Новый ген sms 27

013412 Область техники, к которой относится изобретение Данное изобретение относится к недавно идентифицированным генам, которые кодируют белки,которые участвуют в синтезе L-аскорбиновой кислоты (далее называемой здесь витамином С) и/или 2 кето-L-гулоновой кислоты (далее называемой здесь 2-KGA). Данное изобретение описывает также полинуклеотиды, содержащие полноразмерные полинуклеотидные последовательности новых генов и их фрагментов, новые полинуклеотиды, кодируемые этими полинуклеотидами и их фрагментами, а также их функциональные эквиваленты. Данное изобретение относится также к применению указанных полинуклеотидов и полипептидов в качестве биотехнологических инструментов в получении витамина С и/или 2-KGA из микроорганизмов, посредством чего модификация указанных полинуклеотидов и/или кодируемых полипептидов оказывает прямое или непрямое действие на выход, продукцию и/или эффективность продуцирования продукта ферментации в указанном микроорганизме. В изобретение включены также способы/процессы использования этих полинуклеотидов и модифицированных полинуклеотидных последовательностей для трансформации микроорганизмов-хозяев. Данное изобретение относится также к генетически сконструированным микроорганизмам и их применению для прямого получения витамина С и 2-KGA. Уровень техники Витамин С является одним из очень важным и незаменимых факторов питания людей. Витамин С используют также в корме животных, даже хотя сельскохозяйственные животные могут синтезировать его в собственном теле. В течение последних 70 лет витамин С получали промышленным путем из D-глюкозы хорошо известным способом Райхштайна. Все стадии в этом процессе являются химическими, за исключением одной (превращения D-сорбита в L-лактозу), которую проводят микробным превращением. С его первоначального воплощения для промышленного получения витамина С, использовали несколько химических и технических модификаций для улучшения эффективности способа Райхштайна. Недавние разработки получения Витамина С суммированы в Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition,Vol. A27 (1996), pp. 547ff. Различные промежуточные стадии получения витамина С выполняли с использованием микроорганизмов или выделенных из них ферментов. Так, 2-кето-L-NS/31.08.2006 гулоновая кислота (2-KGA),промежуточное соединение, которое может быть химически превращено в витамин С реакцией щелочной перегруппировки, может быть получена ферментационным процессом из L-сорбозы или D-сорбита в качестве исходных продуктов с использованием штаммов, принадлежащих, например, к родам Ketogulonicigenium или Gluconobacter, или альтернативным ферментационным процессом из D-глюкозы в качестве исходного продукта с использованием рекомбинантных штаммов, принадлежащих к родам Gluconobacter или Pantoea. Существующие химические способы получения для витамина С имеют некоторые нежелательные характеристики, такие как высокое потребление энергии и использование больших количеств органических и неорганических растворителей. Таким образом, на протяжении последних десятилетий исследовались другие подходы к производству витамина С с использованием микробных превращений, которые могли бы быть более экономичными, а также более экологическими. Прямое продуцирование витамина С из ряда субстратов, включающих в себя D-сорбит, L-сорбозу иL-сорбозон, сообщалось в нескольких микроорганизмах, таких как водоросли, дрожжи и уксуснокислые бактерии, с использованием различных способов культивирования. Примеры известных бактерий, способных к прямому продуцированию витамина С, включают в себя, например, штаммы из родов Gluconobacter, Gluconacetobacter, Acetobacter, Ketogulonicigenium, Pantoea, Pseudomonas или Escherichia. Примеры известных дрожжей или водорослей включают в себя, например, Candida, Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces или Chlorella. Микроорганизмы, способные ассимилировать D-сорбит для роста, обычно имеют ферменты, способные окислять это соединение в универсальный субстрат ассимиляции, такой как D-фруктоза. Микроорганизмы, способные расти на L-сорбозе, имеют фермент, НАД(Ф)Н-зависимую L-сорбозоредуктазу,которая способна восстанавливать это соединение до D-сорбита, который затем окисляется далее в Dфруктозу. D-фруктоза является превосходным субстратом для роста многих микроорганизмов, после того как она фосфорилируется D-фруктозокиназой. Например, в случае уксуснокислых бактерий, которые являются облигатно-аэробными, грамотрицательными микроорганизмами, принадлежащими к роду Acetobacter, Gluconobacter и Gluconacetobacter,эти микроорганизмы способны транспортировать D-сорбит в цитозоль и превращать его в D-фруктозу при помощи цитозольной НАД-зависимой D-сорбитолдегидрогеназы. Некоторые отдельные штаммы,такие как Gluconobacter oxydans IFO 3292 и IFO 3293, способны также транспортировать L-сорбозу в цитозоль и восстанавливать ее в D-сорбит при помощи НАД(Ф)Н-зависимой L-сорбозоредуктазы, которая затем окисляется далее в D-фруктозу. В этих бактериях путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, а также цикл трикарбоновых кислот являются не полностью активными, и основным путем прохождения сахаров в центральный метаболизм является пентозофосфатный путь. D-фруктозо-6-фосфат, полученный из Dфруктозы в результате реакции фосфорилирования, вступает в пентозофосфатный путь, дополнительно-1 013412 метаболизируясь и продуцируя восстанавливающую активность в форме НАД(Ф)Н и трикарбоновые соединения, необходимые для роста и поддержания. Уксуснокислые бактерии хорошо известны в отношении их способности неполно окислять различные субстраты, такие как спирты, сахара, сахароспирты и альдегиды. Эти процессы обычно известны как окислительные ферментации или неполные окисления, и они были хорошо установлены на протяжении продолжительного времени в пищевой и химической промышленности, в частности, в производстве уксуса и L-сорбозы. Полезным продуктом, который, как известно, получают из неполных окислений Dсорбита или L-сорбозы с использованием штаммов, принадлежащих к роду Gluconobacter является 2KGA. Уксуснокислые бактерии выполняют эти реакции неполного окисления при помощи различных дегидрогеназ, локализованных в периплазматическом пространстве, на периплазматической мембране, а также в цитоплазме. Различные кофакторы используются этими различными дегидрогеназами, причем наиболее обычными являются PQQ (пирролохинолинхинол) и FAD (флавинадениндинуклеотид) для мембраносвязанных или периплазматических ферментов и NAD/NADP (НАД/НАДФ) для цитоплазматических ферментов. Хотя все продукты этих реакций окисления диффундируют обратно во внешнюю водную среду через наружную мембрану, некоторые из них могут пассивно или активно транспортироваться в клетку и дополнительно использоваться в метаболических путях, ответственных за рост и образование энергии. Внутри клетки окисленные продукты могут много раз восстанавливаться обратно в их исходный субстрат редуктазами и затем переноситься обратно в центральный метаболизм. Белки, в частности, ферменты и транспортеры, которые являются активными в метаболизации Dсорбита или L-сорбозы, называются здесь участвующими в системе метаболизации сорбита/сорбозы. Такие белки сокращенно называют белками SMS, и они функционируют в прямой метаболизации Dсорбита или L-сорбозы. Метаболизация D-сорбита или L-сорбозы включает в себя, с одной стороны, ассимиляцию этих соединений в цитозоле и последующее превращение в метаболиты, используемые для таких путей ассимиляции, как путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, пентозофосфатный путь, путь Энтнера-Дудорова и цикл трикарбоновых кислот, все из которых участвуют во всех образующих жизненную энергию и анаболических реакциях, необходимых для роста и поддержания живых клеток. С другой стороны, метаболизацияD-сорбита или L-сорбозы включает в себя также превращение этих соединений в дополнительные окисленные продукты, такие как L-сорбозон, 2-KGA и витамин С так называемыми процессами неполного окисления. Раскрытие изобретения Целью этого изобретения является улучшение выходов и/или продуктивности получения Витамина С и/или 2-KGA. Неожиданно, теперь было показано, что белки SMS или субъединицы таких белков, которые имеют активность в отношении ассимиляции или превращения D-сорбита, L-сорбозы или L-сорбозона или которые участвуют в ассимиляции или превращении D-сорбита, L-сорбозы или L-сорбозона, играют важную роль в биотехнологическом получении Витамина С и/или 2-KGA. В одном варианте осуществления белки SMS данного изобретения выбраны из оксидоредуктаз [ЕС 1],предпочтительно оксидоредуктаз, действующих на группу СН-ОН доноров [ЕС 1.1], более предпочтительно оксидоредуктаз с NAD+ или NADP+ в качестве акцептора [ЕС 1.1.1] и оксидоредуктаз с другими акцепторами[ЕС 1.1.99], наиболее предпочтительно выбраны из оксидоредуктаз, принадлежащих к классам ферментов[ЕС 1.1.1.1], [ЕС 1.1.1.15] или [ЕС 1.2.1.-], или предпочтительно оксидоредуктаз, действующих на альдегидную группу или оксогруппу доноров [ЕС 1.2], более предпочтительно оксидоредуктаз с NAD+ или NADP+ в качестве акцептора [ЕС 1.2.1]. Кроме того, белки SMS этого изобретения могут быть выбраны из группы, состоящей из мембраносвязанной PQQ-зависимой D-сорбитолдегидрогеназы, мембраносвязанной L-сорбозодегидрогеназы,мембраносвязаннойLсорбозодегидрогеназы, NAD(P)H-зависимой L-сорбозоредуктазы, цитозольной NADP-зависимой сорбозондегидрогеназы, цитозольной NAD(P)H-зависимой L-сорбозонредуктазы, мембраносвязанной альдегиддегидрогеназы, цитозольной альдегиддегидрогеназы, глицерол-3-фосфатдегидрогеназы, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и других участвующих в SMS белков, включающих в себя белки, участвующие в регуляции генов, кодирующих эти ферменты, такие как факторы транскрипции, в частности, репрессоры. В частности, теперь было обнаружено, что белки SMS, кодируемые полинуклеотидами, имеющими нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется предпочтительно при условиях высокой строгости с последовательностью, показанной в SEQ ID NO:1, играют важную роль в биотехнологическом получении Витамина С и/или 2-KGA. Было также обнаружено, что посредством генетического измене-2 013412 ния уровня экспрессии нуклеотидов в соответствии с этим изобретеним в микроорганизме, способном прямо продуцировать витамин С, таком как, например, Gluconobacter, прямое ферментирование витамина С и/или 2-KGA указанным микроорганизмом может быть даже в сильной степени улучшено. Таким образом, это изобретение относится к полинуклеотиду, выбранному из группы, состоящей из:(a) полинуклеотидов, кодирующих полипептид, содержащий аминокислотную последовательность в соответствии с SEQ ID NO:2;(b) полинуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID(c) полинуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, получаемую амплификацией нуклеиновой кислоты, например, полимеразной цепной реакцией, с использованием геномной ДНК из микроорганизма в качестве матрицы и набора праймеров в соответствии с SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4;(d) полинуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное полипептида, кодируемого полинуклеотидом любого из (а)-(с), где в указанном производном один или несколько аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент или указанное производное имеет активность регулятора транскрипции, предпочтительно репрессора L-сорбозодегидрогеназы (SDH) и/или L-сорбозондегидрогеназы(e) полинуклеотидов, комплементарная цепь которых гибридизуется при условиях строгой гибридизации с полинуклеотидом, определенным в одном из (а)-(d), и которые кодируют регулятор транскрипции, предпочтительно репрессор L-сорбозодегидрогеназы (SDH) и/или L-сорбозондегидрогеназы(f) полинуклеотидов, которые по меньшей мере на 60%, например 70, 85, 90 или 95%, идентичны полинуклеотиду, определенному в любом из (а)-(d), и которые кодируют регулятор транскрипции, предпочтительно репрессор L-сорбозодегидрогеназы (SDH) и/или L-сорбозондегидрогеназы (SNDH) (SMS 27); или комплементарной цепи такого полинуклеотида. Было обнаружено, что белок SMS, выделенный из Gluconobacter oxydans IFO 3293, показанный вSEQ ID NO:2 и описанный здесь, является особенно полезным белком SMS, так как он, по-видимому,выполняет решающую функцию в прямом получении витамина С в микроорганизмах, в частности, в бактериях, таких как уксуснокислые бактерии, такие как Gluconobacter, Acetobacter и Gluconacetobacter. Таким образом, это изобретение относится к полинуклеотиду, кодирующему полипептид в соответствии с SEQ ID NO:2. Этот белок может кодироваться нуклеотидной последовательностью, показанной в SEQID NO:1. Таким образом, это изобретение относится также к полинуклеотидам, содержащим нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO:1. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности, определенные выше, использовали в качестве запрашиваемой последовательности для выполнения поиска с программой Blast2 (версией 2 илиBLAST из национального Центра биологической информации [NCBI] в отношении базы данных PROSW-SwissProt (полной версии плюс инкрементальных модификаций). Из этих поисков полинуклеотидSMS 27 в соответствии с SEQ ID NO:1 был аннотирован как полинуклеотид, кодирующий регулятор транскрипции, относящийся к семейству TetR/AcrR. Этот белок, кодируемый SEQ ID NO:2, действует как репрессор посредством связывания с промоторным районом соответствующих генов, в том числе генов, кодирующих L-сорбозодегидрогеназу (SDH), таких как, например, ген, показанный в SEQ IDNO:11, кодирующий белок, показанный в SEQ ID NO:12, L-сорбозондегидрогеназу (SNDH), таких как,например, ген, показанный в SEQ ID NO:13, кодирующий белок, показанный в SEQ ID NO:14, и экспортер L-сорбазона, такой как, например, ген, показанный в SEQ ID NO:15, кодирующий белок, показанный в SEQ ID NO:16. Нуклеиновая кислота в соответствии с этим изобретением может быть получена амплификацией нуклеиновой кислоты с использованием кДНК, мРНК или, альтернативно, геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих олигонуклеотидных праймеров, таких как нуклеотидные праймеры в соответствии с SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, в соответствии со стандартными способами ПЦР-амплификации. Амплифицированная таким образом нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована анализом ДНК-последовательности. Матрицей для этой реакции может быть кДНК, полученная обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, о которых известно или в отношении которых предполагают, что они содержат полинуклеотид в соответствии с данным изобретением. Продукт ПЦР может быть субклонирован и секвенирован для гарантии, что амплифицированные последовательности представляют последовательности нуклеиновых кислот, описанные здесь, или их функциональный эквивалент. Этот ПЦР-фрагмент может быть затем использован для выделения клона полноразмерной ДНК различными способами. Например, этот амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга библиотеки кДНК бактериофага или космиды. Альтернативно, этот меченый фрагмент может быть использован для скрининга геномной библиотеки.