Полипептид для оживления покоящихся, погибающих или латентных бактериальных клеток, кодирующая его нуклеиновая кислота и способы использования полипептида и нуклеиновой кислоты

007413 Область техники Настоящее изобретение касается RP-факторов, соответствующих им рецепторов, конвертаз, соответствующих генов и их ингибиторов и миметиков. В частности, настоящее изобретение касается антител, фармацевтических композиций и (терапевтических, диагностических) способов, основанных на использовании RP-факторов и их рецепторов и конвертаз. Введение Бактериальные феромоны Известно, что некоторые химические факторы могут опосредовать межклеточные связи в культурах бактерий. Такие связи, как было показано, играют важную роль в процессах споруляции, конъюгации,изменения вирулентности и биолюминесценции. В настоящее время ясно, что ряд различных аутокринных и(или) паракринных химических факторов (феромонов), вырабатываемых в виде вторичных метаболитов, участвуют в обеспечении социального поведения у прокариотических организмов (см., например, Kell et al., 1995, Trends Ecol. Evol., 10, 126-129). Феромоны могут быть обособлены от питательных веществ, помимо прочего, по следующим признакам: (1) они вырабатываются самими организмами; (2) они активны при очень низких концентрациях(например, при пикомолярных или наномолярных концентрациях); и (3) за исключением процессинга прогормонов, для проявления их активности не требуется их метаболического преобразования (хотя,понятно, в конечном счте они могут разрушаться). Химическая природа этих соединений-феромонов варьируется в широких пределах: те из них, которые связаны с грамотрицательными организмами, имеют тенденцию являться низкомолекулярными соединениями (например, производные N-ацилгомосеринлактона), в то время как у некоторых грамположительных организмов используют белки и полипептиды (Kell et al., 1995, цит. выше). Также известно, что феромоны играют важную роль в развитии бактериальных культур. В отсутствие стресса (повреждений) и при оптимальной культуральной среде рост культуры по типу самоподдержки в норме маскируется высоким уровнем выработки факторов роста и чувствительности клеток к этим феромонам. Только при неблагоприятных условиях (например, в обедненной культуральной среде,при низком объеме исходного посева и/или голодании клеток) такое самоподдерживающее поведение культуры становится видимым. Например, резкое сокращение продолжительности лагфазы в культурах Nitrosomonas europea опосредуется N-(3-оксогексаноил)гомосеринлактоном, а сходная стимулирующая рост активность у Xanthomonas maltophila обусловливается лигандом (белок с молекулярной массой 48 кД), подобным хорионическому гонадотропину. Ряд гормонов млекопитающих (включая пептидные и стероидные гормоны,равно как и цитокины) так же, как было показано, характеризуются потенциалом по стимуляции роста и у грамположительных, и у грамотрицательных бактерий. Стадия покоя и оживление Способность микробной клетки расти и делиться на питательной агаровой пластине предоставляет базовый метод определения числа живых клеток в анализируемом образце. Однако также достаточно широко признается, что особенно в природных условиях разграничение между живым и неживым не является абсолютным: дело в том, что многие клетки могут существовать в покоящейся или погибающей формах или состояниях, не образуя при этом дочерних колоний на питательных средах (т.е. не являются культурабильными). Однако такие покоящиеся или латентные клетки не являются мертвыми: они могут быть возвращены к жизни в ходе процесса, известного под названием оживление, в состояние жизнеспособности и культивируемости. Например, известно, что бактерии Micrococcus luteus (грамположительная, с высоким содержанием пары GC) может вступать в стадию истинного покоя, из которого они могут быть выведены (оживлены) с помощью культуральных супернатантов, причем даже в отсутствии любых исходно живых клеток. Латентная стадия (стадия покоя) имеет важное медицинское значение: многие патогенные бактерии (включая патогенные микобактерии, такие как М.tuberculosis), как известно, характеризуются протяженным периодом покоя в организме-хозяине. Действительно, туберкулез является очень важной широко распространенной возобновляющейся инфекцией, и он распознается, в частности, в том, что возбудитель (Mycobacterium tuberculosis) может находиться в латентной фазе (т.е. быть покоящимся) у пациентов и носителей в течение многих лет. Латентная стадия также имеет важное промышленное значение, поскольку она усложняет многие лабораторные методы детекции, культивирования и подсчета бактерий (например, в пищевой и фармацевтической промышленности). Следовательно, имеется насущная необходимость в раскрытии физиологических основ латентности(покоя) и оживления (выхода из нее). Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, стимулирующему оживление покоящихся, погибающих или латентных бактериальных клеток, включающему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:-1 007413 а) последовательности из аминокислотных остатков 285-356 rpf (фактор оживления бактерий)Mycobacterium tuberculosis, MtubZ94752, представленной на фиг. 1 А или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; б) последовательности из аминокислотных остатков 117-185 rpf Mycobacterium tuberculosis,MtubMTV043, представленной на фиг. 1 А или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; в) последовательности из аминокислотных остатков 44-115 rpf Mycobacterium tuberculosis,MtubMTV043, представленной на фиг. 1 А или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; г) последовательности из аминокислотных остатков 73-141 rpf Mycobacterium tuberculosis,MtubU38939, представленной на фиг. 1 А или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; д) последовательности из аминокислотных остатков 54-122 rpf Mycobacterium tuberculosis,MtubZ81368, представленной на фиг. 1 А или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; е) последовательности из аминокислотных остатков 43-114 rpf Mycobacterium leprae, Mlep104666,представленной на фиг. 1 А или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; ж) последовательности из аминокислотных остатков 47-115 rpf Mycobacterium leprae, MlepL01095,представленной на фиг. 1 А или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; з) последовательности из аминокислотных остатков 10-77 rpf Streptomyces coelicolor, Scoeli6C12,представленной на фиг. 1 А или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; и) последовательности из аминокислотных остатков 44-111 rpf Micrococcus luteus, MlutZ96935,представленной на фиг. 1 А или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; к) последовательности из аминокислотных остатков 343-438 предсказанного rpf Bacillus subtilis,YabEBsubt, представленной на фиг. 1B или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; л) последовательности из аминокислотных остатков 193-288 предсказанного rpf Bacillus subtilis,YocHBsubt, представленной на фиг. 1B или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; м) последовательности из аминокислотных остатков 300-362 rpf Mycobacterium tuberculosis,MtubZ94752, представленной на фиг. 1B или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; н) последовательности из аминокислотных остатков 124-318 rpf Clostridium acetobutylicum,Caceto506, представленной на фиг. 1B или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; и о) последовательности из аминокислотных остатков 1-81 rpf Clostridium perfringens, Cperfing, представленной на фиг. 1B или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности. Также изобретение относится к рекомбинантному полипептиду, описанному выше. Изобретение относится к применению указанного выше выделенного полипептида, в терапии, например иммунотерапии, диагностике или профилактике инфекции, обусловленной микроорганизмом. Изобретение также относится к применению указанного выше выделенного полипептида, который находится в составе фармацевтического наполнителя, в виде стандартной дозы или в форме, пригодной для местного или системного введения. Данное изобретение также относится к фармацевтической композиции для оживления покоящихся,погибающих или латентных бактериальных клеток, содержащей эффективное количество полипептида,описанного выше, и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение, кроме того, относится к указанной фармацевтической композиции, представляющей собой вакцину. Также изобретение относится к живой вакцине, включающей аттенуированные микроорганизмы и указанную выше фармацевтическую композицию. Настоящее изобретение относится к рецептору, специфичному в отношении указанного выделенного полипептида, содержащему рецепторный домен, включающий аминокислотную последовательность,обладающую по крайней мере 20% идентичностью или гомологией с любой из последовательностей,описанных выше. Настоящее изобретение относится к антителу или производному антителу, которое специфично в отношении указанного полипептида. Также изобретение относится к антителу, применяемому в терапии, например иммунотерапии, диагностике или профилактике инфекции, обусловленной микроорганизмом. Изобретение относится к применению, при котором указанное антитело находится в составе фармацевтического наполнителя, в виде стандартной дозы или в форме, пригодной для местного или системного введения. Настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей указанный-2 007413 выше полипептид, используемый для оживления покоящихся, погибающих или латентных бактериальных клеток. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей указанную нуклеиновую кислоту. Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему указанную нуклеиновую кислоту. Настоящее изобретение относится к такому вектору, отличающемуся тем, что он является экспрессирующим вектором. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей такой вектор. Изобретение, кроме того, относится к клетке-хозяину, содержащей указанный вектор. Изобретение включает диагностический набор для выявления оживших или неоживших покоящихся, погибающих или латентных бактериальных клеток, содержащий вышеуказанный полипептид. Изобретение относится к культуральной среде, содержащей вышеуказанный полипептид. Настоящее изобретение относится к среде для транспортировки бактериальных клеток, содержащей вышеуказанный полипептид. Резюме изобретения Настоящее изобретение основывается, по крайней мере отчасти, на открытии нового класса феромонов, которые стимулируют оживление бактерий после истинной стадии покоя. Этот фактор оживления (здесь обозначаемый термином RP-фактор) может проявлять активность при пикомолярных концентрациях (т.е. это указывает на отсутствие у него пищевого значения). Расшифровка структуры феромонов по уровню их аминокислотной последовательности также позволила заявителям настоящего изобретения описать большое семейство белков, некоторые члены которого активны в более широком диапазоне как регуляторы клеточного роста или репликации и необязательно являются факторами оживления. Дальнейшее сравнение последовательностей также привело к идентификации соответствующих рецепторов, по крайней мере некоторые из которых проявляют определенный уровень сходства последовательностей с соответствующими RP-факторами. Таким образом, в первом аспекте настоящего изобретения представляется выделенный RP-фактор.RP-факторы По использованию в данном тексте термин RP-фактор призван обозначить любого представителя такого семейства субстанций, члены которого способны оживлять покоящиеся, умирающие или латентные клетки (например, покоящиеся клетки бактерий). Кроме того, RP-факторы по настоящему изобретению могут проявлять активность по стимуляции роста в связи с ростом клеток (например, роста клеток бактерий) и(или) могут быть компетентными по снижению продолжительности лаг-фазы клеточных культур (например, культур бактериальных клеток). Активность по оживлению (и необязательно также активность по стимуляции роста или активность по укорочению лаг-фазы) RP-фактора может быть специфичной в отношении конкретной (бактериальной) клетки (например, специфичной для одного или нескольких видов патогенных микобактерий) или может быть неспецифичной. Специфичностью можно управлять, например, путем конструирования (например, с применением мутагенеза или химеризации так, как это описано в настоящей заявке) домена(ов), контролирующего специфичность RP-фактора, или путем замены сигнальных доменов. Термин RP-фактор также по использованию в данном тексте имеет несколько более широкий смысл, обозначая полипептиды, которые экспрессируются бактериями и которые регулируют (например,способствуют, опосредуют, предотвращают или нарушают) рост или воспроизводство клетки (а именно клетки-мишени), действуя в роли сигнальных компонентов в сочетании с (например, за счет связывания с) соответствующими клеточными рецепторами. Такие полипептиды могут быть названы, по крайней мере здесь, бактериальными цитокинами. Следовательно, RP-факторы по настоящему изобретению включают бактериальные цитокины, которые могут быть способны или неспособны оживлять покоящиеся, умирающие или латентные клетки(например, латентные бактериальные клетки) и(или) проявлять стимулирующую рост активность в отношении растущих клеток (например, растущих клеток бактерий). Они могут быть компетентными или некомпетентными по снижению продолжительности лагфазы в связи с ростом клеточных культур (например, культур бактериальных клеток). Более того, некоторые бактериальные цитокины, которые попадают в объм термина RP-фактора в соответствии с использованием в данном тексте, могут даже предотвращать или нарушать рост клеток-мишеней (в частности, тогда, когда эти клетки-мишени являются эукариотическими клетками, например клетками млекопитающих).RP-факторы по настоящему изобретению могут быть разделены по крайней мере на два функциональных класса: автосигнальные факторы и аллосигнальные факторы. Автосигнальные факторы активны по регуляции роста бактериальной клетки, в которой они экспрессированы (т.е. они действуют как бактериальные аутокринные факторы), в то время как аллосигнальные факторы активны по регуляции роста других клеток (т.е. они действуют как бактериальные паракринные факторы). Следовательно, автосигнальные факторы активны как саморегуляторы роста бактериальной клетки и могут быть ключевыми факторами жизнеспособности и (или) роста. Некоторые RP-факторы могут функционировать и как авто-,и как аллосигнальные цитокины.-3 007413 Аллосигнальные факторы могут проявлять ряд различных специфичностей. Некоторые из них могут действовать только на другие клетки того же вида бактерии, что и клетка, в которой они были выработаны (гомоактивные факторы), в то время как другие могут действовать на клетки одного или нескольких других видов (гетероактивные факторы). Гетероактивные факторы могут проявлять широкий спектр специфичностей: они могут действовать на ряд других видов (например, специфично в отношении разных родов бактерий) или могут быть видоспецифичными. Некоторые гетероактивные бактериальные факторы могут действовать на эукариотические клетки и могут быть специфичными в отношении конкретных типов клеток. Например, некоторые гетероактивные бактериальные цитокины (в частности, те, которые вырабатываются некоторыми патогенами) могут действовать на клетки млекопитающих (например, эпителиальные, эндотелиальные или иммунные клетки млекопитающих) и при этом могут быть тканеспецифичными или специфичными по типам клеток. Вне зависимости от обсуждавшегося выше, считается, что специфичность по крайней мере некоторых RP-факторов может зависеть от концентрации. В этих случаях специфичность любого данного RPфактора находится в общем континууме, в результате чего автосигнальный RP-фактор может опосредовать перекрестные связи и тем самым проявлять аллосигнальную активность в случае присутствия при достаточно высоких концентрациях. Сходным образом аллосигнальные RP-факторы могут проявлять гомо- и гетероактивность в зависимости от концентрации.RP-фактор может быть перенесен через клеточную мембрану, после чего он может быть секретирован в окружающую среду или остаться связанным на поверхности этой клетки. Таким образом, могут существовать по крайней мере два класса RP-факторов: секретируемые и несекретируемые. Секретируемые RP-факторы характеризуются присутствием сигнального сегмента секреции (присутствие которого легко может быть определено специалистом в данной области техники на основе присутствия соответствующих мотивов в ДНК и/или аминокислотной последовательности). Несекретируемые RP-факторы могут являться ассоциированными с клеткой или цитоплазматическими факторами. Оба класса RPфакторов могут существовать в одном клеточном источнике (например, в одном бактериальном источнике). Оба класса RP-факторов находят применение в связи с настоящим изобретением. Несекретируемые RP-факторы могут действовать по крайней мере по четырем различным механизмам: (а) в виде прикрепленного к мембране юкстакринного фактора, опосредующего регулирующий рост сигнал между двумя разными клетками в тесном физическом пространстве или при непосредственном контакте; и/или (b) в виде внеклеточного сигнального компонента до расщепления ферментом (например, конвертазой, что описывается в данном тексте), в результате чего во внеклеточную среду высвобождается свободный сигнальный компонент; и/или (с) в виде аутокринного фактора за счет связывания