Полимерные реагенты, способы их получения, а также содержащие их конъюгаты и фармацевтические препараты

011351 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится в целом к новым полимерным реагентам, включающим специфическую внутреннюю структурную ориентацию, а также к конъюгатам этих новых полимерных реагентов. Кроме того, изобретение относится к способам синтезирования полимерных реагентов и способам конъюгирования полимерных реагентов в активные агенты и другие вещества. Кроме того, изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, а также к способам введения конъюгатов пациентам. Предпосылки к созданию изобретения Ученые и клиницисты сталкиваются с рядом проблем при попытках преобразовать активные агенты в формы, приемлемые для введения пациентам. Активные агенты, представляющие собой полипептиды, нередко вводят скорее путем инъекций, чем орально. В этом случае полипептиды вводятся в большой круг кровообращения и не подвергаются воздействию протеолитической среды желудка. Тем не менее, инъекционное введение полипептидов характеризуется рядом недостатков. Например, многие полипептиды имеют относительно короткий период полураспада, в результате чего возникает необходимость в повторных инъекциях, которые нередко вызывают дискомфорт и являются болезненными. Более того, ряд полипептидов может вызвать одну или несколько иммунных реакций с последствиями, в результате которых иммунная система пациента может быть активирована для разрушения полипептида. Таким образом, введение активных агентов, таких как полипептиды, часто является проблематичным,даже когда эти агенты вводятся инъекционным способом. Ряд успехов был достигнут при решении проблем введения активных агентов инъекционным способом. Например, конъюгирование активного агента до ввода растворимого полимера привело к образованию конъюгатов полимер-активный агент, обладающих пониженной иммуногенностью и антигенностью. Кроме того, указанные конъюгаты полимер-активный агент имеют значительно более длительный период полураспада по сравнению со своими неконъюгированными аналогами в результате сниженного очищения через почки и(или) пониженного ферментативного расщепления в большом круге кровообращения. В результате увеличения периода полураспада для конъюгата полимер-агент требуется менее частое дозирование, что, в свою очередь, снижает общее количество болезненных инъекций и количество посещений врача. Более того, активные агенты, которые лишь частично являются растворимыми, нередко демонстрируют значительное увеличение растворимости в воде при конъюгировании с водорастворимым полимером. Благодаря своей документально подтвержденной безопасности, а также одобрению Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов как для местного, так и внутреннего применения, полиэтиленгликоль был конъюгирован с активными агентами. Когда активный агент конъюгируется с полимером полиэтиленгликоля или ПЭГ, конъюгированный активный агент рассматривается как прошедший пегилирование. Коммерческий успех пегилированных активных агентов,таких как пегилированный интерферон -2 а PEGASYS (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ), пегилированный интерферон -2b PEG-INTRON (Schering Corp., Kennilworth, NJ) и ПЭГ-филграстим NEULASTA(Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) показал, что введение конъюгированной формы активного агента обладает существенными преимуществами по сравнению с неконъюгированными аналогами. Также были получены молекулы с более низкой молекулярной массой, такие как дистеароилфосфат тидилэтаноламин(Zalipsky (1993) Bioconjug. Chez. 4 (4): 296-299) и фторурацил (Ouchi et al. (1992) Drug Des. Discov. 9 (1): 93-105), конъюгированные с поли(этиленгликолем). Harris et al. предоставили анализ влияния пегиляции на фармацевтические препараты. Harris et al. (2003) Nat. Rev. Drug Discov. 2(3): 214-221. Несмотря на достигнутые успехи, конъюгация водорастворимых полимеров с активным агентом до сих пор имеет ряд проблем. Одной из таких проблем является деактивация активного агента при присоединении к относительно длинной молекуле полиэтиленгликоля. Несмотря на то, что относительно длинная молекула полиэтиленгликоля обеспечила бы более высокую растворимость в воде соответствующему конъюгату, активный агент-полимер, конъюгаты, содержащие такие длинные части полиэтиленгликоля, оказывались значительно неактивными in vivo. Была выдвинута гипотеза, что эти конъюгаты являются неактивными ввиду относительной длины цепи полиэтиленгликоля, которая эффективно обертывается вокруг всего активного агента, тем самым блокируя доступ к потенциальным лигандам, необходимым для активности. Проблема, связанная с неактивными конъюгатами, содержащими относительно крупные части полиэтиленгликоля, была частично решена путем использования разветвленных форм полимера. Пример такого разветвленного полимера описывается в US Patent5932462, Harris et al. В соответствии с описанием в патенте mПЭГ 2-N-гидроксисукцинимид может быть присоединен к доступной аминогруппе(например, аминогруппе, не являющейся физически блокированной ввиду конформационной структуры) на биологически активном протеине. Этот разветвленный полимер (имеющий молекулярную массу около 40000 Да), производимый Nektar Therapeutics (Huntsville, AL), имеет следующую структуру: в которой mПЭГ 20K - метоксиблокированный по концам производный полиэтиленгликоль, имеющий молекулярную массу около 20000 Да. Соединение этого разветвленного полимера с интерфероном -2 а позволяет получить конъюгат,содержащий амидную связь, соединяющую интерферон -2 а с полимером. Схематически конъюгат может быть представлен следующим образом: Этот конъюгат, серийно выпускаемый под торговой маркой PEGASYS, обозначающей пегилированный интерферон -2 а (Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ), показан для лечения гепатита С у взрослых больных. Несмотря на то, что использование разветвленного полимера может решить ряд проблем, связанных с относительно большими линейными полимерами, до сих пор остаются другие проблемы в области создания эффективных конъюгатов. Например, скорость расщепления in vivo в целом (хотя и необязательно) частично регулируется скоростью гидролиза, происходящего в определенный момент в ряде атомов, связывающих активный агент с полимером. Таким образом, относительно быстрая гидролитическая скорость может привести к неприемлемому конъюгату, имеющему слишком короткий период полураспада in vivo, в то время как относительно медленный гидролиз может привести к получению неприемлемого конъюгата, характеризующегося слишком длительным периодом полураспада in vivo. В конечном счете, полимеры, имеющие уникальный ряд атомов (как в самом полимере, так и в соответствующем конъюгате), могут привести к уникальным скоростям гидролиза, которые, в свою очередь, влияют на скорость расщепления конъюгата in vivo. Гидролиз конъюгатов некоторых активных агентов и mПЭГ 2-N-гидроксисукцинимида протекает в цепи атомов, соединяющих одну mПЭГ "ветвь" с другой, при условии, что один из метаболитов имеет молекулярную массу около 20000 Да. Одно предполагаемое место в цепи атомов для такого расщепления находится внутри части, расположенной непосредственно рядом с одной из mПЭГ частей в по является наиболее приемлемым местом для расщепления, т.к. только другие атолимере. Часть мы в цепи, соединяющие одну ветвь mПЭГ с другой, являются рядом атомов углерода, входящих в метиПри леновые группы, которые относительно более стойки к расщеплению in vivo, чем часть расщеплении отделенная форма полимера представляет собой mПЭГ-ОН. Таким образом, основываясь,по меньшей мере, частично на преимуществах формирования mПЭГ-ОН, обеспечивается достижение уникальной скорости гидролиза. Тем не менее, было бы желательным получать полимеры таким образом, чтобы их скорости гидролиза могли бы быть адаптированы под потребителя. Например, в отношении обычного еженедельного введения пегилированного интерферона -2 а более медленная скорость гидролиза позволила бы увеличить периоды между ведением препарата. Кроме того, конъюгаты, имеющие исключительно длительный период полураспада in vivo, могли бы быть усовершенствованы путем повышения восприимчивости конъюгатов к гидролизу. Более широкая гамма полимеров, характеризующихся уникальными скоростями гидролиза, позволила бы исследователям и ученым получить конъюгаты полимер-активный агент, адаптированные под потребителя с целью достижения (помимо всего прочего) требуемой более высокой растворимости в воде и(или) скорости расщепления in vivo. Более того, полимеры, имеющие уникальные скорости гидролиза, могли бы быть использованы не только для разветвленных полимеров, но и для других форм (например, линейных или многоответвленных). Таким образом, до сих пор существует необходимость в полимерах, обеспечивающих (помимо всего прочего) уникальные ряды атомов с целью обеспечения скоростей расщепления адаптированных под потребителя. Насколько известно заявителям, описанные в настоящем патенте полимеры, конъюгаты, препараты и способы являются новыми и до настоящего времени не предлагались специалистами в данной области техники. Краткое изложение существа изобретения Основной целью настоящего изобретения, соответственно, является создание полимерного реаген-2 011351 та, содержащего следующую структуру: Водорастворимый полимер Формула (I) где "водорастворимый полимер" является водорастворимым полимером, выбранным из группы, состоящей из полиалкиленоксида, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиоксазолина, полиакрилоилморфолина и полиоксиэтилированных полиолов, каждая независимо обозначает прямую ковалентную связь или спейсерную часть; R1 обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы,состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, где термин замещенный относится к не-интерферирующему заместителю, такому как С 3-C8 циклоалкил; фторо, хлоро, бромо, иодо, циано, алкокси и фенил, a Z - реактивную группу. Как показано в формуле (I), водорастворимый полимер является ближайшим к атому азота части, а реактивная группа Z является ближайшей к карбонильному атому углерода части, охвачены настоящим изобрете нием, предпочтительно, чтобы атом кислорода находился рядом с карбонильным атомом углерода благодаря чему получают часть нередко называемую карбаматной, или уретановой группой. Другие функциональные группы также могут быть представлены внутри полимерного реагента или на нем. Другой целью изобретения является создание такого полимерного реагента, в котором R1 обозначает Н. Еще одной целью изобретения является создание полимерного реагента, в котором водорастворимый полимер является полиалкиленоксидом. Еще одной целью изобретения является создание способа получения вышеописанных полимерных реагентов, в котором способ включает следующие этапы: (i) обеспечение предшественника, произвольно включающего защищенную реактивную группу или одну или нескольких гидроксильных групп; (ii) активация по меньшей мере одной гидроксильной группы предшественника для вступления в реакцию с аминогруппой для образования активированного предшественника; (iii) контактирование в условиях ковалентного соединения по меньшей мере одной активированной гидроксильной группы с водорастворимым полимером, имеющим аминогруппу, с образованием полимера, содержащего часть водорастворимого полимера и защищенную реактивную группу; и (iv) удаление защиты защищенной реактивной группы при ее наличии. Еще одной целью изобретения обозначает создание полимерного конъюгата, содержащего водорастворимый полимер, часть полимер соединен с атомом азота части с помощью либо прямой ковалентной связи, либо с помощью первой спейсерной части; (ii) фармакологически активный элемент соединен с карбонильным атос помощью либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части и мом углерода части(iii) R1 обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, где термин замещенный относится к неинтерферирующему заместителю, такому как С 3-C8 циклоалкил; фторо, хлоро, бромо, иодо, циано, алкокси