Замещённые индазолы, композиции, содержащие указанные индазолы, способ их получения и применение

012702 Настоящее изобретение относится, в частности, к новым химическим соединениям, конкретнее, к новым замещенным индазолам, к композициям, содержащим указанные индазолы, и к применению их в качестве лекарственных средств. Более конкретно, изобретение относится к новым специфическим индазолам, имеющим противораковую активность, опосредованную через модулирование активности белков, в частности, киназ. На сегодняшний день большинство выпускаемых на рынок соединений, используемых в химиотерапии, создают серьезные проблемы, связанные с побочными эффектами и с переносимостью этих соединений пациентами. Эти явления могли бы быть ограничены, если бы используемые лекарственные средства обладали селективным действием на раковые клетки и не затрагивали здоровые клетки. В этой связи одно из решений, направленных на ограничение нежелательных эффектов при химиотерапии, может состоять в использовании лекарственных средств, воздействующих на метаболические пути или на элементы, составляющие эти пути, и экспрессирующихся, главным образом, в раковых клетках и не экспрессирующихся или мало экспрессирующихся в здоровых клетках. Белки киназы составляют семейство ферментов, которые катализируют фосфорилирование гидроксильных групп специфических остатков белков, таких как остатки тирозина, серина или треонина. Такие реакции фосфорилирования могут значительно изменить функцию белков; так, белки киназы играют важную роль в регуляции многочисленных клеточных процессов, включая, в частности, метаболизм,пролиферацию клеток, клеточную дифференцировку клеток, миграцию клеток или выживание клеток. Среди различных клеточных процессов, в которых задействована активность белка киназы, существуют процессы, представляющие собой притягательные мишени для лечения раковых заболеваний, а также других заболеваний. Таким образом, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить композиции, которые обладали бы противораковой активностью и воздействовали, в частности, на киназы. Среди киназ,которые являются объектом модулирования их активности, можно назвать киназы Aurora2, CDK4, KDR и Tie2. Индазолы сравнительно мало встречаются среди выпускаемых фармацевтических продуктов. В указанных ниже документах прелагается терапевтическое использование индазолов, замещенных в положении 3 амидом и в положении 6 замещенным арилом. В заявке на патент WO 03/078403 описаны индазолы, замещенные в положении 3 амидами, которые пригодны для лечения многочисленных патологий, связанных, главным образом, с центральной нервной системой. Использование в онкологии, хотя и заявлено, но не продемонстрировано. В заявке на патент WO 03/051847 описаны индазолы, замещенные в положении 3 амидами, которые пригодны для лечения многочисленных патологий, связанных, главным образом, с центральной нервной системой. Использование в онкологии, хотя и заявлено, но не продемонстрировано. Однако неожиданно было обнаружено, что индазолы, замещенные в положении 3 заместителемNH-M-R3, где M и R3 имеют значение, указанное ниже, и в положении 6 ароматическим заместителем или замещенным гетерароматическим заместителем, проявляют высокую ингибирующую активность в отношении киназ, в частности киназ KDR и Tie2. Одна из заслуг изобретения заключается в открытии того факта, что замещение индазола в положении 6 соответствующей группой приводит к значительному ингибированию киназ KDR и Tie2. Другой заслугой изобретения является открытие того факта, что замещение индазола в положении 3 заместителем NH-M-R3, где M и R3 имеют значение, указанное ниже, является определяющим для достижения удовлетворительной активности в отношении этих двух киназ. Таким образом, изменение функциональной группы в положении 3 индазола систематически влечет за собой снижение ингибирующей активности KDR и Tie2. Более того, другой заслугой изобретения является обнаружение того факта, что, даже если индазол корректно замещен соответствующей группой, необходимо, чтобы азот в положении 1 индазола не был замещен для того, чтобы сохранить на удовлетворительном уровне ингибирующую активность. Упомянутые продукты соответствуют следующей формуле (I):-1 012702 3) L выбран из группы, состоящей из связи, СО, NH, CO-NH, NH-CO, NH-SO, NH-SO2, NH-CO-NHSO2, SO2NH, NH-CH2, CH2-NH, CH2-CO-NH, NH-CO-CH2, NH-CH2-CO, CO-CH2-NH, NH-CO-NH, NH-CSNH, NH-CO-O, O-CO-NH, CH2-NH-CO-NH, NH-CO-NH-CH2; 4) M выбран из группы, состоящей из связи, СО, NH, CO-NH, CS-NH, NH-CO, NH-SO, NH-SO2, CONH-SO2, NH-CH2, CH2-CO-NH, NH-CO-CH2, NH-CH2-CO, CO-CH2-NH; 5) R3 выбран, независимо, из группы, состоящей из H, алкила, алкилена, алкинила, арила, гетероарила, циклоалкила, гетероциклического радикала, замещенного алкила, замещенного алкилена, замещенного алкинила, замещенного арила, замещенного гетероарила, замещенного циклоалкила, замещенного гетероциклического радикала; 6) R4, R5 и R7 выбраны, независимо, из группы, состоящей из H, галогена, R2, CN, O(R2),OC(O)(R2), ОС(О)N(R2)(R1), OS(O2)(R2), N(R2)(R1), N=C(R2)(R1), N(R2)С(О)(R1), N(R2)С(О)О(R1),N(R6)C(O)N(R2)(R1), N(R6)С(S)N(R2)(R1), N(R2)S(O2)(R1), C(O)(R2), C(O)O(R2), C(O)N(R2)(R1),C(=N(R1 (R2), C(=N(OR1(R2), S(R2), S(O)(R2), S(O2)(R2), S(O2)O(R2), S(O2)N(R2)(R1); в которых каждый из R2, R1, R6 выбран независимо из группы, состоящей из H, алкила, алкилена, алкинила, арила,гетероарила, циклоалкила, гетероциклического радикала, замещенного алкила, замещенного алкилена,замещенного алкинила, замещенного арила, замещенного гетероарила, замещенного циклоалкила, замещенного гетероциклического радикала; и в которых, если R2 и R1 одновременно находятся на одном изR4, R5 и R7, то они могут быть связаны друг с другом с образованием цикла. В продуктах формулы (I) Ar-L-A преимущественно означает группу: в которой каждый X1, Х 2, Х 3 и Х 4 выбран независимо из N и C-R11, в которой R11 выбран из группы, состоящей из H, галогена, R2, CN, O(R2), OC(O)(R2), ОС(О)N(R2)(R1), OS(O2)(R2), N(R2)(R1),N=C(R2)(R1),N(R2)С(О)(R1),N(R2)С(О)О(R1),N(R6)C(O)N(R2)(R1),N(R6)С(S)N(R2)(R1),N(R2)S(O2)(R1), C(O)(R2), C(O)O(R2), C(O)N(R2)(R1), С(=N(R1(R2), C(=N(OR1(R2), S(R2), S(O)(R2),S(O2)(R2), S(O2)O(R2), S(O2)N(R2) (R1); в которой каждый из R2, R1, R6 выбран, независимо, из группы, состоящей из H, алкила, алкилена,алкинила, арила, гетероарила, циклоалкила, гетероциклического радикала, замещенного алкила, замещенного алкилена, замещенного алкинила, замещенного арила, замещенного гетероарила, замещенного циклоалкила, замещенного гетероциклического радикала; в которой, если R2 и R1 одновременно находятся на R11, то они могут быть связаны друг с другом с образованием, цикла. Заместители R11, выбранные из группы, состоящей из H, F, Cl, метила, NH2, OCF3 и CONH2, являются предпочтительными. Заместители R4, R5 и R7 преимущественно выбирают из H, F, Cl, Br и метила. Заместитель R7 предпочтительно выбирают из группы, состоящей из F, Cl, Br и метила, в которой F является особенно предпочтительным. Действительно, было обнаружено, что замещение радикала R7 атомом фтора значительным образом улучшает биохимическую активность, в частности ингибирующую активность в отношении киназ, в частности киназ Tie2, KDR. Остаток L-A выбирают преимущественно из NH2, NH-A, NH-CO-NH-A и NH-SO2-A. Предпочтительный заместитель А выбирают преимущественно из группы, состоящей из фенила,пиридила, пиримидила, тиенила, фурила, пирролила, оксазолила, тиазолила, изоксазолила, изотиазолила,пиразолила, имидазолила, индолила, индазолила, бензимидазолила, бензоксазолила и бензотиазолила,причем каждый из перечисленных заместителей может быть замещен. Более предпочтительный заместитель А выбирают из фенила, изоксазолила, замещенного фенила и замещенного изоксазолила. Заместитель А предпочтительно замещен первым заместителем, выбранным из группы, состоящей из алкила, галогенированного алкила, алкилена, алкинила, арила, O-алкила, O-арила, О-гетероарила, Sалкила, S-арила, S-гетероарила, причем каждый из них возможно замещен заместителем, выбранным из(С 1-С 3)алкила, галогена, O-(С 1-С 3)алкила. Заместитель А предпочтительно замещен вторым заместителем, выбранным из группы, состоящей из F, Cl, Br, I, ОН, SH, SO3M, COOM, CN, NO2, CON(R8)(R9), N(R8)(R9)СО(R8), (C1-С 3)алкил-OH, (С 1 С 3)алкил-(R8)(R9), (С 1-С 3)алкил-(R10), (C1-С 3)алкил-СООН, N(R8)(R9); в которой R8 и R9 выбраны независимо из H, (С 1-С 3)алкила, (С 1-С 3)алкил-ОН, (C1-С 3)алкилNH2, (С 1-С 3)алкил-СООМ, (С 1 С 3)алкил-SO3M; в которой, если R8 и R9 одновременно отличаются от H, то они могут быть соединены с образованием цикла; в которой M означает H или катион щелочного металла, выбранного из Li, Na и K; и в которой R10 обозначает H или гетероциклический неароматический возможно замещенный радикал,содержащий 2-7 атомов углерода и 1-3 гетероатома, выбранных из N, О и S. Заместитель А, особенно эффективный для достижения ингибирующей активности в отношении-2 012702 киназ, выбирают из фенила и изоксазолила, причем каждый замещен, по меньшей мере, одним заместителем, выбранным из галогена, (С 1-С 4)алкила, галогенированного(С 1-С 3)алкила, O-(С 1-С 4)алкила, S(C1-С 4)алкила, галогенированного О-(С 1-С 4)алкила и галогенированного S-(C1-С 4)алкила. Кроме того, предпочтительный заместитель M выбирают преимущественно из группы, состоящей из связи, СО, CO-NH и SO2. Заместитель R3 предпочтительно выбирают из группы, состоящей из арила, гетероарила, замещенного арила и замещенного гетероарила. Особенно предпочтительный заместитель R3 представляет собой замещенный гетероарил. Из замещенных гетероарилов выбирают тиенил, пирролил, фурил, индолил,оксазолил, изоксазолил, тиазолил, изотиазолил, имидазолил, индазолил, пиридил, пиримидил, пиразолил и пиридазинил. Преимущественно заместители R4 и R5 обозначают H. Действительно, наблюдения показали, что в этом случае заметно улучшается активность в отношении киназ KDR и/или Tie2, и, как правило, улучшается растворимость. Приемлемые продукты, отвечающие критериям требуемого уровня ингибирующей активности, могут быть выбраны из группы, состоящей из 1-[4-(3-амино-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида,N-6-[4-(2,3-дихлорбензолсульфониламино)фенил]-1 Н-индазол-3-ил-(тиофен-3-илкарбоксамида),N-[4-(3-амино-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-2,3-дихлорбензолсульфонамида. Другие приемлемые продукты, в которых R7 означает предпочтительно галоген, более предпочтительно фтор, отвечающие критериям требуемого уровня ингибирующей активности и обладающие, фактически, более высокой активностью по сравнению с аналогами, в которых R7 отличается от галогена,могут быть выбраны из группы, состоящей из 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида,1-(2-фтор-5-трифторметилфенил)-3-4-[7-фтор-3-(тиофен-3-илкарбониламино)-1H-индазол-6 ил]фенилкарбамида,N-6-[4-(2,3-дихлорбензолсульфониламино)фенил]-7-фтор-1 Н-индазол-3-ил-(тиофен-3 