Способы лечения иммунных нарушений, связанных с пересадкой трансплантата, растворимым мутантным ctla4
Формула / Реферат
1. Способ лечения иммунного нарушения, связанного с пересадкой трансплантата, заключающийся во введении субъекту на ранней фазе от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации, первоначально более частом, чем раз в месяц, эффективной дозы мутантного CTLA4, содержащего внеклеточный домен CTLA4, показанный в SEQ ID NO: 8, начиная с аланина в положении 26 или метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150, или его функциональный участок, причем во внеклеточном домене или его участке аланин в положении 55 заменен на тирозин, а лейцин в положении 130 заменен на глутаминовую кислоту, причем схема введения на ранней фазе включает введение мутантного CTLA4 в день 1, при посещении на неделе 2, при посещении на неделе 4, при посещении на неделе 8 и при посещении на неделе 12 в дозе от 5 до 20 мг/мл, и способ дополнительно включает схему поддерживающей фазы, которая начинается после окончания схемы ранней фазы и на которой мутантный CTLA4 вводят не чаще чем раз в месяц в дозе от 0,2 до 3 мг/мл.
2. Способ лечения иммунного нарушения, связанного с пересадкой трансплантата, заключающийся во введении субъекту на ранней фазе от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации, первоначально более частом, чем раз в месяц, эффективной дозы мутантного CTLA4, содержащего:
(а) аминокислотную последовательность начиная с метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150 SEQ ID NO: 4, или
(б) аминокислотную последовательность начиная с аланина в положении 26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150 SEQ ID NO: 4;
причем схема введения на ранней фазе включает введение мутантного CTLA4 в день 1, при посещении на неделе 2, при посещении на неделе 4, при посещении на неделе 8 и при посещении на неделе 12 в дозе от 5 до 20 мг/мл, и способ дополнительно включает схему поддерживающей фазы, которая начинается после окончания схемы ранней фазы и на которой мутантный CTLA4 вводят не чаще чем раз в месяц в дозе от 0,2 до 3 мг/мл.
3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что схема введения на ранней фазе включает введение мутантного CTLA4 в день 5.
4. Способ по п.3, отличающийся тем, что схема введения на ранней фазе включает введение мутантного CTLA4 при посещении на неделе 6, при посещении на неделе 10, при посещении в месяце 4, при посещении в месяце 5 и при посещении в месяце 6.
5. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что эффективная доза мутантного CTLA4 в период ранней фазы составляет около 10 мг/кг массы пациента.
6. Способ по п.3 или 4, отличающийся тем, что эффективная доза мутантного CTLA4 в период поддерживающей фазы составляет около 5 мг/кг массы пациента.
7. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что эффективная доза мутантного CTLA4 составляет около 10 мг/кг массы пациента со схемой введения, включающей введение в дни 1, 15, 29, 57, 85, а затем 5 мг/кг ежемесячно.
8. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что эффективная доза мутантного CTLA4 составляет около 10 мг/кг массы пациента со схемой введения, включающей введение в дни 1, 5, 15, 29, 57, 85, а затем 5 мг/кг ежемесячно.
9. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что эффективная доза мутантного CTLA4 составляет около 10 мг/кг массы пациента со схемой введения, включающей введение в дни 1, 5, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 113, 141, 169, а затем 5 мг/кг ежемесячно.
10. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что иммунные нарушения, связанные с пересадкой трансплантата, включают отторжение трансплантата плотного органа, ткани и/или клеток.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что иммунные нарушения, связанные с пересадкой трансплантата, включают отторжение почечного трансплантата.
12. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что мутантный CTLA4 дополнительно содержит аминокислотную последовательность, которая изменяет растворимость, аффинность и/или валентность растворимого мутантного CTLA4.
13. Способ по п.12, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность, которая изменяет растворимость, аффинность и/или валентность, содержит иммуноглобулиновый фрагмент.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что иммуноглобулиновый фрагмент представляет собой константную область иммуноглобулина или ее участок.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что константная область иммуноглобулина или ее участок мутирует с целью снижения эффекторной функции.
16. Способ по п.14, отличающийся тем, что константная область иммуноглобулина или ее участок содержит шарнирную область, СН2 и СН3 области человеческого иммуноглобулина или иммуноглобулинов обезьян.
17. Способ по п.15, отличающийся тем, что константная область иммуноглобулина или ее участок содержит шарнирную, СН2 и СН3 области человеческого иммуноглобулина или иммуноглобулинов обезьян.
18. Способ по п.13, отличающийся тем, что иммуноглобулин содержит аминокислотную последовательность, которая начинается с глутаминовой кислоты в положении +152 и кончается лизином в положении +383, как показано в SEQ ID NO: 4.
19. Способ по п.1 или 2, при котором мутантный CTLA4 дополнительно включает соединительный аминокислотный остаток и иммуноглобулин, причем соединительный аминокислотный остаток локализован между аминокислотной последовательностью, которая заканчивается аспарагиновой кислотой в положении +150, и иммуноглобулином.
20. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что мутантный CTLA4 вводят совместно по меньшей мере с одним из агентов, выбранных из группы, состоящей из базиликсимаба, даклизумаба, антитимоцитарного глобулина, ингибиторов кальциневрина, циклоспорина, такролимуса, микофенолята мофетила, микофенольной кислоты, рапамицина, азатиоприна, муромонаба, ритуксимаба, сиролимуса, эверолимуса, FTY720, FK778, Jak-3, сентикана, кортикостероидов, бета-метазона, будезонида, кортизола, кортизона, дексаметазона, гидрокортизона, метилпреднизолона, преднизолона, преднизона и триамцинолона.
21. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что развитие и/или прогрессирование последствия, выбранного из группы, состоящей из CAN, гиперлипидемии, гипертензии, диабета, гирсутизма, алопеции, гипертрофического гингивита, тремора, нейротоксичности и остеопороза, замедляется.
22. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что минимальная сывороточная концентрация мутантного CTLA4 составляет примерно 3-30 мкг/мл.
23. Способ лечения иммунного нарушения, связанного с пересадкой трансплантата, заключающийся во введении субъекту на ранней фазе от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации, первоначально более частом, чем раз в месяц, эффективной дозы мутантного CTLA4, содержащего:
(а) аминокислотную последовательность начиная с метионина в положении 27 и кончая лизином в положении +357 или глицином в положении +356 на фиг. 7, или
(б) аминокислотную последовательность начиная с аланина в положении 26 и кончая лизином в положении +357 или глицином в положении +356 на фиг. 7,
причем схема введения на ранней фазе включает введение мутантного CTLA4 в день 1, при посещении на неделе 2, при посещении на неделе 4, при посещении на неделе 8 и при посещении на неделе 12 в дозе от 5 до 20 мг/мл, и способ дополнительно включает схему поддерживающей фазы, которая начинается после окончания схемы ранней фазы и на которой мутантный CTLA4 вводят не чаще чем раз в месяц в дозе от 0,2 до 3 мг/мл.
24. Способ по пп.1, 2 или 23, отличающийся тем, что мутантный CTLA4 вводят совместно, одновременно или последовательно, с агентами, представляющими собой базиликсимаб или MMF.
25. Способ по пп.1, 2 или 23, отличающийся тем, что мутантный CTLA4 вводят совместно, одновременно или последовательно, с агентами, представляющими собой даклизумаб или сиролимус.
26. Мутантный CTLA4, содержащий внеклеточный домен CTLA4, показанный в SEQ ID NO: 8, начиная с аланина в положении 26 или метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150, или его функциональный участок, причем во внеклеточном домене или его участке аланин в положении 55 заменен на тирозин, а лейцин в положении 130 заменен на глутаминовую кислоту, для лечения иммунного нарушения, связанного с пересадкой трансплантата у субъекта, который является реципиентом с расширенными критериями и/или который получает трансплантат от доноров, отвечающих расширенным критериям.
27. Мутантный CTLA4 по п.26, где расширенные критерии включают один или более из следующих: возраст 10 лет и моложе или 60 лет и более; донор после остановки сердца; ожидаемое время хранения донорского органа до трансплантации более или равно 24 ч; субъекты, которым делают трансплантацию в первый раз, с текущим PRA ³ 50%, или, в случае ретрансплантации, с PRA ³ 30%; субъекты, у которых произошла утрата прежнего трансплантата вследствие острого отторжения в течение первых 6 месяцев после трансплантации; субъекты с позитивной Т-клеточной лимфоцитотоксической перекрестной пробой при использовании лимфоцитов донора и сыворотки реципиента; субъекты с ВИЧ-инфекцией; субъекты с активной формой туберкулеза, требующего лечения в течение предыдущих 3 лет.
28. Мутантный CTLA4 по п.26, где расширенные критерии для донорских органов включают по меньшей мере один из следующих критериев: а) возраст донора 60 лет и более, б) возраст донора 50-59 лет и одно из следующих обстоятельств: (i) инсульт (CVA) + гипертензия + SCr (креатинин сыворотки крови) > 1.5 мг/дл, (ii) CVA + гипертензия, или (iii) CVA + SCr > 1.5 мг/дл, или (iv) гипертензия + SCr > 1.5 мг/дл, в) CIT ³ 24 ч, возраст донора более 10 лет, г) донор с остановкой сердца.
Текст
013122 Область изобретения Настоящее изобретение относится к применению растворимого мутантного CTLA4 с повышенной авидностью к CD80 (В 7-1) и CD86 (В 7-2) по сравнению с CTLA4 дикого типа при лечении иммунных нарушений, обусловленных пересадкой трансплантата. Предпосылки создания изобретения Принимая во внимание важнейшую роль Т-клеток в отторжении трансплантата, можно представить, что общей целью современных иммунодепрессивных средств является блокирование активации и функции Т-клеток (Sayegh M.H., Turka L.A. The role of T-cell costimulatory activation pathways in transplantrejection. N. Engl. J. Med. 1998; 338(25): 1813-21). Для полной активации Т-клеток необходим как антиген-специфический (сигнал 1), так и костимулирующий сигнал (сигнал 2) (Lenschow D.J., Walunas T.L.,Bluestone J.A. CD28/B7 system of T cell costimulation. Annu Rev. Immunol. 1996; 14: 233-58). Один из лучше всего охарактеризованных костимулирующих путей включает взаимодействие CD28-CD80/86 (В 71/2) (Linsley P.S., Ledbetter J.A. The role of the CD28 receptor during T cell responses to antigen. Annu Rev.Immunol. 1993; 11: 191-212). Антиген 4 цитотоксического Т-лимфоцита (CTLA4) связывается с CD80/86 с более высокой авидностью, чем CD28, и транзиторно экспрессируется на Т-клетках после их активации в тех случаях, когда он прерывает взаимодействие между CD28 и CD80/86 (Oosterwegel M.A., GreenwaldR.J., Mandelbrot D.A., Lorsbach R.B., Sharpe A.H. CTLA-4 and T cell activation. Curr. Opin. Immunol. 1999; 11(3): 294-300). При этом возникает негативный сигнал обратного связывания для активации Т-клеток. Вмешательство в этот путь ранее осуществляли с помощью CTLA4Ig. CTLA4Ig успешно применяли в качестве способа лечения аутоиммунных заболеваний, опосредованных Т-клетками, таких как ревматоидный артрит (Kremer J.M., Westhovens R., Leon M., et al. Treatment of rheumatoid arthritis by selectiveLEA29Y изучали на моделях трансплантатов у приматов, индивидуально или в комбинации с другими иммунодепрессивными агентами. Christian Larsen et al. (С. Larsen, Т. Pearson, A. Adams, P. Tso, N.High-Affinity Variant of CTLA4Ig with Potent Immunosuppressive Properties; American Journal of Transplantation; Vol. 5, Issue 3, March 2005, p.443) продемонстрировали повышенную иммунодепрессивную активность LEA29Y по сравнению с CTLA4Ig на модели приматов, используемой для исследования отторжения почечного трансплантата. LEA29Y вводили интраоперационно (во время операции) (10 мг/кг внутривенно), на 4 день (15 мг/кг) и на 14, 28, 42, 56 и 70 день после операции (20 мг/кг внутривенно).CTLA4Ig (16 мг/кг) вводили интраоперационно и на 4, 8, 11 и 16 день после операции. Схема лечения включала также MMF (15 мг/кг bid s.c. (два раз в день подкожно) в дни 0-14, qd (ежедневно) в дни 15180), метилпреднизолон (подкожные инъекции по следующей схеме: день 0: 20 мг, день 1: 16 мг, день 3: 8 мг, день 4: 4 мг, дни 5-14: 3 мг, дни 15-180: 1 мг) и базиликсимаб (0.3 г/кг в.в. в дни 0 и 4). Жизнеспособность реципиентов с почечным трансплантатом, пролеченных с помощью LEA29Y, была четко выше жизнеспособности в группе, получавшей CTLA4Ig, несмотря на сравнимые сывороточные концентрации. Контрольные реципиенты, получавшие альбумин, показывают медианную продолжительность жизни,аналогичную продолжительности жизни (выживаемости) в группе, получавшей CTLA4Ig. Однако несмотря на непрерывное лечение с помощью LEA29Y, все реципиенты испытывали значительное ухудшение почечной функции (повышение уровня сывороточного креатинина).(химерное mab (моноклональное антитело) против человеческого CD40) действует синергистически на модели трансплантации панкреатических островков у приматов с целью продлить период существования трансплантата. LEA29Y вводили внутривенно во время операции (20 мг/кг); на 4, 7 и 14 день после операции; затем каждые 2 недели до дня 100. Дополнительные дозы (20 мг/кг) вводили ежемесячно до 6 месяцев включительно. Протестировано четыре протокола: 1) LEA29Y индивидуально, 2) CD220 (антиCD40), 3) LEA29Y в комбинации с Chi220 и 4) LEA29Y в комбинации с анти-CD20.Andrew Adams et al. (A. Adams, N. Shirasugi, M. Durham, E. Strobert, D. Anderson, P. Rees, S. Cowan,H. Xu, Y. Blinder, M. Cheung, D. Hollenbaugh, N. Kenyon, T. Pearson and С Larsen; Calcineurin Inhibitor Free CD28 Blockade-Based Protocol Protects Allogeneic Islets in Nonhuman Primates; Diabetes, Vol. 51(2),February 2002, p. 265) показали, что комбинация LEA29Y, рапамицина и mAb против IL-2R значительно пролонгируют выживаемость аллотрансплантата островков. LEA29Y вводили внутривенно во время операции (10 мг/кг) и на 4 день после операции (15 мг/кг). Дополнительные дозы по 20 мг/кг давали на 14 день после операции и каждые 2 недели до 154 дня после операции. В течение 2003 года в США было пересажено более 25000 органов. Трансплантаты почки составляют около 60% трансплантированных плотных органов, затем идут трансплантаты печени 21%, сердца-1 013122 8%, легкого 4% и остальные 7% составляют трансплантаты других органов, таких как поджелудочная железа и кишечник (OPTN/SRTR Annual Report 2004 на сайте www.optn.org). Трансплантация почки является наиболее эффективным лечением на последней стадии заболевания почек. Она обеспечивает жизнеспособность и качество жизни (QoL). Поддержание функционирующего почечного трансплантата требует пожизненной иммунодепрессивной терапии для предупреждения иммунного разрушения трансплантата. Современные схемы иммунодепрессивной терапии дают коэффициент выживаемости 1 год для 89% трансплантатов от умерших и 94% трансплантатов от живых доноров. Однако со временем наблюдается прогрессирующая потеря как субъектов, так и трансплантатов. Продолжительность жизни пять лет для трансплантатов, полученных от умерших и живых доноров, составляет 66% и 79%, соответственно. (United Network for Organ Sharing Renal Transplant Registry 2003 на сайте www.unos.org) Наиболее часто встречающимися причинами гибели субъекта и трансплантата через продолжительное время является сердечно-сосудистое заболевание и хроническая нефропатия аллотрансплантатаNephrol Dial Transplant 2000; 15: 149-151) Парадоксально, но основные терапевтические средства при трансплантации почки, ингибиторы кальциневрина (CNI), CsA и такролимус, непосредственно влияют на отдаленную потерю аллотрансплантата и смерть пациента, так как они по определению являются нефротоксическими, а также вызывают или увеличивают риск сердечно-сосудистых заболеваний, включая гипертензию, гиперхолистеринемию и сахарный диабет. Тем не менее, эти агенты являются краеугольным камнем всех традиционных иммунодепрессивных схем при трансплантации почки. В настоящее время не существует одобренных агентов, которые могут заменить CNI в качестве основы поддерживающей иммунодепрессивной терапии у различных субъектов. Один агент, сиролимус(рапамицин, Rapamune от Wyeth/Ayerst), был одобрен в CNI-щадящей схеме. Однако CNI должны попрежнему применяться с сироламусом в течение по меньшей мере 3 месяцев после трансплантации. Более важно то, что сироламус одобрен в качестве CNI-сберегающего агента в этом наборе только у субъектов с риском потери трансплантата от низкого до умеренного. Таким образом, для больных с повышенным риском потери трансплантата, для которых отсутствие нефротоксического эффекта CNI было бы наиболее благоприятно, не существует одобренной альтернативы CNI. Следовательно, существует необходимость в иммунодепрессивных агентах, которые могут обеспечить приемлемый контроль аллоиммунного ответа, сравнимый со стандартами применяемых на практике лекарственных средств, без токсичности, которая способствует отдаленной смерти субъекта и потере трансплантата. В идеале агент мог бы применяться не только у субъектов с пониженным риском, но также у субъектов с повышенным риском потери трансплантата. Сущность изобретения Настоящее изобретение предусматривает способы лечения иммунных нарушений, ассоциированных с трансплантацией, путем введения мутантного CTLA4, который с более высокой авидностью связывается с антигеном CD80 и/или CD86, чем у дикого типа CTLA4 или немутированный CTLA4Ig.CTLA4 включает первую аминокислотную последовательность, содержащую внеклеточный доменCTLA4, в котором некоторые аминокислотные остатки в области S25-R33 и в области М 97-G107 являются мутированными. Мутантные соединения по изобретению могут также включать вторую аминокислотную последовательность, которая повышает растворимость мутантного соединения. Примером мутантного CTLA4 является LI 04EA29YIg (фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4) по данному описанию. Другим примером мутантного CTLA4 CTLA4 является L104EIg (фиг. 8, SEQ ID NO: 5 и 6) по данному описанию. L104EA29YIg и L104EIg связывают CD80 и CD86 с более высокой авидностью, чемCTLA4Ig. Введение мутантного CTLA4 по изобретению можно осуществлять через различные промежутки времени. Обычно схемы применения включают раннюю фазу, в которой дозы выше и частота введения повышается в период наибольшего иммунологического риска, с последующей фазой поддерживающей терапии. Ранняя фаза может длиться от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации. Схема применения в течение ранней фазы может в значительной степени варьироваться в зависимости от состояния реципиента/трансплантата. В одном варианте настоящее изобретение предусматривает способ лечения иммунного нарушения,ассоциированного с трансплантацией ткани, путем введения субъекту эффективной дозы мутантногоCTLA4 с внеклеточным доменом CTLA4, показанным в SEQ ID NO: 8, начиная с аланина в положении 26 или метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150, или его участком. Кроме того, во внеклеточном домене или его участке аланин в положении 55 заменен на тирозин, а лейцин в положении 130 заменен на глутаминовую кислоту. Кроме того, схема применения включает раннюю фазу от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации и предполагает введение, первоначально более частое, чем раз в месяц. В другом варианте настоящего изобретения предусматривается способ лечения иммунного нарушения, ассоциированного с трансплантацией ткани, путем введения субъекту эффективной дозы мутантного CTLA4 с аминокислотной последовательностью начиная с метионина в положении 27 и кончая аспа-2 013122 рагиновой кислотой в положении 150 SEQ ID NO: 4, или с аминокислотной последовательностью начиная с аланина в положении 26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150 SEQ ID NO: 4. Кроме того, схема введения мутантного CTLA4 включает раннюю фазу, причем схема на ранней фазе может соблюдаться от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации и предполагает первоначально более частое введение, чем раз в месяц. На фиг. 1 показан анализ равновесного связывания