и фенил; и (iv) полимерный реагент включает разветвляющую часть. Дополнительной целью изобретения является создание способа получения конъюгата, содержащего этап контактирования полимерного реагента, предлагаемого в данном изобретении, с активным агентом при приемлемых условиях с получением лекарственного конъюгата. Обычно активный агент ковалентно присоединяется к полимеру путем протекания реакции между реактивной группой на полимерном реагенте и функциональной группой (например, амин) на активном агенте. Дополнительной целью изобретения является создание фармацевтического препарата, содержащего конъюгат активный агент-полимер, предлагаемый в настоящем изобретении, в сочетании с фармацевтическим наполнителем. Дополнительной целью изобретения является создание способа для получения фармакологически активного агента, включающего этап введения терапевтически эффективного количества конъюгата полимер-активный агент, предлагаемого в настоящем изобретении. Дополнительные цели, преимущества и новые признаки изобретения изложены в нижеприведенном описании и частично станут очевидными специалистам в данной области техники, исходя из нижесле-3 011351 дующего, или путем практического применения изобретения. Далее в одном примере осуществления изобретения предлагается полимерный реагент, содержащий часть, расположенную между водорастворимым полимером и реактивной группой. Внутреннее структурное расположение является таковым, что (i) азот в части расположен вблизи водораство расположен вблизи реактивной группы; и римого полимера, (ii) карбонильный атом углерода части(iii) R1 обозначает Н или органический радикал, который обычно выбирают из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила, где термин замещенный относится к неинтерферирующему заместителю, такому как С 3-C8 циклоалкил; фторо, хлоро, бромо, иодо, циано, алкокси и фенил; и (iv) полимерный реагент включает разветвляющую часть. Полимерные реагенты в соответствии с настоящим изобретением также включают водорастворимый полимер, выбранный из группы, состоящей из полиалкиленоксида, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиоксазолина, полиакрилоилморфолина и полиоксиэтилированных полиолов,часть и реактивную группу, выбранную из группы, состоящей из гидроксила, ортоэфира, карбоната,ацеталя, альдегида, альдегидгидрата, кетона, винилкетона, кетонгидрата, тиона, монотиогидрата, дитиогидрата, гемикеталя, монотиокеталь гемикеталя, дитиогемикеталя, кеталя, дитиокеталя, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, сульфона, амина, гидразида, тиола, дисульфида, тиолгидрата, карбоновой кислоты, изоциаоната, изотиоцианата, малеимида, сукцинимида, бензотриазола, винилсульфона, хлорэтилсульфона, дитиопиридина, винилпиридина, иодоацетамида, эпоксида, глиоксалей, дионов, мезилатов,тозилатов, тиосульфонатов, тресилатов, силана, -(CH2)rCO2H, -(CH2)r'-CO2NS, -(CH2)r'-CO2Bt,-(CH2)rCH(OR)2, -(CH2)rCHO, -(CH2)2-NH2, -(CH2)rM, -(CH2)r-S-SO2-R, где r составляет 1-5, r' составляет 05, R - арил или алкил, NS - N-сукцинимидил, Bt - 1-бензотриазолил, а М - N-малеимидил, в которых (i) водорастворимый полимер связан с атомом азота части с помощью либо прямой ковалентной связи, либо первой спейсерной части; (ii) реактивная группа связана с карбонильным атомом углерода части с помощью либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части; и (iii) R1 обозначает то,что определено выше. Для полимерных реагентов в соответствии с настоящим изобретением любой водорастворимый полимер может служить в качестве водорастворимого полимера в полимерном реагенте, и изобретение не ограничено в этом отношении. Тем не менее, предпочтительными полимерами являются полимеры с блокировкой на одном конце. Кроме того, полимеры, имеющие среднюю молекулярную массу менее приблизительно 120000 Да, являются предпочтительными. В другом примере осуществления изобретения предлагается способ получения полимерных реагентов в соответствии с изобретением. Вкратце, способ включает получение молекулы-предшественника,состоящей из защищенной реактивной группы или предшественника реактивной группы либо одной или нескольких гидроксильных групп. По меньшей мере одна или несколько гидроксильных групп молекулы-предшественника активируется (благодаря чему образуется активированная молекулапредшественник) таким образом, чтобы по меньшей мере одна из одной или нескольких гидроксильных групп вступила в реакцию с аминогруппой. После этого активированная молекула-предшественник помещается в условия ковалентного соединения и обеспечивается ее контакт с водорастворимым полимером, имеющим аминогруппу, в результате чего происходит химическая реакция этих двух регентов. После завершения реакции образуется ковалентная связь между водорастворимым полимером и активированной молекулой-предшественником, которая, в свою очередь, образует полимер, состоящий из части водорастворимого полимера и защищенной реактивной группы или предшественника реактивной группы. Обычно этот полимер может в дальнейшем вступать в реакцию с различными реагентами с целью функционализации полимера с, например, требуемой реактивной группой. Если молекулапредшественник включает защищенную реактивную группу, способ включает, как преимущество, этап удаления защиты с целью удаления группы, защищающей реактивную группу. В другом варианте этап изолирования полимера выполняется таким образом, чтобы полимер мог быть получен в более чистой форме. Еще в одном примере осуществления настоящего изобретения предлагается конъюгат, содержащий водорастворимый полимер, часть и фармакологически активный агент, в котором: (i) водораство римый полимер связан с атомом азота части с помощью либо прямой ковалентной связи, либо первой спейсерной части; (ii) фармакологически активный агент связан с карбонильным углеродом части с помощью либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части; и (iii) R1 обозначает Н или органический радикал, который обычно выбирают из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила.-4 011351 Преимуществом является то, что может быть использован любой активный агент, который может быть соединен с полимерным реагентами, предлагаемыми в настоящем изобретении, и изобретение не ограничено в отношении конкретного используемого активного агента. Еще в одном примере осуществления изобретения предлагается способ получения конъюгата,включающий этап контактирования полимерного реагента, предлагаемого в настоящем изобретении, с активным агентом при условиях, приемлемых для получения лекарственного конъюгата. Еще в одном примере осуществления изобретения предлагаются фармакологические препараты,включающие конъюгат в соответствии с изобретением с фармакологическим наполнителем. Фармакологические препараты охватывают все типы составов и, в частности, типы составов, являющиеся приемлемыми для инъекции, например порошки, которые могут быть разбавлены до первоначальной плотности,а также суспензии и растворы. В дополнительном примере осуществления изобретения предлагается способ введения конъюгата,включающий этап введения пациенту терапевтически эффективного количества конъюгата, предлагаемого в настоящем изобретении. Обычно, хотя и необязательно, конъюгат предлагается как часть фармацевтического препарата. Может использоваться любой способ введения конъюгата, и изобретение не ограничено в этом отношении. Тем не менее, предпочтительно, чтобы конъюгат вводился путем инъекции. Подробное описание изобретения Прежде чем приступить к подробному описанию настоящего изобретения, специалистам в данной области должно быть очевидно, что настоящее изобретение не ограничено конкретными полимерами,способами синтезирования, активными агентами и т.д., так как они могут изменяться. В настоящем описании и формуле используются термины в соответствии с описанием, приведенном ниже."ПЭГ", полиэтиленгликоль и поли(этиленгликоль), используемый в настоящем описании, охватывает любой водорастворимый поли(этиленоксид) и может быть использован взаимозаменяемо. Обычно ПЭГи, используемые в настоящем изобретении, включают -(ОСН 2 СН 2)m- или О(СН 2 СН 2 О)m-,где m находится в интервале от 2 до 4000, и концевые группы и архитектура полного ПЭГ могут изменяться. В том виде, в каком ПЭГ используется в настоящем описании, он также включает -СН 2 СН 2 О(СН 2 СН 2 О)m-СН 2 СН 2- и -(СН 2 СН 2 О)m- в зависимости от того, был ли замещен концевой кислород или нет. Когда ПЭГ далее включает спейсерную часть (подробное описание которой приведено ниже), атомы, содержащие спейсерную часть при ковалентном присоединении к водорастворимому полимеру, не приводят к формированию кислород-кислородной связи (т.е. -О-О-, перекисная связь). Следует учитывать, что в описании и в формуле в целом термин ПЭГ включает структуры, имеющие различные концевые или блокированные на концах группы и т.д. ПЭГ означает полимер, содержащий большинство, т.е. более 50% подгрупп, являющихся -СН 2 СН 2 О-. Одним обычно используемым ПЭГ является блокированный на концах ПЭГ. Конкретные формы ПЭГ, используемые в настоящем изобретении, включают ПЭГи, имеющие различные молекулярные массы, структуры или конфигурации (например, разветвленные, линейные, раздвоенные ПЭГи, многофункциональные, многоответвленные и т.п.), описание которых более подробно будет приведено ниже. Термин концевое блокирование или блокирование на концах является взаимозаменяемым и используется в настоящем тексте для указания на конец, или конечную точку полимера, имеющего часть концевого блокирования. Обычно в отношении ПЭГ часть концевого блокирования включает гидроксиили C1-20 алкоксигруппу. Таким образом, например, часть концевого блокирования включает алкокси(например, метокси, этокси и бензилокси), а также арил, гетероарил, цикло, гетероцикло и т.п. Следует отметить, что концевые алкокси- и гидроксигруппы могут включать концевой атом кислорода периодического этиленоксидного мономера при вытянутой структуре в зависимости от того, как определен периодический этиленоксидный мономер [например, -(ОСН 2 СН 2)m или -СН 2 СН 2 О(СН 2 СН 2 О)m-СН 2 СН 2-]. Кроме того, предусматриваются насыщенные, ненасыщенные, замещенные и незамещенные формы каждого из вышеуказанных частей концевого блокирования. Более того, группа концевого блокирования также может являться силаном или липидом (например, фосфолипидом). Группа концевого блокирования также может, как преимущество, включать обнаруживаемую метку. Когда полимер содержит группу концевого блокирования, включающую обнаруживаемую метку, количество или нахождение полимера и(или) части (например, активного агента), к которой присоединен полимер, может быть определено с использованием приемлемого датчика. Такие метки включают, без ограничения, флюорессеры, хемилюминисценсоры, части, используемые при мечении ферментов, колориметрики (например, краски), металлические ионы, радиоактивные части и т.п. Приемлемые детекторы включают фотометры, пленки, спектрометры и т.д. Термин не встречающийся в природе в отношении полимера означает полимер, который полностью отсутствует в природе. Тем не менее, не встречающийся в природе полимер может содержать один или несколько подзвеньев или сегментов подзвеньев, которые встречаются в природе, поскольку полная структура полимера отсутствует в природе. Термин водорастворимый, как и в термине водорастворимый полимер, включает полимер, рас-5 011351 творимый в воде при комнатной температуре. Как правило, водорастворимый полимер пропускает по меньшей мере около 75%, более предпочтительно по меньшей мере около 95% света, пропускаемого тем же раствором после фильтрования. Исходя из массы, водорастворимый полимер или его сегмент предпочтительно обозначает, по меньшей мере, растворимый в воде на 35 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 50 мас.% растворимый в воде, еще более предпочтительно приблизительно на 70 мас.% растворимый в воде и еще более предпочтительно приблизительно на 85 мас.% растворимый в воде. Тем не менее, наиболее предпочтительно, чтобы водорастворимый полимер или сегмент являлся растворимым в воде приблизительно на 95 мас.