илкарбоксамида),N-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-2,3-дихлорбензолсульфонамида,1-(2-фтор-5-трифторметилфенил)-3-4-[4,5,7-трифтор-3-(тиофен-3-илкарбониламино)-1 Н-индазол 6-ил]фенилкарбамида,N-[6-(4-аминофенил)-7-фтор-1 Н-индазол-3-ил]-(тиофен-3-илкарбоксамида). Продукт, соответствующий изобретению, может находиться в форме: 1) не хиральной, или 2) рацемической, или 3) обогащенной стереоизомером, или 4) обогащенной энантиомером; и может находиться в солевой форме. Продукт согласно изобретению может быть использован для получения лекарственного средства,пригодного для лечения патологического состояния, в частности рака. Настоящее изобретение относится также к терапевтической композиции, содержащей продукт согласно изобретению, в комбинации с фармацевтически приемлемым эксципиентом, соответствующим выбранному методу введения. Фармацевтическая композиция может находиться в твердой форме, жидкой форме или в форме липосом. Среди твердых композиций можно назвать порошки, желатиновые капсулы, таблетки. Среди форм для перорального введения можно также назвать твердые формы, защищенные от кислой среды желудка. Носители, используемые для твердых форм, представляют собой, в частности, минеральные носители,такие как фосфаты, карбонаты, или органические носители, такие как лактоза, целлюлозы, крахмал или полимеры. Жидкие формы представляют собой растворы, суспензии или дисперсии. Они содержат в качестве дисперсионного носителя либо воду, либо органический растворитель (этанол, NMP или другие) или смеси поверхностно-активных веществ и растворителей, или комплексообразующих агентов и растворителей. Жидкими формами предпочтительно являются формы, пригодные для инъекций, и поэтому они имеют состав, соответствующий этому назначению. Приемлемые пути введения методом инъекции включают внутривенное введение, интраперитональное, внутримышечное и подкожное, причем обычно предпочитают внутривенное введение. Назначаемая доза соединений согласно изобретению подбирается врачом в зависимости от метода введения соединения пациенту и от его состояния. Соединения согласно изобретению могут вводиться индивидуально или в смеси с другими противораковыми агентами. Из возможных комбинаций можно назвать следующие: алкилирующие агенты, в частности, циклофосфамид, мельфалан, ифосфамид, хлорамбуцил, бусульфан, тиотепа, преднимустин, кармустин, ломустин, семустин, стептозотоцин, декарбазин, темозоломид, прокарбазин и гексаметилмеламин,-3 012702 производные платины, такие как, в частности, цисплатин, карбоплатин или оксалиплатин,антибиотические агенты, такие как, в частности, блеомицин, митомицин, дактиномицин,антимикротубулярные агенты, такие как, в частности, винбластин, винкристин, виндезин, винорельбин, таксоиды (паклитаксель и докетаксель),антрациклины, такие как, в частности, доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, эпирубицин, митоксантрон, лозоксантрон,ингибиторы топоизомераз I и II групп, такие как этопозид, тенипозид, амсакрин, иринотекан, топотекан и томудекс,фторпиримидины, такие как 5-фторурацил, UFT, флоксуридин,аналоги цитидина, такие как 5-азацитидин, цитарабин, гемцитабин, 6-меркаптомурин, 6-тиогуанин,аналоги аденозина, такие как пентостатин, цитарабин или флударабинфосфат,метотрексат и фолиевая кислота,ферменты и различные соединения, такие как L-аспарагиназа, гидроксимочевина, транс-ретиноевая кислота, сурамин, декстразоксан, амифостин, герсептин, а также гормоны эстроген, андроген,сосудистые средства, такие как производные комбретастатина или колхицина и их предшественники. Можно также сочетать с приемом соединений согласно изобретению лечение методом облучения. Эти методы лечения могут проводиться одновременно, раздельно или последовательно. Схема лечения подбирается врачом в зависимости от состояния больного. Продукты согласно изобретению используются в качестве ингибиторов реакции, катализируемой киназой. Киназы KDR и Tie2 являются киназами, в отношении которых продукты изобретения особенно пригодны в качестве ингибиторов. Причины, из-за которых выбраны эти киназы, следующие:KDR (Kinase insert Domain Receptor), называемая также VEGF-R2 (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2), экспрессируется только в эндотелиальных клетках. Этот рецептор фиксируется на ангиогенном факторе роста VEGF и является, таким образом, медиатором для трансдукционного сигнала посредством активации своего межклеточного домена киназы. Прямое ингибирование активности рецептора VEGF-R2 в отношении киназы позволяет уменьшить явление ангиогенеза в присутствии эксогенногоVEGF (Vascular Endothelial Growth Factor: фактор роста эндотелия сосудов) (Strawn et al., CancerResearch, 1996, vol. 56, p.3540-3545). Этот способ был выполнен, в частности, с помощью мутантовVEGF-R2 (Millauer et al., Cancer Research, 1996, vol.56, p.1615-1620). Рецептор VEGF-R2, по-видимому,не имеет какой-либо другой функции у взрослого человека, кроме функции, связанной с ангиогеннной активностью VEGF. Следовательно, селективный ингибитор активности рецептора VEGF-R2 в отношении киназы, повидимому, будет проявлять лишь незначительную токсичность. Кроме этой главной роли в процессе динамического ангиогенеза согласно последним данным предполагается, что экспрессия VEGF способствует выживанию опухолевых клеток после химио- и радиотерапии, и подчеркивается потенциальный синергизм ингибиторов KDR с другими агентами (Lee et al.Tie2 (ТЕК) относится к семейству рецепторов тирозинкиназы, специфичной к эндотелиальным клеткам. Tie2 является первым рецептором с активностью тирозинкиназы, о котором известно, что он одновременно является агонистом (ангиопоэтин 1 или Ang1), который стимулирует аутофосфорилирование рецептора и клеточные сигнальные пути [S. Davis et al (1996) cell 87, 1161-1169], и антагонистом (ангиопоэтин 2 или Ang2) [P.С. Maisonpierre et al. (1997) Science 277, 55-60]. Ангиопоэтин 1 может проявлять синергизм с VEGF на последних стадиях неоангиогенеза [Asahara T. Circ. Res. (1998) 233-240]. В результате опытов с нокаутом и при использовании трансгенных манипуляций с экспрессией Tie2 илиAng1 появились животные, у которых наблюдается дефицит васкуляризации [D. J. Dumont et al (1994)Genes Dev. 8, 1897-1909 et C.Suri (1996) Cell 87, 1171-1180]. Связь Angl со своим рецептором приводит к аутофосфорилированию домена киназы Tie2, которая играет существенную роль в неоваскуляризации, а также в привлечении клеток и взаимодействии сосудов с перицитами и клетками гладких мышц; эти явления способствуют созреванию и стабильности вновь сформовавшихся сосудов [P. С. Maisonpierre et al(1997) Science 277, 55-60]. Авторы Lin et al (1997) J. Clin. Invest. 100, 8: 2072-2078 и Lin P. (1998) PNAS 95, 8829-8834, показали ингибирование роста и васкуляризации опухоли, а также уменьшение метастазирования в легких, аденовирусных инфекций или при инъекциях внеклеточного домена Tie2 (Тek) на ксенографических моделях опухоли молочной железы и меланомы. Ингибиторы Tie2 могут быть использованы в случаях, когда неоваскуляризация протекает с патологией (т.е. в случае диабетической ретинопатии, хронического воспаления, псориаза, саркомы Капоши,хронической неоваскуляризации, вызванной макулярной дегенерацией, ревматоидного артрита, инфантильной гемоангиомы и рака). Развитие клеточного цикла часто регулируется циклинзависимыми киназами (CDK), которые активируются взаимодействием с белками, относящимися к семейству циклинов, эта активация заканчивается фосфорилированием субстратов и, в конце концов, делением клеток. Кроме этого, эндогенные ингибиторы CDK, которые активированы (семейство INK4 и KIP/CIP), отрицательно регулируют активностьCDK. Рост нормальных клеток связан с балансом между активаторами CDK (циклины) и эндогенными ингибиторами CDK. В литературе описана экспрессия или аномальная активность нескольких из этих регуляторов клеточного цикла при раках различного типа. Циклин E активирует киназу Cdk2, которая затем вызывает фосфорилирование белка pRb (белок ретинобластомы), приводящее в результате к началу необратимого деления клеток и переходу в фазу SCDK3 необходимы для развития в фазе G1 и для входа в фазу S. Во время образования комплекса с циклином E киназы поддерживают гиперфосфорилирование pRb и помогают развитию фазы G1 в фазу S. В комплексах с циклином А киназа CDK2 играет определенную роль в инактивации E2F и является необходимой для осуществления фазы S (TD. Davies et al.(2001) Structure 9, 389-3). Комплекс CDK1/циклин В регулирует развитие клеточного цикла между фазой G2 и фазой M. Отрицательное регулирование комплекса CDK/циклин В мешает нормальным клеткам войти в фазу S перед тем, как фаза G2 корректно и полностью завершена (К.К. Roy and E.A. Sausville Current PharmaceuticalDesign, 2001, 7, 1669-1687). Существует уровень регуляции активностью CDK. Активаторы циклинзависимых кеназ (CAK) положительно воздействуют на регуляцию CDK. Киназы CAK фосфорилируют CDK на остатке треонина,чтобы сделать энзим полностью активной мишенью. В связи с тем, что наличие дефектов в молекулах, воздействующих на клеточный цикл, влечет активацию CDK и развитие цикла, то естественно желание ингибировать активность ферментов CDK для блокирования клеточного роста раковых клеток. Многочисленные белки, участвующие в сегрегации хромосом и в сборке пучка, были идентифицированы в дрожжах и дрозофиле. Дезорганизация этих белков приводит к несегрегации хромосом и к монополярным или дезорганизованным пучкам. Среди этих белков, некоторые киназы, в частности, Aurora и Ipl1, происходящие, соответственно, из дрозофил и S.cerevisiae, необходимы для сегрегации хромосом и выделения центросомы. Человеческий аналог Ipl1 дрожжей был в последнее время клонирован и охарактеризован в различных лабораториях. Эта киназа, названная Aurora2, STK15 или BTAK, принадлежит семейству серин/треониновых каназ. Bischoff с соавт. показали, что Aurora2 является онкогенной и амплифицируется в колоректальных злокачественных опухолях человека (EMBO J., 1998, 17, 3052-3065). Этот факт подтверждается на примерах раков, происходящих от эпителиальных опухолей, таких как рак молочной железы. Определения терминов Под термином галоген подразумевается элемент, выбранный из F, Cl, Br и I. Под термином алкил подразумевается углеводородный насыщенный заместитель, линейный или разветвленный, имеющий 1-12 атомов углерода. Примерами алкильного заместителя являются метил,этил, пропил, 1-метилэтил, бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, пентил, 1 метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 2,2-диметилпропил,1-этилпропил, гексил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 3,3-диметилбутил, гептил, 1-этилпентил, октил, нонил, децил, ундецил и додецил. Под термином алкилен подразумевается углеводородный заместитель, линейный или разветвленный, имеющий одну или несколько ненасыщенных связей и содержащий 2-12 атомов углерода. Примерами алкиленового заместителя являются заместители этиленил, 1-метилэтиленил, проп-1-енил, проп 2-енил, Z-1-метилпроп-1-енил, Е-1-метилпроп-1-енил, Z-1,2-диметилпроп-1-енил, E-1,2-диметилпроп-1 