Модуляция иммуностимулирующих свойств короткой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты ( siphk ) с помощью модификации нуклеотидов

013375 Предпосылки создания изобретения В последнее время на рибонуклеиновой кислоте (РНК) сконцентрировано повышенное внимание благодаря только что обнаруженной возможности ее использования в качестве терапевтического средства. Например, недавно сообщалось, что некоторые специфические в отношении последовательности двухцепочечные РНК размером, как правило, приблизительно 21-23 нуклеотида можно использовать для подавления избирательным образом экспрессии гена способом, называемым интерференция РНК или посттраскрипционное подавление (молчание) гена. Двухцепочечные РНК, используемые для такого типа интерференции РНК, включают, в частности,так называемые короткие интерферирующие РНК (siРНК). Hannon G.J., 2002, Nature 418:244-51. Напротив, как также недавно сообщалось, что неспецифическая в отношении последовательности двухцепочечная РНК может индуцировать иммуностимулирующие эффекты, действуя через Toll-подобный рецептор 3 (TLR3). Alexopoulou L. et al., 2001, Nature 413:732-8. Кроме того, недавно также сообщалось,что некоторые одноцепочечные РНК, обычно включающие гуанозин (G) и уридин (U) и, в частности,включающие определенные мотивы последовательностей, также являются иммуностимулирующими.Lipford et al., US 2003/0232074 A1. При попытке разработать siРНК для клинического применения недавно стало очевидным, что, по меньшей мере, некоторые siРНК также являются иммуностимулирующими. В некоторых случаях может быть желательным иметь как подавление гена, так и иммуностимуляцию. Однако в других случаях вместо этого может быть желательным иметь подавление гена без сопутствующей иммуностимуляции. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к композициям и способам, касающихся siРНК, характеризующейся определенными модификациями нуклеотидов в пределах смысловой цепи, так что получаемая в результате siРНК с модификаций является менее иммуностимулирующей, чем соответствующая siРНК без модификации. Модификация в смысловой цепи не влияет или незначительно влияет на способностьsiРНК преобразовывать гены-мишени в подавленные. В одном из аспектов настоящее изобретение представляет собой композицию, содержащую двухцепочечную короткую интерферирующую рибонуклеиновую кислоту (siPHK), имеющую смысловую цепь и антисмысловую цепь, при этом каждая цепь имеет 5'-конец и 3'-конец, причем антисмысловая цепь комплементарна последовательности-мишени, и смысловая цепь включает по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, при условии, что модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, не является замкнутой нуклеиновой кислотой (LNA) или 2'-О-метилнуклеотидом. В одном из аспектов настоящее изобретение представляет собой способ уменьшения иммуностимулирующего потенциала двухцепочечной короткой интерферируюшей рибонуклеиновой кислоты (siРНК),имеющей смысловую цепь и антисмысловую цепь, при этом каждая цепь имеет 5'-конец и 3'-конец, причем антисмысловая цепь комплементарна последовательности-мишени. Способ включает стадию введения в смысловую цепь siРНК по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида, имеющего сахар с 2'-модификацией, при условии, что модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией,не является замкнутой нуклеиновой кислотой (LNA) или 2'-О-метилнуклеотидом. В одном из аспектов настоящее изобретение представляет собой способ уменьшения экспрессии гена, имеющего последовательность-мишень. Способ согласно данному аспекту включает стадию приведения в контакт клетки, включающей ген, имеющий последователь-мишень, с эффективным количеством двухцепочечной короткой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (siРНК), имеющей смысловую цепь и антисмысловую цепь, при этом каждая цепь имеет 5'-конец и 3'-конец, причем антисмысловая цепь комплементарна последовательности-мишени, и смысловая цепь включает по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, при условии, что модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, не является замкнутой нуклеиновой кислотой(LNA) или 2'-O-метилнуклеотидом, для уменьшения экспрессии гена, имеющего последовательностьмишень. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смысловая цепь, включающая модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, представляет собой смысловую цепь,включающую только один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смысловая цепь, включающая модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, представляет собой смысловую цепь,включающую множество модифицированных нуклеотидов, имеющих сахар с 2'-модификацией, причем каждый модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, выбирают независимо от любого другого. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 2'-модификацию выбирают из группы, состоящей из 2'-O-алкила, 2'-О-алкенила и 2'-О-алкинила, при условии, что 2'-О-алкил исключает 2'О-метил. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 2'-модификацию выбирают из группы, состоящей из 2'-метоксиэтила, 2'-O-аллила, 2'-пропинила, 2'-аминопропаргила, 2'-О-(3-1 013375 аминопропила), 2'-О-пропила и 2'-О-бутила. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 2'-модификацию выбирают из группы, состоящей из 2'-дезокси, 2'-фтор и 2'-амино. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 2'-модификацией является 2'-фтор. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 2'-модификацию выбирают из 2'-Оалкенила, 2'-О-алкинила, 2'-метоксиэтила, 2'-аминопропаргила, 2'-О-(3-аминопропила) и 2'-амино. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, находится на 5'-конце смысловой цепи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, находится на 5'-конце смысловой цепи, исключая любой выступ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, находится на 3'-конце смысловой цепи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, находится на 3'-конце смысловой цепи, исключая любой выступ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, расположен внутри относительно 5'-конца и 3'конца смысловой цепи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, расположен внутри относительно 5'-конца и 3'-конца смысловой цепи, исключая любой выступ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смысловая цепь включает по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, на 5'-конце смысловой цепи и по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, на 3'-конце смысловой цепи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смысловая цепь включает по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, на 5'-конце смысловой цепи и по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'модификацией, на 3'-конце смысловой цепи, исключая любой выступ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смысловая цепь имеет фосфодиэфирный остов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смысловая цепь имеет стабилизированный остов, включающий по меньшей мере одну стабилизированную межнуклеотидную связь. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смысловая цепь имеет стабилизированный остов, включающий по меньшей мере одну стабилизированную межнуклеотидную связь, выбранную из группы, состоящей из тиоформацеталя, фосфоротиоата, метилфосфоната, боранофосфоната и формацетата. Краткое описание чертежей На фиг. 1 представлена группа из четырех диаграмм, изображающих продукцию цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) человека. Указанные концентрации указанных двухцепочечных siРНК (смысловая цепь (s):антисмысловая цепь (as в присутствии DOTAR инкубировали с РВМС человека, и количество IFN- (пг/мл; панели A и С) или IL-12p40 (пг/мл; панели В и D) определяли в супернатанте спустя 24 ч с помощью ELISA. Последовательности РНК для панелей А и В являются следующими: MARK2 s, SEQ ID NO:1; MARK2 as, SEQ ID NO:2, MAPK2 Exp27 s, SEQ IDNO:3; MAPK2 Exp27 as, SEQ ID NO:4; MAPK2 Ехр 30 s, SEQ ID NO:3; MAPK2 Ехр 30 as, SEQ ID NO:5. Последовательности РНК для панелей С и D являются следующими: ламин AC s, SEQ ID NO:6; ламинAC as, SEQ ID NO:7; ламин AC Ехр 27 s, SEQ ID NO:8; ламин AC Exp27 as, SEQ ID NO:9; ламин AC Ехр 30 s, SEQ ID NO:8; ламин AC Ехр 30 as, SEQ ID NO:10. На фиг. 2 представлена группа из двенадцати диаграмм, изображающих продукцию цитокинов РВМС человека. Указанные концентрации указанных разновидностей РНК (двухцепочечных siРНК(смысловая цепь (s):антисмысловая цепь (as; только смысловая цепь (s); и только антисмысловая цепь(as в присутствии DOTAR инкубировали с РВМС человека, и количество IFN- (пг/мл; панели А и С) или IL-12p40 (пг/мл; панели В и D) определяли в супернатанте спустя 24 ч с помощью ELISA. Последовательности РНК для панелей А и В являются следующими: MARK2 s, SEQ ID NO:1; MARK2 as, SEQ IDMAPK2 Ехр 30 as, SEQ ID NO:5. Последовательности РНК для панелей С и D являются следующими: ламин AC s, SEQ ID NO:6; ламин AC as, SEQ ID NO:7; ламин AC Exp27 s, SEQ ID NO:8; ламин AC Exp27as, SEQ ID NO:9; ламин АС Ехр 30 s, SEQ ID NO:8; ламин АС Ехр 30 as, SEQ ID NO:10. Подробное описание изобретения Интерференция РНК, включая технологию коротких интерферирующих РНК (siРНК), стало важным инструментом для супрессии специфических генов, и уже разрабатываются терапевтические средства на основе siРНК. Синтетическая siРНК обычно состоит из двухцепочечных олигорибонуклеотидов-2 013375 размером 21-23 нуклеотида с фосфодиэфирным остовом. Однако в дополнение к нацеливающему на специфический ген эффекту siРНК недавно описаны неспецифические эффекты данной технологии. Показано, что siРНК индуцирует неспецифическую активацию врожденной иммунной системы, включая увеличение продукции некоторых цитокинов, например продукции интерферона типа I и/или типа II, а также IL-12, IL-6 и/или TNF-. Полагают, что такие эффекты возникают в результате активации Tollподобных рецепторов, подобных TLR7, TLR8 и/или TLR3, с помощью siРНК. Несмотря на то, что активация иммунной системы часто является желательным эффектом, в контексте подавления РНК неспецифическая активация иммунной системы может мешать фактическому действию siРНК и может значительно изменить результат лечения. В описанных ниже примерах было неожиданно обнаружено, что иммуностимулирующая активность некоторых конструкций siРНК, характеризующихся определенными 2'-модификациями сахаров нуклеотидов в специфических местоположениях, снижена без значительного снижения их способности преобразовывать гены в подавленные. siРНК, полученные из последовательностей генов МАРК 2 (Erk2) и ламина АС (табл. 1), индуцировали значительную продукцию цитокинов при инкубации с РВМС человека в присутствии катионного липида N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (DOTAP,фиг. 1). Полагают, что индукция цитокинов осуществляется с помощью иммуностимулирующих последовательностей, присутствующих в антисмысловой и/или смысловой цепи siРНК. В соответствии с настоящим изобретением обнаружено, что химические модификации в пределах смысловой и антисмысловой цепи могут значительно подавлять иммуностимулирующую активностьsiРНК. Введение 2'-модификаций сахара на 5'- и 3'-конце смысловой цепи (фиг. 1) и дополнительных 2'модификаций сахара на 3'-конце антисмысловой цепи полностью упраздняет продукцию IL-12p40 иTNF- и значительно снижает продукцию IFN-. В соответствии с настоящим изобретением неожиданно обнаружено, что введенные модификации влияли только на иммуностимулирующую активность смысловой цепи (s, одноцепочечной РНК) и двухцепочечной siРНК, содержащей смысловую и антисмысловую цепь, но не влияли на активность антисмысловой цепи (as, одноцепочечной РНК), которая все еще сохраняла большую часть ее иммуностимулирующей активности. Следовательно, подавление стимулирующей активности dsРНК или siРНК, повидимому, возможно путем модифицирования смысловой, но не антисмысловой цепи. Это важно, поскольку полагают, что только антисмысловая цепь ответственна за эффект подавления siРНК, так что химические модификации для контроля иммуностимуляции можно ввести в смысловую цепь не оказывая влияния на антисмысловую цепь и, следовательно, не влияя на эффект подавления (молчания). В соответствии с настоящим изобретением также неожиданно обнаружено, что модификации смысловой цепи РНК, введенные только на каждом из 5'- и 3'-концов и, в частности, не в возможной иммуностимулирующей последовательности, все еще приводят к сильному или полному подавлению иммуностимулирующей активности. Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением неожиданно обнаружено, что даже единственная 2'-модификация в иммуностимулирующей одиночной цепи сильно влияет на иммунный ответ,указывая на то, что такая единственная модификация в смысловой цепи может быть достаточной, чтобы повлиять на иммуностимулирующую активность siРНК или dsРНК. В недавней публикации от Hornung et al. (Nature Medicine 11:263-70, 2005) сообщалось, что модификации в виде замкнутой нуклеиновой кислоты (LNA) иммуностимулирующего мотива на 3'-конце ослабляют иммуностимулирующие свойства siРНК. В противоположность сообщению Hornung et al. в соответствии с настоящим изобретением неожиданно обнаружено, что модификации необязательно необходимы в пределах иммуностимулирующего мотива, и модификация, приводящая только к нестимулирующей смысловой цепи, достаточна для подавления иммуностимулирующей активности. В одном из аспектов настоящее изобретение относится, в основном, к композициям и способам, в которые вовлечена двухцепочечная siРНК, включающая определенные модификации. Специфические модификации уменьшают иммуностимулирующий потенциал siРНК по сравнению с потенциалом соответствующих siРНК без модификаций. Используемый в данном описании термин "siРНК" относится к конкретному типу выделенной молекулы двухцепочечной рибонуклеиновой кислоты (РНК), характеризующейся размером приблизительно 21-23 нуклеотида, одноцепочечной смысловой цепью (s) и одноцепочечной антисмысловой цепью (as), причем антисмысловая цепь имеет нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности-мишени, и вышеуказанная молекула РНК при доставке в клетку, экспрессирующую белок, кодируемый последовательностью-мишенью, уменьшает количество нуклеотидной последовательности-мишени (и кодируемого белка) в клетке. Смысловая и антисмысловая цепи siРНК имеют нуклеотидные последовательности, которые строго или, по меньшей мере, существенно комплементарны друг другу, так что они могут образовывать стабильную двойную структуру в подходящих условиях in vivo или in vitro. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения один или оба конца одной из двух цепей могут продолжать после соответствующего конца или концов другую цепь в двойной структуре, что делает возможным, таким образом, небольшой выступ последовательности (обычно размером 1-2 нуклеотида) на одном из двух или-3 013375 обоих концах siРНК. Как правило, siРНК включает нуклеотидные субъединицы, имеющие канонические нуклеооснования, обычные для РНК, например аденин, цитозин, гуанин и урацил, но не ограничиваясь ими. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения могут также присутствовать другие нуклеооснования, включающие, но не ограничиваясь ими, тимин и гипоксантин. Используемый в данном описании в контексте любой РНК-молекулы термин "иммуностимулирующий потенциал" относится к способности РНК-молекулы стимулировать иммунный ответ, например стимулировать клетку иммунной системы с активацией ее пролиферации, дифференциации, с увеличением экспрессии секретируемых продуктов, ассоциируемых с ее активацией, увеличением экспрессии маркеров клеточной поверхности или состимулирующих молекул, ассоциируемых с активацией клетки иммунной системы, или с любой их комбинацией. Секретируемые продукты, ассоциируемые с активацией иммунной клетки, хорошо известны в данной области и могут включать, но, не ограничиваясь ими,цитокины, хемокины и антитела. В качестве признака изобретения смысловая цепь siРНК настоящего изобретения включает модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, при условии, что модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, не является замкнутой нуклеиновой кислотой (LNA) или 2'-O-метилнуклеотидом. Смысловая цепь может включать только единственный модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, или она может содержать два или более модифицированных нуклеотида, имеющих сахар с 2'-модификацией, при этом каждый выбирают независимо от любого другого. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смысловая цепь включает только модифицированные нуклеотиды, имеющие сахар с 2'-модификацией, при этом каждый выбирают независимо от любого другого. Более конкретно, смысловая цепь включает от одного до шести модифицированных нуклеотидов, имеющих сахар с 2'-модификацией, при этом каждый выбирают независимо от любого другого. Когда существует более одного модифицированного нуклеотида, имеющего сахар с 2'модификацией, модифицированные нуклеотиды, имеющие сахар с 2'-модификацией, могут располагаться таким образом, насколько позволяет их число, в виде смежных нуклеотидов, в виде несмежных нуклеотидов или в виде комбинации смежных и несмежных нуклеотидов. Используемый в данном описании термин "нуклеотид" относится к сахару (например, рибозе или дезоксирибозе), связанному с фосфатной группой и взаимозаменяемым органическим основанием (например, нуклеооснованием), которое является или замещенным пиримидином (например, цитозином,тимином или урацилом), или замещенным пурином (например, аденином или гуанином). Как использовано в данном описании, нуклеотиды, имеющие цитозин, тимин, урацил, аденин или гуанин в качестве их нуклеооснований, обозначены их общепринятыми символами в виде единичных букв С, Т, U, А или G соответственно. Рибонуклеотиды включают, но не ограничиваясь ими, канонические рибонуклеотиды С,U, А и G. Используемый в данном описании в контексте с любой разновидностью РНК термин "модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией", относится к нуклеотиду, в котором сахар имеет заместитель в положении 2', которое не является стандартным для рибонуклеотида. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения сахар с 2'-модификацией представляет собой сахар в виде 2'дезоксирибозы, так что соответствующим нуклеотидом является дезоксирибонуклеотид. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 2'-модификацию выбирают из группы, состоящей из 2'O-алкила, 2'-O-алкенила и 2'-O-алкинила, при условии, что 2'-O-алкил исключает 2'-O-метил. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 2'-модификацию выбирают из группы, состоящей из 2'-метоксиэтила, 2'-O-аллила, 2'-пропинила, 2'-аминопропаргила, 2'-О-(3-аминопропила), 2'-O-пропила и 2'-O-бутила. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 2'-модификацию выбирают из группы, состоящей из 2'-дезокси, 2'-фтор-2'-дезокси (т.е. 2'-фтор) и 2'-амино-2'-дезокси (т.е. 2'-амино). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 2'-модификацией является 2'-фтор. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения 2'-модификацию выбирают из 2'-O-алкенила,2'-O-алкинила, 2'-метоксиэтила, 2'-аминопропаргила, 2'-О-(3-аминопропила) и 2'-амино. Используемый в данном описании термин "замкнутая нуклеиновая кислота" (LNA) относится к производному РНК, в котором рибозное кольцо затруднено метиленовой связью между 2'-кислородом и 4'-углеродом. Wahlestedt С. et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:5633-8. Другими словами, модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, может находиться в любом месте вдоль смысловой цепи. В частности, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, находится на 5'конце смысловой цепи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, находится на 3'-конце смысловой цепи. В частности,в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, находится на 5'-конце смысловой цепи и на 3'-конце смысловой цепи. Модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, необязательно находится на конце смысловой цепи, но более предпочтительно он может находиться между концами смысловой цепи, т.е. расположен внутри относительно 5'-конца и 3'-конца смысловой цепи. В некоторых вариантах осуществле-4 013375 ния настоящего изобретения модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, находится на одном из или как на 5'-конце, так и на 3'-конце смысловой цепи, а также является внутренним относительно 5'-конца и 3'-конца смысловой цепи. Нуклеотидная последовательность смысловой цепи, антисмысловой цепи или как смысловой цепи,так и антисмысловой цепи могут необязательно включать иммуностимулирующую последовательность или мотив. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующая последовательность или мотив представляет собой 5'-RURGY-3', где каждый R независимо представляет собой пуриновый рибонуклеотид, и Y представляет собой пиримидиновый рибонуклеотид. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения 5'-RURGY-3', в частности, может включать, но не ограничиваясь ими, 5'-GUGGU-3', 5'-GUGGC-3', 5'-GUAGU-3', 5'-GUAGC-3', 5'-AUGGU-3', 5'-AUGGC-3',5'-AUAGU-3' и 5'-AUAGC-3'. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующая последовательность или мотив представляет собой 5'-GUAGUGU-3'. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующая последовательность или мотив представляет собой 5'-GUUGB-3', где В представляет собой U, G или С. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения 5'-GUUGB-3', в частности, включает 5'-GUUGU-3', 5'-GUUGG-3' и 5'GUUGC-3'. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующая последовательность или мотив представляет собой 5'-GUGUG-3'. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующая последовательность или мотив представляет собой 5'GUGUUUAC-3'. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующая последовательность или мотив представляет собой 5'-GUAGGCAC-3'. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующая последовательность или мотив представляет собой 5'-CUAGGCAC-3'. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующая последовательность или мотив представляет собой 5'-CUCGGCAC-3'. Когда смысловая цепь включает идентифицируемую иммуностимулирующую последовательность или мотив, модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения находится в пределах идентифицируемой иммуностимулирующей последовательности или мотива. Альтернативно и существенно, когда смысловая цепь включает идентифицируемую иммуностимулирующую последовательность или мотив, модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'модификацией, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения находится вне пределов идентифицируемой иммуностимулирующей последовательности или мотива. Когда смысловая цепь включает идентифицируемую иммуностимулирующую последовательность или мотив, и модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, находится вне пределов идентифицируемой иммуностимулирующей последовательности или мотива, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, находится, непосредственно примыкая к идентифицируемой иммуностимулирующей последовательности или мотиву. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения непосредственно примыкающим является непосредственно 5' относительно иммуностимулирующей последовательности или мотива. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения непосредственно примыкающим является непосредственно 3' относительно иммуностимулирующей последовательности или мотива. В других вариантах осуществления настоящего изобретения, в которых смысловая цепь включает идентифицируемую иммуностимулирующую последовательность или мотив, и модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'модификацией, находится вне пределов идентифицируемой иммуностимулирующей последовательности или мотива, модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, удален по меньшей мере на один нуклеотид от иммуностимулирующей последовательности или мотива. Число нуклеотидов между модифицированным нуклеотидом, имеющим сахар с 2'-модификацией, и иммуностимулирующей последовательностью или мотивом может составлять, в различных вариантах осуществления изобретения,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18. Любой нуклеотид смысловой цепи, включая любой модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, как определено ниже, может необязательно включать модификацию, в которую вовлечена фосфатная группа. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смысловая цепь имеет фосфодиэфирный остов, т.е. нуклеотиды смысловой цепи связаны друг с другом с помощью фосфодиэфирных связей. Такие фосфодиэфирные связи и фосфодиэфирный остов являются типичными для природных молекул нуклеиновых кислот, и они относительно чувствительны к расщеплению нуклеазами in vivo. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения смысловая цепь имеет стабилизированный остов. Стабилизированный остов включает по меньшей мере одну стабилизированную межнуклеотидную связь, что приводит к остову, который является относительно устойчивым к расщеплению нуклеазами in vivo или in vitro по сравнению с фосфодиэфирным остовом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стабилизированный остов включает только стабилизированные межнуклеотидные связи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стабилизированные межнуклеотидные связи выбирают из группы, состоящей из тиоформацеталя, фосфоротиоата, метил-5 013375 фосфоната, боранофосфоната и формацетата. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения стабилизированной межнуклеотидной связью является фосфоротиоатная связь.siРНК настоящего изобретения можно синтезировать с использованием применяемых автоматизированных способов и устройств, например или фосфорамидатной, или Н-фосфонатной химической технологии. Способы получения других модификаций и замен в остове нуклеиновых кислот описаны и подразумеваются для использования в настоящем изобретении. Uhlmann E. et al., 1990, Chem. Rev. 90:544;Goodchild J., 1990, Bioconjugate Chem. 1:165. Смысловую и антисмысловую цепи можно синтезировать отдельно. Альтернативно, смысловую и антисмысловую цепи можно синтезировать в виде единой конструкции и затем подвергнуть обработке,чтобы обрезать или иными словами удалить мешающие или посторонние нуклеотиды или связывающие составляющие. Независимо от того, каким образом их синтезируют, желаемые siРНК или компоненты смысловой и антисмысловой цепи предпочтительно отделяют от посторонних реагентов синтеза и необязательно очищают перед использованием. Полагают, что композиции настоящего изобретения полезны в любом случае, требующем использования siРНК. Следовательно, последовательность-мишень может быть любой подходящей последовательностью-мишенью. Клинические случаи, требующие использования siРНК, включают, но не ограничиваясь ими, лечение субъектов, имеющих рак, лечение субъектов, имеющих инфекционное заболевание, лечение субъектов, имеющих аутоиммунное заболевание, лечение субъектов, имеющих отторжение трансплантата, и лечение субъектов, имеющих аллергию или астму. Специалистам в данной области известно, как выбрать подходящую последовательность-мишень и оценить эффективность блокирования РНК для данной мишени. Методы оценки эффективности блокирования РНК для конкретной мишени можно осуществить с использованием стандартных анализов нуклеотидов и белков, таких как количественная полимеразная цепная реакция с использованием обратной транскриптазы (qRT-PCR), иммуноблоттинг и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), при условии, что такие методы подходящим образом адаптированы к конкретной мишени, например, благодаря правильному выбору праймеров для амплификации и антител. Изобретение в одном из аспектов относится к способу уменьшения иммуностимулирующего потенциала siРНК. Данный способ в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения может использоваться для уменьшения иммуностимулирующего потенциала предварительно охарактеризованной siРНК. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения способ может использоваться для уменьшения иммуностимулирующего потенциала предварительно не охарактеризованной siРНК,например, при конструировании и синтезе siРНК впервые. Данный способ включает стадию введения модифицированного нуклеотида, имеющего сахар с 2'-модификацией, в смысловую цепь двухцепочечной siРНК, имеющей смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем антисмысловая цепь комплементарна последовательности-мишени, при условии, что модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, не является замкнутой нуклеиновой кислотой (LNA) или 2'-O-метилнуклеотидом. Как использовано в данном описании со ссылкой на данный аспект настоящего изобретения, введение модифицированного нуклеотида, имеющего сахар с 2'-модификацией, относится к замене существующего или природного нуклеотида модифицированным нуклеотидом, имеющим сахар с 2'-модификацией, как указано выше. Например, если в существующей siРНК антисмысловая цепь имеет G, для которого требуется С в смысловой цепи, С заменяют дезоксицитидином (dC). Стадия введения модифицированного нуклеотида, имеющего сахар с 2'-модификацией, в смысловую цепь, следовательно, включает конструирование и осуществление синтеза смысловой цепи таким образом, чтобы желаемый модифицированный нуклеотид включался в смысловую цепь продукта в желаемом местоположении. Настоящее изобретение в одном из аспектов представляет собой способ осуществления на практике интерференции РНК с использованием siРНК настоящего изобретения. Более конкретно, способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения представляет собой способ уменьшения экспрессии гена, имеющего последовательность-мишень. Как использовано в данном описании, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения уменьшение экспрессии гена, имеющего последовательность-мишень, относится к уменьшению количества информационной РНК, транскрибируемой с конкретного, представляющего интерес гена. Также как использовано в данном описании, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения уменьшение экспрессии гена, имеющего последовательность-мишень, относится к уменьшению количества присутствующего в клетке продукта в виде белка, кодируемого конкретным, представляющим интерес геном. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения включает стадию приведения в контакт клетки, включающей ген, имеющий последовательность-мишень, с эффективным количеством двухцепочечной короткой интерферирующей рибонуклеиновой кислоты (siPHK), имеющей смысловую цепь и антисмысловую цепь, причем антисмысловая цепь комплементарна последовательности-мишени, и смысловая цепь включает модифицированный нуклеотид, имеющий сахар с 2'-модификацией, при условии, что модифицированный нуклеотид,имеющий сахар с 2'-модификацией, не является замкнутой нуклеиновой кислотой (LNA) или 2'-Ометилнуклеотидом, для уменьшения экспрессии гена, имеющего последовательность-мишень. Способ в соответствии с данным аспектом настоящего изобретения можно осуществить in vitro и in vivo. При-6 013375 осуществлении способа in vivo, стадия приведения в контакт дополнительно влечет за собой введение субъекту соединения настоящего изобретения.siРНК настоящего изобретения можно, в частности, использовать для лечения субъектов, имеющих рак, субъектов, имеющих инфекционное заболевание, субъектов, имеющих аутоиммунное заболевание,субъектов, имеющих аллергию, и субъектов, имеющих астму, но не ограничиваясь перечисленным. Используемый в данном описании термин "рак" относится к неконтролируемому росту клеток, которые мешают нормальному функционированию органов и систем организма. Злокачественные опухоли,которые мигрируют из своего первоначального местонахождения и обсеменяют необходимые для жизни органы, могут, в конечном счете, привести к смерти субъекта благодаря функциональному истощению пораженных органов. Виды рака кроветворной системы, такие как лейкоз, способны вытеснить у субъекта нормальные компартменты кроветворной системы, что приводит, таким образом, к нарушению кроветворной системы (в форме анемии, тромбоцитопении и нейтропении), приводящему, в конечном счете, к смерти. Используемый в данном описании термин "субъект, имеющий рак, " относится к субъекту, который имеет определяемые раковые клетки. Метастаз является областью раковых клеток, отличной от местонахождения первичной опухоли,являющейся результатом диссеминирования раковых клеток из первичной опухоли в другие части организма. Во время диагностики массы первичной опухоли субъекта можно проверить на наличие метастазов. Метастазы наиболее часто определяют благодаря исключительному или комбинированному использованию изображений, получаемых с помощью магнитного резонанса (MRI), изображений, получаемых при компьютерной томографии (СТ), числа форменных элементов крови и тромбоцитов, исследований функции печени, рентгеновского исследования грудной клетки и сканограмм костей помимо контролирования специфических симптомов. Злокачественные опухоли включают, но не ограничиваясь ими, базально-клеточную карциному,рак желчных путей, рак мочевого пузыря, рак кости, рак головного мозга и центральной нервной системы, рак молочной железы, рак шеи, хориокарциному, рак толстой и прямой кишок, рак соединительной ткани, рак пищеварительной системы, эндометрический рак, рак пищевода, рак глаза, рак головы и шеи,рак желудка, интраэпителиальную опухоль, рак почки, рак гортани, лейкоз, рак печени, рак легкого (например, мелкоклеточный и немелкоклеточный), лимфому, включая лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, меланому, миелому, нейробластому, рак ротовой полости (например, губ, языка, рта и глотки), рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак прямой кишки, рак почки, рак дыхательной системы, саркому, рак кожи, рак желудка,рак яичка, рак щитовидной железы, рак матки, рак мочевой системы, а также другие карциномы и саркомы. Используемый в данном описании термин "инфекционное заболевание" относится к нарушению,возникающему из-за инвазии инфекционного микроорганизма в хозяина, поверхностно, местно или по всему организму. Инфекционные микроорганизмы включают бактерии, вирусы, паразиты и грибы. Используемый в данном описании термин "субъект, имеющий инфекционное заболевание," относится к субъекту, который подвергся воздействию инфекционного организма и имеет определяемый уровень острой или хронической инфекции в организме. Воздействие инфекционного организма, как правило, происходит с наружной поверхности субъекта, например кожи или слизистых оболочек, и/или относится к проникновению инфекционного организма в наружную поверхность субъекта. Примеры вирусов, которые были обнаружены у людей, включают, но не ограничиваясь ими, Retroviridae (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как HIV-1 (на который также приводится ссылка как на HDTV-III, LAVE, или HTLV-III/LAV, или HIV-III; и другие изоляты, такие как HIV-LP;Adenoviridae (большинство аденовирусов); Herpesviridae (вирус простого герпеса (HSV) 1 и 2, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (CMV), вирус герпеса); Poxviridae (вирусы натуральной оспы, вирусы осповакцины, вирусы оспы) и Iridoviridae (например, вирус африканской лихорадки свиней), и неклассифицированные вирусы (например, агент дельта-гепатита, который, как полагают, является дефектным спутником вируса гепатита В; агенты гепатита не-А, не-В (класса 1 = внутренне передающийся; класса 2 = парентерально передающийся (т.е. гепатит С); вирусы Норвалк и родственные вирусы и астровирусы). У позвоночных животных как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии служат в ка-7 013375 честве антигенов. Такие грамположительные бактерии включают, но не ограничиваясь ими, виды Pasteurella, виды Staphylococci и виды Streptococcus. Грамотрицательные бактерии включают, но не ограничиваясь ими, Escherichia coli, виды Pseudomonas и виды Salmonella. Конкретные примеры инфекционных бактерий включают, но не ограничиваясь ими, Helicobacter pyloris, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, виды Mycobacteria (например, М. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (стрептококк группы А), Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В), Streptococcusanthracis, Corynebacterium diphtheriae, виды Corynebacterium, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, виды Bacteroides, Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia и Actinomyces israelli. Примеры грибов включают Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis,Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Другие инфекционные организмы (т.е. одноклеточные организмы) включают виды Plasmodium, такие как Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale и Plasmodium vivax и Toxoplasmagondii. Паразиты крови-кости и/или тканей включают виды Plasmodium, Babesia microti, Babesia divergens, Leishmania tropica, виды Leishmania, Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma gambiense и Trypanosoma rhodesiense (африканский трипаносомоз), Trypanosoma cryzi (болезнь Шагаса) иToxoplasma gondii. Другие релевантные в медицинском отношении микроорганизмы подробно описаны в литературе,например, см. C.G.A. Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Великобритания 1983, содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки.siРНК настоящего изобретения также полезна для лечения и профилактики аутоиммунного заболевания. Аутоиммунное заболевание представляет собой класс заболеваний, при которых собственные антитела субъекта реагируют с тканями хозяина, или при которых эффекторные Т-клетки иммунной системы являются аутореактивными в отношении эндогенных аутопептидов и вызывают разрушение ткани. Таким образом, возникает иммунный ответ против собственных антигенов субъекта, на которые ссылаются, как на аутоантигены. Аутоиммунные заболевания включают, но не ограничиваясь ими, ревматоидный артрит, болезнь Крона, множественный склероз, системную красную волчанку (SLE), аутоиммунный энцефаломиелит, тяжелую миастению (MG), зоб Хасимото, синдром Гудпасчера, пузырчатку (например, пузырчатку обыкновенную), болезнь Грейвса, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, склеродерму с антителами против коллагена, болезнь смешанных соединительных тканей, полимиозит, пернициозную анемию, идиопатическую болезнь Аддисона,аутоиммунное сопутствующее бесплодие, гломерулонефрит (например, полулунный гломерулонефрит,пролиферативный гломерилонефрит), буллезный пемфигоид, синдром Шегрена, инсулинорезистентность и аутоиммунный сахарный диабет. Используемый в данном описании термин "аллергия" относится к приобретенной гиперчувствительности к веществу (аллергену). Аллергические состояния включают, но не ограничиваясь ими, экзему, аллергический ринит или острый ринит, сенную лихорадку, аллергический конъюнктивит, бронхиальную астму, крапивницу (сыпь) и пищевые аллергии, другие атопические состояния, включая атопический дерматит; анафилаксию; лекарственную аллергию и болезнь Квинке. Аллергические заболевания включают, но не ограничиваясь ими, ринит (сенную лихорадку), астму, крапивницу и атопический дерматит. Как использовано в данном описании, субъектом, имеющим аллергию, является субъект, который имеет аллергическую реакцию в ответ на аллерген. Аллерген относится к веществу (антигену), который индуцирует аллергическую или астматическую реакцию у чувствительного субъекта. Перечень аллергенов огромен и может включать пыльцу, яды насекомых, пыль-перхоть животного происхождения, споры грибов и лекарственные средства (например,пенициллин). Примеры природных аллергенов животного и растительного происхождения включают, но не ограничиваясь ими, белки, специфические в отношении следующих родов: Canis (Canis familiaris);(например, Festuca elatior); Poa (например, Роа pratensis или Poa compressa); Avena (например, Avena sativa); Holcus (например, Holcus lanatus); Anthoxanthum (например, Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (например, Arrhenatherum elatius); Agrostis (например, Agrostis alba); Phleum (например,Phleum pratense); Phalaris (например, Phalaris arundinacea); Paspalum (например, Paspalum notatum); Sorghum (например, Sorghum halepensis) и Bromus (например, Bromus inermis). Используемый в данном описании термин "астма" относится к заболеванию респираторной системы, характеризующемуся воспалением, сужением дыхательных путей и увеличенной реактивностью дыхательных путей на вдыхаемые агенты. Астма часто, хотя не исключительно, ассоциируется с атопическим или аллергическим состоянием. Симптомы астмы включают повторяющиеся эпизоды стерторозного дыхания, одышки и сжатия в груди, и кашель, являющийся результатом затрудненного дыхания. Воспаление дыхательных путей, сопровождающее астму, можно определить благодаря наблюдению за рядом физиологических изменений, таких как денудация эпителия дыхательных путей, отложение коллагена ниже базальной мембраны, отек, активация тучных клеток, инфильтрация воспалительных клеток,включая нейтрофилы, инозинофилы и лимфоциты. В результате воспаления дыхательных путей у больных астмой часто наблюдается гиперреактивность дыхательных путей, затрудненное дыхание, респираторные симптомы и хронический характер болезни. Затрудненное дыхание включает острый бронхостеноз, отек дыхательных путей, образование слизистых пробок и коррекцию дыхательных путей, признаки,которые часто приводят к бронхиальной непроходимости. В некоторых случаях астмы может иметь место фиброз суббазальной мембраны, что приводит к персистированному нарушению функции легких. Как использовано в данном описании, субъектом, имеющим астму, является субъект, который имеет заболевание респираторной системы, характеризующееся воспалением, сужением дыхательных путей и увеличенной реактивностью дыхательных путей на вдыхаемые агенты. Астма часто, хотя не исключительно, сопровождается атопическими или аллергическими симптомами. Астма часто, хотя не исключительно, ассоциируется с контактом с инициатором. "Инициатор", как использовано в данном описании,относится к композиционному состоянию или условию окружающей среды, которые инициируют астму. Инициаторы включают, но не ограничиваясь ими, аллергены, низкие температуры, физические нагрузки,вирусные инфекции, SO2.siРНК настоящего изобретения можно использовать или отдельно, или в комбинации с другими терапевтическими агентами. Другой терапевтический агент в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения представляет собой другую siРНК настоящего изобретения. siРНК и другой терапевтический агент можно вводить одновременно или последовательно. Когда другие терапевтические агенты вводят одновременно, их можно вводить в одной и той же композиции или в отдельных композициях,но их вводят в одно и то же время. Другие терапевтические агенты вводят последовательно с одним другим терапевтическим агентом и с siРНК, когда введение других терапевтических агентов и siРНК разделено во времени. Разделение во времени между введением указанных соединений может быть делом минут или дольше. Другие терапевтические агенты включают, но не ограничиваясь ими, противомикробные агенты, противораковые агенты, противоаллергические агенты и т.