина будет являться более эффективной для профилактики и лечения. Таким образом, согласно одному своему аспекту настоящее изобретение относится к способу профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге, заключающемуся в индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 или, альтернативно, по остаткам 1-10 -синуклеина человека и с эпитопом по остаткам 70-140-синуклеина человека. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения иммунный ответ включает образование антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека и остаткам 120-140 -синуклеина человека. Иммунный ответ, который включает образование антител к эпитопам на обоих концевых участках белка, может быть обозначен как "двойной" иммунный ответ. Двойной иммунный ответ может быть индуцирован различными способами, настоящее изобретение не ограничивается каким-либо определенным способом индукции указанного иммунного ответа. Двойной иммунный ответ может быть индуцирован путем вакцинации единичным полипептидом,который является эффективным в отношении индукции иммунного ответа с образованием антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека, и антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 70-140 -синуклеина человека. Согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения антитела специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-10 и/или по остаткам 120-140 -синуклеина человека. Также может использоваться полипептид, не имеющий в своем составе по крайней мере остатков 25-69 -синуклеина человека, по крайней мере остатков 30-110 -синуклеина человека или по крайней мере остатков 21-119 -синуклеина человека. Когда используются указанные полипептиды, в иммунном ответе не участвуют антитела, специфически связывающиеся с эпитопом по остаткам 25-68 -синуклеина человека. Двойной иммунный ответ также может быть индуцирован путем вакцинации комбинацией двух(или более) полипептидов, при этом один полипептид индуцирует иммунный ответ, включающий образование антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека, а другой полипептид индуцирует иммунный ответ, включающий образование антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 70-140 -синуклеина человека. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения антитела специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-10 и/или по остаткам 120-140 -синуклеина человека. Таким образом, лечебный или профилактический эффект может быть достигнут введением первого иммуногенного фрагмента -синуклеина, который индуцирует иммунный ответ с образованием антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека, и второго иммунного фрагмента, который индуцирует иммунный ответ с образованием антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 70-140 (или 120-140) -синуклеина человека. Фрагменты -синуклеина человека могут вводиться в комбинации, как описано выше (например, вводиться в форме белка слияния или конъюгата, в составе одной лекарственной формы или во время одного курса лечения).ii) Композиции и наборы. Настоящее изобретение относится к композициям, полезным для индукции иммунного ответа к эпитопам обоих концевых участков -синуклеина. Композиции содержат дозированные формы и лекарственные формы, включающие два или более полипептида, как описано выше, при этом один полипептид индуцирует иммунный ответ с образованием антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека, и антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 70-140 -синуклеина человека. Согласно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения полипептиды индуцируют образование антител, которые специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-10 и/или по остаткам 120-140 -синуклеина человека. Примерные композиции (подходящие для совместного применения полипептидов) известны специалистам в данной области и включают те, которые описаны ниже в разделе VII ("Лечебные режимы").- 17013752 Настоящее изобретение также относится к наборам для индукции иммунного ответа к эпитопам обоих концевых участках -синуклеина. Указанные наборы включают два или более агента, которые индуцируют иммунный ответ с образованием антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека, и антител, специфически связывающихся с эпитопом по остаткам 70-140 -синуклеина человека. Агенты могут быть скомбинированы в одной лекарственной форме для одновременного введения. Агенты могут находиться в составе различных контейнеров (например, флаконах, шприцах, тюбиках и т.п.), каждый из которых содержит свой полипептид, для одновременного,последовательного или раздельного введения. Указанные агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут также вводиться в комбинации с другими агентами, которые, по крайней мере частично, эффективны для лечения заболеваний с тельцами Леви. Наборы также могут содержать агенты, которые усиливают прохождение агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением,через гематоэнцефалический барьер, а также другие адъюванты и материалы для введения пациенту. 2. Агенты для индукции пассивного иммунного ответа. К терапевтическим агентам, заявленным в соответствии с настоящим изобретением, также относятся антитела, которые специфически связываются с альфа-SN или другими компонентами телец Леви. Настоящее изобретение также относится к антителам, которые специфически связываются с NAC компонентом синуклеина амилоидной бляшки. Антитела, иммунореактивные в отношении альфа-SN, хорошо известны специалистам (см., например, Arima, et al., Brian Res. 808:93-100 (1988); Crowther et al.,Neuroscience Lett. 292:128-130 (2000); Spillantini, et al. Nature 388:839-840 (1997). Указанные антитела могут быть поликлональными и моноклональными. Некоторые из указанных антител специфически связываются с нерастворимыми агрегатами альфа-SN без специфического связывания с растворимыми мономерными формами. Некоторые антитела специфически связываются с растворимыми мономерными формами без специфического связывания с нерастворимыми агрегированными формами. Некоторые антитела специфически связываются как с растворимыми мономерными формами, так и с нерастворимыми формами. Некоторые указанные антитела специфически связываются с природными короткими формами альфа-SN (например, NAC) без специфического связывания с природным полноразмерным альфа-SN. Некоторые антитела специфически связываются с полноразмерной формой без связывания с короткой формой альфа-SN. Некоторые антитела специфически связываются с альфа-SN без связывания с другими компонентами LBs. Некоторые антитела специфически связываются с альфа-SN без специфического связывания с другими компонентами амилоидных бляшек. См. заявку РСТ WO 05/0138889 и заявку на патент US60/471929 от 19 мая 2003 г., которые включены в настоящее описание в качестве ссылок; в указанных заявках раскрываются специфические антитела, которые специфически связываются с фрагментами -синуклеина без специфического связывания непосредственно с интактным -синуклеином. Указанные антитела являются полезными для профилактики и лечения синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний. В экспериментах, осуществленных для раскрытия настоящего изобретения, predictive ex vivo анализ(пример