Конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов

КОНЪЮГАТ 28-НОРБРАССИНОЛИДА С ПЕРОКСИДАЗОЙ ХРЕНА В КАЧЕСТВЕ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 7-ОКСА-6 ОКСОБРАССИНОСТЕРОИДОВ Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена. Задачей настоящего изобретения является конъюгат 28-норбрассинолида и пероксидазы хрена, который может быть использован в качестве меченого антигена в иммуноферментном определении 7-окса-6-оксобрассиностероидов - брассинолида, 24-эпибрассинолида, 28 гомобрассинолида, 28-норбрассинолида и др. Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом 28-норбрассинолида и пероксидазы хрена, который получают N-оксисукцинимидного эфира (22R,23R)-2,3,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-В-гомо-7-окса-5-холестан-6-она(гаптена) с пероксидазой хрена в диоксановой среде в присутствии гидрокарбоната калия (рН 8,5) и очисткой образовавшегося продукта на сефадексе с последующим замораживанием раствора в глицерине. Хрипач Владимир Александрович, Жабинский Владимир Николаевич, Антончик Алексей Владимирович, Литвиновская Раиса Павловна, Драч Светлана Васильевна, Свиридов Олег Васильевич, Прядко Андрей Георгиевич, Новик Татьяна Валентиновна, Матвеенцев Виталий Демидович (BY)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ" (BY) 015275 Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена формулы 1 где ПХ - пероксидаза хрена,который может быть использован в качестве меченого антигена в аналитической тест-системе для иммуноферментного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов - брассинолида, 24-эпибрассинолида, 28 гомокастастерона, 28-норбрассинолида и др. Брассиностероиды (БС) - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1, 2]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - менее 10-5%. В очень малых концентрациях они проявляют и свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [3-8]. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее известных в настоящее время является препарат эпин, действующим веществом которого стал фитогормон 24-эпибрассинолид. Наибольшую активность проявляют брассиностероиды, имеющие в своей структуре 7-окса-6-оксогруппировку (так называемые брассиностероидные лактоны) [1]. Низкое содержание БС в природных объектах и исчезающе малые дозы, вызывающие их эффект, делают необходимым разработку методов анализа брассиностероидов, в частности брассиностероидных лактонов. Все вышеизложенное ставит на повестку дня разработку методов анализа брассиностероидов, которые должны обладать высокой чувствительностью, избирательностью, простотой в исполнении и быть доступными. Развитие в последнее время методов, основанных на использовании антител, в частности иммуноферментного анализа, требует наличия как иммуногена, так и иммуноферментной метки, в качестве которой может выступать субстрат, меченный пероксидазой хрена. В настоящее время известен конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена 2, который был получен и использован в иммуноаналитических системах для определения только 24Rметилбрассиностероидов (24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида, 24-эпи-6-дезоксокастастерона) [9]. Применение его для определения других БС проблематично из-за низкой чувствительности. Целью изобретения является ранее неизвестный конъюгат 28-норбрассинолида и пероксидазы хрена, который может быть использован в качестве меченого антигена в иммуноферментном анализе 7-окса 6-оксобрассиностероидов (брассиностероидных лактонов). Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом 1, который получают взаимодействием Nоксисукцинимидного эфира (22R,23R)-2,3,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-В-гомо-7-окса-5 холестан-6-она (гаптена) с пероксидазой хрена в диоксановой среде в присутствии гидрокарбоната калия(рН 8,5) и очисткой образовавшегося продукта на сефадексе с последующим замораживанием раствора конъюгата в глицерине. Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1. Растворяют 30 мг (52 ммоль) (22R,23R)-2,3,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-В-гомо-7 окса-5-холестан-6-она (1) в 6 мл абс. диоксана, добавляют 8 мг сухого N-оксисукцинимида (70 ммоль) и прикапывают при t = 8-10 С 13 мг (63 ммоль) дициклогексил карбодиимида в 4 мл абс. диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным Na2SO4, упаривают. Образовавшийся эфир используют без до-1 015275 полнительной очистки. К раствору 6 мг пероксидазы хрена в 600 мл дист. воды в присутствии 2-3 капель 0,1 М раствора гидрокарбоната натрия (рН 8,35) добавляют раствор 3 мг (4,4 ммоль) N-сукцинимидного эфира, перемешивают 30 мин при 10 С и при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Очищают на колонке с сефадексом, элюент - дист. вода. Собирают окрашенную фракцию (желто-коричневая), затем разбавляют глицерином (1:2) и хранят в морозильнике (при -18 С). Синтезированный конъюгат используют в качестве меченого антигена в иммуноаналитической системе для количественного определения 7-окса-6-оксобрассиностероидов, что подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 2. Для проведения анализа в лунки планшета с иммобилизованными антителами вносили по 50 мкл калибровочных проб или исследуемых растворов брассиностероидов и 100 мкл рабочего раствора конъюгата 28-норбрассинолидпероксидаза хрена. Планшеты инкубировали в течение 2 ч при 37 С без встряхивания, затем удаляли жидкость из лунок и промывали их 1%-ным раствором NaCl, содержащим 0,02%Tween 20. Для проведения цветной реакции в лунки немедленно вносили по 150 мкл раствора 3,3',5,5'тетраметилбензидина в субстратном буфере и инкубировали планшет в течение 15 мин при 37 С без доступа света. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента (5%-ный раствор H2SO4) и не позже чем через 30 мин проводили измерение оптической плотности на ИФА-ридере при длине волны 450 нм. Результаты анализа рассчитывали методом интерполяции по калибровочной кривой [9]. Концентрация нативного антигена, при которой достигается замещение половины меченого антигена в комплексе антитело-антиген, составила 0,3 нмоль/л или 7 пкг в 50 мкл образца. Заявляемый конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена получается с высоким выходом,обладает стабильностью, обеспечивает необходимую иммунореактивность метки и позволяет проводить количественное определение 7-окса-6-оксобрассиностероидов (брассинолида, 24-эпибрассинолида, 28 гомобрассинолида, 28-норбрассинолида и др.) методом иммуноферментного анализа. Литература 1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. Минск: Навука i тэхнiка, 1993. 288 с. 2. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., de Groot Ae. Brassinosteroids - A New Class of Plant Hormones. SanDiego: Acad. Press. 1999, 456 p. 3. Патент РБ 2806 от 23.11.1995. Средство для снижения накопления радионуклидов растениями и способ его применения./Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Деева В.П.,Веденеев А.Н.//Оф. Бюл. Белгоспат., 2000,2 (26). С. 159. 4. Патент РБ 3488 от 4.07.1996. Способ повышения питательной ценности картофеля./Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И. (Беларусь), Вакуленко В.В. (Россия).//Оф. Бюл. Белгоспат., 2000,3 (27). С. 74. 5. Патент РБ 3400 от 4.07.1996. Способ защиты картофеля от фитофтороза./Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Кильчевский А.В., Титова С.Н.//Оф. Бюл. Белгоспат., 2000,2 (25). С. 75. 6. Патент РБ 5168./Хрипач В.А., Литвиновская Р.П., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Волынец А.П., Прохорчик Р.А., Пшеничная Л.А., Манжелесова Н.Е., Морозик Г.В.//Оф. Бюл. НЦИС РБ, 2003 2(37). С. 95. 7. Патент РБ 5212. Способ повышения урожайности льна и улучшения качества льноволокна./Воскресенская Л.Г., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.//Оф. Бюл. НЦИС РБ, 2003,2 (37). С. 93. 8. Патент РБ 5698. Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля./Бобрик А.О., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.//Оф. Бюл. НЦИС РБ,20034 (39). 9. Патент РБ 9771 (С 2 С 07J 41/00). Конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 24R-метилбрассинстероидов./Хрипач В.А.,Свиридов О.В., Литвиновская Р.П., Прядко А.Г., Драч С.В., Матвеенцев В.Д., Новик Т.В.//Оф. Бюл. изобрет. НЦИС, 2007,5, с. 94. 10. Хрипач В.А., Свиридов О.В., Прядко А.Г., Литвиновская Р.П., Драч С.В., Матвеенцев В.Д., Новик Т.В., Михаилопуло К.И., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Аверькова М.А., Драченова О.А., Чащина Н.М. Иммуноферментный анализ (24R)-брассиностероидов.//Биоорг. химия. - 2007 - т. 33,3. С. 371378. 11. Егоров A.M. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк., 1991. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Конъюгат 28-норбрассинолида с пероксидазой хрена формулы