д.siРНК настоящего изобретения можно вводить субъекту с противомикробным агентом. Противомикробный агент, используемый в данном описании, относится к природному или синтетическому соединению, которое способно уничтожать или ингибировать инфекционные микроорганизмы. Тип противомикробного агента, применимый в соответствии с настоящим изобретением, будет зависеть от типа микроорганизма, которым инфицирован или риск инфицирования которым имеется у субъекта. Противомикробные агенты включают, но не ограничиваясь ими, антибактериальные агенты, противовирусные агенты, противогрибковые агенты и антипаразитарные агенты. Такие выражения, как "противоинфекционный агент", "антибактериальный агент", "противовирусный агент", "противогрибковый агент", "антипаразитарный агент" и "паразитицид", имеют хорошо установившиеся значения для специалистов в данной области и определены в стандартных руководствах по медицине. Кратко, антибактериальные агенты уничтожают или ингибируют бактерии и включают антибиотики, а также другие синтетические или природные соединения, имеющие схожие функции. Антибиотики представляют собой низкомолекулярные молекулы, которые продуцируются в виде вторичных метаболитов клетками, такими как микроорганизмы. Как правило, антибиотики блокируют одну или несколько функций или структур бактерий, которые являются специфическими для микроорганизма и которые не присутствуют в клетках-хозяина. Противовирусные агенты можно выделить из природных источников или синтезировать, и они используются для уничтожения или ингибирования вирусов. Противогрибковые агенты используют для лечения поверхностных грибковых инфекций, а также инфекций, вызванных условно-патогенными грибами, и первичных системных грибковых инфекций. Антипаразитарные агенты уничтожают или ингибируют паразитов. Примеры антипаразитарных агентов, на которые также приводится ссылка как на паразитициды,используемые для введения человеку, включают, но не ограничиваясь ими, альбендазол, амфотерицин В,бензнидазол, битионол, хлорохин HCl, хлорохина фосфат, клиндамицин, дегидроэметин, диэтилкарбамазин, дилоксанида фуроат, эфлорнитин, фуразолидон, глюкокортикоиды, галофантрин, иодхинол, иверместин, мебендазол, мефлохин, меглюмина антимониат, меларсопрол, метрифонат, метронидазол, никлозамид, нифуртимокс, оксамнихин, парамомицин, пентамицина изотионат, пиперазин, празиквантел, при-9 013375 махина фосфат, прогуанил, пирантела памоат, пириметамин-сульфонамиды, пириметаминсульфадоксин, хинакрин HCl, хинина сульфат, хинидина глюконат, спирамицин, стибоглюконат натрия(натрия сурьмы глюконат), сурамин, тетрациклин, доксициклин, тиабендазол, тинидазол, триметропримсульфаметоксазол и трипарсамид, некоторые из которых используются отдельно или в комбинации с другими. Антибактериальные агенты уничтожают или ингибируют рост или функцию бактерий. Большим классом антибактериальных агентов являются антибиотики. На антибиотики, эффективные для уничтожения или ингибирования широкого ряда бактерий, приводится ссылка как на антибиотики широкого спектра. Другие типы антибиотиков преимущественно эффективны против грамположительных или грамотрицательных бактерий. На такие типы антибиотиков приводится ссылка как на антибиотики узкого спектра. На другие антибиотики, которые эффективны против одного организма или заболевания и не эффективны против других типов бактерий, приводится ссылка как на антибиотики ограниченного спектра. Классификацию антибактериальных агентов иногда проводят на основе первичного образа действия. Как правило, антибактериальные агенты являются ингибиторами синтеза клеточной стенки, ингибиторами клеточной мембраны, ингибиторами синтеза белков, синтеза нуклеиновых кислот или функциональными ингибиторами, и конкурентными ингибиторами. Противовирусными агентами являются соединения, которые предотвращают инфицирование клеток вирусами или репликацию вирусов внутри клетки. Существует намного меньше противовирусных лекарственных средств, чем антибактериальных лекарственных средств, поскольку процесс репликации вирусов столь близко связан с репликацией ДНК внутри клетки-хозяина, что неспецифические противовирусные агенты часто являются токсичными для хозяина. Существует несколько стадий внутри процесса вирусной инфекции, которые можно блокировать или ингибировать с помощью противовирусных агентов. Эти стадии включают прикрепление вируса к клетке-хозяина (иммуноглобулин или связывающие пептиды), декапсидацию вируса (например, амантадин), синтез или трансляцию вирусной мРНК(например, интерферон), репликацию вирусной РНК или ДНК (например, аналоги нуклеотидов), созревание новых вирусных белков (например, ингибиторы протеаз) и почкование и высвобождение вируса. Аналогами нуклеотидов являются синтетические соединения, сходные с нуклеотидами, но которые имеют неполную или аномальную дезоксирибозную или рибозную группу. При попадании аналогов нуклеотидов в клетку они фосфорилируются с образованием трифосфатных форм, которые конкурируют с нормальными нуклеотидами за включение в вирусную ДНК или РНК. После включения трифосфатной формы аналога нуклеотида в растущую нуклеотидную цепь он вызывает необратимое связывание с вирусной полимеразой и, следовательно, обрыв цепи. Аналоги нуклеотидов включают, но, не ограничиваясь ими, ацикловир (используемый для лечения вируса простого герпеса и вируса ветряной оспы), ганцикловир (используемый для лечения цитомегаловируса), идоксуридин, рибавирин (использульзуемый для лечения респираторно-синцитиального вируса), дидезоксиинозин, дидезоксицитидин, цидовудин(азидотимидин), имиквимод и резимиквимод. Интерфероны представляют собой цитокины, которые секретируются инфицированными вирусами клетками, а также клетками иммунной системы. Интерфероны функционируют, связываясь со специфическими рецепторами на клетках, примыкающих к инфицированным клеткам, что вызывает в клетке изменение, которое защищает ее от инфицирования вирусом. Интерфероныитакже индуцируют экспрессию молекул МНС класса I и II на поверхности инфицированных клеток, что приводит к увеличению презентации антигенов для распознавания клетками иммунной системы. Интерфероныидоступны в рекомбинантных формах и использовались для лечения хронического гепатита В и С. В дозах, которые являются эффективными для противовирусной терапии, интерфероны имеют тяжелые побочные эффекты, такие как лихорадка, недомогание и потеря массы. Противовирусные агенты, используемые в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваясь ими, иммуноглобулины, амантадин, интерфероны, аналоги нуклеотидов и ингибиторы протеаз. Конкретные примеры противовирусных агентов включают, но не ограничиваясь ими, ацеманнан, ацикловир,ацикловир натрий, адефовир, аловудин, алвирцепт судотокс, амантадин гидрохлорид, аранотин, арилдон,атевирдина мезилат, авридин, цидофовир, ципамфиллин, цитарабин гидрохлорид, делавирдина мезилат,десцикловир, диданозин, дисоксарил, эдоксудин, энвираден, энвироксим, фамцикловир, фамотин гидрохлорид, фиацитабин, фиалуридин, фосарилат, фоскарнет натрий, фосфонет натрий, ганцикловир, ганцикловир натрий, идоксуридин, кетоксаль, ламивудин, лобукавир, мемотин гидрохлорид, метисазон, невирапин, пенцикловир, пиродавир, рибавирин, римантадин гидрохлорид, саквинавира мезилат, сомантадин гидрохлорид, соривудин, статолон, ставудин, тилорон гидрохлорид, трифлуридин, валацикловир гидрохлорид, видарабин, видарабина фосфат, видарабина натрия фосфат, вироксим, зальцитабин, цидовудин и цинвироксим. Противогрибковые агенты полезны для лечения и профилактики инфекционных грибов. Классификацию противогрибковых агентов иногда проводят по их механизму действия. Некоторые противогрибковые агенты функционируют в качестве ингибиторов клеточной стенки путем ингибирования глюкозо- 10013375 синтазы. Такие агенты включают, но не ограничиваясь ими, базиунгин/ЕСВ. Другие противогрибковые агенты функционируют путем дестабилизации целостности мембраны. Такие агенты включают, но не ограничиваясь ими, иммидазолы, такие как клотримазол, сертаконзол, флуконазол, интраконазол, кетоконазол, миконазол и вориконазол, а также FK 463, амфотерицин В, BAY 38-9502, MK 991, прадимицин,UK 292, бутенафин и тербинафин. Другие противогрибковые агенты функционируют путем разрушения хитина (например, хитиназа) или иммуносупрессии (крем 501).siРНК настоящего изобретения можно также вводить в комбинации с противораковой терапией. Противораковая терапия включает лекарственные средства против рака, облучение и хирургические способы. Используемый в данном описании термин "лекарственное средство против рака" относится к агентам, которые вводят субъекту с целью лечения рака. Как использовано в данном описании, "лечение рака" включает предотвращение развития рака, уменьшение симптомов рака и/или ингибирование роста укоренившегося рака. В других аспектах лекарственное средство против рака вводят субъекту с риском развития рака с целью уменьшения риска развития рака. Различные типы лекарственных средств для лечения рака описаны в данном описании. Для целей данного описания лекарственные средства против рака классифицируют в виде химиотерапевтических агентов, иммунотерапевтических агентов, противораковых вакцин, гормонотерапии и модификаторов биологического ответа. Химиотерапевтические агенты могут быть выбраны из группы, состоящей, но не ограничиваясь ими, из метотрексана, винкристина, адриамиуина, цисплатина, не содержащих сахара хлорэтилнитрозомочевин, 5-фторурацила, митомицина С, блеомицина, доксорубицина, дакарбазина, таксола, фрагилина,мегламина GLA, валрубицина, кармустаина и полиферпосана, MMI270, BAY 12-9566, ингибитора фамезилтрансферазы RAS, ингибитора фамезилтрансферазы, ММР, MTA/LY231514, LY264618/лометексола,гламолека, CI-994, TNP-470, гикамтина/топотекана, PKC412, валсподара/PSC833, новантрона/митроксантрона, метарета/сурамина, батимастата, Е 7070, ВСН-4556, CS-682, 9-АС, AG3340, AG3433,инсела/VX-710, VX-853, ZD0101, ISI641, ODN 698, ТА 2516/мармистата, ВВ 2516/мармистата, CDP 845,D2163, PD183805, DX8951f, лемонала DP 2202, FK 317, пицибанила/OK-432, AD 32/валрубицина, метастрона/производного стронция, темодала/темозоломида, эвацета/липосомального доксорубицина, ютаксана/паклитаксела, таксола/паклитаксела, кселоада/капецитабина, фуртулона/доксифлуридина, циклопакса/перорального паклитаксела, перорального таксоида, SPU-077/цисплатина, HMR 1275/флавопиридола,СР-358(774)/EGFR, СР-609(754)/ингибитора онкогена RAS, BMS-182751/пероральной платины, UFT (тегафура/урацила), эргамизола/левамизола, энилурацила/776 С 85/усилителя 5FU, кампто/левамизола, камптосара/иринотекана, тумодекса/ралитрекседа, леустатина/кладрибина, паксекса/паклитаксела, доксила/липосомального доксорубицина, каеликса/липосомального доксорубицина, флудара/флударабина,фармарубицина/эпирубицина, DepoCyt, ZD1839, LU 79553/бис-нафталимида, LU103793/доластаина, каетикса/липосомального доксорубицина, гемзара/гемцитабина, ZD 0473/анормеда, YM 116, затравочных кристаллов лодина, ингибиторов CDK4 и CDK2, ингибиторов PARP, D4809/дексифосамида, ифеса/меснекса/ифосфамида, вумона/тенипозида, параплатина/карбоплатина, плантинола/цисплатина, вепезида/этопозида, ZD 9331, таксотера/доцетаксела, пролекарства гуанина арабинозида, аналога таксана,нитрозомочевин, алкилирующих агентов, таких как мелфелан и циклофосфамид, аминоглутетимида, аспарагиназы, бусулфана, карбоплатина, хлоромбуцила, цитарабина HCl, дактиномицина, даунорубицина(аналога LHRH-высвобождающего фактора), ломустина (CCNU), мехлоретамина HCl (нитрогена мустарда), меркаптопурина, месны, митотана (o.p'-DDD), митоксантрона HCl, октреотида, пликамицина,прокарбазина HCl, стрептозоцина, тамоксифена цитрата, тиогуанина, тиотепа, винбластина сульфата,амсакрина (m-AMSA), азацитидина, эртропоэтина, гексаметилмеламина (НММ), интерлейкина 2, митогуазона (метил-GAG; метилглиоксаля бис-гуанилгидразона; MGBG), пентостатина (2'-дезоксикоформицина), семустина (метил-CCNU), тенипозида (VM-26) и виндесина сульфата. Иммунотерапевтические агенты могут быть выбраны из группы, состоящей, но не ограничиваясь ими, из рибутаксина, герцептина, квадрамета, панорекса, IDEC-Y2B8, ВЕС 2, C225, онколима, SMARTM195, ATRAGEN, оварекса, бексксара, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-11, MDX-22, OV103, 3622W94,анти-VEGF, зенапакса, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2, MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMab-G2, TNT, глиомаб-Н, GNI-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, монофарм-С, 4 В 5, ior egf.r3,ior c5, BABS, анти-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMART 1D10 Ab, SMART ABL364 Ab и ImmunoRAITCEA. Противораковые вакцины могут быть выбраны из группы, состоящей, но не ограничиваясь ими, изEGF, антиидиотипических противораковых вакцин, антигена Gp75, вакцины против меланомы GMK,вакцины на основе конъюгата с ганглиозидом MGV, Her2/neu, оварекса, M-Vax, O-Vax, L-Vax, STn-KHL тератопа, BLP25 (MUC-1), липосомальной идиотипической вакцины, мелацина, вакцины на основе пептидных антигенов, вакцин на основе токсина/антигена, вакцин на основе MVA, PACIS, вакцины БЦЖ,TA-HPV, TA-CIN, DISC-вируса и ImmunoCyst/TheraCys.siРНК настоящего изобретения можно также вводить субъекту с лекарственным средством против астмы/аллергии. "Лекарственное средство против астмы/аллергии", используемое в данном описании,- 11013375 представляет собой обсуждаемую композицию, уменьшающую симптомы, предотвращающую развитие или ингибирующую астматическую или аллергическую реакцию. Различные типы лекарственных средств для лечения астмы и аллергии описаны в публикации Guidelines For The Diagnosis and Management of Asthma, Expert Panel Report 2, NIH Publication No. 97/4051, July 19, 1997, содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки. Краткое описание лекарственных средств,представленных в публикации NIH, приведено ниже. В большинстве вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство против астмы/аллергии используется до некоторой степени для лечения как астмы, так и аллергии. Лекарственные средства для лечения астмы, как правило, разделяют на две категории, быстро ослабевающие лекарственные средства и лекарственные средства продолжительного действия. Больные астмой принимают лекарственные средства продолжительного действия ежедневно для достижения и сохранения контроля над персистированной астмой. Лекарственные средства продолжительного действия включают противовоспалительные агенты, такие как кортикостероиды, кромолин натрия и недокромил; продолжительно действующие бронхолитические средства, такие как продолжительно действующие 2 агонисты и метилксантины, и модификаторы лейкотриена. Быстро успокаивающие лекарственные средства включают короткого действия 2-агонисты, антихолинергичекие средства и системные кортикостероиды. Существует много побочных эффектов, связанных с каждым из указанных лекарственных средств, и ни одно из них отдельно или в комбинации не способно предотвратить или полностью вылечить астму. Лекарственные средства против астмы включают, но не ограничиваясь ими, ингибиторы PDE-4,бронхолитические средства/2-агонисты, средства, открывающие K+-каналы, антагонисты VLA-4, антагонисты нейрокина, ингибиторы синтеза тромбоксана А 2 (ТХА 2), ксантины, антагонисты арахидоновой кислоты, ингибиторы 5-липоксигеназы, антагонисты рецептора для ТХА 2, антагонисты ТХА 2, ингибитор активирующих 5-липоксигеназу белков и ингибиторы протеаз. Бронхолитическое средство/2-агонисты являются классом соединений, вызывающих расширение бронхов или релаксацию гладкой мускулатуры. Бронхолитическое средство/2-агонисты включают, но не ограничиваясь ими, сальметерол, сальбутанол, альбутерол, тербуталин, D2522/формотерол, фенотерол, битолтерол, пирбутерол, метилксантины и орципреналин. 2-агонисты и бронхолитические средства продолжительного действия представляют собой соединения, которые используют в дополнение к противовоспалительной терапии для продолжительного предотвращения симптомов. 