Гены токсинов и способы их применения

Медведев В.Н. (RU) Предлагаются композиции и способы придания пестицидной активности бактериям, растениям,клеткам, тканям и семенам растений. Предлагаются композиции, содержащие кодирующую последовательность для полипептида дельта-эндотоксина. Кодирующие последовательности могут быть использованы в ДНК-конструкциях или экспрессирующих кассетах для трансформации и экспрессии в растениях и бактериях. Композиции также содержат трансформированные бактерии, растения, клетки, ткани и семена растений. В частности,предлагаются выделенные молекулы нуклеиновых кислот дельта-эндотоксинов. Кроме того,изобретение охватывает аминокислотные последовательности,соответствующие полинуклеотидам, и антитела, специфически связывающиеся с этими аминокислотными последовательностями. В частности, настоящее изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 61-121 и 133-141, или нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1-60, 124-132 и 142-283, а также их варианты и фрагменты. Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Описаны новые гены, которые кодируют пестицидные белки. Эти белки и последовательности нуклеиновых кислот, которые их кодируют, можно использовать для получения пестицидных составов и для получения трансгенных растений, устойчивых к вредителям. Уровень техникиBacillus thuringiensis представляет собой грамположительную спорообразующую почвенную бактерию, отличающуюся своей способностью продуцировать кристаллические включения, которые особенно токсичны для некоторых отрядов и видов насекомых, но безвредны для растений и других, не являющихся мишенью организмов. По этой причине композиции, включающие штаммы Bacillus thuringiensis или их инсектицидные белки, могут быть использованы в качестве приемлемых с экологической точки зрения инсектицидов для контроля насекомых-вредителей сельскохозяйственных культур или насекомых-переносчиков большого числа заболеваний человека или животных. Кристаллические (Cry) белки (-эндотоксины) бактерии Bacillus thuringiensis обладают выраженной инсектицидной активностью преимущественно в отношении личинок бабочек, двукрылых насекомых и жуков. Также было показано, что эти белки активны против отрядов вредителей Hymenoptera,Homoptera, Phthiraptera, Mallophaga и Acari, а также других отрядов беспозвоночных, таких как Nemathelminthes, Platyhelminthes и Sarcomastigorphora (Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree. В руководстве Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.) эти белки первоначально классифицировали как CryI-CryV, на основании главным образом их инсектицидной активности. Основными классами являлись Lepidoptera-специфичные (I), Lepidoptera- и Diptera-специфичные (II), Coleoptera-специфичные (III), Diptera-специфичные (IV) и специфичные к нематодам (V) и (VI). Белки дополнительно классифицировали на подсемейства; более близкородственным белкам в каждом семействе присваивали буквы разделов, такие как CryIA, CryIB, CryIC и т.д. Еще более близкородственным белкам в каждом разделе давали названия, такие как CryIC1, CryIC2 и т.п. Недавно для генов Cry была предложена новая номенклатура на основании гомологии аминокислотной последовательности вместо специфичности к насекомым-мишеням (Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813). В новой классификации каждый токсин имеет уникальное обозначение,включающее основной таксономический уровень (арабская цифра), вторичный таксономический уровень(заглавная буква), третичный таксономический уровень (строчная буква) и четвертичный таксономический уровень (другая арабская цифра). В новой классификации в основном таксономическом уровне римские цифры заменили арабскими цифрами. Белки, последовательность которых гомологична менее чем на 45%, имеют разные основные таксономические уровни, а критерии для вторичных и третичных таксономических уровней составляют 78 и 95% соответственно. Кристаллический белок не проявляет инсектицидной активности до тех пор, пока он не будет поглощен насекомыми и солюбилизирован в его средней кишке. В пищеварительном тракте насекомого протоксин гидролизуется протеазами до активной токсичной молекулы (Hfte и Whiteley (1989) Microbiol. Rev. 53:242-255). Этот токсин связывается с рецепторами на апикальной поверхности щеточной каемки средней кишки мишеневых личинок и встраивается в апикальную мембрану, образуя ионные каналы или поры, приводящие к гибели личинки.-Эндотоксины, как правило, имеют пять доменов с консервативными последовательностями и три консервативных структурных домена (см., например, статью de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи -спиралей и участвует во встраивании в мембрану и образование пор. Домен II состоит из трех -складчатых слоев, расположенных в конфигурации "греческий ключ", и домен III состоит из двух антипараллельных -складчатых слоев в расположении "рулет с вареньем" (de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III участвуют в распознавании и связывании рецептора и поэтому имеют детерминанты специфичности к токсину. Интенсивное применение инсектицидов на основе В. thuringiensis уже привело к достижению устойчивости в популяциях на полях капустной моли Plutella xylostella (Ferr и Van Rie (2002) Annu. Rev.Entomol. 47:501-533). Самым распространенным механизмом устойчивости является снижение связывания токсина со своим(и) специфическим(и) рецептором(ами) средней кишки. Это к тому же может приводить к перекрестной резистентности с другими токсинами, которые также используют этот рецептор(Ferr и Van Rie (2002. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к композициям и способам придания устойчивости бактериям,растениям, клеткам, тканям и семенам растений к вредителям. Композиции включают молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие последовательности полипептидов -эндотоксинов, векторы, содержащие эти молекулы нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, содержащие векторы. Композиции также включают полипептидные последовательности эндотоксина и антитела против этих полипептидов. Нуклеотидные последовательности могут быть использованы в ДНК-конструкциях или экспрессионных кассетах для трансформации и экспрессии в организмах, в том числе микроорганизмах и растениях. Нуклеотид-1 020327 ные или аминокислотные последовательности могут быть синтетическими последовательностями, которые были получены для экспрессии в организме, в том числе, но ими не ограничиваясь, в микроорганизме или растении. Композиции также содержат трансформированные бактерии, растения, клетки, ткани и семена растений. В частности, изобретение относится к выделенным молекулам нуклеиновых кислот, соответствующим последовательностям нуклеиновых кислот -эндотоксинов. Кроме того, изобретение относится к аминокислотным последовательностям, соответствующим этим полинуклеотидам. В частности, настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61-121 и 133-141 или нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1-60 и 124-132, а также их варианты и фрагменты. Изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые комплементарны нуклеотидной последовательности по изобретению или которые гибридизуются с последовательностью по изобретению. Композиции и способы по изобретению можно использовать для получения организмов, обладающих устойчивостью к пестицидам, конкретно бактерий и растений. Эти организмы и композиции, полученные из них, предпочтительны для целей сельского хозяйства. Композиции по изобретению также можно использовать для получения измененных или улучшенных белков -эндотоксинов, которые обладают пестицидной активностью, или для определения наличия белков или нуклеиновых кислот эндотоксинов в продуктах или организмах. Подробное описание Настоящее изобретение относится к композициям и способам регуляции устойчивости к вредителям у организмов, конкретно растений или растительных клеток. Способы включают трансформацию организмов нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок -эндотоксин по изобретению. В частности, нуклеотидные последовательности по изобретению можно использовать для получения растений и микроорганизмов, которые обладают пестицидной активностью. Таким образом, настоящее изобретение относится к трансформированным бактериям, растениям, клеткам растений, тканям и семенам растений. Композиции представляют собой нуклеиновые кислоты и белки -эндотоксинов бактерии Bacillus thuringiensis. Последовательности можно использовать для конструирования векторов экспрессии для последующей трансформации в интересующие организмы в качестве зондов для выделения других генов -эндотоксинов и для получения измененных пестицидных белков способами, известными в данной области, например обмен доменами или перетасовка ДНК. Белки можно использовать для контроля или уничтожения популяций бабочек, жуков и нематод-вредителей и для получения композиций с пестицидной активностью. Под " -эндотоксином" понимают токсин бактерии Bacillus thuringiensis, который обладает токсичностью в отношении одного или нескольких вредителей, включая, но ими не ограничиваясь, члены отрядов Lepidoptera, Diptera и Coleoptera, или представители типа Nematoda, или белок, который гомологичен такому белку. В некоторых случаях белки -эндотоксины были выделены из других организмов, в том числе из Clostridium bifermentans и Paenibacillus popilliae. Белки -эндотоксины включают аминокислотные последовательности, полученные из полноразмерных нуклеотидных последовательностей, описанных в настоящем документе, и аминокислотные последовательности, которые короче полноразмерных последовательностей либо вследствие использования альтернативного сайта начала транскрипции, либо вследствие процессинга, при котором продуцируется более короткий белок, обладающий пестицидной активностью. Процессинг может происходить в организме, в котором белок экспрессируется, или у вредителя после попадания белка в организм. К -эндотоксинам относятся белки, обозначаемые как cry1-cry43, cyt1 и cyt2, и Cyt-подобный токсин. На сегодняшний день существует более 250 известных видов -эндотоксинов с широким диапазоном специфичностей и токсичностей. Для расширенного перечня см. статью Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813, и регулярные обновления доступны на сайте Crickmore et al. (2003)"Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/bt/index. В настоящем документе представлены новые выделенные нуклеотидные последовательности, которые придают пестицидную активность. Также в документе описаны аминокислотные последовательности белков -эндотоксинов. Белок, полученный после трансляции этого гена, дает возможность клеткам контролировать или уничтожать вредителей при попадании этого белка в организм. Выделенные молекулы нуклеиновых кислот и их варианты и фрагменты Один из аспектов изобретения относится к выделенным или рекомбинантным молекулам нуклеиновых кислот, содержащим нуклеотидные последовательности, кодирующие белки и полипептиды эндотоксины или их биологически активные участки, а также к молекулам нуклеиновых кислот, достаточным для применения в качестве гибридизационных зондов для идентификации нуклеиновых кислот,кодирующих -эндотоксины. Под используемым в настоящем документе термином "молекула нуклеиновой кислоты" понимают молекулы ДНК (например, рекомбинантную ДНК, кДНК или геномную ДНК) и молекулы РНК (например, мРНК) и аналоги ДНК или РНК, полученные с использованием аналогов нук-2 020327 леотидов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК."Выделенная" или "очищенная" молекула нуклеиновой кислоты, или белок, или их биологически активный участок, по существу, свободны от другого клеточного материала или культуральной среды при получении методами рекомбинантных ДНК, или, по существу, свободны от химических предшественников или других химических веществ при химическом синтезе. Предпочтительно "выделенная" нуклеиновая кислота свободна от последовательностей (предпочтительно последовательностей, кодирующих белок), которые в природных условиях фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательностей, расположенных на 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, из которого получена нуклеиновая кислота. Для целей изобретения "выделенная" в случае использования в отношении молекул нуклеиновых кислот исключает выделенные хромосомы. Например, в большом числе вариантов осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая -эндотоксин, может содержать менее чем около 5, 4, 3, 2, 1, 0,5 или 0,1 т.п.н. нуклеотидных последовательностей, которые в природных условиях фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой нуклеиновая кислота получена. К белку -эндотоксину, который, по существу, свободен от клеточного материала, относятся препараты белка, имеющие меньше чем около 30, 20, 10 или 5% (сухой массы) белка, отличающегося от -эндотоксина (также обозначаемого в настоящем документе как "контаминантный белок"). К нуклеотидным последовательностям, кодирующим белки по настоящему изобретению, относятся последовательность SEQ ID NO: 1-60 и 124-132, а также ее варианты, фрагменты и комплементарные последовательности. Под "комплементарной последовательностью" понимают нуклеотидную последовательность, которая в достаточной степени комплементарна заданной нуклеотидной последовательности,так что она может гибридизоваться с ней, образуя стабильный дуплекс. Аминокислотная последовательность белка -эндотоксина, кодируемого нуклеотидной последовательностью, соответствует последовательностям SEQ ID NO: 61-121 и 133-141. Молекулы нуклеиновых кислот, которые представляют собой фрагменты нуклеотидных последовательностей, кодирующих -эндотоксин, входят в состав настоящего изобретения. Под "фрагментом" понимают участок нуклеотидной последовательности, кодирующей белок -эндотоксин. Фрагмент нуклеотидной последовательности может кодировать биологически активный участок белка -эндотоксина, или он может представлять собой фрагмент, который может быть использован в качестве зонда для гибридизации или ПЦР-праймера, используя способы, описанные ниже. Молекулы нуклеиновых кислот, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности -эндотоксина, содержат по меньшей мере около 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350,1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 2000, 2050, 2100, 2150, 2200, 2250,2300, 2350, 2400, 2450, 2500, 2550, 2600, 2650, 2700, 2750, 2800, 2850, 2900, 2950, 3000, 3050, 3100, 3150,3200, 3250, 3300, 3350 последовательных нуклеотидов или вплоть до количества нуклеотидов, присутствующего в полноразмерной нуклеотидной последовательности, кодирующей -эндотоксин, описанной в настоящем документе, в зависимости от заданной цели. Под "последовательными" нуклеотидами понимают нуклеотидные остатки, которые непосредственно соседствуют друг с другом. Фрагменты нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению кодируют белковые фрагменты, которые сохраняют биологическую активность белка -эндотоксина и, следовательно, сохраняют пестицидную активность. Под "сохраняют активность" понимают, по меньшей мере, активность приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 70, 80, 90, 95% или выше белка эндотоксина у фрагмента. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, статьи Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988)Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США 5743477, все они приводятся в настоящем документе в качестве ссылок в полном объеме. Фрагмент кодирующей нуклеотидной последовательности -эндотоксина, который кодирует биологически активный участок белка по изобретению, должен кодировать по меньшей мере около 15, 25, 30,50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000,1050, 1100 последовательных аминокислот или вплоть до общего числа аминокислот, присутствующих в полноразмерном белке -эндотоксине по изобретению. Предпочтительные белки -эндотоксины по настоящему изобретению кодируются нуклеотидной последовательностью с достаточной степенью идентичности нуклеотидной последовательности SEQ IDNO: 1-60 и 124-132. Под "с достаточной степенью идентичности" понимают аминокислотную или нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 60 или 65% идентична последовательности, приблизительно на 70 или 75% идентична последовательности, приблизительно на 80 или 85% идентична последовательности, приблизительно на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или выше идентична последовательности по сравнению с эталонной последовательностью, используя одну из программ выравнивания, описанных в настоящем документе, используя стандартные параметры. Специалисту в данной области будет понятно, что эти величины могут быть подходящим образом подогна-3 020327 ны для определения соответствующей идентичности белков, кодируемых двумя нуклеотидными последовательностями, учитывая вырожденность генетического кодона, сходность аминокислот, расположенность рамки считывания и подобное. Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот последовательности выравнивают для оптимального сравнения. Процент идентичности двух последовательностей представляет собой функцию от числа идентичных позиций, которые являются общими для последовательностей (т.е. процент идентичности = число идентичных позиций/общее число позиций (например, перекрывающиеся позиции)100). В одном из вариантов осуществления две последовательности имеют одинаковую длину. В другом варианте осуществления сравнение проводят по всей эталонной последовательности (например, по всей одной из SEQ ID NO: 1-60 и 124-132 или по всей из одной из SEQ ID NO: 61-121 и 133-141). Процент идентичности двух последовательностей может быть определен, используя методики, аналогичные методикам, описанным ниже, с допущением или без допущения пропусков. При расчете процента идентичности обычно подсчитывают точное соответствие. Определение процента идентичности двух последовательностей можно осуществлять, используя математический алгоритм. Не ограничивающим примером математического алгоритма, использованного для сравнения двух последовательностей, является алгоритм Karlin и Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87:2264, модифицированный в статье Karlin и Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:58735877. Такой алгоритм встроен в программы BLASTN и BLASTX авторов Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Поиски нуклеотидных последовательностей в BLAST могут быть осуществлены с помощью программы BLASTN, баллы = 100, длина слова = 12, для получения нуклеотидных последовательностей,гомологичных молекулам -эндотоксинподобных нуклеиновых кислот по изобретению. Поиски белка в программе BLAST могут быть осуществлены с помощью программы BLASTX, баллы = 50, длина слова = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных молекулам белка -эндотоксина по изобретению. Для получения выравниваний с пропусками для сравнения может быть использована программа Gapped BLAST (в BLAST 2.0), как описано в статье Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Альтернативно, для осуществления итеративного поиска, при котором определяются отдаленные сходства между молекулами, может быть использована программа PSI-Blast. См. статью Altschul etal. (1997) выше. При использовании программ BLAST, Gapped BLAST и PSI-Blast могут быть использованы параметры по умолчанию соответствующих программ (например, BLASTX и BLASTN). Выравнивание также может быть осуществлено сравнением вручную. Другим, не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). Алгоритм ClustalW сравнивает последовательности и полностью выравнивает аминокислотную или ДНК-последовательность и, таким образом, может предоставить данные о консервативности последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности. Алгоритм ClustalW используется в нескольких коммерчески доступных пакетах программного обеспечения для анализа ДНК/аминокислот,таких как модуль ALIGNX пакета программ Vector NTI (продукция фирмы Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). После выравнивания аминокислотных последовательностей с помощью программы ClustalW может быть оценен процент аминокислотной идентичности. Не ограничивающим примером программного обеспечения, используемого для анализа выравниваний с помощью ClustalW, являетсяGENEDOC. Программа GENEDOC (Karl Nicholas) дает возможность оценить сходность аминокислот (или ДНК) и идентичность большего числа белков. Другим, не ограничивающим примером математического алгоритма, используемого для сравнения последовательностей, является алгоритм Myers иMiller (1998) CABIOS 4:11-17. Такой алгоритм встроен в программу ALIGN (версия 2.0), которая является частью пакета программ GCG Wisconsin Genetics, Version 10 (доступного у фирмы Accelrys, Inc., 9685Scranton Rd., San Diego, CA, USA). При использовании программы ALIGN для сравнения аминокислотных последовательностей могут быть использованы таблица весовых остатков РАМ 120, штраф за длину пропуска - 12 и штраф за разрыв - 4. Если не указано другое, для определения идентичности или сходности последовательностей используется программа GAP Version 10, в которой используется алгоритм Needleman и Wunsch (1970) J.Mol. Biol. 48 (3): 443-453, используя следующие параметры: % идентичности и % подобия нуклеотидной последовательности, используя штраф за пропуск 50 и штраф за удлинение 3 и матрицу заменnwsgapdna.cmp; % идентичности или % подобия для аминокислотной последовательности, используя штраф за пропуск 8 и штраф за удлинение 2 и матрицу замен BLOSUM62. Также могут быть использованы эквивалентные программы. Под "эквивалентной программой" понимают любую программу сравнения последовательностей, которая производит выравнивание двух любых рассматриваемых последовательностей, имеющее совпадения идентичных нуклеотидных остатков, и идентичный процент гомологии последовательностей при сопоставлении с соответствующим выравниванием, полученным с помощью программы GAP Version 10. Изобретение также относится к вариантам молекул нуклеиновых кислот. К"вариантам" нуклеотидных последовательностей, кодирующих -эндотоксин, относятся такие последовательности, которые кодируют белки -эндотоксины, описанные в настоящем документе, но которые отличаются вследствие вырожденности генетического кода, а также такие последовательности, которые в достаточной степени идентичны, как описано выше. Природные аллельные варианты могут быть идентифицированы с помощью хорошо известных молекулярно-биологических методик, таких как методы полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизации, описанных ниже. К вариантам нуклеотидных последовательностей также относятся синтетические нуклеотидные последовательности, которые были получены, например, используя сайт-направленный мутагенез, но которые сохраняют способность кодировать белки -эндотоксины, описанные в настоящем изобретении, как описано ниже. Варианты белков,описываемые в настоящем изобретении, биологически активны, то есть они сохраняют желательную биологическую активность нативного белка, то есть пестицидную активность. Под "сохраняют активность" понимают, что вариант обладает по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 70% или по меньшей мере около 80% пестицидной активности нативного белка. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, статьиCzapla и Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 и патент США 5743477, которые приведены в настоящем документе в качестве ссылок в полном объеме. Специалисту в данной области, кроме того, будет понятно, что изменения могут быть введены посредством мутации нуклеотидных последовательностей по изобретению, таким образом, изменяя аминокислотную последовательность кодируемых белков -эндотоксинов без изменения биологической активности белков. Таким образом, варианты выделенных молекул нуклеиновых кислот могут быть получены введением одной или нескольких нуклеотидных замен, добавок или делеций в соответствующую нуклеотидную последовательность, описанную в настоящем документе, так что в кодируемый белок вводятся одна или несколько аминокислотных замен, добавок или делеций. Мутации могут быть введены стандартными методиками, такими как сайт-направленный мутагенез и ПЦР-опосредованный мутагенез. Такие варианты нуклеотидных последовательностей также входят в состав настоящего изобретения. Например, консервативные аминокислотные замены могут быть получены в одном или нескольких прогнозируемых заменимых аминокислотных остатках. "Заменимый" аминокислотный остаток представляет собой остаток, который может быть изменен у последовательности дикого типа белка эндотоксина без изменения биологической активности, в то время как "незаменимый" аминокислотный остаток необходим для биологической активности. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменяется аминокислотным остатком, имеющим сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи,были определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глютамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин,валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), -разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин,фенилаланин, триптофан, гистидин).-Эндотоксины, как правило, имеют пять доменов с консервативными последовательностями и три консервативных структурных домена (См., например, статью de Maagd et al. (2001) Trends Genetics 17:193-199). Первый консервативный структурный домен состоит из семи -спиралей и участвует во встраивании в мембрану и образование пор. Домен II состоит из трех -складчатых слоев, расположенных в конфигурации "греческий ключ", а домен III состоит из двух антипараллельных -складчатых слоев в расположении "рулет с вареньем" (de Maagd et al., 2001, выше). Домены II и III участвуют в распознавании и связывании рецептора и поэтому они имеют детерминанты специфичности для токсина. Аминокислотные замены могут быть осуществлены в неконсервативных областях для сохранения их функций. В целом, такие замены, по всей видимости, не могут быть осуществлены с консервативными аминокислотными остатками или аминокислотными остатками, находящимися в консервативном повторе, когда такие остатки незаменимы для активности белка. Примерами остатков, которые являются консервативными и которые могут быть незаменимыми для активности белка, относятся, например, остатки, которые идентичны среди всех белков, в которых они содержатся, при выравнивании аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению и известных последовательностей эндотоксинов. Примерами остатков, которые являются консервативными, но но для которых можно провести консервативные аминокислотные замены с сохранением активности, относятся, например, остатки,которые имеют лишь консервативные замены между всеми белками, в которых они содержатся, при выравнивании аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению и известных последовательностей -эндотоксинов. Тем не менее, специалисту в данной области будет понятно, что функциональные варианты могут иметь незначительные консервативные или неконсервативные изменения в консервативных остатках. Альтернативно, варианты нуклеотидных последовательностей могут быть получены введением мутаций случайным образом на протяжении всей или части кодирующей последовательности, например, с помощью насыщающего мутагенеза, и полученные мутанты могут быть скринированы на способность придавать активность -эндотоксина для идентифицикации мутантов, которые сохраняют активность. После мутагенеза кодируемый белок может быть экспрессирован с помощью рекомбинантных техник, и активность белка может быть определена, используя стандартные методы анализа. Используя способы, такие как ПЦР, гибридизация и подобное, могут быть идентифицированы соответствующие последовательности -эндотоксинов, причем такие последовательности обладают существенной идентичностью с последовательностями по изобретению. См., например, руководства Sambrook и Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdPress, NY). В способе гибридизации вся или часть нуклеотидной последовательности -эндотоксина может быть использована для скрининга кДНК или геномных библиотек. Способы создания таких кДНК и геномных библиотек хорошо известны в данной области и описаны в руководстве Sambrook and Russell,2001, выше. Так называемые зонды для гибридизации могут представлять собой фрагменты геномной ДНК, фрагменты кДНК, фрагменты РНК или другие олигонуклеотиды и могут быть помечены с помощью детектируемой группы, такой как 32 Р, или любого другого детектируемого маркера, такого как другие радиоизотопы, флуоресцентное соединение, фермент или кофактор фермента. Зонды для гибридизации могут быть получены мечением синтетических олигонуклеотидов, основанных на известной кодирующей -эндотоксин нуклеотидной последовательности, описанной в настоящем документе. Кроме того, могут быть использованы вырожденные праймеры, созданные на основе консервативных нуклеотидов или аминокислотных остатков в нуклеотидной последовательности или кодируемой аминокислотной последовательности. Зонд обычно содержит область нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях по меньшей мере с около 12, по меньшей мере с около 25, по меньшей мере с около 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350 или 400 последовательными нуклеотидами эндотоксинкодирующей нуклеотидной последовательности по изобретению или ее фрагментом или вариантом. Способы получения зондов для гибридизации хорошо известны в данной области и описаны в руководстве Sambrook and Russell, 2001, выше, приведенном в данном документе в качестве ссылки. Например, в качестве зонда, способного специфически гибридизоваться с соответствующими эндотоксинподобными последовательностями и матричными РНК, могут быть использованы полноразмерная последовательность -эндотоксина, описанная в настоящем документе, или один или несколько ее участков. Для достижения специфической гибридизации в различных условиях такие зонды включают последовательности, которые уникальны и предпочтительно составляют по меньшей мере около 10 нуклеотидов в длину или по меньшей мере около 20 нуклеотидов в длину. Такие зонды могут быть использованы для амплификации соответствующих последовательностей -эндотоксина из выбранного организма с помощью ПЦР. Этот метод может быть использован для выделения из желаемого организма дополнительных кодирующих последовательностей или в качестве диагностического анализа для определения наличия в организме кодирующих последовательностей. К техникам гибридизации относится гибридизационный скрининг библиотек ДНК (либо бляшек, либо колоний; См., например, Sambrook et al.Harbor, New York). Гибридизация таких последовательностей может быть осуществлена в жестких условиях. Под "жесткими условиями" или "жесткими условиями гибридизации" понимают условия, при которых зонд будет гибридизоваться со своей мишеневой последовательностью, с регистрируемой более высокой степенью, чем с другими последовательностями (например, по меньшей мере в 2 раза выше фонового значения). Жесткие условия зависят от последовательности и различаются при различных условиях. Регулируя жесткость гибридизации и/или условия промывки, могут быть идентифицированы мишеневые последовательности, которые на 100% комплементарны зонду (гомологичное зондирование). Альтернативно, условия жесткости могут быть доведены до некоторого несоответствия в последовательностях, чтобы регистрировалась меньшая степень подобия (гетерологичное зондирование). Как правило, зонд составляет менее около 1000 нуклеотидов в длину, предпочтительно менее 500 нуклеотидов в длину. Обычно жесткие условия представляют собой такие условия, в которых концентрация соли составляет менее около 1,5 М иона Na, обычно концентрация иона Na (или других солей) от около 0,01 до 1,0 М при величине рН от 7,0 до 8,3, и температура равняется по меньшей мере около 30 С для коротких зондов (например, от 10 до 50 нуклеотидов) и по меньшей мере около 60 С для длинных зондов (например,больше чем 50 нуклеотидов). Жесткие условия также могут быть получены путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Характерные условия низкой жесткости включают гибридизацию с помощью буферного раствора от 30 до 35% формамида, 1 М NaCl, 1% SDS (додецилсульфат натрия) при 37 С и промывку в от 1-кратного до 2-кратного SSC (20-кратный SSC=3,0 М NaCl/0,3 М тринатриевый цитрат) при от 50 до 55 С. Характерные условия умеренной жесткости включают гибридизацию в от 40 до 45% формамиде, 1,0 М NaCl, 1% SDS при 37 С и промывку в от 0,5-кратного до 1-6 020327 кратного SSC при от 55 до 60 С. Характерные условия высокой жесткости включают гибридизацию в 50% формамиде, 1 М NaCl, 1% SDS при 37 С и промывку в 0,1-кратном SSC при от 60 до 65 С. Необязательно промывочные буферы могут содержать от около 0,1 до около 1% SDS. Продолжительность гибридизации составляет, как правило, менее около 24, обычно от около 4 до около 12 ч. Специфичность обычно зависит от пост-гибридизационной промывки, причем критическими