с соответствующими рецепторами, находящимися на поверхности клетки, в которой несекретируемый фактор экспрессирован, или за счет полностью внутриклеточной активности; и/или (d) в виде соответствующего рецептора для другого несекретируемого или секретируемого RP-фактора. Следовательно, RP-факторы по настоящему изобретению могут включать девять факторов, определяемых последовательностями, показанными на фиг. 1 А, и пятью факторами, определяемыми показанным на фиг. 1 В, наряду с их видовыми вариантами, аллельными формами, гомологами, производными,мутантными вариантами и соответствующими секретируемыми/несекретируемыми формами (см. выше) . Предпочтительно RP-факторы по настоящему изобретению являются видовыми вариантами, аллельными формами, гомологами, производными, мутантными вариантами и соответствующими секретируемыми/несекретируемыми формами одного из девяти факторов, определяемых последовательностями, показанным на фиг. 1 А, и пяти факторов, определяемых как показано на фиг. 1 В.RP-факторы могут быть синтезированы в форме предшественника, который процессируется с образованием зрелой формы. Такой процессинг может проходить через различные промежуточные формы(проформы). По использованию в данном тексте такие предшественники, промежуточные формы и зрелые белки определяются термином RP-фактор, за исключением специально оговариваемых случаев. По использованию в данном тексте термин пpo-RP-фактор конкретно определяет любой из предшественников (который может быть или не быть активным) зрелого RP-фактора. Процессинг может включать протеолитическое расщепление и (или) секрецию. Предшественники могут быть изначально неактивными и становиться активными, как следствие процессинга, в виде зрелой формы. Предшественники могут включать белки, имеющие секреторные лидерные сегменты, которые удаляются в процессе секреции (преформы). Такие формы по использованию в данном тексте обозначаются как пpe-RP-фактор или пpeпpo-RP-факторы. Как объяснялось выше, такие пре- и препроформы также призваны включить в себя термин RP-фактор, за исключением специально оговариваемых случаев. Процессинг может сопровождать связывание предшественника RP-фактора на соответствующем рецепторе. Такие рецепторы затем могут напрямую (или косвенно) расщеплять предшественник с образованием более зрелой формы RP-фактора. Такой процессинг может происходить по типу каскада, вовлекая ряд рецептор-процессирующих комплексов, в результате чего в конечном счете образуется зрелый RP-фактор, который затем действует в качестве сигнального компонента за счет связывания с концевым (передающим сигнал) рецептором.-4 007413 При таком процессинге начальные (или промежуточные) рецепторы могут функционировать как конвертазы, а концевой рецептор - как передатчик сигнала. Однако, рецептор может функционировать и как конвертаза, и как передатчик сигнала. По использованию в данном тексте термин конвертаза призван определить молекулу, которая связывает предшественник RP-фактора и (напрямую или косвенно) обеспечивает его процессинг с образованием более зрелой формы. Они могут, например, обладать протеазной активностью. Рецепторы/конвертазы, обсуждавшиеся выше, могут находиться на клеточной поверхности (например, будучи связанным на мембране), в цитоплазме или во внеклеточном пространстве. Предпочтительно RP-фактор является производным от бактерии (например, патогенной бактерии). В частности, предпочтительными являются RP-факторы, производные от грам-положительных бактерий,характеризующихся высоким содержанием GC. Однако, также заявители описали члены семейства RPфакторов у представителей грам-положительных организмов с низким содержанием пары GC, включаяBacillus subtilis и клостридий. Таким образом, RP-факторы, производные от грам-положительных бактерий с низким содержанием GC (например, патогенные грам-положительные бактерии с низким содержанием GC) также являются предпочтительными в соответствии с настоящим изобретением. Примерами последних являются: Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Listeria spp., Bacillus spp., Clostridium spp. иLactobacillus spp. Также настоящее изобретение представляет гомологи, аллельные формы, видовые варианты, производные, мутантные варианты или эквиваленты RP-факторов и рецепторов/конвертаз RP-факторов по настоящему изобретению. Предпочтительно гомологи, производные, мутантные варианты или эквиваленты RP-фактора по настоящему изобретению характеризуются по крайней мере 20%-ным уровнем идентичности с любой из конкретных аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 1 А и 1 В. Конкретно предпочтительными являются гомологи, производные, мутантные варианты или эквиваленты RP-фактора по настоящему изобретению, которые характеризуются уровнем идентичности по крайней мере 30%, например по крайней мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98% по отношению к любой из конкретных аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 1 А и 1 В. Гомологи, производные, мутантные варианты или эквиваленты RP-фактора по настоящему изобретению могут характеризоваться по крайней мере 25%-ным уровнем гомологии с любой из конкретных аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 1 А и 1 В. Конкретно предпочтительными являются гомологи, производные, мутантные варианты или эквиваленты RP-фактора по настоящему изобретению, которые характеризуются уровнем гомологии по крайней мере 30%, например по крайней мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98% по отношению к любой из конкретных аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 1 А и 1 В. Настоящее изобретение представляет химерные RP-факторы. Это такие факторы, которые включают один или большее число гетерологичных доменов. В этом смысле под гетерологичным доменом понимается участок RP-фактора, который является производным от RP-фактора, отличающегося от того фактора, от которого происходит (происходят) другой(ие) домен(ы), с которым те ассоциированы. Такие химерные RP-факторы находят сво конкретное применение тогда, когда специфичность и(или) активность RP-фактора подвержена воздействию или изменена. Также настоящее изобретение представляет все отдельные функциональные домены RP-факторов по настоящему изобретению в качестве отдельных и независимых элементов. Также настоящее изобретение представляет рекомбинантный RP-фактор. По использованию в данном тексте термин рекомбинантный призван определить материал, который был выработан в результате применения комплекса методов, известных в объме технологий рекомбинантной ДНК (например, с использованием нуклеиновой кислоты, векторов или клеток-хозяев, описывавшихся ниже). Соответствующие рецепторы В некоторых случаях соответствующий клеточный рецептор является поверхностно-клеточным рецептором, в других случаях он является цитоплазматическим рецептором, с которым взаимодействует цитокин после поглощения его клеткой-мишенью. Рецепторы, с которыми взаимодействуют RP-факторы и(или) бактериальные цитокины по настоящему изобретению, могут иметь ряд общих структурных мотивов с самими RP-факторами/цитокинами. В частности, рецепторы могут включать лигандсвязывающий домен, который структурно сходен с сигнальным доменом соответствующего им RPфактора/цитокина. Также эти рецепторы могут включать домен прикрепления к мембране и домен пронизывания клеточной стенки. Предпочтительно соответствующий рецептор включает рецепторный домен, что определяется здесь далее, и(или) пронизывающий клеточную стенку домен, что будет определено здесь далее, и(или) мембранный якорь. Конкретно предпочтительными являются рецепторы, включающие аминокислотную последовательность MtubZ94752 в соответствии с показанным на фиг. 1 А или аминокислотную последовательность YabE B.subtilis, показанную на фиг. 1 В.-5 007413 Также соответствующий рецептор может включать производные или эквивалентные последовательности аминокислотных остатков, которые определялись выше, но в которых аминокислоты были добавлены, делетированы или заменены (например, по консервативному типу) при том, что биологическая активность (например, сигнальная активность или активность по связыванию лигандов) по сути сохраняется. Соответствующие рецепторы также могут включать производные или эквивалентные последовательности аминокислотных остатков, которые характеризуются по крайней мере 20%-ным уровнем идентичности или гомологии по отношению к аминокислотной последовательности MtubZ94752, показанной на фиг. 1 А, или аминокислотной последовательности YabE B.subtilis, показанной на фиг. 1 В, например, по крайней мере 30%-ным уровнем идентичности или гомологии, например, идентичностью или гомологией с ними на уровне по крайней мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%. Доменная структура RP-фактора/соответствующего рецептораRP-факторы по настоящему изобретению (включая бактериальные цитокины, как также определяемые здесь) и соответствующие им рецепторы могут включать множество отдельных доменов. Эти домены могут быть функционально и(или) структурно разобщнными.RP-факторы по настоящему изобретению могут быть охарактеризованы присутствием по крайней мере двух функциональных доменов: сигнального сегмента секреции (который может полностью или частично отсутствовать в активной форме данного фактора) и сигнального домена. Сигнальный домен может представлять один из по крайней мере двух различающихся классов, более подробно охарактеризованных ниже. Многие RP-факторы также включают третий функциональный домен, который опосредует физическую связь с поверхностью клетки-мишени (здесь и далее обозначаемый как локализующий домен и более подробно описанный далее).RP-факторы по настоящему изобретению дополнительно могут включать домен, детерминирующий специфичность, который может функционировать в сочетании с сигнальным доменом. Несекретируемые RP-факторы могут дополнительно включать пронизывающий клеточную стенку домен (более подробно он описан ниже) и(или) мембранный якорь. Базовая структура и(или) аминокислотная последовательность названных выше доменов могут в существенной степени варьироваться. В частности, структура поверхностно локализующегося домена может различаться в зависимости от структуры клеточной стенки клетки-мишени. Например, поверхностно локализующийся домен может относиться к одному из по крайней мере двух обособленных классов: класс I (который может действовать на пептидогликан) и класс II (который может действовать на внешнем липидном слое мембраны, обнаруживаемом у микобактерий). Соответствующие рецепторы по настоящему изобретению могут быть охарактеризованы по присутствию по крайней мере двух функциональных доменов: рецепторного домена и пронизывающего клеточную стенку домена. Также они могут включать мембранный якорь. Рецепторный домен может проявлять структурное сходство с сигнальным доменом соответствующего ему RP-фактора (что более подробно описано ниже). Рецепторный/сигнальный домен класса I Этот домен может быть ассоциирован с RP-факторами высоко-GC грамположительных бактерий(таких как микобактерии и Micrococcus spp.) и(или) с соответствующими им рецепторами. Входя в состав RP-факторов, этот домен может участвовать в связывании на рецепторе и может, например, связывать структурно сходный домен соответствующего рецептора. Таким образом, этот домен обозначается как сигнальный домен, когда он является частью RP-фактора по настоящему изобретению, и этот домен обозначается как рецепторный домен, когда он присутствует в соответствующем рецепторе. Этот домен может включать аминокислотную последовательность, которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые помечены звездочками на любой из 9 последовательностей, показанных на фиг. 1 А. В предпочтительных вариантах этот домен может включать последовательность аминокислотных остатков, которая идентична по составу и относительным положениям тем остаткам, которые помечены звездочками и точками на любой из 9 последовательностей, показанных на фиг. 1 А. В конкретных предпочтительных вариантах этот домен может включать последовательность аминокислотных остатков, которая идентична по составу и относительным положениям тем остаткам, которые выделены полужирным шрифтом и заглавными буквами на любой из 9 последовательностей, показанных на фиг. 1 А. В более предпочтительных вариантах этот домен может включать последовательность аминокислотных остатков, которая идентична по составу и относительным положениям тем остаткам, которые выделены заглавными буквами на любой из 9 последовательностей, показанных на фиг. 1 А. Данный домен также может включать производные или эквивалентные последовательности аминокислотных остатков, которые соответствуют определенным выше, но в которых аминокислоты добавлены, делетированы или заменены (например, заменены по консервативному типу) так, что биологическая активность (например, сигнальная активность или активность по связыванию лиганда) в существенной-6 007413 степени сохранена. Этот домен также может включать производные или эквивалентные последовательности аминокислотных остатков, которые характеризуются по крайней мере 20%-ным уровнем идентичности или гомологии по отношению к одной из конкретных аминокислотных последовательностей, определенных выше, например, по крайней мере 30%-ным уровнем идентичности или гомологии, например, идентичностью или гомологией с ними на уровне по крайней мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%. Рецепторный/сигнальный домен класса II Этот домен может быть связан с RP-факторами низко-GC грамположительных бактерий (таких как палочки и клостридии) и(или) с соответствующими им рецепторами. Присутствуя в составе RPфакторов, этот домен может участвовать в связывании на рецепторе и может, например, связывать структурно сходный домен соответствующего рецептора. Таким образом, этот домен обозначается как сигнальный домен, когда он является частью RP-фактора по настоящему изобретению, и этот домен обозначается как рецепторный домен, когда он присутствует в соответствующем рецепторе. Этот домен может включать аминокислотную последовательность, которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые помечены звездочками на любой из 5 последовательностей, показанных на фиг. 1 В(В). В предпочтительных вариантах этот домен может включать аминокислотную последовательность,которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые помечены звездочками и точками на любой из 5 последовательностей, показанных на фиг. 1 В(В). В конкретных предпочтительных вариантах этот домен может включать аминокислотную последовательность, которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые выделены полужирным шрифтом и заглавными буквами на любой из 5 последовательностей, показанных на фиг. 1 В(В). В более предпочтительных вариантах этот домен может включать аминокислотную последовательность, которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые выделены заглавными буквами на любой из 5 последовательностей, показанных на фиг. 1 В(В). Данный домен также может включать производные или эквивалентные аминокислотные последовательности, которые соответствуют определенным выше, но в которых аминокислоты добавлены, делетированы или заменены (например, заменены по консервативному типу) так, что биологическая активность(например, сигнальная активность или активность по связыванию лиганда) в существенной степени сохранена. Этот домен также может включать производные или эквивалентные последовательности аминокислотных остатков, которые характеризуются по крайней мере 20%-ным уровнем идентичности или гомологии по отношению к одной из конкретных аминокислотных последовательностей, определенных выше, например, по крайней мере 30%-ным уровнем идентичности или гомологии, например, идентичностью или гомологией с ними на уровне по крайней мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%. Пронизывающий клеточную стенку домен Этот домен может быть связан с несекретируемыми RP-факторами (например, ассоциированными с клетками RP-факторами или RP-факторами, которые действуют как юкстакринные факторы) и с соответствующими рецепторами RP-факторов по настоящему изобретению. Присутствуя, этот домен вовлечен в опосредование взаимодействия с клеточной стенкой таким образом, что в результате данный RPфактор/рецептор может пронизывать ее. Пронизывающий клеточную стенку домен, следовательно, может быть связан с цитоплазматическими и внеклеточными участками in vivo. Часто этот домен связан с мембранным якорем, и в результате эти два структурных элемента действуют согласованно в поддержке RP-фактора/рецептора на поверхности клетки. Этот домен может включать аминокислотную последовательность, которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые представлены заглавными буквами и помечены знакомна любой из 5 последовательностей, показанных на фиг. 1 В(А). В предпочтительных вариантах этот домен может включать аминокислотную последовательность,которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые представлены заглавными буквами и помечены знакоми точками на любой из 5 последовательностей, показанных на фиг. 1 В(А). В конкретных предпочтительных вариантах этот домен может включать аминокислотную последовательность, которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые выделены полужирным шрифтом и заглавными буквами на любой из 5 последовательностей, показанных на фиг. 1 В(А). В более предпочтительных вариантах этот домен может включать аминокислотную