Способы стимуляции и ингибирования роста в-клеток, продуцирования иммуноглобулинов и коррекции нарушений, связанных с baff-лигандом, у животного

006108 Область изобретения Данное изобретение относится к применению лиганда, BAFFклеток активирующего фактора,принадлежащего к семейству факторов некроза опухолей, и его блокирующих агентов либо для стимуляции, либо для ингибирования экспрессии В-клеток и иммуноглобулинов. Этот белок и его рецептор могут иметь противораковые и/или иммунорегуляторные применения, а также применения для лечения нарушений иммуносупрессии, таких как ВИЧ. Конкретно, этот лиганд и блокирующие его агенты могут играть роль в развитии гипертонии и родственных ей нарушений. Кроме того, клетки, трансфицированные геном этого лиганда, могут быть использованы в генной терапии для лечения опухолей, аутоиммунных заболеваний или наследственных генетических нарушений, в которых принимают участие В-клетки. Блокирующие агенты, такие как рекомбинантные варианты или антитела, специфичные для этого лиганда или его рецептора, могут также иметь иммунорегуляторные применения. Обсуждается применениеBAFF в качестве стимулятора В-клеток для иммуносупрессивных заболеваний, в том числе, например,применения для пациентов, подвергающихся трансплантации органов (например, трансплантата костного мозга), а также восстановления после лечения рака для стимуляции продукции В-клеток. Также обсуждается применение BAFF в качестве адъюванта и/или костимулятора для обладания или восстановления уровней В-клеток приблизительно до нормальных уровней. Предпосылки изобретения Родственные фактору некроза опухолей (TNF) цитокины являются медиаторами защитных сил организма и иммунной регуляции. Члены этого семейства существуют в мембраносвязанной форме, действуя локально через межклеточные контакты, или в виде секретируемых белков, способных диффундировать к более отдаленным мишеням. Параллельное семейство рецепторов сигнализирует о присутствии этих молекул, приводя к инициации смерти клеток или клеточной пролиферации и дифференцировки в ткани-мишени. В настоящее время TNF-семейство лигандов и рецепторов имеет по меньшей мере 11 известных пар рецептор-лиганд, включающих в себя TNF:TNF-R; LT-:TNF-R; LT-/:LTR; FasL:Fas;CD40L:CD40; CD30L:CD30; CD27L:CD27; OX40L:OX40 и 4-1BBL:4-1BB. Последовательности ДНК,кодирующие эти лиганды, имеют только приблизительно 25-30% идентичность даже в наиболее родственных случаях, хотя степень гомологии аминокислот составляет приблизительно 50%. Определяющий признак этого семейства рецепторов цитокинов обнаружен в богатом цистеином внеклеточном домене, первоначально выявленном молекулярным клонированием двух различных TNFрецепторов. Это семейство генов кодирует гликопротеины, характерные для трансмембранных белков типа I, с внеклеточным лиганд-связывающим доменом, одним простирающимся через мембрану районом и цитоплазматическим районом, участвующим в активации клеточных функций. Богатый цистеином лиганд-связывающий район обнаруживает прочно связанный, имеющий дисульфидные связи внутренний(коровый) домен, который в зависимости от конкретного члена семейства повторяется многократно. Большинство рецепторов имеют четыре домена, однако, их может быть как три, так и шесть. Белки в семействе TNF-лигандов характеризуются коротким N-концевым отрезком обычно коротких гидрофильных аминокислот, часто содержащих несколько остатков лизина или аргинина, которые,как считают, служат в качестве стоп-транспортных последовательностей. Далее следует трансмембранный домен и внеклеточный домен вариабельной длины, который отделяет С-концевой рецепторсвязывающий домен от мембраны. Этот район иногда называют "стеблем" ("ножкой"). Сконцевой связывающий район содержит основную массу белка и часто, но не всегда, содержит сайты гликозилирования. Эти гены не имеют классических сигнальных последовательностей, характерных для мембранных белков типа I, мембранных белков типа II с С-концом, лежащим вне клетки, и коротким Nконцевым доменом, находящимся в цитоплазме. В некоторых случаях, например в случае TNF и LT-,расщепление в районе стебля может происходить рано во время процессинга белка, и в этом случае лиганд обнаруживают первично в секретируемой форме. Однако большинство лигандов существуют в мембранной форме, опосредующей локализованную передачу сигнала. Структура этих лигандов была определена кристаллографическим анализом TNF, LT- и CD40L. Как TNF, так и лимфотоксин- (LT-) имеют структуру сэндвича из двух антипараллельных складчатых структур с топографией рулета с джемом или греческого ключа. Rms (среднеквадратичное) отклонение между С- и -остатками составляет 0,61 С, что предполагает высокую степень сходства в их молекулярной топографии. Структурным признаком, обнаруживаемым на основе молекулярных исследований CD40L, TNF и LT-, является склонность к сборке в олигомерные комплексы. Внутренним относительно этой олигомерной структуры является образование сайта связывания рецептора в месте соединения между соседними субъединицами, создающими мультивалентный лиганд. Анализ кристаллических структур показал, что четвертичные структуры TNF, CD40L и LT- существуют в виде тримеров. Многие из аминокислот, консервативных между различными лигандами, находятся в отрезках каркасного -листа. Возможно, что эта основная сэндвич-структура сохраняется во всех этих молекулах, так как части этих каркасных последовательностей являются консервативными у многочисленных членов этого семейства. Эта четвертичная структура может быть также сохранена, поскольку конформация субъединиц, вероятно, остается сходной.-1 006108 Члены TNF-семейства могут быть лучше всего описаны как основные переключатели в иммунной системе, регулирующие как выживание, так и дифференцировку клеток. Только TNF и LT- признаются в настоящее время в качестве секретируемых цитокинов в противоположность другим, преимущественно мембраноприкрепленным членам TNF-семейства. В то время как мембранная форма TNF была хорошо охарактеризована и, вероятно, играет уникальную роль в биологии, секретируемый TNF функционирует в качестве передачи общего сигнала тревоги клеткам, более удаленным от сайта запускающего события. Таким образом, секреция TNF может усиливать событие, приводя к хорошо описанным изменениям выстилки сосудистой сети и продуцируя состояние клеток при воспалении. В противоположность этому мембраносвязанные члены этого семейства передают сигналы через рецепторы типа TNF только к клеткам, находящимся в прямом контакте. Например, Т-клетки обеспечивают СD40-опосредованную помощь только В-клеткам, приведенным в прямой контакт через родственные TCR-взаимодействия. Сходные ограничения межклеточных контактов, влияющие на способность индуцировать смерть клеток,относятся к хорошо изученной Fas-системе. По-видимому, можно разделить лиганды TNF на три группы на основе их способности индуцировать смерть клеток. Во-первых, TNF, Fas-лиганд и TRALL могут эффективно индуцировать смерть клеток во многих линиях, и их рецепторы, наиболее вероятно, имеют хорошо канонизированные домены смерти. Предположительно, лиганд к DR-3 (TRAMP/WSL-1) также относится к этой категории. Затем имеются такие лиганды, которые запускают более слабый сигнал смерти, ограниченный небольшим числом типов клеток, и TWEAK, СD30-лиганд и LTalb2 являются примерами этого класса. Как эта группа может запускать смерть клеток в отсутствие канонического домена смерти является представляющим интерес вопросом и предполагается, что существует отдельный механизм передачи более слабого сигнала смерти. Наконец, имеются члены, которые не могут эффективно доставлять сигнал смерти. Возможно,все группы могут оказывать антипролиферативное действие на некоторые типы клеток вследствие индукции дифференцировки клеток, например, CD40. Funakoshi et al. (1994).TNF-семейство выросло драматически в последние годы и включает в себя по меньшей мере 11 различных путей передачи сигналов, участвующих в регуляции иммунной системы. Широкое распространение экспрессии TWEAK и TRAIL указывает на то, что должно быть открыто еще большее функциональное разнообразие в этом семействе. Этот аспект особенно выдвинулся на передний план недавно при обнаружении двух рецепторов, которые влияют на способность вируса саркомы Рауса и простого герпеса реплицироваться, а также на основе исторических наблюдений, что TNF обладает антивирусной активностью и поксвирусы кодируют TNF-рецепторы-ловушки. Brojatsch et al. (1996); Montgomery et al.TNF представляет собой медиатор септического шока и кахексии и участвует в регуляции развития гематопоэтических (кроветворных) клеток. Он, по-видимому, играет главную роль в качестве медиатора воспаления и защиты против бактериальных, вирусных и паразитарных инфекций, а также обладает противоопухолевой активностью. TNF участвует также в различных аутоиммунных заболеваниях. TNF может продуцироваться несколькими типами клеток, в том числе макрофагами, фибробластами, Тклетками и природными клетками-киллерами. TNF связывается с двумя различными рецепторами, каждый из которых действует через специфические молекулы внутриклеточной передачи сигналов, приводя тем самым к различным эффектам TNF. TNF может существовать либо в мембраносвязанной форме, либо в виде растворимого секретируемого цитокина.LT- разделяет многие активности TNF, например связывание с рецепторами TNF, но в противоположность TNF, по-видимому, секретируется первично активированными Т-клетками и некоторыми лимфобластоидными опухолями. Гетеромерный комплекс LT- и LT- является мембраносвязанным комплексом, который связывается с рецептором LT-. LT-система (LT и LT-R), по-видимому, участвует в развитии периферических лимфоидных органов, поскольку генетическое разрушение LT- ведет к дезорганизации Т- и В-клеток в селезенке и отсутствию лимфатических узлов. LTсистема участвует также в смерти клеток некоторых линий клеток аденокарциномы.Fas-L, другой член TNF-семейства, экспрессируется преимущественно на активированных Тклетках. Он индуцирует смерть клеток, несущих его рецептор, в том числе опухолевых клеток и ВИЧинфицированных клеток, по механизму, известному как запрограммированная смерть клеток или апоптоз. Кроме того, недостаток либо Fas, либо Fas-L может приводить к лимфопролиферативным нарушениям, что подтверждает роль Fas-системы в регуляции иммунных реакций. Fas-система участвует также в повреждении печени в результате хронической инфекции гепатита и в аутоиммунной реакции у ВИЧинфицированных пациентов. Fas-система участвует также в деструкции Т-клеток у ВИЧ-пациентов.TRAIL, другой член этого семейства, по-видимому, также участвует в смерти большого разнообразия трансформированных клеточных линий различного происхождения.CD40-L, другой член TNF-семейства, экспрессируется на Т-клетках и индуцирует регуляцию СD40 несущих В-клеток. Кроме того, изменения в гене CD40-L приводят к заболеванию, известному как Хсвязанный гипер-IgМ-синдром. СD40-система участвует также в различных аутоиммунных заболеваниях, и известно, что CD40-L обладает антивирусными свойствами. Хотя СD40-система участвует в спасе-2 006108 нии апоптотических В-клеток, в неиммунных клетках она индуцирует апоптоз. Многие дополнительные лимфоцитарные члены TNF-семейства также участвуют в костимуляции. Обычно члены TNF-семейства имеют фундаментальную регуляторную роль в контроле иммунной системы и активации острых систем защитных сил хозяина. В условиях существующего прогресса в манипулировании членами TNF-семейства в терапевтических целях представляется вероятным, что члены этого семейства могут обеспечить уникальные средства для борьбы с заболеванием. Некоторые из лигандов этого семейства могут непосредственно индуцировать апоптотическую смерть многих трансформированных клеток, например LT, TNF, Fas-лиганд и TRAIL. Nagata (1997) 88 Cell 355-365. АктивацияFas и, возможно, TNF и СD30-рецептора может индуцировать смерть клеток в нетрансформированных лимфоцитах, что может выполнять иммунорегуляторную функцию. Amakawa et al. (1996) 84 Cell 551562; Nagata (1997) 88 Cell 355-365; Sytwu et al. (1996); Zheng et al. (1995) 377 Nature 348-351. Обычно смерть запускается после агрегации доменов смерти, которые находятся на цитоплазматической сторонеTNF-рецепторов. Домены смерти сопровождают сборку различных компонентов передачи сигнала, которые приводят к активации каскада каспазы. Nagata (1997) 88 Cell 355-365. Некоторые рецепторы не содержат канонических доменов смерти, например LTрецептор и CD30 (Browning et al. (1996); Lee et al.