VII) используют для тестирования антитела, специфически связывающегося с NAC компонентом синуклеина. Обеспечивают контакт антитела к NAC с образцом ткани головного мозга, содержащим амилоидные бляшки и микроглиальные клетки. В качестве контроля используют сыворотку кролика. Последующий мониторинг выявил значительное уменьшение количества и размеров бляшек, что свидетельствует об "очищающем" эффекте антитела. Из представленных данных можно сделать вывод, что амилоидная нагрузка, ассоциированная с болезнью Альцгеймера и другими амилоидными заболеваниями, может быть значительно уменьшена путем применения иммунных агентов, направленных против эпитопов NAC, которые являются эффективными в отношении уменьшения амилоидной нагрузки. Также понятно, что в указанных композициях может использоваться широкий спектр антител. Как обсуждалось выше, заявка на патентUS60/471929 от 19 мая 2003 г., раскрывает специфические антитела, которые специфически связываются с фрагментами -синуклеина без специфического связывания с интактным -синуклеином per se. Антитела, используемые в лечебных целях, обычно имеют интактный константный участок или по крайней мере достаточную часть константного участка для взаимодействия с Fc-рецептором. ИзотипIgG1 человека является предпочтительным, поскольку он имеет наиболее высокую аффинность по отношению к FcRI-рецептору фагоцитарных клеток из всех изотипов человека. Также могут использоваться биспецифические Fab-фрагменты, в которых одно плечо антитела является специфичным для альфа-SN,а другое - для Fc-рецептора. Некоторые антитела связываются с альфа-SN, возможно в денатурированной форме, таким образом, что при обработке SDS аффинность связывания достигает 106, 107, 108, 109 или 1010 М-1 и более. Некоторые антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, специфически связываются с -синуклеином человека в синапсах или телах нейрональных клеток, что определяется с помощью иммуноцитогистохимических способов.- 18013752 Поликлональная сыворотка обычно содержит смешанные популяции антител, связывающихся с несколькими эпитопами на протяжении альфа-SN. Однако поликлональная сыворотка может быть специфичной по отношению к определенному сегменту альфа-SN, такому как NAC. Поликлональная сыворотка, которая является специфичной по отношению к определенному сегменту, содержит антитела, которые специфически связываются с указанным сегментом, и не содержит антител, которые специфически связываются с другими сегментами альфа-SN. Моноклональные антитела связываются со специфическим эпитопом альфа-SN, который может представлять собой конформационный и неконформационный эпитоп. Неконформационные эпитопы сохраняются при денатурации альфа-SN SDS. Профилактическая и терапевтическая эффективность антител может быть оценена с использованием методик на модельных трансгенных животных, как описано ниже в примерах. Некоторые моноклональные антитела связываются с эпитопом участка NAC. Согласно некоторым способам используют множественные моноклональные антитела, обладающие специфичностью связывания по отношению к различным эпитопам. Такие антитела могут вводиться одновременно или последовательно. Также могут использоваться антитела к другим компонентам телец Леви, отличным от альфа-SN. Например, антитела могут быть направлены против нейрофиламента, убиквитина или синфилина. К терапевтическим агентам также относятся антитела, направленные против аналогов альфа-SN и его фрагментов. Некоторые терапевтические агенты,заявленные в соответствии с настоящим изобретением, все, представляют собой D-пептиды, например все - D-альфа-SN или все - D-NAC. Когда говорят о том, что антитело связывается в эпитопом по специфическим остаткам, таким как,например, альфа-SN1-5, это означает, что антитело специфически связывается с полипептидом, в составе которого имеются указанные остатки (т.е. с альфа-SN1-5, как в данном примере). Указанное антитело необязательно вступает в контакт с каждым из остатков 1-5, также как не каждая единичная аминокислотная замена или делеция в пределах альфа-SN1-5 обязательно существенно влияет на афинность связывания. Эпитопная специфичность антитела может быть определена, например, путем формирования фагово-дисплейной библиотеки, разные члены которой представляют различные последовательности альфа-SN. Затем из фагово-дисплейной библиотеки выбирают те члены, которые специфически связываются с тестируемым антителом. Семейство последовательностей изолируют. Обычно указанное семейство включает общую основную последовательность и различные по длине и фланкирующие последовательности других членов библиотеки. Самая короткая основная последовательность, демонстрирующая специфическое связывание с антителом, представляет собой эпитоп, связываемый антителом. Эпитопная специфичность антител также может быть определена с помощью анализа конкурентного связывания с использованием антител, чья эпитопная специфичность уже была установлена. Некоторые антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, специфически связываются с эпитопом участка NAC. Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом гликозилированной формы синуклеина массой 22 кДа, например Р 22-синуклеином (Н. Shimura et al., Science 2001 Jul. 13:293 (5528):224-5). Некоторые антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, связываются с эпитопом на N-концевом участке альфа-SN (например, с эпитопом по аминокислотным остаткам 1-20 или остаткам 1-10 -синуклеина, пронумерованным в соответствии с SEQ ID NO:1). Некоторые антитела связываются с эпитопом, в котором N-концевой остаток представляет собой N-концевой участок полноразмерного альфа-SN. Указанные антитела не связываются с делеционными мутационными формами-синуклеина, в которых отсутствует 1 остаток. Некоторые из указанных антител не связываются с полноразмерным -синуклеином, в котором N-концевая аминокислота связана с гетерологичным полипептидом. Некоторые антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, специфически связываются с эпитопом по остаткам 1-69 или 1-20 -синуклеина человека. Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом сегмента -синуклеина человека, выбранного из остатков 1-Na последовательности SEQ ID NO:1, где Na составляет от 5 до 20; остатков 2-Nb последовательности SEQ ID NO:1,где Nb составляет от 6 до 21; или остатков 3-Nc последовательности SEQ ID NO:3, где Nc составляет от 7 до 22. Некоторые антитела связываются с эпитопом сегмента -синуклеина, выбранного из группы,включающей SN1-5, SN1-6, SN1-7, SN1-8, SN1-9, SN1-10, SN1-11, SN1-12, SN1-13, SN1-14, SN1-15,SN1-16, SN1-17, SN1-18, SN1-19 и SN1-20. Некоторые антитела связываются с эпитопом, расположенным на или около С-концевого участка альфа-SN (например, по аминокислотным остаткам 70-140, 100-140, 120-140, 130-140 или 135-140). Некоторые антитела связываются с эпитопом, в котором С-концевой аминокислотный остаток представляет собой С-концевой остаток (полноразмерного) альфа-SN. Указанные антитела не связываются с делеционными мутантами -синуклеина, в которых отсутствует 140 остаток. Некоторые из указанных антител не связываются с полноразмерным -синуклеином, в котором С-концевая аминокислота связана с гетерологичным полипептидом. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения антитело специфически связывается с NAC без связывания с полноразмерным альфа-SN.- 19013752 Некоторые антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, специфически связываются с эпитопом по остаткам 70-140 или 83-140 -синуклеина человека. Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом по остаткам 120-140 -синуклеина человека. Некоторые антитела специфически связываются с эпитопом сегмента -синуклеина человека, выбранным из группы, включающей 83-101,107-125, 110-128 и 124-140. Некоторые антитела связываются с эпитопом сегмента -синуклеина человека, выбранным из группы, включающей SN124-140, SN125-140, SN126-140, SN127-140,SN128-140, SN129-140, SN130-140, SN131-140, SN132-140, SN133-140, SN134-140, SN135-140,SN136-140, SN137-140, SN124-139, SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN124-139,SN125-139, SN126-139, SN127-139, SN128-139, SN129-139, SN130-139, SN131-139, SN132-139,SN133-139, SN134-139, SN135-139, SN136-139, SN137-139, SN124-138, SN124-138, SN125-138,SN126-138, SN127-138, SN128-138, SN129-138, SN130-138, SN131-138, SN131-138, SN132-138,SN133-138, SN134-138, SN135-138, SN136-138, SN124-137, SN125-137, SN126-137, SN127-137,SN128-137, SN129-137, SN130-137, SN131-137, SN132-137, SN133-137, SN134-137, SN135-137,SN124-136, SN125-136, SN126-136, SN127-136, SN128-136, SN129-136, SN130-136, SN131-136,SN132-136, SN133-136 и SN143-136. Моноклональные антитела, связывающиеся с С-концевыми эпитопами, предпочтительно связываются с -синуклеином человека с высокой аффинностью, составляющей по крайней мере 108, 109 или 1010 М-1. Моноклональные или поликлональные антитела, которые специфически связываются с предпочтительным сегментом альфа-SN без специфического связывания с другими участками альфа-SN, имеют ряд преимуществ по сравнению с моноклональными антителами, связывающимися с другими участками или поликлональной сывороткой к интактному альфа-SN. Во-первых, для равных массовых дозировок дозы антител, которые специфически связываются с предпочтительными сегментами, включают более высокие молярные дозировки антител, эффективных для растворения амилоидных бляшек. Во-вторых, антитела, специфически связывающиеся с предпочтительными сегментами, могут индуцировать иммунный ответ, способствующий исчезновению LBs, без индукции иммунного ответа к интактному альфа-SN, что приводит к уменьшению вероятности возникновения побочных эффектов. Профилактическая или терапевтическая активность антител может быть протестирована на трансгенных животных, моделях заболеваний с LBs, как описано выше. Коллекция антител может быть также предварительно протестирована на наличие контрольного связывания с денатурированным-синуклеином или его фрагментом. Контрольные аффинности связывания могут быть определены на основании контрольной интенсивности сигналов в иммуноблоттинге. Антитело, имеющее контрольную аффинность связывания, превышающую среднюю величину, или предпочтительно антитело, имеющее наибольшую установленную аффинность связывания, отбирают для дальнейшего анализа на трансгенных животных. Аналогичное предварительное скринирование может быть осуществлено для тестирования антител на предмет связывания с агрегированным -синуклеином в тканевых срезах с помощью иммуногистохимических способов. Тканевые срезы могут быть приготовлены из головного мозга больных людей или модельных трансгенных животных. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения антитело, обозначаемое как 6 Н 7, или антитело, которое конкурирует с 6 Н 7 за специфическое связывание с -синуклеином, используется для пассивной иммунизации. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения антитело, обозначаемое как 8 А 5, или антитело, которое конкурирует с 8 А 5 за специфическое связывание с -синуклеином, используется для пассивной иммунизации. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящего изобретения 6 Н 7 или 8 А 5 используют в комбинации друг с другом или с другими антителами к -синуклеину.i) Активная иммунизация для индукции иммунного ответа, направленного против эпитопов на обоих концевых участках -синуклеина. Как описано в настоящем изобретении, введение антител, распознающих эпитопы на аминоконцевых и карбоксиконцевых участках -синуклеина (например, 8 А 5 или 6 Н 7), приводит к уменьшению агрегации -синуклеина в головном мозге трансгенных мышей, избыточно эксперессирующих-синуклеин человека (см. пример IX). На основании указанного открытия авторами было сделано предположение, что введение комбинации антител, которые распознают N-концевой эпитоп (например, как описано выше), и антител, которые распознают С-концевой эпитоп (например, как описано выше), будет особенно эффективным для профилактики и лечения. Следовательно, согласно одному своему аспекту настоящее изобретение относится к способу профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге, который заключается во введении пациенту, страдающему от указанного заболевания или имеющему риск его развития, первого антитела, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 1-20 -синуклеина человека, остатки пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO:1, и второго антитела, которое специфически связывается с эпитопом по остаткам 70-140 -синуклеина человека, в эффективном режиме. Предпочтительно первое- 20013752 антитело связывается с эпитопом -синуклеина с последовательностью, состоящей из остатков 1-Na SEQ ID NO:1, где Na составляет от 5 до 20; с последовательностью остатков 2-Nb SEQ ID NO:1, гдеNb составляет от 6 до 21; и/или с последовательностью остатков 3-Nc SEQ ID NO:1, где Nc составляет от 7 до 22. Предпочтительно второе антитело специфически связывается с эпитопом по остаткам 120-140-синуклеина человека. Первое и второе антитела могут вводиться одновременно (например, в составе одной лекарственной формы), в один день, в один месяц и/или во время одного курса лечения.ii) Композиции и наборы. Настоящее изобретение относится к композициям для профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге, включающей одно или более антитело, которое связывается с концевым участком -синуклеина и, например, имеет специфичность, как описано выше. Композиции включают дозированные формы и лекарственные формы, содержащие два и более антитела. Примерные лекарственные формы (подходящие для одновременного введения антител) хорошо известны специалистам в данной области и включают лекарственные формы, описанные в разделе VII ("Лечебные режимы"). Настоящее изобретение также относится к наборам для профилактики и лечения заболевания, характеризующегося образованием телец Леви или агрегацией -синуклеина в головном мозге. Указанные наборы содержат два (или более) антитела, при этом первое антитело связывается с эпитопом наN-концевом участке -синуклеина человека, а второе антитело связывается с эпитопом на С-концевом участке -синуклеина человека. Указанные антитела могут быть объединены в одной лекарственной форме или в одном наборе для одновременного введения. Альтернативно, антитела могут находиться в разных контейнерах (например, фалконах, шприцах, тюбиках и т.