енил, бут-1,3-диенил, 1-метилиденилпроп-2-енил, Z-2-метилбут-1,3-диенил, Е-2-метилбут-1,3-диенил, 2 метил-1-метилиденилпроп-2-енил, ундец-1-енил и ундец-10-енил. Под термином алкинил подразумевается углеводородный заместитель, линейный или разветвленный, имеющий, по меньшей мере, две ненасыщенные связи, находящиеся между двумя соседними атомами углерода, и содержащий 2-12 атомов углерода. Примерами алкинилового заместителя являются заместители этинил, проп-1-инил, проп-2-инил и бут-1-инил. Под термином арил подразумевается моно- или полициклический ароматический заместитель,имеющий 6-14 атомов углерода. Примерами арильного заместителя являются фенил, нафт-1-ил, нафт-2 ил, антрацен-9-ил, 1,2,3,4-тетрагидронафт-5-ил и 1,2,3,4-тетрагидронафт-6-ил. Под термином гетероарил подразумевается моно- или полициклический гетероароматический заместитель, имеющий 1-13 атомов углерода и 1-4 гетероатома. Примерами гетероарильного заместителя являются пиррол-1-ил, пиррол-2-ил, пиррол-3-ил, фурил, тиенил, имидазолил, оксазолил, тиазолил, изоксазолил, изотиазолил, 1,2,4-триазолил, оксадиазолил, тиадиазолил, тетразолил, пиридил, пиримидил,-5 012702 пиразинил, 1,3,5-триазинил, индолил, бензо[b]фурил, бензо[b]тиенил, индазолил, бензимидазолил, азаиндолил, хинолил, изохинолил, карбазолил и акридил. Под термином гетероатом подразумевается по меньшей мере один двухвалентный атом, отличающийся от атома углерода. Примерами гетероатома являются N, О, S и Se. Под термином циклоалкил подразумевается циклический углеводородный заместитель, насыщенный или частично ненасыщенный, имеющий 3-12 атомов углерода. Примерами циклоалкильного заместителя являются заместители циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклопентенил, циклопентадиенил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, бицикло[2.2.1]гептил, циклооктил, бицикло[2.2.2]октил, адамантил и пергидронафтил. Под термином гетероциклический радикал подразумевается циклический углеводородный заместитель, насыщенный или частично ненасыщенный, имеющий 1-13 атомов углерода и 1-4 гетероатома. Предпочтительно, циклическим углеводородным заместителем, насыщенным или частично ненасыщенным, является моноциклический углеводород, который содержит 4-5 атомов углерода и 1-3 гетероатома. Под термином замещенный подразумевается заместитель, отличающийся от H, например, галоген, алкил, арил, гетероарил, циклоалкил, гетероциклический радикал, алкилен, алкинил, ОН, O-алкил,O-алкилен, O-арил, O-гетероарил, NH2, NH-алкил, NH-арил, NH-гетероарил, SH, S-алкил, S-арил, S(O2)H,S(O2)алкил, S(O2)арил, SO3H, SO3-алкил, SO3-арил, CHO, С(О)алкил, С(О)арил, C(O)OH, С(O)O-алкил,С(O)O-арил, ОС(O)алкил, ОС(O)арил, C(O)NH2, С(О)NH-алкил, С(О)NH-арил, NHCHO, NHC(О)алкил,NHC(O)арил, NH-циклоалкил, NH-гетероциклический радикал. Изобретение относится также к способу получения продуктов формулы (I). Продукты согласно изобретению могут быть получены на основе методов классической органической химии. Приведенная ниже схема 1 иллюстрирует метод, использованный при получении соединения примера 6. Однако это не является основанием для ограничения объема изобретения в части методов получения заявленных соединений. Схема 1 Для специалиста само собой разумеется, что для осуществления способов согласно изобретению,описанных выше, может потребоваться введение защитных групп для амино-, карбоксильной и спиртовой функциональной группы для того, чтобы избежать побочных реакций. Эти группы являются такими,которые могут быть удалены без ущерба для остальной части молекулы. В качестве примеров защитных групп аминофункций можно назвать трет-бутилкарбамат, который может быть регенерирован с помощью иодтриметилсилана, ацетил, который может быть регенерирован в кислой среде (например, в хлористоводородной кислоте). В качестве защитных групп карбоксильной функции можно назвать сложноэфирные группы (например, группа сложного метоксиметилового эфира, бензилового эфира). В качестве защитных групп спиртовой функции можно назвать сложноэфирные группы (например, группа бензоилового сложного эфира), которые могут быть регенерированы в кислой среде или каталитическим гидрированием. Другие используемые защитные группы, описаны T.W. GREENE et coll. в Protective Groupsin Organic Synthesis, third edition, 1999, Wiley-Interscience. Соединения формулы (I) выделяют и, если необходимо, очищают обычными известными методами,например кристаллизацией, хроматографией или экстракцией. Энантиомеры, диастереоизомеры соединений формулы (I) составляют также часть изобретения. Соединения формулы (I), содержащие остаток основного характера, могут быть, при желании, превращены в аддитивные соли с минеральной или органической кислотой путем реакции с такой кислотой в среде растворителя, например, органического, такого как спирт, кетон, эфир или хлорированный растворитель. Соединения формулы (I), содержащие кислотный остаток, могут быть, при желании, превращены в соли с металлами или в аддитивные соли с азотсодержащими основаниями в соответствии с известными методами. Эти соли могут быть получены действием основания металла (например, щелочного или щелочно-земельного), аммиака, амина или соли амина на соединение формулы (I) в растворителе. Образовавшуюся соль отделяют обычными методами. Эти соли также составляют часть изобретения. Если продукт согласно изобретению имеет по меньшей мере одну свободную функцию основного характера, то фармацевтически приемлемые соли могут быть получены взаимодействием между указанным продуктом и минеральной или органической кислотой. Фармацевтически приемлемые соли включают хлориды, нитраты, сульфаты, гидросульфаты, пиросульфаты, бисульфаты, сульфиты, бисульфиты,фосфаты, моногидрофосфаты, дигидрофосфаты, метафосфаты, пирофосфаты, ацетаты, пропионаты, акрилаты, 4-гидробутираты, каприлаты, капроаты, деканоаты, оксалаты, малонаты, сукцинаты, глутараты,адипаты, пимелаты, малеаты, фумараты, цитраты, тартраты, лактаты, фенилацетаты, манделаты, себацаты, субераты, бензоаты, фталаты, метансульфонаты, пропансульфонаты, ксилолсульфонаты, салицилаты,циннаматы, глутаматы, аспартаты, глюкуронаты, галактоуронаты. Если продукт согласно изобретению имеет по меньшей мере одну свободную кислотную функцию,то фармацевтически приемлемые соли могут быть получены взаимодействием указанного продукта с минеральным или органическим основанием. Фармацевтически приемлемые основания включают гидроксиды катионов щелочного или щелочно-земельного металла, такого как Li, Na, К, Mg, Ca, аминосодержащие соединения основного характера, такие как аммиак, аргинин, гистидин, пиперидин, морфолин,пиперазин, триэтиламин. Продукты согласно изобретению, полученные в виде солей, в частности гидрохлорида, могут быть переведены из солей взаимодействием с минеральным или органическим основанием согласно известным методам. Изобретение описывается также с помощью изложенных ниже примеров, которые только иллюстрируют изобретение. Анализы методом жидкостной хроматографии/масспектрометрии (LC/MC) осуществлены на приборе Micromass, модель LCT, соединенном с прибором HP 1100. Содержание продуктов измерялось с помощью детектора с диодной планкой HP G1315A при длине волн 200-600 нм и детектора с устройством рассеяния света Sedex 25. Снятие масс-спектров Mass spectra осуществлялось в диапазоне 180-800. Данные анализировались с использованием компьютерного программного обеспечения Micromass MassLynx. Разделение осуществлялось на колонке Hypersil BDS С 18, 3 мкм 504,6 мм) при элюировании с линейным градиентом 5-90%, ацетонитрила, содержащего 0,05% (об./об.) трифторуксусной кислоты(TFA) в воде, содержащей 0,05% (об./об.) TFA, в течение 3,5 мин с дебитом 1 мл/мин. Общее время анализа, включая период повторного уравновешивания колонки, составляет 7 мин. Спектры MC получали путем электронного распыления (ES+) на приборе Platform II (Micromass). Были описаны основные наблюдаемые ионы. Температуры плавления определяли методом плавления в капилляре на аппарате Mettler FP62 в интервале температур 30C-300C при подъеме температуры 2 С в минуту. Очистка методом LC/MC Продукты могут быть очищены методом LC/MC с использованием системы Waters FractionsLynx,состоящей из градиентного насоса Waters, модель 600, обратного насоса Waters, модель 515, промывного насоса Waters Reagent Manager, автоматического инжектора Waters, модель 2700, двух вентилей Rheodyne, модель LabPro, детектора с диодной планкой Waters, модель 996, масс-спектрометра Waters, модельZMD и сборника фракций Gilson, модель 204. Система контролировалась с помощью программного обеспечения Waters FractionsLynx. Разделение осуществлялось поочередно на двух колонках WatersSymmetry (C18, 5 мкМ, 1950 мм, номер по каталогу 186000210), причем одна колонка находилась в режиме регенерации смесью вода/ацетонитрил 95/5 (об./об.), содержащей 0,07% (об./об.) трифторуксусной кислоты, в то время как вторая колонка находилась в режиме разделения. Элюирование в колонках осуществлялось с линейным градиентом 5-95% ацетонитрила, содержащего 0,07% (об./об.) трифторуксусной кислоты (TFA) в воде, содержащей 0,07% (об./об.) трифторуксусной кислоты, с дебитом 10 мл/мин. На выходе из колонки разделения одна тысячная часть эффлюента отделялась в жидкостном хроматографе Packing Accurate, разбавлялась метиловым спиртом с дебитом 0,5 мл/мин и направлялась на детек-7 012702 торы из расчета 75% на детектор с диодной планкой и остальные 25% направлялись на массспектрометр. Остаток эффлюента (999/1000) направляли в сборник фракций, из которого поток удаляется, пока масса целевого продукта не будет определяться устройством с программным обеспечением FractionsLynx. Вещества с формулой целевых продуктов поступают в программное обеспечение FractionsLynx, которое включает сбор продукта, когда сигнал от определяемой массы соответствует иону[М+Н]+ и/или [M+Na]+. В некоторых случаях, в зависимости от результата анализов LC/MC, когда интенсивный ион, соответствующий иону [М+2 Н] обнаружен, значение, соответствующее половине рассчитанной молекулярной массы (MW/2) также поступает на устройство с программным обеспечениемFractionsLynx. B этих условиях сбор также выполняется, как только обнаруживается сигнал массы иона[М+2 Н] и/или [M+Na+H]. Продукты собираются в тарированной стеклянной трубке. После сбора растворители выпаривают в центрифужном испарителе Savant AES 2000 или Genevac HT8 и массы продуктов определяют взвешиванием трубок после испарения растворителей. Пример 1. Гидрохлорид 1-[4-(3-амино-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида Гидрохлорид 1-[4-(3-аминофтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида получают гидролизом 37%-ым раствором хлористо-водородной кислоты (4,2 мл) в этаноле при кипячении с обратным холодильником в течение 24 ч 0,4 г 1-(4-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Ниндазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении и получают остаток, который перемешивают с 10 мл ацетонитрила, затем перекристаллизовывают из 7 мл горячего метанола. После фильтрации и сушки под вакуумом получают 70 мг гидрохлорида 1-[4-(3-амино-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида,имеющего следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 3413; 1656; 1550; 1442; 1340; 1117 и 816 см-1 Спектр ЯМР 1H (400 МГц, (CD3)2SOв м.