факторами являются ионная сила и температура последнего промывочного раствора. Для гибридов ДНКДНК Tm может быть аппроксимирована, исходя из уравнения Meinkoth и Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm=81,5C+16,6 (log M)+0,41 (% GC)-0,61 (% форм)-500/L; где М представляет собой молярность моновалентных катионов, % GC представляет собой процент гуанозиновых и цитозиновых нуклеотидов в ДНК, % форм представляет собой процент формамида в растворе для гибридизации, и L представляет собой длину гибрида в парах оснований. Tm представляет собой температуру (при определенных ионной силе и величине рН), при которой 50% комплементарной мишеневой последовательности гибридизуется с полностью совместимым зондом. Tm снижается на около 1 С для каждого 1% несовместимости; таким образом, Tm, условия гибридизации и/или промывки могут быть доведены, чтобы гибридизоваться с последовательностями желаемой идентичности. Например, если желательно, последовательность с идентичностью 90% Tm может быть снижена на 10 С. Как правило, жесткие условия выбирают так, чтобы температура оказалась на около 5 С ниже, чем температура точки плавления (Tm) для конкретной последовательности и ее комплементарной последовательности при определенной ионной силе и величине рН. Тем не менее, при крайне жестких условиях может использоваться гибридизация и/или промывка при температуре на 1, 2, 3 или 4 С ниже, чем температура точки плавления (Tm); при условиях средней жесткости может использоваться гибридизация и/или промывка при температуре на 6,7, 8, 9 или 10 С ниже, чем температура точки плавления (Tm); при условиях низкой жесткости может использоваться гибридизация и/или промывка при температуре на 11, 12, 13, 14, 15 или 20 С ниже, чем температура точки плавления (Tm). Используя уравнение, композиции для гибридизации и промывки и желаемую величину Tm, специалисту в данной области будет понятно, что, по существу, описаны варианты жесткости растворов для гибридизации и/или промывки. Если желаемая степень несовпадения приводит к Tm меньше чем 45 С (водный раствор) или 32 С (раствор формамида), предпочтительно повысить концентрацию SSC, чтобы можно было использовать более высокую температуру. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот находится в пособиях Tijssen (1993) Laboratory TechniquesManual. (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Выделенные белки и их варианты и фрагменты Настоящее изобретение также охватывает белки -эндотоксины. Под "белком -эндотоксином" понимают белок, с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 61-121 и 133-141. Также можно использовать для осуществления способов по настоящему изобретению его фрагменты, биологически активные участки и варианты. К "фрагментам" или "биологически активным участкам" относятся полипептидные фрагменты, содержащие аминокислотные последовательности, в достаточной степени идентичные аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61-121 и 133-141, и у которых наблюдается пестицидная активность. Биологически активный участок белка -эндотоксина может представлять собой полипептид, то есть например, 10, 25, 50, 100 или более аминокислот в длину. Такие биологически активные участки могут быть получены методами рекомбинантных ДНК и оценены на пестицидную активность. Способы измерения пестицидной активности хорошо известны в данной области. См., например, статьи Czapla and(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293; и патент США 5743477, все они приводятся в настоящем документе в качестве ссылок в полном объеме. Используемый в данном случае фрагмент содержит по меньшей мере 8 непрерывных аминокислот SEQ ID NO: 61-121 и 133-141. Изобретение охватывает другие фрагменты, тем не менее, такие как любой фрагмент в белке больше чем около 10, 20, 30, 50, 100,150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150,1200, 1250 или 1300 аминокислот. Под "вариантами" понимают белки или полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на около 60, 65%, около 70, 75%, около 80, 85%, около 90, 91, 92, 93, 94,95, 96, 97, 98 или 99% идентична любой аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 61-121 и 133141. К вариантам также относятся полипептиды, кодируемые молекулой нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется с молекулой нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 1-60 и 124-132, или ее комплементарной последовательностью в жестких условиях. К вариантам относятся полипептиды, которые отличаются по аминокислотной последовательности по причине мутагенеза. Вариантные белки, охватываемые настоящим изобретением, биологически активны, то есть они сохраняют желаемую биологическую активность нативного белка, а именно пестицидную активность. Способы измерения пестицидной активности хоро-7 020327 шо известны в данной области. См., например, статьи Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:24802485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 и патент США 5743477, все они приводятся в настоящем документе в качестве ссылок в полном объеме. Гены бактерий, такие как гены axmi по настоящему изобретению, довольно часто обладают множественными инициирующими кодонами метионина вблизи начала открытой рамки считывания. Часто инициация трансляции в одном или нескольких из этих стартовых кодонов будет приводить к получению функционального белка. К этим стартовым кодонам могут относиться кодоны ATG. Тем не менее, бактерии, такие как Bacillus sp., также распознают в качестве стартового кодона GTG, и белки, которые транслируются, начиная с кодонов GTG, в первой аминокислоте содержат метионин. Более того, не часто определяется a priori, какой из этих кодонов используется в природных условиях в бактерии. Таким образом, понятно, что применение одного из альтернативных метиониновых кодонов также может приводить к получению белков -эндотоксинов, которые кодируют пестицидную активность. Эти белки эндотоксины охватываются настоящим изобретением и могут быть использованы в способах по настоящему изобретению. Также изобретение относится к антителу против полипептидов по настоящему изобретению или против их вариантов или фрагментов. Способы получения антител хорошо известны в данной областиLaboratory, Cold Spring Harbor, NY; патент США 4196265). Измененные или улучшенные варианты Известно, что ДНК-последовательности -эндотоксина могут быть изменены большим числом способов, и что эти изменения могут приводить к ДНК-последовательностям, кодирующим белки с аминокислотными последовательностями, отличными от кодируемых -эндотоксином по настоящему изобретению. Этот белок может быть изменен большим числом способов, к которым относятся аминокислотные замены, делеции, усечения и вставки одной или нескольких аминокислот SEQ ID NO: 61-121 и 133141, включая до около 2, около 3, около 4, около 5, около 6, около 7, около 8, около 9, около 10, около 15,около 20, около 25, около 30, около 35, около 40, около 45, около 50, около 55, около 60, около 65, около 70, около 75, около 80, около 85, около 90, около 100, около 105, около 110, около 115, около 120, около 125, около 130 или больше аминокислотных замен, делеций или инсерций. Способы осуществления таких вмешательств хорошо известны в данной области. Например, варианты аминокислотной последовательности белка -эндотоксина могут быть получены путем мутаций в ДНК. Это также может быть осуществлено одной из нескольких форм мутагенеза и/или при направленном развитии. В некоторых аспектах изменения, кодируемые в аминокислотной последовательности,будут несущественно влиять на функцию белка. Такие варианты будут обладать желаемой пестицидной активностью. Тем не менее, понятно, что способность -эндотоксина придавать пестицидную активность может быть улучшена за счет применения таких техник к композициям по настоящему изобретению. Например, можно экспрессировать -эндотоксин в клетках-хозяевах, у которых наблюдаются высокие степени ошибки включения основания в процессе репликации ДНК, таких как клетки XL-1 Red (продукция фирмы Stratagene). После размножения в таких штаммах можно выделять ДНК -эндотоксина (например, путем получения плазмидной ДНК или путем амплификации с помощью ПЦР и клонирования полученного ПЦР-фрагмента в вектор), культивировать мутации -эндотоксина в немутагенном штамме и идентифицировать мутантные гены -эндотоксина, обладающие пестицидной активностью, например,осуществляя анализ на тестирование в отношении пестицидной активности. Как правило, белок смешивают и используют в анализах подкормки. См., например, статью Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Такие анализы могут включать приведение в контакт растений с одним или несколькими вредителями и определение способности растения выживать и/или вызывать гибель вредителей. Примеры мутаций, которые приводят к повышенной токсичности, можно найти в статье Schnepf etal. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806. Альтернативно, изменения могут быть осуществлены на последовательности белка большого числа белков на амино- или карбоксиконце, существенно не влияя на активность. Они могут включать вставки,делеции или изменения, вводимые современными молекулярными способами, такими как ПЦР, включая ПЦР-амплификацию, которые изменяют или удлиняют кодирующую белок последовательность за счет включения последовательностей, кодирующих аминокислоты, в олигонуклеотиды, используемые в ПЦРамплификации. Альтернативно, добавленные белковые последовательности могут включать полные белок-кодирующие последовательности, такие как последовательности, широкоиспользуемые в данной области для получения слитых белков. Такие слитые белки часто используют для (1) повышения экспрессии интересующего белка, (2) введения связывающего домена, ферментативной активности или эпитопа для содействия либо очистке белка, детекции белка, либо другим экспериментальным применениям,известным в данной области, (3) адресной секреции или трансляции белка в субклеточные органеллы,такие как периплазматическое пространство грамотрицательных бактерий или эндоплазматическая сеть эукариотических клеток, последняя из которых часто приводит к гликозилированию белка. Варианты нуклеотидных и аминокислотных последовательностей по настоящему изобретению также охватывают последовательности, полученные исходя из мутагенных и рекомбиногенных процедур, таких как перетасовка ДНК. С помощью такой процедуры один или несколько различных регионов,кодирующих белок -эндотоксин, могут быть использованы для создания нового белка -эндотоксина,обладающего желаемыми свойствами. Таким образом, библиотеки рекомбинантных полинуклеотидов получают из популяции полинуклеотидов с родственными последовательностями, содержащих области последовательности, которые имеют значительную идентичность последовательности и могут быть гомологично рекомбинированы in vitro или in vivo. Например, используя этот подход, мотивы последовательности, кодирующие интересующий домен, могут быть перетасованы между геном -эндотоксина по изобретению и другими известными генами -эндотоксинов для получения нового гена, кодирующего белок с улучшенным интересующим свойством, таким как повышенная инсектицидная активность. Методики такой перетасовки ДНК известны в данной области. См., например, статьи Stemmer (1994) Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; и патенты США 5605793 и 5837458. Обмен или перетасовка доменов представляет собой другой механизм получения измененных белков -эндотоксинов. Домены II и III можно обменять между белками -эндотоксинами, получая гибридные или химерные токсины с улучшенной пестицидной активностью или спектром мишеней. Способы получения рекомбинантных белков и тестирования их в отношении пестицидной активности хорошо известны в данной области (см., например, статьи Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:53285330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990; J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ.Microbiol. 