последовательность, которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые выделены заглавными буквами на любой из 5 последовательностей, показанных на фиг. 1 В(А). Данный домен также может включать производные или эквивалентные аминокислотные последова-7 007413 тельности, которые соответствуют определнным выше, но в которых аминокислоты добавлены, делетированы или заменены (например, заменены по консервативному типу) так, что биологическая активность(например, сигнальная активность или активность по связыванию лиганда) в существенной степени сохранена. Этот домен также может включать производные или эквивалентные последовательности аминокислотных остатков, которые характеризуются по крайней мере 20%-ным уровнем идентичности или гомологии по отношению к одной из конкретных аминокислотных последовательностей, определнных выше, например, по крайней мере 30%-ным уровнем идентичности или гомологии, например, идентичностью или гомологией с ними на уровне по крайней мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%. Локализующий домен класса I Этот домен может присутствовать в составе секретируемых RP-факторов и может опосредовать физическую связь с поверхностью клетки-мишени за счет активности по связыванию с пептидогликаном или некоторыми другими поверхностными компонентами (компонентом). Следовательно, он может действовать по увеличению локальной концентрации цитокина на поверхности клетки-мишени, проявляя активность по увеличению локальной концентрации RP-фактора в непосредственной близости от соответствующего рецептора. Локализующие домены могут, следовательно, характеризоваться свойством аллосигнальных бактериальных цитокинов и могут отсутствовать в автосигнальных факторах, или наоборот. Например, входя в состав автосигнальных факторов, локализующие домены могут обеспечивать сохранение данного фактора на поверхности клетки или рядом с ней после секреции через клеточную мембрану. Если они присутствуют, локализующийся домен может определять важные связывающие свойства в отношении RP-фактора, тем самым делая связывание с соответствующим рецептором двухфазовым процессом, характеризующимся первичным связыванием (относительно неспецифичным) с клеточной поверхностью и последующим вторичным связыванием (относительно высокоспецифичным) с соответствующим рецептором. Этот домен может включать аминокислотную последовательность, которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые помечены звездочками на любой из 10 последовательностей, показанных на фиг. 1 С. В предпочтительных вариантах этот домен может включать аминокислотную последовательность,которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые помечены звездочками и точками на любой из 10 последовательностей, показанных на фиг. 1 С. В конкретных предпочтительных вариантах этот домен может включать аминокислотную последовательность, которая идентична по составу и относительным положениям тем аминокислотным остаткам, которые выделены полужирным шрифтом и заглавными буквами на любой из 10 последовательностей, показанных на фиг. 1 С. В более предпочтительных вариантах этот домен может включать аминокислотную последовательность, которая идентична по составу и относительным положениям аминокислотным остаткам любой из 10 последовательностей, показанных на фиг. 1 С. Данный домен также может включать производные или эквивалентные аминокислотные последовательности, которые соответствуют определенным выше, но в которых аминокислоты добавлены, делетированы или заменены (например, заменены по консервативному типу) так, что биологическая активность(например, сигнальная активность или активность по связыванию лиганда) в существенной степени сохранена. Этот домен также может включать производные или эквивалентные последовательности аминокислотных остатков, которые характеризуются по крайней мере 20%-ным уровнем идентичности или гомологии по отношению к одной из конкретных аминокислотных последовательностей, определенных выше, например, по крайней мере 30%-ным уровнем идентичности или гомологии, например, идентичностью или гомологией с ними на уровне по крайней мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%. Локализующий домен класса II Этот домен может присутствовать в составе секретируемых RP-факторов и может опосредовать физическую связь с поверхностью клетки-мишени, проявляя активность по связыванию с внешней липидной оболочкой, имеющейся у микобактерий. Следовательно, он может обеспечивать локальную концентрацию цитокина на поверхности клетки-мишени, тем самым обеспечивая активность по увеличению локальной концентрации RP-фактора в непосредственной близости от соответствующего рецептора. Локализующие домены могут, следовательно, характеризовать аллосигнальные бактериальные цитокины и могут отсутствовать в составе автосигнальных факторов. Если они присутствуют, локализующийся домен может проявлять важные связывающие свойства в отношении RP-фактора, тем самым делая связывание с соответствующим рецептором двухфазовым процессом, характеризующимся первичным связыванием (относительно неспецифичным) с клеточной поверхностью и последующим вторичным связыванием (относительно высокоспецифичным) с соответст-8 007413 вующим рецептором. Этот домен может включать богатый аланином + пролином сегмент, такой как один или несколько аминокислотных мотивов 'А', А, В, В', С, 'С, D, D и D' (любой из них может быть тандемно повторен),как это показано на фиг. 1D. В предпочтительном варианте этот домен может включать аминокислотную последовательность,соответствующую остаткам 158-322 последовательности MtubMTV043, показанной на фиг. 1D, или остаткам 45-112 последовательности MtubMTV008, показанной на фиг. 1 А. Данный домен также может включать производные или эквивалентные аминокислотные последовательности, которые соответствуют определенным выше, но в которых аминокислоты добавлены, делетированы или заменены (например, заменены по консервативному типу) так, что биологическая активность(например, сигнальная активность или активность по связыванию лиганда) в существенной степени сохранена. Этот домен также может включать производные или эквивалентные последовательности аминокислотных остатков, которые характеризуются по крайней мере 20%-ным уровнем идентичности или гомологии по отношению к одной из конкретных аминокислотных последовательностей, определенных выше, например, по крайней мере 30%-ным уровнем идентичности или гомологии, например, идентичностью или гомологией с ними на уровне по крайней мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%. По использованию в данном тексте термин выделенный указывает на то, что данный фактор существует в физической среде, отличной от той среды, в которой он находится в природе. Например, выделенный фактор может быть в существенной степени отделн от комплексной клеточной среды, в которой он находится в естественных условиях. Абсолютный уровень чистоты не является критическим признаком, и специалист в данной области техники легко сможет определить необходимые уровни чистоты в соответствии с использованием, предназначаемым для данного фактора. Во многих вариантах выделенный фактор будет составлять часть композиции (например, более или менее неочищенного экстракта, содержащего многие другие белки и субстанции), буферной системы или фармацевтического наполнителя, которые могут, например, содержать другие компоненты (включая другие белки, такие как альбумин). В других вариантах выделенный белок может быть очищен до существенной гомогенности, например, в соответствии с анализом методами электрофореза в ПААГ или хроматографии на колонках (например, ВЭЖХ или масс-спектрометрия). В предпочтительных вариантах, выделенный RP-фактор по настоящему изобретению по существу является единственным активным RP-фактором в составе данной композиции. Конкретно предпочтительными являются композиции, в которых RP-фактор (или его конкретный видовой вариант, гомолог, мутантный вариант, производное или эквивалент) присутствуют в качестве единственного активного компонента в составе фармацевтической композиции. Однако предназначенный для использования в связи с настоящим изобретением RP-фактор не обязательно должен быть выделен в том смысле, о котором говорилось выше. Например, более или менее неочищенные культуральные супернатанты (например, истощнная культуральная среда) могут содержать достаточно высокие концентрации RP-фактора с точки зрения ряда вариантов его применения. Предпочтительно такие супернатанты фракционируют и (или) экстрагируют (см. далее), хотя во многих вариантах они могут быть использованы без предварительной обработки. Предпочтительно они являются производными от истощнной среды, использовавшейся для культивирования микроорганизмов, вырабатывающих RP-фактор (например, бактериальных источников, описываемых здесь ниже). Предпочтительно супернатанты должны быть стерильны. Они могут быть обработаны различными способами,например, путм концентрирования, фильтрования, центрифугирования, высушивания распылением,диализа и (или) лиофилизации. С точки зрения удобства культуральные супернатанты могут быть просто подвергнуты центрифугированию с целью удаления клеток и (или) клеточного дебриса с последующим отфильтровыванием. Такие супернатанты находят сво применение в диагностических наборах и способах, например, в диагностических наборах и способах, описанных здесь далее. Также они находят применение в выделении из различных образцов культивируемых микроорганизмов (например, почвенных, пищевых, морских, пресноводных или тканевых образцов) или из образцов, взятых от организма (например, человека или животного). Также культуральные супернатанты могут быть использованы в качестве добавок в различных культуральных субстратах, например в культуральных или транспортных средах. Культуральная среда может иметь любую стандартную форму, такую как, например, агаровые пластины, бульоны, скошенные тврдые среды, покрытые (напылнные) стержни, покрытые зонды, мембраны, покрытые или заполненные лунки или плнки. Эта среда может быть определнной или сложной средой и может содержать индикаторные красители, призванные облегчить идентификацию культивируемых микроорганизмов. Предпочтительно эта среда пригодна для культивирования или транспортировки бактерий, напримерMycobacterium spp. Термин выделенный в приложении к другим материалам по настоящему изобретению (например,-9 007413 к генам или другим нуклеиновым кислотам, кодирующим RP-фактор или соответствующие ему рецепторы/конвертазы) должен интерпретироваться с внесением необходимых изменений. Следовательно, в приложении в нуклеиновой кислоте (например, РНК, или ДНК, или (структурными) генами) выделенная нуклеиновая кислота может находиться в составе широкого круга векторов и в различных клеткаххозяевах (или других средах, таких как буферы, вирусы или клеточные экстракты). Термин семейство в приложении к белкам по настоящему изобретению по использованию в данном тексте указывает на группу белков, которые характеризуются существенным сходством последовательностей либо на уровне первичных последовательностей самих белков, либо на уровне ДНК, их кодирующих. Сходство последовательностей может распространяться на весь белок (ген) или может ограничиваться конкретными участками или доменами. Это сходство может быть основано на идентичности,равно как и сходстве нуклеотидных (аминокислотных) последовательностей (например, для специалиста в данной области техники будут ясны типы сходных аминокислот и различия в идентичности, обусловливаемые заменами сходных аминокислот, относящихся к общему консервативному типу). Некоторые члены семейства белков могут быть родственными в том смысле, что они имеют общего эволюционного предшественника, и такие родственные белки могут быть определены как гомологичные. Члены семейства белков не обязательно характеризуются общими биохимическими свойствами или биологическими функциями, хотя их сходство обычно отражает общие функциональные признаки (такие как наличие сайтов и субстратов эффекторного связывания). Критерии, по которым определяются семейства белков, хорошо известны в науке и включают компьютерный анализ большой группы последовательностей на уровне ДНК и белка, равно как и результатов применения биохимических анализов, таких как гибридизационный анализ и каталитические тесты(см., например, PearsonLipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444). Таким образом, RP-факторы по настоящему изобретению включают те факторы, которые показаны на фиг. 1 А и 1 В, наряду с их видовыми вариантами, аллельными формами, гомологами, производными,мутантными вариантами и соответствующими секретируемыми/несекретируемыми формами (см. ниже). Предпочтительно RP-факторы по настоящему изобретению являются видовыми вариантами, аллельными формами, гомологами, производными, мутантными вариантами и соответствующими секретируемыми/несекретируемыми формами любого из белков, представленных на фиг. 1 А и 1 В.RP-факторы могут быть синтезированы в форме предшественника, который процессируется с образованием зрелой формы. Такой процессинг может проходить с образованием различных промежуточных форм (проформ). Все такие предшественники, промежуточные формы и зрелые белки призваны попадать в объм термина RP-фактор по использованию в данном тексте, за исключением специально оговариваемых случаев. По использованию в данном тексте термин пpo-RP-фактор специфическим образом определяет любой из различных предшественников (которые могут быть или не быть активными) зрелого RP-фактора. Процессинг может обеспечиваться протеолитическим расщеплением и(или) секрецией. Предшественники могут быть неактивными и становиться активными в результате процессинга, становясь зрелой формой. Эти предшественники могут включать белки, включающие сигнальный (лидерный, секреторный) сегмент, который отщепляется в процессе секреции (от преформы). Такие формы в данном тексте определяются как пpe-RP-фактор или пpeпpo-RP-факторы. Как объяснялось выше, такие пре- и препроформы также охватываются смыслом термина RP-фактор по использованию в данном тексте, за исключением специально оговариваемых случаев. Процессинг может сопровождаться связыванием предшественника RP-фактора с соответствующим ему рецептором. Такие рецепторы затем могут напрямую (или опосредованно) расщеплять предшественник с образованием более зрелой формы данного RP-фактора. Такой процессинг может происходить в форме каскада процессов, включающего ряд рецепторно-процессинговых комплексов, после чего в конечном счете образуется зрелый RP-фактор, который затем действует как сигнальный элемент путем связывания с концевым (передающим сигнал) рецептором. В ходе такого процессинга исходные (или промежуточные) рецепторы могут функционировать как конвертазы, а концевой рецептор - как передатчик сигнала. Однако один рецептор может функционировать и как конвертаза, и передатчик сигнала. По использованию в данном тексте термин конвертаза призван определить молекулу, которая связывается с предшественником RP-фактора и (прямо или косвенно) процессирует его с образованием более зрелой формы. Например, они могут обладать протеазной активностью. Обсуждавшиеся выше конвертазы/рецепторы могут находиться на клеточной поверхности (например, будучи связанными на мембране), быть цитоплазматическими или внеклеточными. Предпочтительно RP-фактор является производным от бактерии (например, патогенной бактерии). Конкретно предпочтительными являются RP-факторы, производные от грамположительных бактерий с высоким содержанием пары GC. Термин является производным от в приложении к конкретному источнику призван определить не только сам источник в смысле того, что он является физическим источником данного материала, но также определить материал, который имеет структурные и(или) функциональные характеристики, которые- 10007413 соответствуют тому материалу, который происходит от данного ссылочного источника. Таким образом,не является обязательной очистка белка, производного от данного источника. Термин высоко-GC (с высоким содержанием пары GC) грамположительные бактерии является известным научным термином, определяющим конкретный класс бактерий, характеризующихся эволюционным родством. Этот класс включает микрококки Micrococcus spp. (например, M.luteus), микобактерии Mycobacterium spp. (например, быстро- или медленнорастущие микобактерии, например М.tuberculosis, M.leprae, M.smegmatis или M.bovis), стрептомицеты Streptomyces spp. (например,S.rimosus и S.coelicolor) и коринебактерии Corynebacterium spp. (например, С.glutamicum). Предпочтительно соответствующими настоящему изобретению являются RP-факторы, соответствующие им рецепторы и конвертазы, происходящие от микобактерии (микобактериальные RP-факторы, рецепторы RPфакторов и конвертазы RP-факторов). Также настоящее изобретение представляет гомологи, аллельные формы, видовые варианты, производные, мутантные варианты или эквиваленты RP-факторов и рецепторов/конвертаз RP-факторов по настоящему изобретению. Термин гомологичный по использованию в данном тексте имеет два различных смысла. В узком смысле он применяется для определения соответствующего белка у другого организма (т.е. видовой вариант): в этом случае имеется прямая эволюционная связь между данным белком и его гомологом. Это может отражаться в структурной и функциональной эквивалентности, вследствие чего данный белок и его гомолог выполняют одинаковую роль в каждом из организмов. Также в данном тексте данный термин используется в широком смысле, определяя белок, характеризующийся структурным сходством (т.