% или полностью растворимым в воде. Молекулярная масса в контексте водорастворимого полимера изобретения, например ПЭГ, может выражаться либо как среднечисленная молекулярная масса, либо как средневесовая молекулярная масса. Если не указано иное, все ссылки на молекулярную массу в данном описании относятся к средневесовой молекулярной массе. Обе молекулярные массы - среднечисленная и средневесовая - могут быть измерены с использованием гель-проникающей хроматографии или с помощью иных способов жидкостной хроматографии. Также могут быть использованы другие способы измерения молекулярного веса, такие как анализ концевых групп или измерение коллигативных свойств (например, понижение точки замерзания, повышение точки кипения или осмотическое давление) с целью определения среднечисленной молекулярной массы, либо с помощью приборов измерения рассеянного света, ультрацентрифугирования или вискозиметрии для определения средневесовой молекулярной массы. Полимеры в соответствии с изобретением обычно являются полидисперсными (т.е. среднечисленная молекулярная масса и средневесовая молекулярная масса полимеров не являются одинаковыми), обладающими низкими значениями полидисперсности, предпочтительно менее 1,2, более предпочтительно менее приблизительно 1,15, еще более предпочтительно менее 1,10, еще более предпочтительно менее приблизительно 1,05 и наиболее предпочтительно менее приблизительно 1,03. В том значении, в каком используется в данном описании, термин карбоновая кислота означает часть, имеющую функциональную группу, также представленную в виде -СООН или -С(О)ОН, а также части, являющиеся производными карбоновой кислоты, при этом такие производные включают,например, защищенные карбоновые кислоты. Таким образом, если в тексте четко не указано иное, термин карбоновая кислота включает не только кислотную форму, но также соответствующие сложные эфиры, а также защищенные формы. Иллюстративные защищенные группы для карбоновых кислот и другие защищенные группы описаны в работе Greene et al., "Protective Groups in Organic Synthesys",Chapter 6, 3rd Edition, John Wiley и Sons, Inc., New York,1999 (p. 454-493). Термин реактивный или активированный при использовании в сочетании с конкретной функциональной группой относится к реактивной функциональной группе, легко вступающей в реакцию с электрофилом или нуклеофилом на другой молекуле. Эти группы противоположны группам, для которых требуется сильный катализатор или жесткие условия реакции для обеспечения их вступления в реакцию (т.е. нереактивная или инертная группа). Термин защищенный, защищающая группа или защитная группа относится к наличию части(т.е. защищающей группы), предотвращающей или блокирующей реакцию конкретной химически реактивной функциональной группы в молекуле при определенных условиях реакции. Защищающая группа изменяется в зависимости от типа химически реактивной защищаемой группы, а также от создаваемых условий реакции и наличия дополнительных реактивных или защищающих групп в молекуле, если таковые имеются. Защищающие группы, известные в данной области техники, содержатся в работе Greene etal., supra. Активированная карбоновая кислота означает функциональное производное карбоновой кислоты, которая является более реактивной, чем исходная карбоновая кислота, в частности, в отношении замещения нуклеофильного ацила. Активированная карбоновая кислота включает галогенангидриды (например, хлорангидриды кислот), ангидриды, амиды и сложные эфиры, но не ограничивается ими. Термин функциональная группа, используемый в настоящем описании, или его любой синоним охватывает ее защищенные формы. Термин спейсер и спейсерная часть используется в данном описании и относится к атому или совокупности атомов, произвольно используемых для связывания межсоединяющихся частей, например,таких как конец части водорастворимого полимера или функциональной группы. Спейсерная часть может быть гидролитически устойчивой либо может включать физиологически гидролизуемую или ферментно-деструктурируемую связь. Термин алкил относится к углеводородной цепи, длина которой обычно находится в пределах приблизительно от 1 до 20 атомов. Такие углеводородные цепи предпочтительно, но не обязательно, являются насыщенными и могут представлять собой разветвленную или прямую цепь, хотя обычно прямая цепь является предпочтительной. Иллюстративные алкильные группы включают этил, пропил, бутил,пентил, 1-метилбутил (т.е. 2-пентил), 1-этилпропил (т.е. 3-пентил), 3-метилпентил и т.п. Термин алкил,используемый в настоящем описании, включает циклоалкил, когда ссылка дается на три или более атомов углерода.-6 011351 Термин низший алкил относится к алкильной группе, содержащей от 1 до 6 атомов углерода, и может являться прямой или разветвленной цепью, примером чему являются метил, этил, n-бутил, изобутил и трет-бутил. Термин циклоалкил относится к насыщенной или ненасыщенной циклической углеводородной цепи, включающей соединенные мостиковой связью, сплавленные или спиро-циклические соединения,предпочтительно состоящие приблизительно из 3-12 атомов углерода, более предпочтительно от 3 до приблизительно 8. Неинтерферирующие заместители - это группы, которые, присутствуя в молекуле, обычно являются нереактивными с другими функциональными группами, находящимися внутри молекулы. Термин замещенный как, например, замещенный алкил относится к части (например, алкильной группе), замещенной одной или несколькими неинтерферирующими замещающими группами, такими как С 3-C8 циклоалкил, например циклопропил, циклобутил и т.п.; гало, например фторо, хлоро, бромо и йодо; циано; алкокси, фенил; замещенный фенил и т.п., но не ограниченными ими. Замещенный арил является арилом, имеющим одну или несколько неинтерферирующих групп в качестве замещающих групп. Для замещений на фенильном кольце замещающие группы могут находиться в любой ориентации(т.е. орто, мета или пара). Алкокси относится к группе -O-R, где R обозначает алкил или замещенный алкил, предпочтительно С 1-С 20 алкил (например, метокси, этокси, пропилокси, бензил и т.д.), предпочтительно С 1-С 7. Алкенил в том значении, в каком он используется в настоящем описании, относится к разветвленной или неразветвленной углеводородной группе длиной от 1 до 15 атомов, содержащей по меньшей мере одну двойную связь, например этенил, n-пропенил, изопропенил, n-бутенил, изобутенил, октенил,деценил, тетрадеценил и т.п. Используемый в настоящем описании термин алкинил относится к разветвленной или неразветвленной углеводородной группе длиной от 2 до 15 атомов, содержащей по меньшей мере одну тройную связь, этинил, n-бутинил, изопентинил, октинил, децинил и т.д. Темин арил означает одно или несколько ароматических колец, каждое из которых состоит из 5 или 6 основных атомов углерода. Арил включает несколько арильных колец, которые могут быть сплавленными, как в нафтиле, или несплавленными, как в бифениле. Арильные кольца могут также быть сплавлены или несплавлены с одним или более циклическим углеводородом, гетероарилом или гетероциклическими кольцами. Используемое в данном контексте значение арил включает гетероарил. Гетероарил обозначает арильную группу, содержащую от одного до четырех гетероатомов, предпочтительно N, О, или S, или их сочетание. Гетероарильные кольца могут также быть сплавлены с одним или более циклическим углеводородом, гетороциклическими, арильными или гетероарильными кольцами. Гетероцикл или гетороциклический означает одно или более колец из 5-12 атомов, предпочтительно 5-7 атомов, имеющих ненасыщенные или ароматические свойства, или без них, и имеющие по меньшей мере один кольцевой атом, не являющийся углеродом. Предпочтительные гетероатомы включают серу, кислород и азот. Замещенный гетероарил обозначает гетероарил, имеющий одну или более неинтерферирующую группу в качестве замещающей группы. Замещенный гетероцикл обозначает гетероцикл, имеющий одну или несколько боковых цепей,сформированных из неинтерферирующих замещающих групп. Темин электрофил относится к иону, атому или совокупности атомов, которые могут быть ионными, имеющими электрофильный центр, т.е. центр, ищущий электрон и способный реагировать с нуклеофилом. Термин нуклеофил относится к иону, или атому, или совокупности атомов, которые могут быть ионными, имеющими нуклеофильный центр, т.е. центр, ищущий электрофильный центр и способный реагировать с электрофилом. Физиологически расщепляемая, или гидролизуемая, или деструктурируемая связь обозначает относительно слабую связь, которая вступает в реакцию с водой (т.е. гидролизуется) при физиологических условиях. Склонность связи к гидролизу в воде зависит не только от общего типа связи, соединяющей два центральных атома, но также и от замещающих групп, присоединенных к этим центральным атомам. Соответствующие гидролитически неустойчивые, или слабые, связи включают, но не ограничены карбоксилатным эфиром, фосфорнокислым эфиром, ангидридами, ацеталями, кеталями, ацилоксиалкиловым эфиром, иминами, ортоэфирами, пептидами и олигонуклеотидами. Термин ферментно деструктурируемая связь означает связь, поддающуюся расщеплению с помощью одного или нескольких ферментов. Термин гидролитически устойчивая связь или соединение относится к химической связи, обычно к ковалентной связи, являющейся в целом устойчивой в воде, то есть не подвергается гидролизу при физиологических условиях в какой-либо заметной степени в течение длительного периода времени. Примеры гидролитически устойчивой связи включают, но не ограничены, следующие углерод-углеродные свя-7 011351 зи (например, в алифатических цепях), простые эфиры, амиды, уретаны и т.п. В целом, гидролитически устойчивая связь является связью, проявляющей скорость гидролиза менее приблизительно 1-2% в сутки при физиологических условиях. Скорости гидролиза представительных химических связей можно найти в большинстве стандартных учебников по химии. Термины активный агент, биологически активный агент и фармакологически активный агент используются в данном контексте взаимозаменяемо и включают любой агент, лекарственное средство,соединение, состав вещества или смеси, обеспечивающие определенный фармакологический, нередко полезный, эффект, который может быть продемонстрирован in vivo или in vitro. Он включает пищевые продукты, пищевые добавки, питательные вещества, нутрицевтики (nutriceuticals), лекарства, вакцины,антитела, витамины и иные полезные агенты. В данном контексте эти термины далее включают любое физиологически или фармакологически активное вещество, создающее локализованный или систематический эффект в организме пациента. Термины фармацевтически приемлемый наполнитель и фармацевтически приемлемый носитель относятся к наполнителю, который может быть включен в составы в соответствии с изобретением и который не вызывает никакого значительного неблагоприятного токсикологического воздействия на организм пациента. Термины фармакологически эффективное количество, физиологически эффективное количество и терапевтически эффективное количество используются взаимозаменяемо в данном контексте и означают количество конъюгата полимер-активный агент, присутствующего в фармацевтическом препарате, который необходим для обеспечения требуемого уровня активного агента и(или) конъюгата в кровотоке или в целевой ткани. Точное количество будет зависеть от многочисленных факторов, например конкретного активного агента, компонентов и физических свойств фармацевтического препарата, предполагаемой совокупности пациентов, заключений пациентов и т.п., и может быть легко определен специалистами в данной области техники на основе информации, представленной в данном описании и содержащейся в соответствующей литературе. Термин многофункциональный в контексте полимера в соответствии с изобретением означает полимер, имеющий 3 или более функциональных групп, содержащихся в нем, при этом функциональные группы могут быть аналогичными или различными. Многофункциональные полимеры в соответствии с изобретением обычно содержат приблизительно от 3 до 100 функциональных групп, или от 3 до 50 функциональных групп, или от 3 до 25 функциональных групп, или от 3 до 15 функциональных групп,или от 3 до 10 функциональных групп, или содержат 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 функциональных групп в основной цепи полимера. Дифункциональный полимер означает полимер, имеющий две функциональные группы, содержащиеся в нем, либо аналогичные (т.