2-агонисты продолжительного действия включают, но не ограничиваясь ими, сальметерол и альбутерол. Такие соединения обычно используются в комбинации с кортикостероидами и, как правило, не используются без какойлибо противовоспалительной терапии. Они сопровождаются побочными эффектами, такими как тахикардия, тремор скелетной мускулатуры, гипокалемия и удлинение интервала QTc при передозировке. Метилксантины, включающие, например, теофиллин, использовались для продолжительного контроля и предотвращения симптомов. Данные соединения вызывают расширение бронхов, являющееся результатом ингибирования фосфодиэстеразы и, по-видимому, антагонизма в отношении аденозина. С таким типом соединений особой проблемой является связанная с дозой острая токсичность. В результате следует контролировать определенную концентрацию в сыворотке для того, чтобы объяснить токсичность и сузить терапевтический диапазон, возникающий из-за индивидуальных различий в метаболическом очищении. Побочные эффекты включают тахикардию, тахиаритмию, тошноту и рвоту, стимуляцию центральной нервной системы, головную боль, припадки, гематемезис, гипергликемию и гипокалемию. 2-агонисты короткого действия включают, но не ограничиваясь ими, альбутерол, битолтерол, пирбутерол и тербуталин. Некоторые побочные эффекты, связанные с введением 2-агонистов короткого действия, включают тахикардию, тремор скелетной мускулатуры, гипокалемию, увеличение молочной кислоты, головную боль и гипергликемию. Традиционные способы лечения или профилактика аллергии включали использование антигистаминных средств или десенсибилизационной терапии. Антигистаминные средства и другие лекарственные средства, которые блокируют действие химических медиаторов аллергической реакции, помогают контролировать тяжесть аллергических симптомов, но не предотвращают аллергическую реакцию и не оказывают влияния на последующие аллергические реакции. Десенсибилизационную терапию проводят путем назначения небольших доз аллергена, обычно с помощью инъекции под кожу, для того, чтобы индуцировать ответ IgG-типа против аллергена. Присутствие антител в виде IgG помогает нейтрализовать продукцию медиаторов, являющуюся, как полагают, результатом индукции антител в виде IgE. Первоначально субъекта подвергают лечению очень низкой дозой аллергена для того, чтобы избежать индукции тяжелой реакции, и дозу медленно увеличивают. Данный тип терапии является опасным, поскольку субъекту на самом деле вводят соединения, которые вызывают аллергическую реакцию, и результатом могут быть тяжелые аллергические реакции. Лекарственные средства против аллергии включают, но не ограничиваясь ими, антигистаминные средства, стероиды и индукторы простагландинов. Антигистаминные средства представляют собой соединения, которые нейтрализуют гистамин, высвобождаемый тучными клетками или базофилами. Дан- 12013375 ные соединения хорошо известны в данной области и обычно используются для лечения аллергии. Антигистаминные средства включают, но не ограничиваясь ими, астемизол, азеластин, бетатастин, буклизин,цетиризин, аналоги цетиризина, CS 560, деслоратадин, эбастин, эпинастин, фексофенадин, HSR 609, левокабастин, лоратидин, мизоластин, норастемизол, терфенадин и траниласт. Индукторы простагландинов представляют собой соединения, которые индуцируют активность простагландинов. Простагландины функционируют путем регуляции релаксации гладкой мускулатуры. Индукторы простагландинов включают, но без ограничения, S-5751. Лекарственные средства против астмы/аллергии также включают стероиды и иммуномодуляторы. Стероиды включают, но не ограничиваясь ими, беклометазон, флутиказон, триамцинолон, кортикостероиды и будезонид. Кортикостероиды включают, но не ограничиваясь ими, беклометазона дипропионат, будезонид,флунисолид, флутиказона пропионат и триамцинолона ацетонид. Хотя дексаметазон является кортикостероидом, обладающим противовоспалительным действием, его не используют на регулярной основе для лечения астмы/аллергии в ингаляционной форме, поскольку он сильно абсорбируется и имеет продолжительные супрессивные побочные эффекты при эффективной дозе. Однако дексаметазон можно использовать в соответствии с настоящим изобретением для лечения астмы/аллергии, поскольку при введении в комбинации с нуклеиновыми кислотами настоящего изобретения его можно вводить в низкой дозе для уменьшения побочных эффектов. Некоторые побочные эффекты, связанные с кортикостероидами, включают кашель, дисфонию, стоматит (кандидоз), и при более высоких дозах системные эффекты,такие как подавление надпочечников, остеопороз, подавление роста, утончение кожи и легкость возникновения кровоподтеков. BarnerPeterson, 1993, Am. Res. Respir. Dis. 148:S1-S26; Kamada A.K. et al.,1996, Am. J. Respir. Crit. Care Med. 153:1739-48. Системные кортикостероиды включают, но не ограничиваясь ими, метилпреднизолон, преднизолон и преднизон. Введение кортикостероидов сопровождается обратимыми изменениями метаболизма глюкозы, увеличением аппетита, задержкой жидкости, увеличением массы, изменением настроения, гипертензией, пептической язвой и асептическим некрозом кости. Данные соединения используют для предотвращения в течение короткого времени (3-10 дней) воспалительной реакции при недостаточно контролируемой персистированной астме. Они также функционируют при предотвращении в течение длительного времени симптомов при тяжелой персистированной астме для подавления и контроля, и даже реверсии воспаления. Некоторые побочные эффекты, связанные с продолжительным использованием, включают подавление системы надпочечников, подавление роста, утончение кожи, гипертензию, диабеты, синдром Кушинга, катаракты, мышечную слабость и в редких случаях снижение функции иммунной системы. Рекомендуется использование таких типов соединений в их самых низких эффективных дозах. Guidelinesfor diagnosis and management of astma; expert panel report to; NIH Publication No. 97-4051; July 1997. Иммуномодуляторы включают, но не ограничиваясь ими, группу, состоящую из противовоспалительных агентов, антагонистов лейкотриенов, мутеинов IL-4, растворимых рецепторов для IL-4, иммунодепрессантов (таких как вызывающая толерантность пептидная вакцина), антител против IL-4, антагонистов IL-4, антител против IL-5, слитых белков растворимый IL-13-рецептор/Fc, антител против IL-9, антагонистов CCR3, антагонистов CCR5, ингибиторов VLA-4 и супрессоров IgE. Модификаторы лейкотриенов часто используют для продолжительного контроля и предотвращения симптомов персистированной астмы средней степени тяжести. Модификаторы лейкотриенов функционируют в качестве антагонистов рецепторов лейкотриенов путем избирательной конкуренции за рецепторы для LTD-4 и LTE-4. Данные соединения включают, но не ограничиваясь ими, зафирлукаст и зилеутон в таблетках. Зилеутон в таблетках функционирует в качестве ингибитора 5-липоксигеназы. Прием таких лекарственных средств сопровождается повышением ферментов печени и в некоторых случаях обратимым гепатитом и гипербилирубинемией. Лейкотриены являются биохимическими медиаторами,высвобождаемыми из тучных клеток, инозинофилов и базофилов, которые вызывают сокращение гладкой мускулатуры дыхательных путей и увеличивают проницаемость сосудов, секрецию слизи и активируют клетки воспаления в дыхательных путях больных астмой. Другие иммуномодуляторы включают нейропептиды, которые, как было показано, обладают иммуномодулирующими свойствами. Функциональные исследования показали, что вещество Р, например,может оказывать влияние на функцию лимфоцитов с помощью опосредуемых специфическими рецепторами механизмов. Вещество Р так же, как было показано, модулирует отдельные реакции гиперчувствительности немедленного типа путем стимуляции образования получаемых из арахидоновой кислоты медиаторов в тучных клетках слизистой оболочки. McGillies J. et al., 1987, Fed Proc. 45:196-9. Вещество Р представляет собой нейропептид, впервые идентифицированный в 1931 г. Von Euler and Gaddum, J.Physiol (London) 72:74-87 (1931). Его аминокислотная последовательность сообщена Chang et al. в 1971,Chang M.M. et al., 1971, Nature New Biol 232:86-87. Иммунорегуляторная активность фрагментов вещества Р исследовалась Siemion I.Z. et al. (1990) Molec. Immunol. 27:887-890. Другой класс соединений представляет собой супрессоры IgE. Данные соединения включают пептиды или другие молекулы, обладающие способностью связываться с рецептором для IgE и, таким образом, предотвращать связывание специфического в отношении антигена IgE. Другим типом супрессораIgE является моноклональное антитело, направленное против связывающегося с рецептором для IgE района молекулы IgE человека. Следовательно, одним типом супрессора IgE является антитело противIgE или фрагмент такого антитела. Антитело против IgE разработано Genentech. Специалист в данной области сможет получить функционально активные фрагменты антитела в виде связывающихся пептидов, которые имеют такие же функции. Другим типом супрессора IgE являются полипептиды, способные блокировать связывание антител против IgE с рецепторами Fc на клеточной поверхности и вытеснять IgE из сайтов связывания, с которыми IgE уже связан. Одна проблема, связанная с супрессорами IgE, состоит в том, что многие молекулы не обладают способностью связываться с рецептором, соответствующей очень сильному взаимодействию между природной молекулой IgE и ее рецептором. Молекулы, обладающие такой способностью, имеют тенденцию связываться необратимо с рецептором. Однако такие вещества относительно токсичны, поскольку они могут связываться ковалентно и блокировать другие структурно схожие молекулы в организме. В этой связи, интерес представляет тот факт, что -цепь рецептора для IgE принадлежит большому семейству генов, в котором содержаться, например, несколько различных рецепторов для Fc IgG. Указанные рецепторы абсолютно необходимы для защиты организма, например, от бактериальных инфекций. Молекулы,активированные для ковалентного связывания, являются, кроме того, часто относительно нестабильными и, следовательно, они, вероятно, должны вводиться несколько раз в день и в таком случае в относительно высоких концентрациях, чтобы сделать возможным полное блокирование непрерывно возобновляемого пула рецепторов для IgG на тучных клетках и базофильных лейкоцитах. Кромолин натрия и недокромил используются в качестве лекарственных средств продолжительного действия для предотвращения первичных симптомов астмы, возникающих от физических нагрузок, или аллергических симптомов, возникающих от аллергенов. Полагают, что данные соединения блокируют ранние и поздние реакции на аллергены, мешая функции хлоридных каналов. Они также стабилизируют мембраны тучных клеток и ингибируют активацию и высвобождение медиаторов из инозинофилов и эпителиальных клеток. Для достижения максимальной пользы обычно требуется введение на протяжении четырех-шести недель. Антихолинергичекие средства обычно используют для ослабления острого бронхоспазма. Полагают, что данные соединения функционируют путем конкурентного ингибирования мускариновых холинергичеких рецепторов. Антихолинергичекие средства включают, но без ограничения, ипратропия бромид. Данные соединения реверсируют только холинергически опосредуемый бронхоспазм и не модифицируют какую-либо реакцию на антиген. Побочные эффекты включают сухость во рту и респираторную секрецию, возрастание стерторозного дыхания у некоторых индивидуумов и затуманенное зрение при попадании в глаза. Для использования in vitro и in vivo siРНК настоящего изобретения обычно используют в эффективном количестве. Используемый в данном описании термин "эффективное количество" относится, как правило, к любому количеству, достаточному для достижения желаемого биологического эффекта. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эффективное количество представляет собой клинически эффективное количество, причем клинически эффективным количеством является любое количество, которое достаточно для лечения субъекта, имеющего заболевание. Используемые в данном описании термины "лечить" и "лечение" относятся к уменьшению, устранению или предотвращению по меньшей мере одного признака или симптома заболевания у субъекта, имеющего заболевание или имеющего риск развития заболевания. Используемый в данном описании термин "субъект" относится к человеку или другому млекопитающему. В комбинации с представленными в данном описании методиками, путем выбора среди различных активных соединений и учитывая такие факторы, как активность, относительная биодоступность, масса тела пациента, тяжесть неблагоприятных побочных эффектов и предпочтительный способ введения,можно планировать эффективную профилактическую или терапевтическую схему лечения, которая не вызывает существенной токсичности и все еще является эффективной для лечения конкретного субъекта. Эффективное количество для любого конкретного применения может варьировать в зависимости от таких факторов, как заболевание или состояние, подвергаемое лечению, конкретная вводимая siРНК, размер субъекта или тяжесть заболевания или состояния. Специалист в данной области сможет эмпирически определить эффективное количество конкретной siРНК и/или другого терапевтического агента без необходимости чрезмерного экспериментирования. Обычно предпочтительно использовать максимальную дозу, т.