Предупреждение и лечение амилоидогенного заболевания
Формула / Реферат
1. Способ предупреждения или лечения заболевания, характеризующегося амилоидным отложением у больного, заключающийся во введении активного агента, вызывающего у больного иммунный ответ на пептидный компонент амилоидного отложения.
2. Способ по п.1, дополнительно включающий введение адъюванта, усиливающего иммунный ответ на Аb-пептид.
3. Способ по п.2, отличающийся тем, что адъювант представляет собой StimulonФ QS.
4. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что агент инкапсулирован в частицу.
5. Способ п.1, отличающийся тем, что агент представляет собой Аb-пептид.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что агент представляет собой иммуногенный фрагмент
Аb-пептида.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что иммуногенный фрагмент Аb-пептида представляет собой фрагмент N-концевой половины Аb-пептида.
8. Способ по п.6, отличающийся тем, что иммуногенный фрагмент Аb-пептида выбирают из группы, состоящей из Ab1-5, Аb1-6, Ab1-12, Аb13-28, Аb17-28, Аb25-35, Аb33-42, Аb35-40 и Аb35-42.
9. Способ по пп.5-8, отличающийся тем, что дополнительно вводят молекулу носителя, связанную с Аb-пептидом или его иммуногенным фрагментом.
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что молекула носителя представляет собой молекулу холерогена.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что молекула носителя представляет собой молекулу иммуноглобулина.
12. Способ по п.9, отличающийся тем, что молекула носителя представляет собой молекулу дифтерийного токсина.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что дифтерийный токсин представляет собой CRM 197.
14. Способ по п.9, отличающийся тем, что молекула носителя представляет собой молекулу столбнячного токсина.
15. Способ по любому из пп.9-14, отличающийся тем, что дополнительно вводят адъювант.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что адъювант представляет собой StimulonФ QS-21.
17. Способ по любому из пп. 9-16, отличающийся тем, что агент представляет собой Аb-пептид.
18. Способ по любому из пп.9-16, отличающийся тем, что агент представляет собой иммуногенный фрагмент Аb-пептида.
19. Способ по п.18, отличающийся тем, что иммуногенный фрагмент Аb-пептида представляет собой фрагмент N-концевой половины Аb-пептида.
20. Способ по любому из пп.9-19, отличающийся тем, что дополнительно вводят фармацевтически приемлемый носитель.
21. Способ лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося амилоидными отложениями в организме больного, включающий введение вирусного вектора, кодирующего Аb или его фрагмент, эффективно вызывающий иммунный ответ, представляющий собой антитела к Аb.
22. Способ лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося амилоидными отложениями в организме больного, включающий введение человеческого, химерного или гуманизированного антитела, которое специфически связывается с Аb, причем изотип антитела представляет собой человеческий IgG1.
23. Способ по п.22, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
24. Способ лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося амилоидными отложениями в организме больного, включающий введение антитела, которое специфически связывается с Аb, причем изотип антитела представляет собой человеческий IgG1.
25. Способ по п.24, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
26. Способ по любому из пп.1-25, отличающийся тем, что амилоидное отложение представляет собой агрегированную форму Аb-пептида.
27. Способ по любому из пп.1-25, отличающийся тем, что заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
28. Способ по любому из пп. 1-25, отличающийся тем, что больной является бессимптомным больным.
29. Способ по п.5, отличающийся тем, что Аb находится в агрегированной форме.
30. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что агент представляет собой человеческое, химерное или гуманизированное антитело к Аb, которое вызывает иммунный ответ, связываясь с Аb в организме больного.
31. Способ по п.30, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
32. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что агент представляет собой антитело к Аb, которое вызывает иммунный ответ, связываясь с Аb в организме больного, причем изотип антитела представляет собой человеческий IgG1.
33. Способ по п.32, отличающийся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
34. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что агент представляет собой эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей Аb или ее активный фрагмент, при этом нуклеиновая кислота экспрессируется в организме больного, продуцируя Аb или его активный фрагмент, который вызывает иммунный ответ.
35. Фармацевтическая композиция, содержащая человеческое, химерное или гуманизированное антитело, которое специфически связывается с Аb, и фармацевтически приемлемый носитель, причем изотип антитела представляет собой человеческий IgG1.
36. Композиция по п.35, отличающаяся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
37. Применение человеческого, химерного или гуманизированного антитела, специфически связывающегося с Аb, причем изотип антитела представляет собой человеческий IgG1, для изготовления лекарственного препарата для лечения или предупреждения заболевания, характеризующегося амилоидными отложениями в организме больного.
38. Применение по п.37, отличающееся тем, что антитело представляет собой моноклональное антитело.
Текст
009283 Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к области иммунологии и медицины. Предпосылки создания изобретения Болезнь Альцгеймера (AD, БА) является прогрессирующим заболеванием, приводящим к старческому слабоумию (пресенильная деменция). См. в целом Selkoe, TINS 16, 403-409, 1993; Hardy et al.,WO 92/13069; Selkoe, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 53, 438-447, 1994; Duff et al., Nature 373, 476-477, 1995;Games et al., Nature 373, 523, 1995. Вообще говоря, заболевание бывает двух видов: позднее, возникающее в старости (65 лет и старше), и раннее, развивающееся ранее старческого (сенильного) возраста, т.е. между 35 и 60 годами. В обоих видах заболевания патология та же самая, но в случае начала заболевания в более раннем возрасте имеется тенденция к более тяжелым и обширным нарушениям. Заболевание характеризуется двумя типами патологических изменений мозга: старческими бляшками и нейрофибриллярными узлами. Старческие бляшки представляют собой участки дезорганизованных (разрушенных) нейропилей до 150 мкм в поперечнике с внеклеточными амилоидными отложениями в центре, видимыми при изучении под микроскопом разрывов ткани мозга. Нейрофибриллярные узлы представляют собой внутриклеточные отложения -белка, состоящего из двух филаментов, попарно скрученных вместе. Основной составляющей бляшек является пептид, называемый A- или -амилоидный пептид.A-пептид представляет собой внутренний фрагмент 39-43 аминокислот белка-предшественника,называемого амилоидным белком-предшественником (АРР, АБП). Некоторые мутации в АРР-белке коррелировались с наличием болезни Альцгеймера. См., например, Goate et al., Nature 349, 704, 1991(валин 717 в изолейцин); Chartier Harlan et al., Nature 353, 844, 1991 (валин 717 в глицин); Murrell et al.,Science 254, 97, 1991 (валин 717 в фенилаланин); Mullan et al., Nature Genet. 1, 345, 1992 (двойная замена лизин 595-метионин 596 в аспарагин 595-лейцин 596). Полагают, что такие мутации вызывают болезнь Альцгеймера за счет усиленного или измененного процессинга АРР в A, в частности процессинга АРР в повышенные количества протяженной формы A (т.е. A1-42 и A1-43). Как полагают, мутации в других генах, таких как гены презенилина, PS1 и PS2, косвенно воздействуют на процессинг АРР, генерируя повышенные количества протяженной формы A (см. Hardy, TINS 20, 154, 1997). Эти наблюдения показывают, что A, и в частности его протяженная форма, является причинным (каузальным) элементом болезни Альцгеймера.McMichael в Европейском патенте 526511 предлагает введение гомеопатических доз (менее или равных 10-2 мг/день) A больным с предварительно установленной болезнью Альцгеймера. У обычного человека примерно с 5 л плазмы, как полагают, даже верхний предел этой дозы создает концентрацию не более 2 пг/мл. Нормальная концентрация A в плазме человека обычно находится в интервале 50-200 пг/мл (Seubert et al., Nature 359, 325-327, 1992). Так как предлагаемая в Европейском патенте ЕР 526511 дозировка мало отличается от A во внутреннем кровотоке и так как в этом патенте не рекомендуется применение адъюванта, кажется маловероятным, что достигается какое-либо преимущество при лечении. Напротив, данное изобретение направлено, среди прочего, на терапию болезни Альцгеймера и других амилоидогенных заболеваний путем введения больному A или другого иммуногена в условиях, которые вызывают у больного благоприятный иммунный ответ. Таким образом, изобретение удовлетворяет давнюю потребность в программе (схеме) лечения с целью предотвращения или уменьшения интенсивности невропатологии болезни Альцгеймера. Сущность изобретения В одном аспекте изобретение включает методы предотвращения или терапии заболевания, характеризующегося амилоидными отложениями у больного. Такие методы вызывают у больного индуцирование иммунного ответа на пептидный компонент амилоидного отложения. Такая индукция может быть активной за счет введения иммуногена или пассивной, при введении антитела или активного фрагмента антитела или производного антитела. У некоторых больных амилоидное отложение представляет собой сгруппированный (агрегированный) A-пептид, а заболевание является болезнью Альцгеймера. В некоторых методах болезнь протекает бессимптомно. В некоторых методах больной имеет наследственные факторы риска, указывающие на восприимчивость к болезни Альцгеймера. Такие факторы риска включают аллельные варианты в гене презенилина PS1 или PS2 и вариантные формы АРР. В других методах у больного отсутствуют известные факторы риска относительно болезни Альцгеймера. Для лечения больных, страдающих болезнью Альцгеймера, одна терапевтическая схема предлагает введение больному дозы A-пептида с целью вызвать иммунный ответ. В некоторых методах A-пептид вводят с адъювантом, который усиливает иммунный ответ на A-пептид. В некоторых методах адъювант представляет собой квасцы. В некоторых методах адъювантом является MPL (МФЛ). Доза A-пептида,назначаемая больному, как правило, составляет по меньшей мере 1 или 10 мкг при введении с адъювантом и по меньшей мере 50 мкг при введении без адъюванта. В некоторых методах доза составляет по меньшей мере 100 мкг.-1 009283 В некоторых методах A-пептид представляет собой A1-42. В некоторых методах A-пептид вводят в форме агрегации. В других методах A-пептид вводят в диссоциированной форме. В некоторых методах терапевтический агент представляет собой взятую в эффективной дозе нуклеиновую кислоту,кодирующую A или его активный фрагмент или его производное. Нуклеиновая кислота, кодирующаяA или его активный фрагмент, экспрессирует в организме больного, продуцируя A или его активный фрагмент, который вызывает иммунный ответ. В некоторых из этих методов нуклеиновую кислоту вводят через кожу, при необходимости через накладку. В некоторых методах терапевтический агент определяют скринингом библиотеки соединений с целью установить соединение, реакционноспособное относительно антител к A, и введением соединения больному, чтобы вызвать иммунный ответ. В некоторых методах иммунный ответ направлен на агрегированный A-пептид и не направлен на диссоциированный A-пептид. Например, иммунный ответ может содержать антитела, которые связываются с агрегированным A-пептидом, не связываясь с диссоциированным A-пептидом. В некоторых методах иммунный ответ содержит Т-клетки, которые связываются с A, образующим комплекс с MCHI или MCHII на клетках CD8 или CD4. В других способах иммунный ответ индуцирует введение больному антитела к A. В ряде способов иммунный ответ индуцирует взятие у больного Т-клеток, контактирование Т-клеток с A-пептидом в условиях, при которых осуществляется примирование Т-клетки и возвращение Т-клеток больному. Терапевтический агент обычно вводят перорально, назально, интрадермально (внутрикожно), подкожно, внутримышечно, местно или внутривенно. В некоторых методах больного постоянно контролируют (мониторинг) после введения для оценки иммунного ответа. Если мониторинг показывает (затихание) ослабление иммунного ответа со временем, больному можно дать одну или более дополнительных доз агента. В другом аспекте изобретение включает фармацевтические композиции, содержащие A, и эксципиент, пригодный для перорального и других способов введения. Изобретение также охватывает фармацевтические композиции, содержащие агент, эффективный для того, чтобы вызвать иммуногенный ответ на A у больного, и фармацевтически приемлемый адъювант. В некоторых подобных композициях агент представляет собой A или его активный фрагмент. В некоторых композициях адъювант представляет собой квасцы. В некоторых композициях адъювант представляет собой эмульсию масла в воде. В некоторых композициях A или его активный фрагмент является компонентом сополимера полилактида с полигликолидом (PLPG) или другой частицы. Изобретение дополнительно предлагает композиции, содержащие A или его активный фрагмент, связанный с молекулой конъюгата, которая способствует доставке A в кровоток больного и/или стимулирует иммунный ответ на A. Например, конъюгат может стимулировать иммунный ответ на A. В некоторых композициях конъюгат представляет собой холероген, в некоторых композициях - иммуноглобулин, в некоторых композициях - ослабленный токсин дифтерии CRM 197 (Gupta, Vaccine 15, 1341-39, 1997). Изобретение также включает фармацевтические композиции, содержащие агент, который вызывает у больного иммуногенный ответ на A при условии, что композиция не содержит полный адъювант Фрейнда. Изобретение также предлагает композиции, содержащие вирусный вектор, кодирующий A или его активный фрагмент, эффективно индуцирующий иммунный ответ на A. Соответствующие вирусные векторы включают вирус герпеса, аденоассоциированный вирус, ретровирус, Синдбис-вирус,вирус леса семлики, вирус коровьей оспы или оспы птиц. Изобретение дополнительно предлагает способы предотвращения или терапии болезни Альцгеймера. В соответствии с этими методами больному назначают эффективную дозу A-пептида. Далее изобретение обеспечивает применение A или антитела к нему в производстве лекарственного препарата для предотвращения или терапии болезни Альцгеймера. В другом аспекте изобретение заключается в способах оценки эффективности метода терапии болезни Альцгеймера. В соответствии с этими способами в образце ткани больного перед лечением агентом определяют базовое количество антитела, специфически связывающегося с A-пептидом. Количество антитела, специфически связывающегося с A-пептидом, в образце ткани больного после лечения агентом сравнивают с базовым количеством антитела, специфически связывающегося с A-пептидом. Количество A-пептид-специфического антитела, измеренное после лечения, значительно превышающее базовое количество A-пептид-специфического антитела, указывает на положительный результат лечения. В других способах оценки эффективности метода терапии болезни Альцгеймера определяют базовое количество антитела, специфического к A-пептиду в образце ткани больного, перед лечением агентом. Количество антитела, специфического к A-пептиду, в образце ткани больного после терапии с помощью агента сравнивают с базовым количеством A-пептид-специфического антитела. Уменьшение или отсутствие разницы между количеством A-пептид-специфического антитела, измеренным после лечения, по сравнению с базовым количеством A-пептид-специфического антитела указывает на отри-2 009283 цательный результат лечения. В других способах оценки эффективности метода лечения болезни Альцгеймера определяют контрольное количество антитела, специфически связывающегося с A-пептидом, в образце ткани контрольной популяции. Количество антитела, специфически связывающегося с A-пептидом, в образце ткани больного после введения агента сравнивают с контрольным количеством A-пептидспецифического антитела. Количество A-пептид-специфического антитела, измеренное после лечения,значительно превышающее контрольное количество A-пептид-специфического антитела, характеризует положительный результат лечения. В других способах оценки эффективности метода лечения больного болезнью Альцгеймера определяют контрольное количество антитела, специфического к A-пептиду, в образцах ткани контрольной популяции. Количество антитела, специфического к A-пептиду, в образце ткани больного после введения агента сравнивают с контрольным количеством A-пептид-специфического антитела. Отсутствие значительной разницы между количеством A-пептид-специфического антитела, измеренным после начала указанного лечения, по сравнению с контрольным количеством A-пептидспецифического антитела указывает на отрицательный результат лечения. Другие способы мониторинга болезни Альцгеймера или чувствительности к ней больного включают обнаружение иммунного ответа на A-пептид в образце, взятом у больного. В ряде подобных методов больному вводили агент, действующий как средство, лечащее или предотвращающее болезнь Альцгеймера, и уровень (степень) ответа определял будущий режим лечения больного. В других способах оценки эффективности метода лечения больного болезнью Альцгеймера определяют величину количества антитела, специфически связывающегося с A-пептидом, в образце ткани больного, пролеченного агентом. Значения сравнивают с контрольной величиной, определенной для группы больных, испытавших улучшение или исчезновение симптомов болезни Альцгеймера в результате терапии с помощью агента. Величина (количество антитела) у больного, по меньшей мере, равная контрольной величине, указывает на положительную реакцию на терапию. Объектом настоящего изобретения являются также диагностические наборы для осуществления вышеописанных способов. Такие наборы, как правило, включают реагент, который специфически связывается с антителами к A или стимулирует пролиферацию Т-клеток, реакционноспособных по отношению к A. Краткое описание фигур Фиг. 1 - Титр антител после инъекции A1-42 трансгенным мышам. Фиг. 2 - Амилоидная нагрузка в гиппокампе. Площадь (в процентах) участка гиппокампа, занимаемая амилоидными плашками, определяемая реактивностью в отношении A-специфического mA 3D6,устанавливается с помощью количественного компьютерного анализа изображения иммунореактивных участков мозга. Значения даны для отдельных мышей, классифицированных по группам терапии (опытным группам). Горизонтальная линия для каждого группирования показывает среднюю величину распределения. Фиг. 3 - Невритная дистрофия в гиппокампе. Процент площади участка гиппокампа, пораженной дистрофическим невритом, определяемый ее реактивностью относительно человеческого АРРспецифического mA 8 Е 5, устанавливается с помощью количественного компьютерного анализа изображения иммунореактивных участков мозга. Значения даны группы отдельных мышей, пролеченнойAN 1792 и пролеченной PBS (ЗФР) контрольной группы. Горизонтальная линия для каждого группирования показывает среднюю величину распределения. Фиг. 4 - Астроцитоз в ретросплениальной коре. Процентное содержание площади кортикального участка, занимаемого глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) - положительными астроцитами,определяли количественным компьютерным анализом изображения иммунореактивных участков мозга. Значения для отдельных мышей распределяются (классифицируются) в зависимости от обрабатываемой группы и средние групповые значения указаны горизонтальными линиями. Фиг. 5 - Среднее геометрическое титров антитела к A1-42 после иммунизации серией из восьми доз AN 1792, содержащих 0,14; 0,4; 1,2; 3,7; 11; 33; 100 или 300 мкг. Фиг. 6 - Кинетика гуморального иммунного ответа (антителогенеза) на AN 1792-иммунизацию. Титры выражаются как средние геометрические значения для 6 животных в каждой группе. Фиг. 7 - Количественный анализ изображения кортикального амилоида (нагрузки) у мышей, получавших PBS (ЗФР) и AN 1792. Фиг. 8 - Количественный анализ изображения нейритных бляшек (нагрузки) у мышей, получавшихPBS (ЗФР) и AN 1792. Фиг. 9 - Количественный анализ изображения процентного содержания ретросплениальной коры,занимаемой астроцитами, у мышей, получавших PBS (ЗФР) и AN 1792. Фиг. 10 - Анализ пролиферации лимфоцитов в клетках селезенки мышей, принимавших AN 1792 или PBS (ЗФР).