е. при необязательности эволюционного родства и/или структурной и функциональной эквивалентности) с данным (ссылочным) RP-фактором. В этом смысле гомология определяется на основании исключительно структурных параметров по наличию идентичности аминокислотных последовательностей и (или) консервативных замен аминокислот (в соответствии с перечисленным в атласе Дейхоффа с соавт., Dayhoff et al., 1979, Atlas of Protein Structure, Vol. 5, Natl. BioMedFound., Washington, DC). Для целей настоящего изобретения гомологи могут быть распознаны как те белки, которым соответствуют последовательности ДНК, способные специфически или избирательно гибридизовать, или которые могут гибридизовать в селективных, подходящих и(или) достаточно жстких условиях гибридизации. Термин избирательная или специфичная (перекрестная) гибридизуемость в данном контексте указывает на то, что последовательности соответствующих одноцепочечных ДНК таковы, что связывание с уникальными (или представляющими малочисленный класс) гомологичными последовательностями может быть выявлено при более или менее жстких условиях гибридизации. Этот способ по настоящему изобретению не зависит от каких-либо конкретных условий гибридизации, которые могут быть легко установлены специалистом (например, в рутинном опыте или на основе термодинамического анализа). Предпочтительно гомологи, производные, мутантные варианты или эквиваленты RP-фактора по настоящему изобретению характеризуются по крайней мере 20%-ным уровнем идентичности с любой из конкретных аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 1 А или 1 В. Конкретно предпочтительными являются гомологи, производные, мутантные варианты или эквиваленты RP-фактора по настоящему изобретению, уровень идентичности которых по отношению к любой конкретной аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 1 А или 1 В, составляет по крайней мере 30%, например, по крайней мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%. Гомологи, производные, мутантные варианты или эквиваленты RP-фактора по настоящему изобретению могут характеризоваться по крайней мере 25%-ным уровнем гомологичности с любой из конкретных аминокислотных последовательностей, показанных на фиг. 1 А или 1 В. Конкретно предпочтительными являются гомологи, производные, мутантные варианты или эквиваленты RP-фактора по настоящему изобретению, уровень гомологии которых по отношению к любой конкретной аминокислотной последовательности, показанной на фиг. 1 А или 1 В, составляет по крайней мере 30%, например, по крайней мере 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 98%. Термин производное по использованию в данном тексте в отношении белков (например, RPфакторов или рецепторов/конвертаз RP-факторов) по настоящему изобретению определяет белки, которые являются модифицированными вариантами белков по настоящему изобретению. Такие производные могут включать химерные белки, в составе которых белки по настоящему изобретению были сшиты с одним или несколькими другими белками или пептидами (например, с антителом или белковым доменом, обеспечивающим биохимическую активность, играющим роль метки или облегчающим очистку). Такие производные также могут быть продуктами процессов синтеза, в которых белок по настоящему изобретению используется в качестве исходного материала или реактанта. Термин мутантный вариант (мутеин) используется в данном тексте для определения белков, которые являются мутантными формами белков по настоящему изобретению, т.е. белков, в составе которых одна или большее число аминокислот были добавлены, делетированы или заменены. Мутантные- 11007413 варианты по настоящему изобретению, следовательно, - это фрагменты, укороченные варианты и химерные белки (например, включающие сшитый иммуноглобулин, рецептор, конвертазу или ферментный компонент). Мутантные варианты по настоящему изобретению также включают белки, в состав которых мутации были внесены для того, чтобы способствовать или нарушить одну или большее число активностей этого белка, например, мутации, которые инициируют или нарушают рецепторную функцию, распознавательную последовательность или сайт связывания эффектора. Мутантные варианты могут быть получены с применением любого стандартного метода. Обычно может быть применн направленный мутагенез с мутагенными олигонуклеотидами с использованием двухцепочечных матриц (конструкция pBluescript KS II, включающая ген RP-фактора или рецептора/конвертазы RP-фактора, например, Chameleon или QuikChange производства Stratagene). После проверки каждого мутантного производного с применением секвенирования мутантный ген вырезают и встраивают в состав подходящего вектора таким образом, чтобы мутантный белок был сверхэкспрессирован и очищен. Предпочтительными мутантными вариантами являются укороченные формы, включающие (или включающие в существенной части) сигнальный домен RP-фактора или домен RP-фактора, детерминирующий специфичность, или лигандсвязывающий домен рецептора RP-фактора, или сочетания двух или большего числа перечисленных доменов. Также настоящее изобретение представляет химерные RP-факторы. Они являются факторами, которые включают один или большее число гетерологичных доменов. В данном контексте гетерологичный домен - это часть RP-фактора, которая является производной от RP-фактора, отличающегося от того RP-фактора, с доменом которого соединяется производный от него домен(домены). Такие химерныеRP-факторы находят конкретное применение тогда, когда специфичность и(или) активность данного RPфактора подвергается манипулированию или изменению. Применимыми в конструировании таких химерных RP-факторов являются ДНК-фрагменты или кассеты, по существу включающие ДНК, кодирующую избранные домены (например, сигнальный домен или домен, детерминирующий специфичность), при том, что необязательно эти фрагмент или кассеты связаны по одному или нескольким сайтам узнавания рестриктазами или клонирующим сайтам. Также настоящее изобретение представляет кассеты с объединнными доменами, равно как и структурные гены мутантных RP-факторов, в которых имеются сайты клонирования (например, один или большее число рестрикционных сайтов), расположенные в одном или нескольких междоменных спейсерах. По использованию в данном тексте термин эквивалент в приложении к материалам по настоящему изобретению определяет материалы (например, белки, ДНК и др.), которые проявляют по сути такие же функции, что и у материалов по настоящему изобретению, но отличающиеся от них структурно (например, по нуклеотидной или аминокислотной последовательности). Такие эквиваленты могут быть созданы, например, в результате идентификации функционально важных последовательностей (например,идентификации консервативных или канонических последовательностей или с проведением мутагенеза с последующим функциональным тестированием), отбора аминокислотной последовательности на такой основе и затем синтеза пептида по параметрам отобранной аминокислотной последовательности. Такой синтез может быть осуществлен с применением любого из известных в данной области техники методов,включая твердофазный пептидный синтез (для получения синтетических пептидов) и сборку (с последующим клонированием) олигонуклеотидов. Гомологи, фрагменты, мутантные варианты, эквиваленты или производные белков по настоящему изобретению также могут быть определены, помимо прочего, как белки, которые перекрестно реагируют с антителами, специфичными в отношении белков по настоящему изобретению, и, в частности, перекрестно реагируют с антителами, специфичными в отношении конкретных белков, показанных на фиг. 1 А или 1 В. Настоящее изобретение также по отдельности представляет все функциональные домены RPфакторов по настоящему изобретению в виде отдельных и независимых элементов. Также настоящее изобретение представляет рекомбинантный RP-фактор. По использованию в данном тексте термин рекомбинантный призван определить материал, который был выработан с помощью того набора методов, который известен под сборным названием технологии рекомбинантной ДНК (например, с использованием нуклеиновой кислоты, векторов или клеток-хозяев, что описано ниже). Также настоящее изобретение представляет фармацевтическую композицию (например, вакцину),включающую RP-фактор или рецептор/конвертазу RP-фактора (или их гомолог, видовой вариант, аллельную форму, производное, мутантный вариант или эквивалент) по настоящему изобретению. Фармацевтическая композиция является тврдой или жидкой композицией в форме, концентрации и с уровнем чистоты, подходящими для введения пациенту (например, человеку- или животномупациенту) так, чтобы такое введение обусловливало желательные физиологические изменения. Вакцины по настоящему изобретению могут содержать любой подходящий адъювант (например, адъювант Фройнда, БЦЖ или экстракты БЦЖ).- 12007413 В другом аспекте настоящее изобретение касается фармацевтической композиции, содержащей материал по настоящему изобретению, которая: (а) предназначена для использования в терапии (например,иммунотерапии), диагностике или профилактике и(или) (b) находится в фармацевтическом наполнителе,в форме стандартной дозы или в форме, пригодной для местного или системного введения. В другом аспекте настоящее изобретение представляет антитело (или производное антитела), специфичное в отношении RP-фактора (или его гомолога, производного, мутантного варианта или эквивалента) по настоящему изобретению. Антитело предпочтительно находится в форме, пригодной для терапевтического (например, в иммунотерапии), диагностического или профилактического применения; и(или) в фармацевтическом наполнителе, в форме стандартной дозы или в форме, пригодной для местного или системного введения. Антитело может быть помечено и(или) иммортализовано, и(или) соединено с другим составляющим, при том, что такие варианты имеют конкретное применение для диагностических целей. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения представляется выделенный или рекомбинантный рецептор RP-фактора. Рецептор/конвертаза могут быть производными от любого из источников, описанных выше, например, из бактериального источника (например, являющейся источником патогенной бактерии). Такими источниками являются высоко-GC грамположительные микрококки Micrococcus spp. (например,M.luteus), микобактерии Mycobacterium spp. (например, быстро- или медленнорастущие микобактерии,например, М.tuberculosis, M.leprae, M.smegmatis или M.bovis), стрептомицеты Streptomyces spp. (например, S.rimosus и S.coelicolor) и коринебактерии Corynebacterium spp. (например, С.glutamicum). Также настоящее изобретение представляет гомологи, производные, мутантные варианты или эквиваленты рецепторов/конвертаз по настоящему изобретению, равно как и рекомбинантные рецепторы/конвертазы RP-факторов по настоящему изобретению (что определялось выше). Настоящее изобретение также представляет фармацевтическую композицию (например, вакцину),содержащую рецептор/конвертазу (или ее гомолог, производное, мутантный вариант или эквивалент) по настоящему изобретению. Предпочтительно рецептор/конвертаза (или ее гомолог, производное, мутантный вариант или эквивалент) или фармацевтическая композиция: (а) предназначены для терапевтического (например, иммунотерапевтического), диагностического или профилактического применения и(или) (b) находятся в фармацевтическом наполнителе, в форме стандартной дозы или в форме, пригодной для местного или системного введения. Также представляется антитело (или производное антитела), специфичное в отношении рецептора/конвертазы (или ее гомолога, производного, мутантного варианта или эквивалента) по настоящему изобретению. Такое антитело может: (а) быть использовано в терапии (например, иммунотерапии), диагностике или профилактике и(или) (b) находиться в фармацевтическом наполнителе, в форме стандартной дозы или в форме, пригодной для локального или системного введения. Также представляется антагонист или ингибитор RP-фактора. Предпочтительно таким антагонистом или ингибитором является: (а) антитело по настоящему изобретению; и(или) (b) рецептор/конвертаза по настоящему изобретению; и(или) (с) мутантный вариантRP-фактора, включающий домен RP-фактора, детерминирующий специфичность, который, например,лишен функционального сигнального домена. Рецептор может выполнять роль антагониста или ингибитора, если вводится в растворимой форме, когда он может действовать в качестве ловушки растворимого RP-фактора. Предпочтительно модифицированные рецепторы, включающие рецепторные домены(но лишенные мембранного якоря и пронизывающего клеточную стенку домена), используются в качестве ингибиторов или антагонистов. Такие производные могут характеризоваться высокой растворимостью. Предпочтительно антагонист или ингибитор по настоящему изобретению: а) предназначен для терапевтического (например, иммунотерапевтического), диагностического или профилактического применения и(или) (b) находится в фармацевтическом наполнителе, в форме стандартной дозы или в форме,пригодной для местного или системного введения. Также настоящим изобретением представляется агонист, активатор или имитатор RP-фактора. Предпочтительно агонист, активатор или имитатор включает: (а) антитело к рецептору/конвертазе RPфактора в соответствии с описанным в данном тексте; и(или) (b) мутантный вариант RP-фактора, включающий (или по сути состоящий из) детерминирующий специфичность домен RP-фактора; и(или) (с) мутантный вариант RP-фактора, включающий (или состоящий из) сигнальный домен RP-фактора; и(или)(d) функциональные комбинации (а)-(с) в любом сочетании. Агонист, активатор или имитатор может быть: а) предназначен для терапевтического (например,иммунотерапевтического), диагностического или профилактического применения и(или) b) в фармацевтическом наполнителе, в форме стандартной дозы или в форме, пригодной для местного или системного введения, или в смеси с антибиотиком. Предпочтительно агонист, активатор или имитатор может быть предназначен для использования в качестве дополнительного терапевтического средства (например, в препарате или в сочетании с проти- 13007413 вомикробным агентом, например антибиотиком). Также настоящее изобретение представляет выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую RPфактор (или его гомолог, производное, аллельную форму, видовой вариант, мутантный вариант или эквивалент) или рецептор/конвертазу RP-фактора (или его гомолог, производное, аллельную форму, видовой вариант, мутантный вариант или эквивалент) по настоящему изобретению. Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению, следовательно, охватывают ДНК, характеризующиеся любой последовательностью, если только она кодирует белки по настоящему изобретению. Для специалиста в данной области должно быть понятно, что в результате вырожденности генетического кода любая конкретная аминокислотная последовательность по настоящему изобретению может кодироваться множеством разных последовательностей. Таким образом, последовательность нуклеиновой кислоты может быть выбрана или оптимизована, например, в связи с библиотекой кодонов, характерной для любой конкретной клеткихозяина. Также настоящее изобретение представляет векторы (например, экспрессирующий вектор), включающие нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. С точки зрения настоящего изобретения тип вектора не принципиален. Может быть использован любой подходящий вектор, включая плазмиды, вирусы, фаги, транспозоны, минихромосомы, липосомы или механические носители. Экспрессирующие векторы по настоящему изобретению являются ДНК-конструкциями, пригодными для экспрессирования ДНК, которая кодирует желательный белковый продукт (например, RP-фактор или рецептор RP-фактора), который может включать: (а) регуляторный элемент (например, промотор,оператор, активатор, репрессор и/или энхансер); (b) структурную или кодирующую последовательность,которая транскрибируется с образованием мРНК; и (с) подходящие последовательности инициации и терминации транскрипции и трансляции. Они могут также включать последовательность, кодирующую любую из различных меток (например, призванных облегчить последующую очистку экспрессированного белка, такие как аффинные, например (полигистидиновые) метки). Конкретно предпочтительными являются векторы, которые включают контролирующие экспрессию элемент или элементы, функционально присоединенные к ДНК по настоящему изобретению, что обеспечит экспрессию последней на подходящем уровне. Может быть использован любой из широкого круга контролирующих экспрессию элементов, и контролирующие элемент или элементы могут быть,например, выбраны из промоторов, энхансеров, сайтов связывания на рибосомах, операторов и активаторных последовательностей. Такие контролирующие экспрессию элементы могут включать энхансер, например, могут быть регулируемыми, в частности, будучи индуцибельными (за счт добавления индуктора). По использованию в данном тексте термин функционально присоединн обозначает состояние,при котором участки линейной последовательности ДНК способны влиять на активность других частей той же самой линейной последовательности ДНК. Например, ДНК для сигнального пептида (секреторный лидер) функционально присоединена к ДНК, кодирующей полипептид тогда, когда она экспрессируется в предшественник, участвующий в секреции данного полипептида; промотор функционально присоединн к кодирующей последовательности, если