(1996, но все-таки могут индуцировать смерть клеток, хотя более слабо. По-видимому, эти рецепторы действуют первично, индуцируя клеточную дифференцировку, и смерть является отклоняющимся от нормы следствием в некоторых трансформированных клеточных линиях, хотя эта картина является неясной, так как исследования на CD30-нуль-мышах предполагают роль смерти в негативном отборе в тимусе. Amakawa et al. (1996) 84 Cell 551-562. Напротив, передача сигнала через другие пути, такие какCD40, требует сохранения выживания клеток. Таким образом, существует потребность в идентификации и характеристике дополнительных молекул, которые являются членами TNF-семейства, с обеспечением тем самым дополнительных средств контроля заболевания и манипулирования иммунной системой. В данной заявке авторы характеризуют функциональные свойства нового лиганда TNF-семейства цитокинов. Этот новый лиганд, названный BAFF (фактор активации В-клеток, принадлежащий TNFсемейству), по-видимому, экспрессируется Т-клетками и дендритными клетками для костимуляции Вклеток и, следовательно, может играть важную роль в регуляции функции В-клеток. Кроме того, авторы получили трансгенных мышей с повышенной экспрессией BAFF под контролем специфического для ткани печени промотора. Эти мыши имеют избыточные количества зрелых В-клеток, спонтанные реакции герминативных (зародышевых) центров, секретируют аутоантитела и имеют повышенное количество плазматических клеток во вторичных лимфоидных органах и отложение Ig в почках. Сущность изобретения Таким образом, данное изобретение относится к применению BAFF-лигандов, блокирующих агентов и антител против этого лиганда либо для стимуляции, либо для ингибирования роста В-клеток и секреции иммуноглобулина. Заявленное изобретение может быть использовано для терапевтических применений при многочисленных заболеваниях и нарушениях, как обсуждается более подробно ниже, а также для получения информации об иммунной системе и ее процессах и манипулирования иммунной системой и ее процессами. Кроме того, данное изобретение может быть использовано в качестве способа стимуляции или ингибирования роста В-клеток и секреции иммуноглобулинов. BAFF-ассоциированные молекулы, описанные в данном изобретении, могут также иметь применение при лечении аутоиммунных заболеваний, нарушений, связанных с пролиферацией и созреванием В-клеток, регуляцией BAFFлиганда и воспалением. Данное изобретение может быть использовано в регуляции или предупреждении гипертонии и связанных с гипертонией нарушений почечной и сердечно-сосудистой ткани. Дополнительные признаки и преимущества данного изобретения будут представлены в описании,которое следует ниже, и отчасти будут с очевидностью вытекать из этого описания, или могут быть выявлены при помощи применения на практике данного изобретения. Цели и преимущества данного изобретения будут реализованы и достигнуты при помощи способов, конкретно указанных в приведенном описании и формуле изобретения, а также в прилагаемых чертежах. Таким образом, для достижения этих и других преимуществ и в соответствии с целью данного изобретения, воплощенных в примерах и широко описанных здесь, данное изобретение включает в себя способ воздействия на рост В-клеток и секрецию иммуноглобулинов посредством введения различныхBAFF-лигандов и родственных молекул. В данном изобретении рассматривается также возможность стимуляции роста В-клеток посредством использования BAFF-лигандов или активных фрагментов полипептида. Полипептид может быть использован либо отдельно, либо в сочетании с CD-40-лигандом или антимышиным антителом. В других вариантах данное изобретение относится к способам стимуляции индуцированного дендритными клетками роста и созревания В-клеток посредством применения BAFF-лигандов или активных фрагментов BAFF. Здесь также этот полипептид может быть использован либо отдельно, либо в сочетании с CD-40-лигандом или антиантителами. В других вариантах блокирующие агенты BAFF и BAFF-рецептор использовали для ингибирования роста В-клеток и секреции иммуноглобулина. Эти агенты могут быть нефункциональным, рекомби-3 006108 нантным BAFF, BAFF-специфическими антителами, BAFF-рецептор-специфическими антителами или молекулой антитела против BAFF-лиганда (анти-ВАFF-лигандом). В других вариантах данное изобретение относится к применению BAFF, родственных BAFF молекул и блокирующих BAFF агентов для лечения гипертонии, связанных с гипертонией нарушений, иммунных нарушений, аутоиммунных заболеваний, воспаления и В-клеточных лимфопролиферативных нарушений. Данное изобретение включает в себя применение BAFF и родственных BAFF молекул в качестве либо агонистов, либо антагонистов в индукции иммунных реакций посредством влияния на рост и/или созревание В-клеток и секрецию иммуноглобулина. Данное изобретение относится в других вариантах к растворимым конструкциям, содержащимBAFF, которые могут быть использованы для прямого запуска опосредованных BAFF фармакологических событий. Такие события могут иметь ценные терапевтические преимущества в лечении рака, опухолей или манипулировании иммунной системой для лечения иммунологических заболеваний. Кроме того, в других вариантах заявленное изобретение относится к антителам, направленным против BAFF-лиганда, которые могут быть использованы, например, для лечения рака и манипулирования иммунной системой для лечения иммунологического заболевания. В других вариантах данное изобретение относится к способам генной терапии с использованием генов BAFF. Фармацевтические препараты данного изобретения могут, в случае необходимости, включать в себя фармацевтически приемлемые носители, адъюванты, наполнители или другие фармацевтические композиции и могут вводиться в любой из многочисленных форм или любым из многочисленных способов,известных в данной области. Должно быть понятно, что как предыдущее общее описание, так и нижеследующее подробное описание являются примерными и приведенными для объяснения и предназначены для обеспечения дополнительного объяснения заявленного изобретения. Сопутствующие чертежи включены для обеспечения дополнительного понимания данного изобретения и входят в это описание и составляют его часть, иллюстрируют несколько вариантов данного изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов данного изобретения. Описание чертежей На фиг. 1(А) изображена предсказанная аминокислотная последовательность BAFF человека [SEQID NO: 1] и мыши [SEQ ID NO: 2]. Показаны предсказанный трансмембранный домен (TMD, пунктирная линия), потенциальные сайты N-связанного гликозилирования (звезды) и сайт природного процессингаBAFF человека (стрелка). Двойная линия над hBAFF указывает последовательность, полученную деградацией методом Эдмана процессированной формы BAFF. На фиг. 1(В) изображены в сравнении внеклеточная белковая последовательность BAFF [SEQ IDNO: 3] и таковые некоторых членов семейства TNF-лигандов [SEQ ID NO: 4 (hAPRIL); SEQ ID NO: 5(hTNF альфа); SEQ ID NO: 6 (hFasL); SEQ ID NO: 7 (hLT альфа); SEQ ID NO: 8 (hRANKL)]. Идентичные и гомологичные остатки представлены черными и обведенными штрихами блоками соответственно. На фиг. 1(С) изображена дендограмма лигандов TNF-семейства. Фиг. 2 является схематической характеристикой рекомбинантного BAFF.(А) - схематическое представление рекомбинантных конструкций BAFF. Растворимые рекомбинантные BAFF, начинающиеся при Leu83 и Gln136, экспрессируются слитыми с N-концевой Flag-меткой и линкером из 6 аминокислот. Длинная форма расщепляется между Arg133 и Ala134 (стрелка) в 293 Тклетках, давая процессированную форму BAFF. Asn124 и Asn242 относятся к консенсусным сайтам Nгликозилирования. N-связанный гликан присутствующий на Asn124, показан в виде Y. TMD: трансмембранный домен.(В) - обработка пептид-N-глюканазой F (PNGase F) рекомбинантного BAFF. Концентрированные супернатанты, содержащие Flag-меченные BAFF и APRIL, дегликозилировали и анализировали при помощи Вестерн-блоттинга с использованием поликлональных анти-ВАFF-антител или анти-Flag М 2, как указано. Все полосы, за исключением процессированного BAFF, реагировали также с анти-Flag М 2 (данные не показаны).(С) - полноразмерный BAFF процессируют до растворимой формы. 293 Т-клетки временно трансфицировали полноразмерным BAFF. Трансфицированные клетки и их концентрированные супернатанты анализировали Вестерн-блоттингом с использованием поликлональных анти-ВАFF-антител. Супернатанты, соответствующие 10 количество клеток, наносили на гель.(D) - гель-фильтрация растворимого BAFF на Супердексе-200. Концентрированные супернатанты,содержащие растворимый BAFF/короткий, фракционировали на колонке Супердекса-200 и элюированные фракции анализировали Вестерн-блоттингом с использованием анти-Flag М 2-антитела. Положения миграции маркеров молекулярной массы (в кДа) указаны слева для электрофореза в ДСН-ПААГ и в верхней части фигуры для гель-фильтрации. На фиг. 3 изображена экспрессия BAFF.(А) - нозерн-блоты (2 мкг поли А+РНК на дорожку) различных тканей человека зондировали антисмысловой мРНК BAFF.(В) - амплификация с использованием обратной транскриптазы BAFF, альфа-цепи рецептора IL-2 и актина из РНК очищенных Т-клеток крови в различных временных точках ФГА-активации, Ерозеткообразующие отрицательные клетки крови (В-клетки и моноциты), полученные in vitro незрелые дендритные клетки, 293-клетки и 293-клетки, стерильно трансфицированные полноразмерным BAFF(293-BAFF). Контрольные амплификации проводили в отсутствие добавленной кДНК. Альфа-цепь IL-2 рецептора амплифицировали в качестве маркера активации Т-клеток. На фиг. 4 изображено связывание BAFF со зрелыми В-клетками.(А) - связывание зрелого BAFF с клеточными линиями BJAB и Jurkat и с очищенными СD19+клетками пуповинной крови. Клетки окрашивали указанным количеством (в нг/50 мкл) Flag-BAFF и анализировали проточной цитометрией.(А) - поверхностная экспрессия BAFF в стабильно трансфицированных 293-клетках. 293-BAFF и 293-клетки дикого типа окрашивали mAb 43,9 анти-BAFF и анализировали проточной цитометрией.(В) - костимуляция PBL 293-ВАFF-клетками. PBL (105/лyнкa) инкубировали с 15000 фиксированными глутаровым альдегидом 293-клетками (293-клетками дикого типа или 293-BAFF-клетками) в присутствии или в отсутствие антитела против В-клеточного рецептора (анти-). Фиксированные 293-клетки отдельно включали 100 имп/мин.(С) - зависимая от дозы костимуляция пролиферации PBL растворимым BAFF в присутствии анти-. Пролиферацию определяли после 72 ч инкубации с использованием включения [3 Н]-тимидина. Контроли включают в себя клетки, обработанные только BAFF, денатурированным нагреванием BAFF, или посторонним антителом не относящегося к делу изотипа вместо анти-.(Е) - BAFF костимулирует секрецию Ig предактивированных В-клеток человека. Очищенные CD19+ В-клетки активировали сокультивированием с Т-клетками EL-4 и супернатантами активированных Тклеток в течение 5-6 дней, затем повторно выделяли и культивировали в течение дополнительных 7 дней в присутствии только среды (-) или содержащих 5% активированных Т-клеток супернатантов (T-SUP) или смеси цитокинов (IL-2, IL-4, IL-10). Столбцы означают средние величины концентраций Ig для культур с 1 мкг/мл BAFF или без него. Средние величиныSD в значении увеличения в указанное число раз были 1,230,11 для среды только, 2,060,18 с супернатантами Т-клеток (4 эксперимента) и 1,450,06 с IL-2, IL-4 и IL-10 (2 эксперимента). Эксперименты проводили с периферической кровью (3 эксперимента) или В-клетками пуповинной крови (один эксперимент; 2,3-кратное увеличение с Т-клеточными супернатантами, 1,5-кратное увеличение с IL-2, IL-4 и IL-10).(F) - кривая доза-ответ для действия BAFF в культурах с Т-клеточными супернатантами, как показано в панели D. СреднееSD для 3 экспериментов. Фиг. 6 показывает, что BAFF действует как кофактор для пролиферации В-клеток. ПролиферациюPBL человека измеряли отдельно (500 имп/мин), в присутствии только BAFF-лиганда, в присутствии только козьих антимышиных антител (nu) и как с BAFF-лигандом, так и с антимышиными антителами. Комбинация антимышиного антитела и BAFF значимо повышала пролиферацию PBL по мере увеличения концентрации BAFF, что предполагает наличие кофакторных свойств BAFF. На фиг. 7 изображено повышенное количество В-клеток в BAFF-Tg-мышах.(A) Повышенное количество лимфоцитов в BAFF-Тg-мышах. На этой диаграмме сравниваются 12 контрольных однопометных мышей (левая панель) с 12 BAFF-Tg-мышами (правая панель). Число лимфоцитов показано кружками, а гранулоцитов (в том числе нейтрофилов, эозинофилов, базофилов) - ромбами.(B) Повышенная доля В-клеток в PBL из BAFF-Tg-мышей. PBL окрашивали как анти-В 220-FIТС,так и анти-СD4-ФЭ для FACS-анализа и устанавливали дискриминационные окна в клеточном сортере на живых клетках с использованием прямого рассеивателя. Показаны проценты CD4- и В 220 положительных клеток. Показаны одна контрольная мышь (слева) и две BAFF-Tg-мыши (справа), и результаты были репрезентативными результатами 7 животных, анализируемых в каждой группе.(C) FACS-анализ соотношения В-клеток к Т-клеткам в PBL. Различие между контрольными животными и BAFF-Tg-мышами на (А) и (С) были статистически значимыми (Р 0,001).(D) Увеличенная экспрессия МНС класса II на В-клетках из PBL BAFF-Tg-мышей. Экспрессию МНС класса II анализировали при помощи FACS.-5 006108 Экспрессию Всl-2 измеряли внутрицитоплазматическим окрашиванием, и клетки анализировали при помощи FACS. Как в (D), так и в (Е) дискриминационные окна в клеточном сортере на живых клетках устанавливали на прямом рассеивателе (рассеивающем вперед). Показаны четыре контрольные однопометные мыши (белые столбцы) и 4 BAFF-Tg-мыши, и они являются репрезентативными по меньшей мере для 12 животных, анализируемых для каждой группы. MFI (среднее интенсивности флуоресценции). Различие между контрольными животными и BAFF-Tg-мышами было статистически значимым (Р 0,005).(F) Увеличенная экспрессия эффекторных Т-клеток у BAFF-Тg-мышей. PBL окрашивали анти-СD4 Суchrome, анти-СD44-FITC и анти-L-селектин-ФЭ. Показаны клетки с установкой дискриминационного окна на СD4+-клетки. Показаны проценты CD44hi/L-ceлeктинlo-клeтoк (hi = высокий, lо = низкий). Показаны одна контрольная мышь (слева) и две BAFF-Tg-мыши (справа), и результаты являются репрезентативными результатами для 8 животных, анализируемых в каждой группе. На фиг. 8 изображены компартменты В-клеток в селезенке, но не в костном мозгу BAFF-Tg-мышей.