е. гомодифункциональные), либо различные(т.е. гетеродифункциональные). Термин раздвоенный при ссылке на конфигурацию или полную структуру полимер относится к дифункциональному полимеру, имеющему одну полимерную ветвь (т.е. единичный водорастворимый полимер), в котором обе функциональные группы прикреплены (либо непосредственно, либо с помощью одного или нескольких атомов) к атому, служащему в качестве разветвляющего атома, который, в свою очередь, прикреплен (либо непосредственно, либо с помощью одного или нескольких атомов) к водорастворимому полимеру. Термин разветвленный при ссылке на конфигурацию или полную структуру полимера относится к полимеру, имеющему 2 или более полимерных ветвей. Разветвленный полимер может иметь 2 полимерные ветви, 3 полимерные ветви, 4 полимерные ветви, 6 полимерных ветвей, 8 полимерных ветвей или более. Один конкретный тип сильно разветвленных полимеров обозначает дендритный полимер или дендример, который для целей изобретения рассматривается как обладающий структурой, отличной от структуры разветвленного полимера. Дендример или дендритный полимер является глобулярным, размерным монодисперсным полимером, в котором все соединения отходят радиально от центральной фокальной точки или ядра со систематической структурой разветвления и повторяющимися звеньями, каждое из которых создает точку разветвления. Дендримеры проявляют определенные свойства дендритного состояния, например инкапсуляцию ядра, что делает их уникальными по сравнению с другими типами полимеров, включая разветвленные полимеры. Основной или кислотный реагент, описанный в данном тексте, включает нейтральные, заряженные или его любые соответствующие формы соли. Термин пациент относится к живому организму, страдающему от заболевания или подверженному состоянию, которое можно предотвратить или вылечить путем приема конъюгата, предлагаемого в настоящем описании изобретения, и включает как людей, так и животных. Органический радикал является частью, содержащей углерод, которая может быть присоединена через ковалентную связь к другому атому. Иллюстративный органический радикал включает радикалы,выбранные из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила. Термин произвольный или произвольно означает, что в последующем описанное обстоятельст-8 011351 во может иметь или может не иметь место, таким образом, описание включет случаи, при которых данное обстоятельство имеет место, а также случаи, при которых оно отсутствует. В том значении, в котором используется обозначение гало (например, фторо, хлоро, йодо, бромо и т.д.), оно, в целом, используется, когда галоген присоединяется к молекуле, в то время как суффикс ид (например, фторид, хлорид, йодид, бромид и т.д.) используется при применении ионной формы,когда галоген существует в своей независимой ионной форме (например, в том случае, когда уходящая группа покидает молекулу). В контексте настоящего описания необходимо признать, что определение переменных, представленных в отношении одной структуры или формулы, приемлемо в отношении аналогичной переменной,повторяющейся в различных структурах, если в контексте не указано иное. Таким образом, например,определения POLY, спейсерная часть, (Z) и т.д. в отношении полимерного реагента применимы к конъюгату водорастворимого полимера, предлагаемому в настоящем описании. В первом примере осуществления изобретения предлагается уникальный полимерный реагент. Несмотря на то, что заявители не желают ограничиваться теорией, они считают, что отличительные свойства полимерных реагентов, описанных в настоящем изобретении, определяются уникальной ориентацией атомов. Например, когда полимерный реагент, описанный в настоящем изобретении, соединен с активным агентом для образования конъюгата, скорость гидролиза конъюгата in vivo отличается от скорости гидролиза конъюгата, имеющего аналогичные атомы, но которые расположены в другой последовательности. Кроме обеспечения альтернативных скоростей гидролиза, предлагаемые в настоящем изобретении полимерные реагенты обладают дополнительными преимуществами по сравнению с известными полимерными реагентами. Полимеры в соответствии с настоящим изобретением включают три отдельных компонента, ориентированные специальным образом. Три компонента представляют собой водорастворимый полимер,включающий периодические мономерные звенья; часть, включающую атом азота, ковалентно связанный с атомом углерода карбонила; и реактивную группу. Три компонента полимера специально ориентированы таким образом, чтобы атом азота вышеуказанной части находился вблизи периодически повторяющейся части мономера полимера, в то время как атом углерода расположен вблизи реактивной группы. Следует понимать, что термин вблизи (проксимальный) в настоящем контексте относится к ближайший по наиболее ближайшей траектории связывающих атомов, а не ближайший в плане пространства или абсолютного расстояния. Таким образом, полимер может быть схематически представлен следующей формулой: Водорастворимый полимер где водорастворимый полимер является водорастворимым полимером, содержащим периодические мономерные звенья; каждая независимо обозначает прямую ковалентную связь, или спейсерную часть;R1 обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила,где термин замещенный относится к неинтерферирующему заместителю, такому как С 3-C8 циклоалкил; фторо, хлоро, бромо, иодо, циано, алкокси и фенил, a Z - реактивную группу. является проксимальным к водорастворимому поКак представлено в формуле I, азот части лимеру, а атом углерода карбонила - проксимальным к реактивной группе Z. Таким образом, полимерные реагенты включают часть между водорастворимым полимером, выбранным из группы, состоящей из полиалкиленоксида, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, полиоксазолина, полиакрилоилморфолина и полиоксиэтилированных полиолов, и реактивной группой, выбранной из группы, состоящей из гидроксила, ортоэфира, карбоната, ацеталя, альдегида, альдегидгидрата, кетона, винилкетона, кетонгидрата, тиона, монотиогидрата, дитиогидрата, гемикеталя,монотиокеталь гемикеталя, дитиогемикеталя, кеталя, дитиокеталя, алкенила, акрилата, метакрилата, акриламида, сульфона, амина, гидразида, тиола, дисульфида, тиолгидрата, карбоновой кислоты, изоциаоната, изотиоцианата, малеимида, сукцинимида, бензотриазола, винилсульфона, хлорэтилсульфона, дитиопиридина, винилпиридина, иодоацетамида, эпокида, глиоксалей, дионов, мезилатов, тозилатов, тиосульфонатов, тресилатов, силана, -(CH2)rCO2H, -(CH2)r'CO2NS, -(CH2)r'CO2Bt, -(CH2)rCH(OR)2,-(CH2)rCHO, -(CH2)2-NH2, -(CH2)rM, -(CH2)r-S-SO2-R, где (r) составляет 1-5, (r') составляет 0-5, R - арил или алкил, NS - N-сукцинимидил, Bt - 1-бензотриазолил, а М - N-малеимиди, в которой (i) атом азота в части рода части обозначает проксимальным к водорастворимому полимеру; (ii) карбонильный атом углеобозначает проксимальным к реактивной группе; и (iii) R1 обозначает Н в соответст вии с определением выше. Водорастворимый полимер связан с атомом азота части с помощью либо прямой ковалентной связи, либо первой спейсерной части. Реактивная группа связана с карбониль-9 011351 с помощью либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерным атомом углерода части ной части. Кроме того, полимерные реагенты в соответствии с изобретением могут быть описаны как включающие водорастворимый полимер, часть полимер соединен с атомом азота части и реактивную группу, в которых: (i) водорастворимый либо с помощью первой ковалентной связи, либо первой спейсерной части; (ii) реактивная группа соединена с карбонильным атомом углерода части либо с помощью прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части; (iii) R1 - как указывалось выше; и(iv) полимерный реагент включает разветвляющую часть.(в которой R1 - Н или органический радикал) может считаться амидной частью при ее Часть рассмотрении в изоляции или отдельно от смежных атомов. Тем не менее, следует помнить, что часть в полимере обозначает часть более крупной структуры. Например, атом кислорода может быть - и предпочтительно - непосредственно прикреплен к карбонильному атому углерода части тем са мым создавая часть которая нередко называется как карбамат или уретан. Таким образом, в целях описания химических структур, изложенных ниже, ссылка в целом будет даваться на часть одна часть атома азота присоединяется к атому углерода смежного карВ отношении части бонильного углерода (карбонильный углерод), вторая связь присоединяется либо непосредственно к водорастворимому полимеру или спейсерной части и третья связь присоединяется к заместителю R1. R1 обозначает любой неинтерферирующий заместитель. R1 обычно, хотя и необязательно обозначает Н или органический радикал. Тем не менее, предпочтительно, чтобы R1 обозначал Н. В тех случаях, когда R1 органический радикал, предпочтительные органические радикалы включают органические радикалы,выбранные из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила. Конкретные примеры предпочтительных органических радикалов включают органические радикалы, выбранные из группы, содержащей метил,этил, n-пропил, изопропил, n-бутил, сек-бутил, изобутил, трет-бутил, n-пентил, изопентил, неопентил,трет-пентил и пиперидонил. В отношении реактивной группы Z эта группа может являться любой группой, реагирующей с приемлемым реагентом при соответствующих условиях. Предпочтительные реактивные части выбраны из группы, содержащей электрофилы и нуклеофилы. Примеры таких реактивных групп включают, но не ограничены, реактивные группы, выбранные из группы, содержащей гидроксил (-ОН), сложный эфир, ортоэфир, карбонат, ацеталь, альдегид, альдегидгидрат, кетон, винилкетон, кетонгидрат, тион, монотиогидрат, дитиогидрат, гемикеталь, монотиокеталь,гемикеталь, дитиогемикеталь, кеталь, дитиокеталь, алкенил, акрилат, метакрилат, акриламид, сульфон,сульфон, амин, гидразид, тиол, дисульфид, тиолгидрат, карбоновая кислота, изоцианат, изотиоцианат,малеимид,сукцинимид; бензотриазол; винилсульфон, хлорэтилсульфон, дитиопиридин, винилпиридин, иодоацетамид, эпокид, глиоксали, дионы, мезилаты, тозилаты, тиосульфонат, тресилат, силан, -(CH2)rCO2H, -(CH2)r'CO2NS, -(CH2)r'CO2Bt, -(CH2)rCH(OR)2, -(CH2)rCHO, -(CH2)2-NH2,-(CH2)rM, -(CH2)r-S-SO2-R, где (r) составляет 1-12, (r') составляет 0-5, R - арил или алкил, NS - Nсукцинимидил, Bt - 1-бензотриазолил и М - N-малеимидил, и защищенные и активированные формы любого из вышеуказанных веществ. В отношении любой реактивной группы, в частности малеимида и альдегида, произвольный линкер может связывать реактивную группу с полимером. Таким образом, например, линкер может связывать реактивную группу с спейсерной частью или разветвляющей частью (когда она присутствует). Кроме того, при отсутствии как спейсерной части, так и разветвляющей части линкер может связывать реактивную группу непосредственно с карбонильным углеродом части Линкер может включать насыщенные ациклические углеводороды с прямой цепью, содержащие по меньшей мере четыре атома углерода, такие как тетраметилен, пентаметилен и гексаметилен, а также разветвленные насыщенные ациклические углеводороды, содержащие по меньшей мере четыре атома углерода. В одном примере осуществления углеводородная часть связи имеет структуру -(CR3R4)g-, в которой R3 независимо обозначает Н, алкил или циклоалкил, каждый R4 независимо обозначает Н, алкил или циклоалкил и (g) составляет приблизительно от 2 до 20, предпочтительно приблизительно от 4 до 12.