-3 009283 Фиг. 11 - Уровни тотального A в коре. График разброса профилей индивидуальных A у мышей,иммунизированных A- или АРР-производными в соединении с адъювантом Фрейнда. Фиг. 12 - Содержание амилоида в коре определяли количественным анализом изображения иммунореактивных участков мозга для мышей, иммунизированных A-пептидными конъюгатами A1-5,A1-12 и A13-18, получавших агрегации непроцессированного A AN 1792 (A1-42) и AN 1528(A1-40) и PBS (ЗФР) (контрольная группа). Фиг. 13 - Среднее геометрическое титров A-специфического антитела для групп мышей, иммунизированных производными A или АРР вместе с адъювантом Фрейнда. Фиг. 14 - Среднее геометрическое титров A-специфического антитела для групп морских свинок,иммунизированных AN 1792 или его пальмитоильным производным в соединении с различными адъювантами. Фиг. 15 - Уровни A в коре мышей PDAPP в возрасте 10 месяцев, получавших AN 1792 илиAN 1528 с различными адъювантами. Определения Термин "практическая идентичность" означает, что две пептидные последовательности, будучи оптимально совмещены, например, с помощью программ GAP или BESTFIT, заполняя разрывы (гэпы) по умолчанию, имеют по меньшей мере 65% идентичность последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 80 или 90% идентичность последовательностей, более предпочтительно по меньшей мере 95% идентичность последовательностей или более (например, 99% идентичность последовательностей или выше). Предпочтительно, чтобы неидентичные остатки отличались консервативными аминокислотными заменами. Для сравнения последовательностей, обычно одна последовательность выступает в роли эталонной последовательности, с которой сравниваются испытуемые последовательности. При применении алгоритма сравнения испытуемую и эталонную последовательности вводят в компьютер, если необходимо,устанавливают координаты последовательностей и определяют параметры программы алгоритма последовательностей. Алгоритм сравнения последовательностей позволяет рассчитать затем процент идентичности последовательностей для испытуемой(ых) последовательности(ей) по сравнению с эталонной последовательностью, исходя из установленных программных параметров. Оптимальное совмещение последовательностей с целью сравнения можно проводить, например, с помощью алгоритма локальной гомологии Смита и Уотермана (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482,1981); алгоритма совмещения гомологии Нидльмана и Вунша (Needlman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443,1970); метода подобия Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988; компьютерных разработок этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) или изучая визуально (в целом Ausubel et al., см. выше). Одним из примеров алгоритма, пригодного для определения процента идентичности и подобия последовательностей, является алгоритм BLAST, описанный Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990. Программное обеспечение для осуществления BLAST-анализа является общедоступным через NationalCenter for Biotechnology Information (национальный центр информации по биотехнологии)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Как правило, для проведения сравнения последовательностей можно применять параметры программы, принимающие значение по умолчанию, хотя также можно использовать специально разработанные (заказные) параметры. Для аминокислотных последовательностей программаBLASTP использует в качестве значений по умолчанию длину слова (разрядность, W) 3, ожидание (Е) 10 и оценочную матрицу BLOSUM62 (см. Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915, 1989). С целью классификации аминокислотных замен, как консервативных, так и неконсервативных,аминокислоты группируют следующим образом: группа I (гидрофобные боковые цепи) - норлейцин, met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи) - cys, ser, thr; группа III (кислые боковые цепи) - asp, glu; группа IV (основные боковые цепи) - asn, gln, his, lys, arg; группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи) - gly, pro; группа VI (ароматические боковые цепи) - trp, tyr, phe. Консервативные замены обеспечивают обмен между кислотами того же класса. Неконсервативные замены представляют собой обмен члена одного из этих классов на член другого класса. Терапевтические агенты по изобретению обычно являются практически чистыми. Это означает, что чистота агента обычно составляет по меньшей мере 50 вес.% (вес./вес.), а также то, что агент практически не содержит вредных (мешающих) белков и загрязнений. Иногда агенты имеют чистоту по меньшей мере около 80 вес.%, более предпочтительно по меньшей мере 90 или около 95 вес.%. Однако при при-4 009283 менении соответствующих методов очистки белков можно получить по меньшей мере 99 вес.% гомогенные пептиды. Специфическое связывание между двумя объектами означает аффинность (сродство) по меньшей мере 106, 107, 108, 109 или 1010 М-1. Предпочтительно сродство выше 108 М-1. Термин "антитело" включает интактные антитела и их связывающие фрагменты. Обычно фрагменты конкурируют с интактным антителом, из которого они происходят, в специфическом связывании с антигеном. При необходимости антитела или их связывающие фрагменты могут химически конъюгироваться с белками, слитыми с другими белками, или экспрессировать в виде них. АРР 695, АРР 751 и АРР 770 относится, соответственно, к 695, 751 и 770 протяженным полипептидам из аминокислотных остатков, кодируемым человеческим геном АРР. См. Kang et al., Nature 325, 773, 1987;Ponte et al., Nature 331, 525, 1988 и Kitaguchi et al., Nature 331, 530. 1988. Аминокислоты в человеческом амилоидном предшественнике белка (АРР) обозначены номерами в соответствии с последовательностями изоформы АРР 770. Термины, такие, например, как A39, A40, A41, A42 и A43 относятся кA-пептиду, содержащему аминокислотные остатки 1-39, 1-40, 1-41, 1-42 и 1-43. Термин "эпитоп", или "антигенная детерминанта", относится к сайту на поверхности антигена, на который отвечают В и/или Т-клетки. В-клеточные эпитопы могут образовываться как из прилегающих(соседних) аминокислот, так и не из прилегающих аминокислот, накладывающихся друг на друга за счет третичной укладки (складчатости) белка. Эпитопы, образованные из прилегающих аминокислот, обычно сохраняются при действии денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные за счет третичной структуры (укладки), обычно утрачиваются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитопы обычно содержат по меньшей мере 3 и более обычно по меньшей мере 5 или 8-10 аминокислот в единичной пространственной конформации. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию и двухмерный ядерный магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, Glenn E.Morris, Ed. 1996. Антитела, которые распознают тот же эпитоп, можно идентифицировать простым иммуноанализом, показывающим способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с целевым антигеном. Т-клетки распознают секвенциальные эпитопы, примерно из 9 аминокислот в случаеCD8-клеток и примерно из 13-15 аминокислот в случае клеток CD4. Т-клетки, которые распознают эпитоп, могут быть идентифицированы in vitro анализами, которые определяют антиген-зависимую пролиферацию, как определяемая включением 3 Н-тимидина в премированные Т-клетки в ответ на эпитоп(Burke et al., J. Inf. Dis. 170, 1110-19, 1994), антиген-зависимым киллингом (Т-лимфоцитотоксический тест, Tigges et al., J. Immunol. 156, 3901-3910) или секрецией цитокинов. Термин "иммунологический", или "иммунный" ответ, раскрывает благотворный (полезный) гуморальный (опосредуемый антителом) и/или клеточный (опосредуемый антиген-специфическими Т-клетками или продуктами их секреции) ответ на амилоидный пептид у больного реципиента. Такой ответ может быть активным ответом, стимулированным введением иммуногена, или пассивным ответом,индицированным введением антитела или примированных Т-клеток. Реакция клеточного иммунитета выявляется презентацией полипептидных эпитопов в ассоциации с молекулами MHC класса I и класса II для активации антиген-специфических CD4+ Т-хелперных клеток и/или CD8+ цитотоксических Т-клеток. Ответ может также включать активацию моноцитов, макрофагов, NK-клеток, базофилов, дендритных клеток, астроцитов, микроглии, эозинофилов или других компонентов врожденного иммунитета. Наличие опосредуемого клетками иммунологического ответа можно определить анализами пролиферации(CD4+ Т-клеток) или CTL (Т-лимфоцитотоксическими) анализами (Burke, см. выше; Tigges, см. выше). Относительный вклад антительной и клеточной реакции в защитный или лечебный эффект иммуногена можно различить, выделяя по отдельности IgG и Т-клетки иммунизированного сингенного животного и определяя защитный или терапевтический эффект у второго субъекта. Термин "иммуногенный агент", или "иммуноген", способен стимулировать аутоиммунологический ответ при введении больному, при необходимости в сочетании с адъювантом. Термин "голый полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, не дающему комплекс с коллоидным материалом. Голые полинуклеотиды иногда клонируют в плазмидный вектор. Термин "адъювант" относится к соединению, которое при введении совместно с антигеном усиливает иммунный ответ на антиген, но будучи введено отдельно, не вызывает иммунный ответ на антиген. Адъюванты могут усиливать иммунный ответ по нескольким механизмам, включая рекрутмент лимфоцитов, стимуляцию В и/или Т-клеток и стимуляцию макрофагов. Термин "больной" включает человека или другое млекопитающее, которые получают профилактическое или терапевтическое лечение. Дезагрегированный (диссоциированный) или мономерный A означает растворимые, мономерные пептидные единицы A. Один метод приготовления мономерного A представляет собой растворение лиофилизированного пептида в чистом ДМСО под действием ультразвука. Полученный раствор центрифугируют для удаления нерастворимых (макро)частиц. Агрегированный A представляет собой смесь олигомеров, в которой мономерные единицы удерживаются вместе нековалентными связями.-5 009283 Композиции или методы, "содержащие" один или более описанных элементов, могут включать другие элементы, которые конкретно не описаны. Например, композиция, которая содержит A-пептид, охватывает как изолированный A-пептид, так и A-пептид в качестве компонента большей полипептидной последовательности. Подробное описание изобретенияI. Общие сведения. Изобретение представляет фармацевтические композиции и методы профилактического и терапевтического лечения заболеваний, характеризующихся скоплением амилоидных отложений. Амилоидные отложения содержат пептид, соединенный (собранный) в нерастворимую массу. Природа пептида меняется в различных заболеваниях, но в большинстве случаев агрегация имеет -складчатую структуру и окрашивается конго красным. Заболевания, характеризующиеся амилоидными отложениями, включают болезнь Альцгеймера (AD), как поздний, так и ранний случай. При обоих заболеваниях амилоидное отложение содержит пептид, называемый A, который аккумулируется в мозгу страдающих болезнью людей. Примерами некоторых других заболеваний, характеризующихся амилоидными отложениями, являются SAA амилоидоз, наследственный исландский синдром, множественная миелома и губковидные формы энцефалопатии, включая коровье бешенство, болезнь Якоба Кройцфельда, почесуха овец и губчатая энцефалопатия норок (см. Weissmann et al., Curr. Opin. Neurobiol. 7, 695-700, 1997; Smits et al., Veterinary Quarterly 19, 101-105, 1997); Nathanson et al., Am. J. Epidemiol. 145, 959-969, 1997). Пептиды, образующие агрегации при этих заболеваниях, суть сывороточный амилоид А, цистантин С, легкая цепь каппа IgG, соответственно, в случае первых трех, и белок прион в остальных случаях.II. Терапевтические агенты. 1. Болезнь Альцгеймера. Терапевтические агенты для применения по данному изобретению стимулируют иммунный ответ на A-пептид. Эти агенты включают сам A-пептид и его варианты, аналоги и миметики A-пептида,которые стимулируют антитела к A-пептиду и/или перекрестную реакцию с ними, и антитела или Тклетки, реакционноспособные в отношении A-пептида. Стимуляция (индукция) иммунного ответа может быть активной, как в том случае, когда вводят иммуноген для стимуляции антител или Т-клеток,реактивных в отношении A в организме больного, или пассивным, когда вводят антитело, которое само связывается с A в организме больного.A, также известный как -амилоидный пептид, или А 4-пептид (см. патент США 4666829; Glenner and Wong, Biochem. Biophys. Res. Commun. 120, 1131, 1984), представляет собой пептид из 39-43 аминокислот, который является основным компонентом бляшек, характеристичных для болезни Альцгеймера. A образуется при процессинге большего (по размеру) белка АРР под действием двух ферментов, называемых - и -секретазы (см. Hardy, TINS 20, 154, 1997). Известные мутации в АРР, обусловленные болезнью Альцгеймера, происходят непосредственно близ сайта распознавания - и -секретазы или внутри A. Например, положение 717 является ближайшим к сайту расщепления -секретазой АРР при его процессинге в A, а положения 670/671 являются ближайшими к сайту расщепления под действием -секретазы. Полагают, что мутации вызывают AD-болезнь за счет происходящих таким образом реакций расщепления, при которых образуется A, и получается повышенное количество 42/43 аминокислотных форм.A обладает необычным свойством, он может фиксировать и активизировать как классический, так и альтернативный пути активации комплемента. В частности, он связывается с Clg и, в конечном счете, сC3bi. Эта ассоциация облегчает связывание с макрофагами, приводящее к активации В-клеток. Кроме того, C3bi распадается дальше, а затем связывается с CR2 на В-клетках зависящим от Т-клеток образом,10000-кратно активирующим эти клетки. Этот механизм заставляет A вырабатывать иммунный ответ более сильный, нежели иммунный ответ других антигенов. Терапевтический агент, применяемый в заявляемых методах, может быть любым из природных форм A-пептида, и в особенности человеческими формами A-пептида (т.е. A39, A40, A41, A42 или A43). Последовательности этих пептидов и их родство с предшествеником-АРР иллюстрируется фиг. 1 в Hardy et al., TINS 20, 155-158, 1997. Например, A42 имеет последовательность:A43 отличается от A42 наличием остатка треонина на С-конце. Терапевтический агент может также представлять собой активный фрагмент или аналог природногоA-пептида, который содержит эпитоп, стимулирующий подобный защитный или терапевтический иммунный ответ при введении человеку. Иммуногенные фрагменты обычно имеют последовательность по меньшей мере из 3, 5, 6, 10 или 20 прилегающих (соседних) аминокислот природного пептида. Иммуногенные фрагменты включают A1-5, A1-6, A1-12, A13-28, A17-28, A25-25, A35-40 и A35-42. В-6 009283 некоторых методах предпочтительными являются фрагменты N-терминальной части A. Аналоги включают аллельные, видовые и индуцированные варианты. Аналоги обычно отличаются от природных пептидов в одном или двух положениях, часто вследствие консервативных замен. Обычно идентичность последовательностей аналогов и природных пептидов составляет по меньшей мере 80 или 90%. Некоторые аналоги также включают неприродные аминокислоты или модификации N- или С-концевых аминокислот. Примерами неприродных аминокислот являются ,-дизамещенные аминокислоты,N-алкиламинокислоты,молочная кислота,4-гидроксипролин,-карбоксиглутамат,-N,N,N-триметиллизин, -N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин,3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, -N-метиларгинин. Можно проводить скрининг фрагментов и аналогов на эффективность профилактического или терапевтического действия на моделях трансгенных животных, как описано ниже.A, его фрагменты, аналоги и другие амилоидогенные пептиды можно синтезировать реакцией твердофазного пептидного синтеза или рекомбинантной экспрессией или их можно получать из природных источников. Автоматические синтезаторы пептидов в промышленности выпускаются множеством поставщиков, таких как, например, Applied Biosystems, Foster City, California. Рекомбинантную экспрессию можно осуществлять в бактериях, таких, например, как Е. coli, дрожжах, клетках насекомых или клетках млекопитающих. Методики рекомбинантной экспрессии описаны Sambrook et al., MolecularResearch, Inc. Napa, CA). Терапевтические агенты также включают более протяженные полипептиды, к которым относятся,например, A-пептид, активный фрагмент или аналог вместе с другими аминокислотами. Например,A-пептид может присутствовать в виде интактного АРР-белка или его сегмента, такого, например, как фрагмент С-100, который начинается с N-конца A и продолжается до конца АРР. Можно проводить скрининг таких полипептидов на профилактическую и терапевтическую эффективность на животных моделях, как описано ниже. A-пептид, аналог, активный фрагмент или другой полипептид можно вводить в агрегированной (т.