-3 013412 Таким образом, это изобретение относится к полинуклеотидам, содержащим нуклеотидную последовательность, получаемую амплификацией нуклеиновых кислот, например, полимеразной цепной реакцией, с использованием ДНК, такой как геномная ДНК из микроорганизма, в качестве матрицы и набора праймеров в соответствии с SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4. Это изобретение относится также к полинуклеотидам, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент или производное, кодируемые полинуклеотидом, описанным здесь, где в указанном производном один или несколько аминокислотных остатков консервативно заменены в сравнении с указанным полипептидом, и указанный фрагмент или указанное производное имеет активность полипептида SMS, предпочтительно полипептида SMS 27. Это изобретение относится также к полинуклеотидам, комплементарная цепь которых гибридизуется при строгих условиях с полинуклеотидом, определенным здесь, и которые кодируют полипептидSMS, предпочтительно полипептид SMS 27. Это изобретение относится также к полинуклеотидам, которые по меньшей мере на 60% идентичны полинуклеотиду, определенному здесь, и которые кодируют полипептид SMS; и это изобретение относится также к полинуклеотидам, являющимся комплементарной цепью полинуклеотида, описанного здесь выше. Это изобретение относится также к праймерам, зондам и фрагментам, которые могут быть использованы для амплификации или детектирования ДНК по данному изобретению и для идентификации родственных видов или семейств микроорганизмов, также несущих такие гены. Это изобретение относится также к векторам, которые включают в себя полинуклеотиды этого изобретения, и микроорганизмам, которые сконструированы генетически с этими полинуклеотидами или указанными векторами. Это изобретение относится также к способам получения микроорганизмов, способных экспрессировать полипептид, кодируемый определенным выше полинуклеотидом, и полипептиду, кодируемому определенным выше полинуклеотидом. Это изобретение относится также к микроорганизмам, в которых активность полипептида SMS,предпочтительно полипептида SMS 27, уменьшена или устранена, так что выход Витамина С и/или 2KGA, которые прямо продуцируются из D-сорбита или L-сорбозы, является увеличенным. Квалифицированному в данной области специалисту будет известно, как уменьшить или устранить активность белка SMS, предпочтительно белка SMS 27. Это может быть, например, выполнено либо генетической модификацией организма-хозяина таким образом, что он продуцирует меньше копий или не продуцирует копии белка SMS, предпочтительно белка SMS 27, в сравнении с организмом дикого типа,или устранением специфической активности белка SMS, предпочтительно белка SMS 27. В следующем описании подробно описаны процедуры для достижения этой задачи, т.е. увеличения выхода и/или продукции Витамина С, который образуется непосредственно из D-сорбита или L-сорбозы,уменьшением или устранением активности белка SMS 27. Эти процедуры применимы mutatis mutandis (с соответствующими изменениями) для других белков SMS. Модификации с целью получения организма, продуцирующего меньше копий или не продуцирующего копий гена SMS 27 и/или белка могут включать в себя применение слабого промотора или мутации(например, инсерции, делеции или точковой мутации) (частей) гена SMS 27 или его регуляторных элементов. Уменьшение или элиминация специфической активности белка SMS 27 могут быть также выполнены способами, известными в данной области. Такие способы могут включать в себя мутацию (например, инсерцию, делецию или точковую мутацию) (частей) гена SMS 27. Это может, например, влиять на взаимодействие с ДНК, которое опосредовано N-концевым районом SMS 27, или взаимодействие с другими эффекторными молекулами. В данной области известны также способы уменьшения или устранения активности данного белка контактированием белка SMS 27 со специфическими ингибиторами или другими веществами, которые специфически взаимодействуют с белком SMS 27. Для идентификации таких специфических ингибиторов белок SMS 27 может экспрессироваться и тестироваться на активность в присутствии соединений,которые предположительно ингибируют активность белка SMS 27. Потенциально ингибирующие соединения могут быть, например, моноклональными или поликлональными антителами против белка SMS 27. Такие антитела могут быть получены рутинными протоколами иммунизации подходящих лабораторных животных. Это изобретение может быть выполнено в любом микроорганизме или с любым микроорганизмом,несущим ген SMS 27 или его эквивалент или гомолог. Подходящие микроорганизмы могут быть выбраны из бактерий, либо в виде штаммов дикого типа, мутантных штаммов, произведенных классическими способами мутагенеза и отбора, либо в виде рекомбинантных штаммов. Примерами таких бактерий могут быть, например, Gluconobacter, Gluconacetobacter, Acetobacter, Ketogulonicigenium, Pantoea,Rhizobium, Sinohrizobium, такой как, например, Sinorhizobium meliloti, Bradyrhizobium, такой как, например, Bradyrhizobium japonicum, Roseobacter, Ralstonia, Pseudomonas, такой как, например, PseudomonasA. aceti subsp. orleanus, предпочтительно G. oxydans IFO 3293, и их производные, несущие гены, участвующие в путях образования Витамина С, и смежные районы, в которых могут быть локализованы генSMS 27 или его эквивалент. Микроорганизмы, которые могут быть использованы для данного изобретения, могут быть публично доступны из различных источников, например, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Germany, American Type Culture CollectionIFO 13773, депонированный 08 декабря 1977 г. Штамм Acetobacter sp. ATCC 15164, который также является примером предпочтительной бактерии, был депонирован АТСС. Микроорганизм данного изобретения может нести дополнительные модификации либо на уровне ДНК, либо на уровне белка (см. выше), пока такая модификация не оказывает прямого действия на выход, продуктивность и/или эффективность прямого получения витамина С и/или 2-KGA из таких субстратов, как, например, D-сорбит или L-сорбоза. Такие дополнительные модификации могут, например,влиять на другие гены, кодирующие белки SMS4, описанные выше, в частности, гены, кодирующие мембраносвязанные L-сорбозондегидрогеназы, такие как L-сорбозондегидрогеназа SNDHai, мембраносвязанные PQQ-связанные D-сорбитолдегидрогеназы, и/или другие гены, кодирующие белки, участвующие в транспорте сахаров и/или сахароспиртов, такие как, например, экспортеры, в частности, экспортеры сорбозона, предпочтительно ген, показанный в SEQ ID NO:15. Способы выполнения таких модификаций известны в данной области, с некоторыми примерами, дополнительно описанными здесь. В отношении использования SNDHai для прямого получения витамина С, а также его нуклеотидной и аминокислотной последовательности авторы ссылаются на WO 2005/017159, который включен здесь в качестве ссылки. Согласно следующему предмету данного изобретения обеспечено применение определенного выше полинуклеотида или микроорганизма, который генетически сконструирован с использованием таких полинуклеотидов, в получении витамина С и/или 2-KGA. Данное изобретение относится также к способам экспрессии эндогенных генов в микроорганизме, к способам продуцирования полипептидов, определенных выше, в микроорганизме и к способам получения микроорганизмов, способных продуцировать витамин С и/или 2-KGA. Все эти способы могут предусматривать стадию изменения микроорганизма, где изменение включает в себя, в данном контексте,способ генетического изменения или изменения состава клеточных культуральных сред и/или способов, используемых для культивирования, таким образом, что выход и/или продуктивность продукта ферментации могут быть улучшены в сравнении с организмом дикого типа. В данном контексте, улучшенный выход витамина С обозначает увеличение по меньшей мере на 5, 10, 25, 30, 40, 50, 75, 100,200% или даже более, чем 500%, в сравнении с микроорганизмом дикого типа, т.е. микроорганизмом,который не был генетически изменен. Термин генетически сконструирован или генетически изменен обозначает научное изменение структуры генетического материала в живом организме. Оно включает в себя образование и применение рекомбинантной ДНК. Более конкретно, такое изменение используют для трансдифференцировки генетически сконструированного или модифицированного организма из природно-встречающегося организма. Генетическая инженерия может выполняться рядом способов, известных в данной области, таких как,например, замена генов, амплификация генов, разрушение генов, трансфекция, трансформация с использованием плазмид, вирусов или других векторов. Генетически модифицированный организм, например,генетически модифицированный микроорганизм часто называют также рекомбинантым организмом,например, рекомбинантным микроорганизмом. Согласно еще одному аспекту этого изобретения обеспечен способ получения витамина С и/или 2KGA прямой ферментацией. Несколько субстратов могут быть использованы в качестве источника углерода в способе данного изобретения, т.е. способе прямого превращения рассматриваемого субстрата в витамин С, например,способе, упомянутом выше. Особенно подходящими источниками углерода являются источники, которые могут быть легко получены из пути метаболизации D-глюкозы или D-сорбита, такие как, например,D-глюкоза, D-сорбит, L-сорбоза, L-сорбозон, 2-кето-L-гулонат, D-глюконат, 2-кето-D-глюконат или 2,5 дикетоглюконат. Предпочтительно этот субстрат выбран, например, из D-глюкозы, D-сорбита, Lсорбозы или L-сорбозона, более предпочтительно из D-глюкозы, D-сорбита или L-сорбозы, и наиболее предпочтительно из D-сорбита, L-сорбозы или L-сорбозона. Термин субстрат и продукционный суб-5 013412 страт в связи с вышеуказанным способом, использующим микроорганизм, используется взаимозаменяемо. Средой, используемой для вышеуказанного способа, использующего микроорганизм, может быть любая среда для получения витамина С и/или 2-KGA. Обычно этой средой является водная среда, содержащая, например, соли, субстрат (субстраты) и имеющая определенный рН. Среду, в которой этот субстрат превращается в витамин С и/или 2-KGA, также называют продукционной средой. Ферментация или продуцирование или ферментационный способ, в данном контексте, может быть применением растущих клеток с использованием сред, условий и процедур, известных квалифицированному специалисту, или применением нерастущих, так называемых покоящихся клеток, после того как их культивировали с использованием сред, условий и процедур, известных квалифицированному специалисту, при подходящих условиях для превращения подходящих субстратов в желаемые продукты, такие как витамин С и/или 2-KGA. Предпочтительно для получения витамина С используют покоящиеся клетки. Пример такого способа получения витамина С описан в WO 2005/017159 (включенном здесь в качестве ссылки). Предпочтительно 2-KGA получают с использованием растущих клеток (см.,например, ЕР 0518136 В 1). Термин прямая ферментация, прямое продуцирование, прямое превращение и т.п. предназначен для обозначения того, что микроорганизм способен превращать определенный субстрат в указанный продукт посредством одной или нескольких стадий биологического превращения, без необходимости какой-либо химической стадии превращения. Например, термин прямое превращение D-сорбита в витамин С предназначен для описания способа, в котором микроорганизм продуцирует витамин С и в котором D-сорбит предоставляется в качестве источника углерода без необходимости промежуточной стадии химического превращения. Предпочтительным является единственный микроорганизм, способный прямо ферментировать витамин С. Указанный микроорганизм культивируют в условиях, которые делают возможным такое превращение из субстрата, определенного выше. В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма понятно, что вышеуказанные микроорганизмы также включают в себя синонимы и базонимы таких видов, имеющие одни и те же физиологические свойства, как определено Международным Кодом Номенклатуры Прокариот. Номенклатура микроорганизмов, используемая здесь, является номенклатурой, официально признанной (на дату заявки приоритета) International Committee on Systematics of Prokaryotes and the Bacteriology and AppliedMicrobiology Division of the International Union of Microbiological Societies, и опубликована его официальным печатным изданием International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM). Приводится конкретная ссылка на Urbance et al., IJSEM (2001) vol 51:1059-1070, с корректирующим сообщением в IJSEM (2001) vol 51:1231-1233, описывающим таксономически измененную классификацию G. oxydans DSM 4025 как Ketogulonicigenium vulgare. В данном контексте покоящимися клетками называют клетки микроорганизма, которые, например,являются жизнеспособными, но не растущими активно, или клетки микроорганизма, которые растут при низких скоростях видового роста, например, при скоростях роста, которые являются более низкими, чем 0,02 ч-1, предпочтительно более низкими, чем 0,01 ч-1. Клетки, которые обнаруживают вышеуказанные скорости роста, называют клетками, находящимися в режиме покоящихся клеток. Описанный выше способ данного изобретения с использованием микроорганизма может выполняться в различных стадиях или фазах: предпочтительно этот микроорганизм культивируют в первой стадии (также называемой стадией (а) или фазой роста) в условиях, позволяющих рост. Эта фаза заканчивается изменением условий, так что скорость роста этого микроорганизма уменьшается, приводя к покоящимся клеткам, причем эту стадию называют также стадией (b), с последующим продуцированием Витамина С из субстрата с использованием (b), также называемой продукционной фазой. Стадия роста и продукционная фаза, выполняемые в вышеуказанном способе с использованием микроорганизма, могут выполняться в одном и том же сосуде, т.