- 10011351 В одном предпочтительном примере осуществления изобретения каждый R3 и R4 обозначает Н. В примерах осуществления разветвленных ациклических углеводородов предпочтительно, чтобы происходило разветвление у одного или нескольких из двух атомов углерода, ближайших к реактивной группе (например, малеимид) с целью максимизации пространственного затруднения. В другом примере осуществления изобретения углеводородная часть связи включает насыщенный двухвалентный алициклический углеводород и имеет структуру -(CR3R4)р-С 3-12 циклоалкил-(CR3R4)q-, в которой р и q - каждый независимо составляет приблизительно от 0 до 10, предпочтительно приблизительно от 0 до 6 (например, 0, 1, 2,3, 4, 5 или 6) и R3 и R4 - как определено выше. Двухвалентная циклоалкильная (например, циклоалкилен) группа предпочтительно является С 3-8 циклоалкиленом, таким как различные изометрические формы циклопропадиила (например, 1,1-, cis-1,2-, или транс-1, 2-циклопропилен), циклобутадиила, циклопентадиила, циклогексадиила и циклогептадиила. Циклоалкиленовая группа может быть замещена одной или несколькими алкильными группами, предпочтительно С 1-6 алкильными группами. В отношении водорастворимого полимера полимерные реагенты в соответствии с настоящим изобретением также включают по меньшей мере один сегмент водорастворимого полимера. Водорастворимые полимеры, являющиеся непептидными и водорастворимыми, содержащими от 2 до приблизительно 300 концов, являются исключительно эффективными в изобретении. Примеры приемлемых водорастворимых полимеров включают полиалкиленгликоли, такие как полиэтиленгликоль ("ПЭГ"), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, обладающие водорастворимостью, полиолефиновый спирт, поливинилпирролидон, полигидроксиалкилметакриламид, полигидроксиалкилметакрилат, полисахариды,полиаоксикислота, поливиниловый спирт, полифосфазен, полиоксазолин, поли-N-акрилоилморфолин,такие как описаны в патенте США 5629384, но не ограничены ими. В некоторых случаях применения,в которых необходимо исключительно высокая водорастворимость, водорастворимый полимер не является полипропиленоксидом. Периодические звенья в каждом водорастворимом полимере могут иметь ряд расположений, включающих, но не ограниченных, расположения, выбранные из группы, содержащей гомополимер (в котором каждая мономерное звено, включающее водорастворимый полимер, является одинаковым), чередующийся сополимер (в котором первое мономерное звено последовательно чередуется со вторым мономерным звеном внутри водорастворимого полимера), статистический сополимер (в котором первое мономерное звено непоследовательно чередуется со вторым мономерным звеном внутри водорастворимого полимера), блок-сополимер (в котором два или несколько первых мономерных звена чередуются с двумя или несколькими вторыми мономерными звеньями внутри водорастворимого полимера), чередующийся триполимер, статистический триполимер и блок-триполимер. Водорастворимый полимер предпочтительно, хотя необязательно, является полиэтиленгликолем("ПЭГ") или его производным. Тем не менее, следует понимать, что родственные полимеры также приемлемы для практического использования настоящего изобретения, и использование термина "ПЭГ", или"поли(этиленгликоль)" является включающим, а не исключающим в этом отношении. Следовательно,термин "ПЭГ" включает полиэтиленгликоль в любой из его линейных, разветвленных или многоответвленных форм, включающих алкокси ПЭГ, бифункциональный ПЭГ, раздвоенный ПЭГ, разветвленный ПЭГ, подвесной ПЭГ или ПЭГ, содержащий деструктивные связи, которые подробнее описаны ниже. В одной форме, используемой в настоящем изобретении, свободный или несвязанный ПЭГ является линейным полимером, завершающимся на каждом конце гидроксильными группами где (m') обычно находится в пределах от нуля до приблизительно 4000. Описанный выше полимер, альфа-, омега-дигидроксилполи(этиленгликоль) может быть представлен в краткой форме как НО-ПЭГ-ОН, где следует понимаеть, что обозначение ПЭГ может представлять следующее структурное звено: где (m'), как определено выше. Другим типом ПЭГ, используемым в настоящем изобретении, является метокси-ПЭГ-ОН, или сокращенно mПЭГ, в котором один конец является относительно инертной метоксигруппой, в то время как второй конец - гидроксильной группой. Структура mПЭГ приведена ниже. где (m'), как определено выше. Дополнительно к вышеописанным формам ПЭГ полимер может быть получен с одной или несколькими слабыми или деструктурируемыми связями в полимере, включая любой из вышеописанных полимеров. Например, ПЭГ может быть получен путем создания эфирных связей в полимере, подвергаемом гидролизу. Как показано ниже, этот гидролиз приводит к расщеплению полимера на фрагменты с более низким молекулярным весом Другие гидролитические деструктурируемые связи, являющиеся эффективными в качестве дест- 11011351 руктурируемой связи в основной цепи полимера, включают карбонатные связи; иминные связи, получаемые в результате, например, реакции амина и альдегида (см., например, Ouchi et al. (1997) PolymerPreprints 38(1):582-3); связи эфира фосфорной кислоты, образуемые, например, путем реакции спирта с фосфатной группой; гидрозонные связи, которые обычно образуются путем реакции гидразида и альдегида; ацетальные связи, которые обычно образуются путем реакции между альдегидом и спиртом; ортоэфирные связи, которые, например, образуются путем реакции между формиатом и спиртом; амидные связи, образуемые аминной группой, например, в конце полимера, такого как ПЭГ, и карбоксильной группой другой цепи ПЭГ; уретановые связи, образуемые путем реакции, например, ПЭГ с концевой изоцианатной группой и ПЭГ спиртом; пептидные связи, образуемые аминной группой, например, на конце полимера, такого как ПЭГ, и карбоксильной группой пептида; и олигонуклеотидные связи, образуемые, например, фосфорамидитной группой, например, на конце полимера, и 5'-гидроксильной группой олигонуклеотида. Специалистам в данной области должно быть очевидно, что термин поли-(этиленгликоль) или ПЭГ обозначает или включает все вышеприведенные формы ПЭГ. Несмотря на то, что молекулярная масса водорастворимого полимера (а также полимерного реагента) может изменяться, молекулярная масса будет удовлетворять одному или нескольким из следующих значений: более 100; более 200; более 400; более 500; более 750; более 900; более 1000; более 1400; более 1500; более 1900; более 2000; более 2200; более 2500; более 3000; более 4000; более 4900; более 5000; более 6000; более 7000; более 7500; более 9000; более 10000; более 11000; более 14000; более 15000; более 16000; более 19000; более 20000; более 21000; более 22000; более 25000 и более 30000 Да. Очевидно,что максимальный предел молекулярной массы для любого данного сегмента водорастворимого полимера, используемого в настоящем изобретении, составляет приблизительно 300000 Да. Молекулярная масса водорастворимого полимера (а также всего полимерного реагента) может быть выражена в виде значения в пределах молекулярных весов. Иллюстративные примеры включают от приблизительно 100 до приблизительно 100000 Да; от приблизительно 500 до приблизительно 80000 Да; от приблизительно 1000 до приблизительно 60000 Да; от приблизительно 2000 до приблизительно 50000 Да и от приблизительно 5000 до приблизительно 40000 Да. Иллюстративные молекулярные массы для любого данного водорастворимого полимера (а также всего полимерного реагента) внутри полимерного реагента включают приблизительно 100, приблизительно 200, приблизительно 300, приблизительно 400, приблизительно 500, приблизительно 600, приблизительно 700, приблизительно 750, приблизительно 800, приблизительно 900, приблизительно 1000, приблизительно 2000, приблизительно 2200, приблизительно 2500, приблизительно 3000, приблизительно 4000, приблизительно 4400, приблизительно 5000, приблизительно 6000, приблизительно 7000, приблизительно 7500, приблизительно 8000, приблизительно 9000, приблизительно 10000, приблизительно 11000, приблизительно 12000, приблизительно 13000, приблизительно 14000, приблизительно 15000,приблизительно 20000, приблизительно 22500, приблизительно 25000, приблизительно 30000, приблизительно 40000, приблизительно 50000, приблизительно 60000, приблизительно 75000 и приблизительно 80000 Да. В отношении ПЭГ, в котором могут быть представлены структуры, содержащие периодический этиленоксидный мономер, такой как -(СН 2 СН 2 О)m- или -(ОСН 2 СН 2)m, предпочтительные значения для(m) включают приблизительно от 3 до 3000; приблизительно от 10 до 3000; приблизительно от 15 до 3000; приблизительно от 20 до 3000; приблизительно от 25 до приблизительно 3000; приблизительно от 30 до 3000; приблизительно от 40 до 3000; приблизительно от 50 до 3000; приблизительно от 55 до 3000; приблизительно от 75 до 3000; приблизительно от 100 до 3000 и приблизительно от 225 до 3000. В том значении, в каком используется термин водорастворимый полимер в настоящем описании,он включает полимеры, которые являются биосовместимыми и неиммуногенными, в частности, исключает любые сегменты водорастворимого полимера, не являющиеся биосовместимыми и неиммуногенными. Что касается биосовместимости, вещество считается биосовместимым, если благоприятный эффект, связанный с использованием только одного вещества или с другим веществом (например, активным агентом) в связи с живыми тканями (например, введение пациенту) перевешивает любой неблагоприятный эффект в соответствии с оценкой клинициста, например врача. Что касается неиммуногенности, вещество считается неиммуногенным, если целевое использование вещества in vivo не вызывает неблагоприятной иммунной реакции (например, образование антител), либо при возникновении иммунной реакции такая иммунная реакция не рассматривается клинически значимой или важной по оценке клинициста. Исключительно предпочтительным является то, что сегменты водорастворимых полимеров,описанных в настоящем патенте, а также конъюгаты являются биосовместимыми или неиммуногенными. Специалистам в данной области техники должно быть очевидно, что вышеприведенное описание,касающееся в целом водорастворимого полимера, ни в коем случае не рассматривается как исчерпывающее и является исключительно иллюстративным, и что все полимерные материалы, имеющие вышеописанные свойства, являются предполагаемыми. Термин полимерный реагент в том значении, в каком он используется в настоящем описании, относится ко всей молекуле, которая может содержать во- 12011351 дорастворимый полимер и функциональную группу. Термин водорастворимый полимер обычно используется при рассмотрении одной части более крупной молекулярной структуры, такой как полимерный реагент, молекула предшественника, конъюгат и т.д. Каждая часть (например, функциональная группа, активный агент, водорастворимый полимер и т.д.) полимерного реагента и иные структуры, описанные в настоящем патенте, могут быть непосредственно присоединены друг к другу с помощью прямой ковалентной связи. Тем не менее, в обычном случае каждая часть присоединена с помощью спейсерной части, состоящей из одного или нескольких атомов, служащих для связывания каждой части вместе в единое целое. Предпочтительные спейсерные части, с помощью которых различные части полимерных реагентов и другие описанные в данном патенте структуры, включают цепь атомов, состоящую из углерода, азота,кислорода и(или) атомов серы. Один или несколько других атомов, таких как углерод, азот, кислород,сера и водород, могут быть присоединены к указанной цепи атомов. Цепь может быть короткой и может содержать от двух до пяти атомов. Также предполагаются более длинные цепи, например цепь длиной из десяти, пятнадцати или более атомов. Кроме того, спейсерная часть может содержать кольцо атомов,которое может быть насыщенным, ненасыщенным, а также ароматическим. При присутствии спейсерной части она может предпочтительно содержать приблизительно 1-20 атомов, исключая любые разветвляющие атомы. Предпочтительно атомы, составляющие спейсерную часть (включающие любые разветвляющие атомы), содержат определенное сочетание атомов кислорода, углерода, азота, серы и водорода. Каждая спейсерная часть (например, первая спейсерная часть, вторая спейсерная часть, третья спейсерная часть и т.