д.): 7,38-7,45 (м, 2H); 7,49-7,56 (м, 2H); 7,60 (д шир., J=8,5 Гц, 2H); 7,70 (д шир., J=8,5 Гц, 2H); 7,90 (д, J=8,5 Гц, 1H); 8,65 (дд шир., J=2,5 и 7,5 Гц, 1H); 8,98 (д шир.,J=2,0 Гц, 1H); 9,42 (с, 1H). Спектр MC (ES+): m/z=430 [MH+] 1-(4-3-[(Тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-ил)фенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамид К раствору 1,72 г гидрохлорида 6-(4-аминофенил)-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазола и 0,65 мл триэтиламина в 70 мл тетрагидрофурана медленно добавляют 0,67 мл 2-фтор-5 трифторметилфенилизоцианата в атмосфере аргона. Реакционную смесь перемешивают 3,5 ч при 24C,затем концентрируют при пониженном давлении. Остаток очищают флэш-хроматографией на колонке из диоксида кремния (60; 35-70 мкМ), элюируя смесью дихлорметанметанол (97/3 об.), и получают 0,4 г 1(4-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида, имеющего следующие характеристики: Спектр MC (ES+) : m/z=540 [MH+] Гидрохлорид 6-(4-аминофенил)-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазола К раствору 4,2 г 6-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Ниндазола в 30 мл метанола добавляют 12 мл 4 н раствора хлористоводородной кислоты в диоксане. Реакционную смесь перемешивают в течение 14 ч при температуре около 20C, затем концентрируют при пониженном давлении. Твердый остаток перемешивают с 25 мл изопропилового эфира, фильтруют и центрифугируют с получением 3,45 г гидрохлорида 6-(4-аминофенил)-1-[3-(тиофен-3 ил)карбониламино]-1 Н-индазола, имеющего следующие характеристики: Спектр MC (ES+): m/z=335 [MH+] 6-(4-Трет-Бутоксикарбониламинофенил)-1-[3-(тиофен-3-ил) карбониламино] -1 Н-индазол К раствору 6 г 6-бром-1-[(тиофен-3-ил)карбонил]-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]индазола в 350 мл диоксана добавляют 4,93 г 4-(трет-бутилоксикарбониламино)фенилбороновой кислоты. Добавляют раствор 4,12 г карбоната натрия в 90 мл воды, затем 1,93 г тетракис-трифенилфосфинпалладия. Реакционную смесь перемешивают 4 часа при 90C, затем выливают в 120 мл дистиллированной воды. После экстрагирования этилацетатом, затем промывки насыщенным раствором хлорида натрия, органическую фазу концентрируют при пониженном давлении с получением 13,18 г твердого вещества, которое очищают флэш-хроматографией на колонке из диоксида кремния (60; 35-70 мкМ), элюируя смесью циклогексан-этилацетат (60/40 об.) и получают 4,2 г 6-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)-1-[3-(тиофен-3-8 012702 ил) карбониламино]-1 Н-индазола, имеющего следующие характеристики: Спектр MC (ES+): m/z=435 [MH+] 6-Бром-1-[(тиофен-2-ил)карбонил]-3-[(тиофен-2-ил)карбониламино]индазол К раствору 10 г 6-бром-3-амино-1H-индазола в 250 мл пиридина добавляют 13,8 г хлорангидрида 3 тиофенкарбоновой кислоты. Реакционную смесь перемешивают в атмосфере аргона в течение 16 ч при температуре около 25C, затем выливают в 400 мл воды. Суспензию фильтруют, промывают 280 мл воды, центрифугируют и сушат с получением 19,27 г 6-бром-1-[(тиофен-2-ил)карбонил]-3-[(тиофен-2 ил)карбониламино]индазола, имеющего следующие характеристики: Спектр MC (ES+) : m/z=433 [MH+] 6-Бром-3-амино-1 Н-индазол К раствору 10 г 4-бром-2-фторбензонитрила в 300 мл этанола добавляют 7,29 мл гидразингидрата. Реакционную смесь перемешивают 22 ч при кипячении с обратным холодильником, затем концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток перемешивают в течение 30 мин в 200 мл дистиллированной воды. Суспензию твердого вещества фильтруют, промывают водой и центрифугируют. После сушки под вакуумом получают 10 г 6-бром-3-амино-1H-индазола, имеющего следующие характеристики: Спектр MC (ES+): m/z=213 [MH+] Температура плавления: 249C Пример 2. Гидрохлорид 1-[4-(3-амино-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-2,3-дихлорбензолсульфонамида Гидрохлорид 1-[4-(3-амино-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-2,3-дихлорбензолсульфонамида получают гидролизом 37%-ым раствором хлористо-водородной кислоты (5 мл) в 40 мл этанола при кипячении с обратным холодильником в течение 24 ч 0,54 г 6-[4-(2,3-дихлорбензолсульфониламино)фенил]-1 Ниндазол-3-иламида 3-тиофенкарбоновой кислоты. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении и получают остаток, который перемешивают с 10 мл ацетонитрила. После фильтрации и промывки с 10 мл изопропилового эфира получают 0,46 г гидрохлорида 1-[4-(3-амино-1 Н-индазол-6 ил)фенил]-2,3-дихлорбензолсульфонамида, имеющего следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 3426; 3134; 2902; 2711; 1659; 1404; 1164; 924; 705 и 593 см-1 Спектр ЯМР 1H (400 МГц, (CD3)2SOв м.д.): 7,21 (д шир., J=9,0 Гц, 2H); 7,29 (д шир., J=9,0 Гц,1H); 7,44 (с шир., 1H); 7,58 (т, J=7,5 Гц, 1H); 7,62 (д шир., J=9,0 Гц, 2H); 7,85 (д, J=9,0 Гц, 1H); 7,93 (дд,J=I,5 и 7,5 Гц, 1H); 8,09 (дд, J=1,5 и 7,5 Гц, 1H); 10,95 (с шир., 1H); 11,9-12,4 (м очень ушир.,1 Н). Спектр MC (ES+): m/z=433 [MH+] Пример 3. 6-[4-(2,3-Дихлорбензолсульфониламино)фенил]-1 Н-индазол-3-иламид 3 тиофенкарбоновой кислоты К раствору 1,72 г гидрохлорида 6-(4-аминофенил)-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазола в 69 мл пиридина добавляют при 0C раствор 1,14 г 2,3-дихлорбензолсульфонилхлорида в 23 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при температуре около 20C, затем концентрируют при пониженном давлении. Сухой остаток разбавляют этилацетатом, промывают водой, затем насыщенным раствором хлорида натрия и концентрируют при пониженном давлении. Полученную воздушную массу очищают флэш-хроматографией, элюируя смесью дихлорметан, метанол, ацетонитрил К раствору 0, 63 г 6-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-7 фтор-1 Н-индазола в 20 мл метанола добавляют 1,74 мл 4 н раствора хлористо-водородной кислоты в диоксане. Реакционную смесь перемешивают в течение 14 ч при температуре около 20C, затем концентрируют при пониженном давлении. Твердый остаток перемешивают с 10 мл изопропилового эфира,фильтруют и центрифугируют с получением 0,52 г гидрохлорида 6-(4-аминофенил)-1-[3-(тиофен-3 ил)карбониламино]-7-фтор-1 Н-индазола, имеющего следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 2932; 1728; 1607; 1519; 1504; 1432; 1380; 1288; 1194; 1091; 914; 758 и 701 см-1 Спектр ЯМР 1H (400 МГц, (CD3)2SOв м.д.): 7,18 (дд, J=7,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,33 (д шир., J=8,5 Гц,2H); 7,62-7,76 (м, 5H); 8,49 (м, 1H); 10,9 (с, 1H); 13,3-13,6 (м, очень ушир., 1H). 6-(4-Трет-бутоксикарбониламинофенил)-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-7-фтор-1 Н-индазол К раствору 0,54 г 6-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)-3-амино-7-фтор-1 Н-индазола в 10 мл пиридина добавляют при 15 С 0,23 г 3-хлоркарбонилтиофена. Реакционную смесь перемешивают 12 ч при температуре около 20 С, затем разбавляют в 50 мл дихлорметана и промывают с 450 мл дистиллированной воды. Органическую фазу концентрируют при пониженном давлении. Полученный твердый остаток перемешивают с 10 мл изопропилового эфира, фильтруют и центрифугируют с получением 0,63 г 6-(4-аминофенил)-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-7-фтор-1 Н-индазола, имеющего следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 3248; 2977; 1723; 1658; 1591; 1533; 1342; 1238; 1160; 1052 и 805 см-1 Спектр ЯМР 1H (400 МГц, (CD3)2SOв м.д.): 1,52 (с, 9H); 7,17 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,56 (д шир.,J=8,5 Гц, 2H); 7,59-7,65 (м, 3H); 7,70 (дд, J=3,0 и 5,0 Гц, 1H); 7,74 (дд, J=1,5 и 5,0 Гц, 1H); 8,50 (дд, J=1,5 и 3,0 Гц, 1H); 9,52 (с, 1H); 10,8 (с, 1H), 13,4 (с шир., 1H). 3-Амино-7-фтор-6-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)-1H-индазол К раствору 0,8 г 2,3-дифтор-4-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)бензонитрила в 25 мл абсолютного этанола добавляют 0,35 мл гидразингидрата. Реакционную смесь перемешивают 19 ч при кипячении растворителя с обратным холодильником, затем концентрируют при пониженном давлении. Твердый остаток перемешивают с 25 мл дистиллированной воды, фильтруют и промывают с 25 мл дихлорметана. После центрифугирования получают 0,54 г 3-амино-7-фтор-6-(4-третбутоксикарбониламинофенил)-1 Н-индазола, который имеет следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 3422; 3374; 2981; 1732; 1612; 1530; 1368; 1222; 1159; 1050; 844 и 806 см-1 Спектр ЯМР 1H (400 МГц, (CD3)2SOв м.д.): 1,52 (с, 9H); 5,50 (с, 2H); 6,98 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,48-7,61 (м, 5H); 9,48 (с, 1H); 11,9 (с шир., 1H). 2,3-Дифтор-4-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)бензонитрил К раствору 2,3-дифтор-4-трифторметилсульфонилоксибензонитрила в 60 мл диоксана добавляют в атмосфере аргона 1,24 г 4-(трет-бутоксикарбониламино)фенилбороновой кислоты. Добавляют раствор 1,03 г карбоната натрия в 15 мл воды, затем 0,48 г тетракис-трифенилфосфинпалладия. Реакционную смесь перемешивают 3 часа при 90C, затем выливают в 80 мл дистиллированной воды. После экстрагирования этилацетатом, затем промывки насыщенным раствором хлорида натрия органическую фазу концентрируют при пониженном давлении с получением 0,8 г 2,3-дифтор-4-(4-третбутоксикарбониламинофенил)бензонитрила, который имеет следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 3345; 2981; 2247; 1719; 1595; 1532; 1470; 1409; 1325; 1239; 1158; 1057; 898; 825; 665 и 522 см-1 Спектр MC (ES+) : m/z=331 [MH+] 2,3-Дифтор-4-трифторметилсульфонилоксибензонитрил К раствору 2 г 2,3-дифтор-4-гидроксибензонитрила в 20 мл диметилформамида добавляют небольшими порциями 0,43 г гидрида натрия. После перемешивания в течение 10 мин при комнатной температуре добавляют 4,84 г N-фенилтрифторметилсульфонимида. После 10 ч перемешивания при температуре около 20C реакционную смесь выливают в 100 мл дистиллированной воды и экстрагируют этилацета- 10012702 том. Органическую фазу промывают насыщенным раствором хлорида натрия, затем концентрируют при пониженном давлении с получением 3,68 г масла, которое очищают флэш-хроматографией на колонке из диоксида кремния (60; 35-70 мкМ), элюируя смесью циклогексанэтилацетат (92/8 об.), и получают 0,52 г 2,3-дифтор-4-трифторметилсульфонилоксибензонитрила, который имеет следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 2245; 1497; 1442; 1232; 1138; 1035; 960; 834 и 603 см-1 Спектр MC (ES+): m/z=288 [MH+] Пример 5. 