Моноклональные антитела и смесь антител для выявления белка-приона как показателя трансмиссивных губкообразных энцефалопатий

1 Предпосылка изобретения 1. Область изобретения Данное изобретение относится к выявлению белка-приона (также называемого PrP-Scбелком) как показателя трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ТГЭ). В частности,настоящее изобретение относится к (а) моноклональным антителам, которые специфично связываются с консервативным эпитопом белков-прионов, и (b) смеси моноклональных антител, содержащей моноклональное антитело в комбинации со вторым моноклональным антителом, которое специфично связывается со вторым консервативным эпитопом белков-прионов. Новые антитела и смесь антител пригодны для иммуноанализов для выявления белков-прионов у жвачных животных и других видов, у которых ТГЭ встречается в естественных условиях, или у родственных видов, потенциально подверженных ТГЭ. 2. Описание области техники Трансмиссивные губкообразные энцефалопатии (ТГЭ) представляют собой гетерогенную группу нейродегенеративных заболеваний с летальным исходом, которые возникают у человека, жвачных травоядных животных, норки и кошек. Прототипом этой группы является скрейпи овец. ТГЭ характеризуются отложением прионных белков (также обозначаемых какPrP-скрейпи или РrР-Sc), инфекционной формы белков в центральной нервной системе пораженных болезнью индивидуумов. Прионы были определены как небольшие белковые инфекционные частицы, которые устойчивы к инактивации посредством процедур, которые модифицируют нуклеиновые кислоты. Термин прион является сокращением слов протеин и инфекция, и прионы в значительной степени, если не исключительно, состоят только из молекул PrP-Sc, кодируемых геном РrР. Прионные заболевания часто называют губкообразными энцефалопатиями из-за того, что при посмертном микроскопическом или гистопатологическом исследовании головного мозга инфицированного животного видны большие вакуоли в коре головного мозга и мозжечке. Прионные белки являются нерастворимыми, устойчивыми к протеазам гликопротеидами, возникающими в результате посттрансляционной модификации нормальных гликопротеидов млекопитающихPrP-Sc, аномальной изоформы сиалогликопротеида PrP-С, в центральной нервной системе является достоверным маркером инфекции ТГЭ. Наиболее широко изучены ТГЭ у сельскохозяйственных животных, включая скрейпи у овец и коз, губкообразную энцефалопатию коров (BSE) у крупного рогатого скота (также называемую заболеванием коровьим бешенством) и хроническую изнуряющую болезнь(CWD) у гибридного оленя и лося. Другие ТГЭ животных включают трансмиссивную энцефа 005239 2 лопатию норок (ТМЕ) и кошачью губкообразную энцефалопатию (FSE) домашних и не домашних кошек. Совсем недавно сообщалось о ТГЭ не у людей, а у других приматов, содержащихся в зоопарках Франции; вероятно, это заболевание возникло из BSE (Bons et al., Proceedings of the National Academy of Science of theUnited States of America 96:4046-4051 (1999. Также были идентифицированы прионные болезни у людей. К ним относятся: болезнь Кройцфельда-Якоба (CJD); синдром ГертсманаШтраусслера-Шейнкера (GSS); фатальная семейная бессонница (FFI) и болезнь Куру. Передаваемый агент при этих заболеваниях остается спорным. Однако, как указано выше, нерастворимая изоформа (прион или PrP-Sc) сиалогликопротеида млекопитающих (РrРклеточный или PrP-С) является основным компонентом инфекционного материала. Повидимому, изоформа скрейпи белка-приона(PrP-Sc) необходима как для передачи, так и патогенеза трансмиссивных нейродегенеративных заболеваний животных и человека (смотриS.B. Prusiner, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95:13363-13383 (1998. Основная гипотеза состоит в том, что прионные заболевания возникают в результате превращения PrP-С в PrP-Sc в процессе нуклеации и полимеризации. Распространение новых трансмиссивных губкообразных энцефалопатий у крупного рогатого скота в Великобритании и Европе и у гибридных оленей и лосей в частях Соединенных Штатов придало особое значение необходимости надежных диагностических тестов. Кроме того, эпизоотия ТГЭ среди крупного рогатого скота и ее предполагаемая взаимосвязь с новым вариантом болезни Кройцфельда-Якоба (М.Е.et al., Nature 389:448-450 (1997 расширили общественные и научные знания об этих относительно редких заболеваниях и выдвинули на первый план необходимость преклинического выявления ТГЭ. Хотя в Соединенных Штатах не было обнаружено случаев BSE, чувствительные иммуногистохимические способы и способы преклинического выявления являются основой для выявления, наблюдения и контроля ТГЭ. Прионные заболевания могут иметь длительный инкубационный период. Например, у овец может требоваться от 3 до 5 лет со времени инфицирования животного до момента, когда у него проявляются первые признаки заболевания. При губкообразной энцефалопатии коров(BSE) может требоваться от 2 до 8 лет со времени инфицирования животного до момента, когда у него проявляются первые признаки заболевания. У инфицированных животных и людей не наблюдается ни специфичного для заболевания иммунного ответа, ни установленных биохимических, гематологических и грубых пато 3 логических нарушений. Поэтому ранняя диагностика трансмиссивных губкообразных энцефалопатий может быть основана на появлении клинических признаков, электроэнцефалографии или инвазивном способе взятия биопсии головного мозга. Подтверждение ТГЭ осуществляют при посмертном микроскопическом или гистологическом исследовании ткани головного мозга в подозрительных случаях. Посмертная гистопатологическая диагностика ТГЭ жвачных животных основана на появлении вакуолизации нейронов, губкообразных изменений, глиоза и астроцитоза. Однако указанные проявления могут варьировать по интенсивности и анатомической локализации в зависимости от видов хозяина, индивидуумов, генетики хозяина, стадии заболевания и источника инфекции. Таким образом, диагностика только на основании гистопатологии может быть неопределенной на ранних стадиях и обычно не возможна в аутолизированной ткани. Отложение белка-приона (PrP-Sc) в центральной нервной системе является надежным маркером ТГЭ. Поэтому иммуногистохимическое выявление PrP-Sc является важным дополнением к гистопатологическим исследованиям при диагностике, надзоре и контроле ТГЭ. Моноклональное антитело 263 К 3F4 (патент США 4806627) выявляет PrP-Sc у хомячков и людей и получило широко распространенное применение в диагностических анализах и исследованиях патогенеза ТГЭ человека. Основной недостаток состоит в том, что оно не реагирует с РrР овец и крупного рогатого скота (R.J. Kascsak(1977. Антисыворотка кролика, реактивная по отношению к PrP-Sc жвачных животных, обладает тем недостатком, что ее нельзя стандартизировать для широко распространенного применения из-за ограничений в количестве и специфичности. Моноклональные антитела предпочтительнее кроличьей антисыворотки, поскольку количества не ограничены, и специфичность можно точно определять на уровне одного эпитопа. Однако указанная специфичность может быть недостатком у видов с полиморфными генами РrР. Изменение единственного основания,приводящее в результате к аминокислотной замене в эпитопе, может исключить связывание антитела. Ген РrР человека имеет по меньшей мере 18 патогенных мутаций, приводящих к наследственному прионному заболеванию (J.