д.) в полимерном реагенте может быть аналогичной любой другой спейсерной части, присутствующей в полимере, или отличаться от нее. Неограничивающие примеры спейсерной части выбраны из группы, состоящей из и сочетаний двух или нескольких любых вышеуказанных соединений, где f - от 0 до 6, n - от 0 до 20(предпочтительно от 0 до 10, например 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, и более предпочтительно 4), R2 обозначает Н или органический радикал. Предпочтительные двухвалентные циклоалкильные группы имеют структуру -(CR3R4)р-С 3-12 циклоалкил-(CR3R4)q-, где р и q, каждый независимо, составляет приблизительно от 0 до 10, предпочтительно приблизительно от 0 до 6 (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6), каждыйR3 независимо обозначает Н, алкил или другой циклоалкил, и каждый R4 независимо обозначает Н, алкил или другой циклоалкил. Другие двухвалентные циклоалкильные (например, циклоалкилен) группы включают С 3-8 циклоалкил, такой как различные изомеры циклопропадиила (например, 1,1-, цис-11,2-,или транс-1,2-циклопропилен), циклобутадиила, циклопентадиила, циклогексадиила и циклогептадиила. Циклоалкиленовая группа может быть замещена одной или несколькими алкильными группами, предпочтительно C1-С 6 алкильными группами. Для любой данной спейсерной части, включающей смежные с ней карбонильный и углеродный атом, спейсерная часть произвольно включает органический радикал, присоединенный к атому углерода,- 13011351 смежному с карбонилом. Атом углерода, находящийся в непосредственной близости от карбонильного углерода, обычно называют -углеродом. Таким образом, -углерод в любой данной спейсерной части может иметь органический радикал, такой как малую алкильную группу (например, метилгруппу), присоединенную к нему. Общая структура полимерного реагента может принимать любое количество различных форм. Например, полимерный реагент может быть линейным, разветвленным, многоответвленным, дендритным или раздвоенным. Линейные структуры в соответствии с настоящим изобретением соответствуют формуле II и IIa ниже. Тем не менее, предпочтительно, чтобы полимерный реагент имел либо разветвленную, либо многоответвленную структуру. В целом, такие полимеры обладают двумя или несколькими водорастворимыми полимерами и создают более крупное, более плотное полимерное облако, окружающее активный агент, тем самым сокращая эффективное количество эффективных точек присоединения, имеющихся в соединении. В формулах III, IIIa, IIIb и IIIb1 ниже разветвленные структуры включают два водорастворимых полимера. Разветвленные структуры могут также включать три водорастворимых полимера. С другой стороны, многоответвленные полимеры включают четыре или более таких водорастворимых полимера. Дендритные формы полимеров имеют несколько (например, от 3 до 50) отдельных водорастворимых полимеров, в конечном счете соединенных с ядром, включающим один или несколько атомов. Для любого конкретного полимерного реагента, включающего два или несколько водорастворимых полимеров, каждый водорастворимый полимер может быть аналогичным или различным. Более того, сочетания аналогичных и различных водорастворимых полимеров могут использоваться, когда полимерный реагент включает три или более водорастворимых полимера, хотя предпочтительно, чтобы каждый водорастворимый полимер в полимере являлся аналогичным другому (другим) водорастворимому(ым) полимеру (ам). Что касается разветвленных форм полимерного агента, иллюстративные диапазоны приемлемых размеров для общей молекулярной массы полимера (в соответствии с основанными в целом на совестных массах двух частей водорастворимых полимеров) включают (опять-таки, выраженные в значениях молекулярной массы) приблизительно от 200 до 200000 Да; приблизительно от 1000 до 100000 Да; приблизительно от 2000 до 120000 Да; приблизительно от 4000 до 100000 Да; приблизительно от 5000 до 90000 Да; приблизительно от 10000 до 80000 Да и приблизительно от 15000 до 60000 Да. В частности,общая молекулярная масса (в дальтонах) разветвленного варианта полимера изобретения соответствует одному из следующих значений: приблизительно 400; приблизительно 1000; приблизительно 1500; приблизительно 2000; приблизительно 3000; приблизительно 4000; приблизительно 10000; приблизительно 15000; приблизительно 20000; приблизительно 30000; приблизительно 40000; приблизительно 50000; приблизительно 60000; приблизительно 80000; приблизительно 90000; приблизительно 100000, приблизительно 120000, приблизительно 160000 или приблизительно 200000. При рассмотрении общей структуры описанных в настоящем изобретении полимерных реагентов следует признать определенное различие в отношении полимерных регентов, описанных в известном способе. Например, известные полимерные регенты характеризуются рядом проблем, в результате чего они являются неприемлемыми для присоединения к активному агенту. Например, у некоторых известных полимерных реагентов отсутствует быстро заменяемая функциональная группа, такая как реактивная группа (например, у сложного эфира). Даже при попытках соединения полимерного реагента, у которого отсутствует быстро заменяемая функциональная группа (например, метилен(-СН 2-)группа), условия, необходимые для этого, будут исключительно жесткими (например, условия с высокой концентрацией щелочи), в результате чего существует вероятность деструкции активного агента. Далее ряд известных полимерных реагентов имеет две группы (например, карбонильные группы), замещенные на потенциальных точках присоединения, что нередко приводит к незавершенной конъюгации ввиду стерических эффектов и(или) снижению реактивности в результате близости групп. Когда присутствует только один водорастворимый полимер в общей структуре полимера, структура полимера предпочтительно соответствует формуле (II)R1 - Н или органический радикал (например, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила);X1 - если присутствует, обозначает первую спейсерную часть;X2 - если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть; иZ - реактивная группа. Кроме того, когда полимер включает только одну водорастворимую часть во всей структуре, структура может также соответствовать той, что приведена в формуле IIad - 0, 1, 2 или 3 (и предпочтительно 0 или 1); каждый R1 обозначает независимо Н или органический радикал (например, выбранный из группы,состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила);X1 - если присутствует, обозначает первую спейсерную часть;X2 - если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть;X3 - если присутствует, обозначает третью спейсерную часть;X4 - если присутствует, обозначает четвертую спейсерную часть; а каждый Z - независимо реактивная группа. Кроме того, когда два водорастворимых полимера присутствуют в общей структуре полимерного реагента, структура соответствует формуле IIIj - от 0 до 20 (т.е. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); каждый R1 обозначает независимо Н или органический радикал (например, выбранный из группы,состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила);X1 - если присутствует, обозначает первую спейсерную часть;X2 - если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть;X5 - если присутствует, обозначает пятую спейсерную часть;X6 - если присутствует, обозначает шестую спейсерную часть;X7 - если присутствует, обозначает седьмую спейсерную часть;X8 - если присутствует, обозначает восьмую спейсерную часть;Z - реактивная группа. Предпочтительные полимерные регенты, имеющие структуры, охватываемые формулой II, IIa и III,являются полимерными реагентами, в которых каждый водорастворимый полимер (т.е. POLY1 и/илиPOLY2) является поли(алкиленоксидом), например поли(этиленоксид). Предпочтительно, хотя не обязательно, поли(этиленоксид) блокирован на одном конце группой, такой как метил, бензил или гидроксил. Наиболее предпочтительным поли(этиленоксидом) с концевой блокировкой является поли(этиленоксид),соответствующий одной из следующих структур: Н 3 С-(ОСН 2 СН 2)m- или H3C-(OCH2CH2)m-O-C(O)-NH[СН 2]f-(ОСН 2 СН 2)n-, где m - от 2 до 4000, f - от 0 до 6, n - от 0 до 20. Каждая спейсерная часть (независимо от того, является ли она первой спейсерной частью, второй спейсерной частью или третьей спейсерной частью), появляющаяся в полимере или охваченная формулами II, IIa или III, независимо определена, как указывалось выше в отношении в целом спейсерных частей. Тем не менее, предпочтительно, чтобы каждая из спейсерных частей, таких как спейсерные части,обозначенные X1 и X5, выбиралась из группы, состоящей из -О-, -О-СН 2-, -О-СН 2-СН 2-, -O-C(O)-NH-CH2CH2- и -O-C(O)-NH-CH2-CH2-(ОСН 2 СН 2)2-. Что касается спейсерных частей, обозначенных X2 и X6, то спейсерная часть предпочтительно выбирается из группы, состоящей из -СН 2-, -СН 2-СН 2-, -СН 2 СН 2(OR2)-, -CH2-CH(OR2)-CH(OR2)-, -N(R2)-, и R2 обозначает Н или органический радикал, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила. Что касается спейсерной части, обозначенной X8, спейсерная часть предпочтительно выбирается из группы, состоящей из -О-, -О-СН 2-, -О-СН 2-СН 2-, -О-СН 2 СН 2-СН 2-, -О-СН 2-СН 2-СН 2-С(О)-, -СН 2-, -СН 2-СН 2-, -СН 2-СН 2-СН 2-, -СН 2-СН 2-СН 2-С(О)-, -CH2-CH2- 15011351CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2- и -CH2-CH2-CH2-C(O)-NH-(CH2CH2O)n-CH2-CH2-CH2-, где n составляет от 0 до 20. Как вариант, X8 может включать дальнейшую точку разветвления или несколько точек разветвления, где могут присутствовать дополнительные реактивные группы, благодаря чему обеспечивается раздвоенное расположение. Другие раздвоенные расположения, которые могут использоваться в полимере в соответствии с настоящим изобретением, более полно описаны в международной заявке PCT/US 99/05333. Разветвляющая часть R5 в формуле III может обозначать любую разветвляющую часть, которая может обеспечить соединение по меньшей мере с тремя атомами. Тем не менее, предпочтительно, чтобы R5 выбирался из группы, состоящей из насыщенного алкила, замещенного насыщенного алкила, где р - 1-10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) и q - 1-10 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10). Несмотря на то, что реактивная группа Z, приведенная в формуле II, IIa и III, может быть любой реактивной группой, описанной выше, предпочтительно, чтобы реактивная группа выбиралась из группы,состоящей из карбоновой кислоты, альдегида, сульфона, сложного эфира, сукцинимида и малеимида. Иллюстративные примеры спейсерной части (например, X2, X4 и X8) и сочетания Z включают где r - 1-12 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12), r' - 0-5 (например , 0, 1, 2, 3, 4 или 5) и R6 арил или алкил. Специалистам в данной области очевидно, что настоящее изобретение охватывает большое количество полимеров. Неограничивающие примеры полимеров осуществления в соответствии с настоящим изобретением представлены ниже. в котором каждое р и q - единица и каНапример, начиная с формулы III и определяя R5 как ждое b и f - нуль, обеспечивается получение полимера, имеющего структуру, соответствующую формуле в которой POLY1, POLY2, а, с, g', j, h, R1, X7, X8 и Z - как определено выше. Формула IIIa, в свою очередь, может быть далее определена с целью получения полимерного реагента, имеющего структуру, соответствующую формуле IIIb. В частности, начиная с формулы IIIa и определения каждого R1 как Н, каждый POLY1 и POLY2 как Н 3 С-(ОСН 2 СН 2)m-, где m - от 2 до 4000, каждый из а и е равен единице, каждый X1 и X5 обозначает -O-C(O)-NH-[CH2]f-(OCH2CH2)n-, где f - от 0 до 6 и n - от 0 до 20, обеспечивается получение полимерного реагента, имеющего структуру, соответствующую формуле IIIb в которой каждый m - от 2 до 4000, каждый f - независимо от 0 до 6, и каждый n - независимо от 0 до 20,и g', h, j, X7, X8 и Z - как определено выше. Формула IIIb, в свою очередь, может быть далее определена с целью получения полимерного реагента, имеющего структуру, соответствующую формуле IIIc. В частности, начиная с формулы IIIb и определяя каждый из g' и j как нуль, h равным единице, X8 как -СН 2-СН 2-СН 2-, a Z обозначающим карбоновую кислоту, обеспечивается получение полимера, имеющего структуру, соответствующую формуле IIIc где каждый m - от 2 до 4000, каждый f - независимо от 0 до 6 и каждый n - независимо от 0 до 20 (например, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20). Как вариант, формула IIIc также может включать алкильную группу, соединенную либо с - или углеродом карбоновой кислоты. Что касается алкильной группы (например, метил), то на -углероде карбоновой кислоты структура соответствует формуле IIIb1. Кроме того, формула IIIa может быть далее определена с целью получения другого предпочтительного полимера, в частности, начиная с формулы IIIa и определяя каждый POLY1 и POLY2 как Н 3 С(ОСН 2 СН 2)m-, в которой m - от 2 до 4000, каждый из а, с, g' и j - как нуль, h - как единица, X8 - как -CH2CH2-CH2-C(O)-NH-CH2-CH2-NH-C(O)-CH2-CH2- и Z как имеющего следующую структуру: обеспечивается получение полимера, в которой каждое m - от 2 до 4000. Дополнительные полимерные реагенты в соответствии с изобретением включают в которых все переменные, как определено выше, в которых каждый n' - 0-100, более предпочтительно 040 и наиболее предпочтительно 0-20. В определенных случаях полимерные реагенты в соответствии с изобретением не включают кетонную часть, т.