65:2918-2925). Векторы. Последовательность -эндотоксина по изобретению может быть получена в кассете экспрессии для экспрессии в интересующем растении. Под "растительной кассетой экспрессии" понимают ДНКконструкцию, которая способна приводить к экспрессии белка в растительной клетке, начиная с открытой рамки считывания. Обычно они содержат промотор и кодирующую последовательность. Часто такие конструкции также будут содержать 3'-нетранслируемый регион. Такие конструкции могут содержать"сигнальную последовательность" или "лидерную последовательность" для облегчения котрансляционного или посттрансляционного транспорта пептида в некоторые внутриклеточные структуры, такие как хлоропласт (или другая пластида), эндоплазматическая сеть или комплекс Гольджи. Под "сигнальной последовательностью" понимают последовательность, которая, как известно или предполагается, обеспечивает котрансляционный или посттрансляционный транспорт пептида через клеточную мембрану. В эукариотах это обычно включает секрецию в комплекс Гольджи с некоторым гликозилированием в результате. Под "лидерной последовательностью" понимают любую последовательность, которая при трансляции приводит к получению аминокислотной последовательности, достаточной для запуска котрансляционного транспорта пептидной цепи в субклеточную органеллу. Таким образом,указанное выше включает транспорт, направленный лидерными последовательностями, и/или гликозилирование за счет переноса в эндоплазматическую сеть, переноса в вакуоли, пластиды, включая хлоропласты, митохондрии и подобное. Под "вектором для трансформации растений" понимают молекулу ДНК, которая необходима для эффективной трансформации растительной клетки. Такая молекула может состоять из одной или нескольких растительных экспрессирующих кассет и может быть организована в более чем одну "векторную" молекулу ДНК. Например, бинарные векторы представляют собой векторы для трансформации растений, в которых используются два не смежных ДНК-вектора для кодирования всех необходимых цис- и трансдействующих функций для трансформации растительных клеток (Hellens and Mullineaux(2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Под "вектором" понимают конструкцию из нуклеиновой кислоты, предназначенную для переноса между различными клетками-хозяевами. Под "экспрессирующим вектором" понимают вектор, который обладает способностью встраиваться, интегрировать и экспрессировать гетерологичные последовательности или фрагменты ДНК в чужеродную клетку. Кассета должна содержать 5'- и 3'-регуляторные последовательности, функционально связанные с последовательностью по изобретению. Под "функционально связанными" понимают функциональную связь между промотором и второй последовательностью, где последовательность промотора инициирует и опосредует транскрипцию последовательности ДНК соответствующей второй последовательности. Как правило, "функционально связанные" означает, что связанные последовательности нуклеиновых кислот непрерывны и при необходимости соединения двух белоккодирующих регионов непрерывны и находятся в одной и той же рамке считывания. Кассета может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген для котрансформации в организм. Альтернативно, дополнительный(е) ген(ы) может(гут) быть предложен(ы) в большом числе экспрессирующих кассет. Под "промотором" понимают последовательность нуклеиновой кислоты, которая функционирует,-9 020327 чтобы контролировать транскрипцию ниже расположенной кодирующей последовательности. Промотор наряду с другими последовательностями нуклеиновой кислоты, регулирующими транскрипцию и трансляцию (также обозначаемыми "контрольными последовательностями"), необходимы для экспрессии интересующей последовательности ДНК. Такая экспрессионная кассета снабжена большим числом сайтов рестрикции для встраивания последовательности -эндотоксина под регуляцией транскрипции регуляторными областями. Экспрессионная кассета должна включать в 5'-3' направлении транскрипции область инициации транскрипции и трансляции (т.е. промотор), последовательность ДНК по изобретению и область терминации транскрипции и трансляции (т.е. область терминации), функционирующий у растений. Промотор может быть нативным, или аналогичным, или чужеродным, или гетерологичным для растения-хозяина и/или для последовательности ДНК по изобретению. Кроме того, промотор может представлять собой природную последовательность или, альтернативно, синтетическую последовательность. Если промотор является "нативным" или "гомологичным" для растения-хозяина, то предполагается, что промотор существует в нативном растении, в которое промотор встраивают. Если промотор "чужероден" или "гетерологичен" последовательности ДНК по изобретению, предполагается, что промотор не является нативным или природным промотором для функционально связанной ДНК-последовательности по изобретению. Область терминации может быть нативной по отношению к области инициации транскрипции, может быть нативной по отношению к функционально связанной интересующей последовательности ДНК,может быть нативным по отношению к растению-хозяину или может быть получен из другого источника(т.е. быть чужеродным или гетерологичным для промотора, интересующей последовательности ДНК,растения-хозяина или любого их сочетания). Принятые области терминации доступны из Ti-плазмиды бактерии A. tumefaciens, такие как области терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также статьи Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell. 64:671-674; Sanfacon etal. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant. Cell. 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; and Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639. При необходимости ген(ы) может(гут) быть оптимизирован(ы) для повышенния экспрессии в трансформированной клетке-хозяине. То есть гены могут быть синтезированы для улучшенной экспрессии, используя предпочтительные для клетки-хозяина кодоны, или могут быть синтезированы, используя кодоны с периодичностью употребления кодона, предпочтительной для хозяина. Как правило, GCсодержание гена будет повышенным. Для рассмотрения употребления предпочтительного для хозяина кодона см., например, статью Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11. В данной области доступны способы синтеза генов, предпочтительных для растения. См., например, патенты США 5380831 и 5436391 и статью Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, приведенные в настоящем документе в качестве ссылки. В одном из вариантов осуществления -эндотоксин для экспрессии нацеливают на хлоропласт. Таким образом, если -эндотоксин не вводят непосредственно в хлоропласт, экспрессионная кассета будет дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую транзитный пептид для направления эндотоксина в хлоропласты. Такие транзитные пептиды известны в данной области. См., например, статьи Von Heijne et al. (1991) Plant. Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:1754417550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant. Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res.Commun. 196:1414-1421; and Shah et al. (1986) Science 233:478-481. Ген -эндотоксина для нацеливания на хлоропласт может быть оптимизирован для экспрессии в хлоропласте с учетом различия в использовании кодона между ядром растения и этой органеллой. Таким образом, интересующие нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы, используя кодоны, предпочтительные для хлоропласта. См., например, патент США 5380831, приведенный в настоящем документе в качестве ссылки. Трансформация растения Способы по изобретению включают введение нуклеотидной конструкции в растение. Под "введением" понимают наличие в растении нуклеотидной конструкции такой, чтобы конструкция проникла во внутреннее пространство клетки растения. Способы по изобретению не требуют, чтобы использовался определенный способ введения нуклеотидной конструкции в растение, за исключением того, чтобы нуклеотидная конструкция проникала во внутреннее пространство по меньшей мере одной клетки растения. Способы введения нуклеотидных конструкций в растения известны в данной области, к ним относятся,но ими не ограничиваясь, способы устойчивой трансформации, способы временной трансформации и вирус-опосредованные способы. Под "растением" понимают целые растения, органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), семена, растительные клетки, побеги, зародыши и их потомство. Клетки растений могут быть дифференцированными или недифференцированными (например, каллюс, клетки суспензионной культуры,протопласты, клетки листа, клетки корня, клетки флоэмы, пыльца). Под "трансгенными растениями", или "трансформированными растениями", или "устойчиво транс- 10020327 формированными" растениями, или клетками, или тканями понимают растения, у которых в растительную клетку ввели или интегрировали экзогенные последовательности нуклеиновых кислот или ДНКфрагменты. К этим последовательностям нуклеиновых кислот относятся последовательности, которые являются экзогенными или отсутствуют в нетрансформированной растительной клетке, а также последовательности, которые могут быть эндогенными или присутствовать в нетрансформированной растительной клетке. Под "гетерологичными", как правило, понимают последовательности нуклеиновых кислот,которые не являются эндогенными для клетки или участка нативного генома, в котором они присутствуют, и были добавлены в клетку путем инфицирования, трансфекции, микроинъекции, электропорации,микропроекции или подобное. Трансформация растительных клеток может быть осуществлена одной из нескольких техник, известных в данной области. Ген -эндотоксина по изобретению может быть модифицирован для достижения или усиления экспрессии в растительных клетках. Обычно конструкция, которая экспрессирует такой белок, должна содержать промотор для запуска транскрипции гена, а также 3'-нетранслируемую область для терминации транскрипции и полиаденилирования. Организация таких конструкций хорошо известна в данной области. В некоторых