(B) FACS-окрашивание на пре-В-клетки (B220+/CD43-) и про-В-клетки (B220+/CD43+) в костном мозгу с использованием анти-CD43-FITC, анти-В 220-Су-сhrome и анти-IgM-ФЭ одновременно. Показаны клетки с установкой дискриминационного окна на IgM-отрицательную популяцию. Показаны проценты пре-В-клеток (B220+/CD43-) и про-В-клеток (B220+/CD43+). Для всех фигур (А и В) показаны одна контрольная мышь (слева) и две BAFF-Tg-мыши (справа), и результаты являются репрезентативными для 7 животных, анализируемых для каждой группы. На фиг. 9 изображены повышенные уровни Ig, RF (РФ) и CIC (ЦИК) у BAFF-Tg-мышей.(А) Электрофорез в ДСН-ПААГ двух контрольных сывороток (-) и 4 сывороток из BAFF-Tg-мышей(+) бок о бок с указанным количеством очищенного мышиного IgG для ссылки. Интенсивность полосы альбумина является одинаковой во всех дорожках, указывая, что материал, нанесенный на гель, является эквивалентным для каждой пробы. Анализ на основе ELISA общего мышиного Ig (В), RF (РФ) (С) и CIC (ЦИК) (D) в сыворотках 19 контрольных однопометных животных (белые столбцы) и 21 BAFF-Tg-мыши (черные столбцы). В отсутствие правильного RF-контроля титр (основание логарифма 2) для RF определяют как разведение сывороток, дающее в 3 раза более высокие O.D., чем O.D. фона. Количество CIC определяют как количество РАР (пероксидаза-мышиное антитело против пероксидазы), требующееся для получения O.D., эквивалентного O.D., полученному с тестируемой сывороткой. Различие между контрольными животными иBAFF-Tg-мышами было статистически значимым (Р 0,001 в (В) и (С), Р 0,003 в (D. На фиг. 10 изображено присутствие аутоантител анти-ssДНК и анти-dsДНК (против одноцепочечной ДНК и против двухцепочечной ДНК) у некоторых BAFF-Tg-мышей.(A) Анализ ELISA аутоантител анти-ssДНК у 19 контрольных однопометных мышей (серые столбцы) и 21 BAFF-Tg-мыши (черные столбцы).(B) Анализ ELISA аутоантител анти-ssДНК у 5 контрольных однопометных мышей и 5 животных,показывающих уровни аутоантител анти-ssДНК из (А).(C) Парафиновые срезы почек из контрольной мыши (слева) и BAFF-Tg-мыши (справа), окрашенные козьим антимышиным Ig-HRP. Депонирование Ig видно по коричневому окрашиванию. Эти картины являются репрезентативными для 6 анализированных BAFF-Tg-мышей. На фиг. 11 показаны увеличенные пейеровы бляшки у BAFF-Tg-мышей. Фотография пейеровых бляшек (показанных стрелкой) в тонкой кишке контрольной мыши (слева) и BAFF-Tg-мыши (справа). Эта картина является воспроизводимой по меньшей мере у 12 мышей, умерщвленных в каждой группе. Увеличение 5 Х. На фиг. 12 показаны разрушенные Т- и В-клеточные образования, сильные реакции герминативных(зародышевых) центров, уменьшенное число дендритных клеток и увеличенное число плазматических клеток в селезенке BAFF-Tg-мышей. Контрольная мышь показана на А, С, Е и G, a BAFF-Tg-мышь - на В, D, F и Н. В-клетки - синие, а Т-клетки - коричневые (А и В). Зародышевые центры показаны стрелкой (С и D). Только небольшое число зародышевых центров наблюдается у контрольных мышей (С). CD11c-положительные дендритные клетки коричневые и видны в зоне Т-клеток, в мостиковых каналах и в маргинальной зоне (Е). Очень мало зародышевых центров присутствует в BAFF-Тg-мышах (F). Синдекан-1-положительные плазматические клетки обнаруживаются только в красной пульпе селезенки BAFF-Tg-мышей (Н), но не у контрольных животных (G). Эти картины являются воспроиводимыми по меньшей мере у 12 анализированных BAFF-Tg-мышей и 12 контрольных мышей. Увеличение 100 Х для всех картин, кроме С и D, где увеличение составляет 50 Х. В: В-клеточный фолликул. Т: PALS, WP: белая пульпа, RP: красная пульпа. На фиг. 13 изображены разрушенные Т- и В-клеточные образования, усиленная реакция герминативных (зародышевых) центров и большое число плазматических клеток у MLN BAFF-Tg-мышей.-6 006108 Контрольная мышь показана на А, С, Е и G, а BAFF-Tg-мышь - на В, D, F и Н. Иммуногистохимию проводили, как описано на фиг. 6. Окрашивание Т- и В-клеток показано на А и В, зародышевые центры на С и D, дендритные клетки - на Е и F и плазматические клетки - на G и Н. GC: зародышевый центр. Увеличение 100 Х. Подробное описание изобретения Теперь будут описаны подробно предпочтительные в настоящее время варианты данного изобретения. Изобретение относится к применению BAFF и родственных BAFF молекул для воздействия на рост и созревание В-клеток и секрецию иммуноглобулина. Данное изобретение относится к применениюBAFF и родственных BAFF молекул для индукции ответов иммунной системы, которые необходимы в случае заболеваний, связанных с нарушениями иммунного ответа. Кроме того, данное изобретение связано с лечением рака и нарушений иммунного ответа путем применения BAFF или родственного BAFF гена с помощью методов генной терапии.BAFF-лиганд и его гомологи, продуцируемые хозяевами, трансформированными последовательностями согласно изобретению, а также нативный BAFF, очищенный с использованием способов, известных в данной области, или полученный из известных аминокислотных последовательностей, применимы в многочисленных способах для противоракового, противоопухолевого и иммунорегуляторного приложений. Они применимы также в терапии и в способах, относящихся к лечению других заболеваний. Другой аспект данного изобретения относится к применению полипептида, кодируемого выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей BAFF-лиганд, в "антисмысловой" терапии. Применяемый здесь термин "антисмысловая" терапия относится к введению или генерированию in situ олигонуклеотидов или их производных, которые специфически гибридизуются во внутриклеточной среде с клеточными мРНК и/или ДНК, кодирующими представляющий интерес лиганд, так, чтобы ингибировать экспрессию кодируемого белка, например, путем ингибирования транскрипции и/или трансляции. Это связывание может осуществляться за счет обычной комплементарности пар оснований или, например, в случае связывания с ДНК-дуплексами, через специфические взаимодействия в большой бороздке двойной спирали. В общем, "антисмысловой" терапией называют ряд способов, обычно используемых в данной области, и она включает в себя любую терапию, которая основана на специфическом связывании с олигонуклеотидными последовательностями. Антисмысловая конструкция согласно изобретению может быть доставлена, например, в виде экспрессионной плазмиды, которая при транскрипции в клетке продуцирует РНК, которая комплементарна по меньшей мере части клеточной мРНК, которая кодирует Кау-лиганд. Альтернативно, антисмысловой конструкцией может быть олигонуклеотидный зонд, который генерируется ex vivo. Такие олигонуклеотидные зонды предпочтительно являются модифицированными олигонуклеотидами, которые устойчивы к эндогенным нуклеазам и, следовательно, являются стабильными in vivo. Примерами молекул нуклеиновых кислот для применения в качестве антисмысловых олигонуклеотидов являются фосфоамидатные,фосфотиоатные и метилфосфонатные аналоги ДНК (см., например, патент США 5176996; патент США 5264564 и патент США 5256775). Кроме того, общие подходы к конструированию олигомеров, применимых в антисмысловой терапии, были даны в обзорах, например Van Der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958-976; и Stein et al.(1988) Cancer Res 48:2659-2668, специально включенных здесь в качестве ссылки. С. BAFF-лиганд.BAFF-лиганд согласно данному изобретению, как обсуждалось выше, является членом TNFсемейства и описан в заявке РСТ с номером PCT/US 98/19037 (WO 99/12964), включенной здесь в качестве полной ссылки. Этот белок, его фрагменты или гомологи могут иметь широкие терапевтические и диагностические применения.BAFF-лиганд присутствует прежде всего в селезенке и в лимфоцитах периферической крови (PBL),что строго указывает на его регуляторную роль в иммунной системе. Сравнение заявленных последовательностей BAFF-лиганда с другими членами TNF-семейства человека выявляет значительное структурное сходство. Все эти белки имеют несколько общих районов консервативных последовательностей во внеклеточном домене. Хотя точная трехмерная структура заявленного лиганда неизвестна, прогнозируется, что как членTNF-семейства он может иметь определенные структурные характеристики, общие с другими членами этого семейства. Новые полипептиды данного изобретения специфически взаимодействуют с рецептором, который еще не был идентифицирован. Однако пептиды и способы, описанные здесь, позволяют идентифицировать рецепторы, которые специфически взаимодействуют с BAFF-лигандом или его фрагментами. Заявленное изобретение в некоторых вариантах включает в себя способы применения пептидов,произведенных из BAFF-лиганда, которые обладают способностью связываться с их рецепторами. Фрагменты BAFF-лигандов могут быть получены несколькими путями, например рекомбинантным, при помощи ПЦР, путем протеолитического расщепления или химического синтеза. Внутренние или концевые фрагменты полипептида могут быть получены удалением одного или нескольких нуклеотидов из одного-7 006108 или обоих концов нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид. Экспрессия мутагенизированной ДНК дает фрагменты полипептида. Фрагменты полипептида могут быть также химически синтезированы с использованием способов,известных в данной области, таких как общепринятый твердофазный химический способ Меррифилда с использованием защитных групп f-moc или t-boc. Например, пептиды и последовательности ДНК согласно изобретению могут быть произвольно разделены на фрагменты нужной длины без перекрывания фрагментов или разделены на перекрывающиеся фрагменты желаемой длины. Такие способы описаны более подробно ниже. Генерирование растворимых форм BAFF-лиганда Растворимые формы BAFF-лиганда часто могут быть эффективны в передаче сигнала и, следовательно, могут вводиться в качестве лекарственного средства, которое имитирует природную мембранную форму. Возможно, что заявленный здесь BAFF-лиганд природно секретируется в виде растворимых цитокинов, но если это не происходит, можно заново сконструировать ген для усиления секреции. Для создания растворимой секретируемой формы BAFF-лиганда удаляют на уровне ДНК N-концевые трансмембранные районы и некоторую часть района стебля и заменяют их лидерной последовательностью типа I или альтернативно лидерной последовательностью типа II, которая создаст возможность эффективного протеолитического расщепления в выбранной системе экспрессии. Квалифицированный специалист мог бы варьировать длину района стебля, сохраняемую в секретируемой экспрессионной конструкции для оптимизации как свойств связывания с рецептором, так и эффективности секреции. Например,конструкции, содержащие любую возможную длину стебля, в частности укороченные на N-конце конструкции, можно было бы получить таким образом, что полученные в результате белки, могли бы начинаться с аминокислот 81-139. Таким образом, можно было бы получить последовательность стебля оптимальной длины. Е. Генерирование антител, реактивных с BAFF-лигандом. Данное изобретение включает в себя также антитела, специфически реактивные с заявленнымBAFF-лигандом или его рецепторами. Антибелковые/антипептидные антисыворотки или моноклональные антитела могут быть получены согласно стандартным протоколам (см., например, Antibodies: ALaboratory Manual ed. by Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988. Млекопитающее, такое как мышь, хомячок или кролик, может быть иммунизировано иммуногенной формой этого пептида. Способы придания иммуногенности белку или пептиду включают в себя конъюгирование с носителями или другие способы, хорошо известные в данной области. Иммуногенная часть BAFF-лиганда или его рецепторов может быть введена в присутствии адъюванта. Прогрессирование иммунизации может быть подвергнуто мониторингу путем регистрации титров антител в плазме или сыворотке. Стандартный ELISA или другие иммуноанализы могут быть использованы с иммуногеном в качестве антигена для оценки уровней антител. В предпочтительном варианте рассматриваемые антитела являются иммуноспецифическими в отношении антигенных детерминант BAFF-лиганда или его рецепторов (например, антигенных детерминант полипептида SEQ ID NO: 2, указанная последовательность описана в заявке РСТ с номером PCT/US 98/19037 (WO 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки) или близкородственных гомологов человека или млекопитающего, не являющегося человеком (например, имеющих процент гомологии 70,80 или 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95% гомологии). В дополнительном предпочтительном варианте данного изобретения антитела против BAFF-лиганда или против рецептора BAFFлиганда, по существу, не реагируют перекрестно (т.