е. часть, в которой каждый из двух отдельных атомов углерода присоединен к атому углерода карбонильной части. не являлась частью кольцевой структуры (такой как малеимид) в некоторых случаях. Более того, также предпочтительно, чтобы располагалось ближе к водорастворимому полимеру, чем реактивная группа, исходя из измерений, например, в плане количества атомов, необходимых для достижения реактивной группы, начиная от ближайшего атома в водорастворимом полимере, по сравнению с количеством атомов для достижения реактивной группы,начиная с ближайшего атома в реактивной группе. Изобретение также включает способ получения полимерных реагентов, описанных в настоящем изобретении. Способ включает этап (i) обеспечения предшественника, включающего защищенную реактивную группу или одну или нескольких гидроксильных групп (или незащищенная реактивная группа является такой реактивной группой, которая может остаться неизменной при выполнении этапов способа). Некоторые молекулы предшественника, состоящие из защищенной реактивной группы или реактивной группы предшественника и одной или нескольких гидроксильных групп, могут быть получены промышленным способом. Кроме того, незащищенные формы молекулы предшественника могут быть синтезированы и далее защищены (при необходимости) с использованием известных способов. Несмотря на существование многочисленных форм приемлемых молекул предшественников, и изобретение не ограничено в этом отношении, предпочтительная молекула предшественника имеет две гидроксильные группы. Пример предпочтительной приемлемой молекулы предшественника соответствует формуле (IV) ниже. где PG - защищающая группа. Этот реагент может быть получен синтетически, например, в соответствии с описанием в примере 1. Примеры предпочтительных защищающих групп включают группы, выбранные из групп, состоящих из метила, этила, трет-бутила и бензила. Исключительно предпочтительной защищающей группой является метил. Способ получения полимерного реагента в соответствии с настоящим изобретением включает этап(ii) активирования по меньшей мере одной гидроксильной группы предшественника для вступления в реакцию с аминогруппой для образования активированного предшественника. Несмотря на то, что могут быть использованы любые приемлемые известные активирующие реагенты, предпочтительно использовать активирующий агент, выбранный из группы, состоящей из карбоната ди(N-сукцинимидила) (DSC),N,N'-дициклогексилкарбодиимида (DCC), N,N'-диизопропилкарбодиимида, N-(3-диметиламиноприпил)N'-этилкарбодиимида, 1,1'-карбонилдиимизадола (CDI), 1,1'-карбонил (1,2,4-триазола) (CDT), бис(4 нитрофинил) карбоната, р-нитрофенил хлоркарбоната, 4-диметиламинопиридина (DMAP), фосгена, трифосгена, 1-гидроксибензотриазола (HOBt), дибензотриазолил карбоната (diBTC), N-гидроксисукциминида и DCC, N-гидроксифталимида и DCC и тиазолидин тиона. Обычно активирующий агент добавляют в емкость, содержащую молекулу предшественника таким образом, чтобы активирующий агент контактировал с гидроксильной группой предшественника. Другой этап способа получения полимерных реагентов в соответствии с настоящим изобретением включает (iii) вступление в контакт при условиях ковалентного сочетания по меньшей мере одной активированной гидроксильной группы с водорастворимым полимером, имеющим аминогруппу, с образованием полимера, содержащего часть водорастворимого полимера и защищенную реактивную группу. Специалисты в данной области техники могут определить путем проведения обычного эксперимента,какие условия рН, температура и т.д. являются подходящими для образования ковалентного сочетания. Например, этот этап сочетания может проводиться несколько раз, при этом каждый раз при различном наборе условий (например, различный рН, различные температуры, растворители и т.д.) Путем определения количества полимера, состоящего из части водорастворимого полимера и защищенной реактивной группы (например, путем проведения гель-хроматографии), получаемого в результате каждого набора условий, возможно определить какой(ие) набор(ы) условий является наиболее подходящим для проведения этапа сочетания. Несмотря на то, что может быть использовано большинство любых водорастворимых полимеров,исключительно предпочтительно использовать один из следующих полимеров: в которых m составляет от 2 до 4000. Водорастворимые полимеры, имеющие аминогруппу, могут быть синтезированы de novo с использованием методов, известных специалистам в данной области техники, и могут быть получены через серийных поставщиков, таких как Nektar Therapeutics (Huntsville, AL). В том случае, когда в молекуле предшественника присутствует защитная группа, способ получения полимерных реагентов также включает этап (iv) удаления защиты защищенной реактивной группы при ее наличии с образованием полимерного реагента. Этап удаления защиты может проводиться с использованием любого способа, подходящего для удаления конкретной защитной группы. Специалистам в данной области техники известны соответствующие способы удаления защиты в отношении любой конкретной защитной группы. Кроме того, приемлемые способы удаления защиты описаны в соответствующей литературе, например Greene et al., supra. Предпочтительный способ удаления защиты кислотной группы, защищенной как сложный эфир алкильной группы (например, метиловый эфир), заключается в проведении щелочно-катализируемого гидролиза молекулы, содержащей защищенную группу. Примеры приемлемых оснований, добавляемых в реакционный сосуд, в котором находятся молекулы,содержащие защищенную реактивную группу, включают, без ограничений, неорганические гидроксиды,такие как гидроксид натрия, гидроксид калия и соли металлов слабых кислот, таких как ацетат натрия,карбонат натрия, бикарбонат натрия, фосфат натрия, карбонат калия, бикарбонат калия, цитрат калия,ацетат калия и т.д. Кислотно-катализируемый гидролиз также может быть проведен с ортоэфирами, хотя можно использовать сочетание кислотно-катализируемого гидролиза с последующим щелочнокатализируемым гидролизом с указанными производными. С ацеталями кислотно-катализируемый гидролиз является эффективным, в то время как щелочно-катализируемый гидролиз - неэффективным. С бензиловыми сложными эфирами или бензиловыми эфирами каталитическое восстановление является эффективным, хотя кислотно- или щелочно-катализируемый гидролиз также эффективен со сложными эфирами. Способ получения полимерных реагентов, как вариант, включает дополнительный этап выделения полимерного реагента после его формирования. Для выделения полимера могут использоваться известные способы, но исключительно предпочтительно использовать хроматографию, например ионнообменную хроматографию или гель-хроматографию. В альтернативном варианте или дополнительно способ включает этап очистки полимера после его формирования. В этом случает также могут быть использованы стандартные известные способы очистки полимера. В отношении любого данного полимера, полученного в соответствии с настоящим способом, способ обеспечивает более эффективное дальнейшее преобразование полимера (либо до, либо после любого этапа удаления защиты) таким образом, чтобы он содержал конкретную реактивную группу. Таким образом, используя известные в данной области техники способы, полимер может быть функционализирован для включения реактивной группы (например, активный сложный эфир, тиол, малеимид, альдегид, кетон и т.д.). Различные этапы для получения полимерного реагента проводятся в приемлемом растворителе. Специалисты в данной области техники могут определить, пригоден ли какой-либо конкретный растворитель для любого данного этапа реакции. Тем не менее, нередко растворитель обозначает предпочтительно неполярным растворителем или полярным растворителем. Неограничивающие примеры неполярных растворителей включают бензол, ксилол и толуол. Исключительно предпочтительные неполярные растворители включают толуол, ксилол, диоксан, тетрагидрофуран и трет-бутиловый спирт. Иллюстративные полярные растворители включают, но не ограничены, диоксан, тетрагидрофуран (ТГФ), третбутиловый спирт, ДМСО (диметилсульфоксид), ГМФА (гексаметилфосфорамид), ДМФ (диметилформамид), ДМА (диметилацетамид), и NMП (N-метилпирролидинон). Настоящее изобретение также включает конъюгаты, содержащие часть водорастворимого полимера, часть и фармакологически активный агент. Конъюгаты имеют следующую внутреннюю структурную ориентацию: (i) часть водорастворимого полимера связана с атомом азота части с помощью либо прямой ковалентной связи, либо первой спейсерной части; (ii) фармакологически активный агент связан с карбонильным атомом углерода части с помощью либо прямой ковалентной связи, либо второй спейсерной части; и (iii) R1 обозначает Н или органический радикал.- 27011351 Когда присутствует только один водорастворимый полимер в общей структуре конъюгата, структура конъюгата предпочтительно соответствует формуле VR1 - Н или органический радикал (например, выбранный из группы, состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила);X1, если присутствует, обозначает первую спейсерную часть;X2, если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть; активный агент - фармакологически активный агент. Кроме того, когда в общей структуре конъюгата присутствуют два водорастворимых полимера,структура конъюгата предпочтительно соответствует формуле VIj - от 0 до 20 (т.е. 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20); каждый R1 обозначает независимо Н или органический радикал (например, выбранный из группы,состоящей из алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, арила и замещенного арила);X1 - если присутствует, обозначает первую спейсерную часть;X2 - если присутствует, обозначает вторую спейсерную часть;X5 - если присутствует, обозначает пятую спейсерную часть;X6 - если присутствует, обозначает шестую спейсерную часть;X7 - если присутствует, обозначает седьмую спейсерную часть;X8 - если присутствует, обозначает восьмую спейсерную часть;R5 - разветвляющая часть; активный агент - фармакологически активный агент. Полимерные реагенты, описанные в настоящем патенте, эффективно конъюгируют с биологически активными агентами или поверхностями. Предпочтительными группами, приемлемыми для проведения реакции с полимерными реагентами, описанными в данном патенте, являются электрофильные или нуклеофильные группы. Иллюстративные группы включают первичные амины (например, первичные амины из боковой цепи лизинового остатка или N-конца полипептида), спирты (например, первичный спирт из боковой цепи серинового или треонинового остатка), тиолы, гидразины, гидразиды и сульфидрилы. Такие группы, приемлемые для проведения реакции с полимерными реагентами, описанными в данном патенте, известны специалистам в данной области техники. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается способ получения конъюгата, включающий этап контактирования при условиях конъюгирования активного агента с полимерным реагентом, описанным в настоящем патенте. Приемлемые условия конъюгации включают время, температуру, рН, концентрацию реагента,функциональную(ые) группу(ы) реагента, имеющиеся функциональные группы на активном агенте, растворитель и иные подобные параметры, достаточные для проведения конъюгации между полимерным реагентом и активным агентом. Как известно в данной области техники, конкретные условия зависят,кроме других факторов, от активного агента, типа требуемой конъюгации, наличия других материалов в реакционной смеси и т.д. Достаточные условия для проведения конъюгации в любом конкретном случае могут быть определены специалистами в данной области техники после ознакомления с изобретением в настоящем описании, со ссылками на соответствующую литературу и(или) путем проведения обычных- 28011351 экспериментов. Например, когда полимерный реагент содержит активный сложный эфир N-гидроксисукцинимида(например, сукцинимидил сукцинат, сукцинимидил пропионат и сукцинимидил бутаноат), и активный агент содержит аминогруппу (например, концевую аминогруппу на полипептиде и(или) эпсилон-амине лизинсодержащего полипептида), конъюгация может быть проведена при рН от приблизительно 7,5 до приблизительно 9,5 при комнатной температуре. Кроме того, когда полимерный реагент содержит винилсульфоновую реактивную группу или малеимидную группу, и фармакологически активный агент содержит сульфидрильную группу (например, сульфидрильную группу цитеин- или метионинсодержащего полипептида), конъюгация может быть проведена при рН от приблизительно 7 до приблизительно 8,5 при комнатной температуре. Более того, когда реактивная группа, связанная с полимерным агентом,является альдегидом или кетоном, и фармакологически активный агент содержит первичный амин,конъюгация может быть проведена путем проведения реакции гидроаминирования, в которой первичный амин фармакологически активного агента вступает в реакцию с альдегидом или кетоном полимера. Реакция гидроаминирования, протекающая при рН от приблизительно 6 до приблизительно 9,5, первоначально приводит к получению конъюгата, в котором фармакологически активный агент и полимер связаны с помощью иминной связи. Последующая обработка иминсодержащего конъюгата растворителем,восстанавливающим агент, такой как NaCNBH3, обеспечивает восстановление имина до вторичного амина. Дополнительная информация относительно указанных и других реакций конъюгации содержится в работе Hermanson "Bioconjugate Techniques", Academic Press, 1996. Иллюстративные условия конъюгации включают проведение реакции конъюгации при рН от приблизительно 4 до приблизительно 10 и, например, при рН приблизительно 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0,7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 или 10,0. Реакция протекает в течение периода времени от приблизительно 5 мин до приблизительно 72 ч, предпочтительно от приблизительно 30 мин до приблизительно 48 ч и более предпочтительно от приблизительно 4 до приблизительно 24 ч. Температура, при которой протекает реакция конъюгации обычно, хотя не обязательно, находится в диапазоне от приблизительно 0 до приблизительно 40 С и нередко при комнатной температуре или более низкой температуре. Реакции конъюгации обычно проводятся с использованием фосфатного буферного раствора, ацетата натрия или аналогичных соединений. Что касается концентрации реагента, избыток полимерного реагента обычно соединяется с активным агентом. Тем не менее, в ряде случаев предпочтительно иметь теоретически необходимое количество реактивных групп на полимерном реагенте по отношению к реактивным группам активного агента. Таким образом, например, 1 моль полимерного реагента, содержащего две реактивные группы, соединяется с 2 молями активного агента. Иллюстративные соотношения полимерного реагента к активному агенту включают молярные соотношения приблизительно 1:1 (полимерный реагент:активный агент),1,5:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 8:1 или 10:1. Реакция конъюгации протекает до тех пор, пока не прекращается конъюгация, что может быть в целом определено путем контроля за протеканием реакции во времени. Протекание реакции контролируют путем взятия аликвотных проб из реакционной смеси в различные моменты времени и проведения анализа реакционной смеси с использованием масс-спектрометрииSDS-PAGE и MALDI-TOF или любого иного приемлемого аналитического метода. По достижению стабилизации в отношении количества сформированного конъюгата или количества оставшегося, не прошедшего конъюгацию полимерного реагента, реакция считается завершенной. Обычно реакция конъюгации протекает в течение от нескольких минут до нескольких часов (например, от 5 мин до 24 ч и более). Полученная смесь продукта предпочтительно, но не обязательно, очищается для отделения избытка полимерного реагента не прошедших конъюгацию реактантов (например, активного агента) и нежелательных многоконъюгированных продуктов реакции. Полученные конъюгаты могут быть далее исследованы с помощью таких аналитических методов, как MALDI, капиллярный электрофорез, гельэлектрофорез и(или) хроматография. Конъюгаты полимер-активный агент могут быть очищены с целью получения/выделения различных конъюгированных продуктов реакции. В альтернативном случае и более предпочтительно в отношении полимерных реагентов с более низкой молекулярной массой (например, менее приблизительно 20000 Да, более предпочтительно менее приблизительно 10000 Да), используемых для формирования конъюгатов, смесь продукта может быть очищена с целью достижения распределения сегментов водорастворимого полимера по активному агенту (например, смесь продукта может быть очищена с целью получения в среднем от одного, двух, трех, четырех или пяти присоединений полимерного реагента на активный агент (например, протеин). Стратегия для очищения конечной реакционной смеси конъюгата зависит от ряда факторов, включающих, например, молекулярную массу используемого полимерного реагента, конкретный активный агент, требуемый режим дозирования, остаточная активность и in vivo свойства отдельного конъюгата(ов). При необходимости конъюгаты, имеющие различные молекулярные массы, могут быть выделены с использованием гель-фильтрационной хроматографии, т.е. гель-фильтрационная хроматография используется для фракционирования различно пронумерованных отношений полимерный агент-активный агент- 29011351 и т.д., где "1-мономерное звено полимера" означает 1 полимерный реагент на активный агент, "2 мономерное звено полимера" означает два полимерных реагента на активный агент и т.д.) на основе их различных молекулярных масс (где разница, в целом, соответствует среднему молекулярному весу сегментов водорастворимого полимера). Например, в иллюстративной реакции, где протеин с молекулярной массой 100000 Да произвольно конъюгирован с разветвленным ПЭГ, имеющим общую молекулярную массу около 20000 Да (в котором каждая полимерная ветвь разветвленного ПЭГ имеет молекулярную массу около 10000 Да), полученная реакционная смесь может содержать немодифицированный протеин(имеющий молекулярный веси около 100000 Да), моноПЭГилированный протеин (имеющий молекулярную массу около 120000 Да), диПЭГилированный протеин (имеющий молекулярную массу около 140000 Да) и т.д. В то время как данный способ может быть использован для разделения ПЭГ и других конъюгатов полимер-активный агент, имеющих различные молекулярные веса, этот способ, в целом, является неэффективным для разделения позиционных изомеров, имеющих различные центры присоединения полимера внутри протеина. Например, гель-фильтрационная хроматография может использоваться для отделения от других смесей ПЭГ 1-мономерного звена полимера, 2-мономерного звена полимера, 3 мономерного звена полимера и т.д., хотя каждый из выделенных составов ПЭГ-мономерных звеньев полимера может содержать ПЭГи, присоединенные к различным реактивным аминогруппам (например,остатки лизина) внутри активного агента. Гель-фильтрационные колонки, подходящие для проведения такого рода разделения, включают Superdex и Sephadex колонки, поставляемые компанией Amersham Biosciences. Выбор конкретной колонки будет зависеть от требуемого диапазона фракцинации. Элюирование обычно проводится с использованием приемлемого буферного раствора, например фосфата, ацетата и т.п. Собранные фракции могут быть проанализированы с использованием ряда различных способов, например, (i) оптическая плотность(OD) при 280 нм на содержание протеина; (ii) протеиновый анализ бычьего сывороточного альбумина(BSA); (iii) йодная проба на содержание ПЭГ (Sims et al. (1980) Anal. Biochem, 107: 60-63); и iv) проведение электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с последующим окрашиванием (проявлением) йодистым барием. Разделение позиционных изомеров проводится с помощью хроматографии с обращенной фазой с использованием колонки С 18 высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (RPHPLC) (компании Amersham Bioscience или Vydac) либо с помощью ионообменной хроматографии с использованием ионообменной колонки, например ионообменной колонки Sepharose компании Amersham Biosciences. Любой из способов может быть использован для разделения изомеров полимерактивный агент, имеющих один и тот же молекулярный вес (позиционные изомеры). Полимерные реагенты в соответствии с настоящим изобретением могут присоединяться либо ковалентно, либо нековалентно к ряду объектов, включая пленки, поверхности химического разделения и очистки, твердые опоры, металлические поверхности, такие как золото, титан, тантал, ниобий, алюминий, сталь и их окислы, диоксид кремния, макромолекулы (например, протеины, полипептиды и т.д.) и малые молекулы. Кроме того, полимерные реагенты также могут использоваться в биохимических сенсорах, биоэлектрических выключателях и затворах. Полимерные реагенты могут также использоваться в качестве носителей для синтеза пептидов, для получения поверхностей с полимерным покрытием и полимерных прививок, для получения конъюгатов полимер-лиганд для распределения по сродству, для получения сшитых и несшитых гидрогелей и для получения аддуктов полимер-кофатор для биореакторов. Биологически активный агент, используемый для присоединения к полимерному реагенту в соответствии с настоящим изобретением, может представлять собой любой один или более из нижеперечисленных. Приемлемые агенты могут быть выбраны, например, из снотворных средств и седативных средств, антидепрессантов, транквилизаторов, респираторных лекарств, противосудорожных средств,миорелаксантов, средств против болезни Паркинсона (антагонисты допамина), болеутоляющих средств,противовоспалительных средств, успокаивающих средств (транквилизаторы), супрессивных средств аппетита, средств против мигрени, противосудорожных средств, противоинфекционных средств (антибиотики, антивирусные средства, противогрибковые средства, вакцины), средств против артрита, противомалярийных средств, противорвотных средств, противоэпилептических средств, бронхилитических средств, цитокинов, факторов роста, противораковых средств, антитромбических средств, гипотензивных средств, сердечно-сосудистых лекарств, средств против аритмии, антиоксидантов, противоастматических средств, гормональных средств, включая противозачаточные средства, симпатомиметики, мочегонные средства, средства, регулирующие содержание липидов, антиандрогенные средства, противопаразитарные средства, антикоагулянты, противоопухолевые средства, средства против пониженного содержания глюкозы в крови, пищевые агенты и добавки, добавки для увеличения роста, средства против энтерита, вакцины, антитела, диагностические средства и контрастирующие средства. В частности, активный агент может входить в один из ряда структурных классов, включающих, но не ограниченных, малые молекулы (предпочтительно нерастворимые малые молекулы), пептиды, полипептиды, протеины, антитела, фрагменты антител, полисахариды, стериоды, нуклеотиды, олигонуклео- 30