случаях она может быть использована для получения гена так,что полученный пептид секретируется или иначе нацелен на растительную клетку. Например, ген может быть получен так, что содержит сигнальный пептид для облегчения переноса пептида в эндоплазматическую сеть. Также может быть предпочтительно получена растительная экспрессионная кассета, содержащая интрон такой, что для экспрессии требуется процессинг мРНК с удалением интрона. Обычно эта "растительная экспрессионная кассета" должна встраиваться в "вектор для трансформации растения". Этот вектор для трансформации растения может быть составлен из одного или нескольких ДНК-векторов, необходимых для трансформации растения. Например, установившейся практикой в данной области является использование векторов для трансформации растений, которые состоят из более чем одного непрерывного ДНК-сегмента. Эти векторы часто обозначают в данной области как"бинарные векторы". Бинарные векторы, а также векторы со вспомогательными плазмидами чаще всего используют для Agrobacterium-опосредованной трансформации, когда размер и сложность ДНКсегментов, желательных для достижения эффективной трансформации, довольно велики, и предпочитается разделять функции между отдельными молекулами ДНК. Бинарные векторы обычно содержат плазмидный вектор, который содержит цис-действующие последовательности, требуемые для переноса Т-ДНК (такой как левый край и правый край), селектируемый маркер, который создают, чтобы он мог экспрессироваться в растительной клетке, и "интересующий ген" (ген, созданный так, чтобы он мог экспрессироваться в растительной клетке, для которой желательно получение трансгенных растений). Также на этом плазмидном векторе присутствуют последовательности, необходимые для бактериальной репликации. Цис-действующие последовательности расположены так, чтобы дать возможность эффективного переноса в растительные клетки и экспрессии в них. Например, ген селектируемого маркера и эндотоксин расположены между левым и правым краями. Часто второй плазмидный вектор содержит транс-действующие факторы, которые опосредуют перенос Т-ДНК из Agrobacterium в растительные клетки. Эта плазмида часто содержит функции вирулентности (гены Vir), которые дают возможность инфицирования растительных клеток штаммом Agrobacterium и переноса ДНК за счет расщепления по краевым последовательностям и vir-опосредованного переноса ДНК, как известно в данной области (Hellens и Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5:446-451). Для трансформации растений могут быть использованы некоторые типы штаммов Agrobacterium (например, LBA4404, GV3101, ЕНА 101, ЕНА 105 и т.д.). Для трансформации растений другими способами, такими как микропроекция, микроинъекция,электропорация, полиэтиленгликоль и т.д., второй плазмидный вектор не требуется. В целом, способы трансформации растений включают перенос гетерологичной ДНК в растительные мишеневые клетки (например, незрелые или зрелые зародыши, суспензионные культуры, недифференцированный каллюс, протопласты и т.д.) с последующим применением максимального порогового уровня подходящей селекции (в зависимости от гена селектируемого маркера) для извлечения трансформированных растительных клеток из группы нетрансформированной клеточной массы. Эксплантаты обычно переносят в свежий материал той же среды и культивируют принятым способом. Затем трансформированные клетки дифференцируются в побеги после помещения на среду для регистрации, дополненную максимальным пороговым уровнем селективного агента. Побеги затем переносят в селективную среду для укоренения с целью получения укоренившегося побега или проростка. Трансгенный проросток затем вырастает в зрелое растение и продуцирует фертильные семена (например, Hiei et al. (1994) The PlantJournal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750). Эксплантаты обычно переносят на свежий материал той же среды и культивируют принятым способом. Общее описание техник и способов получения трансгенных растений можно найти в статьях Ayres и Park (1994) Critical Reviews in Plant Science 13:219-239 и Bommineni и Jauhar (1997) Maydica 42:107-120. Поскольку трансформированный материал содержит большое число клеток, в любом участке подвергшегося воздействию мишеневого каллюса или ткани или группы клеток присутствуют как трансформированные, так и нетрансформированные клетки. Возможность уничтожать нетрансформированные клетки и давать возможность трансформиро- 11020327 ванным клеткам пролиферировать приводит к получению культур трансформированного растения. Часто способность удалять нетрансформированные клетки является ограничением для быстрого извлечения трансформированных растительных клеток и успешного получения трансгенных растений. Протоколы трансформации, а также протоколы встраивания нуклеотидных последовательностей в растения могут изменяться в зависимости от типа растения или растительной клетки, т.е. от того, является ли растение, нацеленное на трансформацию, однодомным или двудомным. Получение трансгенных растений может быть осуществлено одним из нескольких способов, к которым относятся, но ими не ограничиваясь, микроинъекция, электропорация, прямой перенос гена, встраивание в растительные клетки гетерологичной ДНК с помощью Agrobacterium (Agrobacterium-опосредованная трансформация), бомбардировка растительных клеток гетерологичной чужеродной ДНК, адгезированной на частицах, баллистическое ускорение частиц, трансформация струей аэрозоля (опубликованная заявка США 20010026941; патент США 4945050; международная публикация WO 91/00915; опубликованная заявка США 2002015066), трансформация Lec1 и большое число других способов переноса ДНК, прямо не опосредованных частицами. Способы трансформации хлоропластов известны в данной области. См., например, статьи Svab et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12:601-606. Способ основан на доставке ДНК, содержащей селектируемый маркер, с помощью генной пушки и нацеливании ДНК на геном пластиды за счет гомологичной рекомбинации. Кроме того, трансформация пластиды может быть осуществлена посредством трансактивации молчащего пластидного трансгена за счет тканеспецифичной экспрессии кодируемой в ядре и направленной на пластиду РНК-полимеразы. О такой системе было сообщено в статье McBride et al. (1994)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7301-7305. После интеграции гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки затем используют максимальный пороговый уровень подходящей селекции в среде для уничтожения нетрансформированных клеток и отделения и пролиферации предполагаемых трансформированных клеток, которые выживают после этого режима селекции, путем периодического переноса на свежую среду. За счет непрерывного пассажа и проверки с помощью подходящей селекции идентифицируются и пролиферируют клетки, которые трансформированы плазмидным вектором. Для подтверждения наличия интересующего интегрированного гетерологичного гена в геноме трансгенного растения затем могут быть использованы молекулярные и биохимические способы. Трансформированные клетки могут быть выращены до растений в соответствии с принятыми способами. См., например, статью McCormick et al. (1986) Plant. Cell. Reports 5:81-84. Эти растения затем могут быть выращены и опылены либо тем же самым трансформированным штаммом, либо отличными штаммами и идентифицирован полученный гибрид с конститутивной экспрессией желаемых фенотипических характеристик. Для устойчивого сохранения и наследования экспрессии желательных фенотипических характеристик могут быть выращены два или более поколений и затем получены семена с экспрессией желательных фенотипических характеристик. Таким образом, настоящее изобретение относится к трансформированным семенам (также обозначаемым как "трансгенные семена"), имеющим нуклеотидную конструкцию по изобретению, например экспрессионную кассету по изобретению, устойчиво встроенную в их геном. Оценка трансформации растений После введения гетерологичной чужеродной ДНК в растительные клетки трансформацию или интеграцию гетерологичного гена в геном растения подтверждают большим числом способов, таких как анализ нуклеиновых кислот, белков и метаболитов, связанных с интегрированным геном. Анализ ПЦР представляет собой быстрый способ скрининга трансформированных клеток, ткани или побегов на наличие встроенного гена на ранней стадии перед высадкой в почву (Sambrook и Russell(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,NY). ПЦР осуществляют, используя олигонуклеотидные праймеры, специфичные для интересующего гена или фонового вектора Agrobacterium и т.д. Трансформация растения может быть подтверждена анализом саузерн-блот геномной ДНК (Sambrook и Russell, 2001, выше). В целом, из трансформанта экстрагируют суммарную ДНК, расщепляют с помощью подходящих рестриктаз, фракционируют в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозную или найлоновую мембрану. Мембрану или "блот" затем исследуют, например, с помощью радиоактивно меченного 32 Р нацеленного ДНК-фрагмента для подтверждения интеграции введенного гена в геном растения согласно стандартным техникам (Sambrook и Russell, 2001, выше). В анализе нозерн-блот из специфических тканей трансформанта выделяют РНК, фракционируют в агарозном геле с формальдегидом и блоттируют на найлоновом фильтре согласно стандартным процедурам, которые принято использовать в данной области (Sambrook и Russell, 2001, выше). Экспрессию РНК, кодируемой геном -эндотоксина, затем тестируют посредством гибридизации фильтра с радиоактивным зондом, полученным исходя из -эндотоксина, посредством способов, известных в данной области (Sambrook и Russell, 2001, выше). Для подтверждения наличия белка, кодируемого геном -эндотоксина, на трансгенных растениях могут быть осуществлены вестерн-блот, биохимические анализы и пободное с помощью стандартных процедур (Sambrook и Russell, 2001, выше), используя антитела, которые связываются с одним или несколькими эпитопами, присутствующими на белке -эндотоксине. Пестицидная активность в растениях В другом аспекте изобретения можно получить трансгенные растения, экспрессирующие эндотоксин, который обладает пестицидной активностью. Для получения трансгенных растений могут быть использованы способы, описанные выше в качестве примера, но то, каким образом получают трансгенные растения, не является решающим для настоящего изобретения фактором. На усмотрение экспериментатора могут быть использованы способы, известные или описанные в данной области, такие как Agrobacterium-опосредованная трансформация, биолистическая трансформация и способы, не опосредованные частицами. Растения, экспрессирующие -эндотоксин, могут быть выделены общими способами, описанными в данной области, например трансформацией каллюса, селекцией трансформированного каллюса и восстановлением фертильных растений из такого трансгенного каллюса. В таком способе в качестве селектируемого маркера можно использовать любой ген при условии, что его экспрессия в растительных клетках дает возможность идентифицировать или отобрать трансформированные клетки. Для использования с растительными клетками было разработано большое число маркеров, таких как устойчивость к хлорамфениколу, аминогликозиду G418, гигромицину или подобное. В качестве селектируемых маркеров также могут быть использованы другие гены, которые кодируют продукт, участвующий в метаболизме хлоропластов. Например, могут найти особое применение гены, которые придают устойчивость к гербицидам растений, таким как глифозат, бромоксинил или имидазолинон. Такие гены были описаны (Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314 (ген нитрилазы, придающей устойчивость к бромоксинилу); и Sathasivan et al. (1990) Nucl. Acids Res.18:2188 (ген устойчивости к имидазолинону AHAS). Кроме того, гены, описанные в настоящем документе, можно использовать в качестве маркеров для оценки трансформации бактериальных или растительных клеток. Способы определения наличия трансгена в растении, органе растения (например, листьях, стеблях, корнях и т.