он контролирует транскрипцию этой последовательности; сайт связывания на рибосоме функционально присоединн к кодирующей последовательности, если он расположен так, чтобы обеспечить трансляцию. Дополнительно вектор может включать позитивный селективный маркр и(или) негативный селективный маркр. Использование позитивного селективного маркра облегчает отбор и(или) идентификацию клеток, несущих данный вектор. Также настоящим изобретением представляются клетки-хозяева, несущие вектор по настоящему изобретению. Может быть использована любая подходящая клетка-хозяин, включая прокариотические клетки-хозяева (такие как Escherichia coli, Streptomyces spp. и Bacillus subtilis) и эукариотические клеткихозяева. В другом аспекте настоящее изобретение представляет культуральную или транспортную среду,содержащую RP-фактор (или его гомолог, производное, мутантный вариант или эквивалент) по настоящему изобретению. Культуральная среда может иметь любую из стандартных форм, таких как, например, агаровые пластины, бульоны, скошенные пластины, покрытые стержни, покрытые зонды, мембраны, покрытые или заполненные лунки или плнки. Среда может быть определнной или сложной средой и может содержать индикаторные красители, призванные облегчить идентификацию культивируемых микроорганизмов. Предпочтительно среда пригодна для культирования или транспортировки бактерий,например, Mycobacterium spp., Streptomyces spp. и Corynebacterium spp. Также настоящее изобретение представляет нуклеотидный зонд, включающий нуклеиновую кислоту, комплементарную нуклеиновым кислотам по настоящему изобретению. Такие зонды предпочтительно специфичны по гибридизации с нуклеиновой кислотой, кодирующей белки (например, RP-фактор или рецепторы/конвертазы RP-факторов) по настоящему изобретению. Обычно они являются одноцепочечными ДНК- или РНК-зондами. Также настоящее изобретение представляет диагностический набор реактивов, включающий фактор (или его гомолог, производное, мутантный вариант или эквивалент), рецептор, антитело, зонд или- 14007413 культуральную среду по настоящему изобретению. В другом аспекте настоящее изобретение представляет антисмысловую ДНК, соответствующую нуклеиновой кислоте, кодирующей RP-фактор или рецептор/конвертазу RP-фактора по настоящему изобретению. Также настоящее изобретение представляет способ выработки противомикробного лекарственного агента, включающий следующие стадии: (а) взятие рецептора RP-фактора; (b) взятие предполагаемых лекарственных агентов; (с) скрининг предполагаемых агентов путем контактирования рецептора/конвертазы RP-фактора с одним из предполагаемых агентов и определение аффинности предполагаемого агента в отношении рецептора RP-фактора, при том, что аффинность есть индекс противомикробной активности; и, что необязательно, (d) синтез или очистка агента, обладающего противомикробной активностью на основании идентичности предполагаемого агента, подвергнутого скринингу на стадии(с). Предпочтительно способ получения противомикробного агента включает стадии: (а) взятие рецептора/конвертазы RP-фактора; (b) взятие предполагаемого агента; (с) взятие RP-фактора; (d) скрининг предполагаемых агентов путем контактирования рецептора/конвертазы RP-фактора с одним из предполагаемых агентов в присутствии RP-фактора с последующим определением способности предполагаемого агента непродуктивно конкурировать с RP-фактором за связывание с рецептором RP-фактора, при том, что способность к конкурентному связыванию является показателем противомикробной активности; и, что необязательно, (е) синтез или очистка агента, обладающего противомикробной активностью на основании идентичности предполагаемого агента, подвергнутого скринингу на стадии (d). Настоящее изобретение также охватывает противомикробное средство, выработанное (или полученное) с применением способа по настоящему изобретению, а также его производные. Также настоящим изобретением представляется способ определения микробиологического качества продукта (например, пищевого продукта, фармацевтического препарата или медицинского материала),включающий стадию контактирования образца такого продукта с RP-фактором (например, с RPфактором, определенным здесь выше). В таких способах RP-фактор предпочтительно формирует часть питательной композиции (например, пластины, бульона, пленки или стержня). В другом аспекте настоящее изобретение касается способа культивирования бактериальных (например, микобактериальных) клеток, включающего стадию инкубации этих клеток в культуральной среде, содержащей RP-фактор (например, RP-фактор, определенный здесь выше). Также настоящим изобретением представляется способ диагностики ex vivo, включающий стадию контактирования биологического образца с RP-фактором (например, RP-фактором, определенным здесь выше). Диагностический способ по настоящему изобретению предпочтительно включает стадию инкубации культуральной или транспортной среды по настоящему изобретению с целью обеспечения роста клеток в биологическом образце (например, бактериальных клеток). Также настоящим изобретением представляется способ: (а) стимуляции роста микроорганизма; и(или) (b) оживления покоящегося, умирающего или латентного микроорганизма, включающий стадию контактирования данного микроорганизма с RP-фактором (например, RP-фактором, определенным здесь выше). Настоящее изобретение также представляет способ получения рекомбинантного RP-фактора или рецептора/конвертазы RP-фактора по настоящему изобретению, включающий стадии: (а) культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению и (b) очистку фактора или его рецептора/конвертазы от культивируемых клеток-хозяев (например, от культурального супернатанта или клеточной фракции). Также настоящим изобретением представляется способ получения рекомбинантного RP-фактора или рецептора/конвертазы по настоящему изобретению, включающий стадии: (а) зондирование генной библиотеки с использованием нуклеотидного зонда, который способен избирательно гибридизовать с соответствующим структурным геном, давая этим сигнал, который указывает на ген, избирательно гибридизующий с зондом; (b) экспрессию гена, идентифицированного на стадии (а) (например, путем клонирования в клетку-хозяин, например, в соответствии с определенным выше способом) с получением фактора или рецептора. Также в объем включены рекомбинантный RP-фактор или рецептор/конвертаза, получаемые вышеописанными способами. Медицинские применения Настоящее изобретение позволяет выделить, синтезировать и рациональным образом сформировать широкий круг новых медикаментов и фармацевтических средств, предназначенных для терапевтического, профилактического и диагностического применения. Различные формы терапии, профилактики и диагностики, в которых могут найти применение материалы по настоящему изобретению, могут включать изменение, прерывание или ослабление (RPфакторного) сигнального механизма оживления одного или большего числа инфекционных патогенов. Таким образом, материалы по настоящему изобретению находят принципиальное применение в качестве противомикробных агентов, например в качестве противобактериальных агентов. Следовательно,- 15007413 они могут быть использованы для лечения, профилактики или диагностики микробных (например, бактериальных) инфекций, в частности, тех инфекций, которые связаны с латентностью (например, микобактериальных инфекций). Таким образом, настоящее изобретение может быть, например, использовано для предотвращения,снижения или пресечения: (a) оживления латентного (или покоящегося) патогена; и(или) (b) роста патогена; и(или) (с) размножения и распространения патогена; и(или) (d) активации латентной инфекции (например, латентной бактериальной (например, микобактериальной) инфекции). В целом, материалы по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения состояний,при которых показано изменение, разрушение или ослабление сигнального (RP-факторного) механизма оживления или блокировка рецептора/конвертазы RP-фактора, связанного с инфекционным патогеном. Конкретно применимыми материалами, предназначенными для использования в таких способах терапии и профилактики, являются антагонисты или ингибиторы RP-фактора. Такие антагонисты или ингибиторы могут включать: антитела, специфичные в отношении к RP-факторам или рецептора/конвертазы RP-фактора, в соответствии с определнным в данном тексте; рецептор/конвертазу RPфактора по настоящему изобретению; мутантный вариант RP-фактора, например, такой, у которого изменн детерминирующий специфичность RP-фактора домен и(или) утрачен функциональный сигнальный домен. Антитела к RP-факторам обеспечивают ограничение и в конечном счте уничтожение эндогенныхRP-факторов у пациента, поражнного латентной микробной инфекцией. Антитела к рецептору RP-фактора непродуктивно связываются с рецепторами, ассоциированными с инфекционным патогеном. Антитела к конвертазе инактивируют (например, по типу стерического подавления) конвертазную активность, тем самым предотвращая процессинг зрелого RP-фактора. Эти антитела могут, таким образом, конкурентно подавлять связывание эндогенного RP-фактора с рецепторами/конвертазами, ассоциированными с инфекционными патогенами. С другой стороны, они могут с высоким уровнем аффинности связываться (и/или в существенной степени необратимо) с рецепторами/конвертазами RP-фактора, тем самым блокируя связывание RP-фактора как лиганда или процессинг зрелого RP-фактора. Сходная активность проявляется мутантными вариантами RP-факторов, обладающими изменнными специфичностью и(или) сигнальной активностью. В любом случае связывание RP-фактора с рецептором/конвертазой RP-фактора, необходимое для оживления латентных патогенов, роста патогена и(или) развития заболевания, ослабляется, снижается или предотвращается. Рецепторы RP-фактора, предназначенные в качестве лекарственных средств для данных способов,изымаются из сигнального механизма, в котором они в норме участвуют. Следовательно, они предпочтительно являются свободными (т.е. растворимыми или диспергированными) и(или) не связаны с мембранами. В этом случае у этого пациента могут быть установлены и поддержаны эффективные циркулирующие или системные концентрации свободного рецептора RP-фактора. В такой форме рецепторы RPфактора действуют как ловушки RP-фактора и вымывают (предпочтительно полностью удаляют) эндогенные RP-факторы у пациента, поражнного латентной микробной инфекцией. Следовательно, эти рецепторы снижают или предотвращают активацию (латентного) патогена и(или) стимуляцию роста патогена, тем самым замедляя или останавливая развитие инфекции. В другом аспекте настоящее изобретение может быть использовано для оживления или способствования оживлению (или активации или способствования активации) латентного (покоящегося) патогенного микроба in vivo, тем самым давая возможность проводить вспомогательное (дополнительное) противомикробное лечение. Дополнительные способы противомикробной терапии с указанными применениями - те, при которых полная эффективность зависит от наличия нелатентной или активной (т.е. растущей или размножающейся) популяции патогена-мишени (например, дополнительные способы лечения на основе применения антибиотиков). Таким образом, материалы по настоящему изобретению могут проявлять синергизм с различными противомикробными соединениями при проведении противомикробной терапии. В предпочтительном варианте настоящее изобретение применяется для повышения эффективности противомикробной терапии туберкулза, например, путм одновременного введения изониазида, рифампицина, пирзинамида и(или) этамбутола (или стрептомицина) или их сочетаний. Предпочтительными применимыми материалами для использования в таких способах лечения являются, например, RP-факторы по настоящему изобретению, агонисты, активаторы и имитаторы RPфакторов. Такие агонисты, активаторы или имитаторы могут включать: антитела к рецепторам RPфакторов, описанные здесь выше; конвертаза RP-фактора, определнная здесь выше; мутантный вариантRP-фактора, включающий (или состоящий из) детерминирующий специфичность RP-фактора домен; мутантный вариант RP-фактора, включающий (или состоящий из) сигнальный домен RP-фактора и(или) их функциональные сочетания. Антитела к рецепторам RP-факторов, предназначенные для использования в таких способах, - это такие антитела, которые необходимы для запуска эфферентного сигнального механизма, связанного с рецептором RP-фактора. Следовательно, они могут выполнять роль имитатора RP-фактора, нарушая ла- 16007413 тентность (покой) и обусловливая оживление патогена. Конкретно применимы в таких способах мутантные RP-факторы, характеризующиеся изменнной специфичностью (например, за счт мутирования или модифицирования в их составе детерминирующего специфичность домена). Такие мутантные RP-факторы могут быть активны в отношении широкого спектра патогенов (например, против практически всех патогенных или инфекционных микобактерий) или могут быть сконструированы активными в отношении конкретных патогенов (например, М.tuberculosis и М.leprae). Антитела, RP-факторы, рецепторы и конвертазы, обсуждавшиеся выше, могут быть введены напрямую или в виде живой вакцины. Такие живые вакцины содержат микроорганизмы, которые были сконструированы методами генетической инженерии с целью экспрессии (и предпочтительно секреции) терапевтически активных антител, RP-факторов, рецепторов и конвертаз по настоящему изобретению invivo. Следовательно, настоящее изобретение находит сво применение в лечении широкого круга микробных инфекций, а конкретно находит применение в лечении латентных микробных (например, бактериальных) инфекций. В предпочтительных вариантах настоящее изобретение находит применение в лечении актиномицетных или микобактериальных инфекций, например, тех, которые обусловлены М.tuberculosis, М.leprae,M.bovis, M.kansasii и М.avium. Другие инфекции, лечение которых возможно в соответствии с настоящим изобретением, включают Corynebacterium spp. (включая Corynebacterium diphtheriae), Tropheryma whippelii, Nocardia spp.spp., Gordona spp., Tsukamurella spp. и Oerskovia spp., равно как и другие патогенные организмы, относящиеся к группе высоко-GC грамположительных бактерий. Другими инфекциями, которые могут быть подвергнуты лечению, являются патогенные низко-GC грамположительные бактерии (например, Streptococcus spp., Staphylococcus spp., Listeria spp., Bacillus spp., Clostridium spp. и Lactobacillus spp.). Также настоящее изобретение может быть внесено в различные вакцины или иммунотерапевтические средства. Такие вакцины или средства направлены на один или большее число элементов сигнального пути, ассоциированного с RP-фактором, описанного в данном тексте (и, в частности, на сами RPфакторы или рецепторы/конвертазы RP-факторов). Следовательно, RP-факторы могут быть введены в составе вакцины или иммунотерапевтической композиции с целью индукции иммунного ответа, направленного на эндогенный RP-фактор пациента, тем самым снижая или предотвращая активацию патогена, а тем самым замедляя или останавливая развитие инфекционного заболевания. С другой стороны (или дополняя вышесказанное), рецепторы/конвертазы RP-факторов могут быть введены в составе вакцины или иммунотерапевтической композиции с целью вызвать у данного пациента иммунный ответ, направленный на рецепторы, специфичные для вырабатываемого патогеном RPфактора. В этом случае клеточные и (или) гуморальные иммунные ответы могут быть простимулированы против патогена(ов) и/или активации латентного патогена (или продолжения его роста или размножения) опосредованно через ослабление или блокировку сигнальных механизмов RP-фактора, что в результате приведт к замедлению или остановке развития инфекционного заболевания. Также настоящее изобретение находит свое применение в получении живых вакцин: могут быть созданы ослабленные штаммы микробов, у которых ген(ы), кодирующий (или регулирующий экспрессию или активность) один или несколько RP-факторов, является мутантным. Такие ослабленные вакцины могут основываться на мутантных штаммах актиномицетов, микобактерий (например, М.tuberculosis,M.leprae, M.bovis (например, M.bovis BCG), M.kanasii и М.avium), Corynebacterium spp. (включая Corynebacterium diphtheriae), Tropheryma whippelii, Nocardia spp. (включая Nocardia asteroides и Nocardia brasiliensis), Streptomyces spp. (включая Streptomyces griseus, Streptomyces paraguayensis и Streptomyces somalienesis), Actinomadura spp., Nocardiopsis spp., Rhodococcus spp., Gordona spp., Tsukamurella spp. иOerskovia spp., равно как и других патогенных организмов, относящихся к группе высоко-GC грамположительных бактерий. Конкретно применимыми в таких ослабленных вакцинах являются штаммы, несущие мутантные гены, кодирующие RP-факторы. Такие мутации могут являться мутациями сдвига рамки, делециями,вставками и(или) заменами нуклеотидов. В предпочтительных вариантах все такие мутации являются нулевыми (например, необратимыми нулевыми мутациями) и могут предотвращать рост данного микроба (например, ослаблять его). В других вариантах мутации могут обусловливать экспрессию мутантных RP-факторов, характеризующихся измененной специфичностью (например, таких, у которых мутирован или модифицирован домен, детерминирующий специфичность) и/или утратой функционального сигнального домена. Такие мутантные RP-факторы могут связываться с высоким уровнем аффинности(и/или по существу необратимо) и непродуктивно с рецепторами/конвертазами RP-факторов, тем самым блокируя связывание RP-фактора или процессинг