е. только в одном сосуде или в двух и более различных сосудах с необязательной стадией разделения между этими двумя фазами. Полученный витамин С может быть извлечен из клеток любым подходящим способом. Способом извлечения является, например, способ, заключающийся в том, что продуцированный витамин С может быть выделен из продукционной среды. Необязательно полученный таким образом витамин С может быть дополнительно обработан. Для цели данного изобретения, относящегося к вышеуказанному способу с использованием микроорганизма, термины фаза роста, стадия выращивания, стадия роста и период роста используются здесь взаимозаменяемо. То же самое относится к терминам продукционная фаза, продукционная стадия, продукционный период. Одним путем выполнения вышеуказанного способа с использованием микроорганизма, описанного в данном изобретении, может быть способ, в котором этот микроорганизм выращивают в первом сосуде,так называемом сосуде для роста, в качестве источника для покоящихся клеток и по меньшей мере часть этих клеток переносят во второй сосуд, так называемый продукционный сосуд. Условия в продукционном сосуде могут быть такими, что перенесенные из сосуда для роста клетки становятся покоящимися клетками, определенными выше. Витамин С продуцируют во втором сосуде и извлекают из него.-6 013412 В связи с описанным выше способом с использованием микроорганизма в одном аспекте стадия выращивания может выполняться в водной среде, т.е. среде для выращивания, дополненной подходящими питательными веществами для роста при анаэробных условиях. Культивирование может проводиться, например, в периодическом режиме, периодическом режиме с подпиткой, полунепрерывном или непрерывном режиме. Период культивирования может варьироваться в зависимости, например, от хозяина,рН, температуры и питательной среды, которые должны использоваться, и могут быть, например, приблизительно 10 ч - приблизительно 10 дней, предпочтительно приблизительно 1 день - приблизительно 10 дней, более предпочтительно приблизительно 1 день - приблизительно 5 дней при проведении культивирования в периодическом режиме или периодическом режиме с подпиткой, в зависимости от микроорганизма. Если клетки выращивают в непрерывном режиме, время пребывания в сосуде может быть,например, приблизительно 2 - приблизительно 100 ч, предпочтительно приблизительно 2 ч - приблизительно 50 ч, в зависимости от микроорганизма. Если микроорганизм выбран из бактерий, культивирование может проводиться, например, при рН приблизительно 3,0 - приблизительно 9,0, предпочтительно приблизительно 4,0 - приблизительно 9,0, более предпочтительно приблизительно 4,0 - приблизительно 8,0, даже более предпочтительно приблизительно 5,0 - приблизительно 8,0. При использовании водорослей или грибов культивирование может проводиться, например при рН ниже приблизительно 7,0, предпочтительно ниже приблизительно 6,0, более предпочтительно ниже приблизительно 5,5 и наиболее предпочтительно ниже приблизительно 5,0. Подходящий диапазон температур для проведения культивирования с использованием бактерий может быть, например, приблизительно 13 С - приблизительно 40 С, предпочтительно приблизительно 18 С - приблизительно 37 С, более предпочтительно приблизительно 13 С - приблизительно 36 С и наиболее предпочтительно приблизительно 18 С -приблизительно 33 С. При использовании водорослей или дрожжей подходящий диапазон температур для проведения культивирования может быть, например, приблизительно 15 С - приблизительно 40 С, предпочтительно приблизительно 20 С - приблизительно 45 С, более предпочтительно приблизительно 25 С приблизительно 40 С, даже более предпочтительно приблизительно 25 С - приблизительно 38 С и наиболее предпочтительно приблизительно 30 С - приблизительно 38 С. Культуральная среда для выращивания обычно может содержать такие питательные вещества, как ассимилируемые источники углерода, например,глицерин, D-маннит, D-сорбит, L-сорбоза, эритрит, рибит, ксилит, арабит, инозит, дульцит, D-рибоза, Dфруктоза, D-глюкоза, сахароза и этанол, предпочтительно L-сорбоза, D-глюкоза, D-сорбит, D-маннит,глицерин и этанол; и перевариваемые источники азота, такие как органические вещества, например, пептон, дрожжевой экстракт и аминокислоты. Среды могут содержать или могут не содержать мочевину,и/или жидкий кукурузный экстракт и/или хлебопекарные дрожжи. В качестве источников азота могут быть использованы различные неорганические вещества, например, нитраты и соли аммония. Кроме того, среда для выращивания может обычно содержать неорганические соли, например, сульфат магния,сульфат марганца, фосфат калия и карбонат кальция. Клетки, полученные с использованием описанных выше процедур, могут затем дополнительно инкубироваться по существу при тех же самых режимах,температурных условиях и рН, какие описаны выше, в присутствии таких субстратов, как D-сорбит, Lсорбоза или D-глюкоза, таким образом, что они превращают эти субстраты непосредственно в Витамин С и/или 2-KGA. Инкубирование может выполняться в богатой азотом среде, содержащей, например, источники органического азота, например, пептон, дрожжевой экстракт, хлебопекарные дрожжи, мочевину, аминокислоты и жидкий кукурузный экстракт, или неорганические источники азота, например, нитраты и соли аммония, и в этом случае клетки будут способны расти далее, продуцируя Витамин С и/или 2-KGA. Альтернативно, инкубирование может выполняться в бедной азотом среде, и в этом случае клетки по существу не будут расти и будут находиться в режиме покоящихся клеток, или режиме биотрансформации. Во всех случаях, инкубационная среда может также содержать неорганические соли, например, сульфат магния, сульфат марганца, фосфат калия и хлорид кальция. В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма в фазе роста конкретные скорости роста равны, например, по меньшей мере 0,02 ч-1. Для клеток, растущих в периодическом, периодическом с подпиткой или полунепрерывном режиме, скорость роста зависит, например, от состава среды для выращивания, рН, температуры и т.п. Обычно скорости роста могут быть, например, в диапазоне приблизительно 0,05 -приблизительно 0,2 ч-1, предпочтительно приблизительно 0,06 - приблизительно 0,15 ч-1, и наиболее предпочтительно приблизительно 0,07 - приблизительно 0,13 ч-1 . В другом аспекте вышеуказанного способа с использованием микроорганизма покоящиеся клетки могут быть обеспечены культивированием соответствующего микроорганизма на чашках с агаром, служащих таким образом в качестве сосуда для выращивания, с использованием по существу тех же самых условий, например, периода культивирования, рН, температуры, питательной среды, что и описанные выше, с добавлением агара. В связи с вышеуказанным сцособом с использованием микроорганизма, если фазу роста и продукционную фазу выполняют в двух отдельных сосудах, то клетки из фазы роста могут быть собраны или сконцентрированы и перенесены во второй сосуд, так называемый продукционный сосуд. Этот сосуд может содержать водную среду, дополненную любым применимым продукционным субстратом, который может быть превращен в витамин С этими клетками. Клетки из сосуда для роста могут быть собра-7 013412 ны и сконцентрированы любой подходящей операцией, такой как, например, центрифугирование, ультрафильтрация или микрофильтрация в поперечном потоке через мембрану, фильтрация, декантация,флокуляция. Полученные таким образом клетки могут быть перенесены в продукционный сосуд в форме исходного бульона из сосуда для роста, без сбора, концентрирования или промывания, т.е. в форме суспензии клеток. В предпочтительном варианте осуществления, эти клетки переносят из сосуда для выращивания в продукционный сосуд в форме суспензии клеток без какой-либо стадии промывания или выделения между ними. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа с использованием микроорганизма стадия (а) и стадия (с) способа данного изобретения, описанного выше, не разделены никакой стадией промывания и/или разделения. В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма, если фазу роста и продукционную фазу выполняют в одном и том же сосуде, клетки могут быть выращены при подходящих условиях до желаемой плотности клеток с последующей заменой среды для выращивания продукционной средой, содержащей продукционный субстрат. Такой заменой может быть, например, подача продукционной среды в сосуд одновременно и при той же скорости, при которой отбирают или собирают супернатант из этого сосуда. Для поддерживания покоящихся клеток в этом сосуде могут быть использованы операции для рециркуляции или удерживания клеток, такие как, например, стадии рециркуляции. Такие стадии рециркуляции включают в себя, например, но не ограничиваются ими, способы, использующие центрифуги, фильтры, стадии микрофильтрации или ультрафильтрации в поперечном потоке через мембрану, мембранные реакторы, флокуляцию или иммобилизацию клеток в подходящих, пористых, непористых или полимерных матриксах. После переходной стадии сосуд подвергают условиям способа, при которых эти клетки находятся в режиме покоящихся клеток, определенном выше, а продукционный субстрат эффективно превращается в витамин С. Водная среда в продукционном сосуде, используемая для продукционной стадии в связи с описанным выше способом, далее называемая продукционной средой, может содержать только продукционный субстрат (продукционные субстраты), подлежащие превращению в витамин С, или может содержать,например, дополнительные неорганические соли, например, хлорид натрия, хлорид кальция, сульфат магния, сульфат марганца, фосфат калия, фосфат кальция и карбонат кальция. Продукционная среда может содержать также перевариваемые источники азота, такие как, например, органические вещества, например, пептон, дрожжевой экстракт, мочевину, аминокислоты, жидкий кукурузный сироп, и неорганические вещества, например, аммиак, сульфат аммония и нитрат натрия, в таких концентрациях, что эти клетки поддерживаются в режиме покоящегося состояния, описанном выше. Эта среда может содержать или может не содержать мочевину и/или жидкий кукурузный сироп и/или хлебопекарные дрожжи. Продукционная стадия может проводиться, например, в периодическом режиме, периодическом режиме с подпиткой, полунепрерывном или непрерывном режиме. В случае периодического режима с подпиткой,полунепрерывного или непрерывного режима как клетки из сосуда для выращивания, так и продукционная среда могут подаваться непрерывно или периодически в продукционный сосуд при подходящих скоростях подачи. Альтернативно, только продукционная среда может подаваться непрерывно или периодически в продукционный сосуд, в то время как клетки, поступающие из сосуда для выращивания, переносятся сразу же в продукционный сосуд. Клетки, поступающие из сосуда для выращивания, могут быть использованы в виде суспензии клеток в продукционном сосуде или могут быть использованы, например, в виде флоккулированных или иммобилизованных клеток в любой твердой фазе, такой как пористые или полимерные матриксы. Продукционный период, определенный как период, прошедший между вхождением субстрата в продукционный сосуд и сбором супернатанта, содержащего витамин С, так называемого потока собранного продукта, может варьироваться в зависимости, например, от типа и концентрации клеток, рН, температуры и питательной среды, которые должны использоваться, и предпочтительно равен приблизительно 2 - приблизительно 100 ч. рН и температура могут отличаться от рН и температуры стадии роста, но по существу являются теми же самыми, что и рН и температура стадии роста. В предпочтительном варианте осуществления вышеуказанного способа с использованием микроорганизма продукционную стадию проводят в непрерывном режиме, что означает, что первый подаваемый поток, содержащий клетки из сосуда роста, и второй подаваемый поток, содержащий субстрат, подают непрерывно или периодически в продукционный сосуд. Первый поток может содержать только клетки,выделенные/отделенные из продукционной среды, или суспензии клеток, приходящие из стадии роста,т.е. клетки, суспендированные в среде для выращивания, без промежуточной стадии отделения, промывания и/или выделения клеток. Второй подаваемый поток, как определено здесь, может включать в себя все другие подаваемые потоки, необходимые для операции (режима работы) продукционной стадии, например, продукционную среду, содержащую субстрат, в форме одного или нескольких различных потоков, воду для разбавления и основание для контроля рН. В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма, когда оба потока подают непрерывно, отношение скорости подачи первого потока к скорости подачи второго потока может варьироваться между приблизительно 0,01 и приблизительно 10, предпочтительно между приблизительно 0,01 и приблизительно 5, наиболее предпочтительно между приблизительно 0,02 и приблизительно 2.-8 013412 Это отношение зависит от концентрации клеток и субстрата в первом и втором потоке, соответственно. Другим путем выполнения способа, описанного выше, с использованием микроорганизма данного изобретения может быть способ с использованием определенной плотности покоящихся клеток в продукционном сосуде. Плотность клеток измеряют в виде единиц оптической плотности (оптическая плотность) при 600 нм способами, известными квалифицированному в данной области специалисту. В предпочтительном варианте осуществления плотность клеток в продукционной стадии равна по меньшей мере приблизительно 10, более предпочтительно приблизительно 10 - приблизительно 200, даже более предпочтительно приблизительно 15 - приблизительно 200, еще более предпочтительно 15 - приблизительно 120 и наиболее предпочтительно приблизительно 20 - приблизительно 120. В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма для поддержания этих клеток в продукционном сосуде при желаемой плотности клеток во время продукционной фазы, выполняемой, например, в непрерывном или полунепрерывном режиме, могут быть использованы любые средства, известные в данной области, такие как, например, рециркуляция клеток центрифугированием, фильтрация, ультрафильтрация или микрофильтрация в поперечном потоке через мембрану, декантация, флокуляция, удерживание клеток в сосуде мембранными устройствами или иммобилизацией клеток. Кроме того, в случае выполнения продукционной стадии в непрерывном или полунепрерывном режиме и при непрерывной или периодической подаче клеток из сосуда для выращивания плотность клеток в продукционном сосуде может поддерживаться при константном уровне, например, сбором количества клеток из продукционного сосуда, соответствующего количеству клеток, подаваемому из сосуда для выращивания. В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма, продуцированный витамин С, содержащийся в так называемом потоке собранного продукта, извлекают/собирают из продукционного сосуда. Поток собранного продукта может включать в себя, например, бесклеточный или содержащий клетки водный раствор, приходящий из продукционного сосуда, который содержит витамин С как результат превращения продукционного субстрата покоящимися клетками в продукционном сосуде. Клетки, все еще присутствующие в потоке собранного продукта, могут быть отделены от витамина С любой операцией, известной в этой области, такой как, например, фильтрация, центрифугирование, декантация,мембранная ультрафильтрация или микрофильтрация в поперечном потоке, ультрафильтрация или микрофильтрация в тангенциальном потоке или тупиковая фильтрация. После этой операции отделения клеток поток собранного продукта по существу не содержит клеток. В дополнительном аспекте способ данного изобретения может быть комбинирован с дополнительными стадиями отделения и/или очистки полученного витамина С от других компонентов, содержащихся в потоке собранного продукта, т.