6-[4-(2,3-Дихлорбензолсульфониламино)-7-фторфенил]-1 Н-индазол-3-иламид 3 тиофенкарбоновой кислоты К раствору гидрохлорида 6-(4-аминофенил)-7-фтор-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазола в 20 мл пиридина добавляют при 0C раствор 0,315 г 2,3-дихлорбензолсульфонилхлорида в 6,5 мл дихлорметана. Реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч при температуре около 20C, затем концентрируют при пониженном давлении. Сухой остаток разбавляют дихлорметаном, промывают водой, затем насыщенным раствором хлорида натрия и концентрируют при пониженном давлении. Полученную воздушную массу очищают флэш-хроматографией, элюируя смесью дихлорметан, метанол, ацетонитрил К раствору 0,88 г гидрохлорида 6-(4-аминофенил)-7-фтор-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Ниндазола в 80 мл тетрагидрофурана добавляют 0,46 г 2-фтор-5-трифторметилфенилизоцианата и 0,636 мл триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают в течение 12 ч при температуре около 20C, затем концентрируют при пониженном давлении. После очистки флэш-хроматографией на колонке из диоксида кремния(60; 35-70 мкМ), элюируя смесью дихлорметан, ацетонитрил, метанол (96/2/2 об.) получают 0,51 г 1-(47-фтор-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида, который имеет следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 3418; 1659; 1608; 1542; 1442; 1339; 1264; 1200; 1122; 741 и 614 см-1 Спектр ЯМР 1H (400 МГц, (CD3) 2SOв м.д.): 7,20 (дд, J=7,5 и 9,0 Гц, 1H); 7,42 (м, 1H); 7,53 (дд,J=9,0 и 10,5 Гц, 1H); 7,60-7,72 (м, 6H); 7,74 (дд, J=1,0 и 5,0 Гц, 1H); 8,49 (дд, J=1,0 и 3,0 Гц, 1H); 8,65 (дд,J=2,5 и 7,5 Гц, 1H); 9,04 (м шир, 1H); 9,44 (с шир., 1H); 10,8 (с шир., 1H); 13,4 (с очень шир., 1H). 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(2-фтор-5 Гидрохлорид 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида получают гидролизом 37%-ым раствором хлористо-водородной кислоты (4,2 мл) в этаноле при кипячении с обратным холодильником в течение 24 ч 1-(4-7-фтор-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Ниндазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении и получают остаток, который перемешивают с 15 мл ацетонитрила. После фильтрации и сушки под вакуумом получают 0,38 г гидрохлорида 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6 ил)фенил]-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида, имеющего следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 3327; 3168; 1653; 1601; 1544; 1443; 1342; 1322; 1187; 1117; 1070; 809 и 615 см-1 Спектр ЯМР 1H (400 МГц, (CD3)2SOв м.д.): 7,08 (дд, J=6,5 и 8,0 Гц, 1H); 7,42 (м, 1H); 7,49-7,65 (м,6H); 8,65 (дд, J=2,5 и 7,0 Гц, 1H); 8,99 (д, J=3,5 Гц, 1H); 9,40 (с, 1H); 11,8-12,5 (м, очень ушир., 1H). Пример 8. Гидрохлорид 1-[4-(3-амино-1 Н-индазол-6-ил)-7-фторфенил]-2,3-дихлорбензолсульфонамида Гидрохлорид 1-[4-(3-амино-1 Н-индазол-6-ил)-7-фторфенил]-2,3-дихлорбензолсульфонамида получают гидролизом 37%-ым раствором хлористо-водородной кислоты (1,36 мл) в 11 мл этанола при кипячении, с обратным холодильником в течение 16 ч 0,15 г 6-[4-(2,3-дихлорбензолсульфониламино)-7 фторфенил]-1H-индазол-3-иламида 3-тиофенкарбоновой кислоты. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении и получают остаток, который перемешивают с 5 мл ацетонитрила. После фильтрации получают 90 г гидрохлорида 1-[4-(3-амино-1 Н-индазол-6-ил)-7-фторфенил]-2,3 дихлорбензолсульфонамида, имеющего следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 3435; 1656; 1507; 1404; 1164; 1139; 912; 704 и 593 см-1 Спектр ЯМР 1H (400 МГц, (CD3)2SOв м.д.): 7,00 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,22 (д шир., J=8,5 Гц,2H); 7,50 (д шир., J=8,5 Гц, 2H); 7,54-7,62 (м, 2H); 7,94 (дд, J=1, 5 и 7,5 Гц, 1H); 8,10 (дд, J=1,5 и 7,5 Гц,1H); 11,0 (с шир., 1H). Спектр MC (EI): m/z=450 [M+0] Пример 9. 1-(4-4,5,7-Трифтор-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2 фтор-5-трифторметилфенил)карбамид К раствору 0,175 г гидрохлорида 6-(4-аминофенил)-4,5,7-трифтор-1-[3-(тиофен-3 ил)карбониламино]-1 Н-индазола в 10 мл тетрагидрофурана добавляют 84,5 мг 2-фтор-5 трифторметилфенилизоцианата и 0,58 мкл триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч при температуре около 20C, затем концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток перемешивают с 15 мл этилацетата, затем фильтруют и центрифугируют с получением 29 мг 1-(4-4,5,7-трифтор-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Ниндазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида, который имеет следующие характеристики:(м очень ушир., 1H). Спектр MC (ES+): m/z=594 [MH+] Гидрохлорид 6-(4-аминофенил)-4,5,7-трифтор-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазола К раствору 0,65 г 6-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-4,5,7 трифтор-1H-имидазола в 10 мл метанола добавляют 1,66 мл 4 н раствора хлористо-водородной кислоты в диоксане. Реакционную смесь перемешивают в течение 48 ч при температуре около 20C, затем фильтруют и центрифугируют с получением 0,21 г гидрохлорида 6-(4-аминофенил)-1-[3-(тиофен-3 ил)карбониламино]-4,5,7-трифтор-1H-индазола, который имеет следующий характеристики; Спектр MC (ES+): m/z=389 [MH+] 6-(4-Трет-бутоксикарбониламинофенил)-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-4,5,7-трифтор-1 Нимидазол К раствору 0,5 г 6-бром-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-4,5,7-трифтор-1 Н-индазола в 40 мл диоксана добавляют 0,31 г 4-(трет-бутилоксикарбониламино)фенилбороновой кислоты. Добавляют раствор 0,42 г карбоната натрия в 5 мл воды, затем 0,184 г тетракис-трифенилфосфинпалладия. Реакционную смесь перемешивают 42 ч при 90C, затем выливают в 40 мл дистиллированной воды. После экстрагирования дихлорметаном, затем промывки насыщенным раствором хлорида натрия, органическую фазу концентрируют при пониженном давлении и получают твердое вещество, которое очищают флэшхроматографией на колонке из диоксида кремния (60; 35-70 мкМ), элюируя смесью циклогексанэтилацетат (50/50 об.) и получают 0,65 г 6-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)-1-[3-(тиофен-3 ил)карбониламино]-4,5,7-трифтор-1 Н-индазола, имеющего следующие характеристики: Спектр MC (ES+): m/z=489 [MH+] 6-Бром-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-4,5,7-трифтор-1 Н-индазол К раствору 1,8 г 6-бром-1-[(тиофен-3-ил)карбонил]-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-4,5,7 трифториндазола в 130 мл диоксана добавляют 1,1 г карбоната натрия, растворенного в 45 мл воды. Реакционную смесь нагревают 4 ч при 90C, затем концентрируют при пониженном давлении и получают твердое вещество, которое очищают флэш-хроматографией на колонке с диоксидом кремния (60; 35-70 мкМ), элюируя смесью циклогексан-этилацетат (85/15 об.) и получают 0,32 г 6-бром-1-[3-(тиофен-3 ил)карбониламино]-4,5,7-трифтор-1 Н-индазола, имеющего следующие характеристики: Спектр MC (ES+): m/z=377 [MH+] 6-Бром-1-[(тиофен-3-ил)карбонил]-3-[(тиофен-3-ил) карбониламино] -4, 5, 7-трифтор-1 Н-индазол К раствору 3 г 6-бром-3-амино-4,5,7-трифтор-1 Н-индазола в 60 мл пиридина добавляют 3,3 г хлорангидрида 3-тиофенкарбоновой кислоты. Реакционную смесь перемешивают в атмосфере аргона в течение 16 ч при температуре около 25 С, затем выливают в 120 мл воды. Суспензию промывают с 2100 мл дихлорметана, затем фильтруют, центрифугируют и сушат с получением 1,85 г 6-бром-1-[(тиофен-3 ил)карбонил]-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-4,5,7-трифториндазола, имеющего следующие характеристики: Спектр MC (ES+): m/z=487 [MH+] 6-Бром-3-амино-4,5,7-трифтор-1 Н-индазол К раствору 5 г 4-бром-2,3,5,6-тетрафторбензонитрила в 90 мл этанола добавляют 9,7 мл гидразингидрата. Реакционную смесь перемешивают 17 ч при кипячении с обратным холодильником, затем концентрируют при пониженном давлении. Полученный остаток перемешивают в течение 30 мин в 80 мл дистиллированной воды. Суспензию твердого вещества фильтруют, промывают водой и центрифугируют, затем растирают в 200 мл этилового эфира и фильтруют с получением 1,03 г 6-бром-3-амино-4,5,7 трифтор-1 Н-индазола, который имеет следующие характеристики: Спектр MC (ES+) : m/z=267 [MH+] Пример 10. 1-(4-3-[(Тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5 трифторметилфенил)карбамид Работают согласно методу, описанному в примере 1, и получают 1-(4-3-[(тиофен-3 ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамид в виде твердого вещества желтого цвета, которое имеет следующие характеристики: К раствору 0,610 г гидрохлорида N-[(7-фтор-6-3-фтор-4-аминофенил-1 Н-индазол-3-ил)]тиофен-3 карбоксамида в 30 мл тетрагидрофурана добавляют 0,3 г 2-фтор-5-трифторметилфенилизоцианата и 0,211 мл триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают в течение 12 ч при температуре около 20C, затем концентрируют при пониженном давлении. После очистки флэш-хроматографией на колонке из диоксида кремния с элюированием смесью циклогексана и этилацетата (50/50 об.) получают после выпаривания растворителей 0,287 г вещества в виде порошка желтого цвета, которое перекристаллизовывают из этилацетата. Получают 0,154 г 1-(4-7-фтор-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-ил-2-фторфенил)-3-(2 фтор-5-трифторметилфенил)карбамид в виде твердого вещества белого цвета, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 300 МГц получают на спектрометре Bruker Avance DPX-300 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 7,21 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,41 (м, 1H); 7,50 (т, J=9,0 Гц, 1H); 7,59 (д шир., J=12,0 Гц, 1H); 7,63 (д,J=8,5 Гц, 1H); 7,69 (дд, J=2,5 и 5,0 Гц, 1H); 7,72 (дд, J=1,5 и 5,0 Гц, 1H); 8,32 (т, J=8,5 Гц, 1H); 8,48 (м шир., 1H); 8,67 (дд, J=2,5 и 7,5 Гц, 1H); 9,34 (м ушир., 1H); 9,46 (м ушир., 1H); 10,8 (м очень ушир., 1H); 13,45 (м очень ушир. 1H). Спектр ИК (KBr): 3435; 1706; 1547; 1442; 1341; 1265; 1200; 1127 и 822 см-1 Спектр MC (ES+): m/z=57 6 [MH+]N-[(7-Фтор-6-3-фтор-4-аминофенил-1 Н-индазол-3-ил)]тиофен-3-карбоксамид К раствору 0,99 г N-[(7-фтор-6-3-фтор-4-трет-бутоксикарбониламинофенил-1 Н-индазол-3 ил)]тиофен-3-карбоксамида в 30 мл метанола добавляют при комнатной температуре 2,63 мл 4 н раствора хлористо-водородной кислоты в диоксане. Реакционную смесь нагревают 4 ч при 40C, затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученное твердое вещество растирают в изопропиловом эфире, фильтруют. После сушки под вакуумом получают 0,99 г N-[(7-фтор-6-3-фтор-4-аминофенил-1 Н-индазол-3 ил)]тиофен-3-карбоксамида в виде твердого вещества желтого цвета, которое имеют следующие характеристики: Спектр MC (ES+): m/z=370 [MH+](7-Фтор-6-3-фтор-4-трет-бутилоксикарбониламинофенил-1H-индазол-3-ил)-тиофен-3-карбоксамид К раствору 1,5 г трет-бутил-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)-2-фторфенил]карбамата в 34 мл пиридина добавляют при 15 С 0,61 г 3-тиофенкарбонилхлорида. Реакционную смесь перемешивают 18 ч,затем выливают в дистиллированную воду, экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу промывают несколько раз дистиллированной водой, затем насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над сульфатом магния, затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Получают 1,58 г (7 фтор-6-3-фтор-4-трет-бутилоксикарбониламинофенил-1 Н-индазол-3-ил)тиофен-3-карбоксамида в виде твердого вещества кремового цвета, которое имеет следующие