с образованием зрелого RP-фактора. Ослабленные штаммы микробов по настоящему изобретению также могут нести мутации других генов (например,других генов, участвующих в контроле роста) и также могут нести один или несколько генетических- 17007413 маркеров. Биотехнологическое применение Хорошо известно, что подавляющее большинство (весьма вероятно, что более 99%) почвенных организмов пока не были включены в культуру. При этом также считается, что некультивируемые организмы существуют и в других источниках. Настоящее изобретение может быть использовано для выделения таких организмов путем культивирования из любого источника. Таким образом, настоящее изобретение предоставляет путь к проникновению в огромный резервуар биоразнообразия, про который известно, что он существует, но который до сих пор оставался недоступным. Таким образом, настоящее изобретение представляет беспрецедентный источник формирования библиотек потенциально применимых микроорганизмов и биологических молекул. Такие библиотеки затем могут быть использованы в скрининге способов, направленных на поиск продуктов, имеющих медицинское или промышленное применение. Следовательно, в другом аспекте настоящего изобретения представляется способ продуцирования библиотеки биологических молекул, включающий стадии: (а) получение образца (например, почвы, морской воды, пищи, пресной воды, ткани или производного от организма); (b) инкубацию этого образца в культуральной среде, содержащей RP-фактор (например, RP-фактор в соответствии с определенным настоящей заявкой выше или культуральный супернатант, содержащий RP-фактор), с получением культуры микроорганизмов; и (с) выделение микроорганизмов из культуры, полученной на стадии (b). Этот способ дополнительно может включать стадию скрининга выделенных микроорганизмов на выработку ими одной или большего числа представляющих интерес биологических молекул (например,метаболита, фермента, антибиотика [например, противовирусного, противобактериального или противогрибкового агента] или токсина). Также представляется биологическая молекула, выработанная (или полученная) описанным выше способом, или ее производное. В другом аспекте настоящее изобретение представляет способ формирования библиотеки микроорганизмов (например, бактерий), включающий стадии: (а) получение образца (например, почвы, морской воды, пищи, пресной воды, ткани или производного от организма); (b) инкубацию этого образца в культуральной среде, содержащей RP-фактор (например, RP-фактор в соответствии с определенным настоящей заявкой выше или культуральный супернатант, содержащий RP-фактор), с получением культуры микроорганизмов; и (с) выделение микроорганизмов из культуры, полученной на стадии (b). Также представляется микроорганизм, полученный указанным выше способом или его производное(например, его мутантный вариант). Поясняющие примеры Далее настоящее изобретение будет описано более подробно путем отсылки к нескольким примерам. Это имеет целью исключительно проиллюстрировать, но не ограничить настоящее изобретение каким бы то ни было образом. Описание чертежей Фиг. 1. Часть А. Сопоставление нескольких расшифрованных аминокислотных последовательностей продуктов, родственных RP-фактору генов M.luteus, M.tuberculosis, M.leprae и Streptomyces coelicolor. Белки, сходные с RP-фактором, были получены от М.tuberculosis (депозитарныеU38939, нуклеотиды 2406-2765 и Z81368, нуклеотиды 33932-34396) и М.leprae (депозитарныеL01095, нуклеотиды 12292-12759 и L04666, нуклеотиды 25446-24921). Представляющие интерес последовательности ДНК в Z81368 также охватываются последовательностьюAD000010. N-концевые остатки, соответствующие сегменту грамположительного сигнала, подчеркнуты. Последовательность L04666 М.leprae также может включать короткий 32-аминокислотный сегмент. Часть В. Сопоставление нескольких последовательностей продуктов генов, родственных YabE Bacillus subtilis. Сопоставление проведено в разделах (А и В), причем непосредственно сопоставляемые(имеющие партнера в другой последовательности) остатки выделены заглавными буквами. Те остатки,которые консервативны (или заменены по консервативному типу) в двух или большем числе последовательностей, выделены жирным шрифтом. В части А полностью консервативные остатки помечены знаком , а консервативные замены - точкой (.). Cperfring - неполная кодирующая рамка-1 (ОRF1) Clostridium perfringens (депозитарныйU04966); Caceto506 - неполная (ORF) из состава контига 506 (проект секвенирования генома клостридия Clostridium acetobutylicum). YocH B.subtilis и YabE B.subtilis - предсказываемые продукты генов YocH и YabE в соответствии с проектом секвенирования генома сенной палочки B.subtilis (депозитарныеBG13521 и Р 37456). Часть С. Сопоставление RP-факторных С-концевых доменов с известными и предполагаемыми белками, ассоциированными с клеточными стенками, других организмов. Полностью консервативные остатки отмечены звездочкой, а те, которые консервативны по крайней мере в 7 последовательностях, помечены точкой (.). Часть D. С-концевые мотивы (остатки 158-322) MtubMTV043. Часть Е. Сопоставление расшифрованной аминокислотной последовательности RP-фактораM.luteus и белка р 60 Listeria spp. Многие остатки, которые консервативны при сопоставлении С-кон- 18007413 цевой части RP-фактора M.luteus (остатки 125-220) и белка р 60 L.monocytogenes EGD (остатки 158-245),также оказываются консервативными в составе белка р 60 6 других видов листерий Listeria spp. Фиг. 2. Часть А. Последовательность гена, кодирующего RP-фактор, и расшифрованный продукт. Нуклеотидная последовательность набрана строчными буквами, а жирным шрифтом выделены затравки для ПЦР. Расшифрованная белковая последовательность показана заглавными буквами полужирным шрифтом (в соответствии с однобуквенным кодом). Белковые и пептидные микропоследовательности,использовавшиеся при конструировании олигонуклеотидов, представлены заглавными буквами и выделены курсивом. Часть В. 299-нуклеотидная последовательность ДНК-фрагмента, кодирующего часть RP-фактораStreptomyces coelicolor. Расшифрованная аминокислотная последовательность дана под последовательностью ДНК с использованием однобуквенного кода аминокислот. Фиг. 3. Профиль элюции активности по оживлению. Фракции, элюированные с DEAE-сефарозной колонки (см. раздел Материалы и методы) с 0,25 М KСl, переносили на колонку Mono-Q, которую элюировали 20 мл линейного градиента от 0,08 до 0,28 М KСl в 10 мМ буфера Трис-HCl с добавлением 10% глицерина, рН = 7,4. 10 мл разбавленной суспензии голодающих клеток (КОЕ=3 млн клеток/мл, общее число 1,2 млрд клеток/мл) добавляли к 200 мл среды LMM, дополненной 0,5% (в/о) лактата и 0,05% дрожжевого экстракта, содержащего 2 мкл каждой фракции, в 5-10 повторностях в анализатореBioscreen. Подробности описаны в разделе Материалы и методы. А. Поглощение при 280 нм и кратность концентрации KСl. В. Активность оживления. С. Электрофоретический в SDS-ПААГ профиль фракций после хроматографии на DEAE-целлюлозе и Mono-Q. Дорожки: 1 - маркеры (94, 67, 43, 30, 20,1,14,4 кД); 2 - фракции с DEAE-целлюлозной колонки; 3 - очищенные препараты (фракция 8 - с колонкиMono-Q). D. Снижение продолжительности лагфазы живых клеток. 10 мкл разбавленной суспензии живых клеток, находящихся в стационарной фазе роста (прижизненный подсчет - 20) вносили в 200 мкл среды LMM, дополненной 0,5% (в/о) L-лактата и содержащей по 2 мкл каждой из фракций (из различных экспериментов к показанному в частях А и В), в 5-10 повторностях в анализаторе Bioscreen. Видимую лагфазу оценивали путем экстраполяции кривой экспоненциальной фазы роста на ось абсцисс. Фиг. 4. Влияние очищенного RP-фактора на M.luteus.A. Зависимость активности RP-фактора по оживлению от концентрации: проводили оживление покоящихся клеток с использованием разных концентраций RP-фактора. 10 мкл разбавленной суспензии голодающих клеток (КОЕ=3 млн клеток/мл, общее число 5 млрд клеток/мл) добавляли к 200 мкл средыB. Рост промытых клеток. Клетки M.luteus в стационарной фазе роста, растущие в среде LMM,промывали 5 раз путем суспендирования и центрифугирования в LMM, из которой был удален лактат. В конце бактерий суспендировали в той же среде путем повторяющегося пропускания через шприц, разбавляли и высевали в 20-мл колбы, содержащие только LMM или LMM + 31 пкМ RP-фактора. Исходная плотность составила 250 живых клеток на 1 мл, а инкубацию проводили при 30 С при интенсивном встряхивании. Рост контролировали путем высева 0,1 мл образца на пластины, содержащие уплотненный агаром бульон Е. Фиг. 5. Выявление родственных RP-фактору генов у Micrococcus luteus, Mycobacterium smegmatis и(В) в серии экспериментов с оценкой по уровню мутности. М.smegmatis культивировали в бульоне Е, в который добавляли RP-фактор в концентрации 31 пкМ/л. Клетки высевали из расчета 200 на лунку и рост контролировали в анализаторе Bioscreen. M.bovis культивировали в среде Саутона в соответствии с описанным в разделе Материалы и методы, в который RP-фактор (620 пкМ/л) добавляли или не добавляли. Размер инокулята составлял 100 тысяч клеток на 1 мл, а показанная оптическая плотность является средней величиной, определенной в 10 разных измерениях по 10 отдельным пробиркам. Фиг. 7. А. Очистка His-хвостового RP-фактора. RP-фактор экспрессировали в клетках E.coliHSM174(DE3) и очищали в соответствии с описанным далее. Показаны электрофоретические в SDSПААГ профили фракций после хелатирующей хроматографии с никелем. В качестве маркров молекулярной массы (Sigma) использовали бычий сывороточный альбумин (67 кД), овальбумин (43 кД), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (36 кД), карбоангидразу (30 кД), ингибитор трипсина сои (20,1 кД) и лактальбумин (14,4 кД). Дорожки: 1 - маркры; 2 - неочищенный экстракт клеток E.coli, содержащий вектор рЕТ 19b; 3 - неочищенный экстракт клеток E.coli, содержащий pRPFl; 4 - очищенный рекомбинантный RP-фактор .B. Снижение продолжительности видимой лагфазы живых клеток M.luteus под влиянием очищенного рекомбинантного RP-фактора. Подробности эксперимента описаны в приложении к фиг. 3 С. Разбавление фактора 10 соответствует 33 мкг RP-фактора на 1 мл.C. Стимуляция роста промытых клеток M.luteus очищенным рекомбинантным RP-фактором. Клетки M.luteus в стационарной фазе роста, растущие в среде LMM, промывали 5 раз путм суспендирования и центрифугирования в LMM, из которой был удалн лактат. В конце бактерий суспендировали в той же среде путм неоднократного пропускания через шприц, разбавляли и высевали в 20-мл колбы, содержащие только LMM или LMM в присутствии RP-фактора (230 пкМ/л). Исходная плотность клеток составила примерно 100 живых клеток на 1 мл, а инкубацию проводили при 30 С при интенсивном встряхивании. Рост контролировали путм высева 0,1 мл образца на пластины, содержащие уплотннный агаром питательный бульон Е. Фиг. 8. А. Подавление роста Micrococcus luteus антисывороткой к RP-фактору. Бактерии высевали при исходной плотности 500 тысяч на 1 мл на лактатсодержащую минимальную среду (LMM) и время от времени контролировали оптическую плотность при 600 нм. Рост культуры отслеживали в течение свыше 140 ч. Образцы, помеченные LMM + антитело и LMM + контрольное антитело, содержали эквивалентные количества соответственно иммунной и преиммунной сыворотки. Иммунную сыворотку (Аb) и преиммунную сыворотку (контрольное Аb) разводили в соотношении 1:1000. В. Преодоление RP-фактором ингибиторного действия антисыворотки к RP-фактору на рост Micrococcus luteus. Бактерии высевали при исходной плотности 10 млн клеток на 1 мл и рост контролировали время от времени по оптической плотности OD600. Иммунную сыворотку (Аb) и преиммунную сыворотку (контрольное Аb) разводили в соотношении 1:1000, а RP-фактор добавляли при конечной его концентрации 50 нг/мл. Фиг. 9. Часть А. Сопоставление сегментов 9 RP-факторов (как объясняется далее, MtubZ94752 может являться соответствующим рецептором). Участки идентичности/сходства последовательности затенены. Продукт гена S.coelicolor показан в виде фрагмента . Часть В. Схематическое представление доменной структуры некоторых продуктов, кодируемых генами семейства RP-факторов. Фиг. 10. Влияние рекомбинантного RP-фактора на рост М.tuberculosis в среде Саутона. Среду Саутона, содержащую 0,05% Твин-80 и 100 мкмоль/л олеата натрия, а также 10% (o/o) добавки (которая содержит 50 г бычьего сывороточного альбумина, 20 г глюкозы и 8,5 г NaCl в расчете на 1 л), заражали из расчета исходной плотности клеток 31000 КОЕ на 1 мл (подсчет живых клеток проводили путем высева на уплотненную агаром среду Middlebrook-7H9, содержащую 10% (o/o) добавки, состав которой описан выше) [общий подсчет под микроскопом равен 1 млн клеток в 1 мл], используя 2,5-месячную культуру туберкулезной микобактерии М.tuberculosis штамма H37Ra, выращенной на той же среде. Рост культур в пробирках при 37 С измеряли величиной OD при 600 нм с интервалом 28 дней. Неразбавленные концентрации RP-факторов - Rpf (M.luteus) и Rpf2 (M.tuberculosis), - использовавшихся в данных экспериментах, составили приблизительно 10 мкг/мл. Примеры Материалы и методы. Организмы и культуральные среды.Micrococcus luteus NCIMB 13267 (ранее описанный как штамм Флеминга 2665) культивировали в аэробных условиях при 30 С в колбах-шейкерах в лактатной минимальной среде (LMM), содержащей Lлактат в соответствии с описанным выше. По достижении культурой стационарной фазы роста продолжали встряхивание при 30 С в течение 2 месяцев. Культуры затем выдерживали в аэробных условиях при комнатной температуре без встряхивания в течение ещ 2-3 месяцев. Видимая исходная жизнеспособность этих культур в данный момент времени (измеряемая сравнением подсчтов с высевом и под микроскопом) была менее 10-3.Mycobacterium smegmatis (быстрый штамм Всероссийского института контроля ветпрепаратов в Москве) выращивали либо в среде Саутона, либо в питательном бульоне Е (LabM). Для посева культур при исходной плотности 1000 клеток на 1 мл использовали прекультуры, выдерживавшиеся в течение ночи. Mycobacterium bovis (BCG), Mycobacterium tuberculosis H37RV и Mycobacterium avium выращивали в среде Саутона.M.luteus. Получение истощнной среды. Супернатант был получен после центрифугирования в конце логарифмической фазы роста культурM.luteus (200-1000 мл), выращенных в лактатной минимальной среде или в такой же среде, в которой лактат был заменн на сукцинат с добавлением 0,01% дрожжевого экстракта, из которого путм диализа были удалены все макромолекулы. Инокулят включал 2% клеток, выращенных на обогащенной среде(бульон Е, LabM), после чего его промывали средой LMM без лактата. Перед использованием полученные супернатанты пропускали через 0,22-мкм фильтр (Whatman).M.luteus. Определение жизнеспособности клеток с помощью высева. Использовали пластины, содержащие 1,3% питательного бульона Е (LabM) или лактатную минимальную среду. Разведения клеток выполняли в 4 повторностях с центрифугированием и автоклавированием истощнной среды, отбираемой из голодающих культур. Чашки для высева инкубировали при 30 С в течение 3-5 дней.M.luteus. Определение жизнеспособности клеток в тесте MPN. Тест MPN проводили с применением оптического анализатора роста Bioscreen С (Labsystems, Финляндия) с использованием лактатной минимальной среды, дополненной 0,5% лактата и 0,05% дрожжевого экстракта, взятых в качестве оживляющей среды. Разведения голодающих клеток выполняли в соответствии с описанным. По 10 мкл каждого разведения (5-10 повторностей) добавляли в лунку, содержащую 200 мкл либо лактатной минимальной среды с добавлением 0,5% лактата и 0,05% дрожжевого экстракта, либо той же среды с тестируемыми фракциями (2-20 мкл). Рост (оптическую плотность) контролировали с использованием 600-нм светофильтра. Чашки инкубировали при 30 С при интенсивном непрерывном встряхивании. Общий период измерений составил 120 ч, а каждую лунку тестировали ежечасно. Фракции, полученные после хроматографии, диализовали против элюционного буфера 2 (см. далее), разводили в оживляющей среде в различных пропорциях (1:10, 1:100, 1:500, 1:1000, 1:5000,1:10000) и отфильтровывали через тельмановские фильтры с порами 0,22 мкм с последующим тестированием. Расчет MPN основывался на известных таблицах. Общий подсчет клеток. Неокрашенные клетки подсчитывали с помощью фазоконтрастного микроскопа с использованием модифицированного счетчика Нойбауэра. В долговременных экспериментах с микобактериями организмы перед обсчетом окрашивали реагентом Циля-Нильсена. Хроматография. Предварительно замоченную DEAE-целлюлозу добавляли к культуральному супернатанту (1:10,o/o) и инкубировали при 4 С в течение 1 ч при слабом встряхивании. Целлюлозу загружали на колонку и промывали 5 об. буфера 1, содержащего 10 мМ Трис-Сl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 10% (о/о) глицерина,рН=7,4 при 10 мМ KСl. Эту колонку поэтапно элюировали 2-3 базовыми объемами буфера 1 с 0,3 М KСl. Полученную фракцию медленно разбавляли буфером 1 на льду с достижением конечной концентрацииKСl 0,08 М. Сорок колоночных объемов этой фракции затем загружали на быстроточную колонку изDEAE-сефарозы (1 часть сефарозы, предварительно уравновешенной буфером 1, содержащим 0,08 МKСl). Эту колонку промывали 5 базовыми объемами буфера 1, содержащего 0,08 М KСl, и поэтапно элюировали 3 об. буфера 1, содержащего 0,25 М KСl. Полученную фракцию вновь медленно разбавляли буфером 1 на льду до конечной концентрации 0,08 М KСl, отфильтровывали через тельмановский фильтр 0,22 мкм и загружали на колонку Mono-Q (модель HR5/5, предварительно упакованная, Pharmacia), уравновешенную буфером 2, содержащим 10 мМ Трис-Сl, 10% глицерина, рН=7,4, 0,08 М KСl. Колонку Mono-Q элюировали линейным градиентом хлорида калия от 0,08 М до 0,28 М в буфере 2 (общий объем элюции составил 20 мл). Скорость потока и размер фракции составили соответственно 1 мл/мин и 1 мл на пробирку. Все манипуляции, за исключением этапа хроматографии на колонке Mono-Q,проводили при 4 С. Полученные фракции диализовали против 10 мМ Трис-Сl, содержащего 10% глицерина (диализ является важным этапом с точки зрения сохранения активности) и хранили при 4 С вплоть до 5 дней без потери активности. Для более длительного хранения путем глубокой заморозки фракции диализовали тем же образом с добавлением глицерина в конечной концентрации 20-30% (в/о). Содержание белка в очищенных препаратах оценивали по триптофановой флуоресценции с использованием лизоцима в качестве стандарта. Обработка трипсином. Трипсин добавляли к активной диализованной фракции, полученной с колонки Mono-Q и разведенной средой LMM, дополненной 0,5% (в/о) лактата и 0,05% дрожжевого экстракта (1:100) (конечная концентрация трипсина - 50 мкг/мл). Полученную смесь инкубировали в течение получаса при 37 С. Реакцию останавливали добавлением ингибитора трипсина (100 мкг/мл). В контрольных экспериментах ингибитор трипсина добавляли к смеси (100 мкг/мл) перед инкубацией.