е. в виде амилоидного пептида) или в диссоциированной форме. Терапевтические агенты также включают мультимерные или мономерные иммуногенные агенты. В других вариантах иммуногенный пептид, например, такой как A, может присутствовать в виде вирусной или бактериальной вакцины. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуногенный пептид,встраивается в геном или в эписому вируса или бактерии. При необходимости нуклеиновая кислота встраивается таким образом, что иммуногенный пептид экспрессирует в виде секретируемого белка или слитого белка с поверхностным белком вируса или трансмембранным белком бактерий так, что пептид воспроизводится. Вирусы или бактерии, применяемые в таких методах, должны быть непатогенными или ослабленными. Соответствующие (пригодные) вирусы включают аденовирус, HSV (вирус простого герпеса), вирус коровьей оспы или оспы птиц. Слияние иммуногенного пептида с HBsAg HBV является особенно пригодным. Терапевтические агенты также включают пептиды и другие соединения, которые не обязательно имеют значительное сходство аминокислотных последовательностей с последовательностью A, но, тем не менее, работают как миметики A и индуцируют сходный иммунный ответ. Например, можно проводить скрининг на пригодность любых пептидов или белков, образующих -складки. Также можно применять антиидиотипические антитела против моноклональных антител к A или другим амилоидогенным пептидам. Такие анти-Id антитела имитируют антиген и вырабатывают иммунный ответ на него (см. Essential Immunology (Roit ed., Blackwell Scientific Publications, Palo Alto, 6th ed.,p. 181). Также можно проводить скрининг на пригодность произвольных библиотек пептидов или других соединений. Можно получать комбинаторные библиотеки для многих типов соединений, которые можно синтезировать поэтапно (постепенно). Такие соединения включают полипептиды, миметики с-поворотом, полисахариды, фосфолипиды, гормоны, простагландины, стероиды, ароматические соединения, гетероциклические соединения, бензодиазепины, олигомерные N-замещенные глицины и олигокарбаматы. Большие комбинаторные библиотеки можно создать методом кодируемых синтетических библиотек (ESL), описанным Affymax, международная заявка WO 95/12608, Affymax, WO 93/06121,Columbia University, WO 95/08051, Pharmacopeia, WO 95/35503 и Scripps, WO 95/30642 (каждая из которых вводится ссылкой). Пептидные библиотеки также можно создать, отбирая нужные фаги из библиотеки фагов. См., например, Devlin, WO 91/18980. Комбинаторные библиотеки и другие соединения сначала подвергают скринингу на пригодность,определяя их способность связываться с антителами или лимфоцитами (В или Т), известными своей специфичностью к A или другим амилоидогенным пептидам. Например, можно проводить начальный скрининг любых поликлональных сывороток или моноклонального антитела к A или другому амилоидогенному пептиду. Соединения, идентифицируемые таким скринингом, затем дополнительно анализируют на способность индуцировать антитела к A или реакционноспособные относительно A или дру-7 009283 гого амилоидогенного пептида лимфоциты. Например, многократные разведения сывороток можно проверять на микропланшетах с предварительно нанесенным A-пептидом, а для проверки реакционноспособного к A антитела можно применять стандартный метод ELISA. Затем соединения можно испытать на профилактическую и терапевтическую эффективность на трансгенных животных, предрасположенных к амилоидогенному заболеванию, как описано в примерах. Такие животные включают, например,мышей, несущих 717-мутацию АРР, описанных выше, и мышей, несущих шведскую (Swedish) мутацию АРР, как это описано McConlogue, патент США 5612486 и Hsiao et al., Science 274, 99, 1996; Staufenbiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 13287-13292, 1997; Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 94, 13287-13292, 1997; Borchelt et al., Neuron 19, 939-945, 1997. Тот же метод скрининга можно применить для других потенциальных агентов, таких, например, как фрагменты A, аналоги A и более протяженные пептиды, включая A, описанные выше. Терапевтические агенты по изобретению также включают антитела, которые специфически связываются с A. Такие антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Некоторые такие антитела специфически связываются с агрегированной формой A, не связываясь с диссоциированной формой. Некоторые связываются с диссоциированной формой и не связываются с агрегированной формой. Некоторые связываются как с агрегированной, так и с диссоциированной формой. Получение нечеловеческих моноклональных антител, например антител мышей или крыс, можно осуществлять, например, иммунизацией животного A. См. Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual. CSHP NY,1988 (вводится ссылкой). Такой иммуноген можно получать из природного источника, пептидным синтезом или рекомбинантной экспрессией."Гуманизированные" формы мышиных антител можно получать, связывая CDR-участки нечеловеческих антител с константными областями человеческих антител методами рекомбинантной ДНК. См. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033, 1989 и WO 90/07861 (вводимый ссылкой). Человеческие антитела можно получать фаг-дисплей методом (получение и анализ фагов, экспрессирующих или содержащих нужные гены). См., например, Dower et al., WO 91/17271; McCafferty et al.,WO 92/01047. В этих методах получают библиотеки фагов, которые (фаги) обнаруживают различные антитела на своей внешней поверхности. Антитела обычно выявляются в виде фрагментов Fv или Fab. Фаги, выявляющие (демонстрирующие) антитела с заданной специфичностью, выбираются исходя из повышенного сродства (из увеличения сродства) к A или его фрагментам. А также можно получить из трансгенных млекопитающих (не человека), имеющих трансгены, кодирующие, по меньшей мере, сегмент локуса человеческого иммуноглобулина и локус инактивированного эндогенного иммуноглобулина. См., например, международные заявки Lonberg et al., WO 93/12227, 1993; Kucherlapati, WO 91/10741,1991 (каждая из которых вводится ссылкой во всей полноте). Человеческие антитела можно выбрать в экспериментах по конкурентному связыванию или другим способом, чтобы иметь ту же самую специфичность эпитопа, что и определенное антитело мыши. По-видимому, такие антитела, в особенности,имеют общие с антителами мыши полезные функциональные свойства. Человеческие поликлональные антитела также могут предоставляться в виде сыворотки людей, иммунизированных иммуногенным агентом. При необходимости такие поликлональные антитела можно концентрировать аффинной очисткой с A или другим амилоидным пептидом в качестве аффинного реагента. Можно создать человеческие или "гуманизированные" антитела, содержащие константную областьIgG, IgD, IgA и IgE и любой изотип, включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Антитела могут экспрессировать в виде тетрамеров, содержащих две легкие и две тяжелые цепи, в виде отдельных тяжелых цепей, легких цепей, в виде Fab, Fab', F(ab')2 и Fv или в виде одноцепочечных антител, в которых вариабельные области тяжелой и легкой цепей связаны через спейсер. Терапевтические агенты для применения в данных методах также включают Т-клетки, которые связываются с A-пептидом. Например, Т-клетки могут активироваться против A-пептида с помощью экспрессии человеческого гена MHC класса I и человеческого гена -2-микроглобулина линией клеток насекомых, вследствие чего комплекс образуется на поверхности клеток и может связываться сA-пептидом. Т-клетки, контактировавшие с клеточной линией, становятся специфически активированными против пептида. См. Peterson et al., US 5314813. Линии клеток насекомых, экспрессирующие антиген MHC класс II, можно таким же образом использовать для активации CD4 Т-клеток. 2. Другие заболевания. Те же самые или аналогичные принципы определяют получение терапевтических агентов для лечения других амилоидогенных заболеваний. Вообще агенты, отмеченные выше, как применяющиеся для лечения болезни Альцгеймера, могут также применяться для лечения раннего случая болезни Альцгеймера, связанного с (обусловленного) синдромом Дауна. При бешенстве коров прион-пептид, активные фрагменты, аналоги и антитела к прион-пептиду используют вместо A-пептида, активных фрагментов,аналогов и антител к A-пептиду, используемых при лечении болезни Альцгеймера. При лечении множественной миеломы используют легкую цепь IgG, и аналоги, и антитела к нему, и т.д. при других заболеваниях.-8 009283 3. Белки-носители. Некоторые агенты для индуцирования иммунного ответа содержат подходящий эпитоп для стимулирования иммунного ответа против амилоидных отложений, но они слишком малы, чтобы быть иммуногенными. В этой ситуации пептидный иммуноген может быть связан с соответствующим носителем для того, чтобы выявить иммунный ответ. Соответствующие (пригодные) носители включают сывороточные альбумины, гемоцианин лимфы улитки, молекулы иммуноглобулина, тироглобулин, овальбумин,столбнячный токсин, или анатоксины других патогенных бактерий, например, таких, как дифтерия,Е. coli, холера или Н. pylori, или ослабленное производное токсина. Другие носители для стимулирования или усиления иммунного ответа включают цитокины, например, такие как IL-1, IL-1 - и -пептиды,IL-2, INF, IL-10, GM-CSF M1P1 ии RANTES. Иммуногенные агенты могут также быть связаны с пептидами, которые усиливают транспорт через ткани, как описано в O'Mahony, WO 97/17613 иWO 97/17614. Иммуногенные агенты могут связываться с носителями за счет перекрестного сшивания. Методики связывания иммуногена с носителем включают образование дисульфидных связей с применением(SPDP) и сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилата (SMCC) (если в пептиде отсутствует сульфгидрильная группа, ее можно ввести добавлением цистеинового остатка). Эти реагенты образуют дисульфидную связь между собой и пептидными цистеиновыми остатками на одном белке и амидную связь за счет -аминогруппы в лизине или другой свободной аминогруппы в других аминокислотах. Множество таких дисульфид/амидообразующих агентов описано в Immun. Rev. 62, 185, 1982. Другие бифункциональные связывающие агенты образуют скорее тиоэфирную, нежели дисульфидную связь. Многие из этих тиоэфиробразующих агентов выпускаются промышленностью и включают реакционноспособные эфиры 6-малеинимидокапроновой кислоты, 2-бромуксусной кислоты и 2-йодуксусной кислоты,4-(N-малеинимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты. Карбоксильные группы можно активировать за счет их соединения с сукцинимидом или натриевой солью 1-гидроксил-2-нитро-4-сульфоновой кислоты. Иммуногенные пептиды могут также экспрессировать в виде слитых белков с носителями. Иммуногенный пептид может связываться с носителем по аминному концу, по карбоксильному концу или внутренней частью молекулы. При необходимости в слитом белке могут присутствовать множественные повторы иммуногенного пептида. 4. Нуклеиновая кислота, кодирующая иммуногены. Иммунный ответ на амилоидные отложения может индуцироваться также введением нуклеиновой кислоты, кодирующей A-пептид или другие пептидные иммуногены. Такие нуклеиновые кислоты могут представлять собой ДНК или РНК. Сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующий иммуноген, обычно связывается с регуляторными элементами, такими как промотор и энхансер, которые дают возможность экспрессировать ДНК-сегмент в заданных клетках-мишенях больного. Для экспрессии в клетках крови,что желательно для стимуляции иммунного ответа, промоторные и энхансерные элементы легкой или тяжелой цепи генов иммуноглобулина или ранний промотор и энхансер главного посредника CMV пригодны для прямой экспрессии. Связанные регуляторные элементы и кодирующие последовательности часто клонируют в вектор. Пригоден ряд вирусных векторных систем, включая ретровирусные системы (см., например, Lawrieand Tumin, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109, 1993); аденовирусные векторы (см., например, Bett et al.,J. Virol. 67, 5911, 1993); аденоассоциированные вирусные векторы (см., например, Zhou et al., J. Exp.Med. 179, 1867, 1994), вирусные векторы семейства оспы (pox), включая вирус коровьей оспы и вирусы оспы птиц, вирусные векторы из рода -вирусов, такие, например, как образованные из Синдбис-вируса и вируса лесов Семлики (см., например, Dubensky et al., J. Virol. 70, 508-519, 1996), и вирусы папилломыAcids. Res. 24, 2630-2622, 1996). ДНК, кодирующая иммуноген, или вектор, содержащий таковую, могут быть упакованы в липосомы. Пригодные липиды и родственные аналоги описаны в патентах США 5208036, 5264618, 5279833 и 5283185. Векторы и ДНК, кодирующие иммуноген, также могут абсорбироваться носителями в форме(макро)частиц или связываться с ними, примеры макрочастиц включают полиметилметакрилат и полилактиды и поли(лактид-согликолиды), см., например, McGee et al., J. MicroEncap. 1996. Векторы или "оголенная" ДНК для генной терапии могут доставляться in vivo при введении больному, обычно при системном введении (например, путем внутривенного, внутрибрюшинного, назального, желудочного или внутричерепного вливания) или при местном применении (см., например, Патент США 5339346). ДНК также можно вводить, применяя генное ружье. Xiao and Brandsma, см. выше. ДНК,кодирующую иммуноген, осаждают на поверхности из микроскопических металлических гранул (бусин). Микроснаряды ускоряются за счет ударной волны или расширения гелия и проникают в ткани на глубину нескольких слоев клеток. Например, пригоден Accel Gene Delivery Device, производимый Agacetus,Inc. Middleton WI. Или же "оголенная" ДНК может поступать через кожу в кровоток просто при наложе-9 009283 нии ДНК (накладка) на кожу с химическим или механическим раздражением (см. WO 95/05853). В дополнительном варианте изобретения, векторы, кодирующие иммуноген, могут доставляться к клеткам ex vivo, к таким клеткам, как клетки эксплантата отдельного больного (например, лимфоциты,костный мозг, биопсия тканей) или универсальные донорские гемопоэтические стволовые клетки, с последующей реплантацией клеток больному, обычно после отбора по клеткам, которые ассимилировали вектор.III. Больные, подлежащие лечению. В число больных, подлежащих лечению, входят люди с повышенным риском заболевания, но не проявляющие симптомов, а также больные с симптомами заболевания. В случае болезни Альцгеймера фактически любой человек рискует заболеть болезнью Альцгеймера, если он или она живет достаточно долго. Следовательно, данные методы можно назначать профилактически целой популяции без какойлибо оценки риска у подвергаемого (лечению) больного. Данные методы особенно пригодны для тех людей, которые имеют известный генетический риск заболевания болезнью Альцгеймера. К таким людям относятся люди, имеющие родственников с этим заболеванием, и те, риск которых обнаружен анализом генетических или биохимических маркеров. Генетические маркеры риска в отношении болезни Альцгеймера включают мутации в гене АРР, особенно мутации в положении 717 и в положениях 670 и 671, называемые мутации Харди и Шведская соответственно (Hardy, TINS, см. выше). Другими маркерами риска являются мутации в генах пресенилина PS1 и PS2 и АроЕ 4, семейный анамнез относительноAD, холестеринемии или атеросклероза. Людей, в данное время страдающих болезнью Альцгеймера,можно узнать по характерному слабоумию, а также по наличию описанных выше факторов риска. Кроме того, для определения людей с AD применим ряд диагностических тестов. Они включают определение уровней CSF и A42. Повышенный уровеньи пониженный уровень A42 означают наличие AD. Людей, страдающих болезнью Альцгеймера, также можно диагностировать с помощью критериев MMSE или ADRDA, как описано в примерах. Лечение больных с бессимптомным течением болезни можно начинать в любом возрасте (например, в 10, 20, 30 лет). Обычно, однако, нет необходимости начинать лечение до достижения больным возраста 40, 50, 60 или 70 лет. Лечение обычно требует многократных доз в течение времени. Лечение можно постоянно контролировать, анализируя антительные (иммунные) ответы, реакции активированных Т- и В-клеток на терапевтический агент (например, A-пептид) во времени. Если реакция ослабляется, назначается (показана) бустерная доза. В случае больных с потенциальным синдромом Дауна лечение можно начинать антенатально, вводя терапевтический агент матери, или вскоре после рождения.IV. Схемы лечения. При применении для профилактики фармацевтические композиции или лекарственные препараты вводят больному, чувствительному, или иначе с повышенным риском, к конкретному заболеванию в количестве, достаточном для исчезновения или снижения степени риска или для отсрочки начала заболевания. При терапевтическом применении композиции или лекарственные препараты вводят больному с подозрением на наличие этой болезни либо уже страдающему этой болезнью в количестве, достаточном для лечения или, по меньшей мере, для частичного подавления симптомов заболевания и его осложнений. Количество, достаточное для выполнения этого, определяется как терапевтически- или фармацевтически эффективная доза. Как при профилактической, так и при терапевтической схемах лечения агенты обычно вводят в виде нескольких дозировок до тех пор, пока не будет достигнут достаточный иммунный ответ. Обычно иммунный ответ контролируют и, если иммунный ответ начинает постепенно затихать,дают повторные дозы. Эффективные дозы композиций по данному изобретению для лечения вышеописанных состояний варьируются в зависимости от множества различных факторов, включая способы введения, нужное место (введения), физиологическое состояние больного, является ли больной человеком или животным,другие вводимые препараты и является ли лечение профилактическим или терапевтическим. Обычно больным является человек, но при некоторых заболеваниях, например, таких как коровье бешенство,больным может быть другое млекопитающее, такое как корова. Лечебные дозы нужно титровать, чтобы достичь оптимальной безопасности и эффективности. Количество иммуногена зависит от того, вводится ли также адъювант, причем в отсутствие адъюванта требуются более высокие дозы. Количество иммуногена для введения иногда варьируется от 1 до 500 мкг одному больному и более обычно от 5 до 500 мкг на инъекцию при введении человеку. Иногда применяют более высокую дозу, 1-2 мг на одну инъекцию. Как правило, на каждую инъекцию человеку применяют 10, 20, 50 или 100 мкг. Частота инъекций может варьироваться значительно от одного раза в день до одного раза в год и одного раза в десять лет. В любой день приема дозы доза составляет более 1 мкг/больной и обычно более 10 мкг/больной, если также вводится адъювант, и