L104EA29YIg, L104EIg и дикого типа CTLA4Ig с CD86Ig. На фиг. 2 А и 2 В приводятся данные анализов FACS, показывающие связывание L104EA29YIg,L104EIg и CTLA4Ig с человеческими CD80- или CD86-трансфецированными СНО-клетками, описанное в примере 2, ниже. На фиг. 3 А и 3 В показано ингибирование пролиферации CD80-позитивных и CD86-позитивных СНО клеток, описанное в пример 2, ниже. На фиг. 4 А и 4 В показано, что LI104EA29YIg более эффективно, чем CTLA4Ig, ингибирует пролиферацию первичных и вторичных аллостимулированных Т клеток, как описано в примере 2, ниже. На фиг. 5 А-С показано, что LI104EA29YIg более эффективно, чем CTLA4Ig, ингибирует продуцирование IL-2 (фиг. 5 А), EL-4 (фиг. 5 В) и -интерферона (фиг. 5 С) аллостимулированными Т клетками,как описано ниже, в примере 2. На фиг. 6 показано, что L104EA29YIg более эффективно, чем CTLA4Ig, ингибирует пролиферацию стимулированных фитогемагглютинином (РНА) Т клеток обезьяны, как описано ниже, в примере 2. На фиг. 7 (SEQ ID NO: 3 и 4) изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность мутантного CTLA4 ("L104EA29YIg"), содержащего сигнальный пептид; мутированный внеклеточный домен CTLA4 начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124,или начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; и область Ig,как описано ниже, в примере 1. SEQ ID NO: 3 и 4 изображают нуклеотидную и аминокислотную последовательность, соответственно, мутантного CTLA4 ("L104EA29YIg"); мутированный внеклеточный домен CTLA4 начиная с метионина в положении +27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150,или начиная с аланина в положении +26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150; и областьIg. На фиг. 8 (SEQ ID NO: 5 и 6) изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность мутантного CTLA4 ("L104EIg"), содержащая сигнальный пептид; мутированный внеклеточный доменCTLA4 начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; и область Ig, как описано ниже, в примере 1. SEQ ID NO: 5 и 6 изображают нуклеотидную и аминокислотную последовательность, соответственно, мутантного CTLA4 ("L104EIg"), содержащего сигнальный пептид; мутированный внеклеточный домен CTLA4 начиная с метионина в положении +27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150, или начиная с аланина в положении +26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150; и область Ig. На фиг. 9 (SEQ ID NO: 7 и 8) изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность мутантного CTLA4Ig, содержащая сигнальный пептид; мутированный внеклеточный домен CTLA4 начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124, или начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; и область Ig. SEQ ID NO: 7 и 8 изображают нуклеотидную и аминокислотную последовательность, соответственно, CTLA4Ig, содержащего сигнальный пептид; дикого типа аминокислотную последовательность внеклеточного домена CTLA4 начиная с метионина в положении +27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150, или начиная с аланина в положении +26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +150; и область Ig. На фиг. 10 А-С изображен SDS гель (фиг. 10 А) для CTLA4Ig (дорожка 1), L104EIg (дорожка 2) и(фиг. 10 С). На фиг. 11 А и 11 В изображена ленточная диаграмма V-образной складки внеклеточной IgVподобной складки CTLA4, полученная при исследовании структуры в растворе методом ЯМРспектроскопии. На фиг. 11 В дано увеличенное изображение области S25-R33 и области MYPPPY, показывающее локализацию и ориентацию боковой цепи мутаций, повышающих авидность, L104 и А 29. На фиг. 12 изображена принципиальная схема вектора, piLN-L104EA29YIg, имеющегоL104EA29YIg вставку. На фиг. 13 изображены нуклеотидная и аминокислотная последовательность рецептора CTLA4(SEQ ID NO: 9 и 10). Подробное описание изобретения Определения Если не указано иначе, все научные и технические термины, употребляемые в данном патенте, имеют общепринятые в уровне техники значения. Употребляемые в данном изобретении нижеприведенные слова или выражения имеют указанные значения. Термин "лиганд" по данному описанию относится к соединению (молекуле), которое (которая) спе-3 013122 цифически распознает и связывает другое(ую) соединение (молекулу), например лигандом для CTLA4 является В 7."Дикого типа CTLA4" или "немутированный (немутантный) CTLA4" по данному описанию имеет аминокислотную последовательность природного полноразмерного CTLA4, показанную на фиг. 13 (SEQID NO: 9 и 10; также описанную в патентах США 5434131, 5844095, 5851795), или какого-либо его участка, или его производного, который распознает или связывает В 7 или противодействует (сталкивается с) В 7 таким образом, что блокируется связывание с CD28 и/или CTLA4. В конкретных вариантах изобретения внеклеточный домен дикого типа CTLA4 начинается с метионина в положении +1 и кончается аспарагиновой кислотой в положении +124, или внеклеточный домен дикого типа CTLA4 начинается с аланина в положении -1 и кончается аспарагиновой кислотой в положении +124. Дикого типа CTLA4 представляет собой белок клеточной поверхности, имеющий N-концевой внеклеточный домен, трансмембранный домен и С-концевой цитоплазматический домен. Внеклеточный домен связывается с целевыми молекулами (молекулами-мишенями), такими как молекула В 7. В клетке природный дикого типа CTLA4 белок транслируется в виде незрелого полипептида, который включает сигнальный пептид на N-конце. Незрелый полипептид претерпевает посттрансляционный процессинг, который включает отщепление и удаление сигнального пептида с образованием продукта расщепления CTLA4, имеющего новообразованного N-конца, который отличается от N-конца в незрелой форме. Специалисту в данной области техники ясно, что может происходить дополнительный посттрансляционный процессинг, в результате которого из вновь образованного N-конца продукта расщепления CTLA4 удаляется одна или более аминокислот. Или же, сигнальный пептид может не удаляться целиком, в результате образуется молекула, которая начинается ранее обычной стартовой аминокислоты метионина. Таким образом, зрелый белокCTLA4 включает внеклеточный домен или его любой участок, который связывается с В 7."CTLA4Ig" представляет собой растворимый слитый белок, содержащий внеклеточный домен дикого типа CTLA4, связанный с Ig хвостом, или его участок, который связывает В 7. Конкретный вариант изобретения содержит внеклеточный домен дикого типа CTLA4 (как показано на фиг. 9, SEQ ID NO: 7 и 8) начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124; или начиная с аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124; соединительный аминокислотный остаток глутамин в положении +125; и иммуноглобулиновый участок, охватывающий область от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356 включительно (ДНК, кодирующая CTLA4Ig, депонирована 31 мая 1991 г. в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 согласно условиям Будапештского Соглашения и имеет присвоенный АТСС регистрационный номер АТСС 68629; Linsley, P., etal., 1994 Immunity 1: 793-80. CTLA4Ig-24, линия клеток яичников китайского хомячка (СНО), экспрессирующих CTLA4Ig, депонирована 31 мая 1991 г. в АТСС под идентификационным номером CRL-10762). Растворимый CTLA4Ig может включать или не включать последовательность сигнального пептида (лидерную последовательность). Термин "слитый белок" по данному описанию определяется как одна или более аминокислотных последовательностей, соединенных вместе общеизвестными в уровне техники способами как описано в патентах США 5434131 или 5637481. Соединенные аминокислотные последовательности образуют при этом один слитый белок. Понятие "растворимый" по данному описанию относится к молекуле любого соединения или к ее фрагментам и производным, не связанным или не соединенным с клеткой, т.е., например, циркулирующей. Например, CTLA4, В 7 или CD28 можно сделать растворимыми путем присоединения иммуноглобулиновой (Ig) частицы к внеклеточному домену CTLA4, В 7 или CD28, соответственно. Или же, соединение, такое как CTLA4, можно сделать растворимым, удалив его трансмембранный домен. Выражение "внеклеточный домен CTLA4" представляет собой участок CTLA4, который узнает и связывает CTLA4 лиганды, такие как В 7. Например, внеклеточный домен CTLA4 содержит область от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг. 13, SEQ ID NO: 9 и 10). Или же, внеклеточный домен CTLA4 содержат область от аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124 (фиг. 13, SEQ ID NO: 9 и 10). Внеклеточный домен включает фрагментыCTLA4, которые связывают В 7. Внеклеточный домен CTLA4, показанный на фиг. 13 (SEQ ID NO: 9 и 10), может также включать мутации, которые изменяют авидность связывания CTLA4 для В 7 молекулы. Выражение "мутантный CTLA4" ("мутантная молекула CTLA4") означает дикого типа CTLA4, показанный в (SEQ ID NO: 9 и 10), или любой участок его последовательности, или производное, которые содержат мутацию или множественные мутации (предпочтительно, во внеклеточном домене дикого типаCTLA4). Мутантный CTLA4 имеет последовательность, аналогичную, но не идентичную последовательности дикого типа CTLA4, но все еще связывает В 7. Мутации могут включать один или более аминокислотных остатков с аминокислотой, имеющей консервативную (например, замена глицина на изолейцин) или неконсервативную (например, замена глицина на триптофан) структуру или химические свойства,аминокислотные делеции, добавления, сдвиги рамки или усечения (укорочения). Молекулы мутантногоCTLA4 могут заключать в себе или быть связаны с не-CTLA4 молекулами. Мутантные соединения могут-4 013122 быть растворимыми (т.е. циркулирующими) или связанными с клеточной поверхностью. Другие мутантные CTLA4 включают CTLA4, описанные в патентных заявках США порядковые номера 09/865321,60/214065 и 60/287576; в патентах США 6090914, 5844095 и 5773253; и описанные Peach, R.J., et al., в J.Exp. Med. 180: 2049-2058 (1994). CTLA4 мутантные молекулы можно получать синтетическими методами или методами рекомбинантной ДНК. Обычно в способах и/или наборах по изобретению молекулы не включают последовательность сигнального пептида."L104EA29YIg" представляет собой слитый белок, который является растворимым мутантнымCTLA4, содержащим внеклеточный домен дикого типа CTLA4 с аминокислотными заменами A29Y (замена аминокислотного остатка аланина на тирозин в положении 29) и L104E (аминокислотная замена лейцина на глутаминовую кислоту в положении +104), или его частью, которая связывает молекулу В 7,соединенной с Ig хвостом (включенным в фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4; ДНК, кодирующая L104EA29YIg,депонирована 20 июня 2000 г. под номером АТСС РТА-2104; одновременно рассматриваемые патентные заявки США 09/579927, 60/287576 и 60/214065, вводимые в данное описание ссылкой). РастворимыеL104EA29YIg, применяемые в способах и/или наборах по изобретению, могут включать или не включать последовательность сигнального (лидерного) пептида. Термин "мутация" по данному описанию означает изменение в нуклеотидной или аминокислотной последовательности соединения дикого типа, например, изменение в ДНК и/или аминокислотной последовательностях внеклеточного домена дикого типа CTLA4. Мутация в ДНК может менять кодон, что приводит к изменению аминокислотной последовательности. Изменение ДНК может включать замены,делеции, инсерции, добавления, укорочения или ошибки процессинга или расщепления белка. Или же мутации в нуклеотидной последовательности могут дать молчащую мутацию в аминокислотной последовательности, хорошо известную в уровне техники. При этом некоторые нуклеотидные кодоны кодируют одну и ту же аминокислоту. Примеры включают нуклеотидные кодоны CGU, CGG, CGC и CGA,кодирующие аминокислоту аргинин (R); или кодоны GAU и GAC, кодирующие аспарагиновую кислоту(D). Таким образом, белок может кодироваться одной или более аминокислотами, которые отличаются своей конкретной нуклеотидной последовательностью, хотя кодируют белки, имеющие идентичные последовательности. Ниже даны кодирующие последовательности для аминокислот. Молекула мутантного соединения может иметь одну или более мутаций. Выражение "последовательность не-CTLA4 белка" или "не-CTLA4 белок (молекула)" по данному описанию означает любую белковую молекулу, которая не связывает В 7 и не препятствует связыванию(Ig) или ее участок. Предпочтительно константная область Ig представляет собой константную область Ig человека или обезьян, например, области человеческого С(гамма)1, включающие шарнирную область,СН 2 и СН 3. Константная область Ig может быть мутантной с целью снижения его эффекторной функции(Патенты США 5637481, 5844095 и 5434131). Термин "фрагмент", "участок" или "часть" по данному описанию означает любую часть или любой сегмент CTLA4, предпочтительно внеклеточный домен CTLA4 или его участок или сегмент, который распознает и связывает его цель, например молекулу В 7. Внеклеточный домен CTLA4 может включать мутации, которые изменяют авидность связывания (молекулы) CTLA4 с (молекулой) В 7."В 7" по данному описанию относится к семейству молекул В 7, включая, но без ограничения, В 7-1(CD80), В 7-2 (CD86) и В 7-3, которые могут распознавать и связывать CTLA4 и/или CD28. Выражение "В 7-позитивные клетки" означает любые клетки с одним или более типов В 7 молекул,экспрессированных на поверхности клеток. Термин "производное" по данному описанию обозначает молекулу, последовательность которой гомологична последовательности, а активность аналогична активности исходной молекулы. Например,производное CTLA4 включает растворимый CTLA4, имеющий аминокислотную последовательность по меньшей мере на 70% аналогичную аминокислотной последовательности внеклеточного домена дикого типа CTLA4 и распознающий и связывающий В 7, например, CTLA4Ig, или L104EA29YIg, являющийся мутантным растворимым CTLA4."Регулировать" иммунный ответ по данному описанию означает активировать, стимулировать, позитивно регулировать, ингибировать, блокировать, негативно модулировать или модифицировать иммунный ответ. Аутоиммунные заболевания по данному описанию можно лечить регуляцией иммунного ответа, например, регуляцией функциональных взаимодействий CTLA4- и/или CD28-позитивных клеток с В 7-позитивными клетками. Например, способ регуляции иммунного ответа включает контактирование В-позитивных клеток с растворимым CTLA4 по изобретению с образованием комплексов CTLA4/B7,растворимого CTLA4, мешающего реакции эндогенного CTLA4 и/или CD28 с указанным В 7."Блокировать" или "ингибировать" рецептор, сигнал или молекулу (соединение) по данному описанию означает противодействовать активации рецептора, сигнала или молекулы, обнаруживаемой с помощью общепризнанного в уровне техники теста. Блокада или ингибирование могут быть частичными или тотальными. Например, блокаду клеточного иммунного ответа можно детектировать, определяя функциональность трансплантата, такую как концентрации сывороточного креатинина после трансплантации почки. Выражение "блокирование В 7 взаимодействия" по данному описанию означает противодействие связыванию В 7 с его лигандами, такими как CD28 и/или CTLA4, т.е. препятствие взаимодействию Тклеток и В 7-позитивных клеток. Примеры агентов, которые блокируют В 7 взаимодействия, включают,но без ограничения, молекулы, такие как антитело (или его участок или производное), которые узнаютCTLA4, CD28 или В 7 (например, В 7-1, В 7-2) и связываются с ними; растворимую форму (или участок или производное) молекул, такую как растворимый CTLA4; пептидный фрагмент или другую малую молекулу, созданную с целью помешать клеточному сигналу с помощью CTLA4/CD28/B7 опосредованного взаимодействия. В предпочтительном варианте изобретения блокирующий агент представляет собой мутантный CTLA4, такой как L104EA29YIg (ATCC РТА-2104). Выражение "лечить" или "лечение" нарушения или заболевания по данному описанию означает помочь больному бороться с болезнью или с нарушением медицинскими или другими средствами. Лечение заболевания или состояния может подавить иммунные события, ассоциированные с заболеванием,уменьшить симптомы заболевания или нарушения, понизить тяжесть заболевания или нарушения, изменить ход прогрессирования заболевания или нарушения и/или облегчить или вылечить основное заболевание или нарушение. Например, лечение иммунного нарушения, ассоциированного с трансплантацией ткани, можно осуществлять регуляцией иммунного ответа, например, регуляцией функциональных взаимодействий CTLA4-и/или CD28-позитивных клеток с В 7-позитивными клетками. Или же, лечение иммунного заболевания или нарушения можно проводить, предупреждая или ингибируя начало или прогрессирование заболевания или нарушения с помощью композиций по данному описанию. Например,лечение отторжения почечного трансплантата включает ингибирование отторжения почечного трансплантата, измеряемого скоростью (уровнем) гломерулярной фильтрации (СКФ, GFR). Например, лечение иммунных нарушений, ассоциированных с трансплантацией ткани, включает профилактику отторжения органа с помощью введения L104EA29YIg. Кроме того, лечение иммунных нарушений, ассоциированных с трансплантацией ткани, может пролонгировать продолжительность существования хозяина и трансплантированного органа."Заболевание иммунной системы" по данному описанию включает любое заболевание, опосредованное взаимодействиями Т-клеток с В 7-позитивными клетками, включая, но без ограничения, аутоиммунные заболевания, иммунопролиферативные заболевания и иммунные нарушения, ассоциированные с трансплантацией органа или ткани. Выражение " иммунные нарушения, ассоциированные с трансплантацией органа или ткани" по данному описанию означает любое заболевание, опосредованное взаимодействиями Т-клеток с В 7 позитивными клетками, включая, но без ограничения, иммунные нарушения, ассоциированные с отторжением трансплантата, нарушения, связанные с трансплантатом, гомологичную болезнь ("трансплантат против хозяина" (GVHD (например, такую, которая возникает при пересадке костного мозга или при индукции толерантности), отторжение ткани или трансплантата, включая острое отторжение ткани или трансплантата и хроническое отторжение ткани или трансплантата. Трансплантаты могут быть аллотрансплантатами или ксенотрансплантатами плотного органа, тканевыми или клеточными аллотрансплантатами или ксенотрансплантатами или аллотрансплантатами или ксенотрансплантатами внешних органов, включая, но без ограничения, островковые клетки (также известные как островки), мышцы, ге-6 013122 патоциты, нейроны, сердце, печень, почку, легкое, придатки, конечности, нос, ухо или лицо. Иммунопролиферативные заболевания по данному описанию включают, но без ограничения, Тклеточную лимфому; Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз; тестикулярную ангиоцентрическую Т-клеточную лимфому; и доброкачественный лимфоцитарный ангиит. Аутоиммунные заболевания по данному описанию включают, но без ограничения, такие заболевания, как волчанка (например, красная волчанка, волчаночный нефрит), псориаз; тиреоидит Хашимото,первичная микседема, болезнь Грейвза, злокачественная анемия, аутоиммунный атрофический гастрит,болезнь Аддисона, диабет (например, инсулиннезависимый сахарный диабет, сахарный диабет типа I,сахарный диабет типа II), синдром Гудпасчера, тяжелая миастения, болезнь Крона, воспалительное заболевание кишечника (IBD), симпатическая офтальмия, аутоиммунный увеит, рассеянный склероз, аутоиммунная гемолитическая анемия, идиопатическая тромбоцитопения, первичный билиарный цирроз,хронический активный гепатит, язвенный колит, синдром Шегрена, ревматические заболевания (например, ревматоидный артрит, псориатический артрит), полимиозиты, склеродермия и смешанная соединительно-тканная болезнь. Композиции и способы по изобретению Настоящее изобретение охватывает новый класс иммунодепрессивных средств для трансплантации. Этот класс представляет собой слитый белок, который связывается с молекулами В 7 на поверхности антиген-презентирующих клеток (АРС), ингибируя костимуляцию, необходимую для Т-клеточной активации. Растворимый мутантный CTLA4 по изобретению отличается от имеющихся иммунодепрессантов ограниченной локализацией молекулярной мишени и специфичностью эффекта. Настоящее изобретение предусматривает растворимый мутантный CTLA4, который распознает и связывает CD80 и/или CD86. В некоторых вариантах изобретения растворимые мутантные CTLA4 обладают более высокой авидностью к CD80 и/или CD86, чем CTLA4Ig. Например, L104EA29YIg связывается с CD80 с авидностью примерно в 2 раза более высокой, а с CD86 примерно в 4 раза более высокой, чем дикого типа CTLA4Ig (в данном описании называемый CTLA4Ig). Это более сильное связывание приводит к тому, что L104EA29YIg более эффективно блокирует иммунные реакции, нежели CTLA4Ig. В одном варианте настоящее изобретение предусматривает способы лечения заболеваний иммунной системы. Способы включают введение терапевтической композиции, содержащей растворимый мутантный CTLA4 по данному описанию, субъекту в количестве, эффективно ослабляющем по меньшей мере один из симптомов, ассоциированных с заболеванием иммунной системы. Кроме того, растворимый мутантный CTLA4 по данному описанию может обеспечить продолжительное лечение заболеваний иммунной системы, блокируя взаимодействия Т-клеток с В-позитивными клетками, тем самым блокируется активация/костимуляция Т-клеток с помощью костимулирующих сигналов, таких как связывание В 7 с СВ 28, приводящее к индукции нечувствительности или толерантности Т-клеток. Болезни (заболевания) иммунной системы включают, но без ограничения, аутоиммунные заболевания, иммунопролиферативные заболевания и иммунные нарушения, ассоциированные с обсуждавшейся выше трансплантацией органов и тканей. В другом варианте настоящее изобретение предусматривает способы индукции толерантности у субъекта с иммунными нарушениями, ассоциированными с трасплантацией органов и тканей, путем введения терапевтической композиции, содержащей растворимые мутантные CTLA4, раскрываемые в данном описании. Растворимые мутантные CTLA4, раскрываемые в данном описании, проявляют ингибирующие свойства in vivo. В условиях, когда взаимодействия Т-клеток/с В 7-позитивными клетками, например взаимодействия Т-клеток/с В клетками, происходят в результате контакта между Т-клетками и В 7 позитивными клетками, связывание введенного мутантного CTLA4 для реакции с В 7-позитивными клетками, например В-клетками, может препятствовать, т.