е. реагируют специфически) с белком, который, например, менее чем на 80% гомологичен указанной последовательности SEQ ID NO: 2 или 6, описанной в заявке PCT/US 98/19037 (WO 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки; предпочтительно менее чем на 90% гомологичен указанной последовательности SEQ ID NO: 2, описанной в заявке PCT/US 98/19037 (WO 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки, и наиболее предпочтительно менее чем на 95% гомологичен указанной последовательности SEQ ID NO: 2, описанной в заявке PCT/US 98/19037 (WO 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки. "По существу перекрестно не реагирует" означает, что это антитело имеет аффинность связывания в отношении негомологичного белка менее 10%, более предпочтительно менее 5% и даже более предпочтительно менее 1% аффинности связывания в отношении белка указанной последовательности SEQ ID NO: 2, описанной в заявке PCT/US 98/19037 (WO 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки. Применяемый здесь термин "антитело" включает в себя фрагменты антитела, которые также специфически реактивны с BAFF-лигандом или его рецепторами. Антитела могут быть фрагментированы с использованием общепринятых способов, и фрагменты могут быть подвергнуты скринингу на применимость таким же образом, как описано выше для целых антител. Например, F(ab')2-фрагменты могут быть получены обработкой антитела пепсином. Полученный F(ab')2-фрагмент может быть обработан для уменьшения числа дисульфидных мостиков с получением Fab'-фрагментов. Подразумевается, что антитела согласно изобретению дополнительно включают в себя биоспецифические и химерные молекулы,имеющие активность против BAFF-лиганда или против рецептора BAFF-лиганда. Таким образом, как моноклональные, так и поликлональные антитела (Ab) против BAFF-лиганда, Tumor-лиганда и их рецеп-8 006108 торов, и фрагменты антител, такие как Fab' и F(ab')2, могут быть использованы для блокирования действия этого лиганда и его соответствующего рецептора. Различные формы антител могут быть также получены с использованием стандартных способов рекомбинантных ДНК. Статья Winter and Milstein (1991) Nature 349:293-299 специально включена здесь в качестве ссылки. Например, могут быть сконструированы химерные антитела, в которых антигенсвязывающий домен из антитела животного связан с константной областью иммуноглобулина человека (например, Cabilly et al., US patent 4816567, включенный здесь в качестве ссылки). Химерные антитела могут ослаблять наблюдаемые иммуногенные реакции, вызываемые антителами животных, при клиническом применении на человеке. Кроме того, могут быть синтезированы рекомбинантные гуманизированные антитела, которые узнают BAFF-лиганд или его рецепторы. Гуманизированные антитела являются химерами, содержащими в основном последовательности IgG человека, в которые были встроены районы, ответственные за специфическое связывание антигена. Животных иммунизируют желаемым антигеном, соответствующие антитела выделяют и часть последовательностей вариабельной области, ответственных за связывание специфического антигена, удаляют. Затем полученные у животного районы связывания антигена клонируют в соответствующее местоположение генов антител человека, в которых были делетированы районы связывания антигена. Гуманизированные антитела позволяют минимизировать использование гетерологичных (например, межвидовых) последовательностей в антителах человека и, следовательно, они с меньшей вероятностью вызывают иммунные реакции при введении субъекту. Конструирование различных классов рекомбинантных антител может также выполняться посредством получения химерных или гуманизированных антител, содержащих вариабельные домены и константные домены человека (СН 1, СН 2, СН 3), выделенные из различных классов иммуноглобулинов. Например, антитела с увеличенными валентностями сайтов связывания антигена могут быть рекомбинантно получены клонированием антиген-связывающего сайта в векторы, несущие константные области цепи (иммуноглобулина) человека. Статья Arulanandam et al. (1993) J. Exp. Med., 177: 1439-1450 включена здесь в качестве ссылки. Кроме того, стандартные способы рекомбинантных ДНК могут быть использованы для изменения связывающих аффинностей рекомбинантных антител с их антигенами путем изменения аминокислотных остатков вблизи антиген-связывающих сайтов. Антиген-связывающая аффинность гуманизированного антитела может быть увеличена посредством мутагенеза на основе молекулярного моделирования. Публикация Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 86:10029-33 включена здесь в качестве ссылки.F. Получение аналогов; получение измененных последовательностей ДНК и пептидов. Аналоги BAFF-лиганда могут отличаться от природно встречающегося BAFF-лиганда в аминокислотной последовательности или иным образом, который не затрагивает последовательности, или же и тем, и другим. Не относящиеся к последовательности модификации включают в себя in vivo или in vitro химическую дериватизацию BAFF-лиганда. Не относящиеся к последовательности модификации включают в себя, не ограничиваясь ими, изменения ацетилирования, метилирования, фосфорилирования, карбоксилирования или гликозилирования. Предпочтительные аналоги включают в себя биологически активные фрагменты BAFF-лиганда, последовательности которых отличаются от последовательности, даваемой в указанной в SEQ ID NO: 2 последовательности, описанной в заявке с номером PCT/US 98/19037 (WO 99/12964), включенной здесь в виде полной ссылки, одной или несколькими консервативными заменами аминокислот или одной или несколькими неконсервативными заменами аминокислот, делециями или инсерциями, которые не устраняют активность BAFF-лиганда. Консервативные замены обычно включают в себя замену одной аминокислоты другой аминокислотой со сходными характеристиками, например замены в пределах следующих групп: валин, глицин; глицин, аланин; валин, изолейцин, лейцин; аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; аспарагин, глутамин; серин, треонин; лизин, аргинин; и фенилаланин, тирозин.G. Материалы и способы данного изобретения. Использовали моноклональное антитело анти-Flag М 2, биотинилированное антитело анти-Flag М 2 и антитело анти-Flag М 2, связанное с агарозой, марки Sigma. Реагенты для культуры клеток приобретали в Life Sciences (Basel, Switzerland) и Biowhittaker (Walkersville, MD). Flag-меченный APRIL человека (остатки К 110-L250) получали в 293-клетках, как описано (10, 11). FITC-меченные антитела анти-СD4, антиCD8 и анти-СD19 приобретали в Pharmingen (San Diego, CA). Козьи F(ab')2, специфичные для Fc5 фрагмента IgM человека, приобретали в Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA). Вторичные антитела получали либо из Pharmingen, либо из Jackson ImmunoResearch и использовали в рекомендуемых разведениях. 293 Т (12)-клетки и линии фибробластных клеток почек эмбриона человека (табл. 1) поддерживали в DMEM, содержащей 10% инактивированную нагреванием фетальную телячью сыворотку (ФТС). 293 клетки почек эмбриона человека поддерживали в DMEM-питательной смеси F12 (1:1), дополненной 2% ФТС. Т-клеточные линии, В-клеточные линии и линии макрофагальных клеток (табл. 1) выращивали вRPMI, дополненной 10% ФТС. Клетки Molt-4 культивировали в среде Iscov, дополненной 10% ФТС. Линии эпителиальных клеток выращивали в среде МЕМ-альфа, содержащей 10% ФТС, 0,5 мМ не-9 006108 незаменимых аминокислот, 10 мМ Na-Hepes и 1 мМ Na-пирувата. HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) поддерживали в среде M199, дополненной 20% ФТС, 100 мкг/мл фактора роста эпителиальных клеток (Collaborative Research, Inotech, Dottikon, Switzerland) и 100 мкг/мл натриевой соли гепарина (Sigma). Все среды содержали антибиотики пенициллин и стрептомицин. Лейкоциты периферической крови выделяли из гепаринизированной крови здоровых взрослых волонтеров посредством центрифугирования в градиенте Paque-фиколла (Pharmacia, Uppsala, Sweden) и культивировали в RPMI,10% ФТС. Т-клетки получали из неприкрепленных PBL розеткообразованием с обработанными нейраминидазой эритроцитами овцы и отделяли от не образующих розеток клеток (в основном В-клеток и моноцитов) центрифугированием в градиенте Paque-фиколла. Очищенные Т-клетки активировали в течение 24 ч фитогемагглютинином (ФЭ) (Sigma) (1 мкг/мл), промывали и культивировали в RPMI, 10% ФТС, 20 Е/млIL-2. CD14 моноциты очищали путем магнитного сортинга клеток с использованием анти-СD14 антител микрогранул, покрытых козьими антимышиными антителами и устройства Minimacs (MiltenyiCD83, популяции клеток, подобных дендритным клеткам. В-клетки человека со степенью чистоты 97% выделяли, как описано (13), из периферической крови или крови пуповины с использованием покрытых анти-СD19 магнитных гранул (М 450, Dynal, Oslo, Norway). Нозерн-блот-анализ. Нозерн-блот-анализ проводили с использованием Нозерн-блотов I и II многочисленных тканей человека (Clontech 7760-1 и 7759-1). Мембраны инкубировали в растворе для гибридизации (50% формамид, 2,5 х Denhardt, 0,2% ДСН, 10 мМ ЭДТА, 2 х SSC, 50 мМ NaH2PO4, pH 6,5, 200 мкг/мл обработанной ультразвуком ДНК спермы лосося) в течение 2 ч при 60 С. Зонд антисмысловой ДНК, содержащий нуклеотиды, соответствующие аминокислотам 136-285 hBAFF, денатурировали нагреванием и добавляли при 2106 имп/мл в свежий раствор для гибридизации. Мембрану гибридизовали 16 ч при 62 С, промывали один раз в 2 х SSC, 0,05% ДСН (30 мин при 25 С), один раз в 0,1 х SSC, 0,1% ДСН (20 мин при 65 С) и экспонировали при -70 С на рентгеновских пленках. Характеристика кДНК BAFF. Частичная последовательность кДНК BAFF человека содержалась в нескольких EST-клонах (маркерных экспрессирующихся последовательностях) (например, с номерами доступа банка генов Т 87299 и АА 166695), полученных из библиотек фетальной печени и селезенки и рака яичников. 5'-фрагмент этой кДНК получали амплификацией 5'-RACE-PCR (ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК) (Marathon-Ready cDNA, Clontech, Palo Alto, CA) с олигонуклеотидами AP1 и JT1013 (5'ACTGTTTCTTCTGGACCCTGAACGGC-3') [SEQ ID NO: 9] с использованием библиотеки кДНК, полученной из пула лейкоцитов человека в качестве матрицы, как рекомендовано изготовителем. Полученный ПЦР-продукт клонировали в PCR-0-blunt (Invitrogen, NV Leek, The Netherlands) и субклонировали в виде EcoRI/PstI-фрагмента в вектор рТ 7 Т 3 Рас (Pharmacia), содержащий EST-клон Т 87299. Таким образом, полноразмерную кДНК BAFF человека получали объединением 5'- и 3'-фрагментов с использованием внутреннего PstI-сайта BAFF. Этой последовательности был дан номер доступа GenBank AF116456. Частичная последовательность 617 п.н. мышиного BAFF содержалась в двух перекрывающихсяEST-клонах (АА 422749 и АА 254047). ПЦР-фрагмент, охватывающий нуклеотиды 158-391 этой последовательности, использовали в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК селезенки мыши (Stratagene, La Jolla, CA). Экспрессия рекомбинантного BAFF. Полноразмерный hBAFF амплифицировали с использованием олигонуклеотидов JT1069 (5'GACAAGCTTGCCACCATGGATGACTCCACA-3')PCR-3. Короткую версию растворимого BAFF (аминокислоты Q136-L285) амплифицировали с использованием олигонуклеотидов JT636 (5'-CTGCAGGGTCCAGAAGAAACAG-3') [SEQ ID NO: 12] и JT637. Длинную версию растворимого BAFF (аминокислоты L83-L285) получали из полноразмерного BAFF с использованием внутреннего PstI-сайта. Растворимые BAFF повторно субклонировали в виде PstI/EcoRIфрагментов после сигнального пептида гемагглютинина и Flag-последовательности модифицированного вектора PCR-3 и в виде PstI/SpeI-фрагментов в модифицированный бактериальный экспрессирующий вектор pQE16 в рамке считывания с N-концевой Flag-последовательностью (14). Конструкции секвенировали на обеих цепях. Установление стабильных линий 293-клеток, экспрессирующих короткую растворимую форму или полноразмерный BAFF, и экспрессию и очистку рекомбинантного растворимогоBAFF из клеток бактерий и 293-клеток млекопитающих выполняли, как описано (14, 15). ПЦР с обратной транскриптазой. Тотальную РНК, экстрагированную из Т-клеток, В-клеток, in vitro полученных незрелых дендритных клеток, 293-клеток дикого типа и клеток 293-BAFF (полноразмерный), обратно транскрибировали сBAFF и -актина регистрировали при помощи ПЦР-амплификации с ДНК-полимеразой Taq (стадии 1 мин каждая при 94 С, 55 С и 72 С в течение 30 циклов) с использованием специфических олигонуклеотидов: для BAFF, JT1322 5'-GGAGAAGGCAACTCCAGTCAGAAC-3' [SEQ ID NO: 13] и JT1323 5'CAATTCATCCCCAAAGACATGGAC-3' [SEQ ID NO: 14]; для альфа-цепи IL-2-рецептора, JT1368 5'TCGGAACACAACGAAACAAGTC-3' [SEQ ID NO: 15] и JT1369 5'-CTTCTCCTTCACCTGGAAACTGACTG-3' [SEQ ID NO: 16]; для -актина, 5'-GGCATCGTGATGGACTCCG-3' [SEQ ID NO: 17] и 5'-GCTGGAAGGTGGACAGCGA-3' [SEQ ID NO: 18]. Гель-фильтрация. 293 Т-клетки временно трансфицировали короткой формой растворимого BAFF и выращивали в бессывороточной среде Optimem в течение 7 дней. Кондиционированные супернатанты концентрировали в 20 раз, смешивали с внутренними стандартами каталазой и овальбумином и наносили на колонку Superdex-200 HR10/30. Белки элюировали в ЗФР при 0,5 мл/мин и фракции (0,25 мл) осаждали трихлоруксусной кислотой и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антитела анти-Flag М 2. Колонку калибровали стандартными белками: ферритином (440 кДа), каталазой (232 кДа), альдолазой (158 кДа), бычьим сывороточным альбумином (67 кДа), овальбумином (43 кДа), химотрипсиногеном А (25 кДа) и рибонуклеазой А (13,7 кДа). Обработка пептид-N-глюканазой F. Пробы нагревали в 20 мкл 0,5% ДСН, 1% 2-меркаптоэтаноле в течение 3 мин при 95 С, затем охлаждали и дополняли 10% нонидетом Р-40 (2 мкл), 0,5 М фосфатом натрия, рН 7,5 (2 мкл) и пептид-Nглюканазой F (125 единиц/мкл, 1 мкл, или без фермента в контролях). Пробы инкубировали в течение 3 ч при 37 С перед анализом с использованием Вестерн-блоттинга. Секвенирование по Эдману. 