[Biol.] 343:371-378 (1994, и ряд непатогенных мутаций, одна из которых (кодон 129) связана с предрасположенностью к ятрогенной, спорадической и атипичной CJD (J. Collinge et al., Lancet 337:1441-1442, 1991); M.S. Palmer et al., Nature 352:340-342 (1991); M. Zeidler et al., Lancet 350:668 (1997. M. Horiuchi et al. (Journal ofGeneral Virology 76:2586-2587 (1995 описывают панель синтетических пептидов, которые 4 вызывали образование моноклональных и поликлональных антител, реактивных по отношению к РrР-клеточному (не связанному с заболеванием белку) на иммуноблотах отобранной ткани овец и крупного рогатого скота. Указанные авторы не сообщали об эффективном выявлении связанной с заболеванием изоформы PrP-Sc. Кроме того, они не сообщали об эффективном выявлении ни PrP-С ни PrP-Sc в фиксированных формалином тканях. Посмертную диагностику прионных заболеваний производят с использованием гистологических и иммуногистохимических анализов ткани головного мозга. Тестирование перед смертью у людей с предполагаемой CJD выполняют путем иммуногистохимического и гистологического исследования биопсий головного мозга. Кроме того, у людей с новым вариантомCJD, связанным с тем, что они подвергались воздействию BSE, имеет место накопление PrPSc в лимфоидных тканях (A.F. Hill et al., Lancet 349: 99 (1997. Присутствие PrP-Sc в лимфоидной ткани отличает атипичную CJD от спорадического или семейного заболевания. Поскольку биопсия головного мозга у жвачных животных не осуществима, при новом подходе, основанном на наблюдении W.J. Hadlow et al. (The Journal of Infectious Diseases 146:657-664 (1982, для биопсии были выбраны лимфатические узлы.Hadlow et al. показали, что инфективность обнаруживалась в некоторых лимфатических узлах(ретрофарингеальных, миндалинах, мезентеральных,подлопаточных,бронхиальномедиастинальных и селезеночных) и лимфоидной ткани в кишечнике овец, инфицированных скрейпи. В исследованиях Hadlow, выполненных до открытия белка-приона, обнаружена инфективность при прививке мышей. Race et al.Clinical Microbiology 34:1228-1231 (1996 выполнили сходные исследования посредством вестерн-иммуноблотов или иммуногистохимического анализа выбранных лимфатических узлов, используя поликлональную антисыворотку. Биопсия ткани миндалин у людей с клиническими признаками атипичной CJD является менее инвазивной процедурой, чем биопсия головного мозга, и иммуноанализ лимфоидной ткани можно использовать для диагностики атипичной CJD и для того, чтобы отличить эту форму от семейной, ятрогенной и спорадической CJD. Однако у жвачных домашних животных к основным недостаткам отбора образцов ткани миндалин или лимфоидной ткани относятся следующие: отбор образцов указанных внутренних тканей требует дорогостоящих инвазивных способов, включая общую анестезию с сопутствующим ей риском и периодом восстановления; лимфоидные ткани овец часто инфицированы бактериями Corynebacterium pseu 5dotuberculosis, которые нарушают структуру лимфатического узла и ограничивают его использование в данных исследованиях; ткань миндалин поглощает антигены окружающей среды, включая грибковые антигены, некоторые из которых перекрестно реагируют с PrP-Sc,давая неопределенные или ложно позитивные иммуногистохимические реакции, решения относительно которых должны быть приняты посредством технически требуемого Вестернблот-анализа. Совсем недавно O'Rourke et al.(The Veterinary Record, May 2, 1998, pp.489-491) описали неинвазивный диагностический анализ для преклинического выявления PrP-Sc у овец с использованием лимфоидной ткани мигательной перепонки (третьего века). Современные нормы федерального права США требуют истребления инфицированных скрейпи овец, а в некоторых штатах требуется уничтожение всех овец в стаде, родившихся в 60-дневный период после рождения ягненка у овцы, у которой впоследствии обнаружили скрейпи. Такие процедуры уничтожения являются очень дорогостоящими для производства. Кроме того, овцы в Америке крупные, мясные и быстро растущие. Многие зарубежные страны очень бы хотели закупить овец в Америке для генетических целей, но это не допускается из-за наличия скрейпи. Эпидемия BSE в Великобритании и Европейском Сообществе обошлась производителям и потребителям прямыми потерями поголовья скота и непрямой потерей рынков говядины и субпродуктов из говядины, включая экономически важные фармацевтические продукты. Страны, производящие баранину и говядину, во всем мире осуществляют дорогостоящие программы контроля и карантина, чтобы поддержать свой статус страны, в которой нет BSE. Что еще более важно, данные нескольких научных направлений исследования представили строгое доказательство того, что в Великобритании BSE были инфицированы люди. Размах этого нового заболевания еще не установлен. Необходимой является система реагентов для практического иммуноанализа, подходящая для выявления PrP-Sc в тканях человека, сельскохозяйственных животных, домашних животных и не домашних животных в зоопарках. Реагенты для анализа должны быть пригодными для выявления PrP-Sc у индивидуумов с разными генотипами РrР в пределах каждого вида и чувствительными и специфичными при использовании во множестве стандартных лабораторных протоколов. Сущность изобретения Данное изобретение относится к способам выявления белков-прионов или PrP-Sc-белков как показателя трансмиссивных губкообразных энцефалопатий. В одном варианте настоящее изобретение охватывает моноклональные антитела, которые специфично связываются с кон 005239 6 сервативным эпитопом на белках-прионах,идентифицированным как Gln-Tyr-Gln-Arg-GluSer, и способы иммуноанализа с использованием антител, включая иммуногистохимический анализ и Вестерн-блоттинг. Антитела пригодны для выявления PrP-Sc в фиксированной или нефиксированной ткани в качестве показателя наличия ТГЭ-инфекции. Во втором варианте настоящее изобретение относится к смеси моноклональных антител, содержащей вышеупомянутое моноклональное антитело в комбинации со вторым моноклональным антителом, которое специфично связывается со вторым консервативным эпитопом на белках-прионах, определенным как IleHis-Phe-Gly. Последнее антитело описано в заявке WO 99/19360. Неожиданно авторы обнаружили, что комбинация (обозначенная здесь как смесь моноклональных антител) антител к неперекрывающимся отдельным эпитопам обеспечивает оптимальное сочетание высокой