е. так называемыми стадиями обработки ниже по ходу процесса. Эти стадии могут включать в себя любые средства, известные квалифицированному в данной области лицу,такие как, например, концентрирование, кристаллизация, осаждение, адсорбция, ионный обмен, электродиализ, биполярный мембранный электродиализ и/или обратный осмос. Витамин С может быть дополнительно очищен в форме свободной кислоты или любой из его известных форм солей посредством таких операций, как, например, обработка активированным углем, ионообмен, адсорбция и элюция, концентрирование, кристаллизация, фильтрация и сушка. Конкретно, первое отделение витамина С от других компонентов в потоке собранного продукта может выполняться любой комбинацией или повторением, например, следующих способов: содержащего два или три компартмента электродиализа, биполярного мембранного электродиализа, обратного осмоса или адсорбции, например, на ионообменных или неионообменных смолах. Если полученной формой витамина С является соль L-аскорбиновой кислоты,превращение этой формы соли в форму свободной кислоты может быть выполнено, например, биполярным мембранным электродиализом, ионообменом, хроматографическими способами с имитированным движущимся слоем и т.п. Комбинирование указанных стадий, например, электродиализа и биполярного мембранного электродиализа в одной стадии может быть также использовано, как и комбинирование указанных стадий, например, нескольких стадий ионообмена с использованием хроматографических способов с имитированным движущимся слоем. Любые из этих процедур, отдельно или в комбинации,представляют удобные средства для выделения и очистки этого продукта, т.е. витамина С. Полученный таким образом продукт может быть дополнительно выделен таким способом, как, например, концентрирование, кристаллизация, осаждение, промывание и сушка кристаллов, и/или дополнительно очищен,например, обработкой активированным углем, ионообменом и/или перекристаллизацией. В предпочтительном варианте осуществления витамин С очищают из потока собранного продукта рядом стадий обработки ниже по ходу процесса, как описано выше, без перенесения его в неводный раствор в любой момент этой обработки, т.е. все стадии выполняют в водной среде. Такая предпочтительная процедура обработки ниже по ходу процесса может включать в себя, например, концентрирование потока собранного продукта, приходящего из продукционного сосуда, при помощи имеющего два или три компартмента электродиализа, превращение витамина С в его форме соли, присутствующей в концентрированном растворе, в его форму кислоты с использованием биполярного мембранного электродиализа и/или ионообмена, очистку такими способами, как, например, обработка активированным углем, ионообменом или неионными смолами с последующей стадией концентрирования и кристаллизации. Эти кристаллы могут быть отделены, промыты и высушены. Если необходимо, эти кристаллы могут быть-9 013412 опять повторно солюбилизированы в воде, обработаны активированным углем и/или ионообменными смолами и перекристаллизованы. Затем эти кристаллы могут быть отделены, промыты и высушены. Предпочтительные варианты осуществления этого изобретения становятся очевидными из зависимых пунктов формулы изобретения. Эти и другие аспекты и варианты осуществления данного изобретения должны быть очевидными специалистам с квалификацией в данной области из приведенных здесь утверждений. Последовательность гена, содержащая нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ IDNO:1, кодирующую белок SMS 27, определяли секвенированием геномного клона, полученного из Gluconobacter oxydans IFO 3293. Данное изобретение относится также к полинуклеотиду, кодирующему по меньшей мере биологически активный фрагмент или производное полипептида SMS 27, показанного в SEQ ID NO:2. В данном контексте биологически активный фрагмент или биологически активное производное обозначает полипептид, который сохраняет, по существу, ту же самую биологически активную функцию или активность, что и полипептид, показанный в SEQ ID NO:2. Примерами биологической активности могут быть, например, ферментативная активность, активность передачи сигнала или реактивность антитела. Термин та же самая биологическая функция или функциональный эквивалент обозначает в данном контексте, что этот белок имеет по существу ту же самую биологическую активность, например,ферментативную активность, активность передачи сигнала, реактивность антитела, функцию регулятора транскрипции, что и полипептид, показанный в SEQ ID NO:2. Полипептиды и полинуклеотиды данного изобретения предпочтительно обеспечивают в выделенной форме и предпочтительно очищают до гомогенности. Термин выделенный означает, что этот материал удален из его исходного окружения (например,природного окружения, если он является природно-встречающимся). Например, природновстречающийся полинуклеотид или полипептид, присутствующий в живом микроганизме, не является выделенным, но тот же самый полинуклеотид или полипептид, отделенный от нескольких или всех сосуществующих материалов в природной системе, является выделенным. Такие полинуклеотиды могли бы быть частью вектора и/или такие полинуклеотиды или полипептиды могли бы быть частью композиции и все еще быть выделенными, в том смысле, что такой вектор или композиция не являются частью их природного окружения. Выделенным полинуклеотидом или выделенной нуклеиновой кислотой может быть ДНК или РНК,которая является непосредственно смежной с обеими из кодирующих последовательностей, с которыми она является непосредственно смежной (одной на 5'-конце и одной на 3'-конце) в природновстречающемся геноме организма, из которого она получена. Таким образом, в одном варианте осуществления нуклеиновая кислота включает в себя несколько или все 5'-некодирующие (например, промотор) последовательности, которые являются непосредственно смежными с кодирующей последовательностью. Таким образом, термин выделенный полинуклеотид включает в себя, например, рекомбинантную ДНК, которая включена в вектор, в автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус или в геномную ДНК прокариоты или эукариоты или которая существует в виде отдельной молекулы (например,фрагмента кДНК или геномной ДНК, полученного при помощи ПЦР или обработки рестрикционными эндонуклеазами), независимой от других последовательностей. Этот термин включает в себя также рекомбинантную ДНК, которая является частью гибридного гена, кодирующего дополнительный полипептид, которая по существу не содержит клеточного материала, вирусного материала или культуральной среды (при получении способами рекомбинантных ДНК) или химических предшественников или других материалов (при химическом синтезе). Кроме того, выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты является фрагментом нуклеиновой кислоты, который не встречается в природе в виде фрагмента и не мог бы быть обнаружен в природном состоянии. В данном контексте термины полинуклеотид, ген и рекомбинантный ген относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые могут быть выделены из хромосомной ДНК, которые включают в себя открытую рамку считывания, кодирующую белок, например, белки SMS G. oxydans IFO 3293. Полинуклеотид может включать в себя полинуклеотидную последовательность, показанную в SEQ IDNO:1, или ее фрагменты и районы слева и справа от последовательностей гена, которые могут включать в себя, например, районы промотора, районы регулятора и района терминатора, важные для правильной экспрессии и стабилизации полученного из них полипептида. Ген может включать в себя кодирующие последовательности, некодирующие последовательности,такие как, например, нетранслируемые последовательности, расположенные при 3'- и 5'-концах кодирующего района гена, и регуляторные последовательности. Кроме того, термин ген относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, определенной здесь. Кроме того, квалифицированному в данной области специалисту понятно, что могут существовать полиморфизмы ДНК-последовательности, которые приводят к изменениям в аминокислотной последовательности белков SMS в популяции, например,в популяции Gluconobacter oxydans. Такой генетический полиморфизм в гене SMS 27 может существовать среди индивидуумов в популяции вследствие природной вариации или в клетках из различных популяций. Такие природные вариации могут обычно приводить к 1-5% дисперсии в нуклеотидной после- 10013412 довательности гена SMS 27. Предполагается, что любые и все подобные вариации и полученный полиморфизм аминокислот в SMS 27 являются результатом природной вариации, которая не изменяют функциональную активность, и находятся в объеме этого изобретения. В данном контексте предполагается, что термины полинуклеотид или молекула нуклеиновой кислоты включают в себя молекулы ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, генерированные с использованием аналогов нуклеотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота может быть синтезирована с использованием аналогов или производных олигонуклеотидов (например, инозина или фосфоротиоатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды могут быть использованы, например, для получения нуклеиновых кислот, которые имеют измененные способности спаривания оснований или увеличенную устойчивость к нуклеазам. Информация последовательности, обеспеченная здесь, не должна пониматься так узко, как информация, требующая включения ошибочно идентифицированных оснований. Конкретные последовательности, раскрытые здесь, могут быть легко использованы для выделения полного гена из рекомбинантного или нерекомбинантного микроорганизма, способного превращать конкретный источник углерода непосредственно в витамин С и/или 2-KGA, в частности, Gluconobacter oxydans, предпочтительно Gluconobacter oxydans IFO 3293, который, в свою очередь, может быть легко подвергнут дополнительному анализу последовательности с идентификацией посредством этого ошибок секвенирования. Если нет другого указания, все нуклеотидные последовательности, определенные секвенированием молекулы ДНК здесь, определяли с использованием автоматизированного ДНК-секвенатора, и все аминокислотные последовательности полипептидов, кодируемых определенными здесь молекулами ДНК,предсказывали трансляцией последовательности ДНК, определенной выше. Таким образом, как известно в этой области для любой ДНК-последовательности, определенной с использованием этого автоматизированного подхода, любая определенная здесь нуклеотидная последовательность может содержать некоторое количество ошибок. Нуклеотидные последовательности, определенные с использованием автоматизации, обычно являются по меньшей мере на приблизительно 90% идентичными, более часто по меньшей мере на приблизительно 95% - по меньшей мере приблизительно 99,9% идентичными фактической нуклеотидной последовательности секвенированной молекулы ДНК. Фактическая последовательность может быть более точно определена другими подходами, включающими в себя способы мануального секвенирования, хорошо известные в этой области. Как также известно в этой области, единственная инсерция или делеция в определенной нуклеотидной последовательности в сравнении с фактической последовательностью будет вызывать сдвиг рамки в трансляции этой нуклеотидной последовательности,так что предсказанная аминокислотная последовательность, кодируемая определенной нуклеотидной последовательностью, будет полностью отличающейся от аминокислотной последовательности, фактически кодируемой секвенированной молекулой ДНК, начинающейся с точки такой инсерции или делеции. Специалист с квалификацией в этой области способен идентифицировать такие ошибочно идентифицированные основания и корректировать такие ошибки. Молекула нуклеиновой кислоты в соответствии с этим изобретением может содержать только часть или фрагмент последовательности нуклеиновой кислоты, обеспеченной данным изобретением, такой как, например, последовательность, показанная в SEQ ID NO:1, например фрагмент, который может быть использован в качестве зонда или праймера, таких как, например, SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:4, или фрагмент, кодирующий часть белка в соответствии с данным изобретением. Нуклеотидная последовательность, определенная из клонирования гена SMS 27, позволяет генерировать зонды и праймеры,предназначенные для применения в идентификации и/или клонировании других членов семейства SMS 27, а также гомологов SMS 27 из других видов. Зонд/праймер обычно содержит, по существу, очищенные олигонуклеотиды, которые обычно содержат район нуклеотидной последовательности, который гибридизуется предпочтительно при условиях высокой строгости по меньшей мере с приблизительно 12 или 15, предпочтительно приблизительно 18 или 20, более предпочтительно приблизительно 22 или 25,даже более предпочтительно приблизительно 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, или 75 или более последовательными нуклеотидами нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1 или ее фрагмента или производного. Молекула нуклеиновой кислоты, включающая в себя всю последовательность нуклеиновой кислоты или часть последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO:1, может быть также выделена полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием синтетических олигонуклеотидных праймеров,сконструированных на основе информации последовательности, содержащейся в ней. Нуклеиновая кислота этого изобретения может быть амплифицирована с использованием кДНК,мРНК или альтернативно геномной ДНК в качестве матрицы и подходящих праймеров в соответствии со стандартными способами ПЦР-амплификации. Амплифицированная таким образом нуклеиновая кислота может быть клонирована в подходящий вектор и охарактеризована анализом секвенирования ДНК. Фрагменты полинуклеотида по данному изобретению могут также включать в себя полинуклеоти- 11013412 ды, не кодирующие функциональные полипептиды. Такие полинуклеотиды могут функционировать в качестве зондов или праймеров для ПЦР-реакции. Нуклеиновые кислоты в соответствии с этим изобретением, независимо от того кодируют ли они функциональные или нефункциональные полипептиды, могут быть использованы в качестве гибридизационных зондов или праймеров полимеразной цепной реакции (ПЦР). Применения молекул нуклеиновых кислот данного изобретения, которые не кодируют полипептид, имеющий активность SMS 27,включают в себя, inter alia, (1) выделение гена, кодирующего белок данного изобретения, или его аллельных вариантов из библиотеки кДНК, например, из других организмов, чем