д.), семенах, растительной клетке, ростке, зародыше или их потомстве хорошо известны в данной области. В одном из вариантов осуществления наличие трансгена определяют тестированием на пестицидную активность. Фертильные растения, экспрессирующие -эндотоксин, могут быть протестированы на пестицидную активность, и растения, у которых наблюдается оптимальная активность, отобраны для дополнительного скрещивания. Способы оценки активности против вредителей доступны в данной области. Как правило, белок смешивают и используют в анализах с подкормкой. См., например, статью Marrone et al.(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293. Настоящее изобретение может быть использовано для трансформации любого вида растений,включая, но ими не ограничиваясь, однодомных и двудомных. Примером интересующих растений являются, но ими не ограничиваются, кукуруза, сорго, пшеница, подсолнечник, помидоры, крестоцветные,перец, картофель, хлопок, рис, соя, сахарная свекла, сахарный тростник, табак, ячмень и масличный репсBrassica sp., люцерна, рожь, просо, сафлор, арахис, батат, маниока, кофе, кокос, ананас, цитрусовые деревья, какао, чай, банан, авокадо, инжир, гуаява, манго, маслина, дынное дерево, анакард, макадамия,миндаль, овес, овощи, декоративные растения и хвойные деревья. К овощам относятся, но ими не ограничиваются, томаты, салат-латук, зеленая фасоль, фасоль Лима,горох и члены рода Curcumis, такие как огурец, мускусная дыня и мускусный арбуз. К декоративным растениям относятся, но ими не ограничиваются, азалия, гортензия, гибискус, розы, тюльпаны, желтые нарциссы, петунии, гвоздика, пуансеттия и хризантема. Предпочтительно растения по настоящему изобретению представляют собой зерновые растения (например, маис, сорго, пшеницу, подсолнечник, помидор, крестоцветные, перец, картофель, хлопок, рис, сою, сахарную свеклу, сахарный тростник, табак,ячмень, масличный рапс и т.д.). Применение в контроле за вредителями В настоящей области известны основные способы использования штаммов, содержащих нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или ее вариант, в контроле пестицидными препаратами или в создании других организмов в качестве пестицидных агентов. См., например, патент США 5039523 и ЕР 0480762 А 2. Штаммы Bacillus, содержащие нуклеотидную последовательность по настоящему изобретению или ее вариант, или микроорганизмы, которые были генетически изменены так, чтобы содержать пестицидные ген и белок, могут быть использованы для защиты сельскохозяйственных зерновых культур и продуктов от вредителей. В одном из аспектов изобретения целые, т.е. нелизированные клетки токсин (пестицид)-продуцирующего организма, обрабатывают реагентами, которые пролонгируют активность токсина, продуцируемого в клетке, при применении клетки в среде обитания мишеневого(вых) вредителя(ей). Альтернативно, пестицид продуцируют введением гена -эндотоксина в клеточного хозяина. Экспрессия гена -эндотоксина непосредственно или косвенно приводит к внутриклеточной продукции и сохранению пестицида. В одном из аспектов настоящего изобретения эти клетки затем обрабатывают в условиях, которые продляют активность токсина, продуцируемого в клетке, при применении клетки в среде обитания мишеневого(вых) вредителя(ей). Полученный продукт сохраняет токсичность токсина. Эти природным образом инкапсулированные пестициды затем могут быть смешаны в соответствии с принятыми методиками для применения в среде обитания мишеневого вредителя, например почве, воде и листве растений. См., например, ЕРА 0192319 и ссылки, приведенные там. Альтернативно, можно смешать клетки, экспрессирующие ген по данному изобретению, таким образом, чтобы использовать полученный материал в качестве пестицида. Пестицидные композиции Активные ингредиенты по настоящему изобретению обычно используют в виде композиций, и они могут быть использованы на посевной площади или обрабатываемых растениях одновременно или последовательно с другими соединениями. Эти соединения могут представлять собой удобрения, гербициды, криопротекторы, поверхностно-активные вещества, детергенты, пестицидные омыляющие вещества,дормантные масла, полимеры и/или препаративные формы с высвобождаемым с течением времени или биодеградируемым носителем, которые обеспечивают длительное дозирование мишеневой области, после однократного нанесения препаративной формы. Они также могут представлять собой селективные гербициды, химические инсектициды, вируциды, микробициды, амебициды, пестициды, фунгициды,бактериоциды, нематоциды, моллюскоциды или смеси нескольких из этих препаратов при необходимости вместе с дополнительными приемлемыми для сельского хозяйства носителями, поверхностноактивными веществами или способствующими нанесению наполнителями, обычно применяемыми в данной области смешивания. Подходящие носители и наполнители могут представлять собой твердое вещество или жидкость и соответствовать веществам, обычно используемым в технологии смешивания,например природным или искусственным минеральным веществам, растворителям, диспергирующим веществам, увлажняющим агентам, усилителям клейкости, связующим средствам или удобрениям. Также препаративные формы могут быть получены в съедобных "приманках" или сформированы в "западни" для вредителей для кормления или поглощения вредителем, являющимся мишенью, пестицидной препаративной формы. К способам нанесения активного ингредиента по настоящему изобретению или агрохимической композиции по настоящему изобретению, которая содержит по меньшей мере один из пестицидных белков, продуцируемых бактериальными штаммами по настоящему изобретению, относятся нанесение на листья, дражирование семян и внесение в почву. Количество нанесений и скорость нанесения зависят от интенсивности нашествия соответствующего вредителя. Композиция может быть смешана в виде порошка, дуста, пилюли, гранулы, спрея, эмульсии, коллоида, раствора или тому подобного и может быть получена такими принятыми способами, как высушивание, лиофилизация, гомогенизация, экстракция, фильтрация, центрифугирование, осаждение или концентрирование культуры клеток, содержащих полипептид. Во всех таких композициях, которые содержат по меньшей мере один такой пестицидный полипептид, полипептид может присутствовать в концентрации от около 1 до около 99 мас.%. Бабочки, жуки или нематоды-вредители могут быть уничтожены или их количество снижено на данной площади способами по изобретению или можно применить на области обитания с профилактической целью для предотвращения нашествия чувствительного вредителя. Предпочтительно вредитель поглощает или приводится в контакт с пестицидно-эффективным количеством полипептида. Под "пестицидно-эффективным количеством" понимают количество пестицида, которое способно привести к гибели по меньшей мере одного вредителя или к заметному снижению роста, питания или нормального физиологического развития вредителя. Это количество будет изменяться в зависимости от таких факторов,как, например, конкретные контролируемые мишеневые вредители, обрабатываемая конкретная окружающая обстановка, месторасположение, растение, зерновая культура или сельскохозяйственный участок, условия окружающей среды и способ, скорость, концентрация, устойчивость и количество применяемой пестицидно-эффективной полипептидной композиции. Препаративные формы также могут изменяться в связи с климатическими условиями, факторами окружающей среды, которые необходимо учесть, и/или частотой применения и/или тяжестью нашествия вредителей. Описанные пестицидные композиции могут быть получены смешиванием либо бактериальной клетки, кристаллической и/или споровой суспензии, либо выделенного белкового компонента с желательным приемлемым для сельского хозяйства носителем. Композиции могут быть смешаны до применения подходящими способами, такими как лиофилизация, высушивание замораживанием, высушивание, или в водном носителе, среде, или подходящем разбавителе, таком как солевой раствор или другой буфер. Смешанные композиции могут находиться в форме дуста, или гранулированного материала, или суспензии в масле (растительном или минеральном), или воде, или эмульсиях масло/вода, или в виде гигроскопичного порошка, или в сочетании с любым другим материалом носителя, подходящим для применения в сельском хозяйстве. Подходящие для сельского хозяйства носители могут представлять собой твердые вещества или жидкости и хорошо известны в данной области. Термин "приемлемый для сельского хозяйства носитель" охватывает все наполнители, инертные компоненты, диспергирующие средства, поверхностно-активные вещества, клеющие средства, связующие средства и т.д., которые обычно используются в технологии препаративных форм пестицидов; они хорошо известны специалистам в препаративной форме пестицидов. Препаративные формы могут быть смешаны с одним или несколькими твердыми или жидкими наполнителями и получены большим числом способов, например смешиванием до однородного состояния, смешиванием и/или растиранием пестицидной композиции с подходящими наполнителями, используя принятые техники смешивания. Подходящие препаративные формы и способы применения описаны в патенте США 6468523, приведенном в настоящем документе в качестве ссылки. К "вредителям" относятся, но ими не ограничиваются, насекомые, грибы, бактерии, нематоды, клещи, иксодовые клещи и подобное. К насекомым-вредителям относятся насекомые, выбранные из отрядовColeoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera,Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera и т.