е. ингибировать взаимодействия Т-клеток/с В 7 позитивными клетками, что приводит в результате к регуляции иммунного ответа. Другой вариант изобретения предусматривает способы регуляции иммунного ответа. Модулирование иммунного ответа по типу негативной регуляции (понижение) растворимыми мутантными CTLA4,раскрываемыми в данном описании, может осуществляться путем ингибирования или блокирования уже имеющегося иммунного ответа или может включать предупреждение индукции иммунного ответа. Растворимые мутантные CTLA4, раскрываемые в данном описании, могут ингибировать функции активированных Т клеток, например, пролиферацию Т лимфоцитов, секрецию цитокинов и/или продуцирование цитокинов, подавляя Т-клеточный ответ или индуцируя специфическую толерантность в Т-клетках, или делая и то, и другое. Кроме того, растворимые мутантные CTLA4, раскрываемые в данном описании,вмешиваясь в путь CTLA4/CD28/D7, могут ингибировать Т-клеточную пролиферацию и/или секрецию цитокинов и, тем самым, вызывают деструкцию тканей и индукцию нечувствительности или инертности Т-клеток. Мутантные CTLA4 содержат по меньшей мере один внеклеточный домен CTLA4, или его участки,которые связывают CD80 и/или CD86. Внеклеточный участок мутантного CTLA4 содержит аминокислотную последовательность начиная с метионина в положении +1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124 (фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4; или фиг. 8, SEQ ID NO: 5 и 6). Или же внеклеточный участок-7 013122 мутантного CTLA4 может содержать аминокислотную последовательность начиная с аланина в положении -1 и кончая аспарагиновой кислотой в положении +124 (фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4; или фиг. 8, SEQ IDNO: 5 и 6). В одном варианте изобретения растворимый мутантный CTLA4 представляет собой слитый белок,содержащий внеклеточный домен CTLA4, имеющий одну или более мутаций в области аминокислотной последовательности начиная с серина в положении +25 и кончая аргинином в положении +33 (S25-R33). Например, аланин в положении +29 дикого типа CTLA4 может быть заменен на тирозин (кодоны: UAU,UAC). Или же, аланин может быть заменен на лейцин (кодоны: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), фенилаланин (кодоны: UUU, UUC), триптофан (кодон: UGG) или треонин (кодоны: ACU, АСС, АСА,ACG). Как легко поймут специалисты в данной области техники, урацил (U), нуклеотид последовательности РНК, соответствует тимину (Т), нуклеотиду ДНК последовательности. В другом варианте изобретения растворимый мутантный CTLA4 представляет собой слитый белок,содержащий внеклеточный домен CTLA4, имеющий одну или более мутаций в или около области аминокислотной последовательности начиная с метионина в положении +97 и кончая глицином в положении+107 (M97-G107). Например, лейцин в положении +104 дикого типа CTLA4 может быть заменен на глутаминовую кислоту (кодоны: GAA, GAG). Мутантный CTLA4, имеющий такую замену, в данном описании обозначен как L104EIG (фиг. 8, SEQ ID NO: 5 и 6). Еще в одном варианте изобретения растворимый мутантный CTLA4 представляет собой слитый белок, содержащий внеклеточный домен CTLA4, имеющий одну или более мутаций в областях S25-R33 иM97-G107. Например, в одном варианте изобретения мутантный CTLA4 имеет тирозин в положении +29 вместо аланина; и глутаминовую кислоту в положении +104 вместо лейцина. Мутантный CTLA4, имеющий эти замены, в данном описании называется L104EA29YIg (фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4). Нуклеотидная молекула, которая кодирует L104EA29YIg, содержится в pD16 L104EA29YIg и депонирована 19 июня 2000 г. в Американской коллекции типовых клеток (АТСС), 10801 University Blvd., Manassas, VA 201102209 (ATCC No. PTA-2104). Вектор pD16 L104EA29YIg является производным вектора pcDNA3 (INVITROGEN). Помимо этого, данное изобретение предусматривает мутантный CTLA4, содержащий внеклеточный домен мутантного CTLA4, показанного на фиг. 7 (SEQ ID NO: 3 и 4) или фиг. 8 (SEQ ID NO: 5 и 6),или его участок (участки), и фрагмент, который изменяет растворимость, аффинность и/или валентность мутантного CTLA4. В соответствии с практическим применением изобретения фрагмент может представлять собой константную область или его участок, например один или более из СН 1 домена, шарнира, СН 2 домена или СН 3 домена. Для применения in vivo предпочтительно, чтобы константная область иммуноглобулина не проявляла вредного иммунного ответа у субъекта. Например, в клинических протоколах может быть предпочтительным, что мутантные молекулы включают константные области человеческого или обезьяньего иммуноглобулина или ее часть. Примеры подходящих иммуноглобулиновых доменов включают,но без ограничения IgC1 (IgC гамма 1), IgC2 (IgC гамма 2), IgC3 (IgC гамма 3), IgC4 (IgC гамма 4), IgC(IgC мю), IgC1 (IgC альфа 1), IgC2 (IgC альфа 2), IgC (IgC дельта) или IgC (IgC ипсилон). Возможны другие изотипы. Кроме того, возможны константные области других иммуноглобулинов (предпочтительно константные области слабо- или неиммуногенных иммуноглобулинов или их участок). Для клинических протоколов предпочтительно, чтобы иммуноглобулиновый фрагмент не вызывал у субъекта вредного иммунного ответа. Предпочтительным фрагментом является константная область иммуноглобулина или его участок, включая константные области человеческого или обезьяньего иммуноглобулина или их участок. Примером подходящей иммуноглобулиновой области является человеческий C1, включающий шарнирную, СН 2 и СН 3 области, который может опосредовать эффекторные функции, такие как связывание с Fc рецепторами, содействующими комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), или опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). Иммуноглобулиновый фрагмент может в себе содержать одну или более мутаций (например, в домене СН 2, для снижения эффекторных функций, таких как CDC или ADCC), причем мутация модулирует способность иммуноглобулина связываться со своим лигандом за счет повышения или понижения способности связывания иммуноглобулина с Fc рецепторами. Например, мутации в иммуноглобулиновом фрагменте могут включать замены любого цистеинового остатка или всех цистеиновых остатков в шарнирной области, например цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин (фиг. 9, SEQ IDNO: 8). Иммуноглобулиновый фрагмент может также включать замену пролина в положении +148 на серин, как показано на фиг. 9 (SEQ ID NO: 8). Кроме того, мутации в иммуноглобулиновом фрагменте могут включать замену лейцина в положении +144 на фенилаланин, замену лейцина в положении +145 на глутаминовую кислоту или замену глицина в положении +147 на аланин. Примеры иммуноглобулиновых фрагментов включают фрагменты, описанные и раскрываемые в опубликованных патентных заявках США 2002/0114814 А 1 и 2004/0151725 А 1, патентах США 6444792 и 675033 и в Международной патентной заявке WO 97/28267. Другие фрагменты включают полипептидные метки ("хвосты"). Примеры подходящих меток вклю-8 013122 чают, но без ограничения, молекулу р 97, молекулу env gp120, молекулу Е 7 и молекулу ova (Dash, В., etal. (1994) J. Gen. Virol. 75: 1389-97; Ikeda, Т., et al. (1994) Gene 138: 193-6; Falk, K., et al. (1993) Cell. Immunol. 150: 447-52; Fujisaka, K. et al. (1994) Virology 204: 789-93). В качестве меток могут применяться другие молекулы (Gerard, С. et al. (1994) Neuroscience 62: 721-739; Byrn, R. et al. J. Virol. (1989) 63: 43704375; Smith, D. et al., (1987) Science 238: 1704-1707; Lasky, L., (1996) Science 233: 209-212). Помимо этого, изобретение предусматривает слитые белки растворимого мутантного CTLA4Ig,преимущественно более реактивные с CD80 и/или CD86 антигеном по сравнению с дикого типа CTLA4. Примером является L104EA29YIg, показанный на фиг. 7 (SEQ ID NO: 3 и 4). В другом варианте изобретения растворимый мутантный CTLA4 включает соединительный (соединяющий) аминокислотный остаток, локализованный между участком CTLA4 и иммуноглобулиновым участком. Соединяющая аминокислота может быть любой аминокислотой, включая глутамин. Соединяющую аминокислоту можно вводить молекулярными методами или методами химического синтеза,известными в уровне техники. В другом варианте изобретения растворимый мутантный CTLA4 включает иммуноглобулиновый участок (например, шарнирный СН 2 и СН 3 домены), в котором любой из цистеиновых остатков или все цистеиновые остатки в шарнирном домене иммуноглобулинового участка заменены на серин, например цистеиновые остатки в положениях +130, +136 или +139 (фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4; или фиг. 8, SEQ IDNO: 5 и 6). Мутантная молекула может также включать замену пролина в положении +148 на серин, как показано на фиг. 7 (SEQ ID NO: 3 и 4) на фиг. 8 (SEQ ID NO: 5 и 6). Растворимый мутантный CTLA4 может включать последовательность сигнального пептида, связанную с N-концом внеклеточного домена CTLA4 участка мутантной молекулы. Сигнальный пептид может иметь любую последовательность, которая допускает секрецию мутантной молекулы, включая сигнальный пептид онкостатина М (Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9: 2847-2853), или CD5 (Jones,N. H. et al., (1986) Nature 323: 346-349), или сигнальный пептид любого внеклеточного белка. Молекула мутантного соединения может включать сигнальный пептид онкостатина М, связанный сN-концом внеклеточного домена CTLA4, и молекулу человеческого иммуноглобулина (например, шарнир, СН 2 и СН 3), связанную с С-концом внеклеточного домена CTLA4. Молекула этого слитого белка включает сигнальный пептид онкостатина М, охватывающий аминокислотную последовательность от метионина в положении -26 до аланина в положении -1, участок CTLA4, охватывающий аминокислотную последовательность от метионина в положении +1 до аспарагина в положении +124, включительно,соединительный аминокислотный остаток глутамин в положении +125 и иммуноглобулиновый участок,охватывающий аминокислотную последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356 включительно. Растворимые мутантные CTLA4 по изобретению можно получать молекулярными методами или методами химического синтеза. Молекулярные методы могут включать следующие стадии: введение подходящей клетки-хозяина с нуклеотидом, который экспрессирует и кодирует растворимый мутантныйCTLA4; культивирование клетки-хозяина, введенной таким образом, в условиях, которые способствуют экспрессии мутантных соединений в клетке-хозяине; и выделение экспрессированных мутантных соединений (молекул). Участок сигнального пептида мутантного соединения (белка) содействует экспрессии белковых молекул на клеточной поверхности и их секреции клеткой-хозяином. Транслируемые мутантные молекулы могут претерпевать пост-трансляционную модификацию, включающую отщепление сигнального пептида с образованием зрелого белка, содержащего CTLA4 и иммуноглобулиновый участки. Отщепление может быть после аланина в положении -1, в результате образуется зрелый мутантный белок, содержащий метионин в положении +1 в качестве первой аминокислоты (фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4; или фиг. 8, SEQ ID NO: 5 и 6). Или же, отщепление может быть после метионина в положении -2, в результате образуется зрелый мутантный белок, содержащий аланин в положении -1 в качестве первой аминокислоты. Специалисты в данной области техники понимают, что в результате экспрессии L104EA29YIg в клетках млекопитающих могут продуцироваться N- и С-варианты, так что продуцированные белки могут иметь аминокислотную последовательность из остатков: (i) от +1 до +357; (ii) от -1 до +357; (iii) от +1 до+356; или (iv) от -1 до +356 (фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4; или фиг. 8, SEQ ID NO: 5 и 6). Предпочтительный вариант изобретения представляет собой мутантный CTLA4, содержащий внеклеточный домен человеческого CTLA4, связанный с целой молекулой человеческого иммуноглобулина или с ее частью (например, шарниром, СН 2 и СН 3). Это предпочтительное соединение включает CTLA4 участок растворимой молекулы, охватывающий аминокислотную последовательность от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, соединительный аминокислотный остаток в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356. Участок, содержащий внеклеточный домен CTLA4, мутирует таким образом, что аланин в положении +29 заменяется на тирозин, а лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы может мутировать таким образом, что цистеиновые остатки в положениях+130, +136 и +139 заменяются на серин. Это мутантное соединение в данном описании обозначено какL104EA29YIg (фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4). В другом варианте изобретения L104EA29YIg представляет собой мутантный белок (молекулу),имеющий аминокислотную последовательность от аланина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, соединительный аминокислотный остаток в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 (например, от+126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356). Участок, содержащий внеклеточный домен CTLA4, мутирует таким образом, что аланин в положении +29 заменяется на тирозин, а лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Иммуноглобулиновый участок мутантной молекулы мутирует таким образом, что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменяются на серин, а пролин в положении +148 заменяется на серин. Это мутантное соединение (молекула) в данном описании обозначено как L104EA29YIg (фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4). После отщепления сигнальной последовательности L104EA29YIg может начинаться либо с метионина в положении +1, либо с аланина в положении -1. Другим мутантным белком (молекулой) по изобретению является растворимый мутантный CTLA4,содержащий внеклеточный домен человеческого CTLA4, связанный с молекулой человеческого иммуноглобулина (например, с шарниром, СН 2 и СН 3). Эта молекула включает участок аминокислотной последовательности, кодирующей CTLA4, начиная с метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, соединительный аминокислотный остаток глутамин в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356. Участок, содержащий внеклеточный доменCTLA4, мутирует таким образом, что лейцин в положении +104 заменяется на глутаминовую кислоту. Шарнирный участок мутантной молекулы мутирован таким образом, так что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменены на серин, а пролин в положении +148 заменен на серин. Эта мутантная молекула обозначена в данном описании как L104EIg (фиг. 8, SEQ ID NO: 5 и 6). Или же, вариант изобретения L104EIg представляет собой растворимый мутантный CTLA4, содержащий внеклеточный домен человеческого CTLA4, связанный с молекулой человеческого иммуноглобулина (например, с шарниром, СН 2 и СН 3). Эта предпочтительная молекула (предпочтительное соединение) включает участок CTLA4, охватывающий аминокислотную последовательность, начиная с аланина в положении -1 до аспарагиновой кислоты в положении +124, соединительный аминокислотный остаток глутамин в положении +125 и иммуноглобулиновый участок, охватывающий последовательность от глутаминовой кислоты в положении +126 до лизина в положении +357 или глицина в положении +356. Участок, содержащий внеклеточный домен CTLA4, мутирует таким образом, что лейцин в положении+104 заменяется на глутаминовую кислоту. Шарнирный участок мутантной молекулы мутирован таким образом, что цистеиновые остатки в положениях +130, +136 и +139 заменены на серин, а пролин в положении +148 заменен на серин. Эта мутантная молекула обозначена в данном описании как L104EIg(фиг. 8, SEQ ID NO: 5 и 6). Помимо этого, изобретение предусматривает растворимый мутантный CTLA4, имеющий: (а) первую аминокислотную последовательность мембранного гликопротеина, например, CD28, CD86, CD80,CD40 и gp39, которая блокирует пролиферацию Т клеток, слитую со второй аминокислотной последовательностью; (б) вторую аминокислотную последовательность, являющуюся фрагментом внеклеточного домена мутантного CTLA4, которая блокирует пролиферацию Т клеток, такую, например, как аминокислотная последовательность от метионина в положении +1 до аспарагиновой кислоты в положении +124(фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4; или фиг. 8, SEQ ID NO: 5 и 6); третью аминокислотную последовательность,которая служит в качестве идентификационной метки или повышает растворимость молекулы. Например, третья аминокислотная последовательность может состоять главным образом из аминокислотных остатков шарнирной, СН 2 и СН 3 областей неиммуногенного иммуноглобулина. Примеры подходящих иммуноглобулинов включают, но без ограничения, человеческий или обезьяний иммуноглобулин, например, IgC1. Возможны также другие изотипы. Настоящее изобретение также предусматривает способ лечения иммунного нарушения, ассоциированного с пересадкой трансплантата, путем введения субъекту эффективной дозы мутантного CTLA4 с внеклеточным доменом CTLA4, показанным SEQ ID NO: 8, начиная с аланина в положении 26 или метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150, или его участком. Кроме того, во внеклеточном домене или его участке аланин в положении 55 заменен глутаминовой кислотой. Кроме того, схема введения содержит схему ранней фазы лечения, причем схема ранней фазы может продолжаться от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации и включает введение, первоначально более частое, чем раз в месяц. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает способ лечения иммунного нарушения, ассоциированного с пересадкой трансплантата, путем введения субъекту эффективной дозы мутантногоCTLA4 с аминокислотной последовательностью начиная с метионина в положении 27 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150 по SEQ ID NO: 4, или с аминокислотной последовательностью начиная с аланина в положении 26 и кончая аспарагиновой кислотой в положении 150 по SEQ ID NO: 4. Кроме того, схема введения мутантного CTLA4 содержит схему ранней фазы лечения, причем схема ранней- 10013122 фазы может продолжаться от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации и включает введение, первоначально более частое, чем раз в месяц. Кроме того, изобретение предусматривает нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности, соответствующие растворимым мутантным CTLA4 по изобретению. В одном варианте изобретения нуклеиновая кислота представляет собой ДНК (например, кДНК) или ее гибрид. Или же, нуклеиновая кислота представляет собой РНК или ее гибрид. Кроме того, изобретение предусматривает вектор, который содержит нуклеотидные последовательности по изобретению. Также предусматривается система вектор-хозяин. Система вектор-хозяин содержит вектор по изобретению в подходящей клетке-хозяине. Примеры подходящих клеток-хозяев включают, но без ограничения, прокариотические и эукариотические клетки. Изобретение включает фармацевтические композиции для применения при лечении иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата, содержащие фармацевтически эффективные дозы растворимого мутантного CTLA4. В некоторых вариантах изобретения иммунные нарушения, ассоциированные с пересадкой трансплантата, опосредуются взаимодействиями CD28 и/или CTLA4 позитивных клеток с CD80 и/или CD86-позитивными клетками. Растворимые мутантные CTLA4, предпочтительно, имеют одну или более мутаций во внеклеточном домене CTLA4. Фармацевтическая композиция может включать растворимый мутантный CTLA4 белок и/или нуклеиновую кислоту и/или векторы, кодирующие этот белок. В предпочтительных вариантах изобретения растворимый мутантныйCTLA4 имеет последовательность внеклеточного домена CTLA4, показанную на фиг. 7 (SEQ ID NO: 3 и 4) или 8 (SEQ ID NO: 5 и 6), L104EA29Y или L104E соответственно. Еще более предпочтительно растворимый мутантный CTLA4 представляет собой L104EA29YIg, раскрываемый в данном описании. Кроме того, композиция может включать другие терапевтические агенты, включая, но без ограничения, лекарственные токсины, ферменты, антитела или конъюгаты. Предпочтительно фармацевтические композиции включают также подходящие носители и адъюванты, которые включают любой материал, который, при смешении с белками (молекулами) по изобретению (например, с растворимым мутантным CTLA4, таким как L104EA29Y или L104E), сохраняют активность молекулы и нереактивны по отношению к иммунной системе субъекта. Примеры подходящих носителей и адъювантов включают, но без ограничения, человеческий сывороточный альбумин; ионообменные вещества; оксид алюминия; лецитин; буферные вещества, такие как фосфаты; глицин; сорбиновую кислоту; сорбат калия; и соли или электролиты, такие как протаминсульфат. Другие примеры включают любые стандартные фармацевтические носители, такие как фосфатно-солевой буферный раствор; вода; эмульсии, такие как эмульсия масла в воде; и различные типы смачивающих веществ. Другие носители могут включать также стерильные растворы; таблетки, включая таблетки, покрытые оболочкой, и капсулы. Обычно такие носители содержат эксципиенты, такие как крахмал, молоко, сахар, некоторые виды глины, желатин, стеариновую кислоту или ее соли, стеарат магния или кальция, тальк, растительные жиры и масла, камеди, гликоли или другие известные эксципиенты. Такие носители могут также включать вкусовые добавки и красители или другие ингредиенты. Композиции, содержащие такие носители, готовят общеизвестными традиционными методами. Такие композиции можно также готовить в различных липидных композициях, таких как, например, липосомы, а также в различных полимерных композициях, таких как полимерные микросферы. Фармацевтические композиции по изобретению можно вводить субъекту традиционными способами, включая, но без ограничения, внутривенное (в.в.) введение, интраперитонеальное (и.п.) введение,внутримышечное (в.м.) введение, подкожное введение, пероральное введение, введение в виде суппозитория или при топическом контакте, или имплантация устройства пролонгированного действия, такого как миниосмотический насос. Фармацевтические композиции по изобретению могут быть в виде различных лекарственных форм,которые включают, но без ограничения, жидкие растворы или суспензии, таблетки, пилюли, порошки,суппозитории, полимерные микрокапсулы или микровезикулы (микропузырьки), липосомы и инъецируемые или вливаемые (инфузия) растворы. Предпочтительная форма зависит от способа введения и терапевтического применения. Ниже приводится типичная фармацевтическая композиция по изобретению для внутривенного- 11013122 Композиция лиофилизированного фармацевтического продукта,содержащего 100 мг L104EA29YIg/ампула Каждая ампула (флакон) содержит 10% избыток восстановленного раствора с учетом остатка в ампуле, игле и шприце. Лиофилизированный фармацевтический продукт может быть составлен с водным носителем. Представляющий интерес водный носитель по данному описанию представляет собой водный носитель, являющийся фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксическим для введения человеку) и применимым для приготовления жидкого препарата, после лиофилизации. Как правило, лиофилизированный фармацевтический продукт готовят из расчета 25 мг/мл с 10 мл либо стерильной воды для инъекций,USP (SWFI), либо 0.9% хлорида натрия для инъекций, USP. Далее полученный раствор разводят 0.9% раствором хлорида натрия для инъекций, USP, до концентрации фармацевтического продукта между 1 и 10 мг/мл. Разведенный фармацевтический продукт для инъекций является изотоническим и пригоден для введения с помощью внутривенной инфузии (вливания). Поверхностно-активное вещество можно добавлять в препарат в количестве, достаточном для уменьшения или предотвращения взаимодействия созданного (составленного) фармацевтического продукта с силиконизированным шприцом. Наиболее эффективный способ введения и наиболее эффективная схема приема композиций по данному изобретению зависит от тяжести и течения заболевания, состояния здоровья пациента и его реакции на лечение и мнения лечащего врача. Соответственно, дозировки (также известные как дозы) композиций следует титровать для отдельного пациента. Растворимый мутантный CTLA4 можно вводить субъекту в количестве, с частотой, достаточной, и через промежуток времени (например, продолжительность и/или многократность), достаточный для того, чтобы блокировать связывание эндогенного В 7 (например, CD80 и/или CD86) с их соответствующими лигандами, в организме субъекта. Блокада связывания эндогенного В 7/лиганд тем самым ингибирует взаимодействия между В 7-позитивными клетками (например, CD80- и/или CD86-позитивными клетками) и CD28- и/или CTLA 4-позитивными клетками. Доза терапевтического агента зависит от многих факторов, в том числе, но без ограничения, тип пораженных клеток, тип иммунного нарушения, ассоциированного с подвергающейся лечению пересадкой трансплантата, тяжесть заболевания, здоровье субъекта и реакцию субъекта на лечение агентами. Дозы веществ (молекул) или фармацевтических композиций по изобретению зависят от массы тела,а схемы введения могут определяться целевыми профилями сывороточного минимума (углубления, впадины). Обычно целевой минимальной (впадина) сывороточной концентрации мутантного CTLA4 по изобретению между 3 и около 30 мкг/мл в первые 3-6 месяцев после трансплантации бывает достаточно для сохранения функции аллотрансплантата, предпочтительно, около 5-20 мкг/мл. Обычно целевая минимальная (впадина) сывороточная концентрация мутантного CTLA4 по изобретению в поддерживающей фазе составляет около 0.2-3 мкг/мл, предпочтительно около 0.25-2.5 мкг/мл. Мутантный CTLA4 по изобретению можно вводить в количестве около 0.1-20 мг/кг веса пациента,как правило, около 1.0-15.0 мг/кг. Например, L104EA29Y можно вводить в количестве 10 мг/кг массы пациента в течение ранней фазы, периода высокого риска после трансплантации, и снижается до 5 мг/кг веса пациента в качестве поддерживающей дозы. Введение белков или фармацевтических композиций по изобретению можно делать через различные промежутки времени, обычно схемы приема (введения) включают раннюю фазу, во время которой дозы выше и частота введения повышается во время наивысшего иммунологического риска, с последующей поддерживающей фазой. Схема ранней фазы может быть от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации и включает введение, первоначально более частое, чем раз в месяц, предпочтительно с частотой раз в день, раз в неделю или каждые две недели в зависимости от иммунологического риска и/или целевой минимальной (впадина) сывороточной концентрации. Поддерживающая фаза начинается, когда кончается ранняя фаза, и включает введение не чаще раза в месяц и длится столько, сколько необходимо,как правило, столько времени, сколько у пациента сохраняется трансплантат. По данному описанию день 1 определяется как день трансплантации или первый день лечения соединениями (молекулами) или фармацевтическими композициями по изобретению. Дозировка мутантного CTLA4 по изобретению на ранней фазе составляет около 8-12 мг/кг массы тела пациента, предпочтительно около 10 мг/кг. Дозировка мутантного CTLA4 по изобретению в поддерживающей фазе составляет около 3-7 мг/кг массы тела пациента, предпочтительно около 5 мг/кг.- 12013122 Ранняя фаза может продолжаться от первых 3 до 6 месяцев после трансплантации. Схема введения во время ранней фазы может меняться в зависимости от состояния реципиента и/или трансплантата. Например, более интенсивная схема на ранней фазе включает введение повышенной дозы соединений (белков, молекул) или фармацевтических композиций по изобретению при посещении в день 1, день 5, через 2 недели (например, день 13-17), чем каждые две недели в течение первых 3 месяцев (например, посещение на неделе 4, посещение на неделе 6, посещение на неделе 8, посещение на неделе 10 и посещение на неделе 12), с последующими ежемесячными визитами вплоть до 6 месяцев (например, посещение на 4 месяце, посещение на 5 месяце, посещение на 6 месяце). Примером типичной более интенсивной схемы на ранней фазе является введение L104EA29YIg в количестве 10 мг/кг массы тела пациента в дни 1, 5, 15,29, 43, 57, 71, 85, 113, 141 и 169. По менее интенсивной схеме, например, вводят соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по изобретению в день 1, при посещении на неделе 2, неделе 4, затем ежемесячно до месяца 3 включительно. Примером типичной менее интенсивной схемы на ранней фазе является введение L104EA29YIg в количестве 10 мг/кг массы тела пациента в дни 1, 15,29, 57 и 85. Как правило, после ранней фазы следует поддерживающая фаза, во время которой более низкие дозы соединений (белков, молекул) или фармацевтических композиций по изобретению вводят с интервалами один-два месяца столько времени, сколько необходимо, как правило, столько времени, сколько у пациента сохраняется трансплантат. Более интенсивная схема поддерживающей фазы в вышеприведенном примере включает ежемесячное введение L104EA29YIg в количестве 5 мг/кг массы тела пациента,начиная с посещения на 7 месяце. В то время как менее интенсивной схемы поддерживающей фазы в вышеприведенном примере включает ежемесячное введение L104EA29YIg в количестве 5 мг/кг массы тела пациента, начиная с посещения на 4 месяце. Или же, специалист в данной области техники способен модифицировать схему введения в зависимости от степени риска пациента и/или реакции на посттрансплантационную терапию. Например, менее интенсивную схему ранней фазы, описанную выше, можно модифицировать, добавляя к схеме введение на день 5, тем самым увеличивая частоту введения в период наивысшего иммунологического риска. Выражения "четыре недели", "месяц", "месяцы" или "ежемесячно" по данному описанию относятся к периоду 285 дней. Выражение "две недели" по данному описанию относится к периоду 143 дня. Гибкость схемы введения требуется для того, чтобы упростить планирование введения в течение жизни реципиентов трансплантата, в то же время поддерживая целевой минимальный (впадина) профиль мутантного CTLA4 по изобретению. Разрешенные интервалы для введения доз можно представить следующим образом: Намеченный день получают прибавлением необходимого промежутка времени к фактической дате предыдущего посещения. Заданный промежуток времени до посещения на неделе 2 составляет 10 дней. Заданное время составляет 14 дней до посещения, планируемого через две недели после предыдущего посещения, например посещения на неделе 6 после посещения на неделе 4. Заданное время составляет 28 дней до посещения, планируемого через месяц или четыре недели после предыдущего посещения,например посещения в 4 месяце после посещение в 3 месяце. Заданное время составляет 56 дней до посещения, планируемого через два месяца после предыдущего посещения, например посещения в 8 месяце после посещения в 6 месяце. Например, фактическая дата посещения день 15 плюс 14 дней дают намеченный день 29 на неделе 4. На основании вышеуказанного интервала (окна) посещения введение можно осуществлять на 29 день 3 дня. Если введение осуществляют в день 26, этот день становится фактической датой посещения, используемой для расчета следующей намеченной даты. Реципиенты с низкой степенью риска острого отторжения трансплантата обычно включают тех реципиентов, которые получают трансплантаты от живых родственных доноров и у реципиентов из удачно подобранных пар реципиент/доноры. Реципиенты с высокой степенью риска острого отторжения трансплантата обычно включают тех реципиентов, которые получают трансплантаты от маргинальных доноров или повторные трансплантаты, имеют большой набор реактивных антител или являются афроамериканцами. Помимо непосредственного риска острого отторжения трансплантата, применение поддерживающих лекарств, таких как ингибиторы кальциневрина и стероиды, в течение длительного времени вызывает токсичность, которая негативно влияет на отдаленный результат и качество жизни пациента. Например, побочные эффекты поддерживающих лекарств включают нефротоксичность (CAN), приводящую в результате к снижению почечной функции и/или утрате трансплантата, и сердечно-сосудистые и метабо- 13013122 лические заболевания, такие как гипертензия, гиперлипидемия и диабет, которые вызывают сердечнососудистые заболевания и смерть. Другие побочные эффекты включают гирсутизм, алопецию, гипертрофический гингивит, тремор, нейротоксичность и остеопороз, что приводит к несоблюдению режима и ухудшению качества жизни. Соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по изобретению могут применяться для того, чтобы избежать этих последствий, понизить заболеваемость, развитие и/или прогрессирование этих последствий при лечении иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата, или для лечения иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата, у пациентов, у которых риск этих последствий высок. Соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по изобретению можно применять для улучшения почечной функции, такой, которая измеряется СКФ (GFR). Введение соединений (молекул) или фармацевтических композиций по изобретению можно осуществлять с помощью внутривенного вливания (инфузии) в течение периода от 30 мин до 1 ч. Или же, нужную дозу можно доставлять с помощью разовой подкожной инъекции или многократных подкожных инъекций. Типичным способом введения является тридцатиминутное внутривенное вливание, применяемое на ранней фазе лечения, в то время, когда пациент находится в больнице и/или наносит плановые визиты к профессиональному работнику здравоохранения с целью мониторинга. Подкожная инъекция является типичным способом введения, применяемым в поддерживающей фазе, что позволяет пациенту вернуться к их обычному графику вследствие уменьшения числа посещений профессионального работника здравоохранения для внутривенных вливаний. Другой вариант изобретения предусматривает способ лечения иммунного нарушения, ассоциированного с пересадкой трансплантата у субъектов, которые получали альтернативную иммунодепрессивную терапию после трансплантации. Субъекты, получающие альтернативную фармацевтическую иммунодепрессивную терапию, могут сменить ее, или переключиться, или обратиться к терапии, включающей соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по настоящему изобретению, при этом отменив альтернативное (другое) лекарство. Обычно фармацевтический препарат, который следует исключить, постепенно уменьшают в течение соответствующего периода времени на основании предписанных для конкретного лекарства инструкций, в то же время соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по настоящему изобретению вводят чаще чем раз в месяц. Когда субъект полностью отказывается от другого (альтернативного) лекарства, он может вернуться к стандартной поддерживающей схеме с применением соединений (молекул) или фармацевтических композиций по настоящему изобретению. Например, субъект, получающий лечение по схеме CsA/MMFкортикостероид, может заменитьCsA на L104EA29YIg по схеме L104EA29YIg/MMFкортикостероид. Схема изменения введения может включать постепенное уменьшение дозы CsA в течение двух месяцев и введение 5 мг/кг L104EA29YIg каждые две недели в течение этих двух месяцев. Когда CsA исключен, субъект вступает в поддерживающую фазу и продолжает получать 5 мг/кг каждые 4 или 8 недель в продолжение лечения в отсутствиеCsA. В одном варианте изобретения предусматриваются подходящие дозы растворимого мутантногоCTLA4 по данному описанию, позволяющие эффективно блокировать взаимодействия В 7 с его лигандом и лечить заболевание иммунной системы. Например, доза может определяться массой тела, а схему введения могут диктовать целевые сывороточные минимальные (впадина) профили. Например, эффективные целевые минимальные сывороточные концентрации растворимого мутантного CTLA4, раскрываемого в данном описании, для лечения заболевания иммунной системы могут составлять около 0.1-30 мкг/мл. Или же, растворимый мутантный CTLA4, раскрываемый в данном описании, можно вводить в количестве около 0.1-20.0 мг/кг массы тела пациента для лечения заболеваний иммунной системы. Помимо этого, настоящее изобретение предусматривает способы лечения иммунных нарушений,ассоциированных с пересадкой трансплантата. В конкретных вариантах изобретения иммунные нарушения, ассоциированные с пересадкой трансплантата, опосредуются взаимодействиями CD28- и/илиCTLA4-позитивных клеток с CD80/CD86-позитивными клетками. В другом варианте изобретения ингибируются взаимодействия Т клеток. Эти способы включают введение субъекту растворимого мутантногоCTLA4 по изобретению для регуляции взаимодействий Т клеток с CD80- и/или CD86-позитивными клетками. Примеры иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата, обсуждаются выше. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает способ профилактики или ингибирования или предупреждения отторжения трансплантата плотных органов, ткани, клеток и/или наружных органов у субъекта, причем субъект является реципиентом трансплантата плотных органов, ткани, клеток и/или наружных органов. Обычно при трансплантации отторжение трансплантата начинается с распознавания его Т клетками как чужеродного с последующим иммунным ответом, который разрушает трансплантат. Растворимые мутантные CTLA4 по настоящему изобретению, ингибируя пролиферацию Т лимфоцитов и/или секрецию цитокинов, могут привести к пониженной деструкции ткани и к ингибированию антиген-специфической невосприимчивости Т клеток, что может обеспечить стойкое (долговременное) приживление трансплантата. В исследовании, описанном в примере 3, сравнивают эффективность и безопасность L104EA29YIg- 14013122 как поддерживающего иммунодепрессанта с циклоспорином A (CsA) в течение 12 месяцев при применении в схеме в качестве компонента в не содержащей CNI (кальциневрин) комбинации по схеме, включающей индукцию базиксимабом (Simulect; Novartis), микофенолята мофетил (MMF; CellCept; Roche) и кортикостероиды у реципиентов трансплантата. Цели (задачи) включали оценку частоты возникновения острого отторжения трансплантата (подтвержденного биопсией или предполагаемого) через 6 месяцев или через 1 год; измерение скорости (уровней) гломерулярной (клубочковой) фильтрации (СКФ,GFR), рассчитываемых по клиренсу йогексола через 1, 6 и 12 месяцев; параметры гипертензии, включая сывороточный холестерин и триглицериды; и общую безопасность. Другие определяемые данные включают смерть пациента или потерю трансплантата через 1 год; тяжесть острого отторжения; заболеваемость сахарным диабетом после трансплантации [который определяется требующей любого лечения гипергликемией в течение 4 недель, или содержанием гемоглобина А 1 С (HbA1c)7%, у пациентов, ранее не считавшихся диабетиками]; СКФ (GFR), рассчитанные по формулам в исследовании "Модификация Диеты при Почечном Заболевании" (MDRD, Levey A.S., Bosch J.P., Lewis J.P., Greene T., Rogers N., Rothtransplantation. Transplantation. 1995; 59(12): 1683-1689); фармакокинетику и иммуногенность. Диагностику и лечение острого отторжения (AR) осуществляют по критериям международной классификацииBanff 97 (Racusen L.C., Solez K., Colvin R.B., et al. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology. Kidney Int 1999; 55(2): 713-23). Проводят post hoc (вторичный) анализ частоты встречаемости хронической нефропатии аллотрансплантата (CAN). Это 12-месячное исследование показало, что поддерживающая терапия на основе L104EA29YIg обеспечивает эквивалентную CsA эффективность предупреждения AR и аналогичную CsA жизнеспособность пациента и трансплантата. Кроме того, L104EA29YIg продемонстрировал значительное улучшение почечной функции и снижение CAN по сравнению с поддерживающей иммунодепрессией (иммуносупрессией) на основе CsA. L104EA29YIg был безопасен, хорошо переносился и не ассоциировался с типичной обусловленной CNI токсичностью. Оказалось, что повышенная почечная функция в течение первого года после трансплантации согласуется с более благоприятными отдаленными результатами (Hariharan S., McBride M.A., Cherikh W.S.,Tolleris C.B., Bresnahan B.A., Johnson C.P. Post-transplant renal function in the first year predicts long-termkidney transplant survival. Kidney Int 2002; 62(1): 311-8), тогда как продолжительное применение CNI ограничивается их нефротоксичностью (Danovitch G.M. Immunosuppressive medications for renal transplantation: a multiple choice question. Kidney Int 2001; 59(1): 388-402), которая приводит к пониженной функции трансплантата и к почечной недостаточности со всеми вытекающими проблемами. Таким образом, возможно, наиболее значительными результатами, наблюдаемыми при лечении L104EA29YIg, являются превосходные СКФ (GFR) в сочетании с гистологией почки через 12 месяцев, показывающей замедление развития и/или прогрессирования CAN по сравнению с CsA. Это был неожиданный результат, и это был первый случай, когда открытие подобного рода было проиллюстрировано в Фазе II рандомизированного испытания иммунодепрессивного лекарственного средства. Так как сохранение массы нефронов с помощью предупреждения иммунологических, сердечно-сосудистых и/или метаболических инсультов способствует благоприятному действию на выживаемость (жизнеспособность) как пациента, так и трансплантата, возможно, что L104EA29YIg может ассоциироваться с более благоприятными отдаленными результатами. Эти результаты особенно важны при увеличивающемся использовании органов в случае доноров и реципиентов с расширенными критериями, так как они особенно чувствительны к CNI-связанной токсичности. Снижение частоты встречаемости CV и метаболических событий у пациентов, перенесших трансплантацию почки, также является важнейшим для улучшения отдаленных (долговременных) результатов. Соединения (молекулы) или фармацевтические композиции по изобретению можно применять для лечения иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата у субъектов, которые являются реципиентами с расширенными критериями и/или которые получают трансплантаты от доноров,отвечающих расширенным критериям. Эти критерии, частично основанные на критериях Службы обеспечения донорскими органами (UNOS), могут включать один или более следующих показателей: возраст моложе 10 лет или старше или равен 60 годам; донор после остановки сердца; ожидаемое "холодноишемическое" время (время хранения донорского органа до трансплантации) более или равно 24 ч; субъекты, которым делают трансплантацию в первый раз, с текущим PRA50%, или, в случае ретрансплантации, с PRA30%; субъекты, у которых произошла утрата прежнего трансплантата вследствие острого отторжения в течение первых 6 месяцев после трансплантации; субъекты с позитивной Т-клеточной лимфоцитотоксической перекрестной пробой (кросс-матч тест) при использовании лимфоцитов донора и- 15013122 сыворотки реципиента; субъекты с ВИЧ инфекцией; субъекты с активной формой туберкулеза, требующего лечения в течение предыдущих 3 лет; или другие критерии Службы обеспечения донорскими органами (UNOS). Пример возможных расширенных критериев для донора и/или донорской почки включает по меньшей мере 1 из нижеприведенных критериев для донорских органов. а) Возраст донора 60 лет OR. б) Возраст донора 50-59 лет и 1 из следующих обстоятельств: (i) инсульт (CVA) + гипертензия +(в) CIT24 ч, возраст донора 10 лет OR. г) Донор с остановкой сердца (донор, у которого нет пульса). Настоящее изобретение предусматривает также способы ингибирования болезни трансплантатапротив-хозяина у субъекта. Этот способ заключается во введении субъекту растворимого мутантногоCTLA4 по изобретению, самостоятельно или в комбинации, одновременно или последовательно, с другими дополнительными лигандами, реактивными в отношении IL-2, IL-2R, IL-4 или -интерферона. Например, растворимый мутантный CTLA4 по изобретению можно вводить реципиенту в трансплантат костного мозга для ингибирования аллореактивности донорских Т клеток. Или же, донорские Т клетки в трансплантате костного мозга можно сделать толерантными к аллоантигенам реципиента ex vivo перед трансплантацией. Растворимый мутантный CTLA4 по изобретению, например L104EA29Y, можно вводить как единичный активный ингредиент или в комбинации, одновременно или последовательно, с одним или более других лекарств в схемах иммуномодулирующей терапии, иммуносупрессорами (иммунодепрессантами) и/или другими противовоспалительными агентами, например, для лечения, предупреждения или ингибирования или профилактики острого или хронического отторжения аллотрансплантата или ксенотрансплантата или для индукции толерантности. Например, его можно использовать в комбинации с ингибитором кальциневрина (например, циклоспорином А или FK506); макролидом иммунодепрессивного действия (например, такролимусом, рапамицином, сиролимусом) или его производным (например, 40-О-(2 гидрокси)этилрапамицином, сиролимусом, центиканом); агентом хоуминга лимфоцитов (например,FTY720) или его аналогом (FK778, Jak-3), кортикостероидами; циклофосфамидом; азатиопреном; метотрексатом; лефлуномидом или его аналогом; мизорибином; микофенольной кислотой; микофенолята мофетилом; 15-дезоксиспергуалином или его аналогом; иммуносупрессорными моноклональными антителами (например, базиликсимабом, даклизумабом), лигандами, моноклональными антителами или фрагментами антител к рецепторам лейкоцитов (например, МНС, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25,CD27, В 7, CD40, CD45, CD58, CD 137, ICOS, CD150 (SLAM), OX40, 4-1BB или их лиганды); или другими иммуномодулирующими соединениями (например, CTLA4/CD28-Ig), или другими ингибиторами молекул адгезии (например, mAb) или низкомолекулярными ингибиторами, включая антагонисты LFA-1,антагонисты селектина и антагонисты VLA-4. Соединение особенно применимо в комбинации с соединением, которое является помехой CD40 и его лиганду (например, антитела к CD40 или к CD40-L), таким как Chi220 (патент США 6051228), например, в вышеописанных показаниях, например, при индукции толерантности. Если растворимый мутантный CTLA4 по изобретению вводится одновременно или последовательно в сочетании с другим иммуносупрессором (иммунодепрессантом)/иммуномодулятором, например, по данному описанию, дозы вводимого совместно иммунодепрессанта или иммуномодулятора, естественно,меняются в зависимости от типа используемого совместно лекарства ("солекарства"), например, от того,является ли оно стероидом или циклоспорином, от конкретного используемого лекарства, от состояния,которое нужно лечить и т.д. В соответствии с вышеописанным, настоящее изобретение предусматривает, помимо этого, терапевтические комбинации, например, набор для применения в любом способе по определению выше, содержащий L104EA29YIg в свободном виде или в виде фармацевтически приемлемой соли, для одновременного или последовательного применения, по меньшей мере, с одной фармацевтической композицией,содержащей иммунодепрессант, иммуномодулятор или противовоспалительное лекарство. Набор может содержать инструкции для применения. В соответствии с вышеописанным, настоящее изобретение предусматривает, еще в одном аспекте,способы по определению выше, содержащие введение, например, одновременно или последовательно,терапевтически эффективной дозы мутантного растворимого CTLA4 по изобретению с иммунодепрессантами (иммуносупрессорами). Иммунодепрессанты включают растворимый gp39 (также известный какVCAM-1, растворимый LECAM-1, растворимый ELAM-1, растворимый CD44, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с gp39 (например, АТСС НВ-10916, АТСС НВ-12055 или АТСС НВ 12056), лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с CD40 (например, АТСС НВ-9110), ли- 16013122 ганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с В 7 (например, АТСС НВ-253, АТСС CRL-2223,АТСС CRL-2226, АТСС НВ-301, АТСС НВ-11341, и т.д.), 1 лиганды, антитела или фрагменты антитела,реактивные с CD28 (например, АТСС НВ-11944 или mAb 9.3, описанное Martin et al. (J. Clin. Immun. 4(1): 18-22, 1980), лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с LFA-1 (например, АТСС НВ-9579 и АТСС TIB-213), лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с LFA-2, лиганды,антитела или фрагменты антитела, реактивные с EL-2 или IL-2R, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с IL-12, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с IFN-гамма, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с CD2, лиганды антител, антитела или фрагменты антитела, реактивные с CD48, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с любыми ICAM(например, ICAM-1 (АТСС CRL-2252), ICAM-2 и ICAM-3), лиганды, антитела или фрагменты антитела,реактивные с CTLA4 (e.g., АТСС НВ-304), лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные сThy-1, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с CD56, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с CD3, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с CD29, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с TCR, лиганды, антитела или фрагменты антитела,реактивные с VLA-4, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с VCAM-1, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с LECAM-1, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с ELAM-1, лиганды, антитела или фрагменты антитела, реактивные с CD44. В некоторых вариантах изобретения предпочтительны моноклональные антитела. В других вариантах изобретения предпочтительными являются фрагменты антитела. Фрагменты антитела включают, но без ограничения, Fab,Fab', F(ab')2, Fv, scFv и доменные антитела (dAb, вариабельные домены тяжелых цепей), включая, но без ограничения, эти фрагменты, описанные в Международной заявке WO 2006/030220. Как легко поймут специалисты в данной области техники, комбинация может включать растворимый мутантный CTLA4 по изобретению и еще один иммуносупрессор, растворимый мутантный CTLA4 по изобретению и два других иммуносупрессора, растворимый мутантный CTLA4 по изобретению и еще три иммуносупрессора и т.д. Можно определить оптимальные комбинации и дозы и оптимизировать их общеизвестными в уровне техники методами. Особенно применимой комбинацией является комбинация L104EA29YIg или его фармацевтической композиции с соединением, которое мешает IL-2 и его лиганду, конкретно, антагонистом, нацеленным на 1L-2R(альфа), который селективно экспрессируется на поверхности активированных Т-лимфоцитов. Соединение, которое связывается с 1L-2R(альфа), конкурентно ингибирует опосредованную IL-2R активацию лимфоцитов, которая представляет собой важнейший каскад реакций в клеточном иммунном ответе, сопровождающий отторжение аллотрансплантата. Ниже представлены некоторые конкретные комбинации: L104EA29YIg и CD80 моноклональные антитела (mAbs); L104EA29YIg и CD86 mAbs; L104EA29YIg, CD80 mAbs и CD86 mAbs; L104EA29YIg иgp39 mAbs; L104EA29YIg и CD40 mAbs; L104EA29YIg и CD28 mAbs; L104EA29YIg, CD80 и CD86 mAbs и gp39 mAbs; L104EA29YIg, CD80 и CD86 mAbs и CD40 mAbs; и L104EA29YIg, анти-LFA1 mAb и антиgp39 mAb. Конкретным примером gp39 mAb является MR1. Специалисты в данной области техники сразу оценят и представят другие комбинации. В соответствии с вышеизложенным еще в одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способы по определению выше, включающие совместное введение, например одновременно или последовательно, терапевтически эффективной дозы растворимого мутантного CTLA4 по изобретению с дополнительным агентом и/или кортикостероидом. Целью является заменить токсические ингибиторы кальциневрина мутантным CTLA4 по изобретению. Однако мутантный CTLA4 по изобретению также может вводиться, одновременно или последовательно, совместно с CNI, такими как циклоспорин(Neoral, Сандиммун от Novartis) и такролимус (FK506, Програф от Fujisawa). Примеры дополнительных агентов включают, но без ограничения, ингибиторы инозинмонофосфат-дегидрогеназы (MPDH), например микофенолята мофетил (MMF, Селлсепт от Roche Laboratories) и микофенольную кислоту (Мифортик от Novartis); рапамицин (сиролимус, Рапамун отWyeth/Ayerst); азатиоприн (Азарсан от Salix, Имуран, дженерик); агент хоуминга лимфоцитов, например FTY720 (от Novartis); FK778 (от Fujisawa); Jak-3 (от Pfizer); и Сертикан (эверолимус от Novartis). Примеры кортикостероидов включают, но без ограничения, бетаметазон, будезонид, кортизол, кортизон, дексаметазон, гидрокристин, метилперднизолон, преднизолон, преднизон и триамцинолон. Типичные комбинации для совместного введения включают, но без ограничения, L104EA29YIg и по меньшей мере один дополнительный агент, выбранный из перечисленной выше группы;L104EA29YIg и по меньшей мере один кортикостероид, выбранный из перечисленной выше группы;L104EA29YIg, MMF (Селлсепт от Roche) и кортикостероид, выбранный из перечисленной выше группы;L104EA29YIg, рапамицин (сиролимус, Рапамун от Wyeth/Ayerst) в присутствии или в отсутствие кортикостероида, выбранного из перечисленной выше группы. Описанные выше комбинации для совместного введения можно применять с индукционным агентом, таким как иммуносупрессивные (иммуносупрессорные) моноклональные антитела, например базиликсимаб (Симулект от Novartis), мурономаб (Ортоклон ОКТ 3 от Ortho Biotech), ритуксимаб (Ритук- 17013122 сан от Genentech) и даклизумаб (Зенапакс от Roche Labs); или антитимоцит-глобулин (Тимоглобулин от SangStat). Например, подходящие комбинации включают, но без ограничения, базиликсимаб (Симулект от Novartis) с L104EA29YIg, MMF (Селлсепт от Roche) и преднизолон; или даклизумаб (Зенапакс от Roche), L104EA29YIg и рапамицин (сиролимус, Рапамун от Wyeth/Ayerst). Обычно на стандартные дозы и схему введения совместно вводимых лекарств, описанных выше, не влияет добавление к схеме лечения мутантного CTLA4 по изобретению. Однако специалист в данной области техники может назначать более низкие дозы совместно вводимых лекарств, например, дополнительных агентов и/или кортикостероидов, за счет включения в схему лечения менее токсичного мутантного CTLA4 по изобретению. При назначении каждого совместно вводимого лекарства можно руководствоваться сведениями во вкладыше в упаковку. Кортикостероид можно вводить совместно с соединением или с композицией по изобретению. Например, пациентов можно лечить, давая кортикостероид каждый день. Один метод поддерживающей стероидной терапии и постепенного уменьшения дозы стероида может включать 500 мг в.в. метилпреднизолона в операционной (OR) перед операцией, 250 мг в.в. метилпреднизолона на 2 день,а затем преднизон (или преднизолон) 100 мг перорально на 3 день, с последующим постепенным снижением дозы преднизона (или преднизолона) до 20-30 мг/день к концу недели 2, с последующим постепенным снижением дозы преднизона (или преднизолона), доводя ее через 6 месяцев не ниже, чем до 2.5 мг/день. Пациентам можно давать дозу, по меньшей мере, 2.5 мг/день в течение их курса лечения. Дополнительные совместно вводимые лекарства могут включать микофенолята мофетил (MMF). Обычно MMF вводят в виде 2 раздельных доз по соответствующей схеме в зависимости от времени дня и приема пищи. Пример схемы введения MMF включает 2 г ежедневно. Первую дозу можно вводить перед операцией. Последующие дозы можно вводить п.о., как только пациент сможет переносить пероральный прием лекарства. Дозу и схему можно корректировать с учетом лабораторных данных (например, пониженное число лейкоцитов (WBC и переносимости пациентом. Во вкладыше в упаковку предоставлена полная информация о предписаниях (назначении). Другое совместно вводимое лекарство может включать базиликсимаб. Восстановленный базиликсимаб (20 мг в 5 мл) можно разводить до объема 50 мл нормальным физиологическим солевым раствором или 5% декстрозой и вводить в виде в.в. инфузии в течение 20-30 мин. Первую дозу 20 мг можно вводить в 1 день (день трансплантации). Вторую дозу 20 мг можно давать на 5 день. Во вкладыше в упаковку предоставлена полная информация о назначении. Помимо этого, предусматриваются терапевтические комбинации, например, набор для применения в любом способе по определению выше, содержащий L104EA29YIg, в свободном виде или в виде фармацевтически приемлемой соли, для одновременного или последовательного применения, по меньшей мере, с одной фармацевтической композицией, содержащей дополнительный агент и кортикостероиды. Набор может содержать инструкции для его применения. На этикетке и/или в инструкциях может быть указано, что фармацевтическую композицию можно использовать самостоятельно (индивидуально) или в комбинации, одновременно или последовательно,со вторым агентом для лечения выбранного состояния, например, заболеваний иммунной системы, аутоиммунных заболеваний, иммунопролиферативных заболеваний, иммунных нарушений, ассоциированных с пересадкой трансплантата, описанных выше. На этикетке могут быть указаны подходящие дозы для соединений, раскрываемых в данном описании. Например, на этикетке может быть указано, что эффективные дозы соединения для блокады взаимодействий В 7 с его лигандами и/или для лечения заболевания иммунной системы можно определять с учетом массы тела, а схемы введения могут диктоваться целевыми минимальными сывороточными профилями. Например, на этикетке может быть указано, что эффективные целевые минимальные сывороточные концентрации мутантного CTLA4, раскрываемого в данном описании, для лечения заболевания иммунной системы могут составлять около 0.2-30 мкг/мл. Или же, на этикетке может быть указано, что для лечения заболеваний иммунной системы мутантный CTLA4, раскрываемый в данном описании,можно вводить в количестве около 0.1-20.0 мг/кг массы тела пациента. Способы получения соединений (молекул) по изобретению Экспрессия мутантного CTLA4 может быть в прокариотических клетках. Прокариоты чаще всего бывают представлены различными штаммами бактерий. Бактерии могут быть грамположительными или грамотрицательными. Как правило, предпочтительны грамотрицательные бактерии, такие как Е.coli. Можно также использоваться другие микробные штаммы. Последовательности, кодирующие мутантный CTLA4, можно вводить в вектор, созданный для экспрессии чужеродных последовательностей в прокариотических клетках, таких как Е.coli. Эти векторы могут включать обычные прокариотические контрольные последовательности, которые по данному описанию включают промоторы для инициации транскрипции, необязательно с оператором, наряду с последовательностями сайта связывания рибосом, включают такие обычно применяемые промоторы, как промоторная система бета-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (lac) (Chang, et al., (1977) Nature 198: 1056),промоторная система триптофана (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8: 4057) и PL промотор фага- 18013122 лямбда, и сайт связывания рибосом N-гена (Shimatake, et al., (1981) Nature 292: 128). Такие экспрессирующие векторы включают также ориджины репликации и селективные маркеры,такие как ген бета-лактамазы или неомицин фосфотрансферазы, придающие устойчивость к антибиотикам, так что векторы могут реплицироваться в бактериях, и можно выбирать клетки, несущие плазмиды,выращенные в присутствии антибиотиков, таких как ампициллин или канамицин. Плазмиду экспрессии можно вводить в прокариотические клетки различными стандартными методами, включая, но без ограничения, CaCl2-шок (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110, и Sambrook et al. (eds.), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989 и электропорацию. В соответствии с практикой применения изобретения эукариотические клетки также являются подходящими клетками-хозяевами. Примеры эукариотических клеток включают любую животную клетку,первичную или иммортализованную, клетки дрожжей (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и Pichia pastoris), и растительные клетки. Миеломные, COS и СНО клетки являются примерами животных клеток, которые могут использоваться в качестве хозяев. Конкретные СНО клетки включают, но без ограничения, DG44 (Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12: 