д.) в составе набора для одновременного, последовательного или раздельного использования. Указанные антитела могут также вводиться в комбинации с другими агентами, которые, по крайней мере частично, эффективны для лечения заболеваний с образованием телец Леви. Набор также может содержать агенты, которые улучшают прохождение антител, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, через гемато-энцефалический барьер, а также другие адъюванты и материалы для введения пациенту.iii) Общая характеристика иммуноглобулинов. Основная структурная единица антитела, как известно, представляет собой тетрамер субъединиц. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая из пар имеет одну"легкую" (около 25 кДа) и одну "тяжелую" цепь (около 50-70 кДа). Аминоконцевой отдел каждой из цепей имеет вариабельный участок, состоящий приблизительно из 100-110 или более аминокислот, который отвечает, в первую очередь, за распознавание антигена. Карбоксиконцевой отдел каждой цепи включает константный участок, отвечающий главным образом за эффекторную функцию. Легкие цепи классифицируют на две группы: каппа и лямбда. Тяжелые цепи классифицируют на гамма, мю, альфа, дельта и ипсилон цепи, в соответствии с чем разделяют следующие изотипы антител:IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно. В составе легких и тяжелых цепей вариабельный и константный участки соединены участком "J", состоящим приблизительно из 12 аминокислот, при этом тяжелые цепи также имеют "D" участок, состоящий приблизительно из 10 или более аминокислот (см. в общемFundamental Immunology, Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y., 1989, Ch. 7 (включена в настоящее описание в качестве ссылки). Вариабельные участки каждой пары легкой/тяжелой цепей формируют антигенсвязывающий сайт антитела. Таким образом, интактное антитело имеет два связывающих сайта. За исключением бифункциональных или биспецифических антител указанные два связывающих сайта являются одинаковыми. Все цепи имеют одинаковую общую структуру относительно консервативных каркасных участков (FR,от англ. Framework Region), связанных тремя гипервариабельными участками, которые также обозначают как участки, определяющие комплементарность или CDRs (от англ. Complementarity DetermingRegion). CDRs двух цепей каждой пары сближены за счет каркасных участков, что обеспечивает связывание со специфическим эпитопом. От N-концевого участка до С-концевого участка обе, легкая и тяжелая, цепи включают следующие домены: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Распределение аминокислот в каждом домене соответствует тому, что приведено у Kabat, Sequences of Proteins ofiv) Получение нечеловеческих антител. Химерные и гуманизированные антитела имеют такую же или аналогичную специфичность связывания и аффинность, как и мышиные или другие нечеловеческие антитела, которые являются стартовым материалом для конструирования химерных или гуманизированных антител. Химерные антитела представляют собой антитела, чьи гены тяжелых и легких цепей были выделены, обычно с помощью генной инженерии, из генных сегментов иммуноглобулинов, принадлежащих другим видам животных. Например, вариабельные (V) сегменты генов моноклональных антител мышей могут быть присоединены к константным (С) сегментам человека, таким как IgG1 и IgG4. Изотип IgG1 человека является предпочтительным. Согласно некоторым способам изотипом антитела является IgG1 человека. Также согласно не- 21013752 которым способам могут использоваться антитела класса М. Типичное химерное антитело представляет собой гибридный белок, состоящий из V или антигенсвязывающего домена мышиного антитела и С или эффекторного домена антитела человека. В гуманизированных антителах каркасные аминокислотные остатки вариабельного участка почти полностью заменены остатками из антитела человека (обозначаемого как акцепторное антитело), а участки, определяющие комплементарность выделены из мышиного антитела (обозначаемого как донорский иммуноглобулин). См., Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989), WO 90/07861,US 5693762, US 5693761, US 5585089, US 5530101 и Winter, US 5225539 (все документы приведены здесь в качестве ссылок). Константные участки, в случае их наличия, также частично или полностью представлены участками иммуноглобулина человека. Человеческие вариабельные домены обычно выбирают из антител человека, чьи каркасные последовательности имеют высокий процент идентичности с мышиными вариабельными доменами, из которых получают CDRs. Каркасные аминокислотные остатки вариабельных участков тяжелых и легких цепей могут быть выделены из одинаковых или различных последовательностей антител человека. Последовательность антитела человека может представлять собой последовательность природных антител человека или может представлять собой последовательность, сконструированную из нескольких антител человека. См. Carter et al., WO 92/22653. 3. Фагово-дисплейные способы. Другой подход для получения человеческих анти-альфа-SN антител заключается в скринировании библиотеки ДНК из В-клеток человека в соответствии с общим протоколом, изложенным Huse et al.,Science, 246:1275-1281 (1989). Как было описано для триомной методики, указанные В-клетки могут быть получены из организма человека, иммунизированного альфа-SN, его фрагментом, более длинным полипептидом, имеющим в своем составе альфа-SN или его фрагменты, или антиидиотипическим антителом. В-клетки также могут быть получены из организма человека, который в будущем будет получать лечение указанными антителами. Антитела, связывающиеся с альфа-SN или его фрагментом, отбирают. Последовательности, кодирующие указанные антитела (или связывающие фрагменты), затем клонируют и амплифицируют. Методика, описанная Huse, наиболее эффективна в комбинации с фагово-дисплейной методикой. См., например, Dower et al., WO 91/17271 и McCafferty et al., WO 92/01407, US 5877218,US 5871907, US 5858657, US 5837242, US 5733743 и US 5565332 (все источники приведены здесь в качестве ссылок). Согласно указанным способам создают фаговые библиотеки, члены которых экспонируют различные антитела на своей внешней поверхности. Антитела обычно представлены как Fv- илиFb-фрагменты. Фаги, экспонирующие антитела с желаемой специфичностью, отбирают с помощью аффинного обогащения с использованием альфа-SN пептида или его фрагмента. С помощью одного из вариантов фагово-дисплейного способа можно получить человеческие антитела, обладающие специфичностью связывания отобранного мышиного антитела. См. Winter,WO 92/20791. Согласно указанному способу в качестве стартового материала используют вариабельные участки как легких, так и тяжелых цепей отобранного мышиного антитела. В том случае, если в качестве стартового материала выбирают вариабельный участок легкой цепи, фаговую библиотеку конструируют так, чтобы ее члены экспонировали тот же вариабельный участок легкой цепи (т.е. в качестве стартового материала используют мышиное антитело) и другой вариабельный участок тяжелой цепи. Вариабельные участки тяжелой цепи получают из библиотеки перегруппированных вариабельных участков тяжелых цепей антител человека. Фаг, демонстрирующий сильную специфичность связывания с альфа-SN (например, по крайней мере 108 М-1 и предпочтительно по крайней мере 109 М-1), отбирают. Вариабельный участок тяжелой цепи человека указанного фага затем используют в качестве стартового материала для конструирования дополнительной фаговой бибилиотеки. В указанной библиотеке каждый фаг экспонирует такой же вариабельный участок тяжелой цепи (т.