- 21007413 Электрофорез в ПААГ. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ) проводили по методу Лэммли. Хроматографические фракции диализовали против 10 мМ Трис-HCl, рН=7,4 в течение 4-5 ч, высушивали в вакуумной центрифуге (полтора часа), растворяли в буфере для образцов (Sigma, S3401), загружали в 15%-ный акриламидный гель и разгоняли при напряжении постоянного тока 200 В. Гель окрашивали коллоидным кумасси G (Sigma). Химикаты. Питательный бульон Е, дрожжевой экстракт и агар были получены от LabM, в то время как Lлактат (литиевая соль молочной кислоты), сукцинат, трипсин, соевый ингибитор трипсина и быстроточная DEAE-сефароза были получены от Sigma. DEAE-целлюлоза DE52 была получена от Whatman, а колонки Mono-S и Mono-Q - от Pharmacia. Другие химреактивы имели степень чда и были получены отSigma или BDH. Манипуляции с ДНК. Аминокислотные микропоследовательности N-конца (ATVDTWDRLAEexSNGTxD) и внутреннего пептида (VGGEGYPHQASK), взятые от очищенного RP-фактора, были использованы при конструировании двух олигонуклеотидов, обозначенных А 1 (GCSACSGTSGACACSTGGGACCGSCTSGCSGAG) и А 2 (GCYTGRTGIGGRTAICCYTCICC) соответственно. Полимераза Taq была использована в стандартных условиях для цели амплификации 147-нуклеотидного ПЦР-продукта из ДНК M.luteus при использовании указанных затравок. ПЦР-продукт, полученный на материале ДНК M.luteus с этими затравками, помечали дигоксигенином и использовали в качестве зонда для Саузерн-блоттинга. Обработанную рестриктазой SmaI геномную ДНК фракционировали по размеру с помощью электрофореза в агарозном геле и примерно 1400-нуклеотидные фрагменты были клонированы в состав плазмиды pMTL20 с поддержанием ее в клетках E.coli штамма DH5. Две рекомбинантные плазмиды, включающие желательную вставку, выявили при гибридизации, что было подтверждено с помощью ПЦР с олигонуклеотидами А 1 и А 2, а одну из них напрямую секвенировали по обеим цепям с использованием метода Сэйнджера. Стандартные процедуры были использованы для выделения ДНК из M.luteus и M.smegmatis. ДНКStreptomyces rimosus была любезно предоставлена Д-ром D.Hranueli. Саузерн-блот-гибридизацию с ДНК(0,lxSSC, 65C) после этого применяли для скрининга сформированной космидной библиотеки ДНКRP-фактор, очищенный на материале культуральных супернатантов клеток, выращивавшихся в лактатной минимальной среде в соответствии с описанным в разделе Материалы и методы, выявил присутствие существенного количества полимерного материала, элюируемого со всех типов использовавшихся хроматографических колонок, которые подавляют оживление покоящихся клеток и рост жизнеспособных клеток M.luteus. Более того, повышенные концентрации этого материала могут даже обусловливать лизис клеток (данные не включены). Этот обладающий ингибиторной активностью материал,по-видимому, является производным от лактата полимером, поскольку содержащая лактат культуральная среда LMM, сохраняемая на протяжении 10 ч при комнатной температуре без клеток, но подвергаемая такой же процедуре очистки, проявляет ингибиторные свойства, сходными с теми, которые характерны для истощенной среды. Для избежания этой проблемы заявители поменяли лактат в составе культуральной среды на сукцинат, хотя для обеспечения хорошего роста подтверждается необходимость добавления небольшого количества (0,01% в/о) дрожжевого экстракта, диализованного с целью удаления макромолекул. После использования сукцинатных культур активную фракцию очищали с использованием сочетания анион-обменной среды (см. раздел Материалы и методы). Конечную активность элюировали при примерно 180 мМ KСl в линейном градиенте KСl (от 0,08 до 0,28 М KСl) с колонки Mono-Q в трех соседних фракциях (фиг. 3). Заслуживает внимания быть отмеченной важность проведения диализа фракций перед тестированием их активности, потому что некоторые из фракций были неактивными до проведения диализа. Активные фракции не меняют своей активности по оживлению после разбавления вплоть до 400-кратного (о/о). Интересно, что те фракции, которые были активными по индукции оживления, также могли интенсифицировать рост живых клеток. Материал, способный обусловливать оживление, полученный на заключительном этапе очистки,был тестирован методом электрофореза в SDS-ПААГ. Было подтверждено, что конечный продукт (фиг. 3 С) включает единственный белок, характеризующийся молекулярной массой примерно 16 кД. Все активные фракции включают единственный бэнд с максимальным содержанием белка во фракции N9. Клонирование гена RP-фактора. Две затравки были сформированы на основании анализа данных по микропоследовательностям, находящимся в N-конце очищенного RP-фактора и во внутреннем пептиде. Они были использованы для амплификации 147-нуклеотидного фрагмента ДНК M.luteus, который был клонирован и секвенирован. Затем полноразмерный ген был получен с использованием сочетания применения инверсионной ПЦР с- 22007413 использованием олигонуклеотидов G1 и G2 и выделения 1400-нуклеотидного геномного SmaIфрагмента. Проведенное секвенирование выявило, что исходный ПЦР-продукт являлся частью гена, способного кодировать белок, включающей сигнальный сегмент (фиг. 2 А). Предсказываемый размер секретируемой формы продукта этого гена составляет 19148 Д, а его предсказываемая N-концевая аминокислотная последовательность соответствует данным по микропоследовательности белка, включая остатки,которые не использовались при конструировании затравок (фиг. 2 А). Тот факт, что предсказанный генный продукт больше, чем RP-фактор, очищенный из культуральных супернатантов, предполагает, что он, например, может секретироваться в виде предшественника, который затем превращается в свою биологически активную форму после контакта с соответствующим ему рецептором/конвертазой. Идентификация гомологов RP-фактора. Скрининг в программе BLAST был предпринят с использованием в качестве запрашиваемого объекта расшифрованной по кодирующей рамке M.luteus аминокислотной последовательности. Семь генов,характеризующихся существенным сходством, были секвенированы ранее. Пять были найдены у М.tuberculosis и два - у Mycobacterium leprae (фиг. 1 А). Один или большее число генных продуктов у каждого организма предположительно имели сигнальные сегменты секреции (на фиг. 1 А подчеркнуты). Функции предсказанных продуктов этих микобактериальных генов неизвестны; они были найдены при осуществлении проектов по секвенированию геномов. Скрининг BLAST также выявил сходство между остатками 126-220 последовательности RP-фактора и консервативного сегмента (главных внеклеточных) белков р 60, которые были вовлечены в процесс прикрепления клеток Listeria spp. к фибробластам 3 Т 6 мыши: это, по-видимому, указывает на вероятную роль RP-фактора или продукта его протеолитического расщепления в процессах адгезии M.luteus (фиг. 1E). Как и М.tuberculosis и М.leprae, M.luteus имеет второй ген, сходный с геном, кодирующим RPфактор. В Саузерн-блот-гибридизации с использованием образцов ДНК, расщепленной рядом различных рестриктаз, и клонированного 147-нуклеотидного фрагмента в качестве зонда (фиг. 5 А и 5 В), выявляется два бэнда гибридизации. Более сильный гибридизационный сигнал образуется геном, кодирующим секретируемый RP-фактор. Другой ген может соответствовать одному из других микобактериальных генов,идентифицированных выше. Данные гибридизации по Саузерну с использованием 147-нуклеотидного фрагмента в качестве зонда, а также данные ПЦР с использованием двух олигонуклеотидов, сформированных по параметрам высококонсервативных аминокислотных мотивов, взятых в качестве затравок, показывают, что гены, кодирующие белки, сходные с RP-фактором, характеризуются существенным распространением, по крайней мере, среди грамположительных бактерий, ДНК которых характеризуется высоким содержанием парыGC. Сходные гены выявляются любыми из этих методов или обоими методами у всех шести видов стрептомицетов, которые были протестированы, включая Streptomyces rimosus (фиг. 5 С), равно как и у других микобактерий, включая Mycobacterium smegmatis (четыре сходных гена - фиг. 5 С), Mycobacteriumbovis (BCG) и Corynebacterium glutamicum (2 сходных гена). Структура домена. Информация о последовательностях показывает, что ген RP-фактора и все его микобактериальные гомологи включают одинаковый сигнальный сегмент и, в частности, высококонсервативный сегмент,состоящий примерно из 70 остатков. Один из них (MTubZ94752) также включает мотив мембранного якоря. Консервативный 70-пептидный сегмент предположительно соответствует сигнальному домену. Большая часть этого участка слабо гидрофильна (Kyte-Doolittle) и предположительно образует амфипатическую -спираль (Garnier-Robson; Chou-Fasman) или участки -плоскостей (Eisenberg). В целом, этот сегмент характеризуется низкой поверхностной вероятностью (Emini). Напротив, С-концевой участок характеризуется гораздо меньшим уровнем консервативности, а поэтому весьма вероятно может рассматриваться как предполагаемый локализующий или детерминирующий специфичность участок (например, как метка клеточного участка или как детерминирующий специфичность домен). По аналогии с сигнальными системами других белков (например, многих прогормонов у животных и системина у растений) возможно, что следующая сигнальная молекула является протеолитически расщепленным продуктом. Два кислых остатка - аспарагиновая кислота-7 и глутаминовая кислота-13 (нумерация в соответствии с последовательностью секретируемого белка M.luteus) - в пределах данного сегмента абсолютно консервативны. Фрагмент KAEQIKRAE (остатки 51-59) представляет собой высоковероятный поверхностный островок. Эти элементы могут образовывать часть функциональных доменов в составе белкаRP-фактора. Этот консервативный домен включает 4 консервативных остатка триптофана (один из которых находится в сегменте высокой поверхностной вероятности - DTWDR: остатки 4-8). В комплексе, образуемом гормоном роста человека и его первым рецептором, взаимодействия, вовлекающие два расположенных на поверхности молекулы белка рецептора остатка триптофана, обеспечивают более 75% связывающей свободной энергии данного межбелкового комплекса (ClacksonWells, 1995, Science, 267, 383386). Два консервативных остатка цистеина могут образовывать дисульфидный мостик. Результаты сопоставления, отображающие доменную организацию различных белков, показаны на- 23007413 фиг. 9 А и 9 В. Активность RP-фактора. Наряду с анализом на оживление покоящихся клеток, очищенный RP-фактор M.luteus был протестирован по его активности стимулировать рост M.luteus и некоторых других организмов. Он в значительной степени стимулирует рост M.luteus и M.smegmatis, но, по-видимому, он характеризуется более слабой активностью в отношении М.tuberculosis, M.bovis (BCG) и М.avium (см. фиг. 6). Во всех этих случаях имеет место укорочение видимой лагфазы в культуре (см. фиг. 3D, 4 В, 6 В и табл. 1). Анализируемый фактор активен в обедненной среде и в обедненной среде, дополненной дрожжевым экстрактом, но теряет активность после кипячения или обработки трипсином. В случае добавления примерно 40 пкмоль/л RP-фактора к промытым клеткам Mycobacterium smegmatis рост наблюдался через 20-24 ч, в то время как в контроле без RP-фактора рост не был отмечен в течение 6 дней. Сходные результаты были получены в экспериментах на медленнорастущих микобактериях. Рост M.bovis (BCG) также в значительной степени стимулировался добавлением 40 пкмоль/л RPфактора: рост был отмечен через 14 дней, в то время как в контроле без RP-фактора не выявил роста даже после 90 дней. Наконец, RP-фактор также стимулировал рост Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium avium и Mycobacterium kansasii (см. табл. 1). Таблица 1 Стимуляция роста микобактерий очищенным RP-фактором M.luteusc Рост оценивали под микроскопом (увеличение 600 х) через 14 дней инкубации; приблизительно 50 мкл каждой культуры фиксировали, окрашивали с использованием реагента Циля-Нильсена и подсчитывали. Значения в основном теле таблицы являются средними величинами клеток в поле микроскопа (подсчитывали по 10-20 таких полей)стандартное отклонение с указанием числа анализов в скобках. RP-фактор (после элюции с колонки Mono-Q и диализа) использовали в концентрации примерно 40 пкмоль/л; активность утрачивалась после обработки трипсином,нагревания (авто-клавирования) или фильтрации через мембрану, отсекающую частицы более 12 кД. В данном эксперименте использовали промытые клетки М.smegmatis. Выделение и характеристика гена, кодирующего второй гомолог M.luteus. Сочетание инверсионной ПЦР с олигонуклеотидами G1 и G2 (см. фиг. 2 А) в качестве затравок и клонирования геномных рестрикционных фрагментов подходящего размера может быть использовано для выделения гена, кодирующего второй гомолог у M.luteus. Затем может быть определена последовательность этого гена с учетом тщательного устранения любых возможных при ПЦР ошибок, для чего применяется анализ геномных клонов и прямое секвенирование ПЦР-фрагментов, полученных путем сочетания продуктов серии независимых реакций ПЦР. Сравнительный анализ последовательностей белков M.luteus, M.leprae и М.tuberculosis может затем быть использован для уточненного предсказания остатков, аминокислотных мотивов и структурных мотивов, которые могут быть важными в связи с их биологическими функциями. Сверхэкспрессия и очистка генного продукта M.luteus и М.tuberculosis в клетках E.coli. ПЦР-затравки могут быть сконструированы путем внесения подходящих рестрикционных сайтов таким образом, чтобы последовательности, кодирующие секретируемые формы RP-факторов M.luteus и М.tuberculosis могли быть амплифицированы и внесены в правильной по считыванию рамки ориентации в состав доступных на коммерческой основе плазмид (векторов рЕТ или pCAL). ПЦРамплифицированные фрагменты могут быть сначала клонированы в вектор pBluescript KS II (Stratagene) для того, чтобы вся их последовательность была проверена и возможные при ПЦР ошибки были удалены. (Этот же материал также может быть использован для направленного мутагенеза, см. далее). Конструкции рЕТ или pCAL затем могут быть использованы для достижения контролируемой экспрессии большого количества химерного белка, помеченного полигистидином или кальмодулином, который мо- 24007413 жет быть очищен по сути до гомогенного состояния за одну стадию. Наконец, хвосты, использовавшиеся для очистки этого белка, могут быть удалены (с использованием подходящих ферментов, например, энтерокиназы или тромбина). Экспрессия RP-фактора Micrococcus luteus в клетках E.coli. Две затравки (5'-GTCAGAATTCATATGGCCACCGTGGACACCTGGG-3') и (5'-TGACGGATCCTATTAGGCCTGCGGCAGGACGAG-3') были использованы для амплификации (5 циклов по 30 с при 94 С, 30 с при 60 С, 30 с при 72 С с последующими 15 циклами по 30 с при 94 С, 60 с при 72 С) кодирующей последовательности RP-фактора (т.