555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36: 10901-10909), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-On линию клеток (Clontech), СНО, обозначенные ЕСАСС 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), СНО клон 13 (GEMG,Genova, IT), CHO clone В (GEMG, Genova, IT), CHO-K1/SF, обозначенные ЕСАСС 93061607 (CAMR,Salisbury, Wiltshire, UK) и RR-CHOK1, обозначенные ЕСАСС 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Примеры растительных клеток включают клетки табака (целое растение, клеточную культуру и каллюс),маиса, сои и риса. Также применимы семена маиса, сои и риса. Нуклеотидные последовательности, кодирующие мутантный CTLA4, можно также вводить в вектор, созданный с целью экспрессии чужеродных последовательностей в эукариотическом хозяине. Регуляторные элементы вектора могут меняться в зависимости от конкретного эукариотического хозяина. Распространенные эукариотические контрольные последовательности для применения в экспрессирующих векторах включают промоторы и контрольные последовательности, совместимые с клетками млекопитающих, такие, например, как CMV промотор (CDM8 вектор) и вирус саркомы птиц (ASV) (LN вектор). Другие применяемые традиционно промоторы включают ранний и поздний промоторы вируса зеленой мартышки 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature 273: 113), или можно применять также другие вирусные промоторы, такие как вирусные промоторы полиомы, Аденовируса 2 и вируса бычьей папилломы hMTII (Karin, et al., (1982) Nature 299: 797-802). Векторы для экспрессии мутантного CTLA4 в эукариотах могут также нести последовательности,называемые энхансерными областями. Они важны для оптимизации экспрессии гена и находятся либо в 3'-5', либо в 5'-3'направлении от промоторной области. Примеры векторов экспрессии для эукариотических клеток-хозяев включают, но без ограничения,векторы для клеток-хозяев млекопитающих (например, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2, pTK2 (Maniatis);pIRES (Clontech); pRc/CMV2, pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc векторы, pCMV векторы,pSG5 векторы (Stratagene, ретровирусные векторы (например, pFB векторы (Stratagene, pCDNA-3 (Invitrogen) или его модифицированные формы, аденовирусные векторы; аденоассоциированные вирусные векторы, бакуловирусные векторы, дрожжевые векторы (например, pESC векторы (Stratagene. Нуклеотидные последовательности, кодирующие мутантный CTLA4, можно интегрировать в геном эукариотической клетки-хозяина и реплицировать по мере репликации генома хозяина. Или же, вектор,несущий молекулы мутантного CTLA4, может содержать ориджины репликации, способствующие внехромосомной репликации. Для экспрессии нуклеотидных последовательностей в Saccharomyces cerevisiae можно использовать ориджин репликации из эндогенной дрожжевой плазмиды, кольцо 2 мк (Broach, (1983) Meth. Enz. 101: 307). Или же можно использовать последовательности из генома дрожжей, способные промотировать автономную репликацию (например, с Stinchcomb et al., (1979) Nature 282: 39); Tschemper et al., (1980)Gene 10: 157; и Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101: 300). Последовательности контроля транскрипции для дрожжевых векторов включают промоторы для синтеза гликолитических ферментов (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland et al., (1978)Biochemistry 17: 4900). Другие известные в уровне техники промоторы включают CMV промотор, предусматриваемый в CDM8 векторе (Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268: 217-221); промотор для 3 фосфоглицерат киназы (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255: 2073), и промоторы для других гликолитических ферментов. Другие промоторы являются индуцибельными, потому что они могут регулироваться внешними стимулами или питательной средой клеток. Эти индуцибельные промоторы включают промоторы генов белков теплового шока, алкогольдегидрогеназы-2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, ферментов, ассоциированных с катаболизмом азота, и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. Регуляторные последовательности можно также поместить на 3' конце кодирующих последовательностей. Эти последовательности могут стабилизировать матричную РНК. Такие терминаторы находятся в 3' нетранслируемой области после кодирующих последовательностей в некоторых генах дрож- 19013122 жей и млекопитающих. Типичные векторы для растений и растительных клеток включают, но без ограничения, Tiплазмиды агробактерий, вирус мозаики цветной капусты (CaMV) и вирус золотой мозаики томатов(TGMV). Общие аспекты трансформации системы клеток-хозяев млекопитающего описаны Axel (патент США 4399216, выданном 16 августа 1983 г.). Клетки млекопитающих можно трансформировать разными методами, включая, но без ограничения, трансфекцию в присутствии фосфата кальция, микроинъекцию,электропорацию или трансдукцию вирусными векторами. Методы введения последовательностей чужеродной ДНК в геном растения или дрожжей включают(1) механические методы, такие как микроинъекция ДНК в одиночные клетки или протопласты, встряхивание клеток со стеклянными бусами (шариками) в присутствии ДНК или стрельба покрытыми ДНК свинцовыми или золотыми сферами в клетки или протопласты; (2) введение ДНК за счет того, что мембраны становятся проницаемыми для макромолекул после обработки полиэтиленкликолем, или выдерживание в высоковольтном пульсовом режиме (электропорация); или (3) применение липосом (содержащих кДНК), которые сливаются с клеточными мембранами. Экспрессию мутантного CTLA4 можно детектировать известными в уровне техники методами. Например, мутантные молекулы можно детектировать окрашиванием SDS-PAGE гелей Кумасси голубым и иммуноблоттингом с применением антител, которые связывают CTLA4. Извлечение белка можно осуществлять стандартными методами очистки белков, например, аффинной хроматографией или ионообменной хроматографией, получая практически чистый продукт (R. Scopes в "Protein Purification, Principles and Practice", Third Edition, Springer-Verlag (1994. В опубликованных патентных заявках 2005/0019859, 2005/0084933 и в Международной заявкеWO 04/058944, которые вводятся в данное описание в качестве ссылки, предлагаются способы получения белков по изобретению, в частности, рекомбинантных гликопротеиновых продуктов, при использовании культур клеток животных или млекопитающих. Кроме того, изобретение предусматривает растворимые мутантные CTLA4, полученные по данному описанию. Мутагенез CTLA4IG с помощью мутаций в кодонах В одном варианте изобретения сайт-направленный мутагенез и новая методика скрининга были использованы для идентификации нескольких мутаций во внеклеточном домене CTLA4, которые повышают авидность связывания с CD86. В этом варианте изобретения мутации осуществляют в областях внеклеточного домена CTLA4 от серина 25 до аргинина 33, С' цепь (аланин 49 и треонин 51), F цепь (лизин 93, глутаминовая кислота 95 и лейцин 96) и область от метионина 97 до тирозина 102 включительно, от тирозина 103 до глицина 107, и G цепь в положениях глутамин 111, тирозин 113 и изолейцин 115. Эти сайты выбирают на основании изучения химерных CD28/CTLA4 белков (Peach et al., J. Exp. Med., 1994,180: 2049-2058) и рассмотрения (прогнозирования) на моделях, какие боковые цепи аминокислот будут экспонироваться с растворителем, и отсутствия идентичности или гомологии аминокислотных остатков в некоторых положениях CD28 и CTLA4. Также любой остаток, находящийся в непосредственной пространственной близости (5-20 А) к идентифицированным остаткам, рассматривается как часть настоящего изобретения. Для синтеза и скрининга растворимого мутантного CTLA4 с измененной аффинностью к CD80 и/или CD86 был применен двухстадийный метод. Эксперименты включали, во-первых, создание библиотеки мутаций в конкретном кодоне внеклеточного участка CTLA4, а затем их скрининг с помощьюBIAcore для идентификации мутантов с измененной реактивностью к CD80 и CD86. Аналитическая система BIAcore (Pharmacia, Piscataway, N.J.) использует детекторную систему поверхностного плазмонного резонанса, которая в основном включает ковалентное связывание либо CD80Ig, либо CD86Ig с покрытым декстраном сенсорным чипом, расположенным в детекторе. Тестируемое соединение (молекула) можно затем ввести (инжекция) в камеру, содержащую сенсорный чип, и количество комплементарного белка,который связывается, можно оценивать на основании изменения молекулярной массы, которая физически связана с покрытой декстраном стороной сенсорного чипа; изменение молекулярной массы можно измерять с помощью детекторной системы. Преимущества изобретения Так как связывание CTLA4 с CD80 и CD86 характеризуется быстрыми скоростями ассоциации("on") и быстрыми скоростями диссоциации ("off) и так как комплексы CTLA4Ig-CD86 диссоциируют примерно в 5-8 раз быстрее, чем комплексы CTLA4Ig-CD80, логично предположить, что замедление скорости диссоциации CTLA4Ig из комплексов с CD80 и/или CD86 даст соединения (молекулы) с более сильными иммуносупрессорными свойствами. Так, ожидается, что растворимый мутантный CTLA4, обладающий более высокой авидностью к CD80 и CD86-позитивным клеткам по сравнению с дикого типаCTLA4 или немутированными формами CTLA4Ig, будет блокировать примирование антигенспецифических активированных клеток с более высокой эффективностью, чем дикого типа CTLA4 или немутированными формами CTLA4Ig.- 20013122 Примеры Нижеприведенные примеры представлены для иллюстрации настоящего изобретения и для помощи рядовому специалисту в их получении и применении. Примеры никоим образом не предполагают каклибо ограничить объем изобретения. Пример 1. Данный пример включает описание методов, используемых для создания нуклеотидных последовательностей, кодирующих растворимый мутантный CTLA4 по изобретению. Получают мутант с мутацией в одном сайте (односайтовый мутантный) L104EIg и проверяют кинетику связывания с CD80 и/илиCD86. Нуклеотидную последовательность L104EIg используют в качестве матрицы для создания последовательности CTLA4 с мутацией в двух сайтах, L104EA29YIg, и определяют кинетику его связывания сCD80 и/или CD86. Мутагенез CTLA4IG с помощью мутаций в кодонах. Стратегию мутагенеза и скрининга разрабатывают с целью идентификации мутантных CTLA4Ig,которые имеют более медленные скорости диссоциации ("off") от CD80 и/или CD86. Односайтовые мутантные нуклеотидные последовательности получают, используя CTLA4Ig (патенты США: 5844095; 5851795; и 5885796; АТСС инвентарный номер 68629) в качестве матрицы. Для случайного мутагенеза специфического кДНК кодона создают мутагенные олигонуклеотидные ПЦР праймеры, содержащие любое основание в положениях 1 и 2 кодона, но в положении 3 содержащие только гуанин или тимин(XXG/T; также известный как NNG/T). Таким образом, можно провести случайную мутацию специфического кодона, кодирующего аминокислоту, чтобы кодировать каждую из 20 аминокислот. При этомXXG/T мутагенез дает 32 потенциальных кодона, кодирующих каждую из 20 аминокислот. ПЦР продукты, кодирующие мутации в непосредственной близости к -М 97-G107 CTLA4Ig (см. фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4; или фиг. 8, SEQ ID NO: 5 и 6), расщепляют с помощью SacI/XbaI и субклонируют в аналогично разрезанный CTLA4Ig LN (также известный как piLN) экспрессирующий вектор. Этот метод используют для создания CTLA4 с мутацией в одном сайте, L104EIg (фиг. 8, SEQ ID NO: 5 и 6). Для мутагенеза близ S25-R33 CTLA4Ig 5' к этой петле сначала вводят молчащий NheI сайт рестрикции с помощью ПЦР праймер-направленного мутагенеза. ПЦР продукты расщепляют с помощьюNheI/XbaI и субклонируют в аналогично разрезанный CTLA4Ig или L104EIg векторы экспрессии. Этот метод используют для создания CTLA4 с мутацией в двух сайтах, L104EA29YIg (фиг. 7, SEQ ID NO: 3 и 4). В частности, нуклеотидную молекулу, кодирующую CTLA4 с мутацией в одном сайте, L104EIg, используют в качестве матрицы для создания CTLA4 с мутацией в двух сайтах, L104EA29YIg. ВекторpiLN, содержащий L104EA29YIg, показан на фиг. 12. Пример 2. Далее дается описание методов скрининга, применяемых для идентификации CTLA4 полипептидов с единичной и с двойной мутацией, экспрессированных при использовании конструкций, описанных в примере 1, которые проявляют повышенную авидность связывания с CD80 и CD86 антигенами по сравнению с немутантным CTLA4Ig. Последние in vitro и in vivo исследования показывают, что сам по себе CTLA4Ig не способен полностью блокировать примирование антиген-специфических активированных Т клеток. In vitro исследования с измерением ингибирования пролиферации Т-клеток CTLA4Ig и любым моноклональным антителом, специфическим к CD80 или CD86, показывает, что моноклональное антитело против CD80 не повышает ингибирование CTLA4Ig. Однако моноклональное антитело против CD86 повышает ингибирование, это показывает, что CTLA4Ig не эффективно для блокирования взаимодействий CD86. Эти данные подтверждают результаты, полученные ранее Linsley et al. (Immunity, (1994), 1: 793-801), показывающие, что для ингибирования опосредованных CD80 клеточных ответов требуются примерно в 100 раз более низкие концентрации CTLA4Ig, чем для ответов, опосредованных CD86. На основании этих данных было высказано предположение, что растворимый мутантный CTLA4, обладающий более высокой авидностью к CD86, чем дикого типа CTLA4, способен лучше блокировать примирование антигенспецифических активированных клеток, чем CTLA4Ig. С этой целью растворимый мутантный CTLA4, описанный выше, в пример 1, подвергают скринингу, используя новый метод скрининга, для того, чтобы определить некоторые мутации во внеклеточном домене CTLA4, которые повышают авидность связывания с CD80 и CD86. Эта стратегия скрининга включает эффективный метод непосредственной идентификации мутантов с явно более медленными"off" скоростями (скоростями диссоциации), не требующий очистки или количественного определения белка, так как определение "off" скорости не зависит от концентрации (O'Shannessy et al., (1993) Anal.Biochem., 212: 457-468). Клетки COS трансфецируют при использовании индивидуальных очищенных плазмидных ДНКminiprep и выращивают в течение нескольких дней. Трехдневные кондиционированные культуральные среды наносят на биосенсорные чипы BIAcore (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden), покрытые растворимым CD80Ig или CD86Ig. Специфическое связывание и диссоциацию мутантных белков определяют с помощью поверхностного плазмонного резонанса (O'Shannessy, D.J., et al., (1993) Anal. Biochem.- 21013122 212: 457-468). Все эксперименты проводят на биосенсорах BIAcore или BIAcore 2000 при 25 С. Лиганды иммобилизуют на сенсорных чипах NCM5 (чистые для исследовательских работ) (Pharmacia) с применением связывания стандартногоBiol. Chem. 268: 5425-5434). Способ скрининга. Клетки COS, выращенные в 24-луночных планшетах для тканевых культур, трансфецируют при использовании ДНК, кодирующей мутантный CTLA4Ig. Через 3 дня собирают культуральные среды, содержащие секретированный растворимый мутантный CTLA4Ig. Кондиционированные культуральные среды клеток COS пропускают через биосенсорные чипыChem. 271: 26762-26771), и определяют мутантные молекулы, имеющие более медленные скорости диссоциации ("off"), чем скорости, наблюдаемые для дикого типа CTLA4Ig. кДНК, соответствующие выбранным образцам сред, секвенируют и получают ДНК для осуществления более масштабной транзиторной трансфекции клеток COS, при использовании которых, после очистки культуральных сред от протеина А, получают мутантный CTLA4Ig. Применяемые условия BIAcor и анализ данных равновесного связывания представлены в Greene etal., 1996, J. Biol. Chem. 271: 26762-26771 и в данном описании. Данные анализа BIAcore. Перед началом анализа на сенсограммах нулевую линию (линия отсчета, фон) нормализуют по нулевой единице ответа (относительной единице, RU). Образцы пропускают через псевдодериватизированные проточные кюветы (кюветы сравнения) с целью определения фоновых значений единицы ответа(RU) вследствие большой разницы между коэффициентами преломления растворов. Равновесные константы диссоциации (Kd) рассчитывают по кривым зависимости Req от С, где Req обозначает ответ в стационарном состоянии минус ответ на псевдодериватизированном чипе (проверочном чипе, чипе сравнения), а С обозначает молярную концентрацию аналита. Кривые связывания анализируют с помощью выпускаемой серийно программы построения нелинейной кривой (Prism, GraphPAD Software). Экспериментальные данные сначала применяют к модели связывания одного лиганда с единственным рецептором ("1-сайтовая модель", т.е. простая система Лэнгмюра, А+ВАВ), а равновесные константы ассоциации (Kd=[A][B][AB]) рассчитывают по уравнению R=RmaxC/(Kd+C). Затем данные применяют к простейшей "двухсайтовой" модели связывания лиганда (т.е. к рецептору, имеющему два невзаимодействующих независимых сайта связывания,описываемому уравнениемR=Rmax1C(Kd1+C)+Rmax2C(Kd2+C). Согласие (критерий адекватности) этих моделей анализируют визуально, сравнивая с экспериментальными данными, и статистическими методами, с помощью F теста по сумме квадратов. Как более подходящую выбирают односайтовую модель, если двухсайтовая модель не подходит значительно лучше (р 0.1). Анализ ассоциации и диссоциации проводят с применением программы BIA evaluation 2.1 (Pharmacia). Константы скорости ассоциации kon рассчитывают двояко, предполагая как гомогенные "односайтовые" взаимодействия, так и параллельные "двухсайтовые" взаимодействия. Для "односайтовых" взаимодействий величины kon рассчитывают по уравнению Rt=Req(1-exp-ks(t-t0, где Rt обозначает ответ в данное время t; Req обозначает ответ в стационарном состоянии; t0 обозначает время в начале инжекции(впуска); и ks=dR/dt=konCkoff, и где С обозначает концентрацию аналита, вычисленную в единицах мономерных связывающих сайтов. Для "двухсайтовых" взаимодействий величины kon рассчитывают по уравнению Rt=Req1(1-exp-ks1(t-t0 + Req2(1-exp-ks(t-t0. Для каждой модели величину kon определяют с помощью рассчитанного тангенса угла наклона (примерно, до 70% максимальной ассоциации) на кривых зависимости ks от С. Данные по диссоциации анализируют в приложении к "односайтовой" (АВ=А+В) или "двухсайтовой" (AiBj=Ai+Bj) моделям, а константы скорости (koff) рассчитывают по кривым наибольшего соответствия. Используют модель сайта связывания за исключением тех случаев, когда разность больше фона прибора (автомата) (2-10 RU, в зависимости от прибора), в этом случае используют модель двух сайтов связывания. Полупериод удерживания рецептора рассчитывают по соотношению t1/2=0/693/koff. Проточная цитометрия. Мышиное mAb L307.4 (против CD80) получают от Becton Dickinson (San Jose, California), a IT2.2CD80-позитивные и/или CD86-позитивные СНО клетки удаляют из сосудов для культивирования, инкубируя в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS), содержащем 10 мМ EDTA. Клетки СНО (1-10105) сначала инкубируют с mAb или белками, слитыми с иммуноглобулином, в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), затем отмывают и инкубируют с конъюгатом изоцианата флуоресцеина с антителом козы против мышиного или человеческого иммуноглобулина (Tago, Burlingame,California). Клетки окончательно отмывают и анализируют на FACScan (Becton Dickinson).SDS-PAGE проводят на акриламидных гелях с 4-20% Трис/глицина (Novex, San Diego, CA). Аналитические гели окрашивают Кумасси голубым, а изображения влажных гелей получают цифровым сканированием. CTLA4Ig (25 мкг) и L104EA29YIg (25 мкг) анализируют эксклюзионной хроматографией на колонке TSK-GEL G300 SWx1 (7.8300 мм, Tosohaas, Montgomeryville, PA), уравновешенной фосфатносолевым буферным раствором, содержащим 0.02% NAN3, при скорости потока 1.0 мл/мин.CTLA4XC120S и L104EA29YXC120S. Одноцепочечный CTLA4XC120S получают, как ранее описаны (Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem.,270: 15417-15424). Коротко говоря, плазмиду экспрессии онкостатин М CTLA4 (OMCTLA4) используют в качестве матрицы,прямой праймерGAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG выбирают, чтобы он соответствовал последовательностям в векторе; а обратный праймерGTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC соответствовал последним семи аминокислотам (т.