293-Т-клетки временно трансфицировали длинной формой растворимого BAFF и выращивали в бессывороточной среде Optimem в течение 7 дней. Кондиционированные супернатанты концентрировали в 20 раз, фракционировали электрофорезом в ДСН-ПААГ и блоттировали на поливинилидендифторидную мембрану (BioRad Labs, Hercules, CA), как описано ранее (16), и затем секвенировали с использованием секвенатора с газовой фазой (ABI 120A, Perkin Elmer, Foster City, CA), соединенного с анализатором (ABI 120A, Perkin Elmer), снабженным колонкой фенилтиогидантоина С 18 2,1250 мм. Данные анализировали с использованием программного обеспечения ABI 610 (Perkin Elmer). Антитела. Поликлональные антитела получали путем иммунизации кроликов (Eurogentec, Seraing, Belgium) рекомбинантным растворимым BAFF. Селезенку крыс, иммунизированных тем же самым антигеном,сливали с мышиными миеломными клетками х 63 Аg8.653 и гибридому подвергали скринингу на BAFFспецифические IgG. Одним из этих моноклональных антител, 43.9, является IgG2a, который специфически узнает hBAFF. Клетки окрашивали в 50 мкл FACS-буфера (ЗФР, 10% ФТС, 0,02% NaN3) 50 нг (или указанным количеством) Flag-меченного короткого растворимого hBAFF в течение 20 мин при 4 С, с последующей обработкой антителом анти-Flag М 2 (1 мкг) и вторичным антителом. Моноклональное анти-ВАFFантитело 43,9 использовали при 40 мкг/мл. Для двухцветного FACS-анализа лимфоциты периферической крови окрашивали FLAG-меченным растворимым BAFF/длинным (2 мкг/мл), затем биотинилированным анти-Flag М 2-антителом (1/400) и ФЭ-меченным стрептавидином (1/100), затем либо FITC-меченным анти-СD4, анти-CD8, либо анти-СD19. Анализ пролиферации лейкоцитов периферической крови (PBL). Лейкоциты периферической крови инкубировали в 96-луночных планшетах (105 клеток на лунку в 100 мкл RPMI, дополненной 10% ФТС) в течение 72 ч в присутствии или в отсутствие 2 мкг/мл козьего антитела против -цепи человека (Sigma) или контроля F(ab')2 и с указанной концентрацией нативного или прокипяченного растворимого BAFF/длинного. Клетки кратковременно метили (пульс-метка) в течение еще 6 ч [3H] тимидином (1 мкКи на лунку) и собирали. Включение [3 Н]тимидина регистрировали при помощи жидкостного сцинтилляционного счетчика. В некоторых экспериментах рекомбинантный растворимый BAFF заменяли 293-клетками, стабильно трансфицированными полноразмерным BAFF(или 293-клетками дикого типа в качестве контроля), которые фиксировали в течение 5 мин при 25 С в 1% параформальдегиде. Анализ проводили, как описано (17). В дополнительных экспериментах СD19+клетки выделяли из PBL с магнитными гранулами, а оставшиеся СD19 клетки облучали (3000 рад) перед воссоединением с CD19+-клетками. Затем проводили анализ пролиферации с растворимым BAFF, как описано выше. Анализ активации В-клеток. Очищенные В-клетки, как было описано (13), активировали в культуральной системе EL-4. Вкратце, 104 В-клеток, смешанных с 5104 облученных мышиных клеток тимомы EL-4 (клона В 5), культивировали в течение 5-6 дней в 200 мкл среды, содержащей 5% об./об. культуральных супернатантов Тклеток человека (106/мл), которые были активированы в течение 48 ч с использованием ФГА (1 мкг/мл) и- 11006108 ФМА (1 нг/мл). Затем В-клетки повторно выделяли с использованием анти-СD19-гранул и культивировали в течение дополнительных 7 дней (5104 клеток в 200 мкл, в двух или трех повторах культур в плоскодонных 96-луночных планшетах) только в среде или в среде, дополненной 5% супернатантами Тклеток, или с 50 нг/мл IL-2 (любезный подарок из бывшего Института молекулярной биологии Glaxo,Geneva) и 10 нг/мл каждого из IL-4 и IL-10 (Peprotech, London, UK), в присутствии или в отсутствиеsBAFF. Добавляли антитело анти-Flag М 2 при концентрации 2 мкг/мл, которое само по себе воздействия не оказывало. IgM, IgG и IgA в культуральных супернатантах определяли количественно, как описано(13), при помощи анализов ELISA.BAFF человека идентифицировали по гомологии последовательности в качестве возможного нового члена семейства TNF-лигандов при скрининге общественных баз данных с использованием поиска улучшенного профиля (18). кДНК, кодирующую полный белок из 285 аминокислот, получали объединением EST-клонов (охватывающих 3'-район) с фрагментом (5'-районом), амплифицированным при помощи ПЦР. Отсутствие сигнального пептида предполагало, что BAFF был мембранным белком типа II, что является типичным для членов семейства TNF-лигандов. Этот белок имел предсказанный цитоплазматический домен из 46 аминокислот, гидрофобный трансмембранный район и внеклеточный домен из 218 аминокислот, содержащий два потенциальных сайта N-гликозилирования (фиг. 1 А). Последовательность внеклеточного домена BAFF показывает самую высокую степень гомологии с APRIL (33% идентичности аминокислот, 48% гомология), тогда как идентичность с другими членами этого семейства, такими какTNF, FasL, LT, TRAIL или RANKL, ниже 20% (фиг. 1 В, С). Клон кДНК мышиного BAFF, выделенный из библиотеки селезенки, кодировал несколько более длинный белок (309 аминокислот) вследствие вставки между трансмембранным районом и первой из нескольких -цепей, которые составляют рецепторсвязывающий домен во всех членах TNF-лигандов (19). Этот богатый -цепями эктодомен является почти идентичным в мышином и человеческом BAFF (86% идентичность, 93% гомология), что предполагает, что ген BAFF был высококонсервативным во время эволюции (фиг. 1 А). Хотя члены TNF-семейства синтезируются как вставленные в мембрану лиганды, часто наблюдается расщепление в районе стебля (ножки) между трансмембранным и рецептор-связывающим доменом. Например, TNF или FasL легко отщепляются от поверхности клеток металлопротеиназами (20, 21). Хотя в 293 Т-клетках продуцируется несколько форм рекомбинантного BAFF, авторы отмечают, что рекомбинантная растворимая форма 32 кДа BAFF (аминокислоты 83-285, sBAFF/длинный), содержащая полный район стебля и N-концевую Flag-метку, кроме рецептор-связывающего домена, подвергались интенсивному процессингу до меньшего фрагмента в 18 кДа (фиг. 2 А, В). Расщепление имело место в районе стебля, поскольку этот фрагмент регистрировался только с помощью антител, индуцированных против полного домена BAFF, взаимодействующего с рецептором, но не с анти-Flag-антителами (данные не показаны). Также было выявлено, что только N124 (локализованный в стебле), но не N242 (локализованный в начале Fскладчатой структуры) был гликозилирован, так как молекулярная масса непроцессированного sBAFF/длинного уменьшалась с 32 до 30 кДа при удалении N-связанных углеводов пептидN-глюканазой F, в то время как расщепленная форма 18 кДа была нечувствительной к этой обработке. Анализ пептидной последовательности фрагмента в 18 кДа действительно показал, что расщепление происходит между R133 и А 134 (фиг. 1 А). R133 лежит в конце многоосновного района, который является консервативным между человеческим (R-N-K-R) и мышиным (R-N-R-R). Для тестирования того, не является ли расщепление лишь артефактом экспрессии растворимых, неприродных форм BAFF, мембраносвязанный полноразмерный BAFF экспрессировали в 293 Т-клетках (фиг. 2 С). Полный BAFF в 32 кДа и некоторые молекулярные частицы более высокой молекулярной массы (возможно, соответствующие недиссоциированным димерам и тримерам) легко определялись в клеточных экстрактах, но более 95%BAFF, извлеченного из супернатанта, соответствовали процессированной форме 18 кДа, что указывает на то, что BAFF процессировался также при синтезе в виде мембраносвязанного лиганда. Конструировали растворимый BAFF (Q136-L285, sBAFF/короткий), последовательность которого начиналась на 2 аминокислоты справа от сайта процессинга (фиг. 1 В). Как предсказано, Flag-метка, присоединенная к N-концу этой рекомбинантной молекулы, не удалялась (данные не показаны), что позволяет ее очистку при помощи анти-Flag-аффинной колонки. Для испытания его на правильность укладки очищенный sBAFF/короткий анализировали гель-фильтрацией, при которой этот белок элюировался при средней молекулярной массе 55 кДа (фиг. 2D). sBAFF/короткий правильно собирается в гомотример (320 кДа) в соответствии с четвертичной структурой других членов TNF-семейства (19). Наконец, непроцессированный sBAFF/длинный легко экспрессировался в бактериях, что указывает на то, что событие расщепления было специфическим для эукариотических клеток. Нозерн-блот-анализ BAFF выявил, что мРНК BAFF 2,5 т.п.н. была обильной в селезенке и PBL(фиг. 3 А). Вилочковая железа, сердце, плацента, тонкая кишка и легкое обнаружили слабую экспрессию. Это ограниченное распределение предполагало, что клетки, присутствующие в лимфоидных тканях, были основным источником BAFF. Посредством ПЦР-анализа авторы нашли, что мРНК BAFF присутствовала в Т-клетках и происходящих из моноцитов периферической крови дендритных клетках, но не в В- 12006108 клетках (фиг. 3 В). Даже не подвергнутые воздействию нестимулированные Т-клетки, по-видимому, экспрессируют некоторое количество мРНК BAFF. Меченный последовательностью сайт (STS, SHGC-36171) был обнаружен в базе данных: этот сайт включал в себя BAFF-последовательность человека. Сайт картирован на хромосоме 13 человека, в интервале 9 сМ между маркерами D13S286 и D13S1315. На цитогенетической карте этот интервал соответствует 13q32-34. Из известных членов семействаTNF-лигандов только RANKL (Trance) был локализован в этой хромосоме (22), хотя достаточно далеко от BAFF (13ql4). Для того чтобы этот лиганд проявил максимальные биологические эффекты, по-видимому, было необходимо, чтобы BAFF-рецептор (BAFF-R) экспрессировался либо на тех же самых клетках, либо на соседних клетках, присутствующих в лимфоидных тканях. С использованием рекомбинантного sBAFF в качестве инструмента для специфического определения экспрессии BAFF-R при помощи FACS авторы действительно обнаружили высокие уровни экспрессии рецептора в различных линиях В-клеток, таких как Raji и BJAB лимфомы Беркита (фиг. 4 А, табл. 1). В противоположность этому, все клеточные линии Т-клеток фибробластного, эпителиального и эндотелиального происхождения были отрицательными. Очень слабое окрашивание наблюдали с линией моноцитов ТНР-1, которая, однако, могла быть ответственной за связывание Fc-рецептора. Таким образом, экспрессия BAFF-R, по-видимому, ограничена Вклеточными линиями. Испытанные В-клеточные линии двух мышей были отрицательными при использовании BAFF человека в качестве зонда, хотя слабое связывание наблюдали на мышиных спленоцитах(данные не показаны). Присутствие BAFF-R на В-клетках было подтверждено анализом лимфоцитов пуповинной и периферической крови. В то время как CD8+ и CD4+ Т-клетки не содержали BAFF-R (фиг. 4 В и неприведенные данные), обильное окрашивание наблюдали на CD19+ В-клетках (фиг. 4 А и 4 В), что указывало на то, что BAFF-R экспрессируется на всех В-клетках крови, в том числе не подвергнутых воздействию и обладающих памятью на антиген. Поскольку BAFF связан с происходящими из крови В-клетками, проводили эксперименты для определения того, могли бы этот лиганд доставлять стимулирующие или ингибирующие рост сигналы. Лимфоциты периферической крови (PBL) стимулировали антителами анти-IgMвместе с фиксированными 293-клетками, стабильно экспрессирующими поверхностный BAFF (фиг. 5 А). Уровни включения [3 Н]тимидина, индуцированные только анти-, не изменялись в присутствии контрольных клеток, но увеличивались в два раза в присутствии BAFF-трансфицированных клеток (фиг. 5 В). Зависимую от дозы пролиферацию PBL получали также при замене BAFF-трансфицированных клеток очищенным sBAFF(фиг. 5 С), что указывало на то, что BAFF не требует прикрепления к мембране для проявления его активности. В этой структуре эксперимента пролиферация индуцировалась требуемыми концентрациямиSCD40L, превышающими 1 мкг/мл, но была менее зависимой от присутствия анти-, чем пролиферация,опосредованная BAFF (фиг. 5D). При сокультивировании очищенных CD19+ В-клеток с облученными аутологичными CD19- PBL костимуляция пролиферации под действием BAFF не изменялась, что свидетельствовало о том, что поглощение [3H]тимидина было в основном обусловлено пролиферацией Вклеток, а не опосредованной стимуляцией другого типа клеток (данные не показаны). Наблюдаемая пролиферация В-клеток в ответ на BAFF была полностью зависимой от присутствия антиантител, что указывало на то, что BAFF функционировал в качестве костимулятора пролиферации В-клеток. Для исследования возможного действия BAFF на секрецию иммуноглобулинов очищенные Вклетки периферической или пуповинной крови предварительно активировали сокультивированием с Тклетками EL-4 в присутствии смеси цитокинов из супернатантов ФГА/ФМА-стимулированных Т-клеток(23). Эти В-клетки повторно выделяли со степенью чистоты 98%, и они давали двукратное увеличение секреции Ig во время вторичного культивирования в присутствии BAFF и цитокином активированных Тклеток, в сравнении с уровнем секреции в присутствии одних только цитокинов. Очень умеренное действие имело место в отсутствие экзогенных цитокинов, и промежуточное действие (в 1,5 раза) наблюдали в присутствии рекомбинантных цитокинов IL-2, IL-4 и IL-10 (фиг. 5 Е, 5F). Биохимический анализ BAFF также согласуется с типичной гомотримерной структурой членовTNF-семейства. Среди этого семейства лигандов BAFF проявляет самый высокий уровень сходства последовательности с APRIL, который авторы недавно охарактеризовали как лиганд, стимулирующий рост различных опухолевых клеток (11). В отличие от TNF и LT, которые являются двумя членами семейства с одинаково высокой степенью гомологии (33% идентичность) и гены которых связаны с хромосомой 6, APRIL и BAFF не кластеризованы на одной и той же хромосоме. APRIL локализован на хромосоме 17(J.L.B., неопубликованные данные), тогда как BAFF картирован на дистальном плече хромосомы 13 человека (13q34). Отклонения в этом локусе характеризуются в случае лимфомы Беркитта в качестве второго наиболее частого дефекта (24), кроме транслокации myc гена в локус Ig (25). С учетом высоких уровней экспрессии BAFF-R на всех анализируемых клеточных линиях лимфомы Беркитта (см. табл. 1) поднимается вопрос об интригующей возможности того, что некоторые лимфомы Беркитта могут иметь нарушенную регуляцию экспрессии BAFF, стимулируя таким образом рост аутокринным образом.