Конъюгат кастастерона с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 24s-метилбрассиностероидов

КОНЪЮГАТ КАСТАСТЕРОНА С ПЕРОКСИДАЗОЙ ХРЕНА В КАЧЕСТВЕ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 24S-МЕТИЛБРАССИНОСТЕРОИДОВ Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату кастастерона с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена. Задачей настоящего изобретения является конъюгат кастастерона и пероксидазы хрена, который может быть использован в качестве меченого антигена в иммуноферментном определении 24Sметилбрассиностероидов - кастастерона и брассинолида. Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом кастастерона и пероксидазы хрена, который получают взаимодействием 6O-карбоксиметилоксима кастастерона через N-оксисукцинимидный эфир с пероксидазой хрена в водной среде в присутствии гидрокарбоната калия (рН 8,35), очисткой на сефадексе и замораживанием раствора в глицерине. Хрипач Владимир Александрович, Свиридов Олег Васильевич, Литвиновская Раиса Павловна, Прядко Андрей Георгиевич,Драч Светлана Васильевна, Матвеенцев Виталий Демидович, Новик Татьяна Валентиновна, Жабинский Владимир Николаевич (BY)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ" (BY) 014771 Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату кастастерона-(22R,23R,24S)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил-5-холест-6-она- с пероксидазой хрена формулы I который может быть использован в качестве меченого стероида в аналитической тест-системе для иммуноферментного определения 24S-метилбрассиностероидов - кастастерона и брассинолида. Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - менее 10-5-10-9%. В очень малых концентрациях они проявляют свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [2-7]. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее известных в настоящее время является препарат ЭПИН, действующим веществом которого стал фитогормон 24-эпибрассинолид. Особое место среди брассиностероидов занимает брассинолид и его биосинтетический предшественник. Брассинолид был первым выделенным из растительного сырья и охарактеризованным брассиностероидом. До настоящего времени он считается самым активным из описанных соединений этого класса. Все вышеизложенное ставит на повестку дня разработку методов анализа брассиностероидов, которые должны обладать высокой чувствительностью, избирательностью,простотой в исполнении и быть доступными. Одним из наиболее привлекательных является иммуноферментный анализ. Наряду с соответствующими антителами он требует наличия меченого антигена, в качестве которого может выступать стероид, конъюгированный с пероксидазой хрена. В настоящее время известен только один конъюгат брассиностероида с ферментной меткой - конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена, который был использован в иммуноаналитической системе для определения 24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида (24R-метилбрассиностероидов) [8]. Конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена, как и ожидалось, является специфическим реагентом, позволяющим проводить иммуноферментный анализ целевого вещества (только 24Rметилбрассиностероидов). Целью изобретения является ранее неизвестный конъюгат кастастерона и пероксидазы хрена, который может быть использован в качестве меченого стероида в иммуноферментном анализе 24Sметилбрассиностероидов - кастастерона и брассинолида. Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом (I), который получают взаимодействием Nоксисукцинимидного эфира 6-O-карбоксиметилоксима кастастерона, полученного по методу [9], с пероксидазой хрена в водной среде в присутствии гидрокарбоната калия, очисткой на сефадексе и замораживанием раствора в глицерине. Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1. В 1 мл абсолютного диоксана растворяют 8 мг (0,015 ммоль) 6-O-карбоксиметилоксима кастастерона и 1,8 мг (0,016 ммоль) N-оксисукцинимида. Охлаждают до 5 С и при перемешивании добавляют раствор 2,63 мг дициклогексилкарбодиимида в 0,3 мл абсолютного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 С и 15 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают диоксаном, фильтрат упаривают. Выход N-сукцинимидного эфира - 9 мг (90%). Маслообразный продукт. Спектр ЯМР 1 Н , м.