е. участок, идентифицированный в первой фаговой-дисплейной библиотеки) и другой вариабельный участок легкой цепи. Вариабельные участки легкой цепи получают из библиотеки перегруппированных вариабельных участков легких цепей антител человека. Аналогично, фаг, демонстрирующий сильную специфичность связывания с альфа-SN, отбирают. Указанный фаг экспонирует вариабельные участки полностью человеческих анти-альфа-SN антител. Указанные антитела обычно имеют такую же или аналогичную эпитопную специфичность, как и стартовые мышиные антитела.i) Отбор константных участков. Вариабельные участки тяжелых и легких цепей химерных, гуманизированных или человеческих антител могут быть соединены по крайней мере с частью константных участков человека. Выбор константного участка зависит частично от того, требуется ли антитело-зависимая комплемент- и/или клеточноопосредованная токсичность. Например, изотипы IgG1 и IgG3 обладают способностью активировать комплемент, а изотипы IgG2 и IgG4 - нет. Выбор изотипа также может повлиять на прохождение антитела через гематоэнцефалический барьер. Антитела могут экспрессироваться как тетрамеры, содержащие две легкие и две тяжелые цепи, как отдельные тяжелые цепи, легкие цепи, Fab, Fab' F(ab')2 иFv-фрагменты, как одноцепочечные антитела, в которых вариабельные домены легких и тяжелых цепей соединены через спейсер.ii) Экспрессия рекомбинантных антител. Химерные, гуманизированные и человеческие антитела обычно получают с помощью рекомбинантной экпрессии. Рекомбинантные полинуклеотидные конструкты обычно включают последовательность контроля экспрессии, оперативно связанную с последовательностью, кодирующей цепи антитела,включая природные ассоциированные и гетерологичные промоторные участки. Предпочтительно последовательности контроля экспрессии являются эукариотическими промоторными системами в векторах,способных трансформировать или трансфецировать эукариотические клетки-хозяева. После того как вектор был включен в организм подходящего хозяина, для хозяина поддерживают условия, подходящие для высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, а также для отбора и очищения перекрестно-реагирующих антител. Указанные векторы экспрессии обычно являются реплицируемыми в организмах хозяев как эписомы и как интегральная часть хромосомальной ДНК хозяина. Обычно векторы экспрессии имеют маркеры селекции, например устойчивость к ампициллину или гидромицину, что позволяет установить те клетки,которые были трансформированы желаемой ДНК последовательностью.E.coli представляет собой пример прокариотической клетки-хозяина, которая особенно приемлема для клонирования ДНК последовательностей, заявленных в соответствии с настоящим изобретением. Микробы, такие как, например, дрожжи, также подходят для экспрессии. Сахаромицеты являются предпочтительными дрожжевыми клетками-хозяевами с подходящими векторами, включающими последовательность контроля экспрессии, точку начала репликации, терминирующие последовательности и пр.,при необходимости. К типичным промоторам относятся 3-фосфоглицераткиназа и другие гликолитические ферменты. К индуцибельным дрожжевым промоторам относятся, среди прочих, промоторы из алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома С и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. Клетки млекопитающих являются предпочтительными хозяевами для экспрессии нуклеотидных последовательностей, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты. См. Winnacker, From Genes toClones (VCH Publishers, NY, 1987). В настоящее время был создан целый ряд подходящих клеточных линий, способных секретировать интактные гетерологичные белки, примерами являются клеточные линии СНО, различные клеточные линии COS, HeLa клетки, L-клетки, эмбриональные почечные клетки человека и миеломные клеточные линии. Предпочтительно, клетки имеют нечеловеческую природу. Векторы экспрессии для указанных клеток могут включать последовательности контроля экспрессии,такие как точка начала репликации, промотор, энхансер (Queen et al., Immunol. Rev. 89:49 (1986, а также необходимые информационные сайты процессинга, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминирования транскрипции. Предпочтительные последовательности контроля экспрессии представляют собой промоторы, выделенные из эндогенных генов, цитомегаловируса, SV40, аденовируса, папилломавируса коров и т.д. См. Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992). Альтернативно, последовательности, кодирующие антитела, могут быть включены в трансгены для встраивания в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке трансгенного животного (см., например, US 5741957, US 5304489, US 5849992). К подходящим трансгенам относятся последовательности, кодирующие легкие и/или тяжелые цепи, оперативно связанные с промотором или энхансером из специфического гена железы млекопитающего, такого как ген казеина или лактоглобулина. Векторы, содержащие ДНК сегменты, представляющие интерес, могут быть перенесены в клеткухозяин с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области, в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, перенос с помощью хлорида кальция обычно используют для прокариотических клеток, в то время как обработка фосфатом кальция, электропорация, липофекция, биолистика или вирус-опосредованная трансфекция используются для других клеток-хозяев. К другим способам, используемым для трансформации клеток млекопитающих, относятся использование полибрена, протопластическое слияние, липосомы, электропорация и микроинъекция (см., Sambrook et al., supra). Для получения трансгенных животных трансгены могут быть микроинъецированы в оплодотворенные ооциты или включены в геном эмбриональных стволовых клеток, а ядра указанных клеток переносят в энуклеированные ооциты. После экспрессии антитела могут быть очищены с помощью стандартных методик, хорошо известных специалистам в данной области, включая HPLC очищение, хроматографию на колонке, электрофорез в геле и т.д. (см. Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, NY, 1982. 