характеристики: Спектр MC (EI) : m/z=470 [M+0] Трет-бутил-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)-2-фторфенил]карбамат К раствору 1,49 г трет-бутил-(4'-циано-3,2',3'-трифтордифенил-4-ил)карбамата в 40 мл этанола добавляют 2,14 г гидразингидрата, затем нагревают с обратным холодильником в течение 18 ч. Реакционную смесь концентрируют досуха при пониженном давлении, поглощают дистиллированной водой, полученный твердый продукт фильтруют и сушат. Получают 1,5 г трет-бутил-[4-(3-амино-7-фтор-1 Ниндазол-6-ил)-2-фторфенил]карбамата в виде твердого вещества белого цвета, который имеет следующие характеристики:- 14012702 Спектр MC (EI) : m/z=360 [M+0] Трет-бутил-(4'-циано-3,2',3'-трифтордифенил-4-ил)карбамат К раствору 3,75 г трифторметансульфоната 4-циано-2,3-дифторфенила в 220 мл диоксана добавляют при комнатной температуре 5 г N-Boc-4-амино-3-фторфенилбороновой кислоты, 3,87 г карбоната натрия, растворенного в 56 мл дистиллированной воды, затем 1,81 г тетракис-трифенилфосфинпалладия. Реакционную смесь нагревают 3 ч с обратным холодильником, затем после охлаждения выливают в дистиллированную воду. Эту смесь экстрагируют этилацетатом, органическую фазу декантируют, промывают несколько раз дистиллированной водой, затем насыщенным водным раствором хлорида натрия,сушат над сульфатом магния, затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный твердый продукт хроматографируют на колонке с диоксидом кремния (элюант: циклогексан/этилацетат 90/10 об.). После выпаривания досуха при пониженном давлении фракций, содержащих желаемый продукт, получают 0,75 г трет-бутил-(4'-циано-3,2',3'-трифтордифенил-4-ил)карбамата в виде твердого продукта бледно-розового цвета, имеющего следующие характеристики: Спектр MC (EI) : m/z=348 [M+] Трифторметансульфонат 4-циано-2,3-дифторфенила К раствору 5 г 2,3-дифтор-4-гидроксибензонитрила в 60 мл диметилформамида добавляют при комнатной температуре 1,05 г 75%-го гидрида натрия, затем 12,09 г N-фенилтрифторметансульфонимида. Реакционную смесь перемешивают 18 ч при комнатной температуре, затем выливают в дистиллированную воду. Эту смесь экстрагируют этилацетатом, органическую фазу декантируют, промывают несколько раз дистиллированной водой, затем насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над сульфатом магния, затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный твердый продукт хроматографируют на колонке с диоксидом кремния (элюант: циклогексан/этилацетат 80/20 об.). После выпаривания при пониженном давлении досуха фракций, содержащих желаемый продукт, получают 3,34 г трифторметансульфоната 4-циано-2,3-дифторфенила в виде подвижного масла, которое имеет следующие характеристики: Спектр MC (EI) : m/z=287 [M+] Пример 12. 1-(4-7-Фтор-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-фенилкарбамид Работают согласно методу, описанному в примере 6, и получают 1-(4-7-фтор-3-[(тиофен-3 ил)карбониламино]-1H-индазол-6-илфенил)-3-фенилкарбамид в виде твердого вещества желтого цвета,которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 300 МГц снимался на спектрометре Bruker Avance DPX-300 при химических сдвигах ( в м.д.) в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6) при 2,50 м.д.: 6,99 (т шир., J=7,5 Гц, 1H); 7,19 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,30 (т шир., J=7,5 Гц, 2H); 7,49 (д шир., J=7,5 Гц, 2H); 7,52-7,65 (м,5H); 7,69 (дд, J= 3,0 и 5,0 Гц, 1H) ; 7,72 (д шир. J=5,0 Гц, 1H); 8,48 (м, шир., 1H); 8,83 (с шир. 1H); 8,95 (с шир., 1H); 10,8 (с шир. 1H).; 13,35 (с шир., 1H). Спектр ИК (KBr): 3396; 1650; 1597; 1532; 1498; 1234; 742 и 693 см-1 Спектр MC (ES+): m/z=472 [MH+] Пример 13. 1-(4-7-Фтор-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(5-третбутилизоксазол-3-ил)карбамид Работают согласно методике, описанной в примере 6 и получают 1-(4-7-фтор-3-[(тиофен-3 ил)карбониламино]-1H-индазол-6-илфенил)-3-(5-трет-бутилизоксазол-3-ил)карбамид в виде твердого вещества желтого цвета, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 300 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-300 при химических сдвигах ( в м.д.) в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 Работают согласно методике, описанной в примере 6, и получают 1-(4-7-фтор-3-[(тиофен-3 ил)карбониламино]-1H-индазол-6-илфенил)-3-(2-фторфенил)карбамид в виде твердого вещества желтого цвета, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 300 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-300 при химических сдвигах ( в м.д.) в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д: 7,02 (м, 1H); 7,10-7,30 (м, 3H); 7,52-7,65 (м, 5H); 7,68 (дд, J=3,0 и 5,0 Гц, 1H); 7,72 (д шир., J=5,0 Гц,1H); 8,18 (дт, J=2,0 и 8,5 Гц, 1H); 8,47 (м шир. 1H); 8,65 (м шир. 1H); 9,30 (с шир., 1H); 10,8 (м ушир., 1H); 13,35 (м ушир., 1H). Спектр ИК (KBr): 3267; 1650; 1598; 1532; 1455; 1249; 1184 и 746 см-1 Спектр MC (ES+): m/z=490 [MH+] Пример 15. 1-(4-7-Фтор-3-[(тиофен-3-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(5 трифторметилфенил)карбамид Работают согласно методике, описанной в примере 6, и получают 1-(4-7-фтор-3-[(тиофен-3 ил)карбониламино]-1H-индазол-6-илфенил)-3-(5-трифторметилфенил)карбамид в виде твердого вещества белого цвета, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 300 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-300 при химических сдвигах ( в м.д.) в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 7,19 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,31 (д шир., J=7,5 Гц, 1H); 7,52 (т, J=7,5 Гц, 1H); 7,55-7,68 (м, 6H) ; 7,68 Работают согласно методике, описанной в примере 6, и получают 1-(4-7-фтор-3-[(тиофен-3- 16012702 ил)карбониламино]-1H-индазол-6-илфенил)-3-(5-трет-бутил-2-п-толил-2 Н-пиразол-3-ил)карбамид в виде твердого вещества желтого цвета, которое имеет следующие характеристики: Температура плавления: 196-197 С Спектр ЯМР 1H при 300 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-300 при химических сдвигах ( в м.д.) в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 1,29 (с, 9H); 2,39 (с, 3H); 6,37 (с, 1H); 7,16 (м, 1H); 7,32 (д шир., J=8,5 Гц, 2H); 7,42 (д шир., J=8,5 Гц,2H) ; 7,56 (с шир., 4H); 7,61 (д, J=8,5 Гц, 1H); 7,68 (м шир., 1H); 7,72 (дд, J=1,5 и 5,0 Гц, 1H); 8,47 (м шир.,1H); 8,67 (м ушир., 1H); 9,42 (м ушир., 1H); 10,75 (с шир., 1H); 13,45 (м ушир., 1H). Спектр ИК (KBr): 3435; 1646; 1533; 1410; 1202; 823 и 741 см-1 Спектр MC (ES+): m/z=608 [MH+] Пример 17. 1-(4-7-Фтор-3-[(фуран-2-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5 трифторметилфенил)карбамид К раствору 223,7 мг 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(2-фтор-5 трифторметилфенил)карбамида (полученного согласно методике, описанной в примере 7) в 5 мл пиридина добавляют при комнатной температуре 65,3 мг 2-фуроилхлорида. Реакционную смесь перемешивают 48 ч при комнатной температуре, затем выливают в дистиллированную воду. Эту смесь экстрагируют этилацетатом, органическую фазу декантируют, промывают несколько раз дистиллированной водой, затем насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над сульфатом магния, затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный твердый продукт хроматографируют на колонке с диоксидом кремния (элюант: циклогексан/этилацетат: 50/50 об.). После выпаривания при пониженном давлении досуха фракций, содержащих желаемый продукт, получают 72 мг твердого белого вещества, которое снова очищают методом LC/MC. Получают 22,7 мг 1-(4-7-фтор-3-[(фуран-2-ил)карбониламино]-1 Ниндазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида в форме твердого продукта бледножелтого цвета, который имеет следующие характеристики: Температура плавления: 152-153 С. Спектр ЯМР 1H при 400 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-400 при химических сдвигах ( в м.д.) в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 6,72 (дд, J=2,0 и 3,5 Гц, 1H); 7,19 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,40 (м, 1H); 7,47-7,54 (м, 2H); 7,58-7,65 (м,5H); 7,98 (м шир., 1H); 8,62 (дд, J=2,5 и 7,5 Гц, 1H); 9,02 (д шир., J=2,0 Гц, 1H); 9,41 (с шир., 1H); 10,85 (с шир., 1H); 13,4 (с шир., 1H). Спектр ИК (KBr): 3435; 1669; 1603; 1545; 1442; 1341; 1122; 711 и 614 см-1 Спектр MC (EI): m/z=541 [M+0]. Пример 18. 1-(4-7-Фтор-3-[(фенилкарбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5 трифторметилфенил)карбамид К раствору 223,7 мг 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида (полученного согласно методике, описанной в примере 7) в 5 мл пиридина добавляют при комнатной температуре 70 мг бензоилхлорида. Реакционную смесь перемешивают 48 ч при комнатной температуре, затем выливают в дистиллированную воду. Эту смесь экстрагируют этилацетатом, органическую фазу декантируют, промывают несколько раз дистиллированной водой, затем насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над сульфатом магния, затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный твердый продукт хроматографируют на колонке с диоксидом кремния (элюант; циклогексан/этилацетат 50/50 об.). После выпаривания при пониженном давлении досуха фракций, содержащих желаемый продукт, получают 115 мг твердого вещества серовато-бежевого цвета, которое снова очищают методом LC/MC. Получают 46 мг 1-(4-7-фтор-3-[фенилкарбониламино]1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида в виде твердого продукта бледно- 17012702 желтого цвета, который имеет следующие характеристики: Температура плавления: 206-207C Спектр ЯМР 1H при 400 МГц получали на спектрометре Bruker Avarice DPX-400 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 7,19 (т, шир. J=7,5 Гц, 1H); 7,40 (м, 1H); 7,47-7,67 (м, 9H); 8,09 (д шир., J=8,5 Гц, 2H); 8,62 (дд, J=2,0 и 7,5 Гц, 1H); 9,19 (с шир., 1H); 9,60 (с шир., 1H); 10,9 (с шир., 1H); 13,4 (м ушир., 1H). Спектр ИК (KBr): 3419; 1669; 1599; 1552; 1443; 1342; 1190; 1118; 804; 760 и 614 см-1 Спектр MC (EI): m/z=551 [M+0] Пример 19. 