д. (CD3OD): 0.71 с (3 Н, 18-Ме), 0.75 с (3 Н, 19-Ме), 0.84-0.95 m (12H, 21-, 26-,27-и 28-Ме), 2.85 с (4H, -C(O)-CH2-CH2 С(О)-), 3.54 м (2 Н, С 5- и С 22-Н), 3.88 м (1H, С 2-Н), 3.94 м (1H, С 23 Н), 4.30 м (1H, С 3-Н), 4.96 с (2 Н, -O-CH2-CO). ИК спектр (пленка): 3440, 2950, 2880, 1755, 1730, 1725,1390, 1215, 1090. К раствору 6 мг пероксидазы хрена в 600 мл дист. воды в присутствии 2-3 капель 0,1 М раствора гидрокарбоната натрия (рН 8,35) добавляют раствор 2 мг (0,003 ммоль) N-сукцинимидного эфира 6-Окарбоксиметилоксима кастастерона, перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Очищают на колонке с сефадексом, элюент - дистиллированная вода. Собирают окрашенную желтокоричневую фракцию (10 мл), разбавляют глицерином (1:1) и хранят в морозильнике (при -18 С). Титр полученного конъюгата определяют как его рабочее разведение, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне-1 014771 2,5-0,2 ОЕ. Типичным в проведенных экспериментах было рабочее разведение 1:150000-1:100000, т.е. специфическая активность конъюгата кастастерон-пероксидаза хрена при таком разведении (титре) позволяет проводить иммуноферментный анализ в диапазоне концентраций анализируемого вещества 0,2100 нмоль/л, как следует из примера 2. Пример 2. В полистирольные лунки планшета с иммобилизованными антителами к кастастерону вносят по 0,05 мл калибровочных проб или анализируемых образцов брассиностероидов в дубликатах. Вносят во все лунки по 0,1 мл фосфатно-буферного раствора конъюгата кастастерон-пероксидаза хрена в глицерине. Планшеты инкубируют в течение 2 ч при 37 С без встряхивания, затем удаляют жидкость из лунок и промывают их 3%-ным раствором NaCl, содержащим 0,02% Tween 20. Во все промытые лунки добавляют по 0,15 мл хромоген-субстратного буфера (раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина в субстратном буфере с перекисью водорода) и инкубируют при 37 С в течение 15 мин. Останавливают реакцию добавлением во все лунки по 0,05 мл раствора стоп-реагента (4,8% раствор H2SO4). He позже чем через 30 мин проводят измерение оптической плотности на ИФА-ридере при длине волны 450 нм. Результаты анализа рассчитывают методом интерполяции по калибровочной кривой. Тест-система с использованием конъюгата кастастерон-пероксидаза в качестве меченого антигена обладает чувствительностью, достаточной для обнаружения кастастерона и брассинолида в концентрации 0,2-0,3 нмоль/л или 5-7 пг БС в 50 мкл образца. Таким образом, заявляемый конъюгат кастастерона с пероксидазой хрена получается с высоким выходом, обладает стабильностью, имеет необходимую иммунореактивность и позволяет проводить количественное определение 24S-брассиностероидов (брассинолида и кастастерона) методом иммуноферментного анализа. Литература 1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. Минск: Навука i тэхнiка, 1993,288 с. 2. Патент РБ 2806. Средство для снижения накопления радионуклидов растениями и способ его применения. Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Деева В.П., Веденеев А.Н. Оф. Бюл. Белгос-пат. 2000. N2 (26). с. 159. 3. Патент РБ 3488.1996. Способ повышения питательной ценности картофеля. Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Вакуленко В.В. Оф. Бюл. Белгос-пат. 2000. N3 (27). с.74. 4. Патент РБ 3400. Способ защиты картофеля от фитофтороза. Хрипач В.А., Жабинский В.Н.,Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Кильчевский А.В.,Титова С.Н. Оф. Бюл. Бел-гос-пат. 2000. N2 (25). с.75. 5. Патент РБ 5168. Способ защиты ячменя от листовых болезней. Хрипач В.А., Литвиновская Р.П.,Жабинский В.Н., Завадская М.И., Волынец А.П., Прохорчик Р.А., Пшеничная Л.А., Манжелесова Н.Е.,Морозик Г.В. Оф. Бюл. НЦИС РБ. 2003. 2 (37). с.95. 6. Патент РБ 5212. Способ повышения урожайности льна и улучшения качества льноволокна. Воскресенская Л.Г., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П. Оф. Бюл. НЦИС РБ. 2003. 2 (37). С.93. 7. Патент РБ N5698. Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля. Бобрик А.О., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П. Оф. Бюл. НЦИС РБ. 2003. 4 (39). с.88. 8. V.A. Khripach, O.V. Sviridov, R.P. Litvinovskaya, A.G. Pryadko, S.V. Drach, V.N. Zhabinskii. Analysis of Brassinosteroids. Polish J. Chem. 2006. v.80. p. 651-654. 9. Yokota Т., Wanabe S., Ogino Y., Yamaguchi I., Takahashi N. Radioimmunoassay for brassinosteroidsGrowth Regul. 1990.Vol. 9.-P. 151. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Конъюгат кастастерона с пероксидазой хрена формулы где ПХ - пероксидаза хрена, в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 24Sметилбрассиностероидов. Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2