более 10 мкг/больной, а обычно более 100 мкг/больной в отсутствие адъюванта. Типичная схема представляет собой иммунизацию с последующими бустер-инъекциями с 6-недельными интервалами. Другая схема представляет собой иммунизацию с последующими бустер-инъекциями через 1, 2 и 12 месяцев. По другой схеме требуется инъекция каждые два месяца в течение жизни. Или же бустер-инъекции можно делать нерегулярно по показаниям мониторинга иммунного ответа. Для пассив- 10009283 ной иммунизации с помощью антитела вводят дозы в интервале от 0,0001 до 1 мг/кг и более обычно от 0,01 до 5 мг/кг веса тела хозяина. Дозы нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногены, составляют интервалы примерно 10 нг-1 г, 100 нг-100 мг, 1 мкг-10 мг или 30-300 мкг ДНК на одного больного. Дозы инфекционных вирусных векторов варьируются от 10 до 109 или более вирионов на дозу. Агенты для индуцирования иммунного ответа можно вводить парентерально, местно, внутривенно,перорально, подкожно, внутрибрюшинно, назально, внутримышечно для профилактического и терапевтического лечения. Наиболее типичным способом введения является подкожный, хотя другие способы могут быть столь же эффективны. Следующим наиболее общим способом является внутримышечная инъекция. Такую инъекцию наиболее часто делают в мышцы рук или ног. Внутривенные инъекции, так же как внутрибрюшинные, внутриартериальные, внутричерепные или внутрикожные инъекции, эффективно вызывают иммунный ответ. В некоторых методах агенты вводят с помощью инъекции непосредственно в конкретную ткань, где аккумулируются отложения. Агенты по изобретению можно, при необходимости, вводить в сочетании с другими агентами, которые, по меньшей мере, частично эффективны при лечении амилоидогенного заболевания. В случае синдромов Альцгеймера и Дауна, при которых амилоидные отложения происходят в мозге, агенты по изобретению можно также вводить с другими агентами, которые улучшают прохождение агентов по изобретению через гематоэнцефалический барьер. Иммуногенные агенты по изобретению, например, такие как пептиды, иногда вводят в сочетании с адъювантом. Множество адъювантов может применяться в сочетании с пептидом, например A, для выявления иммунного ответа. Предпочтительные адъюванты усиливают истинный ответ на иммуноген, не вызывая коформационных изменений в иммуногене, которые влияют на качественную форму ответа. Предпочтительные адъюванты включают в себя квасцы, 3-Де-О-ацетилированный монофосфорильный липид А (MPL, МФЛ), см. английский патент 2220211. QS21 представляет собой тритерпеновый гликозид, или сапонини, выделенный из коры дерева Quillaja Saponaria Molina, растущего в Южной АмерикеPress, NY, 1995); патент США 5057540). Другие адъюванты являются эмульсиями масла (такого как сквален или арахисового масла) в воде, при необходимости в сочетании с иммуностимуляторами, такими как монофосфорильный липид А (см. Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91, 1997). Другим адъювантом является CpG (Bioworld Today, Nov. 15, 1998). Или же A может быть связан с адъювантом. Например,липопептидный вариант A можно получить, связывая пальмитиновую кислоту или другие липиды непосредственно с N-концом A, как описано для антигенной вакцины при гепатите В (Livingston, J. Immunol. 159, 1383-1392, 1997). Однако такое связывание практически не должно менять конформацию A так, чтобы влиять на природу иммунного ответа на него. Адъюванты могут вводиться в качестве компонента терапевтической композиции с активным агентом или могут вводиться самостоятельно (отдельно) перед введением терапевтического агента, одновременно с ним или после. Предпочтительным классом адъювантов являются соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия. Такие адъюванты могут применяться с или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких как MPL (МФЛ) или 3-ДМЗ, QS21, полимерные или мономерные аминокислоты, такие как полиглутаминовая кислота или полилизин. Другими классами адъювантов являются рецептуры эмульсий масло-в-воде. Такие адъюванты могут применяться с или без других специфических иммуностимулирующих агентов, таких, например, как мурамилпептиды (например,N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин(thr-MDP),N-ацетил-нормурамил-L-аланил-Dизоглутамин (nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоилsn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (МТР-РЕ), N-ацетилглюксаминил-N-ацетилмурамил-LAl-D-isoglu-L-Ala-дипальмитокси пропиламид (DTP-DPP) терамид) или другие компоненты оболочек бактериальных клеток. Водомасляные эмульсии включают:Span 85 (при необходимости, содержащую различные количества МТР-РЕ), приготовленную в виде мельчайших частиц с применением микрофлюидизатора, например, такого, как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton MA);b) SAF, содержащую 10% сквалана, 0,4% Tween 80, 5% Pluronic блок-полимера L121, и thr-MDP,либо микрофлюидизированную в тончайшую эмульсию, либо встряхиваемую с целью получить более крупнодисперсную эмульсию; с) Ribi- адъювантную систему (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащую 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или более компонентов оболочек бактериальных клеток из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL, МФЛ), димиколята трегалозы (TDM) и скелета клеточных оболочек(CWS), предпочтительно MPL (МФЛ)+CWS (Detox). Другим классом предпочтительных адъювантов являются сапониновые адъюванты, например, такие как Stimulon (QS21, Aquila, Worcester, MA), или порошки, получаемые из него, такие как ISCOM(иммуностимулирующие комплексы) и ISCOMATRIX. Другие адъюванты включают полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда. Другие адъюванты включают цитокины, такие как ин- 11009283 терлейкины (IL-1, IL-2 и IL-12), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CFS), фактор некроза опухолевых клеток (TNF). Адъювант можно вводить вместе с иммуногеном в виде единой композиции или можно вводить перед, одновременно или после введения иммуногена. Иммуноген и адъювант могут упаковываться и поставляться в одной и той же ампуле или в отдельных ампулах и смешиваться перед употреблением. Иммуноген и адъювант обычно упаковывают с этикеткой (вкладышем), на которой указывается предполагаемое терапевтическое применение. Если иммуноген и адъювант упакованы по одельности, упаковка обычно содержит инструкции по смешению перед употреблением. Выбор адъюванта и/или носителя зависит от устойчивости вакцины, содержащей адъювант, способа введения, схемы применения, эффективности адъюванта в отношении вида организма, подлежащего вакцинации, и, если это человек, фармацевтически приемлемым адъювантом является такой, который был одобрен или заслуживает одобрения для введения человеку соответствующими органами власти. Например, полный адъювант Фрейнда не пригоден для введения человеку. Квасцы, MPL (МФЛ) и QS21 являются предпочтительными. При необходимости могут одновременно применяться два или более различных адъюванта. Предпочтительные комбинации включают квасцы с MPL, квасцы с QS21, MPL с QS21 и квасцы, QS21 и MPL вместе. Также можно применять неполный адъювант Фрейнда (Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173186, 1998), при необходимости, в сочетании с любым из квасцов, QS21 и MPL и всеми их сочетаниями. Агенты по изобретению часто вводят в виде фармацевтических композиций, содержащих активный терапевтический и ряд других фармацевтически приемлемых компонентов. См. Remington's Pharmaceutical Science (15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1980). Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Композиции могут также включать, в зависимости от нужной рецептуры, фармацевтически приемлемые нетоксические носители или разбавители, которые называются наполнители, обычно применяемые при приготовлении фармацевтических композиций для введения человеку или животным. Разбавитель (растворитель) выбирают так,чтобы не повлиять на биологическую активность комбинации. Примерами таких растворителей являются дистиллированная вода, забуференный фосфатом физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и раствор Хэнка (Hank). Кроме того, фармацевтическая композиция или препарат (состав) может также содержать другие носители, адъюванты или нетоксические, нетерапевтические, неиммуногенные стабилизаторы и т.п. Однако некоторые реагенты, пригодные для введения животным, такие, например, как полный адъювант Фрейнда, обычно не включается в композиции, применяемые для людей. Фармацевтические композиции также могут содержать большие, медленно преобразующиеся в ходе обмена веществ макромолекулы, например, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты,полигликолевые кислоты и сополимеры (такие, как латексная функционализированная сефароза, агароза,целлюлоза и т.п.), полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и агрегации липидов (такие, как масляные капли или липосомы). Кроме того, эти носители могут действовать как иммуностимуляторы(т.е. адъюванты). Для парентерального введения агенты по изобретению могут вводиться в виде вводимых в качестве инъекций доз раствора или суспензии вещества в физиологически приемлемом растворителе с фармацевтическим носителем, который может быть стерильной жидкостью, такой как водные масла, физиологический раствор, глицерин или этанол. Кроме того, в композициях могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, поверхностно-активные вещества (сурфактанты),рН-буферирующие вещества и т.п. Другими компонентами фармацевтических композиций являются продукты переработки нефти, продукты животного, растительного происхождения или синтетические продукты, например, арахисовое масло, соевое масло или минеральное масло. Вообще говоря, гликоли,такие, например, как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, являются предпочтительными жидкими носителями, особенно для вводимых в качестве инъекций растворов. Как правило, композиции готовят в виде инъецируемых, либо в качестве жидких растворов, либо суспензий; также можно готовить твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препарат также можно эмульгировать или поместить в липосом или микрочастицы, такие как полиактид, полигликолид или сополимер, с целью усиления действия адъюванта, как обсуждалось выше (см. Langer, Science 249, 1527, 1990 и Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28, 97-119, 1997). Агенты по этому изобретению можно вводить в форме "depot"-инъекции, обеспечивающей замедленное всасывание, или имплантировать препарат, который можно готовить таким образом, чтобы обеспечить пролонгированное или пульсирующее высвобождение активного ингредиента. Дополнительные рецептуры, пригодные для других способов введения, включают пероральные, интраназальные и легочные рецептуры, суппозитории и трансдермальные аппликации. В случае суппозиториев связующие и носители содержат, например, полиалкиленгликоли или триглицериды; такие суппозитории можно получать из смесей, содержащих активный ингредиент в интервале 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные рецептуры содержат эксципиенты, например, такие, как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрийсахарин, целлюлоза и карбонат магния, фармацевтической степени чистоты. Эти композиции бывают в виде растворов, суспензий, таблеток, пилюль,капсул, препаратов пролонгированного действия или порошков и содержат 10-95% активного ингреди- 12009283 ента, предпочтительно 25-70%. Местные аппликации могут обеспечить трансдермальную или интрадермальную (внутрикожную) доставку. Местному введению может способствовать совместное введение агента с холерогеном или производным с пониженной токсичностью, или их субъединицами, или другими подобными бактериальными токсинами (см. Glenn et al., Nature 391, 851, 1998). Совместное введение можно осуществлять,применяя компоненты в виде смеси или в виде связанных молекул, полученных химическим перекрестным сшиванием, или экспрессией в виде слитого белка. Или же, трансдермальную доставку можно осуществлять, используя путь через кожу ("skin path" "кожный путь") или с помощью трансферосом (Paul et al., Eur. J. Immunol. 25, 3521-24, 1995; Cevc et al.,Biochem. Biophys. Acta 1368, 201-15, 1998).V. Методы диагностики. Изобретение предлагает методы выявления иммунного ответа на A-пептид у больного, страдающего болезнью Альцгеймера или восприимчивого к ней. Методы особенно применимы для мониторинга курса лечения, назначаемого больному. Методы можно применять для контроля как терапевтического лечения больных с симптомами заболевания, так и профилактического лечения больных с бессимптомным течением болезни. Некоторые методы требуют определения базового значения иммунного ответа у больного перед введением дозы агента и сравнения этого базового значения с величиной иммунного ответа после лечения. Значительное увеличение (т.е. более обычной ошибки опыта при повторных измерениях одного и того же образца, выраженной как одно стандартное отклонение от среднего из таких измерений) величины иммунного ответа говорит о положительном результате лечения (т.е. введение агента достигло результата или стимулировало иммунный ответ). Если величина иммунного ответа не изменяется значительно или уменьшается, это указывает на отрицательный результат лечения. В целом, ожидается, что у больных, проходящих начальный курс лечения агентом, при последующих дозах усилится иммунный ответ, который в конечном счете стабилизируется. Введение агента обычно продолжают, пока иммунный ответ увеличивается. Достижение постоянного значения (стабилизация) является показателем того, что лечение можно прекратить либо уменьшить дозу или частоту введения. В других методах контрольное значение (т.е. среднее и стандартное отклонение) иммунного ответа определяют для контрольной популяции. Обычно отдельные представители контрольной популяции не получали предварительного лечения. Величины иммунного ответа у больного, измеренные после введения терапевтического агента, сравнивают затем с контрольным значением. Значительное увеличение в сравнении с контрольным значением (например, большее, нежели одно стандартное отклонение от среднего) говорит о положительном результате лечения. Отсутствие заметного увеличения или снижение говорит об отрицательном результате лечения. Введение агента обычно продолжают, пока иммунный ответ увеличивается по сравнению с контрольным значением. Как и ранее, прекращение роста по сравнению с контрольным значением является показателем того, что лечение можно прекратить либо уменьшить дозу или частоту. В других методах контрольное значение иммунного ответа (например, среднее и стандартное отклонение) определяют у контрольной популяции отдельных представителей, которых подвергали лечению терапевтическим агентом и у которых иммунный ответ при лечении был постоянным. Измеренные величины иммунного ответа у больного сравнивают с контрольным значением. Если уровень, измеренный у больного, незначительно отличается (например, более одного стандартного отклонения) от контрольного значения, лечение можно прекратить. Если уровень у больного значительно ниже контрольного значения, оправдано продолжение введения агента. Если уровень у больного удерживается ниже контрольного значения, показано изменение схемы лечения, например применение другого адъюванта. В других методах у больного, который в настоящее время не получает лечения, но проходил курс лечения ранее, проверяют иммунный ответ для того, чтобы определить, требуется ли возобновить лечение. Значение иммунного ответа, измеренное у больного, можно сравнить с величиной иммунного ответа, ранее достигавшегося у больного после предыдущего курса лечения. Значительное снижение по сравнению с предыдущим измерением (т.е. более обычной ошибки опыта в повторных измерениях того же образца) является показателем того, что лечение можно возобновить. Или же, значение, измеренное у больного, можно сравнить с контрольным значением (среднее плюс стандартное отклонение), определенным для популяции больных после прохождения ими курса лечения. Или же, измеренное у пациента значение можно сравнить с контрольным значением для популяции профилактически пролеченных больных, у которых продолжают отсутствовать симптомы заболевания, или для популяции терапевтически пролеченных больных, у которых наблюдается улучшение показателей болезни. Во всех этих случаях значительное уменьшение по сравнению с контрольным уровнем (т.е. более стандартного отклонения) является показателем того, что лечение больного следует возобновить. Образцом ткани для анализа, как правило, является кровь, плазма, сыворотка, слизь или цереброспинальная жидкость больного. Образцы анализируют на признаки иммунного ответа на любую формуA-пептида, как правило A42. Иммунный ответ можно определять по наличию, например, антител или- 13009283 Т-клеток, которые специфически связываются с A-пептидом. ELISA-методы обнаружения антител, специфических к A, описаны в разделе "Примеры". Способы обнаружения реактивных Т-клеток описаны выше (см. раздел "Определения"). Изобретение дополнительно предоставляет диагностические наборы для описанных выше методов диагностики. Как правило, такие наборы содержат агент, который специфически связывается с антителами к A или реагирует с Т-клетками, специфическими относительно A. Набор также может содержать метку. Для обнаружения антител к A метка обычно находится в виде меченых антиидиотипических антител. Для обнаружения антител агент можно поставлять в предварительно связанном с твердой фазой виде, как, например, связанным с лунками микропланшета. Для обнаружения реактивных Т-клеток метка может вводиться в 3 Н-тимидин для измерения пролиферативного ответа. Наборы также обычно содержат описания по пользованию набором. Описания также могут содержать схему или другие соответствующие указания, величины, коррелирующие значения измеренных уровней с уровнями антител кA или Т-клеток, реактивных в отношении A. Термины "описания", "ярлыки", "этикетки" относятся к любому написанному или зафиксированному материалу, который относится к набору или иным образом сопровождает набор все время в процессе производства, транспортировки, продажи или использования. Например, термин "описания" охватывает рекламные листовки и брошюры, упаковочные материалы,инструкции, аудио- и видеокассеты, компьютерные диски, а также описания, напечатанные непосредственно на наборах. ПримерыI. Профилактическая эффективность A против AD. Эти примеры описывают введение пептида A42 трансгенным мышам, характеризующимся сверхпродукцией АРР с мутацией в положении 717 (АРР 717VF), что делает их предрасположенными к проявлению альцгеймероподобной нейропатологии. Получение и характеристики этих мышей (PDAPPмышей) описано в Games et al., Nature, см. выше. У этих животных в их гетерозиготной форме начинают появляться отложения A в 6-месячном возрасте. К 15 месяцам уровни отложений A у них эквивалентны уровню отложений, наблюдаемому при болезни Альцгеймера. Мышам PDAPP вводили агрегацииA42 (агрегированные A42) или забуференный фосфатом физиологический раствор. АгрегированныйA42 выбран вследствие своей способности индуцировать антитела к множественным эпитопам A. А. Методы. 