Конъюгат 28-норбрассинолида с бычьим сывороточным альбумином в качестве иммуногена

КОНЪЮГАТ 28-НОРБРАССИНОЛИДА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОГЕНА Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 28-норбрассинолида с бычьим сывороточным альбумином, который может быть использован в качестве иммуногена для получения антител, специфичных к 7-окса 6-оксобрассиностероидам. Целью изобретения является конъюгат 28-норбрассинолида и бычьего сывороточного альбумина, позволяющий получить высокоспецифические антитела к 7-окса-6 оксобрассиностероидам. Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом 28 норбрассинолида и бычьего сывороточного альбумина, который получают взаимодействием Nоксисукцинимидного эфира (22R,23R)-2,3,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-В-гомо-7 окса-5-холестан-6-она (гаптена) с бычьим сывороточным альбумином в диоксановом растворе(рН 8,5), очисткой путем диализа и лиофилизацией конъюгата. Хрипач Владимир Александрович, Жабинский Владимир Николаевич, Антончик Алексей Владимирович, Литвиновская Раиса Павловна, Драч Светлана Васильевна, Свиридов Олег Васильевич, Прядко Андрей Георгиевич, Новик Татьяна Валентиновна, Матвеенцев Виталий Демидович (BY)(71)(73) Заявитель и патентовладелец: ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ" (BY) 015277 Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 28-норбрассинолида с бычьим сывороточным альбумином формулы 1 где БСА - бычий сывороточный альбумин, который может быть использован в качестве иммуногена для получения антител, специфичных к 7-окса-6-оксобрассиностероидам. Брассиностероиды (БС) - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений [1, 2]. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - менее 10-5%. В очень малых концентрациях они проявляют и свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням [3-8]. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее известных в настоящее время является препарат эпин, действующим веществом которого стал фитогормон 24-эпибрассинолид. Наибольшую активность проявляют брассиностероиды, имеющие в своей структуре 7-окса-6-оксогруппировку (так называемые брассиностероидные лактоны) [1]. Низкое содержание БС в природных объектах и исчезающе малые дозы, вызывающие их эффект, делают необходимым разработку методов анализа брассиностероидов, в частности брассиностероидных лактонов. Все вышеизложенное ставит на повестку дня разработку методов анализа брассиностероидов, которые должны обладать высокой чувствительностью, избирательностью, простотой в исполнении и быть доступными. Развитие в последнее время методов, основанных на использовании антител, в частности иммуноферментного анализа, требует наличия иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они должны быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками (через соответствующие гаптены). Известен конъюгат брассинолида с БСА формулы в котором связь брассиностероида с белком осуществляется через 3-гидроксигруппу [9]. К недостаткам данного конъюгата следует отнести, прежде всего, связывание 3-гидроксигруппы, которая относится к группам, ответственным за биологическую активность брассиностероидов, что может сказаться отрицательно на специфичности вырабатываемых животными антител. Известны также конъюгаты БСА с кастастероном (формула 3) и 24-эпикастастероном (формула 4) которые предложены авторами для радиоиммуноанализа брассиностероидов [10] и иммуноферментного анализа 24R-метилбрассиностероидов [11, 12]. Конъюгат 3 был получен на основе 24S-метилбрассиностероида - кастастерона, но не позволил получить антитела, специфичные даже к этой группе брассиностероидов. Использование конъюгата 4 позволило получить высокоспецифичные антитела только к группе 24R-метилбрассиностероидов, которые, однако, оказались нечувствительными к различиям в строении цикла В стероидной молекулы. В научной и патентной литературе отсутствуют упоминания о конъюгатах брассиностероидов, ко-1 015277 торые были получены и могли бы быть использованы для получения антител, специфичных к 7-окса-6 оксобрассиностероидам (брассинолиду, 24-эпибрассинолиду, 28-гомобрассинолиду, 28-норбрассинолиду). Целью изобретения является конъюгат 28-норбрассинолида и бычьего сывороточного альбумина,позволяющий получить высокоспецифические антитела к 7-окса-6-оксобрассиностероидам. Поставленная цель достигается заявляемым соединением 1, которое получают взаимодействием Nоксисукцинимидного эфира (22R,23R)-2,3,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-В-гомо-7-окса-5 холестан-6-она (гаптена) с бычьим сывороточным альбумином в диоксановом растворе (рН 8,5), очисткой путем диализа и лиофилизацией конъюгата. Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1. Растворяют 30 мг (55,7 ммоль) (22R,23R)-2,3,22,23-тетрагидрокси-26-(гемисукцинат)-В-гомо-7 окса-5-холестан-6-она (1) в 6 мл абс. диоксана, добавляют 8 мг сухого N-оксисукцинимида (69,6 ммоль) и прикапывают при t = 8-10 С 13 мг (63,1 ммоль) дициклогексил карбодиимида в 4 мл абс. диоксана. Перемешивают 0,5 ч при t=10 С и 6 ч при комнатной температуре. Контролируют ход реакции методом ТСХ в системе этилацетат:метанол=9:1 (Rt - (1)=0,05; Rf - (конъюгата)=0,67). Выпавшую в осадок дициклогексилмочевину отфильтровывают и раствор диоксана добавляют к раствору БСА в 0,1 М NaHCO3, pH 8,35, содержащему 60 мг белка в 10 мл буфера. Выдерживают 20 ч при комнатной температуре и избыток активированного эфира и диоксан удаляют диализом против 0,005 М раствора NaCl. Полученный конъюгат (1-БСА) лиофилизуют и хранят в замороженном виде при -18 С. Полученный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 7-окса-6 оксобрассиностероидам, что подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 2. Группу из шести кроликов иммунизируют конъюгатом 28-норбрассинолид-БСА с плотностью посадки 25 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят подкожно в 10-15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл фосфатно-буферного раствора поваренной соли (рН 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляли 4 недели. Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие связывающей способности в отношении 24-норбрассинолида и определяют их титры и значения констант ассоциации (Ка). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5-0,2 ОЕ. Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных конъюгатом 28-норбрассинолида с БСА Таким образом, определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало,что ее разбавление в 1000000 (А 1) или 1200000 (А 2) раз позволяет обеспечить хорошие условия определения 28-норбрассинолида. Специфичность. Определялась как перекрестная реакция антител, полученных к 28 нобрассинолиду, с другими брассиностероидами и стероидами различных классов. Результаты приведены на схеме (в скобках - связывание по отношению к 28-норбрассинолиду, %). Из схемы видно, что полученные антитела позволяют определять 7-окса-6-оксобрассиностероиды(брассиностероидные лактоны 5-11) с высокой степенью специфичности. Заявляемый конъюгат получается с высоким выходом, стабильностью, высокой степенью посадки гаптена на белок, обеспечивает необходимую иммуногенность и позволяет получать антитела, специфичные к 7-окса-6-оксобрассиностероидам. Литература 1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. Минск. Навука i тэхнiка, 1993,288 с. 2. Khripach V.A., Zhabinskii V.N., de Groot Ae. Brassinosteroids - A New Class of Plant Hormones. SanDiego: Acad. Press. 1999, 456 p. 3. Патент РБ 2806 от 23.11.1995. Средство для снижения накопления радионуклидов растениями и способ его применения./Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Деева В.П.,Веденеев А.Н.//Оф. Бюл. Белгоспат., 2000,2 (26), с. 159. 4. Патент РБ 3488 от 4.07.1996. Способ повышения питательной ценности картофеля./Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И. (Беларусь), Ва-3 015277 куленко В.В. (Россия).//Оф. Бюл. Белгоспат., 2000,3 (27), с. 74. 5. Патент РБ 3400 от 4.07.1996. Способ защиты картофеля от фитофтороза./Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Литвиновская Р.П., Завадская М.И., Савельева Е.А., Карась И.И., Кильчевский А.В., Титова С.Н.//Оф. Бюл. Белгоспат., 2000,2(25), с. 75. 6. Патент РБ 5168. Хрипач В.А., Литвиновская Р.П., Жабинский В.П., Завадская М.И., Волынец А.П., Прохорчик Р.А., Пшеничная Л.А., Манжелесова Н.Е., Морозик Г.В.//Оф. Бюл. НЦИС РБ, 2003 2(37). с. 95. 7. Патент РБ 5212. Способ повышения урожайности льна и улучшения качества льноволокна./Воскресенская Л.Г., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.//Оф. Бюл. НЦИС РБ, 2003 2(37), с. 93. 8. Патент РБ 5698. Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля./Бобрик А.О., Хрипач В.А., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Литвиновская Р.П.//Оф. Бюл. НЦИС РБ, 2003 4(39). 9. Carl D. Schlagnhaufer, Richard N. Arteca and Allen T. Phillips. Monoclonal antibodies against brassinosteriod a new plant growth regulating compound. Plant Physiol. (Suppl.) - 1988. - Vol. 86. - P. 113. 10. Yokota Т., Wanabe S., Ogino Y., Yamaguchi I., Takahashi N. // J Plant Growth Regul. - 1990. - Vol. 9.P.151. 11. Патент РБ 9770 (C2 С 07J 41/00). Конъюгат 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином в качестве иммуногена. Хрипач В.А., Свиридов О.В., Литвиновская Р.П., Прядко А.Г., Драч СВ., Матвеенцев В.Д., Демченко Н.И.//Оф. Бюл. изобрет. НЦИС, 2007,5, с. 95. 12. Хрипач В.А., Свиридов О.В., Прядко А.Г., Литвиновская Р.П., Драч С.В., Матвеенцев В.Д., Новик Т.В., Михайлопуло К.И., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Аверькова М.А., Драченова О.А., Чащина Н.М. Иммуноферментный анализ (24R)-брассиностероидов.//Биоорг. Химия. - 2007 - Т. 33,3, с.371378. 13. Антончик А.В., Жабинский В.Н., Хрипач В.А. II Международная конференция Химия, структура и функция биомолекул, Минск, 2006, PR6. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Конъюгат 28-норбрассинолида с бычьим сывороточным альбумином формулы