Gluconobacter oxydans, и(2) Нозерн-блот-анализ для детектирования экспрессии мРНК указанного белка в специфических клетках или (3) применение в усилении и/или улучшении функции или активности гомологичных генов SMS 27 в указанных других организмах. Зонды на основе обеспеченных здесь нуклеотидных последовательностей могут быть использованы для детектирования транскриптов или геномных последовательностей, кодирующих те же самые или гомологичные белки, например, в других организмах. Молекулы нуклеиновых кислот, соответствующие природным вариантам и гомологам ДНК не-G. oxydans ДНК G. oxydans SMS 27 данного изобретения,которые также включены в это изобретение, могут быть выделены на основе их гомологии с нуклеиновой кислотой G. oxydans SMS 27, описанной здесь, с использованием ДНК G. oxydans или ее части, в качестве гибридизационного зонда в соответствии со стандартными способами гибридизации, предпочтительно при условиях гибридизации высокой строгости. В предпочтительных вариантах осуществления этот зонд дополнительно содержит присоединенную к нему группу метки, например, эта группа метки может быть радиоактивным изотопом, флуоресцентным соединением, ферментом или кофактором фермента. Последовательности гомологичных генов могут быть выделены, например, выполнением ПЦР с использованием двух пулов вырожденных олигонуклеотидных праймеров, сконструированных на основе нуклеотидных последовательностей, описанных здесь. Матрицей для этой реакции может быть кДНК, полученная обратной транскрипцией мРНК, полученной из штаммов, в отношении которых известно или предполагается, что они экспрессируют полинуклеотид в соответствии с данным изобретением. Этот продукт ПЦР может быть субклонирован и секвенирован для подтверждения, что амплифицированные последовательности представляют последовательности новой последовательности нуклеиновой кислоты, описанной здесь, или ее функциональный эквивалент. Затем этот фрагмент ПЦР может быть использован для выделения полноразмерного кДНК-клона различными известными способами. Например, этот амплифицированный фрагмент может быть помечен и использован для скрининга кДНК-библиотеки бактериофага или космиды. Альтернативно, этот меченый фрагмент может быть использован для скрининга геномной библиотеки. Технология ПЦР может быть также использована для выделения полноразмерных кДНКпоследовательностей из других организмов. Например, РНК может быть выделена в соответствии со стандартными процедурами из подходящего клеточного или тканевого источника. Реакция обратной транскрипции может быть выполнена на этой РНК с использованием олигонуклеотидного праймера,специфического в отношении самого крайнего 5'-конца амплифицированного фрагмента для праймирования синтеза первой цепи. Полученный гибрид РНК/ДНК может быть затем удлинен с образованием хвоста (например, гуанинами) с использованием стандартной реакции терминальной трансферазы, этот гибрид может быть расщеплен РНКазой Н и затем синтез второй цепи может быть праймирован (например, поли-Спраймером). Таким образом, кДНК-последовательности слева от амплифицированного фрагмента могут быть легко выделены. В отношении обзора применимых стратегий клонирования см., например, Sambrook et al., supra; и Ausubel et al., supra. Нуклеиновые кислоты, кодирующие другие члены семейства SMS 27, которые, следовательно,имеют нуклеотидную последовательность, которая отличается от нуклеотидной последовательности SEQID NO:1, находятся также в объеме этого изобретения. Кроме того, нуклеиновые кислоты, кодирующие белки SMS 27 из разных видов, которые, следовательно, могут иметь нуклеотидную последовательность,которая отличается от нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, находятся в объеме этого изобретения. Это изобретение относится также к выделенному полинуклеотиду, гибридизуемому при строгих условиях, предпочтительно при условиях высокой строгости, с полинуклеотидом данного изобретения,таким как, например, полинуклеотид, показанный в SEQ ID NO:1. Предпочтительно, такой полинуклеотид может быть получен из микроорганизма, способного превращать предоставленный источник углерода непосредственно в Витамин С, в частности, из Gluconobacter oxydans, предпочтительно Gluconobacteroxydans IFO 3293. В данном контексте термин гибридизация предназначен для описания условий для гибридизации и промывания, при которых нуклеотидные последовательности, гомологичные друг другу по меньшей мере на приблизительно 50%, по меньшей мере на приблизительно 60%, по меньшей мере на приблизи- 12013412 тельно 70%, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 80%, даже более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 85-90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 95%, обычно остаются гибридизованными друг с другом. В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота этого изобретения является по меньшей мере на 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более гомологичной последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO:1 или ее комплементу. Предпочтительным неограничивающим примером строгих условий гибридизации является гибридизация в смеси 6 х хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при приблизительно 45 С с последующими одной или несколькими промывками в 1x SSC, 0,1% ДСН при 50 С, предпочтительно при 55 С, более предпочтительно при 60 С и еще более предпочтительно при 65 С. Условия высокой строгости включают в себя инкубации при 42 С в течение периода нескольких дней, например 2-4 дней, с использованием меченого ДНК-зонда, например, меченого дигоксигенином(DIG) ДНК-зонда, с последующими одной или несколькими промывками в 2 х SSC, 0,1% ДСН при комнатной температуре и одной или несколькими промывками в 0,5 х SSC, 0,1% ДСН или 0,1 х SSC, 0,1 ДСН при 65-68 С. В частности, условия высокой строгости включают в себя, например, инкубацию 2 ч - 4 дня при 42 С с использованием DIG-меченого ДНК-зонда (полученного, например, с использованием системы DIG-мечения; Roche Diagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Germany) в растворе, таком как раствор DigEasyHyb solution (Roche Diagnostics GmbH), содержащем или не содержащем 100 мкг/ml ДНК спермы лосося, или в растворе, содержащем 50% формамид, 5 х SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрат),0,02% додецилсульфат натрия, 0,1% N-лауроилсаркозин и 2% блокирующий реагент (Roche DiagnosticsGmbH), с последующим промыванием фильтров дважды в течение 5-15 мин в 2 х SSC и 0,1% ДСН при комнатной температуре и затем промыванием дважды в течение 15-30 мин в 0,5 х SSC и 0,1% ДСН или 0,1 х SSC и 0,1% ДСН при 65-68 С. Предпочтительно выделенная молекула нуклеиновой кислоты этого изобретения, которая гибридизуется предпочтительно при условиях высокой строгости с нуклеотидной последовательностью этого изобретения, соответствует природно-встречающейся молекуле нуклеиновой кислоты. В данном контексте природно-встречающейся молекулой нуклеиновой кислоты называют молекулу РНК или ДНК,имеющую нуклеотидную последовательность, которая встречается в природе (например, кодирует природный белок). В одном варианте осуществления эта нуклеиновая кислота кодирует природный белокSMS 27 G. oxydans. Квалифицированному специалисту будет известно, какие условия следует применить в качестве строгих условий гибридизации и условий гибридизации высокой строгости. Дополнительное руководство в отношении таких условий является доступным в этой области, например в Sambrook et al., 1989,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; и Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John WileySons, N. Y.). Конечно, полинуклеотид, который гибридизуется только с поли (А)-последовательностью (такой как 3'-концевой поли (А)-участок мРНК) или с комплементарными остатками участка Т (или U), не должен включаться в полинуклеотид этого изобретения, используемый для специфической гибридизации части нуклеиновой кислоты этого изобретения,так как такой полинуклеотид может гибридизоваться с любой молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей поли (А)-участок или его комплемент (например, практически с любым клоном двухцепочечной кДНК). В типичном подходе могут быть подвергнуты скринингу библиотеки геномных ДНК или кДНК,сконструированные из других организмов, например микроорганизмов, способных превращать предоставленный источник углерода непосредственно в витамин С, в частности, других видов Gluconobacter. Например, штаммы Gluconobacter могут быть подвергнуты скринингу на гомологичные полинуклеотиды при помощи блот-анализа по Саузерну и нозерн-блот-анализа. После детектирования транскриптов, гомологичных полинуклеотидам этого изобретения, могут быть сконструированы ДНКбиблиотеки из РНК, выделенных из подходящего штамма, с использованием стандартных способов, хорошо известных специалистам с квалификацией в данной области. Альтернативно, библиотека тотальной геномной ДНК может быть подвергнута скринингу с использованием зонда, гибридизуемого с полинуклеотидом в соответствии с данным изобретением. Молекула нуклеиновой кислоты данного изобретения, такая как, например, молекула нуклеиновой кислоты, показанная в SEQ ID NO:1, или ее фрагмент или производное, могут быть выделены с использованием стандартных способов молекулярной биологии и информации последовательности, обеспеченной здесь. Например, с использованием всей или части последовательности нуклеиновой кислоты, показанной в SEQ ID NO:1, в качестве гибридизационного зонда, молекулы нуклеиновых кислот этого изобретения могут быть выделены с использованием стандартных способов гибридизации и клонирования(например, описанных в Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, Т. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY,1989). Кроме того, олигонуклеотиды, соответствующие нуклеотидным последовательностям или гибридизуемые с нуклеотидными последовательностями этого изобретения, могут быть получены стандартными- 13013412 синтетическими способами, например, с использованием автоматизированного ДНК-синтезатора. Термины гомология или процентная идентичность используются здесь взаимозаменяемо. Для цели этого изобретения здесь определено, что для определения процентной идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот, эти последовательности сопоставляют для целей оптимального сравнения (например, в последовательности первой аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты могут быть введены гэпы для оптимального сопоставления со второй аминокислотной последовательностью или последовательностью нуклеиновой кислоты). Затем сравнивают аминокислотные остатки или нуклеотиды в соответствующих положениях аминокислот или нуклеотидов. Когда положение в первой последовательности занято тем же самым аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, эти молекулы являются идентичными в этом положении. Процентная идентичность между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для двух последовательностей (т.е. % идентичность = число идентичных положений/общее число положений (т.е. перекрывающихся положений) х 100). Предпочтительно эти две последовательности имеют одну и ту же длину. Квалифицированному специалисту известен тот факт, что несколько различных компьютерных программ доступны для определения гомологии между двумя последовательностями. Например, сравнение последовательностей и определение процентной идентичности между двумя последовательностями может выполняться с использованием математического алгоритма. В предпочтительном варианте осуществления процентную идентичность между двумя аминокислотными последовательностями определяют при помощи алгоритма Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970, который был включен в программу GAP в пакете программ GCG (доступном в http://www.accelrys.com), использующую либо матрицу Blossom 62, либо матрицу РАМ 250 и вес гэпа 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Специалисту в данной области будет понятно, что все эти различные параметры будут давать несколько различающиеся результаты, но что общая процентная идентичность двух последовательностей не изменяется значимо при использовании различных алгоритмов. Еще в одном варианте осуществления, процентную идентичность между двумя нуклеотидными последовательностями определяют с использованием программы GAP в пакете программ GCG (доступном в http://www.accelrys.com), использующей матрицу NWSgapdna.CMP и вес бреши 40, 50, 60, 70 или 80 и вес длины 1, 2, 3, 4, 5 или 6. В другом варианте осуществления процентную идентичность между двумя аминокислотными или нуклеотидными последовательностями определяют с использованием алгоритма Е. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989), который был включен в программу ALIGN (версию 2.0) (доступную в http://vega.iRh.cnrs.fr/bin/aliRn-guess.cgi), использующую таблицу весов остатков РАМ 120, штрафа за длину бреши 12 и штрафа за брешь 4. Последовательности нуклеиновых кислот и белков данного изобретения могут быть дополнительно использованы в качестве запрашиваемой последовательности для выполнения поиска против публичных баз данных, например, для идентификации других членов семейства или родственных последовательностей. Такие поиски могут выполняться с использованием программ BLASTN и BLASTX (версии 2.0) Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Поиски нуклеотидов BLAST могут выполняться с программой BLASTN, оценкой = 100, длиной слова =12 для получения нуклеотидных последовательностей,гомологичных молекулам нуклеиновых кислот этого изобретения. Поиски белков BLAST могут выполняться с программой BLASTX, оценкой = 50, длиной слова = 3 для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белков этого изобретения. Для получения имеющих гэпы сопоставлений для целей сравнения может быть использована Gapped BLAST, описанная в Altschul et al.,(1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например BLASTX иBLASTN). См. http://www.ncbi.nlm.nih.gov. В другом предпочтительном варианте осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты этого изобретения содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая является комплементом нуклеотидной последовательности данного изобретения, такой как, например, последовательность, показанная в SEQ ID NO:1. Молекула нуклеиновой кислоты, которая является комплементарной нуклеотидной последовательности, описанной здесь, является молекулой нуклеиновой кислоты, которая является достаточно комплементарной нуклеотидной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1, так что она может гибридизоваться с указанной нуклеотидной последовательностью с образованием стабильного дуплекса. В следующем предпочтительном варианте осуществления, нуклеиновая кислота этого изобретения,показанная в SEQ ID NO:1, или ее комплемент содержит по меньшей мере одну мутацию, приводящую к продукту гена с модифицированной функцией/активностью. Эта по меньшей мере одна мутация может вводиться описанными здесь способами. В одном аспекте эта по меньшей мере одна мутация приводит к белку SMS 27, функция которого в сравнении с копией дикого типа является полностью или частично разрушенной. Способы введения таких мутаций хорошо известны в этой области. Термин уменьшение активности включает в себя, в данном контексте, уменьшение активности- 14013412 одного или нескольких полипептидов в продуцирующем организме, которые, в свою очередь, кодируются соответствующими описанными здесь полинуклеотидами. Имеется ряд способов, доступных в данной области, для выполнения уменьшения активности конкретного белка, в этом случае белка SMS 27. Обычно может быть уменьшена удельная активность белка или может быть уменьшено число копий этого белка. Для облегчения такого уменьшения может быть уменьшена копийность генов, соответствующих описанным здесь полинуклеотидам, например, недостаточной экспрессией или разрушением гена. Ген называют недостаточно экспрессируемым, если уровень транскрипции указанного гена уменьшен в сравнении с геном дикого типа. Это может быть измерено, например, Нозерн-блот-анализом, определяющим количество мРНК как показатель экспрессии гена. В данном контексте ген является недостаточно экспрессируемым, если количество генерированной мРНК уменьшено по меньшей мере на 1, 2, 5 10, 25, 50, 75, 100, 200 или даже более чем 500%, в сравнении с количеством мРНК, генерированным из гена дикого типа. Альтернативно, может быть использован слабый промотор для регуляции экспрессии полинуклеотида. В другом варианте осуществления промотор, регуляторный район и/или сайт связывания рибосом слева от этого гена могут быть изменены для получения пониженной экспрессии. Экспрессия может быть также уменьшена уменьшением относительного полупериода существования мессенджер-РНК. В другом варианте осуществления активность самого полипептида может быть уменьшена при помощи одной или нескольких мутаций в аминокислотной последовательности полипептида, которые уменьшают активность. Например, изменение аффинности этого полипептида в отношении его соответствующего субстрата может приводить к уменьшенной активности. Подобным образом может быть уменьшен полупериод существования этого полипептида. В любом сценарии, будь это уменьшенная экспрессия гена или уменьшенная активность, уменьшение может достигаться изменением состава сред культуры клеток и/или способов, используемых для культивирования. Уменьшенная экспрессия или уменьшенная активность обозначает в данном контексте уменьшение по меньшей мере на 1, 2, 5 10,25, 50, 75, 100, 200 или даже более, чем 500%, в сравнении с белком, полинуклеотидом, геном дикого типа; или активностью и/или концентрацией белка, присутствующего перед уменьшением этих полинуклеотидов или полипептидов. Активность белка SMS 27 может быть также уменьшена контактированием этого белка со специфическим или общим ингибитором его активности. Термины уменьшенная активность, уменьшенная или устраненная активность используются здесь взаимозаменяемо. Другой аспект этого изобретения относится к векторам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую белок в соответствии с этим изобретением или его функциональный эквивалент или часть. В данном контексте термин вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Одним типом вектора является плазмида, которая является кольцевой двухцепочечной петлей ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации). Другие векторы интегрируются в геном клетки-хозяина после введения в эту клетку-хозяина, и посредством этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Рекомбинантные векторы этого изобретения содержат нуклеиновую кислоту этого изобретения в форме, подходящей для экспрессии этой нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что этот рекомбинантный экспрессирующий вектор включает в себя одну или несколько регуляторных последовательностей, выбранных на основе клеток-хозяев, подлежащих использованию для экспрессии, которые функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, которая должна быть экспрессирована. В рекомбинантном экспрессирующем векторе функционально связанная означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью(регуляторными последовательностями) таким образом, что создается возможность экспрессии этой нуклеотидной последовательности (например, в системе in vitro транскрипции-трансляции или в клеткехозяине, при введении этого вектора в клетку-хозяина). Термин регуляторная последовательность включает в себя промоторы, энхансеры и другие регуляторные элементы экспрессии (например, аттенуатор). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Регуляторные последовательности включают в себя последовательности, которые управляют конститутивной или индуцируемой экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и последовательности, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенной клетке-хозяине(например, тканеспецифические регуляторные последовательности). Специалистам с квалификацией в данной области будет понятно, что конструкция экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, уровень экспрессии желаемого белка и т.д. Экспрессирующие векторы этого изобретения могут вводиться в клетки-хозяева для получения посредством этого белков или пептидов, кодируемых нуклеиновыми кислотами, описанными здесь, в том числе, но не только, мутантных белков, их фрагментов, вариантов или их функциональных эквивалентов, и слитых белков, кодируемых нуклеиновой кислотой, описанной здесь, например, белков SMS 27, мутант- 15013412 ных форм белков SMS 27, слитых белков и т.п. Рекомбинантные экспрессирующие векторы этого изобретения могут быть сконструированы для экспрессии белков SMS 27 в подходящем микроорганизме. Например, белок в соответствии с данным изобретением может быть экспрессирован в бактериальных клетках, таких как штаммы, принадлежащие к родам Gluconobacter, Gluconacetobacter или Acetobacter. Экспрессирующие векторы, применимые в данном изобретении, включают в себя хромосомные, эписомные и произведенные из вирусов векторы,например, векторы, произведенные из бактериальных плазмид, бактериофага, и векторы, произведенные из их комбинаций, такие как векторы, произведенные из генетических элементов плазмид и бактериофагов, такие как космиды и фагмиды. ДНК-инсерт может быть функционально связан с подходящим промотором, который может быть либо конститутивным, либо индуцируемым промотором. Квалифицированный в данной области специалист знает, как отобрать подходящие промоторы. Экспрессионные конструкции могут содержать сайты инициации, терминации транскрипции и, в транскрибируемом районе, сайт связывания рибосом для трансляции. Кодирующая часть зрелых транскриптов, экспрессируемых этими конструкциями, может предпочтительно включать в себя кодон инициации в начале и кодон терминации, подходящим образом расположенный в конце транслируемого полипептида. Векторная ДНК может быть введена в подходящие клетки-хозяева посредством способов трансформации или трансфекции. В данном контексте термины трансформация, трансконъюгация,трансфекция обозначают различные признанные в данной области способы введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включающие в себя кальций-фосфатное или кальций-хлоридное соосаждение, опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию, трансдукцию, инфекцию, липофекцию, опосредованную катионным липидом трансфекцию или электропорацию. Подходящие способы для трансформации или трансфекции клеток-хозяев могут быть найдены в Sambrook, et al.(supra), Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) и других лабораторных руководствах. Для идентификации и отбора клеток, которые интегрировали чужеродную ДНК в их геном, ген, который кодирует селектируемый маркер (например, устойчивости к антибиотикам), обычно вводят в клетки-хозяева вместе с представляющим интерес геном. Предпочтительные селектируемые маркеры включают в себя маркеры, которые сообщают устойчивость к лекарственным средствам, таким как канамицин, тетрациклин, ампициллин и стрептомицин. Нуклеиновую кислоту, кодирующую селектируемый маркер, предпочтительно вводят в клетку-хозяина на том же самом векторе, который кодирует белок данного изобретения, или ее можно вводить на отдельном векторе, например, суицидный вектор, который не может реплицироваться в клетках-хозяевах. Клетки, стабильно трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, могут быть идентифицированы отбором с лекарственным средством (например,клетки, которые включили в себя ген селектируемого маркера, будут выживать, в то время как другие клетки умирают). Данное изобретение обеспечивает также выделенный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, доказанную в SEQ ID NO:2, или аминокислотную последовательность, получаемую экспрессией полинуклеотида данного изобретения, такого как, например, полинуклеотидная последовательность, показанная в SEQ ID NO:1, в подходящем хозяине. Полипептиды по данному изобретению могут содержать только консервативные замены одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO:2, или замены, инсерции или делеции аминокислот, не являющихся незаменимыми. Таким образом, такая заменимая аминокислота является остатком, который может быть изменен в аминокислотных последовательностях, показанных в SEQ ID NO:2, без изменения, по существу, биологической функции. Например,предсказывается, что аминокислотные остатки, которые являются консервативными среди белков данного изобретения, являются особенно не поддающимися изменению. Кроме того, аминокислоты, консервативные среди белков по данному изобретению и других белков SMS 27, по-видимому не поддаются изменению. Термин консервативная замена обозначает замену, в которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Эти семейства известны в данной области и включают в себя аминокислоты со щелочными боковыми цепями (например, лизин, аргинин и гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин,фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин,изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Как упоминалось выше, полинуклеотиды этого изобретения могут быть использованы в генетической инженерии подходящей клетки-хозяина для превращения этой клетки в лучшую и более эффективную в ферментации, например в прямом ферментационном способе для витамина С. В соответствии с этим изобретением описана генетически сконструированная/рекомбинантно полученная клетка-хозяин (также называемая рекомбинантной клеткой или трансформированной клеткой),- 16013412 несущая такой модифицированный полинуклеотид, причем функция соответствующего белка значимо модифицирована в сравнении с клеткой дикого типа, так что выход, продуцирование и/или эффективность продуцирования одного или нескольких ферментационных продуктов, таких как витамин С, улучшается. Эта клетка-хозяин может быть выбрана из микроорганизмов, способных непосредственно продуцировать один или несколько ферментационных продуктов, таких как, например, витамин С, из предоставленного источника углерода, в частности, Gluconobacter oxydans, предпочтительно G. oxydans IFO 3293. Трансформированная клетка или рекомбинантная клетка является клеткой, в которую (или в предка которой) была введена, при помощи способов рекомбинантных ДНК, нуклеиновая кислота в соответствии с данным изобретением, или в которой была уменьшена или устранена активность белка SMS 27. Подходящие клетки-хозяева включают в себя клетки микроорганизмов, способные продуцировать конкретный продукт ферментации, например, превращением предоставленного источника углерода непосредственно в витамин С. В частности, они включают в себя штаммы из родов Pseudomonas, Pantoea,Escherichia, Corynebacterium, Ketogulonicigenium и уксуснокислые бактерии, такие как, например, Gluconobacter, Acetobacter или Gluconacetobacter, предпочтительно Acetobacter sp., Acetobacter aceti, Gluconobacter frateurii, Gluconobacter cerinus, Gluconobacter thailandicus, Gluconobacter oxydans, более предпочтительно G. oxydans, наиболее предпочтительно G oxydans IFO 3293. Для улучшения продуцирования витамина С и/или 2-KGA определенной рекомбинантной клеткихозяина экспрессия гена SMS 27 может быть ингибирована в этом организме, например, нацеливанием нуклеотидных последовательностей, комплементарных регуляторному району нуклеотидной последовательности SMS 27 (например, промотору и/или энхансеру SMS 27), для образования трехспиральных структур, которые предотвращают транскрипцию гена SMS 27 в клетках-мишенях. См., в общем, Helene,С. (1991) AnticancerDrugDes. 6 (6): 569-84; Helene, С. et al. (1992) Ann. N. Y Acad Sci. 660: 27-36; и Maher,L. J. (1992) Bioassays 14 (12): 807-15. Ингибирование или предотвращение экспрессии гена может также достигаться модификацией генаSMS 27, например, введением одной или нескольких мутаций в ген SMS 27, где эти модификации приводят к белку SMS 27 с функцией, которая значимо уменьшена в сравнении с белком дикого типа. Таким образом, в одном дополнительном варианте осуществления полинуклеотид, несущий по меньшей мере одну мутацию, получают из полинуклеотида, представленного SEQ ID NO:1, или его эквивалентов. Мутация в данном контексте может быть любой мутацией, приводящей к менее функциональному или нестабильному полипептиду, например, менее функциональным или нестабильным продуктам генаSMS 27. Это может включать в себя, например, изменение в геноме микроорганизма, которое препятствует синтезу SMS 27 или приводит к экспрессии белка SMS 27 с измененной аминокислотной последовательностью, функция которого в сравнении с копией дикого типа, имеющей неизмененную аминокислотную последовательность, является полностью или частично разрушенной. Эта вмешательство может происходить на транскрипционном, трансляционном или посттрансляционном уровне. Это изменение в геноме микроорганизма может быть получено, например, заменой в результате рекомбинации посредством единственного или двойного кроссинговера ДНК-последовательности дикого типа ДНК-последовательностью, содержащей изменение. Для удобного отбора трансформантов микроорганизма с изменением в его геноме этим изменением может быть, например, ДНК-последовательность,кодирующая маркер устойчивости к антибиотику, или ген, восполняющий возможную ауксотрофию этого микроорганизма. Мутации включают в себя, но не ограничиваются ими, делеционные-инсерционные мутации. Пример такого изменения включает в себя разрушение гена, т.