чувствительности, определенной специфичности и широкой реакционной способности по отношению к PrP-белкам, несмотря на внутривидовое и межвидовое различие. Одно или оба моноклональных антитела в указанной смеси могут узнавать эпитопы, обнаруженные у всех видов млекопитающих, для которых сообщалось о ТГЭ естественного происхождения, и у ряда близко родственных видов. Кроме того, настоящее изобретение охватывает способы иммуноанализа с использованием антител первого варианта и смеси антител,включая иммуногистохимический анализ, Вестерн-иммуноблоты и дот-блоты. Антитело первого варианта и смесь антител согласно настоящему изобретению можно использовать при неинвазивном диагностическом анализе с использованием лимфоидной ткани третьего века, чтобы обнаружить PrP-Sc,как описано в заявке WO 99/19360. Мигательная перепонка или третье веко (palpebra tertia) жвачных животных состоит из хрящевой пластинки с поверхностными лимфоидными фолликулами и серозно-слизеобразующей секретирующей железы под конъюнктивой бульбарной поверхностью. Жвачные животные, включая овец, коз, гибридного оленя, лося и крупный рогатый скот, имеют третье веко. Образец лимфоидной ткани, связанной с мигательной перепонкой, можно легко получить, вывернув третье веко. Обычно видны две грозди лимфоидной ткани, расположенной над более бледной тканью железы. Биопсию лимфоидной ткани можно выполнить, используя только локальный анестетик. Затем собранный образец ткани подвергают иммуногистохимическому анализу или анализу другими способами выявления белка,которые могутвыявить прион или РrР-Sc, если он присутствует в ткани. Таким образом, третье веко представляет собой легко доступный образец для тестирования ткани живых животных 7 или животных, у которых образцы берут при забое. Указанный способ определения представляет очень необходимый практический способ раннего выявления PrP-Sc и обеспечивает способы преклинической диагностики ТГЭ. Согласно данному открытию предметом данного изобретения являются моноклональные антитела, которые узнают консервативный эпитоп белка-приона, и панспецифическая смесь антител, которая содержит моноклональные антитела к неперекрывающимся, отдельным эпитопам на белках-прионах видов, у которых ТГЭ встречается в естественных условиях (люди, крупный рогатый скот, овцы, козы, олень,лось, норка, домашние и не домашние кошки,некоторые виды не домашних жвачных животных и многие виды других приматов, отличных от человека, которые содержатся в зоопарках), и других близко родственных видов, потенциально подверженных ТГЭ-инфекции. Антитела выявляют PrP-Sc в фиксированной, обработанной ткани в качестве показателя наличия ТГЭинфекции и представляют собой смесь чувствительных реагентов для диагностики ТГЭ. Указанные реагенты на основе моноклональных антител к консервативным эпитопам на PrP-Sc обеспечивают специфичные, надежные и гибкие средства для точной диагностики ТГЭ. Применения антител включают их использование в качестве реагентов для стандартизованного диагностического тестирования и сравнительных патологических исследований. Следующим предметом настоящего изобретения являются способы выявления приона или PrP-Sc в качестве маркера ТГЭ, включая преклиническое выявление инфицированных живых животных и способы посмертного выявления. Другим предметом настоящего изобретения являются обеспечение неинвазивных диагностических анализов, основанных на биопсии лимфоидной ткани третьего века, и выявлениеPrP-Sc in situ в качестве практического способа раннего выявления PrP-Sc. Еще один предмет относится к способам имуноанализа, пригодным для диагностических исследований и исследований патогенеза ТГЭ у жвачных животных и людей и пригодных для выявления, надзора и контроля ТГЭ. Другие цели и преимущества настоящего изобретения будут легко понятны из следующего описания. Подробное описание изобретения В первом варианте настоящее изобретение охватывает моноклональные антитела, которые специфично связываются с консервативным карбоксильным эпитопом на белках-прионах,идентифицированным как Gln-Tyr-Gln-Arg-GluSer. Моноклональные антитела связываются с эпитопом на PrP-белках в фиксированной или замороженной ткани, которая была обработана для обнажения скрытого эпитопа PrP-Sc и ис 005239 8 ключения соответствующего эпитопа РrР-С. В целях данного изобретения термин прион илиPrP-Sc определяют как белок, связанный с заболеванием, который является маркером ТГЭ. Поскольку антитела выявляют PrP-Sc в качестве показателя наличия ТГЭ-инфекции в фиксированной, обработанной ткани или в замороженной ткани, предварительно обработанной протеиназой К, чтобы деградировать PrP-С, они представляют собой чувствительный реагент для диагностики ТГЭ. Антитела согласно настоящему изобретению получали, как описано в примере 2 ниже. Коротко, синтезировали пептид, представляющий собой остатки белка овцы 217-233 (остатки белка быка 225-241) Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-GlnArg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala, и связывали его с активированным имидом малеиновой кислоты KLH для применения в качестве иммуногена. Антисыворотку и моноклинальные антитела от мышей, которым проводили инокуляцию, проверяли на реактивность по отношению к рекомбинантному РrР овец, чтобы отобрать перекрестно-реагирующие антитела. Затем показали, что указанные антитела реагируют с PrP-Sc в фиксированной формалином,гидратированной автоклавированной ткани овец, гибридного оленя и лося и крупного рогатого скота. В целях данного изобретения моноклональными антителами, которые специфично связываются с консервативным эпитопом PrPSc, охватываемыми данным настоящим изобретением, являются антитела, которые специфичны по отношению к эпитопу продукта гена РrР,содержащему пептид Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser,и выявляют PrP-С в замороженной необработанной ткани и PrP-Sc в фиксированной или замороженной обработанной ткани. Примером моноклональных антител, которые связываются с данным консервативным эпитопом в фиксированной или нефиксированной обработанной ткани, является моноклональное антителоF99/97.6.1. Изотип данного антитела представляет собой IgGl. Настоящее изобретение также относится к способам иммуноанализа с использованием антител, включая иммуногистохимический анализ и Вестерн-блоттинг. Антитела пригодны для выявления PrP-Sc в фиксированной и нефиксированной ткани в качестве показателя наличия ТГЭ-инфекции. Во втором варианте настоящее изобретение относится к смеси моноклональных антител, содержащей вышеупомянутое моноклональное антитело в комбинации со вторым моноклональным антителом, которое специфично связывается со вторым консервативным эпитопом продукта гена РrР у овец, гибридного оленя и лося и крупного рогатого скота, определенным как Ile-His-Phe-Gly. Указанные моноклональные антитела подробно описаны в заявке на 