1-[4-(3-Амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(3-трифторметилфенил)карбамид К раствору 150 мг 6-(4-аминофенил)-7-фтор-1 Н-индазол-3-иламина в 7 мл безводного тетрагидрофурана добавляют при комнатной температуре 128,7 мг 3-трифторметилфенилизоцианата. Реакционную смесь перемешивают 18 часов при комнатной температуре, затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный твердый продукт очищают методом LC/MC. Получают 84 мг 1-[4-(3-амино 7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(3-трифторметилфенил)карбамида в виде твердого белого продукта,который имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 300 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-300 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 5,47 (с шир., 2H); 6,99 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,30 (д шир., J=7,5 Гц, 1H); 7,47-7,69 (м, 7H); 8,04 (с шир., 1H); 9,60 (м ушир., 1H); 9,78 (м ушир., 1H); 11,85 (с шир., 1H). Спектр ИК (KBr): 3403; 1658; 1605; 1533; 1448; 1338; 1125; 798 и 698 см-1 Спектр MC (ES+): m/z=430 [MH+] 6-(4-Аминофенил)-7-фтор-1 Н-индазол-3-иламин К суспензии 3 г трет-бутил-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]карбамата в 60 мл дихлорметана добавляют при комнатной температуре 6 мл трифторуксусной кислоты. Реакционную смесь перемешивают 18 ч при комнатной температуре, концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученное твердое вещество поглощают этилацетатом, раствор обрабатывают 4 н водным раствором щелочи натрия, затем декантируют. Органическую фазу затем промывают дистиллированной водой, затем насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над сульфатом магния, затем фильтруют и концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный твердый продукт желтого цвета (2,08 г) хроматографируют на колонке с диоксидом кремния (элюант: этилацетат), После выпаривания при пониженном давлении досуха фракций, содержащих желаемый продукт, получают 1,88 г 6-(4-аминофенил)-7 фтор-1 Н-индазол-3-иламина в виде твердого вещества желтого цвета, который имеет следующие характеристики: Спектр MC (EI) : m/z=242 [M+0] Трет-бутил-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]карбамат Суспензию 7,89 г трет-бутил-(4'-циано-2',3'-дифтордифенил-4-ил)карбамата в 50 мл изопропанола нагревают до 50C, затем при этой же температуре в суспензию вводят 5,8 мл гидразингидрата. Реакционную смесь перемешивают в течение 18 ч с обратным холодильником, затем выливают после охлаждения в 500 мл дистиллированной воды. Образовавшийся белый осадок фильтруют и сушат в вакууме при 50 С. Получают 8,39 г трет-бутил-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]карбамата в виде твердого вещества желтого цвета, который имеет следующие характеристики: Спектр MC (ES): m/z=343 [MH+] Трет-бутил-(4'-циано-2',3'-дифтордифенил-4-ил)карбамат К раствору 7 г трифторметансульфоната 4-циано-2,3-дифторфенила в 400 мл диоксана добавляют при комнатной температуре 8,67 г N-Boc-4-амино-3-фторфенилбороновой кислоты, 7,235 г карбоната натрия, растворенного в 100 мл дистиллированной воды, затем 3,38 г тетракистрифенилфосфинпалладия. Реакционную смесь нагревают 3 ч при 90C, затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный твердый продукт обрабатывают этилацетатом, эту органическую фазу промывают несколько раз дистиллированной водой, затем насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над сульфатом магния, концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученный твердый продукт хроматографируют на колонке с диоксидом кремния (элюант: циклогексан/этилацетат 90/10 об.). После выпаривания досуха при пониженном давлении фракций, содержащих желаемый продукт, получают 7,89 г трет-бутил-(4'-циано-3,2',3'-трифтордифенил-4-ил)карбамата в фор- 18012702 ме твердого продукта беловато-кремового цвета, который имеет следующие характеристики: Спектр MC (EI): m/z=330 [M+0] Пример 20. 1-[4-(3-Амино-7-фотор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-фенилкарбамид Работают согласно методике, описанной в примере 19, и получают 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Ниндазол-6-ил)фенил]-3-фенилкарбамид в виде твердого белого вещества, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 300 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-300 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 5,46 (с шир., 2H); 6,98 (м, 2H); 7,29 (т шир., J=8,0 Гц, 2H); 7,45-7,61 (м, 7H); 8,93 (м ушир., 1H); 9,03 Работают согласно методике, описанной в примере 19, и получают 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Ниндазол-6-ил)фенил]-3-(5-трет-бутилизоксазол-3-ил)карбамид в виде твердого белого вещества, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 300 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-300 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 1,30 (с, 9H); 5,47 (с.шир., 2H); 6,52 (с, 1H); 6,98 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,50-7,61 (м, 5H); 9,22 (м ушир., 1H); 9,79 (м ушир., 1H); 11,85 (с шир., 1H). Спектр ИК (KBr): 3414; 1696; 1607; 1530; 1431; 1317; 1202; 912 и 800 см-1 Спектр MC (EI): m/z=408 [MH+0] Пример 22. 1-[4-(3-Амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(2-фторфенил)карбамид Работают согласно методике, описанной в примере 19, и получают 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Ниндазол-6-ил)фенил]-3-(2-фторфенил) карбамид в виде твердого белого вещества, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 300 МГц получали на спектрометре Bruker Avarice DPX-300 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 5,47 (с шир. 2H); 6,98 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,03 (м, 1H); 7,15 (т шир., J=8,5 Гц, 1H); 7,24 (ддд,J=2,0-8,5 и 12,0 Гц, 1H); 7,50-7,61 (м, 5H); 8,16 (дт, J=2,0 и 8,5 Гц, 1H); 8,65 (м ушир., 1H);9,27 (с шир.,1H); 11,85 (с шир., 1H). Спектр ИК (KBr): 3347; 1655; 1603; 1533; 1457; 1251; 1193; 797 и 752 см-1 Спектр MC (EI): m/z=37 9 [MH+0] Работают согласно методике, описанной в примере 11, и получают 1-(4-7-фтор-3-[(тиофен-3 ил)карбониламино]-1H-индазол-6-ил-2-метилфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамид в виде твердого продукта бледно-желтого цвета, который имеет следующие характеристики: Температура плавления: 312-313C Спектр ЯМР 1H при 400 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-400 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 2,37 (с, 3H); 7,18 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,39 (м, 1H); 7,43-7,54 (м, 3H); 7,62 (д, J=8,5 Гц, 1H); 8,68 Работают согласно методике, описанной в примере 11, и получают 1-(5-7-фтор-3-[(тиофен-3 ил)карбониламино]-1H-индазол-6-илпиридин-2-ил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамид в виде твердого вещества, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 400 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-400 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 7,24 (дд, J=6,5 и 8,5 Гц, 1H); 7,45 (м, 1H); 7,55 (дд, J=8,5 и 11,0 Гц, 1H); 7,63-7,70 (м, 3H); 7,73 (дд,J=1,5 и 5,0 Гц, 1H); 8,11 (дм, J=8,5 Гц, 1H); 8,47 (м, 1H); 8,58 (м, 1H); 8,69 (дд, J=2,5 и 7,5 Гц, 1H); 10,1 (с,1H); 10,8 (с, 1H); 11,6 (с шир., 1H); 13,5 (м ушир., 1H). Спектр MC (ES+): m/z=559 [MH+] Пример 25. 1-[4-(3-Амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3-(5-трет-бутил-2-п-толил-2H-пиразол 3-ил)карбамид Работают согласно методике, описанной в примере 19, и получают 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Ниндазол-6-ил)фенил]-3-(5-трет-бутил-2-п-толил-2 Н-пиразол-3-ил)карбамид в виде твердого белого вещества, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 400 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-400 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 1,29 (с, 9H); 2,38 (с, 3H); 5,48 (с шир. 2H); 6,38 (с, 1H); 6,97 (м, 1H); 7,34 (д шир., J=8,5 Гц, 2H); 7,41 К раствору 0,23 г 1-(4-7-фтор-3-[(N-Вос-L-пирролидин-2-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6 илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбоксамида в 20 мл диоксана добавляют при комнатной температуре 1 мл 4 н водного раствора хлористо-водородной кислоты. Реакционную смесь перемешивают 3 ч при 50C, затем концентрируют досуха при пониженном давлении. Полученное твердое вещество поглощают дихлорметаном, осадок фильтруют. Полученное твердое вещество (96 мг) очищают методомLC/MC. Получают 16 мг 1-(4-7-фтор-3-[(L-пирролидин-2-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида в виде твердого вещества бежевого цвета, которое имеют следующие характеристики: Спектр ИК (KBr): 3271; 1703; 1625; 1538; 1442; 1341;1257; 1198; 1117 и 807 см-1 Спектр MC (EI): m/z=544 [MH+0] 1-(4-7-Фтор-3-[(N-Boc-L-пирролидин-2-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5 трифторметилфенил)карбоксамид Работают согласно методике, описанной в примере 17, и получают 1-(4-7-фтор-3-[(N-Вос-Lпирролидин-2-ил)карбониламино]-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбоксамид в виде твердого вещества ярко желтого цвета, которое имеет следующие характеристики: Спектр MC (ES): m/z=645 [MH+] Пример 27. 1-(4-7-Фтор-3-ацетиламино-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамид Работают согласно методике, описанной в примере 17, и получают 1-(4-7-фтор-3-ацетиламино 1 Ниндазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамид в виде твердого вещества яркожелтого цвета, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 400 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-400 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д.: 2,11 (с, 3H); 7,14 (м, 1H); 7,40 (м, 1H); 7,50 (дд, J=8,5 и 11,0 Гц, 1H); 7,55-7,64 (м, 4H); 7,67 (д, J=8,5 Гц, 1H); 8,62 (дд, J=2,5 и 7,5 Гц, 1H); 9,11 (с шир., 1H); 9,50 (с шир., 1H); 10,5 (с шир., 1H); 13,2 (с шир.,1H). Спектр ИК (KBr): 3422; 1710; 1670; 1604; 1550; 1442; 1341; 1125; 818 и 614 см-1 Спектр MC (ES+) : m/z=490 [MH+] Пример 28. 1-(4-7-Фтор-3-формиламино-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамид Раствор 0,633 мл уксусного ангидрида и 0,253 мл муравьиной кислоты нагревают при 50C в течение 2 ч, затем к раствору прикапывают раствор 300 мг 1-[4-(3-амино-7-фтор-1 Н-индазол-6-ил)фенил]-3(2-фтор-5-трифторметилфенил)карбамида (полученного согласно методике, описанной в примере 7) в 7- 21012702 мл пиридина. Реакционную смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре, затем выливают в дистиллированную воду. Эту смесь фильтруют, затем полученное твердое вещество (256 мг) очищают методом LC/MC. Получают 34 мг 1-(4-7-фтор-3-формиламино-1 Н-индазол-6-илфенил)-3-(2-фтор-5 трифторметилфенил)карбамида в виде твердого вещества бежевого цвета, которое имеет следующие характеристики: Спектр ЯМР 1H при 300 МГц получали на спектрометре Bruker Avance DPX-300 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде - d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,50 м.д. после добавления одной капли уксусной кислоты -d4 (CD3COOD): Получают смесь 60-40% двух иминоспиртовых форм целевого продукта: 7,19 (м, 1H); 7,40 (м, 1H); 7,51 (м, 1H); 7,55-7,65 (м, 4H); 7,69 (д, J=8,5 Гц, 0,6H); 7,77 (д, J=8,5 Гц, 0,4H); 8,32 (с, 0,4H); 8,65 (дд,J=2,5 и 7,5 Гц, 1H); 8,98 (с, 0,6H). Спектр ИК (KBr): 3372; 3308;. 1680; 1604; 1551; 1443; 1341; 1263; 1118; 818 и 614 см-1 Спектр MC (EI): m/z=475 [MH+0] Пример 29. N-[6-(4-Аминофенил)-7-фтор-1 Н-индазол-3-ил]тиофен-3-карбоксамид К раствору 1,46 г 6-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-7 фтор-1 Н-индазола в 20 мл дихлорметана добавляют 10 мл трифторуксусной кислоты и 1 мл воды. Реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч при температуре около 20C, затем концентрируют при пониженном давлении. Твердый остаток поглощают этилацетатом и промывают насыщенным раствором бикарбоната натрия до получения водной фазы с рН 9, затем промывают водой. Органическую фазу концентрируют при пониженном давлении и получают 1,02 г N-[6-(4-аминофенил)-7-фтор-1 Н-индазол-3 ил]тиофен-3-карбоксамида с выходом 91%. Продукт имеет следующие характеристики: Анализ LC/MC: [М+Н]+=353,2; время удержания: 2,92 мин. Получение 6-(4-трет-бутоксикарбониламинофенил)-1-[3-(тиофен-3-ил)карбониламино]-7-фтор-1 Ниндазола описано в примере 4. Примеры 30-39. К раствору 100 мг (0,284 ммоль) N-[6-(4-аминофенил)-7-фтор-1 Н-индазол-3-ил]тиофен-3 карбоксамида в 4,5 мл пиридина добавляют при 0C растворы 0,284 ммоль сульфонилхлоридов в 1 мл дихлорметана. Реакционные смеси перемешивают в течение 72 ч при температуре около 20C, затем концентрируют при пониженном давлении. Твердые остатки поглощают метанолом и концентрируют при пониженном давлении. Сухие остатки поглощают в 1,5 мл смеси метанол/уксусная кислота/диметилсульфоксид и очищают методом препаративной LC/MC. Анализы ЯМР были осуществлены следующим образом: Спектр ЯМР 1H при 400 МГц на спектрометре Bruker Avance DPX-400 с химическими сдвигами ( в м.