е. пертурбацию гена таким образом, что продукт, обычно продуцируемый из этого гена, не продуцируется в функциональной форме. Это может быть следствием полной делеции, делеции и инсерции селективного маркера, мутации сдвига рамки, делеции в рамке считывания или точковой делеции, которая приводит к преждевременной терминации. В некоторых из этих случаев отсутствует вся мРНК этого гена, в других случаях варьируется количество продуцируемой мРНК. Во всех случаях полипептид, кодируемый указанным геном, не продуцируется в функциональной форме, либо отсутствует, либо находится в мутированной форме, например, в виде белка, имеющего уменьшенную активность, как определено здесь. Изменение в геноме микроорганизма, приводящие к менее функциональному или нефункциональному полипептиду, могут быть также получены случайным мутагенезом с использованием, например,химических мутагенов, облучения или транспозонов и отбора или скрининга на мутанты, которые являются лучшими или более эффективными продуцентами одного или нескольких продуктов ферментации. Стандартные способы для скрининга и отбора известны квалифицированному в данной области специалисту. В конкретном варианте осуществления, желаемым является нокаут гена SMS 27 данного изобретения, т.е. способ, в котором экспрессию гена искусственно подавляют для улучшения выхода, продуктивности и/или эффективности продуцирования продукта ферментации при введении в подходящую клеткухозяина. Способы обеспечения нокаутов, а также микроорганизмов, несущих такие подвергнутые супрессии гены, хорошо известны в данной области. Супрессия эндогенного гена SMS 27 может быть ин- 17013412 дуцирована делегированием по меньшей мере части этого гена или его регуляторного района. В данном контексте супрессия экспрессии гена включает в себя полную или частичную супрессию, а также супрессию при конкретных условиях и также супрессию экспрессии любого одного из этих двух аллелей. Для создания микроорганизма с нокаутом, в котором экспрессия гена SMS 27 искусственно подавлена, ген SMS 27 сначала может быть клонирован, а затем может быть сконструирован вектор для гомологичной рекомбинации с использованием этого гена для инактивации эндогенного гена SMS 27 в микроорганизме-мишени. Вектор для гомологичной рекомбинации содержит затем последовательность нуклеиновой кислоты, сконструированную для инактивации эндогенного гена SMS 27 в микроорганизмемишени. Такой нуклеиновой кислотой может быть, например, последовательность нуклеиновой кислоты гена SMS 27 или ее регуляторный район, такой как существующий фланкирующий район гена, подлежащего инактивации (in cis), или существующий отдельно (in trans), содержащий по меньшей мере частичную делецию, или альтернативно, она может быть последовательностью нуклеиновой кислоты генаSMS 27 или ее регуляторным районом, содержащим другие гены. Ген, который может также функционировать в качестве маркера, предпочтительно выбирают в качестве гена, встраиваемого в ген SMS 27 или его регуляторный район. Подлежащие использованию гены инсерта включают в себя, например, гены устойчивости к лекарственным средствам, как определено выше. Нет особого ограничения в отношении положения, в котором могут быть встроены эти гены в гене SMS 27, пока инсерция в этом положении приводит к супрессии экспрессии эндогенного гена SMS 27 в этой мишени. Во избежание полярных эффектов этой инсерции могут быть введены молчащие делеции в рамке считывания с использованием,например, системы sacB или ПЦР с гомологией длинных фланкирующих районов. Эти способы хорошо известны в этой области. Вышеупомянутые стратегии мутагенеза для белков SMS 27 могут приводить к увеличенным выходам желаемого соединения, в частности, витамина С и/или 2-KGA. Этот список не является ограничивающим; вариации этих стратегий мутагенеза будут вполне очевидными специалисту с обычной квалификацией в этой области. При помощи этих механизмов молекулы нуклеиновых кислот и белков могут быть использованы для генерирования микроорганизмов, таких как Gluconobacter oxydans или родственные штаммы бактерий, экспрессирующих мутированные молекулы нуклеиновой кислоты и белка, так что выход, продуктивность и/или эффективность продуцирования желаемого соединения, такого как витамин С и/или 2-KGA, улучшаются. В связи с вышеуказанным способом с использованием микроорганизма, в одном аспекте, способ данного изобретения приводит к выходам витамина С, которые равны по меньшей мере приблизительно более, чем 5,7 г/л, например 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400 г/л или более, чем 600 г/л. В одном варианте осуществления выход витамина С, полученного способом данного изобретения, находится в диапазоне приблизительно более, чем 5,7 - приблизительно 600 г/л. Выходом витамина С называют концентрацию витамина С в потоке собранного продукта, выходящем непосредственно из продукционного сосуда, т.е. бесклеточного супернатанта, содержащего витамин С. В одном аспекте этого изобретения, обеспечены микроорганизмы (в частности, из родов Gluconobacter, Gluconacetobacter и Acetobacter), которые способны непосредственно продуцировать витамин С из подходящего источника углерода, такого как D-сорбит и/или L-сорбоза. При измерении, например, в способе покоящихся клеток после инкубационного периода 20 ч было обнаружено, что эти организмы способны продуцировать витамин С непосредственно из D-сорбита или L-сорбозы даже до уровня 280 мг/л и 670 мг/л, соответственно. В другом аспекте этого изобретения обеспечен микроорганизм, способный непосредственно продуцировать витамин С в количествах 300 мг/л или более из D-сорбита в качестве исходного материала или 800 мг/л или более из L-сорбозы в качестве исходного материала, соответственно, например, при измерении в способе покоящихся клеток после инкубационного периода 20 ч. Такой выход может быть получен уменьшением или элиминацией активности полипептида SMS, предпочтительно полипептида SMS 27. Выход витамина С, полученного из D-сорбита, может быть даже таким высоким, как 400, 600, 1000 мг/л, или даже превышать 1,5, 2, 4, 10, 20, 50 г/л. Выход витамина С, полученного из L-сорбозы, может быть даже таким высоким, как 1000 мг/л, или даже превышать 1,5, 2, 4, 10,20, 50 г/л. Предпочтительно эти количества витамина С могут достигаться при измерении способом покоящихся клеток после инкубационного периода 20 ч. В данном контексте измерение в способе покоящихся клеток предусматривает (i) выращивание этих клеток посредством любого способа, хорошо известного специалисту с квалификацией в данной области, (ii) сбор этих клеток из бульона для выращивания и (iii) инкубирование собранных клеток в среде, содержащей субстрат, который должен быть превращен в желаемый продукт, например, витамин С,при условиях, в которых клетки уже не растут, т.е. нет увеличения в количестве биомассы во время этой так называемой стадии превращения. Более общее описание способа покоящихся клеток описано, например, в WO 2005/017159 и в следующих абзацах. В одном аспекте этого изобретения обеспечены микроорганизмы (в частности, из родов Gluconobacter, Gluconacetobacter и Acetobacter), которые способны непосредственно продуцировать 2-KGA из подходящего источника углерода, такого как D-сорбит и/или L-сорбоза. При измерении, например, способом покоящихся клеток, как в примере 4, было обнаружено, что эти организмы способны продуциро- 18013412 вать 2-KGA непосредственно из D-сорбита или L-сорбозы в количествах приблизительно 0,5-0,7 г/л. Вдругом аспекте этого изобретения обеспечен микроорганизм, способный непосредственно продуцировать 2-KGA в количествах приблизительно 7, 8, 9, 10 г/л или более или даже приблизительно 50, 60, 70,80, 90, 100 г/л или более из L-сорбозы в качестве исходного материала. Такой выход может быть получен уменьшением или устранением активности полипептида SMS, предпочтительно полипептида SMS 27 вG oxydans IFO 3293. Рекомбинантный микроорганизм, несущий, например, модифицированный ген SMS 27, который способен продуцировать этот продукт ферментации со значительно более высокими выходом, продуктивностью и/или эффективностью, может культивироваться в водной среде, дополненной подходящими питательными веществами в аэробных условиях, как описано выше. Молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, векторы, праймеры и рекомбинантные микроорганизмы, описанные здесь, могут быть использованы в одном или нескольких из следующих способов: идентификации Gluconobacter oxydans и родственных организмов; картировании геномов организмов,родственных Gluconobacter oxydans; идентификации и локализации представляющих интерес последовательностей Gluconobacter oxydans; эволюционных исследованиях; определении районов белка SMS 27,необходимых для функции; модуляции активности или функции белка SMS 27; модуляции активности пути SMS; и модуляции клеточного продуцирования желаемого соединения, такого как витамин С и/или 2-KGA. Это изобретение обеспечивает способы для скрининга молекул, которые модулируют активность белка SMS 27 либо взаимодействием с самим этим белком или субстратом или партнером связывания белка SMS 27, либо модуляцией транскрипции или трансляции молекул нуклеиновой кислоты SMS 27 этого изобретения. В таких способах микроорганизм, экспрессирующий один или несколько белков SMS 27 этого изобретения, контактируют с одним или несколькими тест-соединениями и оценивают действие каждого тест-соединения на активность или уровень экспрессии белка SMS 27. Обычно биологическая, ферментативная или другая активность белка SMS может быть измерена способами, хорошо известными квалифицированному в данной области специалисту, например, инкубированием клеточной фракции, содержащей белок SMS, в присутствии его субстрата, акцептора (акцепторов) электронов или донора (доноров) электронов, включающих в себя феназинметосульфат (РМС,ФМС), дихлорфенол-индофенол (DCIP), NAD (НАД), NADH (НАДН), NADP (НАДФ), NADPH(НАДФН), потребление которых может быть прямо или опосредованно измерено фотометрическими,колориметрическими или флуорометрическими способами, и других неорганических компонентов, которые могут быть релевантными для развития активности. Так, например, активность мембраносвязаннойD-сорбитолдегидрогеназы может быть измерена в анализе, в котором фракции мембран, содержащие этот фермент, инкубируют в присутствии фосфатного буфера при рН 6, D-сорбита и искусственных акцепторов электронов DCIP и PMS. Скорость потребления DCIP может измеряться при 600 нм, и она прямо пропорциональна активности D-сорбитолдегидрогеназы, присутствующей в этой фракции мембран. Биологическая, ферментативная или другая активность белков SMS, в частности, белка SMS 27,может быть измерена способами, хорошо известными квалифицированному в данной области специалисту, например, определением экспрессии генов, о которых известно, что они находятся под контролем белка SMS 27, способами, известными специалистам с квалификацией в этой области, такими как, например, нозерн-блот-анализ, анализ транскрипционного слияния, анализ микроматриц и т.п. Связывание белка SMS 27 с его промоторными районами-мишенями может быть продемонстрировано экспериментами футпринтинга ДНК, анализами изменения подвижности в геле и т.п. Из приведенного выше описания очевидно, что продукт ферментации способами в соответствии с этим изобретением может не ограничиваться только витамином С. Желаемым соединением или продуктом ферментации, в данном контексте, может быть любой природный продукт Gluconobacter oxydans, который включает в себя конечные продукты и промежуточные продукты путей биосинтеза, такие как, например, L-сорбоза, L-сорбозон, D-глюконат, 2-кето-D-глюконат, 5-кето-D-глюконат, 2,5-дикетоD-глюконат и 2-кето-L-гулонат (2-KGA), в частности, биосинтетического генерирования витамина С. Таким образом, данное изобретение относится к применению полинуклеотида, полипептида, вектора, праймера и рекомбинантного микроорганизма, описанных здесь, в получении витамина С и/или 2KGA, т.е. прямом превращении источника углерода в витамин С и/или 2-KGA. В предпочтительном варианте осуществления, модифицированный полинуклеотид, полипептид, вектор и рекомбинантный микроорганизм, описанные здесь, используют для улучшения выхода, продуктивности и/или эффективности продуцирования витамина С и/или 2-KGA. Термины продукция или продуктивность являются общепризнанными в этой области и включают в себя концентрацию продукта ферментации (например, витамина С и/или 2-KGA), образованного в пределах конкретного времени и в конкретном объеме ферментации (например, кг продукта в час на литр). Термин эффективность продуцирования включает в себя время, необходимое для конкретного уровня продукции, который должен быть достигнут (например, сколько времени требуется клетке для достижения конкретной скорости выхода продукта ферментации). Термин выход является общепризнанным в этой области и включает в себя эффективность превращения источника углерода в продукт(т.е. витамин С). Он обычно выражается, как, например, кг продукта на кг источника углерода. Под увеличением выхода и/или продукции/продуктивности этого соединения имеется в виду, что количество извлеченных молекул или полезных извлеченных молекул этого соединения в конкретном количестве культуры увеличивается на протяжении конкретного периода времени. Термины биосинтез или биосинтетический путь являются общепризнанными в этой области и включают в себя синтез соединения, предпочтительно органического соединения, клеткой из промежуточных соединений в способе,который может быть многостадийным и высокорегулируемым способом. Выражение метаболизм является общепризнанным в этой области и включает в себя все биохимические реакции в целом, которые происходят в организме. Таким образом, метаболизм конкретного соединения (например, метаболизм аминокислоты, такой как глицин) включает в себя все биосинтетические пути, пути модификации и деградации в клетке, связанные с этим соединением. Выражение транспорт или импорт признано в этой области и включает в себя облегченное перемещение одной или нескольких молекул через клеточную мембрану, через которую эта молекула в противном случае была бы неспособна проходить или проходила бы неэффективно. Витамин С в данном контексте может находиться в любой химической форме L-аскорбиновой кислоты, обнаруживаемой в водных растворах, например, недиссоциированной, в ее форме свободной кислоты или диссоциированной в виде аниона. Солюбилизированная форма соли L-аскорбиновой кислоты может быть охарактеризована как анион в присутствии любого типа катионов, обычно обнаруживаемых в супернатантах ферментации, таких как, например, калий, натрий, аммоний или кальций. Могут быть включены также изолированные кристаллы формы свободной кислоты L-аскорбиновой кислоты. С другой стороны, изолированные кристаллы формы соли L-аскорбиновой кислоты называют по соответствующему названию соли, т.е. аскорбат натрия, аскорбат калия, аскорбат кальция и т.