Дансилгидразид 24-эпикастастерона в качестве меченого антигена для иммунохимического анализа (24r)-метилбрассиностероидов

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента ДАНСИЛГИДРАЗИД 24-ЭПИКАСТАСТЕРОНА В КАЧЕСТВЕ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА (24R)-МЕТИЛБРАССИНОСТЕРОИДОВ Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов,а именно к новому химическому соединению - дансилгидразиду 24-эпикастастерона. Задачей настоящего изобретения является конъюгат 24-эпикастастерона с дансилгидразином, который может быть использован в качестве меченого антигена в иммунофлуоресцентном определении(24R)-метилбрассиностероидов. Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом 24 эпикастастерона с дансилгидразином, который получают взаимодействием 24-эпикастастерона в смеси диметилформамида и уксусной кислоты с дансилгидразином и последующим выделением целевого конъюгата методом колоночной хроматографии. Хрипач Владимир Александрович,Жабинский Владимир Николаевич,Иванова Галина Васильевна, Прядко Андрей Георгиевич, Новик Татьяна Валентиновна, Райченок Тамара Фроловна (BY)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ" (BY) 015684 Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к новому химическому соединению - дансилгидразиду 24-эпикастастерона формулы I который может быть использован в качестве меченого антигена в аналитической тест-системе для иммунофлуоресцентного определения (24R)-метилбрассиностероидов. Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - 105-10-9% и менее. В очень малых концентрациях они проявляют и свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур брассиностероидами в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростостимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [2-7]. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее известных в настоящее время является препарат эпин, действующим веществом которого стал фитогормон 24-эпибрассинолид. Доступность последнего (как и других брассиностероидов) может обеспечить только химический синтез. Все вышеизложенное ставит на повестку дня разработку методов анализа брассиностероидов, которые должны обладать высокой чувствительностью, избирательностью, простотой в исполнении и быть доступными. Развитие в последнее время иммунофлуоресцентных методов анализа требует наличия как иммуногена, так и иммунофлуоресцентной "метки", в качестве которой может выступать субстрат, меченный дансилгидразином. В настоящее время неизвестны конъюгаты брассиностероидов с дансилгидразином (или другой флуоресцентной меткой), которые были получены и могли бы быть использованы в иммуноаналитических системах для определения 24-эпикастастерона и эпибрассинолида. Целью изобретения является ранее неизвестный конъюгат 24-эпикастастерона и дансилгидразина дансилгидразид 24-эпикастастерона формулы I, который может быть использован в качестве меченого антигена в иммунофлуоресцентном анализе (24R)-метилбрассиностероидов. Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом I, который получают взаимодействием 24 эпикастастерона с дансилгидразином в смеси диметилформамида и уксусной кислоты. Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1. Эпикастастерон (0,051 г, 0,11 моль) и дансилгидразин (0,0318 г, 0,12 моль) растворяют в смеси диметилформамида и уксусной кислоты (1 мл, 1/1), затем реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре до исчезновения исходного соединения (контроль по ТСХ). Растворитель удаляют в вакууме, остаток хроматографируют на колонке с силикагелем. Выход конъюгата I составляет 77%. Т. пл. 160-163C (EtOAc-гексан). Спектр 1H NMR: 1H-ЯМР (, м.д.): 0.50 (s, 1H, H18), 0.84-0.97 (m,15H, H19, H21, H-26, H27, H-28), 2.41 (dd, 1H, J= 3.6, 13.7 Гц, H-5), 2.88 (s, 6H, -NMe2), 3.41 (m, 1H), 3.54(m, 1H), 3.69 (m, 1H), 3.90 (m, 1H), 7.15 (d, 1H, J = 7.5 Гц), 7.55 (m, 3H), 8.30-8.36 (m, 2H), 8.54 (d, 1H,J=8.4 Гц). 13C-ЯМР (, м.