е. аминокислотам 118-124) во внеклеточном доменеCTLA4 и содержал сайт рестрикции и стоп-кодон (TGA). Обратный праймер определяет мутацию C120S(замена цистеина на серин в положении 120). В частности, нуклеотидная последовательность GCA (нуклеотиды 34-36) обратного праймера, показанного выше, заменяется на одну из следующих нуклеотидных последовательностей: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT или GCT. Как понимают специалисты в данной области техники, нуклеотидная последовательность GCA является обратно-комплементарной последовательностью кодона TGC для цистеина. Аналогично нуклеотидные последовательности AGA, GGA, TGA,CGA, ACT или GCT представляют собой обратно-комплементарные последовательности кодонов для серина. Продукты полимеразной цепной реакции расщепляют с помощью HindIII/XbaI и направленно клонируют в экспрессирующий вектор LN (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ).L104EA29YXC120S получают таким же способом. Каждую конструкцию проверяют секвенированием ДНК. Идентификация и биохимические характеристики высокоавидных мутантов. Для мутагенеза выбирают двадцать четыре аминокислоты, и полученные 2300 мутантных белков анализируют на связывание CD86Ig методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR; описанного выше). Преобладающие результаты мутагенеза в каждом сайте суммированы в табл. II. Случайный мутагенез некоторых аминокислот в S25-R33, очевидно, не изменяет связывания с лигандом. Мутагенез Е 31 иR33 и остатках M97-Y102 явно приводит к более слабому связыванию лиганда. Мутагенез остатков S25,А 29 и Т 30, K93, L96, Y103, L104 и G105 дает белки с медленными скоростями "on" (ассоциации) и/или"off" (диссоциации). Эти результаты подтверждают ранее полученные данные о том, что остатки в области М 97-Y102 влияют на связывание с лигандом (Peach et al., (1994) J. Exp. Med., 180: 2049-2058). Мутагенез в сайтах S25, T30, К 93, L96, Y103 и G105 позволяет идентифицировать некоторые мутантные белки, имеющие более медленные скорости диссоциации ("off") от CD86Ig. Однако в этих примерах замедленная скорость "off" гасится замедленной скоростью "on", в результате полученные мутантные белки с общей авидностью к CD86Ig, несомненно аналогичной авидности, наблюдаемой в случае дикого типа CTLA4Ig. Кроме того, мутагенез K93 приводит к заметной агрегации, которая может быть ответственна за наблюдаемые изменения кинетики. Случайный мутагенез L104 с последующей трансфекцией клеток COS и скринингом методом SPR образцов культуральных сред с помощью иммобилизованного CD86Ig дают шесть образцов сред, содержащих мутантные белки со "off" скоростью, примерно в 2 раза более низкой, чем у дикого типаCTLA4Ig. Когда были секвенированы соответствующие кДНК этих мутантов, оказалось, что каждая из них кодирует мутацию лейцина в глутаминовую кислоту (L104E). Очевидно, замена лейцина 104 на аспарагиновую кислоту (L104D) не влияет на связывание CD86Ig. Мутагенез затем повторяют в каждом сайте, перечисленном в табл. II, на этот раз используя в качестве ПЦР матрицы L104E вместо дикого типа CTLA4Ig, как описано выше. Анализ SPR, снова с применением иммобилизованного CD86Ig, идентифицирует шесть образцов культуральных сред, полученных в результате мутагенеза аланина 29, с белками, имеющими примерно в 4 раза более медленные "off скорости, чем дикого типа CTLA4Ig. Наиболее замедлены эти скорости у двух белков с заменами на тирозин(L104EA29Y), у двух белков с заменами на лейцин (L104EA29L), у одного с заменой на триптофан(L104EA29W) и у одного с заменой на треонин (L104EA29T). Никаких мутантов с медленной скоростью"off" не определяют при случайной мутации одного аланина 29 дикого типа CTLA4Ig. Относительную молекулярную массу и состояние агрегации очищенных L104E и L104EA29YIg определяют методами SDS-PAGE и эксклюзионной хроматографии. L104EA29YIg (1 мкг; дорожка 3) иL104EIg (1 мкг; дорожка 2) явно имеют такую же электрофоретическую подвижность, что и CTLA4IgL104EA29YIg (фиг. 10 С) очевидно имеет такую же подвижность, что и димерный CTLA4Ig (фиг. 10 В). Основные пики относятся к димеру белка, тогда быстрее элюирующий минорный пик на фиг. 10 В относятся к более высокомолекулярным агрегатам. Примерно, 5% CTLA4Ig представлено в виде более высокомолекулярных агрегатов, но отсутствует доказательство агрегации L104EA29YIg или L104EIg. Таким образом, более сильное связывание с CD86Ig, наблюдаемое в случае L104EIg и L104EA29YIg, нельзя отнести на счет агрегации, индуцированной мутагенезом. Анализ равновесного связывания и кинетики связывания. Анализ равновесного связывания и кинетики связывания осуществляют с помощью очищенных на протеине A CTLA4Ig, L104EIg и L104EA29YIg методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Результаты показаны в табл. I. Таблица I Наблюдаемые константы равновесия и кинетические константы(величины представляют собой среднеестандартное отклонение в трех различных экспериментах) Наблюдаемые равновесные константы диссоциации (Kd; табл. I) рассчитывают по кривым связывания в интервале концентраций (5.0-200 нМ). L104EA29YIg прочнее связывается с CD86Ig, чем L104EIg или CTLA4Ig. Более низкая величина Kd L104EA29YIg (3.21 нМ), чем L104EIg (6.06 нМ) или CTLA4Ig(13.9 нМ), указывает на повышенную авидность связывания L104EA29YIg с CD86Ig. Более низкая величина Kd белка L104EA29YIg (3.66 нМ), чем Kd L104EIg (4.47 нМ) или CTLA4Ig (6.51 нМ) указывает на повышенную авидность связывания L104EA29YIg с CD80Ig. Анализ кинетики связывания показывает, что сравнительные скорости "on" для связывания(табл. I). Однако "off" скорости для этих молекул не эквивалентны (табл. I). По сравнению с CTLA4Ig скорость "off" L104EA29YIg примерно в 2 раза медленнее "off" скорости от CD80Ig и примерно в 4 раза медленнее "off" скорости от CD86Ig. "Off" скорости L104E являются промежуточными междуL104EA29YIg и CTLA4Ig. Так как введение этих мутаций не оказывает значительного влияния на "on" скорости, очевидно, что повышение авидности к CD80Ig и CD86Ig, наблюдаемое с L104EA29YIg, происходит главным образом вследствие понижения "off" скоростей (скоростей диссоциации). Для определения, вызвано ли повышение авидности L104EA29YIg к CD86Ig и CD80Ig мутациями,влияющими на способ ассоциации каждого мономера в димер, или повышающими авидность структурными изменениями, введенными в каждый мономер, одноцепочечные конструкции внеклеточных доменов CTLA4 и L104EA29Y получают мутагенезом цистеина 120 в серин, описанным выше, и в соответствии с Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270: 15417-15424. Методом гель-проникающей хроматографии показано, что очищенные белки CTLA4XC120S и L104EA29YXC120S являются мономерными (Linsley et al.,(1995), см. выше), ранее их свойства связываться с лигандом анализировались методом SPR. Результаты показывают, что аффинность связывания обоих мономерных белков с CD86Ig примерно в 35-80 раз меньше, чем аффинность связывания, наблюдаемая в отношении их соответствующих димеров (табл. I). Это подтверждает ранее опубликованные данные, показывающие, что для высокой авидности связывания лиганда требуется димеризация CTLA4 (Greene et al., (1996) J. Biol. Chem., 271: 26762-26771).L104EA29YXC120S связан как с CD80Ig, так и с CD86Ig с аффинностью примерно в 2 раза более высокой, чем CTLA4XC120S. Повышенная аффинность вызвана примерно в 3 раза более медленной скоростью диссоциации от обоих лигандов. Таким образом, наиболее вероятно, что более прочное связываниеL104EA29Y с лигандом обусловлено скорее повышающими авидность структурными изменениями, которые были введены в каждую мономерную цепь, нежели изменениями, при которых молекулы димеризуются. Локализация и структурный анализ мутаций, повышающих авидность. Решение структуры внеклеточного IgV-образного домена CTLA4 недавно осуществлено методом ЯМР спектроскопии (Metzler et al., (1997) Nature Struct. Biol., 4: 527-531). Это позволило точно установить локализацию лейцина 104 и аланина 29 в трехмерном пространстве (фиг. 11 А-В). Лейцин 104 расположен около высококонсервативной MYPPPY аминокислотной последовательности. Аланин 29 расположен близ С-конца области S25-R33, который пространственно прилегает к области MYPPPY. Хотя- 24013122 существует значительное взаимодействие между остатками оснований этих двух областей, по-видимому,непосредственное взаимодействие между L104 и А 29 отсутствует, хотя они оба представляют собой часть непрерывного гидрофобного ядра в белке. Структурные последовательности двух повышающих авидность мутантов изучают на моделях. Мутацию A29Y можно легко разместить в углублении между областью S25-R33 и областью MYPPPY, и она может служить для стабилизации конформации областиMYPPPY. В дикого типа CTLA4 возникают пространственные гидрофобные взаимодействия между L104 и L96 и V94 рядом с областью MYPPPY. Маловероятно, что мутация с заменой на глутаминовую кислоту примет конформацию, аналогичную конформации L104, по двум причинам. Во-первых, без значительного изменения области S25-R33 в структуре недостаточно места для расположения более протяженной боковой цепи глутаминовой кислоты. Во-вторых, энергетические затраты на то, чтобы спрятать отрицательный заряд боковой цепи глутаминовой кислоты в гидрофобной области, были бы велики. Зато изучение на моделях позволяет предсказать, что этот заряд может быть стабилизирован за счет сольватации. Такое конформационное изменение легко можно расположить рядом с G105 с минимальными искажениями в других областях. Связывание высокоаффинных мутантов с СНО клетками, экспрессирующими CD80 или CD86.FACS анализ (фиг. 2) связывания CTLA4Ig и мутантных белков со стабильно трансфецированнымиCD80+ и CD86+CHO клетками осуществляют по данному описанию. CD80-позитивные и CD86 позитивные СНО клетки инкубируют с увеличивающимися концентрациями CTLA4Ig, L104EA29YIg или L104EIg, а затем отмывают. Связанный с иммуноглобулином слитый белок детектируют с помощью конъюгированного с изоцианатом флуоресцеина антитела козы против человеческого иммуноглобулина. Как показано на фиг. 2, CD80-позитивные или CD86-позитивные СНО клетки (1.5105) инкубируют с указанными концентрациями CTLA4Ig (темные квадраты), L104EA29YIg (окружности) или L104EIg(треугольники) в течение 2 ч при 23 С, отмывают и инкубируют с изоцианатом флуоресцеина антитела козы против человеческого иммуноглобулина. Изучено связывание всего на 5000 жизнеспособных клетках (единичное определение) на FACScan, и среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) определяют по данным гистограмм с применением PC-LYSYS. Данные корректируют по фоновой флуоресценции,измеряемой на клетках, инкубированных только с реагентом второй стадии (MFI=7). Контрольное L6mAb (80 нг/мл) дает величину MFI30. Эти результаты являются типичными и взяты из четырех независимых экспериментов. Связывание L104 ЕА 29YIg, L104EIg и CTLA4Ig с человеческими CD80-трансфецированными СНО клетками примерно эквивалентны (фиг. 2 А). L104EA29YIg и L104EIg прочнее (сильнее) связываются с СНО клетками, стабильно трансфецированными человеческим CD86, чем CTLA4Ig (фиг. 2 В). Функциональные анализы. Человеческие CD4-позитивные Т клетки выделяют с помощью иммуномагнитной негативной селекции (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176: 1595-1604). Выделенные CD4-позитивные Т клетки стимулируют форбол-миристат-ацетатом (РМА) плюс CD80-позитивные или CD86-позитивные СНО клетки в присутствии титрующих концентраций ингибитора. CD4-позитивные Т клетки (8-10104/лунка) культивируют в присутствии 1 нМ РМА в присутствии или в отсутствие стимуляторов облученных СНО клеток. Пролиферативные реакции определяют, добавляя 1 мкКи/лунка [3 Н]тимидина в последние 7 ч выращивания в течение 72 ч культуры. Проводят ингибирование РМА плюс CD80-позитивных СНО илиCD86-позитивных СНО стимулированных Т клеток с помощью L104EA29YIg и CTLA4Ig. Результаты показаны на фиг. 3. L104EA29YIg ингибирует пролиферацию CD80-позитивных обработанных РМА СНО клеток сильнее, чем CTLA4Ig (фиг. 3 А). L104EA29YIg также более эффективно, чем CTLA4Ig, ингибирует пролиферацию CD86-позитивных обработанных РМА СНО клеток (фиг. 3 В). Таким образом,L104EA29YIg является более эффективным (сильным) ингибитором опосредованной как CD80, так иCD86 костимуляции Т клеток. На фиг. 4 показано ингибирование с помощью L104EA29YIg и CTLA4Ig аллостимулированных Т клеток, полученных выше, а затем аллостимулированных человеческими клетками В лимфобластоидной линии (LCL), называемой РМ, которые экспрессируют CD80 и CD86 (Т клетки 3.0104/лунка и РМ 8.0103/лунка). Первичную аллостимуляцию проводят в течение 6 дней, затем клетки выдерживают в пульсовом режиме с 3 Н-тимидином в течение 7 ч, после чего определяют включение радиоактивной метки. Вторичную аллостимуляцию осуществляют следующим образом. Аллостимулированные в течение семи дней Т клетки собирают с помощью среды для разделения лимфоцитов (LSM) (ICN, Aurora, ОН) и оставляют на 24 ч. Затем Т клетки рестимулируют (вторичная рестимуляция) в присутствии титрующих количеств CTLA4Ig или L104EA29YIg, добавляя РМ в том же соотношении, что и ранее. Стимуляцию проводят в течение 3 дней, затем клетки выдерживают в пульсовом режиме с радиометкой и собирают,как указано ранее. Влияние L104EA29YIg на первично аллостимулированные Т клетки показано на фиг. 4 А. Влияние L104EA29YIg на вторично аллостимулированные Т клетки показано на фиг. 4 В.L104EA29YIg ингибирует пролиферативный ответ как первично-, так и вторично стимулированных Т клеток сильнее, чем CTLA4Ig.- 25013122 Для определения продуцирования цитокинов (фиг. 5) планшеты для вторичной аллостимуляции ставят в двойном повторе. Через 3 дня культуральные среды анализируют с применением наборов ELISA(Biosource, Camarillo, CA) в условиях, рекомендованных изготовителем. Найдено, что L104EA29YIg блокирует продуцирование цитокинов IL-2, IL-4 и -IFN T клетками после вторичного аллогенного раздражителя более эффективно, чем CTLA4Ig (фиг. 5 А-С). Влияние L104EA29YIg и CTLA4Ig на реакцию смешанной культуры лимфоцитов обезьян (MLR) показано на фиг. 6. Периферические мононуклеарные клетки крови (РВМС; 3.5104 клеток/лунка от каждой обезьяны) от 2 обезьян очищают с помощью среды для разделения лимфоцитов (LSM) и смешивают с 2 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА, РНА). Клетки стимулируют 3 дня, затем выдерживают в пульсовом режиме в течение 16 ч и собирают. LI 04EA29YIg пролиферацию обезьяньих Т клеток эффективнее (лучше), чем CTLA4Ig. Таблица II Влияние мутагенеза CTLA4Ig в перечисленных сайтах на связывание CD86Ig(Преобладающий эффект указан знаком "+") Пример 3. В данном примере проводится сравнение эффективности и безопасности LI 04EA29YIg, описанного выше, в качестве иммунодепрессанта (иммуносупрессора) для поддерживающего лечения с CsA в течение 12 месяцев при использовании его в качестве компонента не содержащей CNI комбинированной схемы лечения, включающий индукцию базиликсимабом (Симулект; Novartis), прием микофенолята мофетила (MMF; Селлсепт; Roche) и кортикостероидов реципиентами почечного трансплантата. Подходящими являются взрослые реципиенты не-HLA-идентичного почечного трансплантата от живого или умершего донора. Пациентов, имевших ранее почечный трансплантат, пациентов с содержанием тест-антигеновых антител 20% в анамнезе или пациентов, по мнению исследователя, с повышенной степенью риска острого отторжения трансплантата ограничивают до 10% от изучаемой популяции. Показатели для недопущения включают основное почечное заболевание очаговый или сегментный гломерулосклероз, типа I или II мембранопролиферативный гломерулонефрит или гемолитический уремический синдром/тромботическая тромбоцитопеническая пурпура; активный гепатит В или С или ВИЧ; и возраст донора 60 или 6, доноры с сердечной смертью или "холодно-ишемическое время" донорской почки (время хранения донорской почки до трансплантации) 36 ч. Исследование представляет собой исследование с открытой меткой, рандомизированное, активно контролируемое, с многократной дозой, многоцентровое, проводимое в Соединенных Штатах, Европе и Канаде. Допущенных до исследования пациентов обоего пола в возрасте 18 лет, подвергающихся трансплантации почки (от умершего или живого донора за исключением случаев, когда донор и реципи- 26013122 ент HLA-идентичны), произвольно распределяют по группам (рандомизируют) в соотношении 1:1:1, в одной группе с более интенсивной (MI) схемой лечения с помощью L104EA29YIg, менее интенсивной(LI) схемой лечения с помощью L104EA29YIg или циклоспорином A (CsA); во всех случаях в комбинации с индукционной терапией с помощью базиликсимаба (Симулект; Novartis), дополнительной поддерживающей терапией микофенолятом мофетила (MMF; Селлсепт; Roche) и кортикостероидами. Обе схемы с L104EA29YIg включают раннюю фазу, в которой L104EA29YIg вводят в количестве 10 мг/кг, и поддерживающую фазу, в которой L104EA29YIg вводят в количестве 5 мг/кг каждые 4 (q4) или 8 недель(q8). Дозы для каждой схемы рассчитывают, исходя из массы тела. Эти дозы определяются целевыми минимальными (углубление) профилями, оказавшимися эффективными в ходе исследований на приматах. Эти профили заставляют применять дозы, которые изначально были выше, в период наивысшего иммунологического риска (день 0-90). Ранняя фаза в схеме MI продолжительнее (6 месяцев по сравнению с 3 месяцами) и включает более частое введение доз. Схема более интенсивного (MI) лечения с помощью L104EA29YIg включает введение 10 мг/кг в дни 1, 5, 15, 29, 43, 57, 71, 85, 113, 141 и 169, а затем 5 мг/кг каждые 4 или 8 недель. Схема менее интенсивного (LI) лечения с помощью L104EA29YIg включает введение 10 мг/кг в дни 1, 15, 29, 57 и 85, а затем 5 мг/кг каждые 4 или 8 недель. L104EA29YIg вводят в виде 30-минутной внутривенной инфузии. Пациенты из CsA группы дважды в сутки получают дозы (73 мг/кг), это позволяет достичь заданный интервал целевых сывороточных концентраций 150-400 нг/мл в течение первого месяца, а 150-300 нг/мл в течение 2-12 месяцев, что согласуется с современной медицинской практикой. Все пациенты получаютMMF 2 г ежедневно и базиликсимаб 20 мг каждые 4 дня. Применяется схема с постепенным уменьшением кортикостероида, включающая в.в. болюсные инъекции метилпреднизолона 500 мг в 1 день и 250 мг на 2 день, а затем перорально вводимые дозы 100 мг на 3 день, 50 мг на 4, 25 мг в дни 5-30, 22.5 мг в дни 31-44, 20 мг в дни 45-58, 17.5 мг в дни 59-72, 15 мг в дни 73-86, 12.5 мг в дни 87-100 и 10 мг в дни 101114. После дня 114 дозу преднизона можно снижать через месяц на 2.5 мг, но она не должна быть менее чем 5 мг в день. Главной целью является продемонстрировать, что L104EA29YIg не хуже CsA предупреждает острое отторжение через 6 месяцев. Вторичными целями является оценка частоты острого отторжения (подтвержденного биопсией или предполагаемого) через 6 месяцев или 1 год; измеренный уровень клубочковой (гломерулярной) фильтрации (GFR) по клиренсу йогексола через 1, 6 и 12 месяцев; параметры гипертензии; сывороточный холестерин и триглицериды; и общая безопасность. Другие определяемые данные включают смерть пациента или потерю трансплантата через 1 год; тяжесть острого отторжения; заболеваемость сахарным диабетом после трансплантации [который определяется требующей любого лечения гипергликемией в течение 4 недель или содержанием гемоглобина А 1 С (HbA1c) 7%, у пациентов, ранее не считавшихся диабетиками]; СКФ (GFR), рассчитанные по формулам в исследовании"Модификация Диеты при Почечном Заболевании" (MDRD, Levey A.S., Bosch J.P., Lewis J.P., Greene T.,Rogers N., Roth D. A more accurate method to estimate glomerular filtration rate from serum creatinine: a newrate after kidney transplantation. Transplantation. 