9 выдачу патента WO 99/19360, которая включена здесь в виде ссылки в полном объеме. Указанный эпитоп далее определили как эпитоп, содержащий аминокислоты 142-145 продукта гена РrР овцы, которые идентичны аминокислотам 142-145 продукта гена РrР оленьих животных(гибридного оленя и лося Скалистых гор) и аминокислотам 150-153 продукта гена РrР быка. Антитела обладают еще одним свойством, состоящим в том, что они выявляют открытые эпитопы белка PrP-Sc в фиксированной или замороженной ткани, и таким образом они пригодны в качестве реагента для диагностики ТГЭ у овец, коз, крупного рогатого скота, гибридного оленя и лося с ТГЭ природного происхождения. Присутствие PrP-Sc свидетельствует о том,что животные инфицированы скрейпи, энцефалопатией коров или хронической изнуряющей болезнью. Примером моноклональных антител, которые связываются с консервативным эпитопомIle-His-Phe-Gly белка PrP-Sc в фиксированной или замороженной обработанной ткани жвачных животных является моноклональное антитело F89/160.1.5. Изотип этого антитела представляет собой IgGl. Характер иммуногистохимического окрашивания моноклонального антитела F89/160.1.5 сходен с характером окрашивания, описанным для головного мозга овец, зараженных скрейпи, с использованием поликлональной кроличьей антисыворотки к РrР овцы или хомячка. Другим примером моноклонального антитела, которое специфично связывается с эпитопом, к которому направлено моноклональное антитело F89/160.1.5, является моноклональное антитело F89/193.1.5. Сообщалось о генетической изменчивости у коз по аминокислотному остатку в эпитопе,узнаваемом моноклональными антителамиF89/160.1.5 и F89/193.1.5 (Ilе на Met в кодоне 142) (W. Goldmann et al., Journal of General Virology 77:2885-2891 (1996, и сообщалось о мутации в гене овцы в кодоне 141 (Phe на Leu),который фланкирует эпитоп (A. Bossers et al.,Journal of General Virology 77:2669-2673 (1996. Хотя эти изменения происходят только у небольших субпопуляций указанных видов, существует вероятность, что данные изменения или другие еще не идентифицированные изменения могут мешать связыванию указанных моноклональных антител с белком-прионом, и важное значение имеют чувствительные иммуногистохимические способы и способы преклинического определения для выявления, надзора и контроля ТГЭ, включая генетические варианты. Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили что комбинация (обозначаемая здесь смесью моноклональных антител) антител к указанным двум неперекрывающимся отдельным эпитопам обеспечивает оптимальное сочетание высокой чувствительности, определенной специфичности и широкой реакционной спо 005239 10 собности по отношению к белкам РrР, несмотря на межвидовое и внутривидовое варьирование. Смесь моноклональных антител согласно настоящему изобретению, по-видимому, выявляет все виды и все известные варианты, у которых встречается ТГЭ естественного происхождения. Антитела выявляют PrP-Sc в нефиксированной или фиксированной обработанной ткани в качестве показателя наличия ТГЭ-инфекции и представляют собой смесь чувствительных реагентов для диагностики ТГЭ. Изучение последовательностей РrР, помещенных в GenBank (табл. 1) показывает,что смесь антител будет выявлять эпитопы продукта гена РrР овец, крупного рогатого скота, людей, оленей, лосей, норки, домашних кошек и 56 видов не домашних жвачных животных и приматов, отличных от человека. Антитела связывают неперекрывающиеся эпитопы в фиксированных формалином тканях, так как удвоенная концентрация любого антитела менее чувствительна, чем комбинирование антител в равной концентрации. Антитела к каждому эпитопу и смесь антител выявляют PrP-Sc в фиксированной или замороженной обработанной ткани в качестве показателя наличия ТГЭ-инфекции и представляют собой чувствительный реагент для диагностики ТГЭ. Образцы ткани, пригодные для тестирования наPrP-Sc, включают лимфоидную ткань, связанную с третьим веком, ткань головного мозга,полученную при аутопсии, ткань, полученную при биопсии или аутопсии лимфатического узла, или ткань, полученную при биопсии или аутопсии селезенки. Моноклональное антитело образует комплекс антиген-антитело, и связанное антитело регистрируют иммунологическими способами, такими как твердофазный иммуноферментный анализ, Вестерн-блот-анализ,дот-блот-анализ, иммунография и иммуноцитохимия. Описание депонированной культуры. Постоянную линию клеток (гибридома), которая продуцирует и секретирует моноклональное антитело F99/97.6.1, поместили 6 апреля 1999 г. на хранение в Американскую коллекцию типов культур (АТСС), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA пo условиям Будапештского договора и присвоили инвентарный номер АТСС НВ-12696. Постоянную линию клеток (гибридома), которая продуцирует и секретирует моноклональное антитело F89/160.1.5,депонировали 24 сентября 1997 г. в АТСС по условиям Будапештского договора и присвоили инвентарный номер АТСС НВ-12403. Постоянную линию клеток (гибридома), которая продуцирует и секретирует моноклональное антителоF89/193.1.5, депонировали 25 мая 1999 г. в АТСС по условиям Будапештского договора и присвоили инвентарный номер РТА-114. 11 Таблица 1. Виды, у которых продукт гена РrР содержит эпитоп(ы) Ile-His-Phe-Gly и/или Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser Способы иммуноанализа с использованием антител также охватываются данным изобретением. Коротко, чтобы выявить PrP-Sc получают образец ткани от субъекта, которого предстоит тестировать; ткань фиксируют, например, консервированием в формалине или параформальдегиде, как известно в данной области. Затем срез фиксированной ткани обрабатывают, чтобы обнажить скрытый эпитоп PrP-Sc и исключить соответствующий эпитоп РrР-клеточного белка,который экспрессируется в тканях нормальных животных. Это удобно выполнять с помощью(а) автоклавирования гидратированного материала, например автоклавирования гидратированных срезов в воде или буфере примерно при 121 С в течение от 20 до 30 мин с последующим охлаждением; (b) обработки 95-99% муравьиной кислотой в течение от 5 до 30 мин с последующей стадией автоклавирования гидратированного материала или без указанной стадии, или (с) расщепления трипсином (например 0,1% трипсином в течение 20 мин при 37 С в Трис-HCl буфере, рН 7,6). Обеспечивают контакт фиксированной обработанной ткани с моноклональным антителом или смесью моноклональных антител согласно настоящему изобретению в количестве и в условиях, пригодных для связывания белка PrP-Sc, если он присутствует в ткани. Как указано в примерах, инкубация образца 12 ткани примерно с 3-5 мкг/мл любого из моноклональных антител или со смесью примерно 35 мкг/мл каждого антитела в подходящем буфере в течение 30 мин вызывает связывание антитела с консервативным эпитопом PrP-Sc. Связанное антитело регистрируют способами, известными в данной области. В одном