1. Источник мышей. 30 самок гетерогенных мышей PDAPP произвольно делят на следующие группы: 10 мышам вводят агрегации A42 (одна умерла при перемещении),5 мышам вводят PBS/адъювант или PBS,10 контрольных мышей не получают ничего,5 мышам вводят сывороточный амилоидный белок (SAP). 2. Приготовление иммуногенов. Приготовление ассоциированного A42: 2 мг A42 (US Peptides Inc. lot K-42-12) растворяют в 0,9 мл воды и доводят до 1 мл, добавляя 0,1 мл 10PBS. Все стряхивают и перемешивают и термостатируют в течение ночи при 37 С в условиях агрегации пептида. Весь неиспользованный A хранят в виде сухого лиофилизированного порошка при -20 С до следующей инъекции. 3. Приготовление инъекций. 100 мг агрегированного A42 в PBS на одну мышь эмульгируют в соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (CFA) с конечным объемом эмульсии 400 мкл для первой иммунизации с последующей добавочной инъекцией такого же количества иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) через 2 недели. Две дополнительные дозы в IFA дают с месячными интервалами. Последующие иммунизации проводят с месячными интервалами в 500 мкл PBS. Инъекции делают внутрибрюшинно (i.p.). Инъекции PBS осуществляют по такому же графику и мышам вводят смесь 1:1 PBS/адъювант в количестве 400 мкл на мышь или 500 мкл PBS на мышь. Инъекции SAP делают по тому же расписанию,используя дозу 100 мкг на инъекцию. 4. Титрование образцов крови мышей, подготовка тканей и иммуногистохимия. Вышеназванные методы описаны в разделе "Общие материалы и методы". В. Результаты. Мышам PDAPP вводят либо агрегации A42 (ассоциированные A42), SAP-пептиды, либо забуференный фосфатом физиологический раствор. Группу мышей PDAPP оставляют без инъекций в качестве позитивного контроля. Титры мышей на агрегации A42 контролируют каждый следующий месяц с четвертого бустера до тех пор, пока мышам не исполнится год. Мышей умерщвляют в 13 месяцев. Во всех изученных временных точках 8 из 9 инъецированных агрегациями A42 мышей имеют высокий титр антивирусных антител, который остается высоким в серии инъекций (титры выше 1/10000). У девятой мыши низкий, но поддающийся измерению титр примерно 1/1000 (фиг. 1, табл. 1). Титр SAPP-инъецированных мышей составляет титры от 1:1000 до 1:30000 для этого иммуногена, за единственным исключением: мышь с титром 1:100000. В случае мышей, инъецированных PBS, титрование проводят против агрегированного A42 через 6,9 и 12 месяцев. При разбавлении 1/100 в группе "PBS-инъецированные мыши" при титровании против ассоциированного A42 титры превышают фон более чем в 4 раза только в одной точке, в других случаях они превышают фон менее чем в 4 раза во всех временных точках (табл. 1). SAP-специфический ответ незначителен во всех временных точках, значения всех титров менее 300. У 7 из 9 мышей в "ассоциированной A1-42" группе не обнаружен амилоид в мозге. Напротив,ткань мозга мышей в SAP- и PBS-группах содержит множественные 3D6-положительные амилоидные отложения в гиппокампе, а также в лобной и поясной коре. Характер отложения подобен отложениям у контрольных животных с типичным поражением восприимчивых подобластей, таких как внешний молекулярный слой зубчатой извилины гиппокампа. Одна мышь из A1-42-инъецированной группы имеет значительно уменьшенную амилоидную нагрузку, ограниченную гиппокампом. Изолированную (отдельную) бляшку идентифицируют у другой A1-42-обработанной мыши. Количественный анализ изображения амилоидного отложения (нагрузки) в гиппокампе подтверждает резкое уменьшение (его) у животных, получавших AN 1792 (фиг. 2). Средние значения амилоидной нагрузки для "PBS-группы" (2,22%) и для необработанной контрольной группы (2,65%) значительно больше значений для группы, иммунизированной AN 1792 (0,00%, р=0,0005). Напротив, среднее значение для группы, иммунизированной SAP-пептидами (SAPP), составляет 5,74%. Ткань мозга необработанных контрольных мышей содержит множественные A-амилоидные отложения, визуализированные с помощью A-специфического моноклонального антитела (mAb) 3D6 в гиппокампе, а также в ретросплениальной коре. Такие же особенности амилоидного отложения наблюдаются у мышей, иммунизированных SAPP или PBS (фиг. 2). Кроме того, в этих последних трех группах наблюдается характерное поражение восприимчивых подобластей мозга, типичных для AD, например, таких как внешний молекулярный слои зубчатой извилины гиппокампа во всех трех этих группах. Мозг, не содержащий A-отложений, не имеет также нейритных бляшек, которые обычно визуализируются у PDAPP-мышей с помощью антитела 8 Е 5 к человеческому АРР. Мозг всех животных оставшихся групп (SAP-инъецированных, PBS и неинъецированных мышей) содержит множественные нейритные бляшки, типичные для непролеченных мышей PDAPP. Малое число нейритных бляшек имелось у одной мыши, получавшей AN 1792, и единственное скопление дистрофических нейритов обнаружено у второй мыши, пролеченной AN 1792. Анализ изображения гиппокампа, как изображено на фиг. 3, показывает действительное исчезновение дистрофических нейритов у AN 1792-пролеченных мышей (в среднем 0%) по сравнению с PBS-реципиентами (среднее 0,28%, р=0,0005). Астроцитоз, характерный для ассоциированного с бляшками воспаления, также отсутствует в мозгеA1-42-инъецированной группы. Мозг мышей в других группах содержит обильные и составляющие скопления GFAP-позитивные астроциты, типичные для ассоциированного с A-бляшками глиоза. Препараты субпопуляции, взаимодействующие с GFAP, контрастно окрашивают тиофлавином S, чтобы локализовать A-отложения. GFAP-позитивные астроциты дают ассоциаты с A-бляшками у SAP-, PBS- и непролеченных контрольных мышей. Такой ассоциации не обнаружено у бляшконегативных A1-42 пролеченных мышей, хотя минимальный обусловленный бляшками глиоз найден у одной мыши, пролеченной AN 1792.- 15009283 Анализ изображения, показанный на фиг. 4 для ретросплениальной коры, подтверждает, что уменьшение астроцитоза является значительным со средним значением 1,56 для мышей, пролеченныхAN 1792, по сравнению со средними значениями более 6% для групп, иммунизированных SAPпептидами, PBS или непролеченных (р=0,0017). Данные, полученные для субпопуляции A1-42- и PBS-инъецированных мышей, показывают, что обусловленная бляшками MHC II иммунореактивность отсутствует у A1-42-инъецированных мышей,что согласуется с отсутствием связанной с A воспалительной реакцией. Срезы мозга также реагировали с mAb, специфически связывающимся с MАC-1, белков поверхности клеток. MАC-1 (CD11b) является членом семейства интегринов и существует в качестве гетеродимера с CD18. Комплекс CD11/CD18 находится в (на поверхности) моноцитах, макрофагах, нейтрофилах и природных клетках-киллерах (Mac and Simard). Резидентным MАC-1-реактивным типом клеток мозга является, по-видимому, микроглия, на основании сходной (подобной) фенотипической морфологии вMАC-1 иммунореактивных срезах. Обусловленное бляшками MАC-1-мечение ниже в мозге мышей, пролеченных AN 1792, по сравнению с PBS контрольной группой, это открытие согласуется с отсутствиемA-индуцированной воспалительной реакции. С. Выводы Отсутствие A-бляшек и реактивных нейронных и глиотических изменений мозга A1-42 инъецируемых мышей указывает на то, что в их мозгу либо совсем не отлагается, либо отлагается чрезвычайно мало амилоидных отложений, и патологические последствия, такие, например, как глиоз и невритическая (невритная) патология, отсутствуют. У PDAPP-мышей, пролеченных A1-42, наблюдается практически такое же отсутствие патологии, что у контрольных нетрансгенных мышей. Следовательно,A1-42-инъекции являются высокоэффективными для предотвращения отложения или для удаления человеческого A из тканей мозга и ликвидации последующих нейронных и воспалительных дегенеративных изменений, т.е. введение A-пептида оказывает благоприятное терапевтическое действие при предотвращении AD.II. Изучение эффекта дозы. Группы самок мышей Swiss Webster в возрасте пяти недель (N=6 в группе) иммунизируют с помощью 300; 100; 33; 11; 3,7; 1,2; 0,4 или 0,13 мкг A в виде рецептуры с CFA/IFA, вводимой внутрибрюшинно. Вводят три дозы с двухнедельными интервалами с последующей через один месяц четвертой дозой. Первую дозу эмульгируют в CFA, а остальные дозы эмульгируют с IFA. У животных берут кровь через 4-7 дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для определения титров антител. У животных субпопуляции из трех групп, иммунизированных с помощью 11, 33 или 300 мкг антигена, дополнительно отбирают пробу крови примерно с месячными интервалами в течение четырех месяцев после четвертой иммунизации для контроля за ослаблением иммунного ответа в интервале доз для вакцинации. Последнюю, пятую иммунизацию этих животных проводят через семь месяцев после начала исследования. Их умерщвляют через неделю после этого с целью измерения гуморального иммунного ответа на AN 1792 и для проведения токсикологических анализов. Убывающий эффект дозы наблюдают от 300 к 3,7 мкг или отсутствие эффекта в случае двух самых низких доз. Средние титры антител составляют примерно 1:1000 после 3 доз и примерно 1:10000 после 4 доз по 11-300 мкг антигена (см. фиг. 5). Титры антител резко возрастают во всех случаях, за исключением группы с самыми низкими дозами, после третьей иммунизации с увеличением GMT в 5-25-кратном интервале. Низкий (слабый) гуморальный иммунный ответ затем наблюдают даже у 0,4 мкг-реципиентов. У групп, получавших 1,2 и 3,7 мкг, титры сравнимы с GMT примерно 1000, а самые высокие четыре дозы ассоциируются с GMT,примерно 25000, за исключением группы, получавшей дозу 33 мкг, с более низким GMT 3000. При последующих четырех иммунизациях увеличение титра более умеренное для большинства групп. Наблюдается четкий эффект дозы в группах с более низкой дозой антигена от 0,14 до 11 мкг в интервале от неразличимого антитела для 0,14 мкг-реципиентов до GMT 36000 для реципиентов 11 мкг. И снова титры для четырех групп с наиболее высокими дозами от 11 до 300 мкг соответствовали друг другу. Так, после двух иммунизаций титр антител зависит от дозы антигена в широком интервале от 0,4 до 300 мкг. При третьей иммунизации титры для всех четырех групп с наиболее высокими дозами сопоставимы и остаются постоянными после дополнительной иммунизации. Через месяц после четвертой иммунизации в группе с дозой 300 мкг титры в 2-3 раза выше, чем титры, измеренные в крови, взятой через пять дней после иммунизации (фиг. 6). Это наблюдение подтверждает, что максимальный анамнестический гуморальный иммунный ответ возникает позднее 5 дней после иммунизации. Более умеренное (50%) увеличение наблюдают в это время в группе, получавшей дозу 33 мкг. В группе, получавшей дозу 300 мкг, через два месяца после последней дозы значения GMT резко понижаются, примерно, на 70%. Еще через месяц падение менее резкое, 45% (100 мкг) и около 14% для доз 33 и 11 мкг. Следовательно, скорость уменьшения титров циркулирующих антител после прекращения иммунизации, по-видимому, имеет две фазы с резким падением в первый месяц после мак- 16009283 симального (пика) ответа с последующей более умеренной скоростью уменьшения впоследствии. Титры антител и кинетика иммунного ответа этих мышей Swiss Webster подобны титрам антител и кинетике иммунного ответа молодых гетерозиготных трансгенных PDAPP-мышей, иммунизированных аналогичным образом. Дозировки, эффективные для того, чтобы индуцировать иммунный ответ у человека, обычно сходны с дозировками, эффективными в случае мышей.III. Скрининг на терапевтическую активность в отношении установленной AD (болезни Альцгеймера). Этот анализ проводят для того, чтобы испытать иммуногенный агент на активность по угнетению или реверсии нейропатологических характеристик AD у животных. Иммунизацию с помощью A протяженностью 42 аминокислоты (AN 1792) начинают в той временной точке, когда амилоидные бляшки уже присутствуют в мозгу PDAPP-мышей. По истечении периода лечения, применяемого в данном исследовании, у непролеченных PDAPPмышей наблюдается ряд нейродегенеративных изменений, которые напоминают изменения при ADA в виде амилоидных бляшек ассоциируется с дегенеративной нейронной реакцией, представляющей собой аберрантные (неправильные) аксоны и дендриты, называемые дистрофическими нейритами. Амилоидные отложения, окруженные дистрофическими нейритами и содержащие их, называются нейритными бляшками. Как у AD-, так и у PDAPP-мыши, дистрофические нейриты имеют определенную глобулярную структуру, иммунореактивны в отношении антител, распознающих АРР и цитоскелетные компоненты, и демонстрируют комплексные субклеточные дегенеративные изменения на ультраструктурном уровне. Эти особенности позволяют делать необходимые в случае заболевания селективные и воспроизводимые измерения образования нейритных бляшек в мозгу PDAPP-мыши. Дистрофическая нейронная компонента PDAPP нейритных бляшек легко визуализируется с помощью антитела, специфического к человеческому АРР (mAb 8E5), и легко определима с помощью компьютерного анализа изображения. Следовательно, помимо измерения влияния AN 1792 на образование амилоидных бляшек контролируется влияние этого лечения на развитие нейритной дистрофии. Астроциты и микроглия не нейронными клетками, которые отвечают на нейронное повреждение и отражают степень нейронного повреждения. GFAP-позитивные астроциты и микроглия MHC II степени обычно наблюдаются при AD, и их активация повышается с тяжестью заболевания. Следовательно, также контролируется развитие реактивных астроцитов и микроглиоза у пролеченных AN 1792 пролеченных мышей. А. Материалы и методы. 48 гетерогенных самок PDAPP-мышей в возрасте 11-11,5 месяцев, полученных от Chales River,произвольно делят на две группы: 24 мышей иммунизируют с помощью 100 мкг AN 1792,24 мышей иммунизируют PBS, во всех случаях вместе с адъювантом Фрейнда. Группы AN 1792 и PBS снова делят по достижении 15 месяцев. В возрасте 15 месяцев примерно половину каждой группы AN 1792- и PBS-пролеченных мышей умерщвляют (эвтаназия) (n=10 и 9 соответственно), иммунизацию остальных продолжают до окончания в возрасте 18 месяцев (n=9 и 12 соответственно). В целом 8 мышей (5 AN 1792, 3 PBS) (сами) умерли во время исследования. Помимо иммунизированных животных для сравнения были включены непролеченные PDAPP-мыши в возрасте 1 года(n=10), 15 месяцев (n=10) и 18 месяцев (n=10) - в ELISA для измерения A и АРР-уровней в мозге; животные в возрасте одного года также участвуют в иммуногистохимических анализах. Методология такая же, как в примере 1, если не указано иначе. Для приготовления антигена для шести иммунизаций до достижения мышами 15-месячного возраста применяют AN 1792 - US Peptide лот 12 и California Peptides лот МЕ 0339. California Peptides лоты МЕ 0339 и МЕ 0439 применяют для трех дополнительных иммунизаций от 15 до 18 месяцев. Для иммунизации 100 мкг AN 1792 в 200 мкл PBS или один PBS эмульгируют в соотношении 1:1(по объему) с полным адъювантом Фрейнда (CFA), или неполным адъювантом Фрейнда (IFA), или PBS в конечном объеме 400 мкл. Первую иммунизацию проводят с CFA в качестве адъюванта, следующие четыре дозы - с IFA и конечные четыре дозы - с одним PBS без добавления адъюванта. Всего проводят девять иммунизаций за семь месяцев с двухнедельным интервалом для первых трех доз, с последующим четырехнедельным интервалом для остальных инъекций. Группа мышей, пролеченная в течение четырех месяцев, умерщвленная в возрасте 15 месяцев, получает только первые 6 иммунизаций. В. Результаты. 1. Действие AN 1792-терапии на амилоидную нагрузку. Результаты AN 1792-терапии на кортикальную амилоидную нагрузку, определенные количественным анализом изображения, показаны на фиг. 7. Среднее значение кортикальной амилоидной нагрузки 0,28% в группе непролеченных PDAPP-мышей 12-месячного возраста, типичная величина нагрузки бляшек у мышей в начале исследования. В возрасте 18 месяцев амилоидная нагрузка увеличивается более чем в 17 раз до 4,87% у PBS-пролеченных мышей, тогда как у AN 1792-пролеченных мышей амилоидная нагрузка значительно снижена и составляет лишь 0,01%, заметно меньше, чем у 12-месячных непроле- 17009283 ченных и в обеих 15- и 18-месячных PBS-обработанных группах. Амилоидная нагрузка значительно снижена у AN 1792-реципиентов как в случае 15 (96% снижение; р=0,003), так и 18 (99% снижение; р=0,0002) месяцев. Обычно кортикальное амилоидное отложение у PDAPP-мышей начинается во фронтальной и ретросплениальной области коркового вещества (RSC) и прогрессирует в направлении вентральнолатеральной области (ЕС). Мало амилоида или совсем его не обнаружено в ЕС 12-месячных мышей примерный возраст, при котором начинают вводить AN 1792. Через 4 месяца лечения AN 1792 амилоидное отложение значительно уменьшается в RSC-области, и прогрессивное воспаление ЕС совершенно исчезает при AN 1792-терапии. Последнее наблюдение показывает, что AN 1792 полностью останавливает прогрессирование амилоида, который при естественном течении занял бы височную и брюшную(темпоральную и вентральную) области коркового вещества, а также прекращает или, возможно, ревертирует отложение в RSC. Глубокое воздействие AN 1792-терапии на развитие кортикальной амилоидной нагрузки у PDAPPмышей дополнительно демонстрируется на примере 18-месячной группы, которую лечили семь месяцев. У AN 1792-пролеченных мышей обнаружено почти полное отсутствие кортикального амилоида при полном исчезновении диффузных бляшек, а также уменьшение плотных отложений. 