- 13006108 Роль антиген-специфических В-лимфоцитов во время различных стадий иммунной реакции сильно зависит от сигналов и контактов из Т-хелперных клеток и антигенпредставляющих клеток, таких как дендритные клетки (20). В-лимфоциты сначала получают эти сигналы на ранних стадиях иммунной реакции, когда они взаимодействуют с Т-клетками в краевой зоне В-клеточных фолликулов в лимфоидной ткани, что приводит к их пролиферации и дифференцировке в клетки, продуцирующие антитела с низкой аффинностью (18). В то же самое время некоторые антиген-специфические В-клетки мигрируют также к В-клеточному фолликулу и способствуют образованию зародышевых центров, другого сайта пролиферации В-клеток, но также аффинному созреванию и генерированию памяти В-клеток и высокоаффинных плазматических клеток (19). Было показано, что сигналы, запускаемые другим членом суперсемейства TNF CD40L, являются решающими для функции В-лимфоцитов на многих стадиях зависимой от Т-клеток иммунной реакции. Однако ряд исследований ясно показал, что взаимодействие CD40L/CD40 не является ответственным за всю контактзависимую помощь Т-клеток в отношении В-клеток. Действительно, было показано, что СD40L-недостаточные Т-клетки, выделенные у мышей "нокаут" или у пациентов с Х-связанным гиперIgM-синдромом, успешно индуцируют пролиферацию В-клеток и их дифференцировку в плазматические клетки. Исследования с использованием блокирующих антител против CD40L показали, что субпопуляция положительных в отношении поверхностного IgD В-клеток, выделенная из миндалин человека, пролиферирует и дифференцируется в ответ на активированные Т-клетки СD40-независимым образом. Было показано, что другие члены TNF-семейства, такие как мембраносвязанные TNF и CD30L, участвуют в независимой от CD40 и поверхностного Ig стимуляции В-клеток. Подобно результатам авторов данного изобретения, полученным с BAFF, было показано, что СD40-дефицитные В-клетки могут быть стимулированы к пролиферации и дифференцировке в плазматические клетки хелперными Т-клетками до тех пор, пока рецепторы поверхностных Ig запускаются в одно и то же время. BAFF, также как CD30L иCD40L, экспрессируется Т-клетками, но его оригинальность состоит в его экспрессии дендритными клетками, а также в высокоспецифической локализации его рецептора на В-клетках, в противоположность CD40, CD30 и TNF-рецептору, экспрессия которого была описана на многих различных клетках. Это наблюдение предполагает независимые и специфические BAFF-индуцируемые функции на Вклетках. В поддержку роли BAFF в индуцированном Т-клетками и дендритными клетками росте и потенциальном созревании В-клеток авторы обнаружили, что BAFF костимулирует пролиферацию полученных из крови В-клеток одновременно со сшиванием В-клеточных рецепторов и, следовательно, независимо от передачи сигнала CD40. Кроме того, с использованием CD19-пoлoжитeльныx В-клеток, дифференцированных in vitro в подобные предшественникам плазматических клеток/GC В-клетки (14), авторы наблюдали костимулирующее действие BAFF на секрецию Ig этими В-клетками в присутствии супернатанта от активированных Т-клеток или смеси IL-2, IL-4 и IL-10. Интересно, что костимулирующее действие было более сильным в присутствии супернатанта активированных Т-клеток в сравнении со смесью цитокинов, что предполагает, что дополнительные растворимые факторы, секретируемые Т-клетками,участвуют в продуцировании антител, которые могут действовать синергично с BAFF или же могут дополнять действие BAFF. Таким образом, возможно, что BAFF активно способствует дифференцировкеGC-подобных В-клеток в плазме. Ясно, что BAFF может передавать сигнал как в не подвергнутых воздействию В-клетках, так и вGC-коммитированных В-клетках in vitro. Будет ли это наблюдение соблюдаться во время нормального иммунного ответа или не будет, должно быть проверено надлежащими экспериментами in vivo. Биологические ответные реакции, индуцируемые BAFF в В-клетках, отличаются от реакцийCD40L, так как пролиферация, запускаемая CD40L, была менее зависимой от костимула анти- (17) (и фиг. 5D). Кроме того, CD40L может противостоять апоптотическим сигналам в В-клетках после того, как займет рецептор В-клеток (29), тогда как BAFF не способен спасти В-клеточную линию Ramos от анти-опосредованного апоптоза, несмотря на тот факт, что клетки Ramos действительно экспрессируютBAFF-R (табл. 1; и J.L.B., неопубликованные наблюдения). Таким образом, вероятно, что CD40L и BAFF выполняют различные функции. В этом отношении заслуживает внимания то, что BAFF не взаимодействовал ни с одним из испытанных 16 рекомбинантных рецепторов TNF-семейства, в том числе CD40 (P.S. и J.T., неопубликованные наблюдения). Рост В-клеток эффективно костимулировался рекомбинантным BAFF, лишенным трансмембранного домена. Эта активность отличается от таковой нескольких членов TNF-семейства, которые являются активными только в виде мембраносвязанного лиганда, таких как TRAIL, FasL и CD40L. Растворимые формы этих лигандов обладали слабой биологической активностью, которую можно было усилить их перекрестным сшиванием, имитированием посредством этого мембраносвязанного лиганда (15). В противоположность этому, перекрестное сшивание Flag-меченного sBAFF с анти-Flag-антителами или использование мембраносвязанного BAFF, экспрессируемого на поверхности эпителиальных клеток, дополнительно не усиливало митогенную активность BAFF, что предполагает, что он может действовать системно в виде секретируемого цитокина, подобно TNF.BAFF, выступала в качестве субстрата для протеазы. Подобные полиосновные последовательности присутствуют также в соответствующих положениях как в APRIL, так и TWEAK, и для каждого из них имеется доказательство протеолитического процессинга (30) (N.H. и J.T., неопубликованное наблюдение). Хотя протеазу, ответственную за расщепление, еще следует определить, она вряд ли является металлопротеиназой, ответственной за высвобождение мембраносвязанного TNF, так как их расщепляемые последовательности полностью отличаются друг от друга (21). Полиосновные мотивы в BAFF (R-N-K-R),APRIL (R-K-R-R) и Tweak (R-P-R-R) напоминают минимальный сигнал расщепления для фурина (R-XK/R-R), прототипа семейства пропротеинконвертазы (31). При реализации данного изобретения будут использованы, если нет иных указаний, общепринятые способы клеточной биологии, культивирования клеток, молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК, белковой химии и иммунологии, которые находятся в пределах квалификации специалистов в данной области. Такие способы описаны в литературе. См., например. Molecular Cloning: AMolecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds). Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds.), 1987,Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker,eds.). Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and С.С. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. Следующие примеры приведены для иллюстрации данного изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его. Примеры В примерах 1-6 использованы следующие экспериментальные процедуры. ДНК-конструкция для получения содержащих мышиный BAFF трансгенных мышей (BAFF-Tgмышей). кДНК-последовательности как мышей, так и человека были описаны ранее (Schneider et al., 1999). ПЦР-фрагмент, кодирующий полноразмерный мышиный BAFF, генерировали посредством ОТ-ПЦР. Первую цепь кДНК синтезировали из полиА+ (Clontech, Palo Alto, CA) с использованием олиго dT в соответствии с протоколом изготовителя (GibcoBRL, Grand Island, NY). ПЦР-реакция содержала 1Pfuбуфер (Stratagene, La Jola, CA), 0,2 мМ dNTP, 10% ДМСО, 12,5 пМ праймеры, 5 единиц Pfu-ферментаTCCAGCAA-3' [SEQ ID NO: 20]. Матрицу амплифицировали в течение 30 циклов при 94 С в течение 1 мин, 54 С в течение 2 мин и 72 С в течение 3 мин, с последующим 10-минутным удлинением при 72 С. Эта последовательность соответствует нуклеотидам 214-1171 реестра банка генов AF119383. ПЦРфрагмент расщепляли Notl и затем клонировали в модифицированный вектор рСЕР 4 (Invitrogen,Carlsbad, CA). Фрагмент, содержащий мышиный BAFF, удаляли Xbal для включения последовательности сайта присоединения полиА SV40. Этот фрагмент клонировали в вектор на основе pUC, где была добавлена промоторная последовательность. Промотор, затупленный Вgl2-Notl-фрагмент в 1 т.п.н., содержащий энхансер АроЕ человека и ААТ-промотор (промотор альфа-антитрипсина) очищали из плазмидного клона 540 В (подарок доктора Katherine Parker Ponder, Washington University, St. Louis, МО). ЕсоRV/Вgl2-фрагмент очищали из конечного вектора и использовали для получения трансгенных мышей. Инъецированного потомка мышей Fl (BDF1) (самка C57BL/6J х самец DBA/2J) обратно скрещивали с мышами C57BL/6. Способы микроинъекции и получения трансгенных мышей были описаны ранее(Mcknights et al., 1983). Аналитические методы. Пробы сыворотки подвергали восстанавливающему электрофорезу в ДСН-ПААГ с использованием линейного 12,5% геля. Тотальную РНК из печени мышей получали и обрабатывали для Нозерн-блотанализа с использованием набора для выделения из Promega (Madison, WI) в соответствии с указаниями изготовителя. BAFF-трансгенспецифическую мРНК регистрировали с помощью зонда, охватывающего полиА-хвост SV40 трансгенной конструкции, и получали путем расщепления модифицированного вектора рСЕР 4 Xba1 и BamH1. Этот зонд узнает полосу 1,8-2 кДа, соответствующую мРНК из BAFFтрансгена. ПЦР-анализ хвостовой части ДНК из BAFF-Tg-мышей проводили с использованием 12,5 пМ следующих праймеров: 5'-GCAGTTTCACAGCGATGTCCT-3' [SEQ ID NO: 21] и 5'-GTCTCCGTTGCGTGAAATCTG-3'[SEQ ID NO: 22] - в реакции, содержащей 1 буфер для полимеразы Taq (Stratagene), 0,2 нМ dNTP, 10% ДМСО и 5 единиц полимеразы Taq (Stratagene). 719 п.н. трансгена амплифицировали в течение 35 цик- 15006108 лов при 94 С в течение 30 с, 54 С в течение 1 мин и 72 С в течение 1,5 мин, с последующим 10 минутным удлинением при 72 С. Присутствие белков в моче мыши измеряли с использованием полосок с реагентами (стрипов)Multistix 10SG для анализа мочи (Bayer Corporation, Diagnostics Division, Elkhart, IN). Анализ клеточных популяций (Cell-dyn) в крови и цитофлуориметрический анализ (FACS) (анализ с использованием клеточного сортера с возбуждением флуоресценции). Дифференциальный подсчет числа клеток свежей цельной крови, обработанной ЭДТА против коагуляции цельной крови определяли с использованием прибора Abbot Cell Dyne 3500 (Chicago, IL). ДляFACS-анализа использовали флуоресцеин (FITC)-, Cy-chrome- и фикоэритрин (ФЭ)-меченные крысиные антимышиные антитела; анти-В 220, анти-СD4, aнти-CD8, aнти-CD43, анти-IgM, aнти-CD5, анти-CD25,aнти-CD24, aнти-CD38, анти-CD21, aнти-CD44, анти-L-селектин и набор анти-Вс 1-2 хомячка/контрольный Ig хомячка фирмы Pharmingen (San Diego, CA). Получение рекомбинантной Е. coli, а также происходящих из клеток млекопитающих человеческого и мышиного Flag-меченного BAFF описано ранее (Schneider et al., 1999). Все антитела использовали в соответствии с описаниями изготовителя.PBL очищали из крови мыши следующим образом: кровь мыши собирали в микропробирки, содержащие ЭДТА, и разводили 1/2 ЗФР. Пятьсот мкл разведенной крови наносили на поверхность 1 мл фиколла(Celardane, Hornby, Ontario, Canada) в стеклянной пробирке на 4 мл, градиент центрифугировали при 2000 об./мин в течение 30 мин при комнатной температуре, и поверхность раздела, содержащую лимфоциты, собирали и промывали дважды в ЗФР перед FACS-окрашиванием. Селезенку, костный мозг и мезентериальные лимфатические узлы растирали в суспензию отдельных клеток в среде RPMI (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) и промывали в FACS-буфере (ЗФР, дополненном 2% фетальной телячьей сывороткой (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Клетки сначала суспендировали в FACS-буфере, дополненном следующими блокирующими реагентами: 10 мкг/мл Ig человека (Sandoz, Basel, Switzerland) и 10 мкг/мл антимышиного блокирующего Fc-антитела (Pharmingen) и инкубировали 30 мин на льду перед окрашиванием меченными флуорохромом антителами. Все антитела разводили в FACS-буфере с указанным выше блокирующим реагентом. Пробы анализировали с использованием цитофлуориметра FACScan(Becton Dickinson). Регистрация общего мышиного Ig и ревматоидных факторов в сыворотках мышей с использованием ELISA-анализов.ELISA-планшеты (Corning glass works, Corning, NY) покрывали в течение ночи при 4 С раствором 10 мкг/мл козьих антител против общего мышиного Ig (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) в 50 мМ натрий-бикарбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали 3 раза ЗФР/0,1% Твин и блокировали в течение ночи 1% желатином в ЗФР. Сто мкл на лунку серийных разведений сыворотки или стандартных разведений добавляли к планшетам и выдерживали в течение 30 мин при 37 С. Мышиные Ig детектировали с использованием 100 мкл на лунку раствора 1 мкг/мл меченных щелочной фосфатазой (АР) козьих антител против общего мышиного Ig (Southern Biotechnology Associates) в течение 30 мин при 37 С. После последней промывки 3 раза ЗФР/0,1% Твин ферментативную реакцию проявляли с использованием раствора 10 мкг/мл паранитрофенилфосфата (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) в 10% диэтаноламине. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 3 н. NaOH на лунку. Оптическую плотность (O.D.) измеряли при 405 нм с использованием спектрофотометра из Molecular Devices(Sunnyvale, CA). Стандартные кривые получали с использованием очищенного мышиного Ig, полученного из Southern Biotechnology Associates. В случае регистрации ревматоидных факторов (RF) планшеты покрывали нормальным козьим Ig (Jackson ImmunoResearch laboratories, Inc., West Grove, PA) вместо козьих антител против мышиного Ig, и регистрацию мышиного Ig выполняли, как описано выше. Регистрацию мышиных изотипов в RF-анализе выполняли с использованием меченных щелочной фосфатазой(АР) козьих антител против мышиных IgA, IgM, IgG2a, IgG2b и IgG3, а также очищенных мышиных IgA,IgM, IgG2a, IgG2b и IgG3 для стандартных кривых (Southern Biotechnology Associates, Inc.). Все статистические сравнения выполняли с использованием дисперсионного анализа. Регистрация циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и преципитация криоглобулинов в сыворотках мышей. Этот анализ проводили, как описано ранее (June et al., 1979; Singh and Tingle, 1982), со следующими модификациями: ELISA-планшеты (Corning glass works) покрывали в течение ночи при 4 С 5 мкг/мл Clq человека (Quidel, San Diego, CA) в 50 мМ натрийбикарбонатном буфере рН 9,6. Планшеты промывали 3 раза ЗФР/0,1% Твин. Пятьдесят мкл на лунку 0,3 М ЭДТА добавляли к этим планшетам плюс 50 мкл на лунку серийных разведений сыворотки или растворов известных концентраций стандартного иммунного комплекса (пероксидаза-мышиное антитело против пероксидазы (РАР) из DAKO (Carpinteria, CA. Планшеты инкубировали 30 мин при 37 С. Планшеты промывали 3 раза смесью ЗФР/0,1% Твин. Мышиный Ig в иммунных комплексах детектировали с использованием 100 мкл на лунку раствора 1 мкг/мл меченного щелочной фосфатазой (АР) козьего антитела против мышиного Ig (Southern BiotechnologyAssociates, Inc.), как описано выше для анализов ELISA. Криоглобулины детектировали инкубированием в течение ночи при 4 С мышиной сыворотки, разведенной водой 1/15, и преципитаты оценивали визуально.- 16006108 Анализ антител против двухцепочечной (ds) и одноцепочечной (ss) ДНК. Анализ анти-ssДНК проводили с использованием планшетов NUNC-immuno Plate MaxiSorp (NUNCA/S, Denmark). Планшеты покрывали в течение ночи при 4 С сначала 100 мкг/мл метилированного БСАLouis, МО). ДНК тимуса теленка подвергали сдвиговым силам посредством обработки ультразвуком и затем расщепляли нуклеазой S1 перед использованием. Для анализа анти-ssДНК эту ДНК кипятили в течение 10 мин и охлаждали на льду перед использованием. После блокирования серийные разведения проб сывороток добавляли и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Аутоантитела детектировали козьими меченными щелочной фосфатазой (АР) антителами против мышиного IgG (Sigma) и проявляли, как описано выше для анализов ELISA. Стандартные кривые получали с использованием известных количеств моноклонального антитела 205 против ДНК, которое является специфичным как для ssДНК, так и для dsДНК (Datta et al., 1987). Иммуногистохимия. Селезенку и лимфатические узлы замораживали в среде для заливки препаратов О.С.Т. (Miles,Elkhart, IN) и монтировали для приготовления срезов в криостате. Срезы толщиной 7-10 мкм сушили и фиксировали в ацетоне. Все инкубации антител (10 мкг/мл) выполняли в течение 1 ч при комнатной температуре в увлажненном боксе после разведения в забуференном Трис солевом растворе A (TBS-A, 0,05 М Трис, 0,15 М NaCl, 0,05% Твин-20 (об./об.), 0,25% БСА), промывали в TBS-B (0,05 М Трис, 0,15 МNaCl, 0,05% Твин-20) и фиксировали 1 мин в метаноле перед инициацией ферментативной реакции. Активности пероксидазы хрена (HRP) и щелочной фосфатазы (АР) проявляли с использованием набора с субстратом в виде таблетки диаминобензидина (DAB) (Sigma) и смеси 5-бром-4-хлор-3 индолилфосфата/нитрокрасителя тетразолиевого синего (BCIP/NBT, Pierce, Rockford, IL) соответственно. Окрашенные срезы тканей в конце концов фиксировали 5 мин в метаноле и контрастно окрашивали с использованием Giemsa (Fluka, Buchs, Switzerland). Меченные биотином антитела крысиный анти-В 220,анти-CD11c, антисиндекан-1, а также немеченые крысиный анти-СD4, анти-СD8 и анти-CD8 приобретали у Pharmingen. Меченный биотином агглютинин земляного ореха (PNA) получали в Vector Laboratories (Burlingame, CA). Меченное пероксидазой хрена мышиное антитело против крысиного Ig и меченный пероксидазой хрена стрептавидин приобретали в Jackson ImmunoResearch laboratories. Inc., а АРмеченный стрептавидин - в Southern Biotechnology Associates, Inc. В случае иммуногистохимии на ткани почки для обнаружения отложений Ig использовали парафиновые срезы, удаляли из них парафин и блокировали их с использованием разведенной лошадиной сыворотки из Vector (Burlingame, CA) с последующим окрашиванием HRP-козьими антителами против мышиного Ig из Jackson ImmunoResearch. Детектирование выполняли, как описано выше. Пример 1. BAFF-трансгенные (BAFF-Tg) мыши-основатели имеют отклоняющийся от нормы фенотип. Полноразмерный мышиный BAFF экспрессировали в трансгенных мышах с использованием специфичного для печени промотора альфа-1-антитрипсина с энхансером АРО Е. Выбирали полноразмерную версию ожидания, что BAFF мог быть либо расщепленным и действовать системно, либо, что если бы он сохранялся в мембраносвязанной форме, наблюдались бы локальные специфичные для печени отклонения, возможно, обеспечивающие ключ к разгадке функции. Авторы получили 13 мышейоснователей, положительных в отношении BAFF-трансгена (табл. 2). Четверо из этих мышей умерли в молодом возрасте. Обычную патологию выполняли на мышах 811 и 816 (табл. 2). Не было явной инфекции у этих мышей, однако, сердечно-сосудистые и почечные отклонения были заметными, и они были сходны с отклонениями, описанными в случаях тяжелой гипертонии (Fu, 1995) (табл. 2). Окрашенные гематоксилином и эозином (НЕ) срезы тканей почек основателя 816 показали, что морфология почечных клубочков у этой мыши была патологической, в то время как остальная ткань почки казалась нормальной (данные не показаны). Многие BAFF-трансгенные мыши-основатели имели протеинурию (табл. 2). Иммуногистохимия на замороженных срезах тканей селезенки мыши 816 выявила аномальное и сильное окрашивание В-клеток и уменьшенное окрашивание Т-клеток, и это наблюдение подтверждалось у потомства (см. ниже, фиг. 12). С использованием двухцветного FACS-анализа рассчитывали отношение % В 220-положительных В-клеток на % CD4-положительных Т-клеток. Это отношение было в 2-7 раз более высоким у BAFF-Tgмышей-основателей в сравнении с контрольными отрицательными BDF1-мышами (табл. 2), что предполагает увеличение популяции В-клеток у BAFF-Tg-мышей. Авторы выбрали девять из этих мышейоснователей для генерирования различных линий трансгенных мышей, подчеркнутых в табл. 2. Ни одна из остальных BAFF-Tg-мышей-основателей или полученное из них потомство не обнаружили никаких признаков ухудшения состояния здоровья в течение месяцев после ранней смерти основателей 696, 700,811 и 816, что предполагает, что эти 4 мыши, возможно, экспрессировали более высокие уровни BAFF,которые вызвали их смерть. Сверхэкспрессия BAFF в печени трансгенных мышей была подтверждена Нозерн-блот-анализом (данные не показаны). У всех BAFF-Tg-мышей, испытанных гистологически, в печени не обнаружили отклонений от нормы: это указывает на то, что локальная сверхэкспрессия BAFF не индуцировала никаких иммунологических или патологических явлений. ELISA-анализ на мышиныйBAFF не проводился, однако, авторы показали, что 2% сыворотка из BAFF-Tg-мышей, но не из контрольных мышей, блокировала связывание полученного из клеток млекопитающего мышиного растворимого Flag-меченного BAFF с клетками BJAB. Кроме того, 5% сыворотка BAFF-Tg-мышей, но не контрольных мышей, увеличивала пролиферацию В-клеток человека из PBL в присутствии анти- (данные не показаны). Эти данные предполагают, что существенные количества растворимого BAFF присутствуют в крови BAFF-Tg-мышей. Пример 2. Периферический лимфоцитоз у BAFF-Tg-мышей происходит за счет повышенного количества В-клеток. Было обнаружено, что популяция трансгенных мышей имеет больше лимфоцитов в крови в сравнении с контрольными отрицательными однопометными животными: их количество достигает таких высоких величин как 13000 лимфоцитов/мкл крови (фиг. 7 А). В противоположность этому, число гранулоцитов на мкл крови как у BAFF-Tg-мышей, так и у контрольных мышей оставалось в нормальных пределах(фиг. 7 А). Поскольку FACS-анализ с использованием антител анти-СD4 и анти-В 220 клеток периферической крови (PBL) 18 BAFF-Tg-мышей, потомков шести различных мышей-основателей, показал увеличенные отношения В/Т (фигуры 7 В и 7 С), повышенные уровни лимфоцитов были результатом увеличенной субпопуляции В-клеток. Подобным образом с использованием этого способа расчет абсолютного количества циркулирующих в кровотоке CD4 Т-клеток выявил 50% уменьшение этой популяции Тклеток у BAFF-Tg-мышей в сравнении с контрольными мышами, и то же самое наблюдение было сделано в отношении субпопуляции CD8 Т-клеток (данные не показаны). Все В-клетки из PBL BAFF-Tgмышей имели увеличенную экспрессию МНС класса II и Всl-2 в сравнении с В-клетками из контрольных мышей (фиг. 7D и 7 Е соответственно), что указывало на некоторый уровень активации В-клеток в PBLBAFF-Tg-мышей. Т-клетки в крови BAFF-Tg-мышей не экспрессировали маркеры ранней активацииCD69 или CD25, однако, 40-56% CD4 или CD8 Т-клеток были активированными эффекторными Тклетками с фенотипом CD44hi, L-селектинlo против только 8-12% у контрольных однопометных мышей(фиг. 7F). Таким образом, BAFF-Tg-мыши явно обнаруживают признаки В-клеточного лимфоцитоза и глобальную активацию В-клеток наряду с изменениями Т-клеток. Пример 3. Увеличенные компартменты В-клеток состоят из зрелых клеток. Для того чтобы выяснить, действовала ли сверхэкспрессия BAFF у трансгенных мышей на Вклеточный компартмент центрально в костном мозге и периферически во вторичных лимфоидных органах, авторы с использованием FACS исследовали в общей сложности селезенку, костный мозг и мезентериальные лимфатические узлы семи BAFF-Tg-мышей и семи контрольных однопометных мышей, полученных от четырех различных мышей-основателей. Компартмент зрелых В-клеток анализировали окрашиванием как антителами анти-В 220, так и антителами анти-IgM. Две репрезентативные BAFF-Tgмыши и одна репрезентативная контрольная однопометная мышь показаны на фиг. 8. Компартмент зрелых В-клеток (IgM+, B220+) был увеличен как в селезенке, так и в мезентериальных лимфатических узлах (фиг. 8 А, верхняя и нижняя панели соответственно). Анализ компартментов В 220+/IgМ+ В-клеток(фиг. 7 А, средняя панель) или про-В-клеток (CD43+/B220+) и пре-В-клеток (CD43-/B220+) в костном мозге (фиг. 8 В) показал, что BAFF-Tg-мыши и контрольные однопометные мыши были сходными. Эти данные показывают, что сверхэкспрессия BAFF действует на пролиферацию зрелых В-клеток на периферии, но не на предшественники В-клеток в костном мозге. Анализ при помощи FACS субпопуляций Вклеток в селезенке выявил увеличенную долю маргинальной зоны (MZ) В-клеток у BAFF-Tg-мышей в сравнении с контрольными мышами (табл. 3). Популяция фолликулярных В-клеток оставалась пропорциональной как у BAFF-Tg-мышей, так и у контрольных мышей, тогда как фракция вновь образованных В-клеток слегка уменьшалась у BAFF-Tg-мышей (табл. 3). Этот результат был подтвержден также наB220+ В-клетках селезенки с использованием анти-СD38-антител вместо анти-СD24-антител и анти-IgM вместо анти-IgD-антител и анализа на CD38hi/CD24+ и IgMhi/IgDlo для популяции В-клеток MZ, соответственно, как описано ранее (Oliver et al., 1997) (данные не показаны). Иммуногистохимический анализ с использованием антитела против мышиного IgM обнаружил расширение IgM-яркой зоны В-клеток MZ в селезенке BAFF-Tg-мышей в сравнении с контрольными мышами (данные не показаны). Все В 220+ Вклетки селезенки BAFF-Tg-мышей экспрессировали также более высокие уровни МНС класса II (табл. 3) и Всl-2 (данные не показаны) в сравнении с В-клетками селезенки из контрольных мышей, что указывает на то, что В-клетки селезенки, как и В-клетки из PBL, находятся в активированном состоянии. Пример 4. BAFF-Tg-мыши имеют более высокий общий уровень иммуноглобулинов, ревматоидных факторов и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке. Увеличенный компартмент В-клеток у BAFF-Tg-мышей предполагал, что уровень общего Ig в крови этих животных может быть также увеличенным. Электрофорез в ДСН-ПААГ сыворотки BAFF-Tgмышей и контрольных однопометных мышей показал, что полосы тяжелой и легкой цепей IgG были по меньшей мере в 10 раз более сильными у 3 из 4 BAFF-Tg-мышей в сравнении с контрольными сыворотками (фиг. 9 А). Подобным образом, ELISA-определение на сыворотках BAFF-Tg-мышей показало значимо более высокий уровень общего Ig в сравнении с его уровнем у контрольных мышей (фиг. 9 В). Несмотря на высокие уровни, наблюдаемые при электрофорезе в ДСН-ПААГ, чрезмерно высокие уровни Ig, наблюдаемые при анализе ELISA у некоторых мышей, например 697-5, 816-8-3 и 823-20, за- 18006108 ставили авторов заподозрить присутствие ревматоидных факторов (RF) в этих сыворотках