аспекте моноклональное антитело, связанное со срезами ткани, выявляют при его контактировании с регистрируемым меченым (ферментными, радиоактивными или флуоресцентными регистрируемыми молекулами или молекулами биотина) реагентом против иммуноглобулина мыши (например IgGl) в таких условиях, чтобы меченый реагент против иммуноглобулина мыши связывался с моноклональным антителом и затем мог быть обнаружен по активности фермента, радиоактивной или флуоресцентной метке или по связыванию биотиновой метки с молекулой авидина/стрептавидина, меченной ферментными, радиоактивными или флуоресцентными молекулами. В предпочтительном варианте регистрацию выполняют посредством последовательной инкубации реагента против иммуноглобулина мыши, например биотинилированного антитела против IgG мыши и стрептавидина,меченного пероксидазой хрена, с промежуточными промывками в буфере, например ТрисНС 1-Твин 20. Добавляют индикаторный хромоген, такой как АЕС, чтобы выявить связанное антитело. В альтернативном случае замороженную ткань гомогенизируют в детергенте и обрабатывают протеиназой К, чтобы исключить полосуPrP-С с М.м. 35 кД и выявить характерные сложные полосы 28-32 кД устойчивых к протеиназе К фрагментов PrP-Sc. Обработанные белки разделяют в полиакриламидных гелях и переносят на фильтры. Осуществляют контакт фильтра с моноклональным антителом согласно настоящему изобретению или со смесью моноклональных антител согласно настоящему изобретению в количестве и в условиях, пригодных для связывания белка PrP-Sc в том случае, если он присутствует в ткани. Антитело или смесь антител выявляют, как описано выше, за исключением того, что предпочтительной конечной стадией регистрации является регистрация с помощью хемилюминесцентного субстрата. Как обсуждалось выше, антитела согласно настоящему изобретению пригодны для диагностических исследований и исследований патогенеза ТГЭ. Примеры Следующие примеры предназначены только для дальнейшей иллюстрации изобретения и не предназначены для ограничения рамок изобретения, которые определены формулой изобретения. Пример 1 Следующий пример описывает детекционный анализ PrP-Sc с использованием смеси со 13 гласно настоящему изобретению в лимфоидной ткани овцы. Тестированные животные. У двадцати семи овец породы Суффолк или родственных черномордых пород из стад, о которых неизвестно,контактировали ли они с овцами, инфицированными скрейпи, брали образцы посредством биопсии лимфоидной ткани мигательной перепонки. У сорока семи овец из стад, подвергавшихся воздействию скрейпи, образцы брали при аутопсии; собирали, как минимум, головной мозг,ретрофарингеальный лимфатический узел и миндалины. Все ткани были негативны в отношении PrP-Sc при иммуногистохимическом анализе, и ни в одной из них не выявили повреждений, характерных для скрейпи. У сорока пяти овец брали образцы при жизни и еще раз при аутопсии, или образцы брали только во время забоя после того, как наблюдали клинические симптомы скрейпи. Как минимум, собирали головной мозг и лимфоидную ткань мигательной перепонки. Образцы головного мозга всех 45 овец были позитивны по накоплениюPrP-Sc в головном мозге и диагностированы как зараженные скрейпи, что было установлено лабораториями национальной ветеринарной службы, Ames IA. Коротко, лимфоидную ткань мигательной перепонки и/или ретрофарингеального узла получали, используя стандартные способы гистопатологической обработки, за исключением того, что большинство тканей очищали муравьиной кислотой (99%, один час) перед заливкой. Срезы толщиной 3 мкм помещали на предметные стекла. Срезы кодировали и передавали в три лаборатории для иммунного окрашивания. Все лаборатории получали смесь моноклональных антител F89/160.1.5 и F99/97.6.1 в конечной концентрации 0,5 мг/мл каждого антитела. Образцы также повторно тестировали в U.S. Department of Agriculture, Agricultural ResearchService, Animal Disease Research Unit (USDA,ARS, ADRU). Образцы в ADRU и в лаборатории 1 анализировали, используя автоматизированное устройство для иммуноокрашивания Ventana Medical Systems, Inc. и рекомендуемые производителем реактивы для детекции с пероксидазой хрена/АЕС (ADRU) или детекции с щелочной фосфатазой/Fast Red (лаборатория 1). В лаборатории 2 срезы красили, используя автоматизированное устройство для иммуноокрашивания DAKO и комплект реактивов DAKO, и в лаборатории 3 использовали автоматизированное устройство для иммуноокрашивания в капиллярной щели с реактивами, описанными ранее (J. M. Miller et al., Journal of VeterinaryDiagnosis Investigation 6:366-368 (1994. Результаты сводили в таблицы в ADRU. Из 27 овец, о которых не было известно,подвергались ли они воздействию скрейпи, 26 были оценены отрицательно во всех лабораториях; один образец оценили позитивно в одной 14 лаборатории (лаборатория 3). Из 47 овец, подвергавшихся воздействию скрейпи, но не проявляющих признаков наличия PrP-Sc в головном мозге или лимфатических узлах с использованием анализа посредством иммуноокрашивания в ADRU, 42 были оценены отрицательно во всех трех лабораториях. Пять образцов были оценены позитивными в лаборатории 3. Из 45 овец со скрейпи, диагностированных на основе позитивного иммуноокрашивания РrР-Sc в головном мозге, 44 были позитивными при повторном тестировании в ADRU, 43 были позитивными в лабораториях 2 и 3. В целом указанное исследование показало,что смесь моноклонального антитела F89/160.1.5 и моноклонального антитела F99/97.6.1 выявляет PrPSc в лимфоидной ткани овец в разных обычных лабораторных условиях. Иммуногистохимический анализ лимфоидной ткани третьего века является чувствительным (93%) и специфичным (100%) диагностическим тестом для скрейпи овец. Инфицированных овец можно идентифицировать примерно в первой трети инкубационного периода. Анализ также пригоден в исследованиях генетически обусловленной чувствительности, пути передачи и патогенеза. Широкая видовая реактивность моноклональных антител F89/160.1.5. и F99/97.6.1 делает эту смесь реагентов пригодной для иммуногистохимического анализа и иммуноблот-анализа нервной и не нервных тканей всех видов, у которых встречается ТГЭ природного происхождения, и для надзора за родственными видами, подверженными ТГЭ в условиях промысла и в зоологических садах. Пример 2 Следующий пример описывает получение и характеристику моноклональных антител, которые специфично связываются с консервативным эпитопом PrP-Sc у жвачных животных или других животных и у людей. Коротко, пять мышей иммунизировали синтетическим пептидом, представляющим аминокислоты 217-233 продукта гена РrР овцы(аминокислоты 225-241 продукта гена РrР быка), конъюгированным с KLH. Проводили скрининг антисыворотки и надосадков гибридом посредством ELISA, используя в качестве антигена рекомбинантный гибридный белок РrР овцы, как описано в заявке WO 99/19360. Линия клеток 99/97 продуцировала антитела, реагирующие в ELISA, и была отобрана для двух раундов клонирования методом лимитирующего разведения. Клетки гибридомы дважды клонированной линии (F99/97.6.1) переносили в систему получения культуры клеток искусственных капилляров in vitro. Надосадок культуры ткани с концентрацией моноклонального антителаF99/97.6.1. (IgGl) от 2 до 4 мг/мл далее характеризовали посредством картирования эпитопов,иммуноблот-анализом и имуногистохимическим анализом. 