е. наивысшую безопасную дозу согласно некоторым медицинским оценкам. Можно рассматривать множество доз в день для достижения системных уровней соединений. Соответствующие системные уровни можно определить с помощью, например, измерения у больного максимального или устойчивого уровня лекарственного средства в плазме. Термины "доза" и "дозировка" используются в данном описании взаимозаменяемо. Как правило, ежедневные пероральные дозы активных соединений составляют приблизительно от 0,01 до 1000 мг/кг в день. Ожидают, что пероральные дозы, находящиеся в диапазоне 0,5-50 мг/кг, для одного или нескольких введений в день дадут желаемые результаты. Дозы можно регулировать соответствующим образом для достижения желаемых уровней лекарственных средств, местных или системных,- 14013375 в зависимости от способа введения. Например, ожидают, что ежедневная доза при внутривенном введении будет на порядок до нескольких порядков ниже. В том случае, если при таких дозах реакция субъекта является недостаточной, можно использовать даже более высокие дозы (или более высокие эффективные дозы, доставляемые с помощью отличного, более локализированного пути доставки) в такой степени, которую может переносить пациент. Можно рассматривать множество доз в день для достижения соответствующих системных уровней соединений. Для любого описанного в данном описании соединения терапевтически эффективное количество можно определить на моделях животных. Терапевтически эффективную дозу можно также определить по данным от человека для siРНК, которая была протестирована на людях, и по соединениям, для которых известно, что они проявляют схожую фармакологическую активность, таким как другие родственные активные агенты. Более высокие дозы могут потребоваться для парентерального введения. Применяемую дозу можно регулировать на основе относительной биодоступности и активности вводимого соединения. Регулирование дозы для достижения максимальной эффективности на основе способов,описанных выше, и других способов, хорошо известных в данной области, находится в компетенции специалиста в данной области. Для того чтобы повысить доставку siРНК в клетки, siРНК необязательно можно представить, приготовить или иным способом объединить с катионным липидом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения таким катионным липидом является DOTAR. Для применения в терапии эффективное количество siРНК можно вводить субъекту любым способом, с помощью которого siРНК доставляется на желаемую поверхность. Введение фармацевтической композиции настоящего изобретения можно осуществить с помощью любого способа, известного специалистам в данной области. Предпочтительные способы введения включают, но, не ограничиваясь ими,оральный, парентеральный, внутримышечный, интраназальный, подъязычный, внутритрахеальный, ингаляционный, глазной, вагинальный и ректальный.siРНК настоящего изобретения можно доставить к конкретной ткани, типу клетки или иммунной системе, или к тому и другому, с помощью вектора. В самом широком смысле "вектор" представляет собой любой носитель, способный облегчать перенос композиции к клеткам-мишеням. Вектор обычно транспортирует siРНК, антитело, антиген и/или специфическое в отношении заболевания лекарственное средство к клеткам-мишеням с уменьшенной деградацией относительно степени деградации, которая происходит в отсутствие вектора. Как правило, используемые в настоящем изобретении векторы делят на два класса: биологические векторы и химические/физические векторы. Биологические векторы и химические/физические векторы используют для доставки и/или поглощения терапевтических агентов настоящего изобретения. Используемый в данном описании термин "химический/физический вектор" относится к природной или синтетической молекуле, отличной от молекул, получаемых из бактериологических или вирусных источников, способной доставлять siРНК и/или другое лекарственное средство. Предпочтительный химический/физический вектор настоящего изобретения представляет собой коллоидную дисперсную систему. Коллоидные дисперсные системы включают системы на основе липидов, включая эмульсии типа масло в воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Предпочтительной коллоидной системой настоящего изобретения является липосома. Липосомы представляют собой искусственные мембранные емкости, которые используются в качестве векторов доставки in vivo или invitro. Показано, что в большие однослойные везикулы (LUV), размер которых находится в диапазоне 0,24 мкм, можно инкапсулировать большие макромолекулы. РНК, ДНК и интактные вирионы можно инкапсулировать в водное содержимое и доставлять к клеткам в биологически активной форме. Fraley et al.,1981, Trends Biochem. Sci. 6:77. Липосомы можно нацелить на конкретную ткань путем сочетания липосомы со специфическим лигандом, таким как моноклональное антитело, сахар, гликолипид или белок. Лиганды, которые можно использовать для нацеливания липосомы на клетку иммунной системы, включают, но, не ограничиваясь ими, интактные молекулы или их фрагменты, которые взаимодействуют со специфическими в отношении иммунных клеток рецепторами и молекулами, такие как антитела, которые взаимодействуют с маркерами клеточной поверхности клеток иммунной системы. Такие лиганды можно легко идентифицировать с помощью анализов связывания, хорошо известных специалистам в данной области. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения липосому можно нацелить на рак путем ее сочетания с одним из иммунотерапевтических антител, обсуждаемых выше. Кроме того, вектор можно сочетать с нацеленным на ядро пептидом, который будет направлять вектор в ядро клетки-хозяина. Липидные композиции для трансфекции коммерчески доступны от QIAGEN, например, как EFFECTENE (нелипосомальный липид со специальным ДНК-конденсирующим усилителем) и SUPERFECT (новая действующая дендримерная технология). Липосомы коммерчески доступны от Gibco BRL, например, как LIPOFECTIN и LIPOFECTACE,которые образованы из катионных липидов, таких как N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,Nтриметиламмонийхлорид (DOTMA) и диметилдиоктадециламмонийбромид (DDAB). Способы получе- 15013375 ния липосом хорошо известны в данной области и описаны во многих публикациях. Обзор липосом также представлен Gregoriadis G. (1985) Trends Biotechnol. 3:235-241. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения носитель представляет собой биосовместимую микрочастицу или имплантат, который подходит для имплантации или введения являющемуся млекопитающим реципиенту. Примеры биоразрушаемых имплантатов, которые применимы в соответствии с данным способом, описаны в опубликованной международной заявке WO 95/24929, озаглавленной "Polymeric Gene Delivery System". B WO 95/24929 описана биосовместимая, предпочтительно биоразрушаемая полимерная матрица для вмещения экзогенного гена под контролем соответствующего промотора. Полимерную матрицу можно использовать для достижения непрерывного высвобождения терапевтического агента у субъекта. Полимерная матрица предпочтительно находится в форме микрочастиц, таких как микросферы (в которых нуклеиновая кислота и/или другой терапевтический агент диспергированы по всей твердой полимерной матрице) или микрокапсулы (в которых нуклеиновая кислота и/или другой терапевтический агент хранятся в ядре, покрытом полимерной оболочкой). Другие формы полимерной матрицы для размещения терапевтического агента включают пленки, покрытия, гели, имплантаты и стенты. Размер и состав устройства в виде полимерной матрицы выбирают таким образом, чтобы получить в результате благоприятную кинетику высвобождения в ткани, в которую вводят матрицу. Размер полимерной матрицы, кроме того, выбирают в соответствии со способом доставки, который должен применяться, обычно инъекцией в ткань или введением суспензии с помощью аэрозоля в области носа и/или легких. Когда используется аэрозольный путь, полимерную матрицу и нуклеиновую кислоту и/или другой терапевтический агент предпочтительно включать в носитель в виде поверхностно-активного вещества. Композицию полимерной матрицы можно выбрать таким образом, чтобы она имела благоприятную скорость деградации, а также чтобы образовывался материал, который является биоадгезивным, для дополнительного увеличения эффективности переноса при введении матрицы на поверхность носа и/или легкого, которая подверглась повреждению. Композицию матрицы также можно выбрать таким образом, чтобы она не разрушалась, а быстро высвобождалась посредством диффузии на протяжении продолжительного периода времени. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления нуклеиновую кислоту вводят субъекту через имплантат, в то время как другой терапевтический агент вводят в экстренном порядке. Биосовместимые микросферы, которые подходят для доставки, такой как доставка в ротовую полость или слизистые оболочки, раскрыты Chickering et al. (1996) Biotech. Bioeng. 52:96-101 и Mathiowitz et al.(1997) Nature 386:410-414 и в заявке РСТ WO 97/03702. Как бионеразрушаемые, так и биоразрушаемые полимерные матрицы можно использовать для доставки субъекту нуклеиновой кислоты и/или другого терапевтического агента. Предпочтительными являются биоразрушаемые матрицы. Такие полимеры могут быть природными или синтетическими полимерами. Полимеры выбирают на основе периода времени, на протяжении которого желательно высвобождение, обычно порядка от нескольких часов до года или дольше. Как правило,наиболее желательным, в частности, для агентов, являющихся нуклеиновыми кислотами, является высвобождение на протяжении периода времени в пределах от нескольких часов до 3-12 месяцев. Полимер необязательно находится в форме гидрогеля, который может абсорбировать приблизительно до 90% его массы в воде и, кроме того, необязательно поперечно сшит с поливалентными ионами или другими полимерами. Представляющие особый интерес биоадгезивные полимеры включают биоразрушаемые гидрогели,описанные H.S. Sawhney, C.P. Pathal и J.A. Hubell в Macromolecules, 1993, 26:581-587, рекомендации которых включены в данное описание. Они включают полигиалуроновые кислоты, казеин, желатин, глутин, полиангидриды, полиакриловую кислоту, альгинат, хитозан, поли(метилметакрилаты), поли(этилметакрилаты), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат). Также может быть желательным использование уплотняющих агентов. Уплотняющие агенты также можно использовать отдельно или в комбинации с биологическим или химическим/физическим вектором. Используемый в данном описании термин "уплотняющий агент" относится к агенту, такому как гистон, который нейтрализует отрицательные заряды на нуклеиновой кислоте и, таким образом, делает возможным уплотнение нуклеиновой кислоты в тонкоизмельченную гранулу. Уплотнение нуклеиновой кислоты облегчает поглощение нуклеиновой кислоты клеткой-мишенью. Уплотняющие агенты можно использовать отдельно, т.е. для доставки нуклеиновой кислоты в форме, которая наиболее эффективно поглощается клеткой или более предпочтительно в комбинации с одним или несколькими из описанных выше векторов. Другие примеры композиций, которые можно использовать для облегчения поглощения нуклеиновой кислоты, включают фосфат кальция и другие химические медиаторы внутриклеточного транспорта,микроинжекторные композиции, композиции для электропорации и гомологичной рекомбинации (например, для интеграции нуклеиновой кислоты в предварительно выбранное местонахождение в пределах хромосомы клетки-мишени).- 16013375 Соединения можно вводить отдельно (например, в солевом растворе или буфере) или с использованием любого вектора доставки, известного в данной области. Например, описаны следующие средства доставки: кохлеаты (Gould-Fogerite et al., 1994, 1996); эмульсомы (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1997);al., 1999, Michalek et al., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); живые бактериальные векторы (например,Salmonella, Escherichia coli, бациллы Кальметта-Гирена, Shigella, Lactobacillus) (Hone et al., 1996, Pouwelset al., 1998, Chatfield et al., 1993, Stover et al., 1991, Nugent et al., 1998), живые вирусные векторы (например, вирус осповакцины, аденовирус, вирус простого герпеса) (Gallichan et al., 1993, 1995, Moss et al.,1996, Nugent et al., 1998, Flexner et al., 1988, Morrow et al., 1999); микросферы (Gupta et al., 1998, Jones etal., 1996, Maloy et al., 1994, Moore et al., 1995, O'Hagan et al., 1994, Eldridge et al., 1989); вакцины на основе нуклеиновых кислот (Fynan et al., 1993, Kuklin et al., 1997, Sasaki et al., 1998, Okada et al., 1997, Ishii etal., 1998); полимерные кольца (Wyatt et al., 1998); протеосомы (Vancott et al., 1998, Lowell et al., 1988,1996, 1997); натрия фторид (Hashi et al., 1998); трансгенные растения (Tacket et al., 1998, Mason et al.,1998, Haq et al., 1995); виросомы (Gluck et al., 1992, Mengiardi et al., 1995, Cryz et al., 1998) и вирусоподобные частицы (Jiang et al., 1999, Leibl et al., 1998). Композиции настоящего изобретения вводят в фармацевтически приемлемых растворах, которые могут в заведенном порядке содержать фармацевтически приемлемые концентрации солей, буферных агентов, консервантов, совместимых носителей, адъювантов и необязательно других терапевтических ингредиентов. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей, разбавителей или инкапсулирующих веществ, которые подходят для введения человеку или другому позвоночному животному. Термин "носитель" означает органический или неорганический ингредиент, природный или синтетический, с которым объединяют активный ингредиент для облегчения применения. Компоненты фармацевтических композиций также можно смешивать с компонентами настоящего изобретения и друг с другом таким образом, чтобы не было взаимодействия,которое может существенно ослабить желаемую фармакологическую эффективность. Для орального введения соединения (т.е. siРНК и необязательно другие терапевтические агенты) можно легко приготовить в виде лекарственного средства комбинированием активного(ых) компонента(ов) с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области. Такие носители дают возможность приготовить соединения настоящего изобретения в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и т.п. для орального введения субъекту, подвергаемому лечению. Фармацевтические препараты для орального применения можно получить в виде твердых эксципиентов, необязательно измельчая полученную в результате смесь и перерабатывая смесь гранул, после добавления подходящих вспомогательных веществ, если желательно, с получением ядер таблеток или драже. Подходящими эксципиентами являются, в частности, такие наполнители, как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; такие целлюлозные препараты, как, например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза и/или поливинилпирролидон (PVP). Если желательно, можно добавить дезинтегрирующие агенты, такие как поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия. Необязательно пероральные композиции можно также приготовить в солевом растворе или буферах, например, EDTA, для нейтрализации внутренних кислотных условий, или их можно вводить без каких-либо носителей. Также специально предусмотрены пероральные дозированные формы вышеуказанного соединения или соединений. Соединение или соединения могут быть химически модифицированы таким образом,чтобы оральная доставка производного была эффективной. Как правило, предусмотренная химическая модификация представляет собой присоединение к самой молекуле соединения по меньшей мере одной составляющей, которая делает возможным (а) ингибирование протеолиза и (b) поступление в кровоток из желудка или кишечника. Также желательным является увеличение общей стабильности соединения или соединений и увеличение времени циркуляции в организме. Примеры таких составляющих включают полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и полипролин. Abuchowski and Davis, 1981, "SolublePolymer-Enzyme Adducts" In: Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York,NY, pp. 367-383; Newmark et al., 1982, J. Appl. Biochem. 4:185-189. Другими полимерами, которые можно использовать, являются поли-1,3-диоксолан и поли-1,3,6-триоксолан. Предпочтительными для фармацевтического применения, как указано выше, являются составляющие полиэтиленгликоля. Для компонента (или производного) местом высвобождения может быть желудок, тонкая кишка(двенадцатиперстная, тощая или подвздошная) или толстая кишка. Специалист в данной области располагает приемлемыми рецептурами композиций, которые не растворяются в желудке, но высвобождают материал в двенадцатиперстной кишке или в каком-либо другом месте в кишечнике. Предпочтительно,чтобы высвобождение было лишено вредных воздействий желудочной среды или с помощью защитыsiРНК (или производного), или с помощью высвобождения биологически активного материала после желудочной среды, например в кишечнике. Для гарантии полной устойчивости к желудочной среде существенным является покрытие, непроницаемое по меньшей мере при рН 5,0. Примерами наиболее общих инертных ингредиентов, которые используются в качестве энтеросолюбильных покрытий, являются тримеллитат ацетата целлюлозы(CAT), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (НРМСР), НРМСР 50, НРМСР 55, поливинилацетатфталат (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, фталат ацетата целлюлозы (CAP), Eudragit L, Eudragit S и Shellac. Такие покрытия можно использовать в виде смешанных пленок. Для таблеток можно также использовать покрытие или смесь покрытий, которые не предназначены для защиты против желудочной среды. Такие покрытия включают сахарные покрытия или покрытия,которые облегчают глотание таблетки. Капсулы могут состоять из твердой оболочки (такой как желатин) для доставки сухого терапевтического агента, т.