д.): 11.3, 12.7, 12.8, 13.2, 17.6, 22.2, 22.7, 23.7, 25.0, 28.1, 28.9, 29.6, 33.1, 33.2,37.5, 40.8, 40.9, 41.7, 42.8, 44.0, 45.9, 46.1, 54.2, 55.4, 57.7, 69.3, 69.8, 73.5, 77.4, 116.5, 120.7, 124.4, 129.4,131.1, 131.2, 131.5, 132.0, 135.7, 153.0, 162.8. Синтезированный дансилгидразид 24-эпикастастерона может быть использован в качестве меченого антигена для количественного определения (24R)-метилбрассиностероидов (24-эпибрассинолида и 24 опикастастерона) методом иммунофлуоресцентного анализа, что подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 2. В качестве компонентов аналитической системы используют: антисыворотку к 24 эпикастастерону, полученную согласно методу, описанному ранее [8]; заявляемый дансилгидразид 24 эпикастастерона; калибровочные пробы - буферные растворы с содержанием 24-эпибрассинолида 0 мкг/мл; 1 мкт/мл, 10 мкг/мл и 100 мкг/мл; буферный раствор для разведения дансилгидразида 24 эпикастастерона; промывочный буферный раствор. Антитела к 24-эпибрассинолида иммобилизуют на внутренней поверхности 96-ти луночных микропланшетов, обычно использующихся в иммуноферментном анализе. Для проведения анализа в лунки планшета вносят по 0,05 мл калибровочных проб. Затем во все лунки вносят по 0,1 мл раствора дансилгидразида 24-эпикастастерона. Инкубируют смесь в течение 2 ч при 37C. Затем содержимое лунок переносят в непрозрачные плашки (Grcincr) для измерения флуоресценции. Флуоресцентные измерения проводят на приборе Infinite M200 (Tecan, Австрия) при 20C.-1 015684 Возбуждение люминесценции проводят при длине волны 340 нм. Спектры флюоресценции регистрируют в диапазоне 370-620 нм. Интенсивность флуоресценции в калибровочных пробах составляет для 0 мкг/мл - 10 отн.ед., 1 мкг/мл - 50 отн.ед., 10 мкг/мл - 400 отн.ед., 100 мкг/мл - 1200 отн.ед., для аналитического образца 20 мкг/мл - 570 отн.ед. Таким образом, на основании сравнения интенсивности флуоресценции анализируемого образца и калибровочных проб можно установить концентрацию брассиностероида в анализируемом образце. Приведенные результаты подтверждают возможность использования заявляемого дансилгидразида 24-эпикастастерона для количественного определения (24R)-метилбрассиностероидов с чувствительностью 0,5 мкг/мл. Заявляемый дансилгидразид 24-эпикастастерона получается с высоким выходом, обеспечивает необходимую иммуногенность метки и позволяет проводить количественное определение (24R)метилбрассиностероидов методом иммунофлуоресцентного анализа. Он является устойчивым соединением и не обнаруживает признаков разложения, по меньшей мере, в течение нескольких месяцев при комнатной температуре. Для сравнения, используемый для аналогичных целей в иммуноферментном анализе в качестве меченого антигена конъюгат 24-эпибрассинолида с пероксидазой хрена отличается недостаточной стабильностью (хранение при -18C) и многостадийностью синтеза [9]. Литература 1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. Минск: Навука i тэхнiка, 1993. 288 с. 2. Патент РБ 2806 от 23.11.1995. Средство для снижения накопления радионуклидов растениями и способ его применения. / Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Деева В.П., Веденеев А.П. // Оф. Бюл. Белгос-пат., 2000, N2 (26), с. 159. 3. Патент РБ 3488 от 04.07.1996. Способ повышения питательной ценности картофеля. / Хрипач В.А.,Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И. (Беларусь), Вакуленко В.В.(Россия). // Оф. Бюл. Белгос-пат., 2000, N3 (27), с.74. 4. Патент РБ 3400 от 04.07.1996. Способ защиты картофеля от фитофтороза. / Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Кильчевский А.В., Титова С.Н. // Оф. Бюл. Бел-гос-пат., 2000, N2(25), с.75. 5. Патент РБ 5168. /Хрипач В.А., Литвиновская Р.П., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Волынец А.П.,Прохорчик Р.А., Пшеничная Л.А., Манжелесова Н.Е., Морозик Г.B.// Оф. Бюл. НЦИС РБ, 2003 2(37), с.95. 6. Патент РБ 5212. Способ повышения урожайности льна и улучшения качества льноволокна./Воскресенская Л.Г., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П. // Оф. Бюл. НЦИС РБ,2003 2(37), с.93. 7. Патент РБ N5698. Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля. / Бобрик А.О., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П. // Оф.Бюл.НЦИС РБ, 2003 4(39). 8. Хрипач В.А., Свиридов О.В., Прядко А.Г., Литвиновская Р.П., Драч С.В., Матвеенцев В.Д., Новик Т.В., Михайлопуло К.И., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Аверькова М.А., Драченова О.А., Чащина Н.М. Биоорган. химия, 33 (2007) 371-378. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Дансилгидразид 24-эпикастастерона формулы I в качестве меченого антигена для иммунофлуоресцентного определения (24R)-метилбрассиностероидов.