15 Материалы и способы Получение антигена и продукция моноклонального антитела. Синтезировали пептидNH2-Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-GlnAla-Tyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala-COOH, представляющий остатки 225-241 продукта гена приона быка (Horiuchi et al., выше), и связывали с активированным имидом малеиновой кислоты гемоцианином морского блюдечка замочная скважина (KLH) (Pierce Chemical Company). Каждой из мышей BALB/c 6-недельного возраста подкожно в два места инокулировали всего 10 мкг конъюгированного пептида, эмульгированного в 200 мкл полного адъюванта Фрейнда. Две повторные инокуляции 10 мкг конъюгированного пептида в 200 мкл неполного адъюванта Фрейнда вводили с интервалами в 14 дней. Сыворотку, собранную венепункцией хвостовой вены, анализировали ELISA с использованием в качестве антигена рекомбинантного PrP-С овцы(смотри ниже). За три дня до слияния клеток мышей иммунизировали внутривенно 10 мкг конъюгированного пептида в фосфатно-солевом буфере (PBS) без адъюванта. Слияние клеток и клонирование методом лимитирующего разведения выполняли, следуя стандартным протоколам (W.M. Yokoyama, In: J.E. Coligan (ed.), Current Protocols in Immunology, Wiley Intersciences,New York, p. 2.2.1-2.5.17 (1994. Проводили скрининг надосадков первичных и клонированных гибридом методом ELISA с рекомбинантным PrP-С овцы. Отобрали клон 6.1 линии клеток F99/97 и перенесли в систему культуры клеток искусственных капилляров (CellMax, CellCoInc.) для получения in vitro надосадка, содержащего моноклональные антитела. Надосадки собирали ежедневно и объединяли. Изотип тяжелой цепи идентифицировали ELISA, а концентрацию моноклональных антител определяли иммунодиффузией. Получение рекомбинантного PrP-С овцы вEscherichia coli. Геномную ДНК выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови овец породы Суффолк. Открытую рамку считывания РrР амплифицировали с использованием фланкирующих праймеров (D. Westaway et al.,Genes Devel. 8:959-969 (1994, модифицированных так, чтобы они включали сайты рестрикции EcoRI: прямой праймер: 5'-ATCGAATTCAAGAAGCGACCACT-3'. Продукт ПЦР длиной 700 п.н. расщеплялиDH5 Е. coli выполняли, следуя традиционным способам. Проводили скрининг трансформантов путем ПЦР минипрепаратов колоний, используя праймеры для клонирования. Выбрали один позитивный клон (shPrP-pMal-1) для крупномасштабной экспрессии слитого белка. Слитый 16 продукт ShPrP-MBP выделяли из лизатов бактерий аффинной хроматографией на колонках с амилозной смолой и элюировали 10 мМ мальтозой. Проводили скрининг фракций с помощью Вестерн-иммуноблота, используя кроличью антисыворотку к PrP-пептиду NH2-Gly-Gln-GlyGly-Gly-Thr-His-Asn-Gln-Trp-Asn-Lys-Pro-SerLys-COOH (R2843) (К.I.O'Rourke et al., J. Gen.(ELISA). 2 планшета Immulon покрывали 6,25 мкг на лунку рекомбинантного слитого белкаShPrP-MBP в 50 мкл 0,05 М карбонатного буфера, рН 9,6 в течение ночи при 4 С. Планшеты блокировали коммерчески доступным блокирующим агентом на основе молока в разведении 1:15 (KPL, Gaithersburg, MD) в течение одного часа. В каждой лунке инкубировали 50 мкл антисыворотки или надосадка гидридом в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты проявляли с помощью антимышиного антитела козы - пероксидазы хрена и сульфоната 2,2'азиноди[3-этилбензтиазолина] (R. Fatzer et al.,Zentralbl. Veterinarmed. A. 43: 23-29 (1996(ABTS) (KPL, Gaithersburg, MD). Оптическую плотность измеряли при 405 нм. Негативные контроли включали в себя сыворотку неинокулированных мышей, надосадки подходящих по изотипу моноклональных антител несоответствующей специфичности или среду культуры ткани с концентрацией фетальной бычьей сыворотки, доведенной до 15%. Лунки с позитивными контролями инкубировали с кроличьей антисывороткой против пептида РrР (R2843) и проявляли с помощью антикроличьего антитела козы - пероксидазы хрена (HRPO) и ABTS. В позитивных лунках OD405 превышало два стандартных отклонения выше среднего значения для 4 лунок с негативными контролями. Определение эпитопа, связываемого моноклональным антителом F99/97.6.1. Набор перекрывающихся пептидов из 6 аминокислот каждый, охватывающий Val-Glu-Gln-Met-Cys-IleThr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-TyrGln-Arg-Gly-Ala-Ser-Val-Ile-Leu-Phe, синтезировали на мембранной подложке, используя традиционные способы, известные специалистам в данной области (Sigma-Genosys). Способность моноклонального антитела F99/197.6.1. связывать индивидуальные пептиды определяли визуально после инкубации с антителом противIgG мыши - пероксидазой хрена и хемилюминесцентным субстратом и экспозиции фильтров с пленкой Kodak X-Omat. Источник и последовательность гена РrР жвачных травоядных животных с ТГЭ природного происхождения. Ткани головного мозга 34 овец с гистопатологическими повреждениями скрейпи тестировали в отношении реактивности с моноклональным антителом F99/97.6.1 посредством иммуногистохимии. PrP-Sc выявили иммуногистохимически, используя поликло 17 нальную антисыворотку кролика против РrР хомячка, в 20 из указанных образов и посредством Вестерн-иммуноблота в 6 из 20 (J.M. Miller,Diagn Invent. 5: 309-316 (1993. Три овцы без гистопатологических повреждений скрейпи, у которых не выявлялся PrP-Sc при Вестерн-блотанализе, использовали в качестве негативных контролей. Указанные ткани были предоставлены патологами коллегий ветеринаров и диагностическими лабораториями штата или персоналом инспекционной службы здоровья животных и растений USDA. Образцы головного мозга 10 гибридных оленей (Odocoileus hemionus hemionus) и 4 лосей (Cervus elaphus nelsoni) c CWD природного происхождения были предоставлены диагностической лабораторией штата Колорадо и Отделением живой природы штата Колорадо. Неокрашенные срезы от 10 коров с BSE и 5 BSE-негативных коров были предоставлены лабораторией патобиологии лабораторий Национальной ветеринарной службы USDAAPHIS, Ames, IA. Парафиновые блоки для указанных срезов предоставлены Dr. Gerald Wells,Ministry of Agriculture, Fisheries and Food, Central Veterinary Laboratory, New Haw, Surrey,United Kingdom. Для анализа генотипа РrР имелись замороженные ткани головного мозга 12 из 34 скрейпи-позитивных овец, всех 10 гибридных оленей с CWD и 42 пораженных CWD лосей. Также имелись образцы крови 150 здоровых гибридных оленей и 244 здоровых лосей. Открытую рамку считывания гена РrР овцы амплифицировали в полимеразной цепной реакции, как описано выше, и полиморфный район из кодонов 112-240 секвенировали на обеих нитях посредством автоматизированной терминации нитей меченными флуоресцентным красителем дидезоксинуклеотидами (К. I. O'Rourke etal. Anim. Biotech. 