1995; 59(12): 1683-1689); фармакокинетика и иммуногенность. Диагностику и лечение острого отторжения (AR) осуществляют по критериям международной классификации Banff 97 (Racusen L.C., Solez K., Colvin R.B., et al. The Banff 97 working classification ofrenal allograft pathology. Kidney Int 1999; 55(2): 713-23). Проводят post hoc (вторичный) анализ частоты встречаемости хронической нефропатии аллотрансплантата (CAN). Диагностику и лечение острого отторжения (AR) осуществляют по критериям международной классификации Banff 97 (Racusen L.C., Solez K., Colvin R.B., et al. The Banff 97 working classification ofrenal allograft pathology. Kidney Int 1999; 55(2): 713-23). Интраоперационную биопсию почечного трансплантата проводят для оценки начальной (базовой) гистологии. Ткань биоптата окрашивают и классифицируют в соответствии с критериями международной классификации Banff 97 для патологии почечного трансплантата. Биопсию оценивает независимый патолог, незнакомый с лечением, для подтверждения,перед лечением AR, всех эпизодов клинически подозреваемого (предполагаемого) AR. Дополнительные ожидаемые результаты включают клинически подозреваемое и подтвержденное с помощью биопсии острое отторжение (CSBPAR) в течение 12 месяцев; смерть или потеря трансплантата в течение 1 года; тяжесть AR эпизодов (по шкале Banff 97); неудачу, неблагоприятный исход лечения(определяемые как мнение исследователя; отторжениестепени ПВ; рецидивирующее или резистентное к стероиду отторжение); почечную функцию через 1, 6 и 12 месяцев (скорости гломерулярной фильтрации [СКФ, GFR], оцениваемые по клиренсу йогексола) и доказательство хронической нефропатии аллотрансплантата (CAN) (интерстициальный фиброз и тубулярная атрофия); показатели гипертензииL104EA29YIg, по сравнению с пациентами, пролеченными CsA. Для оценки безопасности и переносимости АЕ, лабораторные анализы (гематология, биохимия и анализ мочи) и жизненные показатели (признаки) регистрируют во время регулярных визитов в клинику. Результаты. Всего 218 пациентов подвергаются трансплантации почки и произвольно делятся на группы MI(N=74), LI (N=71) или CsA (N=73). Исходные демографические и клинические характеристика в трех экспериментальных группах аналогичны. Всего 164 пациента прошли полный одногодичный курс лечения. Из пациентов, прекративших лечение ранее 1 года (N=16 vs 16 vs 20; MI схема по сравнению с LI схемой по сравнению с CsA), наиболее общими причинами являются АЕ (N=5 vs 8 vs 9) и неблагоприятный исход лечения (N=7 vs 5 vs 3).CSBPAR нечасто встречается во всех экспериментальных группах, и в этом случае между экспериментальными группами нет статистически значимой разницы частоты встречаемости (коэффициент заболеваемости, распространенность) либо CSBPAR, либо доказанного биопсией острого отторжения(BPAR). Через 6 и 12 месяцев коэффициент заболеваемости CSBPAR составляет 6.8%, 5.6% и 8.2% для групп с MI, LI и CsA лечением соответственно. Частота (распространенность) BPAR в группах через 6 и 12 месяцев также аналогична, хотя BPAR немного выше в LI группе, нежели в двух других группах (18.9%, 29.6% и 17.8% для MI, LI и CsA лечения соответственно). Подтвержденное с помощью биопсии острое отторжение встречается чаще, чемCSBPAR, во всех экспериментальных группах, и наиболее распространенным оно является в LI группе. Однако найдено, что многие из этих событий встречаются у пациентов, у которых концентрацииL104EA29YIg ниже заданных минимальных сывороточных концентраций. Никакой статистически значимой разницы тяжести AR между экспериментальными группами не наблюдается; однако число AR было мало и не привело к потере трансплантата. Это исследование выведено из слепого метода, чтобы исследовать лекарственный препарат с целью обеспечить стандартное наблюдение в отношении CsA, что, возможно, способствовало повышенному числу биопсий в L104EA29YIg группах (N=345) по сравнению с CsA группой (N=144). Хотя это не является неожиданным для спланированного таким образом исследования, оно позволяет ускорить диагностику почечных гистологических аномалий в группах, получающих L104EA29YIg. Смерть и/или потеря трансплантата нечасто встречается во всех экспериментальных группах, зарегистрирована 1 смерть в MI группе, 4 в CsA группе и ни одной в LI группе. Большинство случаев потери трансплантата вызвано не иммунологическими событиями, и только 3 трансплантата потеряны в MI иCsA группах АО по сравнению с 1 в LI группе. Заметное улучшение почечной функции наблюдается при лечении с применением LI 04EA29YIg по сравнению с иммуносупрессией на основе CsA. Через 12 месяцев клиренс йогексола при леченииL104EA29YIg больше во всех временных точках, при среднем улучшении 11 мл/мин/1.73 м 2 (20%) по сравнению с CsA. Через 12 месяцев хроническая нефропатия аллотрансплантата (CAN) на 30-50% менее распространена, в относительных величинах, у пациентов, получавших L104EA29YIg, чем у пациентах, получавшихCsA. Доля новых или ухудшающихся CAN через 12 месяцев составляет 29%, 19% и 44% для MI, LI иCsA групп соответственно. Через 1 год среднее систолическое кровяное давление на 3-4 мм Hg выше у пациентов, пролеченных с применением CsA (133 мм Hg), чем в MI (130 мм Hg) и LI (129 мм Hg) группах. Такой результат получают несмотря на то, что в группах, получающих L104EA29YIg, меньше пациентов, использующих антигипертензивный препарат (MI: 87.5%; LI 84.1%: CsA 92.2%). Общий сывороточный холестерин немного ниже у пациентов, пролеченных с помощью L104EA29YIg (MI: 198 мг/дл; LI: 201 мг/дл), по сравнению с пациентами, получающими CsA (212 мг/дл), хотя использование лекарства, понижающего содержание липидов, также ниже с L104EA29YIg (MI: 36.1%; LI: 31.9%; CsA: 53.1%). Четыре (5.5%) пациента умерли в CsA группе по сравнению с 1 в экспериментальных группах, получающих L104EA29YIg. Показатели нежелательных явлений (НЯ, АЕ) в экспериментальных группах сравнимы. Однако сходные АЕ значительно ниже после лечения L104EA29YIg, чем после лечения CsA. Внутривенное введение L104EA29YIg хорошо переносится, при этом отсутствуют реакции на инфузию. У пациентов, пролеченных с помощью L104EA29YIg, не наблюдается типичных связанных с CsA нежелательных явлений, таких как анемия, лейкопения, гирсутизм, тремор и гипертрофический гингивит. Терапия на основе L104EA29YIg не ассоциируется с каким-либо повышенным риском инфекций или злокачественных новообразований по сравнению с терапией на основе CsA. Заключение. Это 12-месячное исследование демонстрирует, что поддерживающая терапия на основеL104EA29YIg позволяет так же эффективно предупреждать AR, как и CsA, и обеспечивает жизнеспособность пациента и трансплантата, аналогично CsA. Кроме того, L104EA29YIg показывает значительное улучшение почечной функции и снижение CAN по сравнению с поддерживающей иммуносупрессии на основе CsA.- 28013122 токсичностью. Степени CSBPAR и BPAR сходны в трех экспериментальных группах, это показывает, что низкие показатели AR, наблюдаемые при лечении с помощью CsA, также достигаются с помощьюL104EA29YIg. Большинство BPAR классифицируется как субклинические, это наводит на мысль, что почечная функция поражена. Количественно более низкая степень AR в MI группе, по сравнению с LI группой, означает вероятную зависимость ответа от дозы в случае L104EA29YIg. Более частая биопсия вL104EA29YIg группах может, теоретически, привести к сверхдиагностике как острого, так и хронического отторжения в этих группах, заставляя предположить, что преимущества L104EA29YIg терапии в данном исследовании могут быть заниженными. Большинство BPAR событий происходит в первые три месяца после трансплантации, что не является неожиданным, так как другие исследователи показали, что в раннем пост-трансплантационном периоде требуются повышенные дозы иммунодепрессантов (Wiecek A., Novicki M., Kokot F., Ritz E. AcuteBennett WM. Posttransplant acute renal failure. Ren Fail 1997; 19(2): 225-6). Так как большинство этих событий происходит при значениях ниже заданных минимальных величин, следует обратить внимание на изменение схемы в первый месяц лечения до достижения гомеостаза. Большинство BPAR, наблюдаемых в поддерживающей фазе, происходит при очень низких или недетектируемых уровнях L104EA29YIg, это показывает, что заболеваемость AR в эти периоды связана с недостаточной иммуносупрессией, которой можно избежать, изменяя схему введения доз (схему лечения). Данное исследование демонстрирует, что лечение L104EA29YIg дает общие показатели АЕ, аналогичные показателям в случае лечения с помощью CsA, но при меньшем количестве АЕ, связанных с исследуемым лекарством. Никакой реальной разницы в числе связанных с вирусами АЕ в трех экспериментальных группах не идентифицировано. При наличии низких степеней AR новой целью поддерживающей иммуносупрессии является снижение отдаленных осложнений, включая гипертензию, гиперлипидемию, токсичность лекарства и предупреждение рубцевания. Как и в случае аутоиммунных заболеваний, появляется новое поколение иммуноселективных поддерживающих иммуносупрессоров. Ингибирование костимуляции Т-клеток путем иммуноселективной блокады костимуляции с помощью L104EA29YIg представляет собой новую схему,предлагающую перспективу более селективной поддерживающей иммуносупрессии, пониженной токсичности и лучших отдаленных результатов при почечной трансплантации. Пример 4. В медицине существует неудовлетворенная необходимость в новых лекарственных препаратах для почечной трансплантации, которые могут обеспечить кратковременную жизнеспособность субъекта и трансплантата, сравнимую с жизнеспособностью в случае лечения CNI, но при отсутствии отдаленных нефротоксических, сердечно-сосудистых и метаболических эффектов. Необходимость в них особенно велика у реципиентов ECD (доноров расширенными критериями) трансплантатов почек, в этом случае отдаленные степени жизнеспособности субъекта и трансплантата отчетливо ниже, чем в случае реципиентов трансплантатов от доноров, отвечающих стандартным критериям пригодности. L104EA29YIg, иммуносупрессор с новым механизмом действия, является перспективным не нефротоксическим кандидатом для применения у реципиентов почечных трансплантатов, имеющих ECD аллотрансплантаты. Так как L104EA29YIg можно вводить скорее во время приживления, нежели с задержкой, что часто необходимо при применении CNI, особенно в случае аллотрансплантатов с начальной недостаточной почечной функцией, он вызывает иммуносупрессию своевременно и не требует применения препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител. Это можно перевести в сравнимые степени острого отторжения с благоприятным профилем безопасности. Так как не ожидается, что L104EA29YIg будет нефротоксическим, можно найти дополнительные преимущества, связанные со структурой (т.е. CAN) и функцией (т.е. СКФ, GFR) трансплантата. Наконец, в отличие от CNI, целевой механизм действия L104EA29YIg должен обеспечить иммуносупрессию при отсутствии вредного воздействия на сердечнососудистый/метаболический профиль. Общая оценка соотношения польза-риск для L104EA29YIg в этой популяции пациентов приводится ниже. Изучают две схемы приема лекарственного средства (описанные в примере 3, с небольшой модификацией LI схемы и применением поддерживающей схемы инфузии каждые 4 недели). Основные цели. 1) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на составную жизнеспособность субъекта и жизнеспособность трансплантата через 12 месяцев. 2) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на составную величину измеренной СКФ(GFR)60 мл/мин/1.73 м 2 через 12 месяцев или снижение измеренной величины СКФ (GFR) 10 мл/мин/1.73 м 2 с 3 по 12 месяц. Цели второго порядка. 1) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на измеренную величину СКФ (GFR) через 12 месяцев. 2) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на подтвержденный с помощью биопсииCAN через 12 месяцев. 3) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на измеренную величину СКФ (GFR) через 3 месяца и изменения по сравнению с базовой линией (3 месяца) до 12 месяцев. 4) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на относительное число субъектов с измеренной величиной СКФ (GFR)30 мл/мин/1.73 м 2 через 12 месяцев. 5) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на расчетную величину СКФ (GFR) через 3, 12, 24 и 36 месяцев и изменения по сравнению с базовой линией (3 месяца) до 12, 24 и 36 месяцев. 6) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на PTDM через 12, 24 и 36 месяцев. 7) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на показатели гипертензии через 12, 24 и 36 месяцев, включая SPB, DBP, заболеваемость и уровень распространения гипертензии и интенсивность схемы лечения. 8) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на показатели дислипидемии через 12, 24 и 36 месяцев, включая сывороточные концентрации общего холестерина, холестерина не-HDL (ЛПВП),липопротеинов низкой плотности LDL (ЛПНП) и HDL (ЛПВП) и TG (триглицериды), заболеваемость и распространенность дислипидемии и контролируемой дислипидемии и интенсивность схемы лечения. 9) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на жизнеспособность субъекта и трансплантата через 24 и 36 месяцев. 10) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на показатели острого отторжения через 6 месяцев, включая частоту и тяжесть острого отторжения, применение препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител для лечения недостаточной почечной функции и прогнозируемой DGF (отсроченной функции трансплантата), начальное применение терапии, истощающей запас лимфоцитов, для лечения острого отторжения, число случаев резистентного к стероидам острого отторжения, частоту полного выздоровления (SCr (креатинин сыворотки крови) возвращается к базовой линии) после острого отторжения, частоту субклинического отторжения и частоту всех пролеченных эпизодов острого отторжения независимо от гистологических данных. 11) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на QoL. 12) Оценить общую безопасность L104EA29YIg, по сравнению с CsA. Цели третьего порядка. 1) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на тангенс угла наклона и отрезок расчетной величины СКФ (GFR) от базовой линии (3 месяца) до 12, 24 и 36 месяцев. 2) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на относительное число субъектов с измеренной величиной СКФ (GFR)45 мл/мин/1.73 м 2 через 12 месяцев. 3) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на относительное число субъектов с расчетной величиной СКФ (GFR)75 мл/мин/1.73 м 2 через 12 месяцев и число субъектов с понижением расчетной СКФ (GFR) с месяца 3 до месяца 12, по меньшей мере, на 15 мл/мин/1.73 м 2. 4) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на частоту DGF. 5) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на показатели острого отторжения через 12, 24 и 36 месяцев, включая частоту и тяжесть острого отторжения, применение препаратов поликлональных антилимфоцитарных антител для лечения недостаточной почечной функции и прогнозируемойDGF (отсроченной функции трансплантата), начальное применение терапии, истощающей запас лимфоцитов, для лечения острого отторжения, число случаев резистентного к стероидам острого отторжения,частоту полного выздоровления (SCr (креатинин сыворотки крови) возвращается к базовой линии) после острого отторжения, частоту субклинического отторжения и частоту всех пролеченных эпизодов острого отторжения независимо от гистологических данных. 6) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на составную конечную точку (ожидаемый результат) сердечно-сосудистых заболеваний (констатированная смерть от сердечно-сосудистого заболевания, инфаркт миокарда, ишемический удар, обязательная госпитализация по причине сердечнососудистого нарушения и чрескожное коронарное вмешательство) через 12, 24 и 36 месяцев. 7) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на составную конечную (результат) в случае вазоренальных заболеваний (смерть, потеря трансплантата, несмертельный инфаркт миокарда и удар) через 12, 24 и 36 месяцев. 8) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, в баллах риска по Фрамингамской шкале (в соответствии с Framingham Study) через 12, 24 и 36 месяцев. 9) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на частоту прерывания исследования лекарства. 10) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на антитела против человеческих лейкоцитарных антигенов (HLA) донора. 11) Оценить влияние L104EA29YIg, по сравнению с CsA, на Cd4 позитивную реакцию в биопсийных образцах. План (дизайн) исследования. Продолжительность исследования составляет 3 года с последующим врачебным наблюдением в течение 8 недель для оценки безопасности. В конце 3-годичного периода лечения пациентов могут отби- 30
МПК / Метки
МПК: A61K 38/17
Метки: иммунных, мутантным, трансплантата, пересадкой, нарушений, растворимым, ctla4, лечения, способы, связанных
Код ссылки
<a href="https://eas.patents.su/30-13122-sposoby-lecheniya-immunnyh-narushenijj-svyazannyh-s-peresadkojj-transplantata-rastvorimym-mutantnym-ctla4.html" rel="bookmark" title="База патентов Евразийского Союза">Способы лечения иммунных нарушений, связанных с пересадкой трансплантата, растворимым мутантным ctla4</a>
Новые производные пиперазинона для лечения нарушений, связанных с 5-нт2а-рецептором
Номер патента: 7539
Опубликовано: 27.10.2006
Авторы: Нильссон Бьерн, Лундстрем Хелена, Сернеруд Магнус, Тор Маркус
МПК: A61K 31/496, A61P 25/24, A61P 15/00...
Метки: пиперазинона, производные, лечения, нарушений, 5-нт2а-рецептором, связанных, новые
Формула / Реферат:
1. Соединение общей формулы (I) где m равно 1 или 2; n равно 0, 1, 2, 3 или 4; R1 означает Н или C1-6-алкил, арил-С1-С3-алкил, гетероарил-С1-С3-алкил, 2-гидроксиэтил, метокси-С2-С4-алкил, С1-С4-алкоксикарбонил, арилокси-С2-С3-алкил или гетероарилокси-С2-С3-алкил; где любой арильный или гетероарильный остаток может быть замещен группой С1-С4-алкил, С1-С4-алкокси, С1-С4-алкилтио, галоген, трифторметил, трифторметокси или циано; каждый из R2 и R3...
Новые производные бензофурана, используемые для профилактики или лечения нарушений, связанных с 5-ht6-рецептором
Номер патента: 10298
Опубликовано: 29.08.2008
Авторы: Йоханссон Гари, Брандт Петер, Нильссон Бьерн М.
МПК: A61K 31/495, A61K 31/343, A61K 31/435...
Метки: профилактики, новые, нарушений, связанных, производные, лечения, используемые, бензофурана, 5-ht6-рецептором
Формула / Реферат:
1. Соединение формулы (I) где P выбирают из заместителей формул (II)-(VII) где х, у и j, каждый независимо, выбирают из 0, 1 и 2; где пунктирными линиями показано, что P и R3, соответственно, могут быть присоединены или к А- или к В-кольцу по любому атому углерода, который можно замещать, при условии, что P и R3, оба, одновременно не присоединены к кольцу В; R1 выбирают из группы, состоящей из: (a) C1-6-алкила, (b) C1-6-алкокси-C1-6-алкила,...
Композиция для уменьшения токсических, алиментарных и/или метаболических нарушений, связанных с раком, и/или химиотерапией рака, и способы её применения
Номер патента: 9516
Опубликовано: 28.02.2008
Автор: Бурзинский Станислав Р.
МПК: A61K 31/195, A23L 1/305, A61K 31/198...
Метки: токсических, метаболических, уменьшения, нарушений, рака, связанных, способы, химиотерапией, раком, применения, композиция, алиментарных
Формула / Реферат:
1. Композиция для ослабления или уменьшения токсических, алиментарных и/или метаболических нарушений, связанных с раком и/или химиотерапией рака, содержащая рибофлавин, эффектор цикла мочевины, выбранный из группы, состоящей из аргинина, орнитина, цитруллина и их смесей, аминокислоты аланин, глицин, серин, таурин, треонин и валин, и подходящий растворитель, разбавитель, наполнитель или носитель. 2. Композиция по п.1, в которой эффектором цикла...
Способы стимуляции и ингибирования роста в-клеток, продуцирования иммуноглобулинов и коррекции нарушений, связанных с baff-лигандом, у животного
Номер патента: 6108
Опубликовано: 25.08.2005
Авторы: Шнайдер Паскаль, Чопп Юрг, Амброуз Кристин, Браунинг Джеффри, Маккэй Фабьенн
МПК: A61K 38/17, A61P 9/00
Метки: иммуноглобулинов, коррекции, ингибирования, животного, стимуляции, связанных, способы, в-клеток, нарушений, роста, продуцирования, baff-лигандом
Формула / Реферат:
1. Способ стимуляции роста B-клеток в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей (а) BAFF-лиганд или его активный фрагмент; (б) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и анти-m-антитело; (в) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и CD40-лиганд и (г) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и анти-CD40-лиганд. 2. Способ стимуляции...
Ifn-бета в отдельности или в комбинации с другими лекарственными средствами для лечения болезни альцгеймера и нарушений, связанных с деменцией
Номер патента: 9668
Опубликовано: 28.02.2008
Автор: Гримальди Луиджи
МПК: A61K 38/21, A61K 45/06
Метки: другими, лекарственными, лечения, болезни, нарушений, альцгеймера, средствами, комбинации, ifn-бета, связанных, деменцией, отдельности
Формула / Реферат:
1. Применение интерферона-b (IFN-b) для производства лекарственного средства для лечения и/или предотвращения болезни Альцгеймера, где указанная болезнь Альцгеймера представляет собой рано начинающуюся болезнь Альцгеймера и где IFN-b вводится в дозировке приблизительно от 1 до 50 мкг на 1 человека в сутки, причем указанный IFN-b вводится 3 раза в неделю подкожно. 2. Применение интерферона-b (IFN-b) в комбинации со средством для лечения болезни...
Предыдущий патент: Амилин и агонисты амилина для лечения психиатрических заболеваний и расстройств
Следующий патент: Замещенные индолы, обладающие активностью ингибирования nos
Случайный патент: Применение эритропоэтина