4. Конъюгаты. Некоторые агенты для индукции иммунного ответа имеют в своем составе подходящий эпитоп для индукции иммунного ответа к LBs, но являются слишком маленькими молекулами для того, чтобы быть иммуногенными. В таком случае пептидный иммуноген может быть соединен с подходящей молекулой носителя с формированием конъюгата, который будет способствовать индукции иммунного ответа. К подходящим носителям относятся альбумины сыворотки, гемоцианин моллюска фисуреллы, молекулы иммуноглобулинов, тиреоглобулин, овальбумин, столбнячный токсин или токсин другой патогенной бактерии, такой как бактерии дифтерии, Е.coli, холера или Н.pylori, или аттенуированные производные токсинов. Эпитопы Т-клеток также являются подходящими носителями. Некоторые конъюгаты могут- 23013752 быть сформированы путем связывания агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, с иммуностимулирующей полимерной молекулой (например, трипальмитоил-S-глицерин цистеином(Pam3Cys), маннаном (полимером маннозы) или гликаном (бета 12 полимером, цитокинами (например, IL-1, IL-1 альфа и бета-пептиды, IL-2, гамма-INF, IL-10, GM-CSF) и хемокинами (например, MIP1 альфа и бета и RANTES). Иммуногенные агенты также могут быть соединены с пептидами, которые усиливают проникновение в ткани, как описано у O'Mahony, WO 97/17613 и WO 97/17614. Иммуногены могут быть присоединены к носителям, имеющим в своем составе спейсерные аминокислоты (например,gly-gly) или не имеющим их. Некоторые конъюгаты могут быть сформированы путем связывания агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, по крайней мере с одним Т-клеточным эпитопом. Некоторые Т-клеточные эпитопы являются "промискуитетными", в то время как другие являются универсальными. Промискуитетные Т-клеточные эпитопы обладают способностью усиливать индукцию Т-клеточного иммунитета у большого круга субъектов, демонстрирующих различные HLA типы. В отличие от "промискуитетных" Т-клеточных эпитопов универсальные Т-клеточные эпитопы обладают способностью усиливать индукцию Т-клеточного иммунитета у большого процента (по крайней мере у 75%) субъектов, экспонирующих различные HLA молекулы, кодируемые различными HLA-DR аллелями. Известно большое количество природных Т-клеточных эпитопов, например столбнячный токсин(например, эпитопы Р 2 и Р 30), поверхностный антиген вируса гепатита В, коклюшный токсин, F белок вируса кори, большой основной мембранный белок Chlamydia trachomatis, дифтеритический токсин,циклоспорозоит Т.Plasmodium falciparum, CS антиген Plasmodium falciparum, триозофосфатизомеразаSchistosoma mansoni, TraT E.coli, гемаглюттинин вируса гриппа (НА). Иммуногенные пептиды, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, также могут быть конъюгированы с Т-клеточными эпитопами, описанными Sinigaglia F. et al., Nature, 336:778-780 (1988); Chicz R.M. et al., J. Exp. Med., 178:2747 (1993); Hammer J. et al., Cell, 74: 197-203 (1993); Falk K. et al., Immunogenetics, 39:230-242 (1994);WO 98/23635; Southwood S. et al., J. Immunology, 160:3363-3373 (1998) - все источники литературы приведены здесь в качестве ссылок. Другими примерами являются Альтернативно, конъюгаты могут быть сформированы путем связывания агентов, заявленных в соответствии с настоящим изобретением, по крайней мере с одним Т-клеточным эпитопом, способным связывать большую часть молекул МНС II класса, таким как эпитоп pan DR ("PADRE"). PADRE описан в патенте US 5736142 и заявке WO 95/07707, а также у Alexander J. et al., Immunity, 1:751-762 (1994), все источники литературы представлены здесь в качестве ссылок. Предпочтительный пептид PADRE имеет последовательность AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO:12) (типичные остатки выделены жирным шрифтом), где X предпочтительно представляет собой циклогексилаланин, тирозин или фенилаланин, при этом циклогексилаланин является наиболее предпочтительным. Иммуногенные агенты могут быть связаны с носителями с помощью химического перекрестного связывания. Методики связывания иммуногена с носителем включают формирование дисульфидных связей с использованием N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионата (SPDP) и сукцинимидил-4-(Nмалеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) (в том случае, если в пептиде отсутствует сульфигидрильная группа, ее включение может быть обеспечено добавлением остатка цистеина). Указанные реагенты создают дисульфидную связь между собой и обеспечивают включение остатка цистеина на одном белке, а также амидную связь между ипсилон-амино на лизине или другие три свободные аминогруппы на других аминокислотах. Различные дисульфид/амид-формирующие агенты описаны в Immun.Rev. 62, 185 (1982). Другие бифункциональные соединяющие агенты формируют тиоэфиры, равно как и дисульфидные связи. Многие указанные тиоэфир-формирующие агенты являются коммерчески доступными и включают реактивные сложные эфиры 6-малеимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты и 2-йодуксусной кислоты, 4-(N-малеимидо-метил)циклогексан-1-карбоксильной кислоты. Карбоксильные группы могут быть активированы путем их комбинирования с сукцинимидом или 1-гидроксил 2-нитро-4-сульфоновой кислотой, ее натриевой солью.- 24013752 Иммуногенность может быть повышена путем добавления спейсерных остатков (например,Gly-Gly) между Th-эпитопом и пептидным иммуногеном, заявленным в соответствии с настоящим изобретением. Помимо физического разделения Th-эпитопа и В-клеточного эпитопа (т.е. пептидного иммуногена), остатки глицина могут препятствовать образованию искусственных вторичных структур, создаваемых при соединении Th-эпитопа и пептидного иммуногена, что будет препятствовать взаимодействию между Т- и/или В-клеточным иммунным ответом. Конформационное разделение хелперного эпитопа и домена антитела обеспечивает более эффективное взаимодействие присутствующего иммуногена и подходящих Th- и В-клеток. Для того чтобы усилить индукцию Т-клеточного иммунитета у большого процента субъектов, экспонирующих различные типы HLA, к иммуногену, заявленному в соответствии с настоящим изобретением, может быть получена смесь конъюгатов с различными Th-клеточными эпитопами. Смесь может содержать смесь по крайней мере двух конъюгатов с различными Th-клеточными эпитопами, смесь по крайней мере трех конъюгатов с различными Th-клеточными эпитопами или смесь по крайней мере четырех конъюгатов с различными Th-клеточными эпитопами. Смесь может вводиться вместе с адъювантами. Иммуногенные пептиды также могут экспрессироваться как белки слияния с носителями (т.е. как гетерологичные пептиды). Иммуногенный пептид может быть соединен с носителем через аминоконцевой участок, через карбоксиконцевой участок или через оба концевых участка. В белке слияния могут присутствовать множественные повторы иммуногенного пептида. Иммуногенный пептид может быть связан с множественными копиями гетерологичного пептида, например, как на N, так и на С-концевых участках пептида. Некоторые носители обладают способностью индуцировать хелперный Т-клеточный ответ к пептиду-носителю. Индуцированные хелперные Т-клетки, в свою очередь, индуцируют В-клеточный ответ к иммуногенному пептиду, связанному с пептидом-носителем. Некоторые агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают белок слияния, в котором N-концевой фрагмент альфа-SN связан на своем С-концевом участке с пептидомносителем. В указанных агентах N-концевой остаток фрагмента альфа-SN составляет N-концевой остаток белка слияния. Соответственно указанные белки слияния являются эффективными для индукции образования антител, которые связываются с эпитопом, который требует свободного N-концевого остатка альфа-SN. Некоторые агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают множественные повторы NAC, соединенные на С-концевом участке с одной или более копией пептиданосителя. Некоторые белки слияния содержат различные сегменты альфа-SN в тандеме. Некоторые агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают белок слияния, в котором С-концевой фрагмент альфа-SN связан на своем N-концевом участке с пептидомносителем. В указанных агентах С-концевой остаток фрагмента альфа-SN составляет С-концевой остаток белка слияния. Соответственно указанные белки слияния