7: 155-162 (1996. Амплифицировали от 100 до 800 нг геномной ДНК гибридного оленя или лося, используя видоспецифичные праймеры: прямой 5'-CTGCAAGAAGCGACCAAAACC обратный 5'-CACAGGAGGGGAGGAGAAGAGGAT в стандартных условиях, за исключением того,что концентрация Мg+2 была увеличена до 2,5 мМ. Продукты ПЦР секвенировали на обеих нитях, используя прямой праймер 5'GGCTATCCACCTCAGCTCTTTGGT которые обычно давали информацию о последовательности в кодонах с 106 по 224. Иммуноблот-анализ. PrP-Sc выделяли из головного мозга овец с клиническими симптомами скрейпи дифференциальным центрифугированием из буфера с саркозилом, как описаноRace et al., выше. Обычно 0,3 г головного мозга гомогенизировали в 50 мМ Трис-HCl, 5 мМ 18 МgСl2, рН 7,4, используя обработку ультразвуком. Гомогенат доводили до концентрации РНКазы 80 мкг/мл и ДНКазы 20 мкг/мл и инкубировали при 37 С в течение одного часа. Добавляли равный объем 20% (мас./об.) саркозила и инкубировали в течение 1,5 ч при комнатной температуре. После центрифугирования при 2000 хg в течение 30 мин при 20 С надосадок извлекали и центрифугировали при 200000 хg в течение 2,5 ч при 20 С. Осажденный материал ресуспендировали в 300 мкл 50 мМ Трис-HCl,рН 7,4 при обработке ультразвуком. Концентрацию протеиназы К в суспензии доводили до 10 мкг/мл в течение одного часа при 37 С, чтобы гидролизовать PrP-С. После добавления Pefabloc (Boerhinger Mannheim), чтобы остановить действие фермента, суспензию центрифугировали при 200000 хg в течение 1 ч при 20 С. Осадок кипятили в 300 мкл SDS-буфера для образцов для иммуноблот-анализа. Различные количества разделяли в 15%-ых полиакриламидных гелях и переносили на мембраны PVDF (Millipore). Мембраны обрабатывали 3 мкг/млF99/97.6.1, контрольным моноклональным антителом сходного изотипа или 3 мкг/млF99/97.6.1, предварительно абсорбированного со 100-кратным молярным избытком пептидаCys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-AlaTyr-Tyr-Gln-Arg-Gly-Ala, чтобы специфично исключить реакционную способность моноклонального антитела. Связанное антитело детектировали с помощью антитела козы против IgGl мыши, конъюгированного с пероксидазой хрена(Caltag Laboratories), и выявляли с помощью хемилюминесцентного субстрата (ECL, Amersham). Фильтры экспонировали с пленкой (Amersham Hyperfilm) в течение от 20 до 120 мин. Иммуногистохимия. Головной мозг фиксировали в 10%-ом забуференном формалине погружением и заливкой в парафиновые блоки. Один срез из каждого блока красили гематоксилином и эозином для обычного гистопатологического анализа. Дополнительные срезы ткани помещали на обработанные силаном предметные стекла для иммуногистохимии. Срезы депарафинировали и гидратировали. Срезы инкубировали в 99%-ой муравьиной кислоте в течение 5 мин, затем промывали и нейтрализовали 0,1 М Трис-HCl,рН 7,6. Срезы обрабатывали теплом в автоклаве или нагревателе под давлением при 121 С в течение 20 мин в модифицированном цитратном буфере, рН 6,1 (буфер DAKO TR). Стекла последовательно инкубировали в буфере с перекисью водорода, чтобы блокировать эндогенную пероксидазу, со смесью моноклональных антител F89/160.1.5 и F99/97.6.1 по 3 мкг/мл каждого в Трис-казеиновом разбавителе (32 мин при 37 С), биотинилированным антителом козы против IgG мыши (8 мин при 37 С), стрептавидином - пероксидазой хрена (8 мин при 37 С),АЕС/перекисью водорода (8 мин, 37 С) и затем 19 противоположно красили гематоксилином. Ткани помещали в водную среду для наложения покровных стекол. Негативные контроли заключались в (1) замене смеси моноклональных антител несоответствующим моноклональным антителом сходной концентрации того же изотипа (IgGl) и (2) инкубации смеси моноклональных антител с тканью головного мозга и лимфоидной тканью не зараженных скрейпи овец,как показано гистопатологическим анализом и Вестерн-блот-анализом. Последовательности генов гибридного оленя и лося. Идентифицировали три аллеля последовательности РrР гибридного оленя. Аллели 138S2 (GenBank, инвентарный номерU97331) кодируют Ser и Asn в кодоне 138. Аллель S1 (инвентарный номер AF009181) отличается от S2 молчащей мутацией. Обнаружены два аллеля гена РrР лося (GenBank AF016227,AF016228), кодирующих замену ML в кодоне 132. Результаты Картирование эпитопов и определение последовательностей. Эпитоп, узнаваемый моноклональным антителом F99/97.6.1, картировали с помощью панели перекрывающихся пептидов. Обнаружено, что для связывания антитела достаточны остатки 220-225 (Gln-Tyr-Gln-Arg-GluSer). Указанная последовательность консервативна в рассчитанных аминокислотных последовательностях аллелей крупного рогатого скота, гибридных оленей, лосей, коз, людей и овец,а также у 32 видов группы риска в отношении ТГЭ. Эпитоп обнаружен в случае вариантного аллеля C.hircus (коза) (GenBank X91999) с полиморфизмом в сайте связывания F89/160.1.5, и вариантного аллеля О. aries (овцы) с полиморфизмом в районе, непосредственно предшествующем эпитопу для F89/160.1.5 (данные приведены в A. Bossers et al., Archives of Virology 144:829-834 (1999. Реактивность в иммуноблотах по отношению к PrP-Sc овец, зараженных ТГЭ. Специфичность моноклонального антитела F99/97.6.1 оценивали Вестерн-блот-анализом препаратовPrP-Sc от овец со скрейпи природного происхождения и от нормальных овец. Полосы пептидов с кажущейся молекулярной массой в пределах 28-35 кД выявляли в экстрактах головного мозга овец, пораженных скрейпи. Полосы не обнаруживали в экстрактах головного мозга нормальных овец или в том случае, когда использовали подходящее по изотипу контрольное моноклональное антитело,или в том случае, когда проводили абсорбциюF99/97.6.1 с помощью пептидов, содержащих эпитоп, с которым связывается указанное антитело. Иммуногистохимия тканей нормальных и пораженных ТГЭ жвачных животных. Моноклональное антитело F99/97.6.1 далее оценива 005239 20 ли в отношении реактивности посредством иммуногистохимии на фиксированной формалином, залитой в парафин ткани головного мозга,подготовленной обычным способом для гистопатологического исследования. У всех животных, пораженных ТГЭ, имел место спонгиоз нейропиля, внутринейронные вакуоли и глиоз в выбранных ядрах ствола мозга и среднего мозга,повреждения, являющиеся диагностическими для ТГЭ. Для иммуногистохимического исследования, как минимум, отбирали средний мозг(на уровне рострального холмика) и продолговатый мозг (на уровне задвижки). Тепловая обработка автоклавированием была необходима для того, чтобы обнажить скрытый эпитоп PrPSc, связывающий моноклональное антителоF99/97.6.1. Выявлено позитивное окрашивание в головном мозге