2. Цитологические и морфологические измерения, обусловленные AN 1792-терапией. Популяция A-позитивных клеток обнаружена в тех областях мозга, в которых, как правило, наблюдаются амилоидные отложения. Удивительно то, что в мозге нескольких AN 1792-реципиентов обнаружено очень мало или совсем не обнаружено экстрацеллюлярных кортикальных амилоидных бляшек. По-видимому, большая часть A-иммунореактивности сосредоточена в клетках с большой дольчатой или агглютинированной сомой. Фенотипически эти клетки похожи на активированные микроглию или моноциты. Они являются иммунореактивными в отношении антител, распознающих лиганды, экспрессируемые активированными моноцитами или микроглией (MHC II и CD116), и в редких случаях (случайно) ассоциируются со стенкой или полостью кровеносных сосудов. Сравнение почти примыкающих(почти сопредельных) срезов, меченых A, и MHC II-специфических антител показывает, что сходные особенности этих клеток распознаются обоими классами антител. Детальное изучение AN 1792 пролеченного мозга показывает, что MHC II-позитивные клетки ограничены близостью органических остатков амилоида у этих животных. В применяемых условиях фиксации клетки не являются иммунореактивными в отношении антител, которые распознают Т-клеточные (CD3, CD3e) или В-клеточные(CD45RA, CD45RB) лиганды или общий лейкоцитарный антиген (CD45), но являются реактивными в отношении антитела, распознающего лейкозиалин (CD43), который перекрестно реагирует с моноцитами. Такие клетки не обнаружены ни у одной из PBS-пролеченных мышей. У PDAPP-мышей обнаруживается плотное амилоидное отложение во внешнем молекулярном слое зубчатой извилины гиппокампа. Отложение образует четкую полосу внутриперфорантного пути, подобласти, в которой традиционно находятся амилоидные плашки при AD. Характерное появление этих отложений у PBS-пролеченных мышей напоминает таковое, ранее характеризовавшее непролеченныхPDAPP-мышей. Амилоидное отложение состоит как из диффузных, так и из плотных (компактных) бляшек в виде непрерывной полосы (кромки). Напротив, эта структура в мозгу ряда AN-пролеченных мышей резко изменяется. Амилоидное отложение в гиппокампе более не содержит диффузного амилоида, а слитая (в виде полосы) структура полностью разрушается. Вместо этого имеется ряд необычных точечных структур, реактивных в отношении анти-А-антител, некоторые из которых, по-видимому, являются амилоидсодержащими клетками.MHC II-позитивные клетки часто наблюдаются вблизи от экстрацеллюлярного амилоида уAN 1792-пролеченных животных. Характер ассоциации A-позитивных клеток с амилоидом в мозгу нескольких AN 1792-пролеченных мышей очень похож. Распространение этих моноцитарных клеток ограничивается близостью амилоидного отложения и совершенно в других областях мозга, не содержащихA-бляшек. Количественный анализ изображения MHC-II и MAC-1-меченых срезов показывает тенденцию к повышенной иммунореактивности в RSC и гиппокампе AN 1792-пролеченных мышей по сравнению сPBS-группой, которая становится значимой при измерении MAC-1-реактивности в гиппокампе. Эти результаты указывают на активное, опосредуемое клетками удаление амилоида в содержащих бляшки участках мозга. 3. Влияние AN 1792 на уровень A: определение с помощью ELISA. а) Содержание (уровни) в коре. У непролеченных PDAPP-мышей средний уровень тотального A в коре в возрасте 12 месяцев составляет 1600 нг/г, который повышается до 8700 нг/г к 15 месяцам (табл. 2). В возрасте 12 месяцев эта величина составляет 22000 нг/г, увеличение более чем в 10 раз за время эксперимента. У PBSпролеченных животных тотальный A составляет 8600 нг/г в 15 месяцев и увеличивается до 19000 нг/г в 18 месяцев. Напротив, AN 1792-пролеченные животные содержат на 81% меньше тотального A в 15 месяцев (1600 нг/г), чем PBS-иммунизированная группа. Значительно меньшее (р=0,0001) тотального A(5200 нг/г) обнаружено в 18 месяцев, когда сравнивают AN 1792- и PBS-группы (табл. 2), эта величина соответствует 72% уменьшению A по сравнению с возможным уровнем (который был бы без этой терапии). Сходные результаты получены при сравнении кортикальных уровней A42, а именно, что AN 1792-пролеченная группа содержит значительно меньше A42, но в этом случае разница между AN 1792 и PBS-группами значительна, как в 15 месяцев (р=0,04), так и в 18 месяцев (р=0,0001, табл. 2). Таблица 2 Средние уровни A (нг/г) в коре Непролеченныеb) Содержание (уровни) в гиппокампе. У непролеченных PDAPP-мышей средний уровень тотального A в гиппокампе в 12 месяцев составляют 15000 нг/г, в 15 месяцев увеличиваются до 51000 нг/г и затем в 18 месяцев увеличиваются до 81000 нг/г (табл. 3). Аналогично, у PBS-иммунизированных мышей эти величины составляют 40000 и 65000 нг/г в 15 месяцев и в 18 месяцев соответственно. У AN 1792-иммунизированных мышей наблюдаются меньшие уровни тотального A, а именно 25000 и 51000 нг/г соответственно в 15 месяцев и в 18 месяцев. В группе 18-месячных AN 1792-пролеченных мышей значение значительно ниже значения в с) Содержание (уровни) в мозжечке. У 12-месячных непролеченных PDAPP-мышей средний уровень тотального A в мозжечке составляет 15 нг/г (табл. 4). В 15 месяцев этот средний уровень повышается до 28 нг/г и к 18 месяцам увеличивается до 35 нг/г. У PBS-пролеченных мышей средние значения уровней тотального A составляют 21 нг/г в 15 месяцев и 43 нг/г в 18 месяцев. Обнаружено, что у AN 1792-пролеченных животных содержание тотального A в 15 месяцев составляет 25 нг/г и значительно меньше (р=0,002) содержание тотального A в 18 месяцев (25 нг/г), чем в соответствующем PBS-группе (табл. 4). 4. Эффект AN 1792-терапии на уровни АРР Обе молекулы - АРР- и непроцессированного АРР - содержат всю или часть последовательности и, следовательно, потенциально на них может влиять возникновение AN 1792-направленного иммунного ответа. В современных исследованиях было отмечено слабое повышение уровней АРР по мере увеличения невропатологии у PDAPP-мышей. В коре уровни либо АРР- /FL (непроцессированный), либо АРР- практически не изменяются при лечении, за исключением того, что уровень APP- снижен на 19% в 18 месяцев у AN 1792-пролеченных по сравнению с PBS-пролеченной группой. Значения АРР у 18-месячных AN 1792-пролеченных мышей незначительно отличаются от значений в группах 12 месячных непролеченных и 15-месячных PBS. Во всех случаях значения АРР остаются в интервалах значений, обычно обнаруживаемых у PDAPP-мышей. 5. Эффект AN 1792-терапии на нейродегенеративную и глиотическую патологию. Нейритные бляшки значительно уменьшаются во фронтальной области коры головного мозга уAN 1792-пролеченных мышей по сравнению с PBS-группой как в 15- (84%; р=0,03), так и в 18-месячном(55%; р=0,01) возрасте (фиг. 8). Средняя величина нагрузки - нейритных бляшек - увеличивается от 0,32 до 0,49% в PBS-группе между 15 и 18 месяцами. Это противоположно значительному замедлению роста нейритных бляшек в AN 1792-группе со средним значением нагрузки - нейритных бляшек - равным 0,05 и 0,22% в 15- и 18-месячных группах соответственно. По-видимому, иммунизация AN 1792 хорошо переносится, и реактивный астроцитоз также значительно уменьшается в RSC AN 1792-пролеченных мышей по сравнению с PBS-группой как в возрасте 15(56%; р=0,011), так и в возрасте 18 (39%; р=0,028) месяцев (фиг. 9). Средние значения (в процентах) астроцитоза в RSC-группе увеличивается между 15 и 18 месяцами от 4,26 до 5,21%. AN 1792-терапия подавляет развитие астроцитоза в обеих временных точках до 1,89 и 3,2% соответственно. Это подтверждает, что нейрофил не нарушается в процессе клиренса. 6. Гуморальный (антительный) иммунный ответ. Как описано выше, 11-месячные гетерозиготные PDAPP-мыши (N=24) получают серию из 5-й иммунизации по 100 мкг AN 1792, эмульгированного с адъювантом Фрейнда и вводимого внутрибрюшинно в 0, 2, 4, 8 и 12 недели, и 6-й иммунизации одним PBS (без адъюванта Фрейнда) на 16 неделе. В качестве негативного контроля аналогичная группа из 24 трансгенных мышей того же возраста подвергают иммунизации PBS, эмульгированным с теми же адъювантами и даваемым по той же схеме. У животных берут кровь на анализ через 3-7 дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы. Гуморальный иммунный ответ на AN 1792 определяют методом ELISA. Геометрические средние титры (GMT) для животных, иммунизированных AN 1792, равны, примерно, 1900, 7600 и 45000 после второй, третьей и последней (шестой) доз соответственно. Никакого A-специфического антигена не найдено у контрольных животных после 6-й иммунизации. Примерно половину животных пролечивают еще в течение трех месяцев, иммунизируя их, примерно, на 20, 24 и 27 неделе. Каждую из этих доз дают в одном носителе PBS без адъюванта Фрейнда. Средние титры антител остаются постоянными в течение этого времени. В действительности титры антител,по-видимому, постоянны с четвертого до восьмой пробы крови, соответствующих периоду, охватывающему с пятой до девятой инъекции. Чтобы определить, ассоциируются ли A-специфические антитела, выявляемые иммунизацией, обнаруженные в сыворотке AN 1792-пролеченных мышей, также с амилоидными отложениями в мозге,проверяют реакцию серии срезов AN 1792- и PBS-пролеченных мышей с антителом, специфическим относительно мышиного IgG. В противоположность PBS-группе A-бляшки мозга животных, пролеченныхAN 1792, покрыты эндогенным IgG. Это различие двух групп наблюдается как в 15-, так и в 18-месячных группах. Особенно удивительно отсутствие лечения в PBS-группе, несмотря на наличие плотной амилоидной нагрузки у этих мышей. Эти результаты показывают, что иммунизация синтетическим A-белком генерирует антитела, которые распознают и связываются in vivo с A в амилоидных бляшках.- 20009283 7. Опосредуемый клетками иммунный ответ. Через 7 дней после 9-й иммунизации у девяти AN 1792-иммунизированных и 12 PBSиммунизированных 18-месячных PDAPP-мышей удаляют селезенку. Спленоциты отделяют и культивируют в течение 72 ч в присутствии A40, A42 или A40-1 (белок с обратным порядком аминокислотных остатков). В качестве позитивного контроля служит митоген Con А. Оптимальные ответы получены с белком более 1,7 мкМ. В ответ как на белок A1-40, так и на белок A1-42 происходит пролиферация клеток всех девяти AN 1792-пролеченных животных с равными уровнями включения обоих белков(фиг. 10, верхний рисунок). Не наблюдается ответа на A40-1-обратный белок. Клетки контрольных животных не отвечают ни на один из A-белков (фиг. 10, нижний рисунок). С. Выводы. Результаты этого исследования показывают, что AN 1792-иммунизация PDAPP-мышей с имеющимися амилоидными отложениями замедляет и предотвращает амилоидное отложение и задерживает последующие не невропатологические изменения мозга у старых PDAPP-мышей. Иммунизация с помощьюAN 1792 практически прекращает рост структур, которые в нормальных условиях подверглись бы амилоидозу. Следовательно, введение A-пептида оказывает терапевтическое действие при лечении AD.IV. Скрининг A-фрагментов. 100 PDAPP-мышей в возрасте 9-11 месяцев иммунизируют с помощью 9 различных областей АРР иA для определения, какие эпитопы передают иммунный ответ. 9 различных иммуногенов и один контрольный вводят i.p. (интраперитонеально, внутрибрюшинно), как описано выше. Иммуногены включают четыре конъюгата человеческого A-пептида 1-12, 13-28, 32-42, 1-5, все связанные с антителом овцы к IgG мыши через цистеиновую связь; АРР-полипептид 592-695, ассоциированный (агрегация) человеческий A1-40, и ассоциированный человеческий A25-35 и ассоциированный A42 грызунов. Агрегация A42 и PBS использовались в качестве контрольных. В группу для терапии берут 10 мышей. Титры контролируют, как указано выше, и мышей умерщвляют по окончании 4 месяцев инъецирования. Гистохимические анализы, определение A-уровней и токсикологические анализы проводят после умерщвления (post mortem). А. Материалы и методы. 1. Приготовление иммуногенов. Получение связанных A-пептидов: четыре конъюгата человеческого A-пептида (аминокислотные остатки 1-5, 1-12, 13-28 и 33-42, каждый конъюгирован с антителом овцы к IgG мыши) получают связыванием через синтетический цистеин, присоединенный к A-пептиду с применением перекрестно связывающего реагента сульфо-EMCS. Производные A-пептида синтезируют с помощью следующих конечных аминокислотных последовательностей. В каждом случае местоположение цистеиновой вставки указано подчеркиванием. Производное A13-28-пептида также содержит два остатка глицина, присоединенных перед цистеином на карбоксильном конце, как указано. Для приготовления к реакции связывания 10 мг антител овцы к IgG мыши (Jackson ImmunoResearchLaboratories) подвергают диализу в течение ночи против 10 мМ натрийборатного буфера, рН 8,5. Антитело после диализа концентрируют до объема 2 мл, используя пробирку Amicon Centriprep. 10 мг сульфо-EMCS [N-(-малеимидокупроилокси)сукцинимида] (Molecular Sciences Co.) растворяют в 1 мл деионизированной воды. К антителу овцы к IgG мыши при перемешивании по каплям прибавляют 40-кратный молярный избыток сульфо-EMCS, а затем раствор перемешивают еще 10 мин. Активированное антитело овцы против IgG мыши очищают и осуществляют буферный обмен, пропуская через 10-мл колонку для гель-фильтрации (Pierce Presto Column, поставляется Pierce Chemicals), уравновешенную 0,1 M NaPO4, 5 мМ EDTA, рН 6,5. Фракции, содержащие антитело, идентифицируют с помощью поглощения при 280 нм, объединяют и разбавляют до концентрации примерно 1 мг/мл, используя 1,4 мг на OD в качестве коэффициента экстинции. 40-кратный молярный избыток A-пептида растворяют в 20 мл 10 мМ NaPO4, рН 8,0, за исключением A33-42-пептида, 10 мг которого сначала растворяют в 0,5 мл ДМСО, а затем разбавляют до 20 мл 10 мМ NaPO4 буфером. Каждый раствор пептида добавляют к 10 мл активированного антитела овцы к IgG мыши и встряхивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Образующиеся конъюгаты концентрируют до конечного объема менее 10 мл, применяя пробирку Amicon Centriprep, а затем подвергают диализу против PBS, чтобы провести буферный обмен и удалить свободный пептид. Конъюгаты пропускают через фильтры с размером пор 0,22 мкм для стерилизации, а затем готовят аликвоты-фракции по 1 мг и хранят в замороженном виде при -20 С. Концентрации конъ- 21009283 югатов определяют ВСА-белковым анализом (Pierce Chemicals) с лошадиным IgG для стандартной кривой. Конъюгация подтверждается увеличением молекулярного веса конъюгированных пептидов по сравнению с молекулярным весом активированного антитела овцы к IgG мыши. Конъюгат A1-5 с антителом овцы к IgG мыши является пулом двух конъюгатов, остальные представляют собой единичный препарат. 2. Препарат агрегаций (ассоциированных) A-пептидов. Человеческий 1-40 (AN 1528; California Peptides Inc., лот МЕ 0541), человеческий 1-42 (AN 1792;Inc., лот МЕ 0218) пептиды солюбилизируют непосредственно перед приготовлением каждого набора инъекций, используя лиофилизированные порошки, хранящиеся в сухом виде при -20 С. Для этой цели 2 мг пептида добавляют к 0,9 мл деионизированной воды и смесь встряхивают и перемешивают до получения сравнительно однородного раствора или суспензии. Из четырех только AN 1528-пептид растворим на этой стадии. Добавляют затем аликвоту - 100 мкл 10 Х PBS (1X PBS: 0,15 М NaCl, 0,01 М фосфата натрия, рН 7,5), и в этот момент AN 1528 начинает выпадать. Суспензию встряхивают, перемешивают снова и термостатируют в течение ночи при 37 С для использования на следующий день. Получение рВ 6-белка. Плазмида экспресс, кодирующая рВ 6, слитый белок, состоящий из N-концевой лидерной последовательности полимеразы 100-аминокислотного бактериофага MS2 с последующими аминокислотами 592-695 белка АРР (APP) конструируют, как описано Oltersdorf et al., J. Biol. Chem. 265, 4492-4497,1990. Плазмиду трансфицируют в Е. coli и белок экспрессирует после индукции промотора. Бактерии лизируют в 8 М мочевине и рВ 6 частично очищают препаративным SDS PAGE. Фракции, содержащие рВ 6, идентифицируют вестерн-блоттингом, используя кроличье поликлональное антитело к рВ 6, объединяют, концентрируют с применением пробирки Amicon Centriprep и подвергают диализу против PBS. Чистота препарата, оцениваемая окрашиванием SDS PAGE с помощью Кумасси синего, составляет примерно 5-10%. В. Результаты и обсуждение. 1. Порядок исследования. 100 мужских и женских особей 9-11-месячных гетерозиготных трансгенных PDAPP-мышей получены из лабораторий Charles River и Taconic. Мышей делят на 10 групп для иммунизации различными участками A или АРР вместе с адъювантом Фрейнда. Животных делят так, чтобы внутри группы они как можно более соответствовали друг другу по полу, возрасту, родословной и источнику. Иммуногены включают четыре A-пептида, полученных из последовательности человеческого белка, 1-5, 1-12, 13-28 и 33-42, каждый в виде конъюгата с антителом овцы к IgG мыши; четыре агрегации A-пептидов, человеческого 1-40 (AN 1528), человеческого 1-42 (AN 1792), человеческого 25-35 и 1-42 грызунов; и слитой полипептид, обозначенный рВ 6, содержащий аминокислотные остатки 592-695 белка АРР. Десятую группу в качестве контрольной иммунизируют PBS в сочетании с адъювантом Фрейнда. Для каждой иммунизации 100 мкг каждого A-пептида в 200 мкл PBS или 200 мкг АРРпроизводного pB6 в том же объеме PBS или один PBS эмульгируют в объемном соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (CFA) с конечным объемом 400 мкл для первой иммунизации с последующей бустер-иммунизацией тем же количеством иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) для последующих четырех доз и PBS для конечной дозы. Иммунизацию осуществляют внутрибрюшинно по двухнедельному графику для первых трех доз, затем с месячным интервалом. Пробы крови животных берут через четыре-семь дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для измерения титров антител. Животных умерщвляют, примерно, через неделю после конечной дозы. 2. Уровни A и АРР в мозге. После примерно 4 месяцев иммунизации различными A-пептидами или производным АРР мозг удаляют из находящихся в физиологическом растворе животных. Одно полушарие готовят для иммуногистохимического анализа, а второе используют для количественного определения A- и АРР-уровней. Для измерения концентрации различных форм амилоидного пептида и амилоидного белкапредшественника полушарие рассекают и готовят гомогенаты области гиппокампа, коры и мозжечка в 5 М гуанидине. Эти гомогенаты разбавляют и уровень амилоида или АРР определяют количественно,сравнивая с серией разведений стандартного A-пептида или АРР с известными концентрациями в формате ELISA. Средняя концентрация тотального A для контрольной группы, иммунизированной PBS, в 5,8 раз выше в гиппокампе, чем в коре (в среднем 24318 нг/г в ткани гиппокампа по сравнению с 4221 нг/г в коре). Средний уровень в мозжечке в контрольной группе (23,4 нг/г ткани) примерно в 1000 раз ниже, чем в гиппокампе. Эти уровни подобны уровням для гетерозиготных PDAPP-трансгенных мышей того же возраста, о которых сообщалось ранее (Johnson-Woods et al., 1997, см. выше). В коре субпопуляции из пролеченных групп средние уровни тотального А и A1-42 значительно отличаются от уровней контрольной группы (р 0,05), причем этим животным дают AN 1792, A1-42 грызунов или конъюгат A1-5-пептида, как показано на фиг. 11. Средние уровни тотального A пониже- 22009283 ны на 75, 79 и 61% соответственно, по сравнению с контрольными для этих подопытных групп. Нет заметной корреляции между титрами A-специфических антител и уровнями A в области коры головного мозга ни в одной из групп. В гиппокампе среднее уменьшение тотального A, обусловленное AN 1792-терапией (46%,р=0,0543) не так велико, как в коре (75%, р=0,0021). Однако величина уменьшения значительно больше в гиппокампе, чем в коре: общее уменьшение 11186 нг/г ткани в гиппокампе по сравнению с 3171 нг/г ткани в коре. В группах животных, получавших A1-42 грызунов или A1-5, средние уровни тотальногоA, понижаются на 36 и 26% соответственно. Однако, если принимать во внимание малые размеры групп и то, что уровни амилоидного пептида очень сильно изменяются от животного к животному внутри обеих групп, это уменьшение является незначительным. Когда измеряют уровни A1-42 в гиппокампе, ни одно индуцированное лечением снижение не достигает значимой величины. Следовательно, из-за меньшей A-нагрузки в коре, измерения на этом участке является более чувствительным индикатором эффекта терапии. Изменения уровней A в коре, определенные методом ELISA, подобны, но не идентичны результатам иммуногистохимического анализа (см. ниже). Тотальный A измеряют также в мозжечке, обычно не пораженной при AD-патологии области. Ни одна из средних концентраций A ни в одной из групп, иммунизированных различными A-пептидами или АРР-производным, не отличается от концентрации в контрольной группе в этой области мозга. Этот результат подтверждает, что на непатологическом уровне A не подвергается воздействию терапии. Концентрацию АРР также определяют методом ELISA в коре и мозжечке пролеченных и контрольных мышей. Применяют два различных метода анализа АРР. Первый, называемый APP-/FL, распознает как АРР- (, секретируемая форма АРР, в котором происходит расщепление A-последовательности),так и непроцессированные формы (FL) АРР, тогда как второй распознает только АРР-. В противоположность обусловленному терапией уменьшению количества A в субпопуляции испытуемых групп уровни АРР не изменяются у всех испытуемых животных по сравнению с контрольными. Эти результаты показывают, что иммунизация A-пептидами не сокращает количество АРР; скорее терапевтический эффект является специфическим относительно A. В целом, уровни тотального A и A1-42 значительно снижаются при терапии с помощью AN 1792,A1-42 грызунов или конъюгата A1-5. В гиппокампе уровень тотального A значительно снижается только при AN 1792-терапии. Никакие другие обусловленные лечением изменения уровней A или АРР в гиппокампе, коре или мозжечке не являются значительными. 