д.) - в растворителе-диметилсульфоксиде d6 (ДМСО-d6), стандартизированном при 2,5 м.д.: Продукты описаны в следующей таблице: Примеры 40-48. В трубках для СВЧ Emrys Optimizer помещались растворы каждого соединения примеров 30-39 в 1,78 мл метанола и 0,22 мл 37%-ого раствора хлористо-водородной кислоты и осуществляли реакции при встряхивании в микроволновой печи в течение 30 мин при 120C. Растворы концентрировали при пониженном давлении, поглощали в 1 мл диметилсульфоксида и очищали методом препаративной LC/MC. Анализы ЯМР проводили следующим образом: Спектр ЯМР 1H при 400 МГц на спектрометре Bruker Определение активности соединений. Описание методик проведения экспериментов 1. KDR Ингибирующее действие соединений определяли в тесте in vitro фосфорилирования субстрата ферментом KDR с использованием сцинцилляционного метода (96-луночный планшет, NEN). Цитоплазмический домен фермента KDR человека клонировали в форме слитого GST в векторе экспрессии бакуловируса pFastBac. Белок экспрессировали в клетках SF21 и очищали до достижения гомогенности около 60%. Активность киназы KDR измеряли в буфере 20 мМ MOPS, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MnCl2, 1 мМ DTT,2,5 мМ EGTA, 10 мМ b-глицерофосфата, рН=7,2, в присутствии 10 мМ MgCl2, 100 мкМ Na3VO4, 1 мМKDR. Реакцию начинали добавлением 20 мкл раствора, содержащего 2 мкг субстрата (фрагмент SH2SH3 из PLC, экспрессированного в форме слитого белка GST), 2 MKCi 33P[ATP] и 2 мкМ холодногоATP. После 1 ч инкубации при 37 С реакцию останавливали добавлением 1 объема (100 мкл) 200 мМEDTA. Инкубационный буфер удаляли и лунки трижды промывали с помощью 300 мкл PBS. Радиоактивность подсчитывали в каждой лунке с использованием счетчика радиоактивности Top Count NXT(Packard). Фоновый шум определяли измерением радиоактивности в четырех разных лунках, содержащих радиоактивный ATP, и одного субстрата. Общую контрольную активность измеряли в четырех разных лунках, содержащих все реактивы ( 33P-[ATP], KDR и субстрат PLC), но в отсутствие соединения. Ингибирующая активность KDR соединения согласно изобретению выражена в процентах ингибирования от контрольной активности, которая определялась в отсутствие соединения. Соединение SU5614 (Calbiochem) (1 мкМ) включается в каждый планшет в качестве контрольного ингибитора. 2. Tie2 Кодирующая последовательность Tie2 человека, соответствующая аминокислотам межклеточного домена 776-1124, генерировалась при помощи ПЦР с использованием кДНК, выделенной из человеческой плаценты в качестве модели. Эта последовательность была введена в вектор экспрессии бакуловируса pFastBacGT в форме слитого белка GST. Эффект ингибирования молекул оценивался в тесте фосфорилирования PLC киназой Tie2 в присут- 26012702 ствии GST-Tie2, очищенного приблизительно, до достижения 80% гомогенности. Субстрат состоял из фрагментов SH2-SH3 из PLC, эспрессированного в форме слитого GST. Активность киназы Tie2 измерялась в буфере MOPS 20 мМ рН 7,2, содержащем 10 мМ MgCl2, 10 мМ MnCl2, 1 мМ DTT, 10 мМ глицерофосфата. На 96-ти луночный планшет, помещенный на лед, наносили реакционную смесь, состоящую из 70 мкл киназного буфера, содержащего 100 нг фермента GSTTie2 в каждой лунке. Затем добавляли 10 мкл исследуемого соединения, разведенного с помощью ДМСО до максимальной концентрации 10%. Для заданной концентрации каждый замер проводился четыре раза. Реакцию инициировали добавлением 20 мкл раствора, содержащего 2 мкг GST-PLC, 2 мкМ холодногоATP и 1 MKCi 33P[ATP]. После 1 ч инкубации при 37C реакцию останавливали добавлением 1 объема(100 мкл) EDTA в концентрации 200 мМ. После удаления инкубационного буфера лунки промывали три раза с помощью 300 мкл PBS. Радиоактивность измеряли на приборе MicroBeta 1450 Wallac. Рассчитывают ингибирующую активность Tie2 и выражают ее в процентах ингибирования по отношению к контрольной активности, рассчитанной в отсутствие соединения. 3. Aurora1 и Aurora2 Ингибирующий эффект соединений в отношении киназ Auroral и Aurora2 определяли с помощью ферментативного теста с использованием измерения радиоактивности. Активность киназ Auroral и Aurora2 определялась путем фосфорилирования субстрата Numaгистидин в присутствии ATP, меченного радиоактивной меткой ([33P]ATP), и использования 96 луночных планшет Flashplate, в которых никельсодержащий хелатный комплекс фиксирован на поверхности микропланшета. Количество фосфата, 33P, введенного в субстрат NuMa, пропорционально активности фермента Aurora1 или Aurora2. Белки Белки получены в лаборатории Sanofi-Aventis по получению белков.Aurora 1: рекомбинантный комплекс Aurora-B/lNCENP-С 3, очищенный приблизительно до 50%, в котором N-концевые участки в Aurora-B мечены гистидином.Aurora 2: цельный рекомбинантный белок, содержащий гистидиновый хвост на N-концевом участке, экспрессированный в E.coli и очищенный более чем на 82%.NuMa (ядерный белок, ассоциированный с митотическим аппаратом): фрагмент из 424 аминокислот, экспрессированный в E.coli, N-концевой участок которого мечен гистидином и использован в качестве субстрата для двух ферментов Aurora. Протокол: Используемые микропланшеты представляют собой 96-луночные планшеты Flash-Plate с никелевым хелатным комплексом (Perkin Elmer, модель SMP107). Исследуемые продукты инкубировали при 37C в реакционном объеме 100 мкл на лунку в присутствии 10 нМ Aurora 1 или Aurora 2, 500 нМ субстрата NaMA в буфере, состоящем из 50 мМ Tris/HCl (рН 7,5), 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2 (Aurora-B) или 10 мМ MgCl2 (Aurora-A) и 1 мМ DTT. В каждую лунку помещают 80 мкл инкубационного буфера фермент/субстрат, затем помещают исследуемый продукт с изменяющейся концентрацией. Реакцию инициируют добавлением 1 мкМ итогового ATP, содержащего 0,2 MKCi [33P]ATP (10 мкл). После 30 мин инкубации реакцию останавливают простым удалением реакционного буфера и каждую лунку дважды промывают 300 мкл буфера Tris/HCl. Радиоактивность подсчитывают в каждой лунке с помощью сцинцилляционного прибора моделиPackard, Top Count. Ферментативная контрольная активность Aurora выражается в числе импульсов в минуту, полученных за 30 минут после вычитания фонового шума (реакционная смесь, не содержащая фермента). Оценку разных исследуемых соединений выражали в процентах ингибирования активности Aurora по отношению к контролю. 4. CDK4/циклин D1 Очистка комплекса CDK4-НА/циклин D1-(HiS)6 методом IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography): Два рекомбинантных бакуловируса, несущие человеческие последовательности, кодирующие соответственно CDK4-HA (слияние С-конца с tag Гемаглутинина) и циклин D1-(His)6, использованы для коинфицирования клеток насекомого Sf9. Шестьдесят часов спустя после начала ко-инфицирования клетки отделяют центрифугированием, затем замораживают при -20 С и хранят их до использования. После размораживания в буфере A (HEPES 200 мМ рН 7,0, 50 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 25 мМ имидазола, 1 мМTCEP, 10% глицерина (вес./об.), 1 мМ NaF, 1 мМ Na3VO4), перемешивания в течение 1 ч при 4 С и центрифугирования комплекс, находящийся в супернатанте в результате лизиса, очищают аффинной хроматографией на никеле (IMAC) и хранят при -80 С. Опыт Flashplate CDK4/циклин D1 с количеством лунок 96 Опыт в планшете "Flashplate" (сцинцилляционный планшет) с 96 лунками, покрытыми стрептавидином, используют для оценки ингибирования киназного комплекса CDK4/циклин D1 исследуемыми продуктами. Для осуществления этого опыта солюбилизируют пептидный биотинилированный субстрат,представляющий собой фрагмент белка pRb (Биотинил-RPPTLSPIPHIPRSPYKFPSSPLR-амид), до дос- 27012702 тижения концентрации 2 мМ в киназном буфере (HEPES/NaOH 50 мМ, NaCl 1 мМ, MgCl2 5 мМ, рН=7,5) для получения маточного раствора, хранящегося при температуре -20C в виде аликвотных частей объемом 110 мкл. В день эксперимента аликвотную часть этого раствора размораживают и разбавляют киназным буфером, содержащим 1 мМ дитиотреитола, вводимым перед самым употреблением, так, чтобы получить конечную концентрацию пептида 2,571 мкМ. Вносят 70 мкл этого раствора в каждую лунку планшета Flashplate для достижения конечной концентрации субстрата 1,8 мкМ в процессе ферментативной реакции, проводимой в конечном объеме 100 мкл (см. ниже). Промежуточные разбавленные растворы ингибиторов (продуктов согласно изобретению) с разными концентрациями готовили в ДМСО на основе маточных растворов с концентрацией 10 мМ в отдельных трубках. Таким образом осуществляли разбавление до концентраций 1000, 333,3, 111,1, 37,03, 12,35, 4,11 и 1,37 мкМ. По 1 мкМ каждого из этих растворов (или 1 мкл ДМСО для контрольного опыта) переносили в лунки тестируемого планшета. Затем в каждую лунку вводили по 19 мкл раствора смеси аденозинтрифосфата (ATP) и ATP 33P в киназном буфере с концентрацией 5,26 мкМ общего ATP и 78,9 мкCl/мл 33P. Ферментативную реакцию начинали добавлением 10 мкл на лунку раствора комплекса CDK4/циклин D1, находящегося в концентрации 250 нМ в киназном буфере, содержащем 1 мМ дитиотреитола (или 10 мкл киназного буфера, содержащего 1 мМ дитиотреитола для контрольных реакций). После завершения различных добавлений конечный объем в каждой лунке составил 100 мкл, конечная концентрация субстрата составила 1,8 мкМ, конечные концентрации ингибиторов составили 10 мкМ, 3,33 мкМ, 1,11 мкМ, 0,37 мкМ, 0,123 мкМ, 0,041 мкМ и 0,014 мкМ (соответственно концентрациям промежуточного разбавления), конечная концентрация ATP составила 1 мкМ, конечное содержание 33P составило 1,5 MKCi/лунку, конечная концентрация комплекса CDK4/циклин D1 составила 25 нМ. После введения всех реагентов тестируемый планшет инкубировали при 30C при встряхивании с вращением со скоростью 650 об./мин. После инкубирования планшет промывали три раза, из расчета 300 мкл на лунку, буфером PBS (Phosphate Buffered Saline, pH=7,4, не содержит ни кальция, ни магния, номер по каталогу 10010-015, Gibco BRL). Введение 33P в пептидный субстрат измерялось путем подсчета методом сцинцилляции на приборе Packard Topcount NXT. Ингибирующая активность соединений согласно изобретению определялась по значению ингибирующей концентрации, вызывающей снижение на 50% активности фермента (IC50). Результаты сведены в таблицу.