е. лишенной сигнального сегмента) на материале клонированного 1400-нуклеотидного SmaI-фрагмента геномной ДНК. Вначале он был внесен в клетки E.coli DH5 в виде 567-нуклеотидного EcoRI/BamHI-фрагмента в плазмиде pMTL20 и затем вырезан как NdeI/BamHI-фрагмент длиной 562 пары нуклеотидов с последующим встраиванием в pET19b (Novagen) и снова внесением в клетки E.coli DH5. Была подтверждена последовательность ПЦР-продукта и векторной вставки плазмиды, обозначенной как pRPFl. RP-фактор был экспрессирован с плазмиды pRPFl после трансформации с ее использованием клеток E.coliHSM174(DE3). Белок, включающий декагистидиновую метку хвост с N-конца, выделяли путем обработки бактерий ультразвуком, выращенных до оптической плотности (600 нм) 0,6 и индуцированных 4 часовой обработкой 0,4 мМ IPTG, в модифицированный связывающий буфер (МВВ - 5 мМ имидазола,рН=7,9; 0,5 М NaCl, 20 мМ Трис-НСl, 8 М мочевины), содержащем 5 мМ дитиотреитола и 2 мМ ЭДТА. После низкоскоростного центрифугирования низкомолекулярные соединения, включая ЭДТА и дитиотреитол, удаляли путем элюции на сефадексовой G10 колонке, предварительно уравновешенной буфером МВВ. Никелевую хелатирующую колонку (иммобилизованная на сефарозу 6 В иминодиуксусная кислота, координированная Ni2+) загружали элюатом с колонки G10, промывали 20 об. МВВ и затем элюировали четырьмя 10-объемными аликвотами МВВ, содержащего последовательно 0,01 М, 0,05 М,0,2 М и 1 М имидазола. В конце эту колонку элюировали стрип-буфером (20 мМ Трис-HCl, рН=7,9; 100 мМ ЭДТА, 0,5 М NaCl). Моноклональные антитела к полигистидину (Sigma; клон His-1) использовали в иммуноблоттинге фракций, подвергнутых электрофорезу в SDS-ПААГ, и электроблоттингу с использованием стандартных методов. Полученные фракции диализовали против буфера 2 и тестировали на их биологическую активность в соответствии с описанным выше. Анализ рекомбинантного RP-фактора. Кодирующую последовательность, соответствующую секретируемой форме RP-фактора, начиная с остатка А 39, встраивали в вектор рЕТ 19b с получением плазмиды pRPF1 (см. далее). Экстракты IPTGиндуцированных клеток E.coli штамма HSM174(DE3), несущих pRPF1, индуцировали антителом к полигистидину. Мощный сигнал был связан с белком (наблюдаемая молекулярная масса 29 кД, расчетная молекулярная масса 22 кД), который был элюирован с аффинной колонки 1 М имидазолом (фиг. 7 А). Помеченный полигистидиновым хвостом белок, выделенный из клеток HSM174-(DE3), обусловливал снижение видимой лагфазы у живых клеток M.luteus, в то время как контроль (материал, элюированный с той же колонки при тех же условиях в варианте с присутствием в клетках только плазмидного вектора) такой активности не проявил (фиг. 7 В). Связь биологической активности с рекомбинантным белком, выработанным несущими плазмиду pRPF клетками E.coli, и отсутствие биологической активности у изогенного контроля, несущего плазмиду рЕТ 19b, однозначно указывает на то, что активной молекулой действительно является продукт гена rpf. Получение антител. Кролика иммунизовали трижды с недельным интервалом с использованием рекомбинантного RPфактора (рекомбинантный белок, получение которого описано выше). Этот белок вводили в количестве 300 мкг белка за 1 инъекцию в неполном адъюванте Фройнда (0,5 мл белка и 0,5 мл адъюванта). Кровь отбирали перед введением и на 11-й день после последней инъекции. Для получения фракций иммуноглобулинов использовали стандартный метод с полиэтиленгликолем. Антитела дополнительно очищали на суперозной колонке с белком-G в соответствии со стандартной прописью (Pharmacia). Конечную концентрацию белка доводили до 1 мг/мл с помощью спектрофотометра. С другой стороны, моноклональные антитела могут быть получены с использованием известных методов. Использование антитела к RP-фактору для подавления роста бактерий. Микрококки Micrococcus luteus высевали при исходной плотности 500 тысяч клеток на 1 мл на лактатную минимальную среду (LMM) и время от времени контролировали оптическую плотность при 600 нм. Рост культур контролировали в течение более 140 ч и присутствие антисыворотки к RP-фактору (полученной в соответствии с описанным в подразделе Получение антител) полностью подавляло рост бактерий (см. фиг. 8). Экспрессия RP-фактора М.tuberculosis в клетках E.coli. Две затравки (5'-ATCAGAATTCATATGGACGACATCGATTGGGACGC-3') и (5'-CGCAGGATCCCCTCAATCGTCCCTGCTCC-3') использовали для амплификации (5 циклов по 30 с при 94 С, 30 с при 58 С, 30 с при 72 С с последующими 25 циклами по 30 с при 94 С, 60 с при 72 С) кодирующей по- 25007413 следовательности RP-фактора (т.е. лишенной сигнального сегмента) на материале геномной ДНК М.tuberculosis штамма H37Rv. ПЦР-продукт вначале был внесен в клетки E.coli DH5 в виде 336 нуклеотидного EcoRI/BamHI-фрагмента в плазмиде pMTL20 и затем вырезан как NdeI/BamHI-фрагмент длиной 331 пара нуклеотидов с последующим встраиванием в pET19b (Novagen) и снова внесением в клетки E.coli DH5. Была подтверждена нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта и векторной вставки плазмиды, обозначенной как pRPF2. RP-фактор М.tuberculosis был экспрессирован с плазмидыpRPF2 после трансформации в клетки E.coli HSM174 (DE3). Белок, включающий декагистидиновую метку с N-конца, выделяли путем обработки бактерий ультразвуком, выращенных до оптической плотности(600 нм) 0,9 и индуцированных 4-часовой обработкой 0,4 мМ IPTG, в модифицированный связывающий буфер (ВВ - 5 мМ имидазола, рН=7,9; 0,5 М NaCl, 20 мМ Трис-НСl, 8 М мочевины). После низкоскоростного центрифугирования никелевую хелатирующую колонку (иммобилизованная на сефарозу 6 В иминодиуксусная кислота, координированная Ni2+) загружали надосадочной фракцией, промывали 20 об. ВВ, 20 об. ВВ, содержащего 100 мМ имидазола, и затем элюировали 10 об. ВВ, содержащего 0,5 М имидазола. Дополнительную очистку проводили методом хроматографии на колонке Mono-Q (см. далее, учтя, что солевой градиент был в диапазоне от 0,1 до 1 М NaCl). Моноклональные антитела к полигистидину (Sigma; клон His-1) использовали в иммуноблоттинге фракций, подвергнутых электрофорезу в SDS-ПААГ, и электроблоттингу с использованием стандартных методов. Полученные фракции диализовали против буфера 2 и тестировали на их биологическую активность в соответствии с описанным выше. Анализ рекомбинантного RP-фактора М.tuberculosis. Кодирующую последовательность, соответствующую секретируемой форме RP-фактора М. tuberculosis (g1655671; депозитарныйZ81368), начиная с аминокислоты D50, встраивали в плазмиду рЕТ 19b с получением плазмиды pRPF2 (см. далее). Экстракты IPTG-индуцированных клеток E.coli штаммаHSM174 (DE3), несущих pRPF2, индуцировали антителом к полигистидину. Мощный сигнал был связан с белком, который был элюирован с аффинной колонки 0,5 М имидазолом. Помеченный полигистидиновым хвостом белок из клеток HSM174 (DE3) обусловливал относительно слабое, но статистически достоверное усиление роста М.tuberculosis H37Rv, что показано на фиг. 10. Также он стимулировал ростM.luteus в среде LMM. Контрольная культура достигала конечной концентрации OD600=1,0, в то время как культуры, содержащие RP-фактор (в разведении 1:100000), достигали конечной величины OD600=2,06,0. Влияние RP-фактора M.luteus на рост клеток Mycobacterium tuberculosis, выделенных из макрофагов. В трех независимых экспериментах спящие латентные клетки М.tuberculosis, выделенные из культуры брюшинных макрофагов мыши, оживляли с использованием RP-фактора M.luteus. Общее число клеток М.tuberculosis в гетерогенной суспензии, полученной на материале мышиных макрофагов, определяли под микроскопом. Подсчет жизнеспособных (нелатентных) клеток проводили путем высева на уплотненную агаром среду Саутона, содержащую 10%-ную (о/о) добавку (в состав которой входит 50 г бычьего сывороточного альбумина, 20 г глюкозы и 8,5 г NaCl на 1 л), или методом MPN с использованием жидкой среды Саутона, содержащей 10% (о/о) той же добавки (см. выше). Количество живых клеток (в методе MPN) в этих клеточных суспензиях было повышено в 25-2500 раз в случае присутствия RP-фактора M.luteus (добавляемого в концентрации 10 нг/мл) (см. табл. 2). Все значения в таблице соответствуют количеству бактерий в 1 мл суспензии. Брюшинные макрофаги были выделены у мышей-альбиносов дикого типа с помощью стандартного метода. Заражение макрофагов туберкулезной микобактерией М.tuberculosis штамма Academiya (лабораторный штамм) проводили in vivo путем внутрибрюшинной инъекции миллионом клеток (общий счет) на 1 мышь с последующей 6-дневной инкубацией (первый пассаж). Для 2-го и 3-го пассажей макрофаги,находящиеся в монослойных культурах, инфицировали клетками М.tuberculosis, выделенными из макрофагов предыдущего пассажа. Таблица 2 Влияние RP-фактора M.luteus на рост клеток Mycobacterium tuberculosis, выделенных из макрофагов- 26007413 Макрофаги выращивали в монослойной культуре на пластиковых чашках Петри (1 млн клеток на 5 см 2) в стандартной среде RPMI, содержащей гентамицин и пенициллин (10 мкг/мл каждого), в стандартных условиях (смесь углекислого газа и кислорода, в инкубаторе при 37 С). Клетки М.tuberculosis выделяли из макрофагов, неоднократно пропуская их через тонкую иглу для шприца. Макрофаговый клеточный дебрис удаляли путем низкоскоростного центрифугирования и клетки М.tuberculosis собирали после этого путем центрифугирования при более высокой скорости. Влияние выключенных мутаций уаbЕ и уосН на рост Bacillus subtilis. Полноразмерный кодирующий участок гена уаbЕ вместе с фланкирующими последовательностями был амплифицирован из геномной ДНК В.subtilis с использованием затравок D11 (5'-GAAGAGAATTCCTTCCATCACGA-3') и D12 (5'-CCAAACGAATTCGGTCAATCAC-3') в виде 1803-нуклеотидного фрагмента. HindIII/BclI-фрагмент длиной 1186 пар нуклеотидов, охватывающий 3'-конец данной кодирующей последовательности, был вырезан из ПЦР-продукта, лигирован в состав HindIII+BamHIобработанной плазмиды pMTL20 и использован для трансформации клеток E.coli штамма DH5 с отбором на резистентность к ампициллину. Плазмида pYABE была выделена из одного из полученных трансформантов. HindIII/BamHI-фрагмент длиной 763 пары нуклеотидов, полностью попадающий в пределы кодирующей последовательности уаbЕ, был вырезан из pYABE, лигирован в состав HindIII +BamHI-обработанной плазмиды pMUTIN4, являющейся интегрирующейся плазмидой, которая может быть использована для получения выключенных мутаций B.subtilis (EdwardsErrington, 1997, Mol.Microbiol., 24, 905-915), и использовали для трансформации клеток E.coli штамма XL-1-Blue с отбором на резистентность к ампициллину. Плазмида pYAB2, включающая внутренний сегмент кодирующей последовательности гена уаbЕ, была выделена из одного из полученных трансформантов. HindIII/EcoRIфрагмент длиной 1207 пар нуклеотидов, охватывающий 3'-конец кодирующей последовательности уаbЕ,был вырезан из pYABE, лигирован в состав HindIII+EcoRI-обработанной плазмиды pMUTIN4 и использован для трансформации клеток E.coli штамма XLl-Blue с проведением отбора по резистентности к ампициллину. Плазмида pYAB3, включающая 3'-конец кодирующей последовательности гена уаbЕ, была выделена из одного из полученных трансформантов. Полноразмерный кодирующий участок гена уосН вместе с фланкирующими последовательностями был амплифицирован из геномной ДНК B.subtilis с использованием затравок D10 (5'GCAAGGATCCCAGACTAAAAAAACAG-3') и D9 (5'-ATCAGGATCCATATTATTAGTTTAAGA-3') в виде фрагмента длиной 1145 пар нуклеотидов. HpaI-фрагмент длиной 358 пар нуклеотидов, полностью попадающий в пределы кодирующей последовательности уосН, вырезали из ПЦР-продукта, лигировали в состав SmaI-обработанной плазмиды pMTL20 и использовали для трансформации клеток E.coli штаммаXLl-Blue с отбором на резистентность к ампициллину. Плазмида pYOC2a, включающая внутренний сегмент кодирующей последовательности гена уосН, была выделена из одного из полученных трансформантов. Вставку этой плазмиды затем вырезали из pYOC2a в виде EcoRI/HindIII-фрагмента длиной 385 пар нуклеотидов и встраивали в плазмиду pMUTIN4 с получением pYOC2. HindIII/BamHI-фрагмент длиной 307 пар нуклеотидов, охватывающий 3'-конец кодирующей последовательности уосН, вырезали из 1145-нуклеотидного ПЦР-продукта, лигировали в состав HindIII + BamHI-обработанной плазмидыpMUTIN4 и использовали для трансформации клеток E.coli штамма DH5 с отбором на резистентность к ампициллину. Плазмида рYОС 3, включающая ДНК-сегмент, охватывающий 3'-конец кодирующей последовательности гена уосН, была выделена из одного из трансформантов. Плазмиды pYAB2, pYAB3, pYOC2 и pYOC3 линеаризовали обработкой рестриктазой АраI, которая расщепляет векторную последовательность pMUTIN4 по единственному сайту, лигировали с использованием ДНК-лигазы Т 4 и использовали для трансформации клеток сенной палочки Bacillus subtilis штамма SA253 nonA nonB leuA8 arg-15 с проведением отбора на резистентность к эритромицину в обогащенной культуральной среде (LB + 1 мкг/мл эритромицина). Резистентные трансформанты (EmR) были затем выделены и протестированы методом Саузерн-блоттинга. С использованием интегрирующейся плазмиды в качестве зонда и расщепления хромосомной ДНК рестриктазой ApaI штаммы, несущие одну копию интегрирующейся плазмиды, проявили по два гибридизационных бэнда, в то время как для штаммов дикого типа (и любого спонтанно резистентного к эритромицину мутанта, которые также присутствовали) было выявлено по единственному гибридизационному бэнду. Анализ продуктов трансформации для каждой из четырех плазмид показывает, что продукты генов уаbЕ и уосН необходимы для роста В.subtilis (по крайней мере в определенных условиях). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Выделенный полипептид, стимулирующий оживление покоящихся, погибающих или латентных бактериальных клеток, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: а) последовательности из аминокислотных остатков 285-356 rpf (фактор оживления бактерий)Mycobacterium tuberculosis, MtubZ94752, представленной на фиг. 1 А, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности;- 27007413 б) последовательности из аминокислотных остатков 117-185 rpf Mycobacterium tuberculosis,MtubMTV043, представленной на фиг. 1 А, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; в) последовательности из аминокислотных остатков 44-115 rpf Mycobacterium tuberculosis,MtubMTV043, представленной на фиг. 1 А, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; г) последовательности из аминокислотных остатков 73-141 rpf Mycobacterium tuberculosis,MtubU38939, представленной на фиг. 1 А, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; д) последовательности из аминокислотных остатков 54-122 rpf Mycobacterium tuberculosis,MtubZ81368, представленной на фиг. 1 А, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; е) последовательности из аминокислотных остатков 43-114 rpf Mycobacterium leprae, Мlер 104666,представленной на фиг. 1 А, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; ж) последовательности из аминокислотных остатков 47-115 rpf Mycobacterium leprae, MlepL01095,представленной на фиг. 1 А, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; з) последовательности из аминокислотных остатков 10-77 rpf Streptomyces coelicolor, Scoeli6C12,представленной на фиг. 1 А, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; и) последовательности из аминокислотных остатков 44-111 rpf Micrococcus luteus, MlutZ96935,представленной на фиг. 1 А, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; к) последовательности из аминокислотных остатков 343-438 предсказанного rpf Bacillus subtilis,YabEBsubt, представленной на фиг. 1B, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; л) последовательности из аминокислотных остатков 193-288 предсказанного rpf Bacillus subtilis,YocHBsubt, представленной на фиг. 1B, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; м) последовательности из аминокислотных остатков 300-362 rpf Mycobacterium tuberculosis,MtubZ94752, представленной на фиг. 1B, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; н) последовательности из аминокислотных остатков 124-318 rpf Clostridium acetobutylicum,Caceto506, представленной на фиг. 1B, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности; и о) последовательности из аминокислотных остатков 1-81 rpf Clostridium perfringens, Cperfing, представленной на фиг. 1B, или по крайней мере на 20% идентичной указанной последовательности. 2. Выделенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что он является рекомбинантным. 3. Применение выделенного полипептида по п.1 или 2 в терапии, например иммунотерапии, диагностике или профилактике инфекции, обусловленной микроорганизмом. 4. Применение по п.3, отличающееся тем, что указанный полипептид находится в составе фармацевтического наполнителя в виде стандартной дозы или в форме, пригодной для местного или системного введения. 5. Фармацевтическая композиция для оживления покоящихся, погибающих или латентных бактериальных клеток, содержащая эффективное количество полипептида по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель. 6. Фармацевтическая композиция по п.5, представляющая собой вакцину. 7. Живая вакцина, включающая аттенуированные микроорганизмы и фармацевтическую композицию по п.5. 8. Рецептор, специфичный в отношении выделенного полипептида по п.1, содержащий рецепторный домен, включающий аминокислотную последовательность, обладающую по крайней мере 20% идентичностью или гомологией с любой из последовательностей, представленных в п.1. 9. Антитело или производное антитела, специфичное в отношении полипептида по п.1. 10. Применение антитела по п.9 в терапии, например иммунотерапии, диагностике или профилактике инфекции, обусловленной микроорганизмом. 11. Применение по п.10, отличающееся тем, что указанное антитело находится в составе фармацевтического наполнителя в виде стандартной дозы или в форме, пригодной для местного или системного введения. 12. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.1, используемый для оживления покоящихся, погибающих или латентных бактериальных клеток. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту по п.12. 14. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.12. 15. Вектор по п.14, отличающийся тем, что он является экспрессирующим вектором. 16. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор по любому из пп.14-15. 17. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.14 или 15.- 28007413 18. Диагностический набор для выявления оживших или неоживших покоящихся, погибающих или латентных бактериальных клеток, содержащий полипептид по п.1. 19. Культуральная среда, содержащая полипептид по п.1. 20. Среда для транспортировки бактериальных клеток, содержащая полипептид по п.1.