2. Гистохимические анализы. Мозг субпопуляции из шести групп готовят для иммуногистохимического анализа: три группы,иммунизированные A-пептидными конъюгатами A1-5, A1-12 и A13-18; две группы, иммунизированные агрегациями непроцессированного (полной длины) A AN 1792 и AN 1528, и пролеченная PBS контрольная группа. Результаты анализа изображения ("создания образа") амилоидной нагрузки в срезах мозга животных этих групп показаны на фиг. 12. Имеется значительное уменьшение амилоидной нагрузки в области коры головного мозга у животных трех испытуемых групп по сравнению с контрольными. Наибольшее уменьшение амилоидной нагрузки наблюдается в группе, получающей AN 1792, где среднее значение снизилось на 97% (р=0,001). Значительное уменьшение наблюдается также у животных,пролеченных AN 1528 (95%, р=0,005) и конъюгатом A1-5-пептида (67%, р=0,02). Результаты, полученные при количественном определении тотального A или A1-42 методомELISA и амилоидной нагрузки методом анализа изображения, до некоторой степени различаются. Лечение с помощью AN 1528 оказывает значительное воздействие на уровень кортикальной амилоидной нагрузки, определенного методом количественного анализа изображения, но не на концентрацию тотального A в той же области, определяемой методом ELISA. Разница между этими двумя результатами, повидимому, связана со спецификой этих методов. Методом анализа изображения измеряют только нерастворимый A, скапливающийся в виде бляшек. Напротив, методом ELISA определяют все формы A,как растворимые, так и нерастворимые, мономерные и ассоциированные (агрегации). В связи с тем, что,как полагают, патология заболевания обусловлена нерастворимой, связанной с бляшками формой A,техника анализа изображения должна быть более чувствительной для того, чтобы обнаружить терапевтический эффект. Однако, так как ELISA является более быстрым и более легким методом анализа, он полезен для целей скрининга. Более того, он может обнаружить, что обусловленное терапией уменьшение уровня A больше для связанного бляшками, чем тотального A. Чтобы определить, регулируют ли A-специфические антитела, выявляемые иммунизацией в испытуемых животных, с отложенным в мозгу амилоида, "субпопуляция" срезов испытуемых животных и контрольных мышей реагирует с антителом, специфическим к мышиному IgG. В противоположностьPBS-группе, A-содержащие бляшки покрыты эндогенным IgG для животных, иммунизированных Aпептидными конъюгатами A1-5, A1-12 и A13-28; и агрегациями непроцессированного A AN 1792 иAN 1528. Мозг животных, иммунизированных другими A-пептидами или АРР-пептидом рВ 6, не анализировался этим методом.- 23009283 3. Определение титров антител. У мышей берут пробу крови через 4-7 дней после каждой иммунизации, начиная со второй иммунизации, всего пять проб (раз). Титры антител измеряют как титры A1-42-связывающего антитела,применяя сэндвич-ELISA с пластиковыми планшетами, покрытыми A1-42. Как показано на фиг. 13,максимальные титры антител обнаружены после четвертой дозы в случае тех четырех вакцин, которые связывают наиболее высокие титры AN 1792-специфических антител: AN 1792 (пик GMT: 94647), AN 1528 (пик GMT: 88231), A1-42-конъюгат (пик GMT: 47216) и A1-42 грызунов (пик GMT: 10766). Титры для этих групп несколько уменьшаются после пятой и шестой доз. В случае остальных пяти иммуногенов максимальные титры достигаются после пятой или шестой доз и величина этих титров значительно ниже величины для четырех групп с наиболее высокими титрами: A1-15-конъюгат (пик GMT: 2356),рВ 6 (пик GMT: 1986), A13-18-конъюгат (пик GMT: 1183), A33-42-конъюгат (пик GMT: 658), A25-35(пик GMT: 125). Также измеряют титры антител против гомологичных пептидов, применяя тот жеELISA-сэндвич формат для субпопуляции иммуногенов, при этом группы иммунизируют A1-15, A1328, A25-35, A33-42 или A1-42 грызунов. Эти титры практически такие же, как титры, найденные против A1-42, за исключением иммуногена A1-42 грызунов, при применении которого титры против гомологичного иммуногена, примерно, вдвое выше. Величина титра AN 1792-специфического антитела индивидуальных животных или средние значения испытуемых групп не коррелируются с эффективностью, измеряемой снижением уровней A в коре головного мозга. 4. Лимфопролиферативный иммунный ответ.A-зависимую лимфопролиферацию определяют, используя клетки селезенки, собираемые примерно через неделю после конечной, шестой, иммунизации. Свежесобранные клетки, 105 на лунку, культивируют в течение 5 дней в присутствии A1-40 с концентрацией 5 мкМ для стимуляции. Клетки субпопуляции семи из десяти групп также культивируют в присутствии обратного пептида, A1-40. В качестве позитивного контроля дополнительные клетки культивируют с Т-клеточным митогеном, РНА и в качестве негативного контроля, клетки культивируют без добавления пептида. В ответ на РНА происходит пролиферация лимфоцитов большинства животных. Заметной реакции нет на A40-1-обратный пептид. Клетки животных, иммунизированных большими по размеру ассоциированными A-пептидами, AN 1792, A1-42 грызунов и AN 1528, устойчиво пролиферируют после стимуляции A1-40 с высочайшим cpm (числом импульсов в минуту) у реципиентов AN 1792. У одного животного в каждой группе, иммунизированной конъюгатом A1-12, конъюгатом A13-28 и A25-35, наблюдается пролиферация в ответ на A1-40. В остальных группах, получающих A1-5-конъюгат,А 33-42-конъюгат, рВ 6 или PBS, нет ни одного животного с A-стимулированным иммунным ответом. Эти результаты сведены в табл. 5. Таблица 5 Эти результаты показывают, что AN 1792 и AN 1528 стимулируют сильной Т-клеточной иммунной реакцией, наиболее вероятно, CD4+ фенотипа. Отсутствие A-специфической Т-клеточной иммунной реакции у животных, иммунизированных A1-5, не является неожиданным, так как эпитопы пептидов,распознаваемые CD4+ Т-клетками, имеют обычно протяженность около 15 аминокислот, хотя более короткие пептиды могут иногда работать с меньшей эффективностью, т.е. большинство эпитопов хелперных Т-клеток четырех пептидных конъюгатов, по-видимому, находящихся в IgG партнере конъюгата,расположены не в области A. Эта гипотеза подтверждается очень малым числом случаев пролиферативного ответа у животных в каждой из этих подопытных групп. Так как конъюгат A1-5 действительно значительно снижает уровень A мозга при явном отсутствии A-специфических Т-клеток, то, повидимому, ключевым действующим началом иммунного ответа, индуцированного иммунизацией этим пептидом, является антитело. Отсутствие Т-клеточной иммунной реакции и слабый гуморальный иммунный ответ на введение слитого пептида рВ 6, охватывающий аминокислоты 592-695 АРР, включая все A-остатки, возможно,- 24009283 вызван слабой иммунологичностью этого конкретного препарата. Слабая иммуногенность агрегацииA25-35, по-видимому, вызвана тем, что пептид слишком мал, чтобы содержать хороший Т-клеточных эпитоп, который бы помог индуцировать гуморальный иммунный ответ. Если этот пептид был бы конъюгирован с белком-носителем, он, возможно, был бы более иммуногенным.V. Препарат поликлональных антител для пассивного иммунитета. 20 нетрансгенных мышей иммунизируют с помощью A или другого иммуногена, при необходимости, плюс адъювант, и умерщвляют в 4-5 месяцев. Кровь иммунизированных животных собирают. При необходимости IgG отделяют от других компонентов крови. Антитело, специфическое к иммуногену, можно частично очистить аффинной хроматографией. В среднем на одну мышь получают около 0,5-1,0 мг иммуноген-специфического антитела, что в общем дает 5-10 мг.VI. Пассивная иммунизация антителами к A. Группы из 7-9-месячных PDAPP-мышей инъецируют 0,5 мг поликлональных антител к A или специфических моноклональных антител к A в PBS, как показано ниже. Все препараты антител очищают так, чтобы у них были низкие уровни эндотоксинов. Можно приготовить моноклональные антитела против фрагмента инъекцией мыши фрагмента или более протяженной формы A, получением гибридом и скринингом гибридом на антитело, связывающееся с заданным фрагментом A без связывания с другими неперекрывающимися фрагментами A. Таблица 6 Мышам вводят инъекции i.p. (в.б. - внутрибрюшинно), при необходимости, в течение 4 месяцев,чтобы поддержать концентрацию циркулирующего антитела, измеряемую титром ELISA более высоким,чем 1/1000, найденным методом ELISA к А 642 или другому иммуногену. Титры контролируют, как указано выше, и мышей умерщвляют по окончании 4 месяцев инъекций. Анализы: гистохимический, A-уровней и токсикологический - проводят после вскрытия. В группу входит 10 мышей.VII. Сравнение различных адъювантов. В этих примерах сравнивают CFA (полный адъювант Фрейнда), квасцы, водомасляную эмульсию иMPL (МФЛ) по способности стимулировать иммунный ответ. А. Материалы и методы. 1. Порядок исследования. 100 самок 6-месячных морских свинок линии Хартлин (Hartley), полученных от Elm Hill, делят на 10 групп для иммунизации AN 1792 или его пальмитоильным производным в сочетании с различными адъювантами. 7 группам делают инъекции AN 1792 (33 мкг, если не указано иначе) в сочетании с:a) PBS (ЗФР),b) адъювантом Фрейнда,с) MPL (МФЛ),d) скваленом,е) MPL/сквален,f) малой дозой квасцов илиg) высокой дозой квасцов (300 мкг AN 1792). 2 группам вводят инъекции пальмитоильного производного AN 1792 (33 мкг) в сочетании с a) PBS или b) скваленом. Последней, 10-й группе дают только PBS без антигена или дополнительного адъюванта. Для группы, получающей адъювант Фрейнда, первую дозу эмульгируют с CFA (полный адъювант Фрейнда), а остальные четыре дозы - с IFA (неполный адъювант Фрейнда). Доза вводимого антигена составляет 33 мкг для всех групп, кроме группы, получающей высокую дозу квасцов, которой дают 300 мкг AN 1792. Инъекции вводят внутрибрюшинно в случае CFA/IFA и внутримышечно в четырехглавную мышцу задней конечности или же в правый или левый бок для всех других групп. Первые три дозы дают по двухнедельному графику, а затем две дозы с месячным интервалом. Пробы крови берут через 6-7 дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, для определения титров антител. 2. Получение иммуногенов. 2 мг A42 (California Peptide, лот МЕ 0339) добавляют к 0,9 мл деионизированной воды и смесь встряхивают и перемешивают для получения сравнительно однородной суспензии. Добавляют 100 мкл аликвоту 10 Х PBS (1X PBS, 0,15 М NaCl, 0,01 М фосфата натрия, рН 7,5). Суспензию снова встряхивают- 25009283 и перемешивают и термостатируют в течение ночи при 37 С с целью использования на следующий день. Неиспользованный A1-42 хранят с осушителем в виде лиофилизированного порошка при -20 С. Пальмитоильное производное AN 1792 получают присоединением пальмитинового ангидрида, растворенного в диметилформамиде, к концевой аминогруппе AN 1792 и выделением получающегося пептида из смолы обработкой фтористоводородной кислотой. Чтобы приготовить дозы вакцины с полным адъювантом Фрейнда (CFA) (группа 2), 33 мкг AN 1792 в 200 мкл PBS эмульгируют в соотношении 1:1 (по объему) с CFA с конечным объемом 400 мкл для первой иммунизации. Для последующих иммунизации антиген аналогично эмульгируют с неполным адъювантом Фрейнда (IFA). Для приготовления доз вакцины с MPL (МФЛ) для групп 5 и 8, лиофилизированный порошок (RibiImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) добавляют к 0,2% водному триэтиламину до конечной концентрации 1 мг/мл и встряхивают при перемешивании. Смесь нагревают до 65-70 С в течение 30 с до получения слегка мутной однородной суспензии из мицелл. Раствор готовят заново перед каждой серией инъекций. Для каждой инъекции в группе 5 33 мкг AN 1792 в 16.5 мкл PBS, 50 мкг MPL (50 мкл) и 162 мкл PBS смешивают в пробирке из боросиликатного стекла непосредственно перед употреблением. Для приготовления доз вакцины с низким содержанием водомасляной эмульсии AN 1792 в PBS добавляют к 5% сквалена, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 в PBS так, чтобы достичь конечной концентрации однократной дозы 33 мкг AN 1792 в 250 мкл (группа 6). Смесь эмульгируют, пропуская через портативное двухкамерное устройство 15-20 раз до тех пор, пока капельки эмульсии не станут примерно равными 1,0 мкм, диаметру сфер стандартного латекса, если рассматривать их под микроскопом. Образующаяся суспензия является опалесцирующей, молочно-белой. Эмульсию готовят непосредственно перед каждой серией инъекций. Для группы 8 добавляют MPL в 0,2% триэтиламине с концентрацией 50 мкг на дозу к сквалену и смеси детергентов для эмульгирования, как описано выше. Для пальмитоильного производного (группа 7) к сквалену добавляют 33 мкг на дозу пальмитоил-NH-A1-42 и перемешивают при встряхивании. Затем добавляют при перемешивании Tween 80 и Span 85. Эту смесь добавляют к PBS до достижения конечной концентрации 5% сквалена, 0,5% Tween 80, 0,5% Span 85 и смесь эмульгируют, как описано выше. Для того чтобы приготовить дозы вакцины с квасцами (группы 9 и 10), AN 1792 в PBS добавляют кAlhydrogel (гель гидроокиси алюминия, Accurate, Westbury, NY) до достижения концентрации 33 мкг(низкая доза, группа 9) или 300 мкг (высокая доза, группа 10) AN 1792 на 5 мг квасцов в конечном объеме дозы 250 мкл. Суспензию осторожно перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре. 3. Измерение титров антител. У морских свинок берут пробу крови через 6-7 дней после иммунизации, начиная со второй иммунизации, всего четыре раза. Титры антител к A42 измеряют методом ELISA, как описано в разделе "Общие материалы и методы". 4. Подготовка ткани. Примерно через 14 недель всем морским свинкам дают CO2. Цереброспинальную жидкость собирают и мозг удаляют и три участка мозга (гиппокамп, кору и мозжечок) разделяют и используют для измерения концентрации тотального A-белка методом ELISA. В. Результаты. 1. Гуморальный ("антительный") иммунный ответ. Эффективность различных адъювантов, измеряемая как гуморальный иммунный ответ на иммунизацию AN 1792, находится в широком интервале. Как показано на фиг. 14, когда AN 1792 вводится вPBS, никаких антител не обнаружено после двух или трех иммунизаций и незначительный иммунный ответ наблюдается после четвертой и пятой доз со средними геометрическими титров (GMT) только около 45. Водомасляная (в/м) эмульсия приводит к умеренным значениям титров после третьей дозы (GMT 255), которые сохраняются после четвертой дозы (GMT 301) и падают с конечной дозой (GMT 54). Наблюдается четкий эффект дозы антигена, так как AN 1792, связанный с квасцами с концентрацией 300 мкг, является более иммуногенным, чем при 33 мкг, во всех временных точках. При максимальном значении иммунного ответа (пик) разница между двумя дозами составляет 43% при значениях GMT, примерно, 1940 (33 мкг) и 3400 (300 мкг). Гуморальный иммунный ответ на 33 мкг AN 1792 плюс MPL очень похож на ответ, вызываемый почти десятикратной дозой антигена (300 мкг), связанного с квасцами. Добавление MPL к м/в эмульсии снижает иммуногенность вакцины относительно иммуногенности сMPL в качестве единственного адъюванта на 75%. Пальмитоильное производное AN 1792 является полностью неиммуногенным при введении в PBS и дает умеренные титры в м/в эмульсии с GMT 340 и 105 для третьей и четвертой проб крови. Наивысшие титры антител достигнуты с адъювантом Фрейнда с пиком GMT примерно 87000, величина, почти в 30 раз большая, чем GMT следующих двух наиболее иммуногенных вакцин, с MPL и с высокой дозой AN 1792/квасцы. Самыми многообещающими адъювантами в этом исследовании являются MPL и квасцы. Из этих двух MPL, по-видимому, является предпочтительным, потому что для того, чтобы вызвать такой же гуморальный иммунный ответ, как и в случае квасцов, требуется в 10 раз меньшая доза антигена. Иммун- 26009283 ный ответ увеличивается при повышении дозы антигена и/или адъюванта и при оптимизации схемы иммунизации. Водомасляная эмульсия является очень слабым адъювантом для AN 1792 и добавление м/в эмульсии к адъюванту MPL снижает свойственную самому MPL адъювантную активность. 