или аутоантител, направленных против антигенных детерминант на Fc-фрагменте IgG (Jefferis, 1995). Эти антитела могли бы связываться с козьими антителами против мышиного Ig, используемого для покрытия ELISAпланшетов, и давать ложные высокие величины. ELISA-планшеты покрывали нормальным (не относящимся к делу) козьим Ig и измеряли связывание BAFF-Tg-Ig с нормальным козьим Ig. На фиг. 9 С показано, что сыворотки большинства из BAFF-Tg-мышей содержали Ig, реагирующий с нормальным козьимIg, тогда как только две из 19 контрольных мышей обнаружили реактивность в том же самом анализе. Эти RF были в основном изотипами IgM, IgA и IgG2a (данные не показаны). Присутствие RF может быть связано с присутствием высоких уровней циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и криоглобулина в крови (Jefferis, 1995). Для выяснения того, имеют ли BAFF-Tgмыши аномальные уровни ЦИК в сыворотке, использовали анализ связывания на основе Clq для детектирования ЦИК у 21 BAFF-Tg-мыши, анализируемых выше. Только 5 BAFF-Tg-мышей обнаружили значимо более высокие уровни ЦИК в сравнении с контрольными мышами, тем не менее эти мыши соответствовали животным, имеющим наиболее высокие уровни тотального Ig и ревматоидных факторов (фиг. 9D). Авторы также наблюдали образование преципитата при разведении сывороток BAFF-Tg-мышей водой 1/15 (в отличие от контрольных сывороток), что указывает на присутствие криоглобулина у этих мышей (данные не показаны). Таким образом, кроме гиперплазии В-клеток BAFF-Tg-мыши проявляют тяжелую гиперглобулинемию, связанную с RF и ЦИК. Пример 5. Некоторые BAFF-Тg-мыши имеют высокие уровни аутоантител против одноцепочечной(ss) и двухцепочечной (ds) ДНК. Первоначально авторы наблюдали патологии почек, напоминающие подобное волчанке заболевание, у двух из мышей-основателей (табл. II). Присутствие аутоантител против ДНК было также ранее описано у пациентов с красной волчанкой (SLE) или у имеющих подобное волчанке заболевание мышей(SWR x NZB) F1 (SNF1) (Datta et al., 1987). Уровни аутоантител анти-ssДНК детектировали у BAFF-Tgмышей, которые показали ранее наивысший уровень общего сывороточного Ig (фиг. 10 А). Авторы анализировали сыворотку двух BAFF-Tg-мышей, отрицательных при анализе на антитела против одноцепочечной ДНК (697-5 и 816-1-1), и трех трансгенных мышей, секретирующих антитела против одноцепочечной ДНК (820-14, 816-8-3 и 820-7), на присутствие антител против двухцепочечной ДНК параллельно с пятью контрольными однопометными мышами. BAFF-Tg-мыши также секретировали анти-dsДНК,однако уровни секреции не всегда коррелировали с уровнем анти-ssДНК-антител, так как сывороткаBAFF-Tg-мыши 697-5, которая не содержала детектируемых уровней анти-ssДНК-антител, была явно положительной в отношении присутствия анти-dsДНК (фиг. 10 В). Таким образом, BAFF-Tg-мыши, обнаруживающие наиболее тяжелую гиперглобулинемию, секретируют патологические уровни аутоантител против ДНК. Кроме того и также подобно проблеме с заболеванием, подобным волчанке, авторы детектировали отложения иммуноглобулина в почках у шести анализированных BAFF-Tg-мышей (фиг. 10 С), три из этих мышей не секретировали детектируемые уровни антител против ДНК (данные не показаны). Пример 6. BAFF-Tg-мыши имеют увеличенные фолликулы В-клеток, многочисленные зародышевые центры, уменьшенное число дендритных клеток и увеличенное количество плазматических клеток как в селезенке, так и в мезентериальных лимфатических узлах (MLN).BAFF-Tg-мыши имели большие селезенки, MLN (данные не показаны) и пейеровы бляшки (фиг. 11). Иммуногистохимия показала присутствие увеличенных фолликулов В-клеток и уменьшенные периферические артериолярные лимфоидные пласты (зону PALS или Т-клеток) у BAFF-Tg-мышей (фиг. 12 В). Интересно, что небольшое число зародышевых центров наблюдали у неиммунизированных контрольных однопометных мышей (и это является типичным для этой колонии в целом), и они были представлены небольшими центрами (фиг. 12 С), тогда как BAFF-Tg-мыши обладали многочисленными зародышевыми центрами в отсутствие иммунизации (фиг. 12D). Окрашивание при помощи анти-CD11c на дендритные клетки в зоне Т-клеток и в маргинальной зоне контрольных мышей (фиг. 12 Е) было значительно уменьшенным у BAFF-Tg-мышей (фиг. 12F). Синдекан-1-положительные плазматические клетки были почти недетектируемыми в селезенке контрольных однопометных мышей (фиг. 12G), но красная пульпа BAFF-Tg-мышей была сильно положительной в отношении синдекана-1 (фиг. 12 Н). Очень сходные наблюдения были сделаны для MLN (фиг. 13). В MLN BAFF-Tg-мышей зоны В-клеток были драматически расширенными (фиг. 13 В) в противоположность нормальному узлу, где фолликулы В-клеток легко распознаются на периферии узла ниже капсулы с типичной паракортикальной зоной Т-клеток (фиг. 13 А). Сердцевина MLN BAFF-Tg-мышей заполнена синдекан-1-положительными клетками, которые предположительно являются плазматическими клетками (фиг. 13 Н). В заключение, анализ вторичных лимфоидных органов у BAFF-Tg-мышей согласуется с экспансивным фенотипом В-клеток, при котором обнаруживаются множественные клеточные аномалии и усиленная иммунная активность. Ссылки 1. Smith et al. (1994) Cell 76:959-962 2. Vassalli (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411-452 3. De Togni et al. (1994) Science 264:703-707- 22006108 Таблица 3 Повышенная экспрессия МНС класса II на В-клетках и увеличенное содержание В-клеток в MZ селезенки BAFF-Tg-мышей ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ стимуляции роста В-клеток в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей(а) BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(б) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и антиантитело;(в) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и CD40-лиганд и(г) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и анти-СD40-лиганд. 2. Способ стимуляции продуцирования иммуноглобулинов в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей(а) BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(б) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и антиантитело;(в) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и CD40-лиганд и(г) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и анти-СD40-лиганд. 3. Способ совместной стимуляции роста В-клеток и продуцирования иммуноглобулинов в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, включающей в себя(а) BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(б) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и антиантитело;(в) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и CD40-лиганд и(г) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и анти-СD40-лиганд. 4. Способ стимуляции индуцированного дендритными клетками роста и созревания В-клеток в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей(а) BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(б) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и антиантитело;(в) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и CD40-лиганд и(г) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и анти-СD40-лиганд. 5. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому BAFF-лиганд представляет собой растворимыйBAFF-лиганд. 6. Способ по п.5, согласно которому растворимый BAFF-лиганд представляет собой рекомбинантный BAFF-лиганд. 7. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому анти-СD40-лиганд представляет собой моноклональное антитело. 8. Способ по любому из пп.1-4, согласно которому указанное животное является млекопитающим. 9. Способ по п.8, согласно которому млекопитающее является человеком.- 23006108 10. Способ ингибирования роста В-клеток в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей(а) анти-ВАFF-лиганд или его активный фрагмент;(б) рекомбинантный, нефункциональный BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(в) антитело, специфичное в отношении BAFF-лиганда, или его активный фрагмент и(г) антитело, специфичное в отношении рецептора BAFF-лиганда или его эпитопа. 11. Способ ингибирования продукции иммуноглобулинов в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей(а) анти-ВАFF-лиганд или его активный фрагмент;(б) рекомбинантный, нефункциональный BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(в) антитело, специфичное в отношении BAFF-лиганда, или его активный фрагмент и(г) антитело, специфичное в отношении рецептора BAFF-лиганда или его эпитопа. 12. Способ совместного ингибирования роста В-клеток и продуцирования иммуноглобулинов в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей(а) анти-ВАFF-лиганд или его активный фрагмент;(б) рекомбинантный, нефункциональный BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(в) антитело, специфичное в отношении BAFF-лиганда, или его активный фрагмент и(г) антитело, специфичное в отношении рецептора BAFF-лиганда или его эпитопа. 13. Способ ингибирования индуцированного дендритными клетками роста и созревания В-клеток в организме животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей(а) анти-ВАFF-лиганд или его активный фрагмент;(б) рекомбинантный, нефункциональный BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(в) антитело, специфичное в отношении BAFF-лиганда, или его активный фрагмент и(г) антитело, специфичное в отношении рецептора BAFF-лиганда или его эпитопа. 14. Способ по любому из пп.10-13, согласно которому анти-ВАFF-лиганд представляет собой растворимый анти-BAFF-лиганд. 15. Способ по п.14, согласно которому растворимый анти-ВАFF-лиганд представляет собой рекомбинантный анти-BAFF-лиганд. 16. Способ по любому из пп.10-13, согласно которому антитело, специфичное в отношении BAFFлиганда, является моноклональным антителом. 17. Способ лечения аутоиммунного заболевания, связанного с BAFF-лигандом, у животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества соединения или композиции, выбранных из группы, содержащей(а) BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(б) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и антиантитело;(в) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и CD40-лиганд;(г) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и анти-СD40-лиганд;(д) анти-ВАFF-лиганд или его активный фрагмент;(е) рекомбинантный, нефункциональный BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(ж) антитело, специфичное в отношении BAFF-лиганда, или его активный фрагмент и(з) антитело, специфичное в отношении рецептора BAFF-лиганда или его эпитопа. 18. Способ лечения нарушения, связанного с BAFF-лигандом, у животного, предусматривающий введение в организм животного терапевтически эффективного количества вектора, содержащего ген,кодирующий соединение, выбранное из группы, содержащей(а) BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(б) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и антиантитело;(в) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и CD40-лиганд;(г) BAFF-лиганд или его активный фрагмент и анти-СD40-лиганд;(д) анти-ВАFF-лиганд или его активный фрагмент;(е) рекомбинантный, нефункциональный BAFF-лиганд или его активный фрагмент;(ж) антитело, специфичное в отношении BAFF-лиганда, или его активный фрагмент и(з) антитело, специфичное в отношении рецептора BAFF-лиганда или его эпитопа. 19. Способ по любому из пп.17-18, согласно которому BAFF-лиганд представляет собой растворимый BAFF-лиганд. 20. Способ по п.19, согласно которому растворимый BAFF-лиганд представляет собой рекомбинантный BAFF-лиганд.- 24006108 21. Способ по любому из пп.17-18, согласно которому анти-СD40-лиганд представляет собой моноклональное антитело. 22. Способ по любому из пп.17-18, согласно которому анти-ВАFF-лиганд представляет собой растворимый анти-BAFF-лиганд. 23. Способ по п.22, согласно которому растворимый анти-ВАFF-лиганд представляет собой рекомбинантный анти-BAFF-лиганд. 24. Способ по любому из пп.17-18, согласно которому антитело, специфичное в отношении BAFFлиганда, представляет собой моноклональное антитело. 25. Способ по любому из пп.17-18, согласно которому антитело, специфичное в отношении рецептора BAFF-лиганда, представляет собой моноклональное антитело. 26. Способ индукции гибели клеток, предусматривающий введение животному терапевтически эффективного количества антитела, специфичного в отношении BAFF-лиганда, или его активного фрагмента. 27. Способ коррекции, супрессии или изменения иммунного ответа, основанного на передаче сигнала между BAFF-лигандом и рецептором BAFF-лиганда, предусматривающий введение животному терапевтически эффективного количества антитела, специфичного в отношении BAFF-лиганда, или его активного фрагмента. 28. Способ ингибирования воспаления у животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества антитела, специфичного в отношении BAFF-лиганда,или его активного фрагмента. 29. Способ ингибирования воспаления у животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества антитела, специфичного в отношении рецептораBAFF-лиганда или его эпитопа. 30. Способ регуляции развития гематопоэтических клеток у животного, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества BAFF-лиганда или его активного фрагмента. 31. Способ коррекции, супрессии или изменения иммунного ответа у животного, основанного на передаче сигнала между BAFF-лигандом и рецептором BAFF-лиганда, предусматривающий введение указанному животному терапевтически эффективного количества антитела, специфичного в отношенииBAFF-лиганда или его активного фрагмента.