п. В одном предпочтительном варианте осуществления данное изобретение относится к способу получения витамина С, в котором нуклеотид в соответствии с этим изобретением, описанный выше, инактивируют в подходящем микроорганизме описанными выше способами, этот рекомбинантный микроорганизм культивируют в условиях, которые делают возможным продуцирование витамина С с высокой продуктивностью, высоким выходом и/или высокой эффективностью, полученный продукт ферментации выделяют из культуральной среды и необязательно дополнительно очищают. Осуществление изобретения Это изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не должны рассматриваться как ограничивающие это изобретение. Содержание всех ссылок, заявок на патенты, патентов и опубликованных заявок на патенты, цитируемых на протяжении этой заявки, включено тем самым здесь путем отсылки. Примеры Пример 1. Получение хромосомной ДНК и амплификация ДНК-фрагмента при помощи ПЦР Хромосомную ДНК Gluconobacter oxydans IFO 3293 получали из клеток, культивированных при 30 С в течение 1 дня в жидкой среде содержащего маннит бульона (MB), состоящей из 25 г/л маннита, 5 г/л дрожжевого экстракта (Difco) и 3 г/л бактопептона (Difco), по способу, описанному Sambrook et al.(1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press. ДНК-фрагмент получали при помощи ПЦР с хромосомной ДНК, полученной, как описано выше, и набором праймеров, Pf (SEQ ID NO:3) и Pr (SEQ ID NO:4). Для реакции использовали набор Expand HighFidelity PCR kit (Roche Diagnostics) и использовали 10 нг хромосомной ДНК в общем объеме 100 мкл в соответствии с инструкцией поставщика, чтобы иметь продукт ПЦР, содержащий ДНКпоследовательность SMS 27 (SEQ ID NO:1). Этот продукт ПЦР извлекали из этой реакции и подтверждали его правильную последовательность. Пример 2. Разрушение гена SMS 27 в G. oxydans IFO 3293 Для конструирования мутанта с нокаутом гена SMS 27, ПЦР Long-Flanking Homology (LFH) использовали для конструирования чистой делеционной-инсерционной мутации. Во-первых, левый и правый районы, фланкирующие ген SMS 27, амплифицировали при помощи ПЦР с использованием соответствующих пар праймеров SMS 27LFH+1 (SEQ ID NO:5)/SMS 27KmLFH-l (SEQ ID NO:6) и SMS 27KmLFH+l (SEQ ID NO:7) / SMS 27LFH-1 (SEQ ID NO:8). Геномную ДНК G. oxydans IFO 3293 использовали в качестве матрицы и условия реакции состояли из 30 циклов денатурации при 95 С в течение 1 мин, отжига при 50 С в течение 1 мин и удлинения при 72 С в течение 1,5 мин. В обоих случаях для минимизации генерируемых ПЦР ошибок использовали ДНК-полимеразу Herculase (Stratagene). Кассету устойчивости к канамицину амплифицировали с использованием ДНК плазмиды pUC4K (Amersham Bioscience, accession No. X06404) в качестве матрицы и пары праймеров SMS 27Km-l (SEQ ID NO:9)/SMS 27Km+l (SEQ ID NO:10) для генерирования фрагмента 1,3 т.п.н. Условия реакции были такими, как описанные выше. Эти три продукта очищали из геля, смешивали и использовали в реакции ПЦР второго раунда с фланкирующими праймерами SMS 27LFH+1/ SMS 27LFH-1 для генерирования продукта 2,6 т.п.н. Условия реакции для второго раунда состояли из 94 С, 2 мин, затем 10 циклов [94 С, 30 с, 63 С, 30 с, 68 С, 6 мин], с последующими 20 циклами [94 С, 30 с, 63 С, 30 с, 68 С, 6 мин с дополнительными 20 с на один цикл] и конечного удлинения при 68 С в течение 10 мин.- 20013412 Продукт ПЦР клонировали в вектор pGEM-TEasy (Promega) с получением плазмиды pGEM-SMS 27. Эту плазмиду трансформировали в компетентные клетки G. oxydans IFO 3293 cells, отбирая трансформанты на среде с агаром MB, содержащей канамицин до конечной концентрации 50 мкг мл-1, с получением мутантного штамма G. oxydans IFO 3293-SMS 27Km. ПЦР с использованием фланкирующих праймеров SMS 27LFH+1/SMS 27LFH-1 использовали для подтверждения, что мутация SMS 27Km была интегрирована посредством двойного кроссинговера. Пример 3. Получение витамина С из D-сорбита с использованием покоящихся клеток Клетки G oxydans IFO 3293 и G. oxydans IFO 3293-SMS 27Km высевали сначала на МВ-среду и выращивали в течение трех дней. Затем клетки выскребали из этих чашек и наносили на среду No. 3BD,содержащую 7% сорбит, и выращивали в течение 3 дней при 30 С. Эти клетки использовали в реакциях покоящихся клеток с 2% сорбитом в качестве субстрата и при плотности клеток OD600=10. После 20-часового периода инкубации, G. oxydans IFO 3293 продуцировал 30 мг/л витамина С из Dсорбита. В качестве сравнения, штамм G. oxydans IFO 3293-SMS 27Km продуцировал более чем 350 мг/л, витамина С. Пример 4. Получение 2-KGA из D-сорбита с использованием покоящихся клеток В соответствии с экспериментальной постановкой примера 3 клетки штаммов G. oxydans IFO 3293 и G. oxydans IFO 3293-SMS 27Km испытывали на их способность продуцировать 2-KGA из D-сорбита. После 20-часового периода инкубации, G oxydans IFO 3293 продуцировал 700 мг/л 2-KGA из Dсорбита. В качестве сравнения, штамм G. oxydans IFO 3293-SMS 27Km продуцировал более, чем 7 г/л,2-KGA. Пример 5. Присутствие гена SMS 27 и его эквивалентов в других организмах Присутствие SEQ ID NO:1 и/или эквивалентов, обнаруживающих сходство/идентичность с SEQ IDNO:1, в других организмах, чем организмы, описанные здесь ранее, например, организмах, описанных в табл. 1, может быть определено простым экспериментом гибридизации ДНК. Штаммы Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13693 and IFO 13773 выращивают при 27 С в течение 3 дней на среде No. 350, содержащей 5 г/л бактопептона (Difco), 5 г/л дрожжевого экстракта (Difco), 5 г/л глюкозы, 5 г/л маннита, 1 г/л MgSO47H2O, 5 мл/л этанола и 15 г/л агара. Все другие штаммы Acetobacter, Gluconacetobacter и все штаммы Gluconobacter выращивают при 27 С в течение 3 дней на агаровой среде с содержащим маннит бульоном (MB), содержащей 25 г/л маннита, 5 г/л дрожжевого субстрата(Difco), 3 г/л бактопептона (Difco) и 18 г/л агара (Difco). E. coli K-12 выращивают на агаровой среде с бульоном Луриа. Другие штаммы/клетки выращивают на среде, рекомендуемой поставщиками, или в соответствии со способами, известными в этой области. Геномную ДНК экстрагируют, как описано, например, Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, из подходящего организма, например, упомянутого в табл. 1. Препараты геномной ДНК расщепляют рестрикционными ферментами, такими как EcoRI или HindIII, и 1 мкг этих ДНК-фрагментов разделяют электрофорезом на агарозном геле (1% агарозе). Этот гель обрабатывают 0,25 N НС 1 в течение 15 мин и затем блоттируют (промакают) на нитроцеллюлозную или найлоновую мембрану с использованием Vacuum Blotter Model 785 (BIO-RAD Laboratories AG, Switzerland) в соответствии с инструкцией поставщика. Затем полученный блот приводят в контакт/гибридизуют с раствором, в котором находится зонд, такой как, например, ДНК-фрагмент с последовательностью SEQ ID NO:1 или ДНКфрагмент, содержащий часть последовательности SEQ ID NO:1 или всю последовательность SEQ IDNO:1, для детектирования положительного ДНК-фрагмента (положительных ДНК-фрагментов) из тесторганизма. Может быть приготовлен DIG-меченый зонд, например, SEQ ID NO:1, в соответствии с примером 1 с использованием набора для ПЦР-DIG-мечения (Roche Diagnostics) и набора праймеров, SEQID NO:3 и SEQ ID NO:4, в соответствии с протоколом поставщика. Результат такого блота изображен в табл. 1. Гибридизация может выполняться при строгих условиях при условиях высокой строгости. Предпочтительным, неограничивающим примером таких условий является гибридизация в смеси 6 х хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) при приблизительно 45 С с последующими одной или несколькими промывками в 1x SSC, 0,1% ДСН при 50 С, предпочтительно при 55 С, более предпочтительно при 60 С и еще более предпочтительно при 65 С. Условия высокой строгости включают в себя, например, инкубацию 2 часа - 4 дня при 42 С в растворе, таком как раствор DigEasyHyb solution (Roche Diagnostics GmbH), содержащий или не содержащий 100 мкг/ml ДНК спермы лосося, или в растворе, содержащем 50% формамид, 5 х SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатрийцитрат), 0,02% додецилсульфат натрия, 0,1% Nлауроилсаркозин и 2% блокирующий реагент (Roche Diagnostics GmbH), с последующим промыванием фильтров дважды в течение 5-15 мин в 2 х SSC и 0,1% ДСН при комнатной температуре и затем промыванием дважды в течение 15-30 мин в 0,5 х SSC и 0,1% ДСН или 0,1 х SSC и 0,1% ДСН при 65-68 С. Для детектирования ДНК-фрагментов с более низкой идентичностью с этим зондом ДНК конечные стадии промывания могут быть выполнены при более низких температурах, таких как 50-65 С и в течение более короткого времени промывания, например 1-15 мин. Гены, соответствующие положительным сигналам в соответствующих организмах, показанных в табл. 1, могут быть клонированы ПЦР-способом, хорошо известным в этой области, с использованием- 21013412 геномной ДНК такого организма вместе с подходящим набором праймеров, таким как, например, SEQ IDNO:3 и SEQ ID NO:4, в условиях, описанных в примере 1, или следующим образом: 5 - 100 нг геномной ДНК используют на реакцию (общий объем 50 мкл). Система ПЦР Expand High Fidelity (Roche Diagnostics) может быть использована с условиями реакции, состоящими из 94 С в течение 2 мин; 30 циклов (i) стадии денатурации при 94 С в течение 15 с, (ii) стадии отжига при 60 С в течение 30 с, (iii) стадии синтеза 72 С в течение 0,5-5 мин в зависимости от длины ДНК-мишени (1 мин /1 т.п.н.); удлинения при 72 С в течение 7 мин. Альтернативно, можно выполнять ПЦР с вырожденными праймерами, которые могут быть синтезированы на основе SEQ ID NO:2 или аминокислотных последовательностей в виде консенсусных последовательностей, выбранных сопоставлением нескольких аминокислотных последовательностей, полученных с использованием программы поиска последовательностей, такой какBLASTP (или BLASTX при использовании нуклеотидной последовательности в качестве запрашиваемой последовательности), для нахождения белков, имеющих сходство с белком SEQ ID NO:2. Для ПЦР,использующей вырожденные праймеры, температура второй стадии отжига (см. выше) может быть понижена до 55 С или даже до 50-45 С. Результат такого эксперимента показан в табл. 1. Пробы реакций ПЦР разделяют электрофорезом в агарозном геле и полосу визуализируют с использованием транс-иллюминатора после окрашивания, например, этидийбромидом, выделяют из геля и подтверждают правильную последовательность. Вышеупомянутыми консенсусными последовательностями могут быть аминокислотные последовательности, принадлежащие к определенным категориям нескольких баз данных доменов/семейств белков, таких как PROSITE (база данных семейств и доменов белков), COG (Кластер групп ортологов), CDD(базы данных консервативных доменов), pfam (большая коллекция множественных выравниваний последовательностей и скрытых моделей Маркова, включающих в себя многие общие домены и семейства белков). После выбора определенного белка с функцией, идентичной/сходной с функцией белка данного изобретения, из белков, содержащих домен или семейство таких баз данных, соответствующая ДНК, кодирующая этот белок, может быть амплифицирована при помощи ПЦР с использованием белковой последовательности или ее нуклеотидной последовательности, когда она доступна в публичных базах данных. Пример 6. Разрушение гена SMS 27 и его эквивалентов в других организмах для получения витамина С и/или 2-KGA Для улучшения продукции витамина С в подходящем микроорганизме, который способен непосредственно продуцировать витамин С из конкретного субстрата, ген SMS 27 и эквиваленты, такие как, например,продукт ПЦР, полученный в примере 5, называемый далее геном X, может быть разрушен в соответствии с геном SMS 27 в G. oxydans IFO 3293 (см. пример 2) для генерирования мутанта с нокаутом, несущим эквивалентный ген SMS 27Km. Подходящие штаммы-хозяева для генерирования таких мутантов с нокаутом могут быть выбраны, например, из штаммов Gluconobacter, перечисленных в табл. 1, в частности, например, G oxydans IFO 3292, G. oxydans ATCC 621H, G. oxydans IFO 12528, G oxydans IFO 3291, G. oxydans IFO 3255, G.oxydans IFO 3244, G. cerinus IFO 3266, G. frateurii IFO 3260, G. oxydans IFO 3287, Acetobacter aceti subsp. orleanus IFO 3259, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13693, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13773 и Acetobacter sp. ATCC 15164, и их производных, несущих гены, участвующие в путях продуцирования витамина С,и смежные районы, в которых может быть локализован ген SMS 27 или его эквивалент. Мутант с нокаутом, такой как мутант с нокаутом G. oxydans IFO 3292-эквивалентный генKm SMS 27,может быть генерирован следующим образом: ПЦР-продукт, полученный из G. oxydans IFO 3293, описанный в примере 5, клонируют в векторе Е. coli pCR2.1-TOPO и используют для трансформации Е. coli TG1 с получением Apr-трансформанта, несущего pCR2.1-ген X. Затем кассету Kmr, выделенную из pUC-4K (AmershamBioscience, accession No. X06404), встраивают в один из сайтов рестрикции гена-мишени при помощи лигазы и полученный продукт лигирования используют для трансформации Е. coli TGI с получением трансформантаApr Kmr, несущего pCR2.1-ген XKm. Плазмиду pCR2.1-ген XKm, полученную из этого трансформанта,расщепляют двумя рестриктазами, выбранными из части сайта множественного клонирования этого вектора для выделения ДНК-фрагмента, содержащего ген ХKm. Полученный ДНК-фрагмент используют для трансформации штамма-хозяина, несущего эквивалентный ген SMS 27, электропорацией с получением разрушенного гена, несущего эквивалентный генKm SMS 27. Дополнительные модификации, включающие в себя гены, участвующие в превращении D-сорбита,L-сорбозы и/или L-сорбозона в витамин С в указанных штаммах, могут быть генерированы для улучшения продукции витамина С в таких штаммах. Продуцирование витамина С с использованием клеток мутанта с нокаутом, например, G. oxydansIFO 3292-эквивалентный генKm SMS 27, и соответствующего штамма дикого типа, например, G oxydans IFO 3292, выполняли в соответствии с примером 3. Продуцирование 2-KGA с использованием клеток мутанта с нокаутом, например, G. oxydans IFO 3292-эквивалентный генKm SMS 27, и соответствующего штамма дикого типа, например, G. oxydansIFO 3292, выполняли в соответствии с примером 4. В реакции покоящихся клеток с 1% L-сорбозоном в качестве субстрата, мутантный штамм может продуцировать по меньшей мере более чем 20% витамина С и по меньшей мере более чем 10%, 2-KGA, в- 22013412 сравнении со штаммом дикого типа. Таблица 1. Эквиваленты гена SMS 27 в других организмах Сигнал 1: Детектирование ДНК на блоте с геномной ДНК разных штаммов и SEQ ID NO:1 в качестве меченого зонда. Сигнал 2: Детектирование ДНК различных штаммов в ПЦР-реакции с использованием пары праймеров SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4. Сигнал 3: Детектирование ДНК разных штаммов в ПЦР-реакции с использованием вырожденных праймеров. В отношении более подробного объяснения смотрите текст.