е. порошка; для жидких форм можно использовать мягкую желатиновую оболочку. Материалом крахмальных капсул может быть плотный крахмал или другая съедобная бумага. Для пилюль, лепешек, формованных таблеток и таблеток в виде порошков можно использовать методику влажного уплотнения. Терапевтический агент может быть включен в композицию в виде множества тонкоизмельченных частиц в форме гранул с размером частиц, составляющим приблизительно 1 мм. Композиция материала для введения в капсулы также может быть в виде порошка, слегка прессованных включений или даже в виде таблеток. Терапевтический агент можно приготовить с помощью прессования. Можно включить красители или корригенты. Например, siРНК (или производное) можно приготовить в виде лекарственного средства (например, с помощью инкапсуляции в липосомы или микросферы) и затем включить в съедобный продукт, такой как охлажденный напиток, содержащий красители или корригенты. Терапевтический агент можно развести или увеличить его объем с помощью инертного материала. Такие разбавители могут включать углеводороды, в частности, маннит, -лактозу, безводную лактозу,целлюлозу, сахарозу, модифицированные декстраны и крахмал. Можно также использовать в качестве наполнителей некоторые неорганические соли, включая трифосфат кальция, карбонат магния и хлорид натрия. Некоторыми коммерчески доступными разбавителями являются Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500,Emcompress и Avicell. В композицию терапевтического агента в твердой дозированной форме можно включить дезинтегрирующие вещества. Материалы, используемые в качестве дезинтегрирующих веществ, включают, но не ограничиваясь ими, крахмал, включая коммерческие дезинтегрирующие вещества на основе крахмала,Explotab. Можно использовать гликолят натрийкрахмала, Amberlite, натрийкарбоксиметилцеллюлозу,ультраамилопектин, альгинат натрия, желатин, апельсиновую корку, кислую карбоксиметилцеллюлозу,природный пористый материал и бентонит. Другой формой дезинтегрирующих веществ являются нерастворимые катионообменные смолы. Камеди в виде порошка можно использовать в качестве дезинтегрирующих веществ и в качестве связующих веществ, и они могут включать камеди в виде порошка, такие как агар, камедь карайи или трагакант. В качестве дезинтегрирующих веществ используют также альгиновую кислоту и ее натриевую соль. Для удерживания вместе терапевтического агента с образованием твердой таблетки можно использовать связующие агенты, и они включают природные продукты, такие как аравийская камедь, трагакант, крахмал и желатин. Другие связующие агенты включают метилцеллюлозу (МС), этилцеллюлозу(ЕС) и карбоксиметилцеллюлозу (CMC). Как поливинилпирролидон, так и гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС) можно использовать в спиртовых растворах для грануляции терапевтического агента. В композицию терапевтического агента можно включить антифрикционный агент для предотвращения прилипания во время процесса приготовления. Лубриканты можно использовать в виде слоя между терапевтическим агентом и стенкой формы, и они включают, но не ограничиваясь ими, стеариновую кислоту, включая ее соли магния и кальция, политетрафторэтилен (PTFE), жидкий парафин, растительные масла и воски. Можно также использовать растворимые лубриканты, такие как лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, полиэтиленгликоль различной молекулярной массы, Carbowax 4000 и 6000. Можно добавить способствующие скольжению вещества (глиданты), которые могут улучшать характеристики текучести лекарственного средства во время приготовления и помочь перегруппировке во время прессования. Способствующие скольжению вещества могут включать крахмал, тальк, пирогенный кремнезем и гидрированный силикоалюминат. Для помощи растворению терапевтического агента в водной среде можно добавить поверхностноактивное вещество в качестве смачивающего агента. Поверхностно-активные вещества могут включать анионные детергенты, такие как лаурилсульфат натрия, сульфосукцинат диоктилнатрия и сульфонат диоктилнатрия. Можно использовать катионные детергенты, и они могут включать бензальконийхлорид или бензетонийхлорид. Список возможных неионных детергентов, которые могут быть включены в композицию в качестве поверхностно-активных веществ, включает лауромакрогол 400, полиоксил 40 стеарат, полиоксиэтилен гидрированное касторовое масло 10, 50 и 60, моностеарат глицерина, полисорбат 40, 60, 65 и 80, сложный эфир жирных кислот и сахарозы, метилцеллюлозу и карбоксиметилцеллюлозу.- 18013375 Такие поверхностно-активные вещества могут быть представлены в композиции siРНК или ее производного или отдельно, или в смеси в различных соотношениях. Фармацевтические препараты, которые можно использовать перорально, включают выдерживающие давление капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие герметизированные капсулы, изготовленные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Выдерживающие давление капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связующими веществами, таким как крахмалы, и/или лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, могут быть добавлены стабилизаторы. Можно также использовать микросферы, полученные для орального введения. Такие микросферы подробно описаны в данной области. Все композиции для орального введения должны быть в дозах, подходящих для такого введения. Для трансбуккального введения композиции могут принимать форму таблеток или лепешек, приготовленных традиционным способом. Для введения с помощью ингаляции соединения, используемые в соответствии с настоящим изобретением, можно обычным образом доставить в форме аэрозольного спрея из упаковок, в которых создано повышенное давление, или распылителя с использованием подходящего диспергатора, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под повышенным давлением единицу дозы можно определить с помощью вентиля для доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи, например, из желатина, для использования в ингаляторе или инсульффляторе можно изготовить таким образом, чтобы они содержали смесь в виде порошка соединения и подходящего основания для порошка, такого как лактоза или крахмал. Также в данном изобретении предусмотрена доставка siРНК (или его производных) в легкие. SiРНК(или производное) доставляется в легкие млекопитающего при вдыхании и перемещается через эпителиальную выстилку легких в кровоток. Другие сообщения вдыхаемых молекул включают Adjei et al., 1990,Pharmaceutical Research, 7:565-569; Adjei et al., 1990, International Journal of Pharmaceutics, 63:135-144al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1145-1146 (а-1-протеиназа); Oswein et al., 1990, "Aerosolization of Proteins",Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, March, (рекомбинантный гормон роста человека); Debs et al., 1988, J. Immunol. 140:3482-3488 (интерферон-гамма и фактор альфа некроза опухоли) и Platz et al., патент США 5284656 (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). Способ и композиция для доставки в легкие лекарственных средств для системного эффекта описаны в патенте США 5451569, выданном 19 сентября 1995 г. на имя Wong et al. Для использования на практике настоящего изобретения предусмотрен широкий диапазон механических устройств, предназначенных для доставки в легкие терапевтических продуктов, включающих, но не ограничиваясь ими, распылители, ингаляторы отмеренной дозы и порошковые ингаляторы, все из которых известны специалистам в данной области. Некоторыми конкретными примерами коммерчески доступных устройств, подходящих для осуществления на практике настоящего изобретения, являются распылитель Ultravent, изготовляемый Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missori; распылитель Acorn II, изготовляемый Marquest Medical Products, Englewood,Colorado; ингалятор отмеренной дозы Ventolin, изготовляемый Glaxo Inc., Research Triangle Park, NorthCarolina; и порошковый ингалятор Spinhaler, изготовляемый Fisons Corp., Bedford, Massachusetts. Для всех таких устройств требуется использовать композиции, подходящие для диспергированияsiРНК (или производного). Как правило, такие композиции являются специфическими в отношении типа используемого устройства и могут включать использование соответствующего материала в виде диспергатора в дополнение к обычным разбавителям, адъювантам и/или носителям, применяемым в терапии. Также предусмотрено использование липосом, микрокапсул или микросфер, комплексов включения или других типов носителей. Химически модифицированные siРНК также могут быть приготовлены в различных композициях в зависимости от типа химической модификации или типа используемого устройства. Композиции, пригодные для использования с распылителем, или струйным, или ультразвуковым,обычно включают siРНК (или производное), растворенную в воде в концентрации, составляющей приблизительно от 0,1 до 25 мг биологически активной siРНК на 1 мл раствора. Композиция может также включать буфер или простой сахар (например, для стабилизации siРНК и регуляции осмотического давления). Композиция для распылителя может также содержать поверхностно-активное вещество для уменьшения или предотвращения индуцированной на поверхности агрегации siРНК, вызванной атомизацией раствора при образовании аэрозоля. Композиции, используемые в устройствах в виде ингалятора отмеренной дозы, включают очень хорошо разделяемый порошок, содержащий siРНК (или производное), суспендированный в диспергаторе с помощью поверхностно-активного вещества. Диспергатором может быть любой общепринятый матери- 19013375 ал, используемый для данной цели, такой как хлорфторуглерод, гидрохлорфторуглерод, гидрофторуглерод или углеводород, включая трихлорфторметан, дихлордифторметан, дихлортетрафторэтанол и 1,1,1,2 тетрафторэтан или их комбинация. Подходящие поверхностно-активные вещества включают триолеат сорбитана и соевый лецитин. В качестве поверхностно-активного вещества может использоваться олеиновая кислота. Композиции для рассеивания из устройства в виде порошкового ингалятора содержат очень хорошо разделяемый сухой порошок, содержащий siРНК (или производное), и может также включать наполнитель, такой как лактоза, сорбит, сахароза или маннит, в количествах, которые облегчают рассеивание порошка из устройства, например, 50-90 мас.% композиции. siРНК (или производное) наиболее выгодно получать в форме частиц со средним размером, составляющим менее 10 мкм (микрон), наиболее предпочтительно 0,5-5 мкм для самой эффективной доставки в дистальные участки легких. Также предусматривается назальная доставка фармацевтической композиции. Назальная доставка делает возможным поступление фармацевтической композиции настоящего изобретения в кровоток непосредственно после введения терапевтического продукта в нос, без необходимости депонирования продукта в легком. Композиции для назальной доставки включают композиции с декстраном или циклодекстраном. Для назального введения используемым устройством является небольшой твердый флакон, к которому присоединен разбрызгиватель отмеренной дозы. В одном из вариантов осуществления отмеренная доза доставляется с помощью втягивания раствора фармацевтической композиции настоящего изобретения в камеру точно определенного объема, которая имеет отверстие, которому приданы нужные размеры для распыления аэрозольной композиции путем образования брызг, когда жидкость в камере сжата. Камеру сжимают для введения фармацевтической композиции настоящего изобретения. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения камера представляет собой поршневое устройство. Такие устройства коммерчески доступны. Альтернативно, используют пластиковый сжимаемый флакон с отверстием, которому приданы нужные размеры для распыления аэрозольной композиции путем образования брызг при сжатии. Отверстие обычно находится наверху флакона, и верх обычно является тонким и удлиненным для того, чтобы частично входить в носовые проходы для эффективного введения аэрозольной композиции. Предпочтительно назальный ингалятор обеспечивает отмеренное количество аэрозольной композиции для введения отмеренной дозы лекарственного средства. Соединения, когда желательно доставить их системно, можно приготовить для парентерального введения с помощью инъекции, например, болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Композиции для инъекции могут быть представлены в единичной дозированной форме, например, в ампулах или в контейнерах с множеством доз, с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и могут содержать формообразующие агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активных компонентов в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных компонентов можно приготовить в виде соответствующих масляных суспензий для инъекции. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, или триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекции могут содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, увеличивающие растворимость соединений, которые дают возможность приготовить растворы с высокой концентрацией. Альтернативно, активные компоненты могут быть в форме порошка для объединения с подходящим носителем, например, стерильной свободной от пирогенов водой, перед применением. Из соединений можно также приготовить ректальные или вагинальные композиции, такие как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие обычные основания для суппозиториев,такие как масло какао или другие глицериды. Помимо описанных выше композиций из соединений можно приготовить препараты-депо. Такие композиции продолжительного действия можно приготовить с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменных смол, или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли. Фармацевтические композиции также могут содержать подходящие носители или эксципиенты,твердые или гелевой фазы. Примеры таких носителей или эксципиентов включают, но, не ограничиваясь ими, карбонат кальция, фосфат кальция, различные сахара, крахмалы, производные целлюлозы, желатин и полимеры, такие как полиэтиленгликоли. Подходящими жидкими или твердыми формами фармацевтических препаратов являются, например, водные или солевые растворы для ингаляции, микроинкапсулированные, помещенные внутрь кохлеат, нанесенные на микроскопические частицы из золота, содержащиеся в липосомах, распыляемые,аэрозоли, гранулы для имплантации в кожу или высушенные на остром предмете, делающем царапины в- 20013375 коже. Фармацевтические композиции также включают гранулы, порошки, таблетки, покрытые таблетки,(микро)капсулы, суппозитории, сиропы, эмульсии, суспензии, кремы, капли или препараты с длительным высвобождением активных компонентов, в которых обычно используют, как описано выше, эксципиенты и добавки и/или вспомогательные вещества, такие как дезинтегрирующие вещества, связующие вещества, агенты для покрытия, агенты, вызывающие набухание, лубриканты, корригенты, подсластители или солюбилизаторы. Фармацевтические композиции подходят для применения в различных системах доставки лекарственного средства. С целью краткого обзора способов доставки лекарственных средств см. публикацию Langer, Science 249:1527-1533, 1990, которая включена в данное описание посредством ссылки.siРНК и необязательно другие терапевтические агенты можно вводить сами по себе (чистыми) или в форме терапевтически приемлемых солей. При использовании в медицине соли должны быть фармацевтически приемлемыми, но фармацевтически неприемлемые соли могут быть подходящим образом использованы для получения их приемлемых солей. Такие соли включают, но не ограничиваясь ими,соли, полученные из следующих кислот: хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной, азотной,фосфорной, малеиновой, уксусной, салициловой, паратолуолсульфокислоты, винной, лимонной, метансульфокислоты, муравьиной, малоновой, янтарной, нафталин-2-сульфокислоты и бензолсульфокислоты. Также такие соли могут быть получены в виде солей щелочных или щелочно-земельных металлов, таких как соли натрия, калия или кальция, и карбоксильной группы. Подходящие буферные агенты включают уксусную кислоту и соль (1-2% мас./об.); лимонную кислоту и соль (1-3% мас./об.); борную кислоту и соль (0,5-2,5% мас./об.); и фосфорную кислоту и соль(0,8-2% мас./об.). Подходящие консерванты включают бензальконийхлорид (0,003-0,03% мас./об.); хлорбутанол (0,3-0,9% мас./об.); парабены (0,01-0,25% мас./об.) и тимеросал (0,004-0,02% мас./об.). Фармацевтические композиции настоящего изобретения содержат эффективное количество siРНК,и необязательно один или несколько дополнительных терапевтических агентов можно включить в фармацевтически приемлемом носителе. Терапевтический(ие) агент(ы), включающие, в частности, но не ограничиваясь ими, siРНК, могут быть предоставлены в форме частиц. Используемый в данном описании термин "частицы" означает нано- или микрочастицы (или в некоторых случаях более крупные), которые состоят полностью или частично из siРНК или другого терапевтического агента(ов), описанного в данном описании. Частицы могут содержать терапевтический агент(ы) в ядре, окруженном оболочной, включая энтеросолюбильную оболочку. Терапевтический агент(ы) может быть также диспергирован во всей частице. Терапевтический агент(ы) может быть адсорбирован на частицах. Частицы могут обладать кинетикой высвобождения любого порядка, включая высвобождение нулевого порядка, высвобождение первого порядка, высвобождение второго порядка, замедленное высвобождение, непрерывное высвобождение, немедленное высвобождение или любую их комбинацию, и т.д. Помимо терапевтического агента(ов) частицы могут включать любой из материалов, которые обычно используются в области фармации и медицине, включая разрушаемый, неразрушаемый, биоразрушаемый или бионеразрушаемый материал или их комбинации. Частицы могут быть в форме микрокапсул, которые содержат siРНК в растворе или в полурастворенном состоянии. Частицы могут быть фактически любой формы. При получении частиц для доставки терапевтического агента(ов) можно использовать как бионеразрушаемый, так и биоразрушаемый полимерный материал. Такие полимеры могут быть природными или синтетическими полимерами. Полимер выбирают на основе периода времени, на протяжении которого желательно высвобождение. Представляющие особый интерес биоадгезивные полимеры включают биоразрушаемые гидрогели, описанные H.S. Sawhney, С.Р. Pathak and J.A. Hubell in Macromolecules,1993, 26:581-587, рекомендации которых включены в данное описание. Они включают полигиалуроновые кислоты, казеин, желатин, глутин, полиангидриды, полиакриловую кислоту, альгинат, хитозан, поли(метилметакрилаты), поли(этилметакрилаты), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат),поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат) и поли(октадецилакрилат). Терапевтический агент(ы) может содержаться в системах контролируемого высвобождения. Термин "контролируемое высвобождение", как подразумевается, относится к любой содержащей лекарственное средство композиции, в которой контролируется способ и профиль высвобождения из нее лекарственного средства. Это относится к композициям как немедленного, так и не немедленного высвобождения, при этом композиции не немедленного высвобождения включают, но не ограничиваясь ими, композиции непрерывного высвобождения и замедленного высвобождения. Используемый в его обычном значении термин "непрерывное высвобождение" (на который также приводится ссылка как на "длительное высвобождение") относится к композиции лекарственного средства, которая обеспечивает постепенное высвобождение лекарственного средства на протяжении длительного периода времени и которая предпочтительно, хотя и необязательно, приводит, по существу, к постоянным уровням лекарственного средства в крови на протяжении длительного периода времени. Используемый в его обычном значении термин "замедленное высвобождение" относится к композиции лекарственного средства, для которой существует задержка во времени между введением композиции и высвобождением из нее лекарственно- 21013375 го средства. Замедленное высвобождение может включать или не включать постепенное высвобождение лекарственного средства на протяжении длительного периода времени и, следовательно, может быть или не быть "непрерывным высвобождением". Для лечения хронических состояний может, в частности, подходить использование имплантата с длительным непрерывным высвобождением. Используемый в данном описании термин "длительное" высвобождение означает, что имплантат создан и аранжирован для доставки терапевтических уровней активного ингредиента на протяжении по меньшей мере 7 дней и предпочтительно 30-60 дней. Имплантаты с длительным непрерывным высвобождением хорошо известны специалистам в данной области и включают некоторые из систем высвобождения, описанных выше. Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые никоим образом не следует рассматривать как ограничивающие. Содержание любой приведенной в данном описании ссылки (включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные заявки на патент и находящиеся в процессе одновременного рассмотрения заявки) специально включено, таким образом, посредством ссылки во всей их полноте. Примеры Пример 1. Получение одноцепочечных и двухцепочечных разновидностей РНК. Ряд пар синтетических одноцепочечных олигорибонуклеотидов (ssOPH), отобранных для использования в качестве siРНК, полученных из последовательностей генов MAPK2 (Erk2) и ламина АС (табл. 1),получали, используя общепринятые методы и реагенты. Для использования в качестве двухцепочечныхsiРНК одноцепочечные члены каждой пары подвергали отжигу в подходящих термических условиях с последующим отделением двухцепочечной siРНК от остальных ssOPH с использованием ВЭЖХ. Последовательности перечислены в табл. 1, где каждый нуклеотид является немодифицированным рибонуклеотидом, и каждая межнуклеотидная связь является фосфодиэфирной, за исключением указанных. Следует понимать, что структуры двухцепочечных siРНК включали 0-2 неспаренных нуклеотидов (т.е. одноцепочечные выступы) на одном или обоих концах. Таблица 1 РНК-последовательность для siРНК Нуклеотиды и/или межнуклеотидные связи между нуклеотидами, показанные жирным шрифтом, были модифицированы и выбраны из 2'-модификаций сахара, как описано в данном описании, и стабилизированной связи между двумя 3'-концевыми нуклеотидами. Пример 2. Модификация смысловой цепи двухцепочечной siРНК ингибирует иммуностимуляцию,вызванную siРНК. РВМС человека выделяли из цельной крови здоровых индивидуумов с помощью центрифугирования при градиенте плотности фиколла-гипака. Выделенные РВМС затем помещали в индивидуальные лунки многолуночных культуральных планшетов в подходящей для культивирования среде. В индивидуальные лунки добавляли различные двухцепочечные РНК в диапазоне концентрации (приблизительно от 2 нМ до приблизительно 0,5 мкМ) в присутствии DOTAR, и клетки инкубировали в течение 24 ч. Супернатанты культур собирали после инкубации и анализировали на IFN- и IL-12p40, используя подходящий ELISA. Различными тестируемыми двухцепочечными siРНК были MARK2, MAPK2 Ехр 27,MAPK2 Ехр 30, ламин АС, ламин АС Ехр 27 и ламин АС Ехр 30. Результаты продемонстрированы на фиг. 1. Данные представлены как среднее арифметическое SEM. Как показано на фиг. 1, включение нуклеотидов, имеющих сахар с 2'-модификацией, в смысловую цепь данных siРНК удивительно и значимо уменьшает количество IFN- и, в частности, IL-12p40 секретируемых РВМС после инкубации в течение 24 ч с siРНК, по сравнению с контролем.- 22013375 Пример 3. Модификация смысловой цепи двухцепочечной siРНК достаточна для ингибирования иммуностимуляции, вызванной siРНК. РВМС человека выделяли и помещали в многолуночные культуральные планшеты, как в примере 2. В индивидуальные лунки добавляли различные разновидности одноцепочечных и двухцепочечных РНК в диапазоне концентрации (приблизительно от 2 нМ до приблизительно 0,5 мкМ) в присутствии DOTAR,и клетки инкубировали в течение 24 ч. Супернатанты культур собирали после инкубации и анализировали на IFN- и IL-12p40, используя подходящий ELISA. Эксперименты предназначались для сравнения двухцепочечной siРНК (s:as) с соответствующими индивидуальными смысловой (s) и антисмысловой(as) одноцепочечной РНК. Различными тестируемыми двухцепочечными siРНК были MARK2, MAPK2 Ехр 27, MAPK2 Ехр 30, ламин АС, ламин АС Ехр 27 и ламин АС Ехр 30. Различными тестируемыми одноцепочечными РНК были MARK2 s, MARK2 as, MAPK2 Ехр 27 s, MAPK2 Ехр 27 as, MAPK2 Ехр 30 s,MAPK2 Ехр 30 as, ламин AC s, ламин AC as, ламин AC Exp27 s, ламин AC Exp27 as, ламин АС Ехр 30 s и ламин АС Ехр 30 as. Результаты продемонстрированы на фиг. 2. Данные представлены как среднее арифметическое SEM. Как показано на фиг. 2, включение нуклеотидов, имеющих сахар с 2'-модификацией, в смысловую цепь данных siРНК удивительно и значимо уменьшает количества IFN- и, в частности, IL-12p40 секретируемых РВМС после инкубации в течение 24 ч или с двухцепочечной siРНК, или только с одноцепочечной смысловой цепью, по сравнению с контролем. Напротив, только модифицированные антисмысловые цепи оставались сильно иммуностимулирующими. Такие же антисмысловые цепи, присутствующие в виде части двухцепочечных siРНК, были, однако, намного менее иммуностимулирующими,что согласуется с мнением, что модификация, в которую вовлечена только смысловая цепь, является необходимой и достаточной для уменьшения иммуностимулирующего потенциала двухцепочечной siРНК. Пример 4. Модифицированные siРНК с уменьшенным иммуностимулирующим потенциалом сохраняют способность преобразовывать гены в подавленные. Для оценки способности модифицированной siРНК преобразовывать гены в подавленные РВМС человека, выделенные и культивированные, как описано в примере 2, анализировали на присутствие транскриптов для генов MAPK2 и ламина АС, используя количественную полимеразную цепную реакцию с использованием обратной транскриптазы и подходящей пары праймеров для каждого транскрипта,который подвергали зондированию. Также измеряли транксрипты для генов домашнего хозяйства для нормализации измерений. Вестерн-блоттинг и иммуноцитохимию использовали для подтверждения соответствующего уменьшения белка MAPK2 и ламина АС, уровни транскриптов уменьшались зависимым от дозы образом на основе концентрации siРНК и, значительно, в схожей степени для модифицированной siРНК и соответствующей контрольной siРНК. Пример 5. Другие 2'-модификации сахара нуклеотида в смысловой цепи siРНК уменьшают иммуностимуляцию и сохраняют подавление генов. Синтезировали дополнительные siРНК с любой из следующих различных 2'-модификаций сахара по меньшей мере одного нуклеотида в смысловой цепи siРНК, выбранных из 2'-O-метила, 2'-дезокси, 2'фтор-2'-дезокси, 2'-амино-2'-дезокси, 2'-метоксиэтила (МОЕ), 2'-O-аллила, 2'-пропинила, 2'-аминопропаргила, 2'-O-(3-аминопропила), 2'-О-пропила, 2'-О-бутила или, как правило, 2'-O-алкила, 2'-Oалкенила и 2'-O-алкинила. Кроме того, использовали замкнутые нуклеиновые кислоты (LNA) и арабинозиды. Различные 2'-модификации сахара вводили в различные положения и под различными номерами на протяжении смысловой цепи. Иммуностимулирующий эффект и эффект подавления генов оценивали способом, аналогично описанному в примерах 2-4 выше. Пример 6. Включение стабилизирующих межнуклеотидных связей в смысловую цепь. Синтезировали дополнительные siРНК с любой из различных 2'-модификаций сахара по меньшей мере одного нуклеотида в смысловой цепи siРНК и по меньшей мере с любой одной из следующих межнуклеотидных связей в смысловой цепи, выбранных из тиоформацеталя, фосфоротиоата, метилфосфоната, боранофосфоната, формацетата и других дефосфоананолов (описанных Uhlmann и Peyman, 1993, Oligonucleotide analogs containing dephospho internucleotide linkages, Methods in Molecular Biology, 20:355,Humana Press, содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки). Различные 2'-модификации сахара и модификации межнуклеотидных связей вводили в различные положения и под различными номерами на протяжении смысловой цепи. Иммуностимулирующий эффект и эффект подавления генов оценивали способом, аналогично описанному в примерах 2-4 выше. Эквиваленты Считается, что предшествующее описание является достаточным для того, чтобы специалист в данной области смог осуществить на практике настоящее изобретение. Объем настоящего изобретения не ограничивается приведенными примерами, поскольку примеры предназначаются только для иллюстрации одного из аспектов настоящего изобретения, и другие функционально эквивалентные варианты осуществления настоящего изобретения входят в пределы объема настоящего изобретения. Различные модификации настоящего изобретения помимо тех, которые продемонстрированы и описаны в данном описании, будут очевидны специалистам в данной области из предшествующего описания и входят в преде- 23013375 лы объема прилагаемой формулы изобретения. Преимущества и объекты настоящего изобретения необязательно охватываются каждым вариантом осуществления настоящего изобретения. Список последовательностей