являются эффективными для индукции образования антител, которые связываются с эпитопом, который требует свободного С-концевого остатка альфа-SN. Некоторые агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, включают множественные повторы С-концевого пептида, такого как SN125-140, связанные на N-концевом участке с одной или более копией пептида-носителя. Некоторые белки слияния содержат различные сегменты альфа-SN в тандеме. В некоторых белках слияния NAC на своем N-концевом участке слит с гетерологичным пептидомносителем. NAC может использоваться вместе с С-концевыми слияниями. Некоторые белки слияния включают гетерологичный пептид, связанный с N-концевым участком или С-концевым участком NAC,который, в свою очередь, связан с одним или более дополнительным NAC сегментом альфа-SN в тандеме. Некоторые белки слияния включают множественные копии С-концевого пептида -синуклеина, как описано выше, и множественные копии гетерологичного пептида, связанные между собой. Некоторые примеры белков слияния, подходящих для использования в соответствии с настоящим изобретением, представлены ниже. Некоторые из указанных белков слияния содержат сегменты альфаSN (включая любые фрагменты, описанные выше), связанные с эпитопами столбнячного токсина, как описано в US 5196512, ЕР 378881 и ЕР 427347. Некоторые белки слияния включают сегменты альфа-SN,связанные по крайней мере с одним PADRE. Некоторые гетерологичные пептиды являются "промискуитетными" Т-клеточными эпитопами, в то время как другие гетерологичные пептиды являются универсальными Т-клеточными эпитопами. Согласно некоторым способам осуществления настоящего изобретения агент для введения представляет собой простой белок слияния с сегментом альфа-SN, связанным с гетерологичным сегментом, в линейной конфигурации. Терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть представлены с помощью формулы. Например, согласно некоторым способам агент представляет собой мультимер белков слияния, представленной формулой 2 х,где х представляет собой целое число от 1 до 5. Предпочтительно х равен 1, 2 или 3, где 2 является наиболее предпочтительным. Когда х=2, такой мультимер имеет четыре белка слияния, соединенных в предпочтительной конфигурации, обозначаемой как МАР 4 (см. US 5229490).- 25013752 Конфигурация МАР 4 представлена ниже, где разветвленные структуры образуются путем инициирующего пептидного синтеза на аминах N-концевой и боковой цепей лизина. В зависимости от того,сколько раз остаток лизина включают в последовательность и позволяют ему разветвляться, в конечной структуре будут присутствовать множественные N-концевые участки. В данном примере четыре идентичных N-концевых участка синтезируют на разветвленном лизинсодержащем ядре. Такая множественность значительно усиливает реактивность соответствующих В-клетокZ относится к NAC пептиду, фрагменту NAC пептида или другому активному фрагменту альфа-SN,как описано в разделе I.2;Z может представлять собой более чем один активный фрагмент, например Другими примерами белков слияния являются Пептид PADRE (все в линейной конфигурации), где X предпочтительно представляет собой циклогексилаланин, тирозин или фенилаланин, где циклогексилаланин является наиболее предпочтительным- 26013752 Другими примерами белков слияния являются Похожие или аналогичные белки-носители и методы связывания могут использоваться для создания иммуногенов, применяющихся для индукции иммунного ответа с образованием антител к альфа-SN для пассивной иммунизации. Например, альфа-SN или его фрагмент, связанный с переносчиком, может вводиться в организм лабораторного животного для получения моноклональных антител к альфа-SN. 5. Нуклеиновые кислоты, кодирующие терапевтические агенты. Иммунный ответ, направленный против телец Леви, также может быть индуцирован путем введения нуклеиновых кислот, кодирующих сегменты пептида альфа-SN или его фрагменты, другие иммуногенные пептиды или антитела или компоненты из цепей, используемые для пассивной иммунизации. Указанные нуклеиновые кислоты могут представлять осбой ДНК или РНК. Сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий иммуноген, обычно соединен с регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, которые обеспечивают экспрессию сегмента ДНК в предполагаемых клетках-мишенях пациента. Для непосредственной экспрессии в клетках крови, что является наиболее желательным для индукции иммунного ответа, наиболее подходящими являются промотор и энхансер генов тяжелых или легких цепей иммуноглобулинов или основной промежуточный ранний промотор и энхансер CMV. Соединенные регуляторные последовательности и кодирующие последовательности часто клонируют в векторе. Для введения антител с двойными цепями две цепи могут быть клонированы как в одном, так и в разных векторах. Нуклеиновая кислота, кодирующая терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, может также кодировать по крайней мере один Т-клеточный эпитоп. Представления, изложенные в настоящем описании и касающиеся использования адъювантов могут быть (с известными поправками) справедливы и для использования нуклеиновых кислот, кодирующих терапевтические агенты, заявленные в соответствии с настоящим изобретением. В настоящее время доступно множество вирусных векторных систем, включая ретровирусные системы (см., например, Lawric and Tumin, Cur. Genet. Develop. 3, 102-109 (1993; аденовирусные векторы(см., например, Bett et al., J. Virol. 61, 5911 (1993; аденоассоциированные вирусные векторы (см., например, Zhou et al., J. Exp. Med. 179, 1867 (1994, вирусные векторы из семейства вирусов оспы, включая вирус коровьей оспы и вирусы птичьей оспы, вирусные векторы из семейства альфа вирусов, такие как векторы, полученные из вирусов Sindbis и вируса лихорадки леса Семлики (см., например, Dubensky etal., J. Virol. 70, 508-519 (1996, вирус венесуэльского энцефалита лошадей (см., US 5643576) и рабдовирусы, такие как вирус васкулярного стоматита (см. WO 96/34625) и папилломавирусы (Ohe et al., Human- 27013752 ДНК, кодирующая иммуноген, или вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, могут быть упакованы в липосомы. Подходящие липиды и их аналоги описаны в патентах US 5208036,52647618, 5279833 и 5283185. Векторы и ДНК, кодирующая иммуноген, также могут быть адсорбированы на поверхности частиц-носителей или ассоциированы с ними, примерами указанных частиц являются полимеры полиметилметакрилата и полилактиды и поли(лактид-со-гликолиды), см., например, McGee etal., J. Micro. Encap. 1996. Векторы для генной терапии или "голая" ДНК могут доставляться in vivo путем их введения конкретному пациенту, обычно путем системного введения (например, внутривенного, интраперитонеального, назального, гастрального, внутрикожного, внутримышечного, подкожного или интракраниального) или местного нанесения (см., например, патент US 5339346). Указанные векторы могут дополнительно включать усиливающие агенты, такие как бупивацин (см., например, патент US 5593970). ДНК также может вводиться с помощью генного ружья, см. XiaoBrandsma, supra. ДНК, кодирующая иммуноген,преципитирована на поверхности микроскопических металлических бусин. Микроснаряды с помощью ударной волны или расширяющегося гелиевого газа проникают в ткани на глубину нескольких клеточных слоев. Например, подходящим устройством является устройство для доставки генов Accel отAgacetus, Inc. Middleton, WI. Альтернативно, "голая" ДНК может проникать через кожу в системный кровоток просто после нанесения ее на поверхность кожи с помощью химической или механической ирритации (см. заявку WO 95/05853). Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения векторы, кодирующие иммуногены, могут доставляться в клетки ex vivo, например в клетки, выделенные от конкретного пациента(например, лимфоциты, аспират костного мозга или тканевая биопсия), или в гемопоэтические клетки универсального донора с последующей реимплантацией указанных клеток пациенту, обычно после отбора тех клеток, в которых произошло включение вектора.III. Агенты для индукции иммунного ответа, направленного против А. А, также известный как -амилоидный пептид, или А 4 пептид (см. US 4666829; GlennerWong,Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131 (1984, представляет собой пептид из 39-43 аминокислот,который является основным компонентом бляшек, характерных для болезни Альцгеймера. А получают путем процессинга большого АРР белка с помощью двух ферментов, обозначаемых как - и -секретазы(см. Hardly, TINS 20, 154 (1997. Известные мутации АРР, ассоциированные с болезнью Альцгеймера,происходят проксимально к сайту - и -секретаз или захватывают А. Например, положение 717 является проксимальным по отношению к сайту расщепления АРР -секретазой во время процессинга в А, а положения 670/671 располагаются проксимально к сайту расщепления -секретазой. Считается, что мутации приводят к развитию AD в результате воздействия на реакции расщепления, за счет которых формируется А, что приводит к увеличению количества 42/43 аминокислотных форм А. А обладает уникальным свойством - способностью фиксировать и активировать как классический,так и альтернативный каскад комплемента. В частности, он связывается с C1q и, главным образом, с С 3bi. Указанная ассоциация обеспечивает связывание с макрофагами, что приводит к активации В-клеток. Кроме того, С 3bi отсоединяется и затем связывается с CR2 на В-клетках Т-клеточнозависимым образом, что усиливает активацию указанных клеток в 10000 раз. Указанный механизм способствует тому, что А генерирует иммунный ответ в избытке по сравнению с другими антигенами. В природе существует несколько форм А. А формы человека включают А 39, А 40, А 41, А 42 и А 43. Последовательности указанных пептидов и их взаимодействие с АРР предшественником представлены на фиг. 1 Hardy et al., TINS 20, 155-158 (1997). Например, A42 имеет следующую последовательность:DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGGAIIGLMVGGVVIAT (SEQ ID NO:33). А 41, А 40 и А 39 отличаются от А 42 отсутствием Ala, Ala-Ile и Ala-Ile-Val соответственно на С-концевом участке. А 43 отличается от А 42 наличием остатка Thu на С-концевом участке. Агенты, аналогичные описанным выше для альфа-SN, предварительно были описаны для А (см.WO 98/25386 и WO 00/72880, обе заявки включены в настоящее изобретение в качестве ссылок). К указанным агентам относятся А и его активные фрагменты, конъюгаты А и конъюгаты активных фрагментов А, антитела к А и его активным фрагментам (например, мышиные, гуманизированные, человеческие и химерные антитела), а также нуклеиновые кислоты, кодирующие цепи антител. Активные фрагменты с N-концевого участка А являются предпочтительными. К предпочтительным иммуногенным фрагментам относятся A1-5, 1-6, 1-7, 1-10, 3-7, 1-3 и 1-4. Обозначение А 1-5 означает, например,что фрагмент включает остатки 1-5 А и не включает другие остатки А. Фрагменты, начинающиеся с остатков 1-3 А и заканчивающиеся остатками 7-11 А, являются наиболее предпочтительными. Все изложенные в настоящем изобретении представления, касающиеся агентов, индуцирующих активный иммунный ответ, агентов, индуцирующих пассивный иммунный ответ, конъюгатов и нуклеиновых кислот, кодирующих терапевтические агенты (см. раздел II, 1-5) справедливы и для А и его фрагментов.- 28013752 Все представления, касающиеся пациентов, подлежащих лечению, а также лечебных режимов (см. разделы IV и V), справедливы и для использования А и его фрагментов. Дезагрегированный А и его фрагменты представляют собой мономерные пептидные единицы. Дезагрегированный А и его фрагменты являются полностью растворимыми, а также обладают способностью к самоагрегации с формированием растворимых олигомеров. Олигомеры А и его фрагменты обычно являются растворимыми и существуют, главным образом, в форме альфа-спиралей и статистических спиралей. Агрегрированный А или его фрагменты представляют собой олигомеры альфа-SN или его фрагментов, которые были ассоциированы в нерастворимые бета-складчатые структуры. Агрегированный А и его фрагменты также могут представлять собой фибриллярные полимеры. Фибриллы обычно являются нерастворимыми. Некоторые антитела связываются как с растворимым А и его фрагментами, так и с агрегированным А и его фрагментами. Некоторые антитела связываются как с растворимым А и его фрагментами, так и с агрегированным А и его фрагментами. Некоторые примеры конъюгатов включаютPADRE пептид (всегда в линейной конфигурации), где X предпочтительно представляет собой циклогексилаланин, тирозин или фенилаланин, где циклогексилаланин является наиболее предпочтительным- 29013752 Другими примерами белков слияния (иммуногенный эпитоп А выделен жирным шрифтом) являются Предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом по остаткам 1-10 А (первый N-концевой остаток природного А обозначается 1). Некоторые предпочтительные моноклональные антитела связываются с эпитопом по аминокислотам 1-5, а некоторые - по эпитопам 5-10. Некоторые предпочтительные антитела связываются с эпитопами по аминокислотам 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7 или 3-7. Некоторые предпочтительные антитела связываются с эпитопом, начинающимся на остатках 1-3 и заканчивающимся на остатках 7-11 А. К другим антителам относятся такие антитела, которые связываются с эпитопом по остаткам 13-280 (например, моноклональное антитело 266). Предпочтительные антитела имеют изотип IgG1 человека.IV. Изучение "очищающей" активности антител. Настоящее изобретение относится к способам изучения "очищающей" активности антител в отношении телец Леви или любого другого антигена или ассоциированной биологической молекулы, для которой желательно наличие указанной активности. Для изучения активности в отношении телец Леви образец ткани головного мозга пациента с PD или модельного животного, имеющего характерную патологию типа болезни Паркинсона, обрабатывают фагоцитирующими клетками, несущими Fc-рецептор, такими как микроглиальные клетки, а также антителами, подлежащими анализу, в среде in vivo. Фагоцитирующие клетки могут представлять собой первичную культуру клеток или клеточную линию, такую какBV-2, C8-B4 или ТНР-1. Согласно некоторым способам компоненты комбинируют на микроскопическом стекле для обеспечения микроскопического контроля. Согласно некоторым способам осуществляют множество реакций параллельно на лунках планшета для микротитрования. В таком случае отдельные миниатюрные предметные стекла могут быть закреплены в отдельных лунках или же может быть ис- 30