овец со скрейпи природного происхождения, гибридных оленей и лосей с CWD и крупного рогатого скота с BSE. Реактивность была ограничена серым веществом в среднем мозге и стволе мозга, была сконцентрирована в пораженных ядрах и присутствовала в нейропиле и в нейронах и глиальных клетках. Большая часть иммуноокрашивания состояла из плотных гранул или бляшек, случайно распределенных в нейропиле серого вещества. Часто РrР-Sc, агрегированный вблизи ядер глиальных клеток и накапливающийся в виде ответвлений вокруг глиальных клеток, гистологически идентифицировали как микроглию (небольшие, от овальных до заостренных гиперхроматических ядер без распознаваемой цитоплазмы). Имело место случайное периваскулярное и субэпендимальное покрывание белком PrP-Sc, напоминающее ножки астроглиальных отростков. Реактивность нейронов заключалась в точечном иммуноокрашивании в теле нейронов или отчетливом покрывании тела нейрона белком PrP-Sc, либо в пределах мембран нейронов, либо в пределах перинейронных глиальных отростков. PrP-Scреактивностью обладали как нейроны без внутринейронных вакуолей, так и нейроны с вакуолями. Не выявлено реактивности в головном мозге незараженных овец, оленей, лосей или крупного рогатого скота при иммуноокрашивании с использованием моноклонального антитела F99/97.6.1. или в головном мозге зараженных скрейпи овец или BSE-позитивного крупного рогатого скота при иммуноокрашивании с использованием контрольного моноклонального антитела подходящего изотипа. Понятно, что вышеуказанное подробное описание приводится только с целью иллюстрации и что могут быть осуществлены модификации и вариации изобретения, не отходя от сути и не выходя за рамки изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Моноклональное антитело, которое специфично связывается с консервативным эпитопом белков-прионов (PrP-Sc), определенным какGln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser (SEQ ID No. 1), и связывается с белком PrP-Sc в фиксированной или нефиксированной ткани, которая была обработана для того, чтобы обнажить указанный скрытый эпитоп белка PrP-Sc и исключить доступность соответствующего эпитопа РrР-С. 2. Моноклональное антитело по п.1, обозначенное F99/97.6.1, продуцируемое постоянной клеточной линией гибридомы АТСС НВ 12696. 3. Линия клеток гибридомы АТСС НВ-12696,которая продуцирует и секретирует моноклональное антитело F99/97.6.1, которое специфично связывается с консервативным эпитопом белковприонов (PrP-Sc), определенным как Gln-Tyr-GlnArg-Glu-Ser (SEQ ID No. 1), и связывается с белкомPrP-Sc в фиксированной или нефиксированной ткани, которая была обработана для того, чтобы обнажить указанный скрытый эпитоп белка PrP-Sc и исключить доступность соответствующего эпитопа РrР-С. 4. Смесь моноклональных антител, которая содержит первое моноклональное антитело,представляющее собой моноклональное антитело по п.1, и второе моноклональное антитело,которое специфично связывается со вторым консервативным эпитопом белков-прионов, определенным как Ile-His-Phe-Gly (SEQ ID No. 2),и связывается с белком PrP-Sc в фиксированной или нефиксированной ткани, которая была обработана для того, чтобы обнажить указанный скрытый эпитоп белка PrP-Sc и исключить доступность соответствующего эпитопа РrР-С. 5. Смесь моноклональных антител по п.4, в которой первое моноклональное антитело представляет собой антитело F99/97.6.1, продуцируемое постоянной клеточной линией гибридомы АТСС НВ-12696, а второе моноклональное антитело представляет собой моноклональное антитело F89/160.1.5 или моноклональное антитело F89/193.1.5. 6. Способ иммуноанализа для выявления белка PrP-Sc у животного или человека, включающий осуществление следующих стадий:(1) получение ткани животного или человека, которого предстоит тестировать;(2) фиксирование или замораживание указанной ткани;(3) обработку указанной фиксированной или замороженной ткани для того, чтобы обнажить скрытые эпитопы PrP-Sc и устранить доступность соответствующего эпитопа РrР-С;(4) обеспечение контактирования указанной обработанной ткани с моноклональным антителом, которое представляет собой моноклональное антитело по п.1, или смесью моноклональных антител по п.4, в таком количестве и в таких условиях, при которых указанные антитела связывают белок PrP-Sc, если указанный белок присутствует в указанной ткани, и(5) детекцию указанных связанных антител. 7. Способ по п.6, согласно которому указанной тканью является фиксированная ткань, а указанная обработка представляет собой автоклавирование гидратированного материала, обработку муравьиной кислотой с последующим автоклавированием гидратированного материала или без него,или расщепление трипсином. 8. Способ по п.6, согласно которому указанной тканью является замороженная ткань, а указанная обработка включает в себя обработку протеиназой K, чтобы исключить полосу PrP-С молекулярной массы 35 кДа и выявить характерные множественные полосы устойчивого к протеиназе K PrP-Sc молекулярной массы 28-32 кДа. 24 9. Способ по п.6, согласно которому указанным моноклональным антителом является антитело F99/97.6.1, продуцируемое постоянной клеточной линией гибридомы АТСС НВ-12696. 10. Способ по п.6, согласно которому указанная смесь моноклональных антител содержит первое моноклональное антитело, представляющее собой антитело F99/97.6.1, продуцируемое постоянной клеточной линией гибридомы АТСС НВ-12 696, и второе моноклональное антитело, представляющее собой антителоF89/160.1.5 или антитело F89/193.1.5. 11. Способ по п.6, согласно которому указанная детекция включает в себя обеспечение контактирования указанных антител с выявляемым меченым реагентом против иммуноглобулина мыши в таких условиях, при которых указанный реагент связывается с указанными антителами, и выявление связанного реагента. 12. Способ по п.6, согласно которому указанная детекция включает в себя(а) обеспечение контактирования указанных антител с меченым реагентом против иммуноглобулина мыши в таких условиях, при которых указанный реагент связывается с указанными антителами;(б) обеспечение контактирования связанного реагента с комплексом фермент-лиганд так,что указанный комплекс связывается с меткой на указанном реагенте, и(в) выявление указанного комплекса фермент-лиганд с помощью хромогенного субстрата. 13. Способ по п.6, согласно которому указанное животное выбрано из группы, состоящей из жвачных домашних животных, кошек, норки и приматов, отличных от человека. 14. Способ по п.13, согласно которому указанное жвачное домашнее животное выбрано из группы, состоящей из овцы, козы, крупного рогатого скота, гибридного оленя и лося. 15. Способ по п.6, согласно которому указанной тканью является лимфоидная ткань, ассоциированная с третьим веком, ткань аутопсии головного мозга, ткань биопсии или аутопсии лимфатического узла или ткань биопсии или аутопсии селезенки.