2. Уровни A в головном мозге. Примерно через 14 недель морских свинок усыпляют, цереброспинальную жидкость (CSF) отбирают и мозг удаляют из животных субпопуляции групп, иммунизированных адъювантом Фрейнда(группа 2), MPL (группа 5), квасцами с высокой дозой, 300 мкг, AN 1792 (группа 10) и иммунизированной PBS контрольной группы (группа 3). Для того чтобы определить уровень A-пептида, одно полушарие мозга отсекают и готовят гомогенаты гиппокампа, кортикального и мозжечкового участков мозга в 5 М гуанидине. Эти гомогенаты разводят и количественно определяют сравнением с серией разведений стандартного A-белка известной концентрации в формате ELISA. Уровни A-белка в гиппокампе, коре и мозжечке очень похожи во всех группах, несмотря на очень широкий интервал гуморального иммунного ответа на A, выявляемого этими вакцинами. Средние A-уровни, примерно 25 нг/г ткани определяют в гиппокампе, 21 нг/г в коре и 12 нг/г в мозжечке. Следовательно, присутствие циркулирующего антитела к A с высоким титром в течение почти трех месяцев у некоторых из этих животных не изменяет уровней тотального A в головном мозге. Уровни A в CSF также совершенно аналогичны в группах. Отсутствие значительного влияния AN 1792-иммунизации на эндогенный A указывает, что иммунный ответ сосредоточен на патологических образованиях A.VIII. Иммунный ответ на различные адъюванты у мышей. Для этого исследования берутся самки Swiss Webster мышей в возрасте шести недель по 10-13 животных в группе. Иммунизацию проводят на 0, 14, 28, 60, 90 дни и вводят 20 подкожных инъекций, объем дозы составляет 200 мкл. Для всех рецептур в качестве буфера берут PBS. Через семь дней после каждой иммунизации, начиная со второй дозы, у животных отбирают пробы крови для определения титров антител методом ELISA. Схема лечения для каждой группы сведена в табл. 7. Таблица 7 Количество мышей в каждой группе в начале исследования. Указаны адъюванты. Буфером для всех этих рецептур является PBS. В группе 8 отсутствуют адъювант и антиген.ELISA-титры антител против A42 в каждой группе показаны в табл. 8. Таблица 8 Среднее геометрическое титров антител Неделя взятия пробы крови Таблица показывает, что наиболее высокие титры получены для групп 4, 5 и 18, в которых адъювантами являются 125 мкг MPL, 50 мкг MPL и QS21 плюс MPL.IX. Терапевтическая эффективность различных адъювантов. Изучение терапевтической эффективности проводят на PDAPP трансгенных мышах с набором адъювантов, пригодных к применению на людях, с целью определения их способности потенцировать иммунный ответ на A и стимулировать иммуноопосредуемый клиренс амилоидных отложений мозга. 180 самцов и самок 7,5-8,5-месячных гетерозиготных PDAPP-трансгенных мышей получают из лаборатории Charles River. Мышей делят на девять групп по 15-25 животных в группе, которых иммунизируют AN 1792 или AN 1528 в сочетании с различными адъювантами. Животных распределяют в максимально близком соответствии с полом, возрастом, происхождением. Адъюванты включают квасцы, MPL и QS21, каждый в сочетании с обоими антигенами, и адъювант Фрейнда (FA) в сочетании только сAN 1792. Дополнительную группу иммунизируют AN 1792 в рецептуре с PBS-буфером плюс консервант тимерозаль (thimerosal) без адъюванта. Девятую группу иммунизируют одним PBS в качестве негативного контроля. Получение агрегации A-пептидов: человеческий A1-40 (AN 1528; California Peptides Inc., Napa,CA; лот МЕ 0541) и человеческий A1-42 (AN 1792; California Peptides Inc., лот МЕ 0439) пептиды солюбилизируют непосредственно перед приготовлением набора (серии) инъекций лиофилизированных порошков, которые хранятся в сухом виде при -20 С. Для этой цели 2 мг пептида добавляют к 0,9 мл деионизированной воды и смесь встряхивают и перемешивают для получения относительно однородного раствора или суспензии. AN 1528 растворяется на этой стадии в отличие от AN 1792. Затем добавляют 100 мкл аликвоту 10 Х PBS (IX PBS, 0,15 М NaCl, 0,01 М фосфата натрия, рН 7,5); при этом AN 1528 начинает выпадать. Суспензии снова перемешивают и встряхивают и термостатируют в течение ночи при 37 С, чтобы использовать на следующий день. Для приготовления доз вакцины с квасцами (группы 1 и 5) A-пептид в PBS добавляют к Alhydrogel (2% водный гель гидроокиси алюминия, Sargeant, Inc., Clifton, NY) до получения концентрации 100 мкг A-пептида на 1 мг квасцов. 10 Х PBS добавляют к объему конечной дозы 200 мкл в 1X PBS. Затем суспензию осторожно перемешивают в течение 4 ч при комнатной температуре перед инъекцией. Для приготовления доз вакцины с MPL (группы 2 и 6) лиофилизированный порошок (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT; лот 67039-EO896B) добавляют к 0,2% водному триэтиламину до конечной концентрации 1 мг/мл и перемешивают при встряхивании. Смесь нагревают до 65-70 С в течение 30 с до получения слегка мутной однородной суспензии из мицелл. Раствор хранят при 4 С. Для каждой серии инъекций 100 мкг пептида на дозу в 50 мкл PBS, 50 мкл MPL на дозу (50 мкл) и 100 мкл PBS на- 28009283 дозу смешивают в пробирке из боросиликатного стекла непосредственно перед употреблением. Для приготовления доз вакцины с QS21 (группы 3 и 7) лиофилизированный порошок (Aquila, Framingham, MA; лот A7018R) добавляют к PBS, рН 6,6-6,7 до конечной концентрации 1 мг/мл и перемешивают при встряхивании. Раствор хранят при -20 С. Для каждой серии инъекций 100 мкг пептида на дозу в 50 мкл PBS, 25 мкл QS21 на дозу в 25 мкл PBS и 125 мкл PBS на дозу смешивают в пробирке из боросиликатного стекла непосредственно перед употреблением. Для приготовления доз вакцины с адъювантом Фрейнда (группа 4), 100 мкг AN 1792 в 200 мкл PBS эмульгируют в объемном соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (CFA) с конечным объемом 400 мкл для первой иммунизации. Для последующих иммунизаций антиген аналогично эмульгируют с неполным адъювантом Фрейнда (IFA). Для вакцин, содержащих адъюванты: квасцы, MPL или QS21,100 мкг на дозу AN 1792 или AN 1528 объединяют с квасцами (1 мг на дозу), или MPL (50 мкг на дозу),или QS21 (25 мкг на дозу) с конечным объемом 200 мкл PBS и вводят с помощью подкожной иммунизации в спину между лопатками. Для группы, получающей FA, 100 мкг AN 1792 эмульгируют в объемном соотношении 1:1 с полным адъювантом Фрейнда (CFA) с конечным объемом 400 мкл и вводят внутрибрюшинно для первой иммунизации, с последующим повторным (бустер) введением того же количества иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда (IFA) в последующих пяти дозах. Для группы, получающейAN 1792 без адъюванта, 10 мкг AN 1792 объединяют с 5 мкг тимерозаля в конечном объеме 50 мкл PBS и вводят подкожно. Девятая контрольная группа получает только 200 мкл PBS, вводимого подкожно. Иммунизацию проводят по двухнедельной схеме для первых трех доз, затем по месячной схеме в дни 0,16, 28, 56, 85 и 112. У животных берут пробу крови на 6-7 день после каждой иммунизации, начиная со второй дозы для измерения титров антител. Животных умерщвляют примерно через неделю после конечной дозы. Результаты определяют методом ELISA-анализа уровней A и АРР в мозге и с помощью иммуногистохимической оценки присутствия амилоидных бляшек на участках мозга. Кроме того, определяют титры A-специфических антител, A-зависимые пролиферативный ответ и реакцию цитокинов. В табл. 9 показано, что самые высокие титры антител на A1-42 выявляются с FA и AN 1792, титры, достигающие пика после четвертой иммунизации (пик GMT: 75386), затем снижаются на 59% после последней шестой иммунизации. Максимальное значение титра, получаемого с MPL в сочетании сAN 1792, на 62% ниже, чем значение титра, получаемого с FA (пик GMT: 28867), и также достигается на ранней стадии схемы иммунизации, после 3 доз, со следующим понижением до 28% от максимального значения после шестой иммунизации. Средние значения максимальных титров с QS21 в сочетании сAN 1792 (GMT: 1511) примерно в 5 раз ниже, чем полученные с MPL. Кроме того, кинетика иммунного ответа медленнее, так как требуется дополнительная иммунизация для достижения максимального ответа. Титры, получающиеся под действием связанного с квасцами AN 1792, в самой малой степени превышают титры, полученные с QS21, и кинетика иммунного ответа имеет более высокую скорость. ДляAN 1792, доставляемого в PBS с тимерозалем, частота и величина (размер) титров едва ли больше, чем таковые для одного PBS. Максимальные титры, получаемые с MPL и AN 1792 (пик GMT 3099), примерно, в 9 раз ниже, чем титры с AN 1792. Связанный с квасцами AN 1528 является очень слабо иммуногенным с низкими титрами антител, вырабатываемых только у некоторых животных. У контрольных животных, иммунизированных только PBS, не наблюдается никакого иммунного ответа. Таблица 9 Среднее геометрическое титров антителa) Неделя взятия пробы крови Среднее геометрическое титров антител, измеренное против A1-42. Число респондеров на группу.- 29009283 Результаты введения AN 1792 или AN 1528 с различными адъювантами или тимерозалем на кортикальную амилоидную нагрузку у 12-месячных мышей, определяемые методом ELISA, даны на фиг. 15. У PBS-контрольных PDAPP мышей средний уровень тотального A в коре в 12 месяцев составляет 1817 нг/г. Заметно меньшие уровни A наблюдаются у мышей, пролеченных AN 1792 плюс CFA/IFA,AN 1792 плюс MPL и QS21 плюс AN 1792. Уменьшение достигает статистического значения (р 0,05) только для AN 1792 плюс CFA/IFA. Однако, как показано в примерах I и III, влияние иммунизации на снижение уровней A становится существенно больше у 15- и 18-месячных мышей, т.е. ожидается, что,по меньшей мере, композиции AN 1792 плюс квасцы, AN 1792 плюс MPL и AN 1792 плюс QS21 достигнут статистического значения у более взрослых мышей. Напротив, AN 1792 плюс консервант тимерозаль показывают средний уровень A примерно такой же, как у мышей, получавших PBS. Сходные результаты получены при сравнении кортикальных уровней A42. Средний уровень A42 у PBS-контрольных мышей составляет 1624 нг/г. Заметно пониженные уровни - 403, 1149, 620 и 714 - получены у мышей,пролеченных AN 1792 плюс CFA/IFA, AN 1792 плюс квасцы, AN 1792 плюс MPL и AN 1792 плюс QS21,соответственно, при уменьшении, достигающем статистического значения (р=0,05) для группы, получавшей AN 1792 CFA/IFA. Средний уровень у мышей, получавших AN 1792-тимерозаль, составляет 1619 нг/г A42.X. Анализ на токсичность. Ткани собирают для гистопатологического исследования в конце исследования, описанного в примерах 2, 3 и 7. Кроме того, проводят гематологические и клинические химические анализы конечных образцов крови из примеров 3 и 7. Большую часть основных органов удаляют, включая мозг, легкие,лимфоидную ткань, желудочно-кишечный тракт, печень, почки, надпочечники и гонады (половые железы). Хотя у подопытных животных наблюдаются случайные поражения, не наблюдается явных различий ни в пораженных тканях, ни в тяжести поражения между AN 1792-пролеченными и непролеченными животными. Нет каких-либо особых гистопатологических поражений, замеченных у AN 1792 иммунизированных животных по сравнению с PBS-пролеченными или непролеченными животными. Нет также различий клинических химических показателей между группами животных с адъювантами и сPBS в примере 7. Хотя наблюдается значительное повышение некоторых гематологических параметров у животных, получавших AN 1792 и адъювант Фрейнда в примере 7 по сравнению с получавшими PBS животными, такого рода эффекты ожидают от введения адъюванта Фрейнда и сопутствующего перитонита и не это указывает на какие-либо побочные эффекты AN 1792-терапии. Не являясь частью токсикологических анализов, тем не менее, патология мозга мышей PDAPP серьезно изучается как часть показателей эффективности. Не было отмечено никаких признаков вредного влияния лечения на морфологию мозга ни в одном из исследований. Эти результаты показывают, что введение AN 1792 хорошо переносится и, по меньшей мере, практически свободно от побочных эффектов.XI. Профилактика и терапия людей. Для определения безопасности проводят стадию I опыта с введением однократной дозы. Различным больным вводят терапевтический агент с увеличением дозы, начиная, примерно, от 0,01 уровня предполагаемой эффективности и увеличивая с коэффициентом 3 до достижения 10-кратной эффективности на мышах. Стадию II опыта проводят, чтобы определить терапевтическую эффективность. Выбирают больных с болезнью Альцгеймера - от ранней до средней - определение, употребляемое по критериям ассоциации"Болезнь Альцгеймера и родственные заболевания" (ADRDA) для возможных AD. Соответствующих больных оценивают в интервале 12-26 по шкале умственной неполноценности - Mini-Mental State Exam(MMSE). Другой критерий отбора - это больные, которые перенесли продолжительное исследование и не имеют осложняющих проблем, таких как применение существующих лекарственных препаратов, которые могут нанести вред. Оценки базовой линии функции больных делают, используя классические психометрические определения, такие, например, как MMSE и ADAS, которые представляют собой полную(исчерпывающую) шкалу оценки больных со статусом "Болезнь Альцгеймера" и ее специфическими свойствами. Эти психометрические тесты обеспечивают измерение прогрессирования болезни Альцгеймера. Для мониторинга лечения можно также применять соответствующие качественные методы оценки. Прогрессирование заболевания также можно контролировать методом ЯМР. Показатели крови больных можно также контролировать, включая анализы иммуноген-специфических антител и Т-клеточный иммунный ответ. После определения базовой линии больные начинают принимать лечение. Их произвольно делят и лечат либо терапевтическим агентом, либо плацебо "вслепую". Больных проверяют, по меньшей мере,каждые шесть месяцев. Эффективность определяется заметным уменьшением (замедлением) прогрессирования пролеченной группы по сравнению с "плацебо-группой". Вторую фазу II испытания осуществляют, чтобы оценить переход больных от болезни, не являющихся болезнью Альцгеймера - ранней потери памяти, иногда называемой связанным с возрастом ослаблением памяти (AAMI) - вероятной болезни Альцгеймера, как она определяется критериями ADRDA. Больных с высокой степенью риска превращения в больных болезнью Альцгеймера выбирают из "не- 30
МПК / Метки
МПК: A61K 9/26, A61P 25/28, A61K 38/00
Метки: предупреждение, заболевания, амилоидогенного, лечение
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-9283-preduprezhdenie-i-lechenie-amiloidogennogo-zabolevaniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Предупреждение и лечение амилоидогенного заболевания</a>
Предотвращение и лечение амилоидогенного заболевания
Номер патента: 7218
Опубликовано: 25.08.2006
Автор: Шенк Дэйл Б.
МПК: A61K 9/26, A61K 38/00, A61P 25/28...
Метки: амилоидогенного, заболевания, предотвращение, лечение
Формула / Реферат:
1. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуногенный агент, эффективно индуцирующий иммунный ответ, представляющий собой антитела против Ab пептида больного, и фармацевтически приемлемый адъювант, причём адъювант повышает иммунный ответ на Ab пептид. 2. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что адъювант представляет собой StimulonTM QS. 3. Фармацевтическая композиция по п.1, отличающаяся тем, что агент инкапсулирован в...
Способы предотвращения и лечения амилоидогенного заболевания и используемые в них фармацевтические композиции
Номер патента: 6630
Опубликовано: 24.02.2006
Авторы: Васкуэз Ники Дж., Шенк Дэйл Б., Еднок Тэд, Бард Фредерик
МПК: A61K 39/00, A61K 39/39, A61K 38/17...
Метки: амилоидогенного, лечения, фармацевтические, способы, заболевания, них, предотвращения, используемые, композиции
Формула / Реферат:
1. Способ предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с отложениями амилоида Ab в головном мозге пациента, включающий введение пациенту эффективной дозы фармацевтической композиции, содержащей антитело, имеющее изотип IgG1, которое специфически связывается с эпитопом в пределах аминокислотных остатков 1-7 Ab. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное заболевание характеризуется когнитивной недостаточностью. 3. Способ...
Комбинированное лечение заболевания цнс, особенно болезни паркинсона, путём совместного введения каберголина и прамипексола
Номер патента: 4474
Опубликовано: 29.04.2004
Автор: Гомес-Мансилья Балтасар
МПК: A61P 25/00, A61K 31/48
Метки: прамипексола, совместного, паркинсона, болезни, комбинированное, путём, введения, кабэрголина, цнс, особенно, заболевания, лечение
Формула / Реферат:
1. Способ лечения пациентов, страдающих заболеванием ЦНС, включающий введение пациенту комбинации каберголина и прамипексола или их фармакологически приемлемых солей. 2. Способ по п.1 для лечения пациентов, страдающих болезнью Паркинсона. 3. Способ по п.2, при котором первоначальная доза каберголина вводится пациенту в количестве от 0,5 до 1 мг в день на пациента и увеличивается с недельными интервалами до терапевтической дозы 2, 4, 6, 8 или 10...
Дискретная твердая единица дозировки фармацевтической композиции для перорального употребления, включающая в себя целекоксиб, (варианты), и способ лечения заболевания или расстройства у пациента, которому показано лечение ингибитором циклооксигеназы-2
Номер патента: 3363
Опубликовано: 24.04.2003
Авторы: Вон Маргарет Б.Вудхалл, Трулов Джеймз Э., Мажари Ахмад М., Хлинак Антони Дж., Гао Данчен
МПК: A61K 9/20, A61P 19/02
Метки: композиции, перорального, варианты, себя, включающая, целекоксиб, единица, употребления, циклооксигеназы-2, дискретная, расстройства, лечение, лечения, пациента, твердая, дозировки, которому, заболевания, фармацевтической, ингибитором, показано, способ
Формула / Реферат:
1. Дискретная твердая единица дозировки фармацевтической композиции для перорального употребления, включающая в себя целекоксиб в виде частиц, в количестве от приблизительно 10 до приблизительно 1000 мг, в однородной смеси с одной или несколькими фармацевтически приемлемыми добавками и имеющая относительную биодоступность не менее приблизительно 50%, предпочтительно не менее приблизительно 70%, по сравнению с принимаемым перорально раствором,...
Предупреждение потери и восстановление костной массы некоторыми агонистами простагландина
Номер патента: 3529
Опубликовано: 26.06.2003
Авторы: Росэйти Роберт Луис, Лефкер Брюс Аллен, Томпсон Дейвид Дуэйн, Кэмерон Кимберли О'киф, Ки Хуа Зу
МПК: C07C 311/06, A61P 19/08, A61K 31/18...
Метки: массы, некоторыми, простагландина, восстановление, потери, предупреждение, костной, агонистами
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы или его фармацевтически приемлемая соль или пролекарство, где n равно числу от 0 до 5; группировка CH3-(CH2)n- возможно моно-, ди- или тризамещена по углероду независимо гидрокси, (C1-C4)алкилом или галогеном-; Q представляет собой -(C2-C6)алкилен-W-(C1-C3)алкилен-, -(C3-C8)алкилен-, причем указанный -(C3-C8)алкилен- возможно замещен заместителями в количестве вплоть до четырех, независимо выбранными из фтора- или...
Предыдущий патент: Производные 4-(2-фенилсульфанилфенил)-1,2,3,6-тетрагидропиридина в качестве ингибиторов повторного поглощения серотонина
Следующий патент: Полипептиды и пути биосинтеза
Случайный патент: Противоскользящее устройство для обуви