д., особенно Coleoptera, Lepidoptera и Diptera. Порядок Coleoptera включает подпорядки Adephaga и Polyphaga. Подпорядок Adephaga включает суперсемейства Caraboidea и Gyrinoidea, тогда как подпорядок Polyphaga включает суперсемейства Hydrophiloidea, Staphylinoidea, Cantharoidea, Cleroidea, Elateroidea, Dascilloidea, Dryopoidea, Byrrhoidea, Cucujoidea, Meloidea, Mordelloidea, Tenebrionoidea, Bostrichoidea, Scarabaeoidea, Cerambycoidea, Chrysomeloidea и Curcblionoidea. Суперсемейство Caraboidea включает семейства Cicindelidae, Carabidae иTineidae. К нематодам относятся паразитарные нематоды, такие как клубеньковые, цистные и корневые нематоды, включая Heterodera spp., Meloidogyne spp. и Globodera spp.; в частности, к членам цистных нематод относятся, но ими не ограничиваясь, Heterodera glycines (соевая цистная нематода); Heteroderaschachtii (свекольная цистная нематода); Heterodera avenae (зерновая цистная нематода) и Globodera rostochiensis и Globodera pailida (картофельные цистные нематоды). К корневым нематодам относятся Pratylenchus spp. К насекомым-вредителям по изобретению основных злаковых культур относятся кукуруза: Ostrinia кукурузная листовая; Sipha flava, тля желтая сахарного тростника; Blissus leucopterus leucopterus, клопчерепашка пшеничный североамериканский; Contarinia sorghicola, галлица сортовая; Tetranychus cinnabarinus, красный паутинный клещ; Tetranychus urticae, обыкновенный паутинный клещ; пшеница: Pseudaletia unipunctata, гусеница; Spodoptera frugiperda, совка травяная; Elasmopalpus lignosellus, малый кукурузный мотылек; Agrotis orthogonia, совка прямоугольная; Oulema melanopus, пьявица красногрудая; Hypera punctata, слоник листовой бобовый; Diabrotica undecimpunctata howardi, блошка 11-точечная Говарда; русская пшеничная тля; Schizaphis graminum, тля злаковая обыкновенная; Macrosiphum avenae, тля листовая; Melanoplus femurrubrum, краснобедрая кобылка; Melanoplus differentialis, кобылка отличительная; Melanoplus sanguinipes, кобылка мексиканская; Mayetiola destructor, гессенская мушка; Sitodiplosisplatura, личинка мухи ростковой; Mayetiola destructor, гессенская мушка; Petrobia lateens; масличный репс: Brevicoryne brassicae, тля капустная; Phyllotreta cruciferae, блошка крестоцветная; Mamestra configurata, совка латуковая; Plutella xylostella, моль капустная; Delia spp., личинки корневые. Способы повышения урожая растений Предлагаются способы повышения урожая растений. Способы содержат введение в растение или растительную клетку полинуклеотида, содержащего пестицидную последовательность, описанную в настоящем документе. Под используемым в настоящем документе термином "урожай" растения понимают качество и/или количество биомассы, продуцируемой растением. Под "биомассой" понимают любой оцениваемый продукт растения. Повышение продукции биомассы представляет собой любое улучшение урожая оцениваемого продукта растения. Увеличенный урожай растения имеет некоторые коммерческие применения. Например, повышенная биомасса листвы растения может увеличивать урожай листовых овощей для употребления человеком или животным. Кроме того, повышенная биомасса листвы может быть использована для увеличения продукции фармацевтических или промышленных продуктов растительного происхождения. Повышение урожая может содержать любое статистически значимое повышение, включая, но ими не ограничиваясь, повышение по меньшей мере на 1%, по меньшей мере на 3%, по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 100% или большее повышение урожая по сравнению с растением, не экспрессирующим пестицидную последовательность. В специфических способах урожай растения повышается в результате улучшенной устойчивости к вредителю растения, экспрессирующего пестицидный белок, описанный в настоящем документе. Экспрессия пестицидного белка приводит к сниженной способности вредителя к нашествию или питанию за счет растения, таким образом, улучшая урожай растения. Следующие примеры предлагаются в качестве иллюстрации, а не ограничения. Экспериментальная часть Пример 1. Обнаружение новых пестицидных генов у бактерии Bacillus thuringiensis. Новые пестицидные гены идентифицировали у бактериальных штаммов, перечисленных в табл. 1,используя следующие стадии: получение внехромосомной ДНК из штамма, который включает плазмиды, обычно содержащие ге- 16020327 ны -эндотоксина; механическое разделение внехромосомной ДНК для получения распределенных по размеру фрагментов; клонирование фрагментов внехромосомной ДНК размером от 2 до 10 т.п.н.; выращивание 1500 клонов внехромосомной ДНК; частичное секвенирование 1500 клонов, используя праймеры, специфичные для клонирующего вектора (считывает конец); идентификация предполагаемых генов токсина посредством анализа гомологии способом MiDAS(описанным в патентной публикации США 20040014091, которая приводится в данном документе в качестве ссылки в полном объеме); завершение последовательностей (прогулка) клонов, содержащих фрагменты предполагаемых интересующих генов токсина. Таблица 1 Список новых генов, выделенных из Bacillus thuringiensis Вероятная коактивность при экспрессии или сочетании с другим токсином,таким как Axmi0014 или Axmi008 2 Вероятная коактивность при экспрессии или сочетании с другим токсином,таким как Axmi0014 или Axmi009 3 Гомология N-терминального домена с каталитическим доменом фосфолипазы С 4 Вероятная коактивность при экспрессии или сочетании с другим токсином,таким как Axmi052 5 Вероятная коактивность при экспрессии или сочетании с другим токсином,таким как Axmi051 Пример 2. Обнаружение новых пестицидных генов Bacillus thuringiensis. Новые пестицидные гены идентифицировали из штаммов, перечисленных в табл. 2, используя способ MiDAS, описанный в патентной публикации США 20040014091, которая приводится в данном документе в качестве ссылки в полном объеме, используя следующие стадии: получение из штамма внехромосомной ДНК. Внехромосомная ДНК содержит смесь некоторых или всех структур из следующего списка: плазмиды различного размера; фаговые хромосомы; фрагменты геномной ДНК, не разделенные посредством протокола очистки; другие неохарактеризованные внехромосомные молекулы; механическое или ферментативное разделение внехромосомной ДНК для получения распределенных по размеру фрагментов; секвенирование фрагментированной ДНК; идентификация предполагаемых генов токсина посредством анализа гомологии и/или другими компьютерными анализами; при необходимости завершение последовательности интересующего гена одной из нескольких стратегий ПЦР или клонирования (например, TAIL-PCR). Таблица 2 Список новых генов, выделенных из Bacillus thuringiensis Этот ген представляет собой N-терминальный участок расщепленного генаcry и образует пару в своем исходном состоянии с геном Axmi126, который представляет С-концевой участок расщепленной пары cry. Эти гены могут действовать в качестве котоксинов, и у них при коэкспрессии или слиянии может наблюдаться усиленная, новая или измененная активность. Промежуточная область между геном Axmi125 и ниже расположенным геном Axmi126 приводится в SEQ ID NO: 122. 2 Этот ген представляет собой С-терминальный участок расщепленного генаcry и образует пару в своем нативном состоянии с Axmi125, который представляет N-концевой участок расщепленной пары cry. Эти гены могут действовать в качестве котоксинов, и у них при коэкспрессии или слиянии может наблюдаться усиленная, новая или измененная активность. Пример 3. Обнаружение нового токсинового гена Axmi068 из штамма Bacillus thuringiensisATX13046. Штамм, кодирующий Axmi068, идентифицировали согласно следующему: информацию о последовательностях известных или предполагаемых токсиновых генов использовали для получения выравнивания, представляющего консервативные и не вполне консервативные ДНКпоследовательности в группе (семействе) токсинов; для селективной амплификации одного или нескольких членов семейства токсинов на основании выровненной последовательности создавали праймеры для проведения полимеразной цепной реакции(ПЦР); ДНК, выделенную из бактериальных штаммов, скринировали посредством ПЦР для идентификации штаммов, содержащих предполагаемые гомологи мишеневого семейства гена; ПЦР-продукты секвенировали для отбора штамма, содержащего интересующий ген. У отобранного штамма идентифицировали полную последовательность гена посредством геномного способа MiDAS (патентная публикация США 20040014091) согласно следующему: получение из штамма внехромосомной ДНК. Внехромосомная ДНК содержит смесь некоторых или всех структур из следующего списка: плазмиды различного размера; фаговые хромосомы; фрагменты геномной ДНК, не разделенные посредством протокола очистки; другие неохарактеризованные внехромосомные молекулы; механическое или ферментативное разделение внехромосомной ДНК для получения распределенных по размеру фрагментов; клонирование фрагментов внехромосомной ДНК в плазмидный вектор; выращивание и очистка клонированной внехромосомной ДНК; частичное секвенирование клонов; идентификация предполагаемых токсиновых генов посредством анализа гомологии и/или другими компьютерными анализами; при необходимости завершение последовательностей (прогулка) клонов, содержащих последовательность предполагаемых интересующих генов токсина; нуклеотидная последовательность гена axmi068 приводится в SEQ ID NO: 16 и аминокислотная последовательность белка axmi068 приводится в SEQ ID NO: 76. Характеристики гена и белка Пример 4. Экспрессия в Bacillus. Инсектицидный ген, описанный в настоящем документе, амплифицируют с помощью ПЦР и ПЦРпродукт клонируют в экспрессионный вектор Bacillus рАХ 916 или другой подходящий вектор способами, хорошо известными в данной области. Полученный штамм Bacillus, содержащий вектор с геномaxmi, культивируют на принятой ростовой среде, такой как среда CYS (бакто-казитон в концентрации 10 г/л; дрожжевой экстракт в концентрации 3 г/л; 6 г/л KH2PO4; 14 г/л K2HPO4; 0,5 мМ MgSO4; 0,05 мМMnCl2; 0,05 мМ FeSO4), пока споруляция не станет очевидна с помощью микроскопической оценки. Образцы получают и тестируют в отношении активности в биоанализах. Пример 5. Создание синтетических последовательностей. В одном из аспектов изобретения получали синтетические последовательности axmi. Эти синтетические последовательности имеют последовательность ДНК, измененную по сравнению с родительской последовательностью axmi, и кодируют белок, который коллинеарен родительскому белку AXMI, которому он соответствует, но во многих белках -эндотоксинах отсутствует С-терминальный "кристаллический домен". Синтетические гены представлены в табл. 3. В другом аспекте изобретения создают модифицированные версии синтетических генов таким образом, чтобы нацелить полученный пептид на органеллу растения, такую как эндоплазматическая сеть или апопласт. Пептидные последовательности, нацеливающие слитые белки на органеллы растений, известны в данной области. Например, N-терминальная область гена кислой фосфатазы белого люпинаLupinus albus (Генбанк ID GI:14276838; Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606) известен в данной области как нацеливающий гетерологичные белки на эндоплазматическую сеть. Если полученный слитый белок также содержит последовательность удержания в эндоплазматической сети, содержащую на С-конце пептид N-конец-лизин-аспарагиновая кислота-глутаминовая кислота-лейцин (т.е. мотив"KDEL" (SEQ ID NO:123), то слитый белок будет нацелен на эндоплазматическую сеть. При отсутствии на С-конце слитого белка последовательности, нацеленной на эндоплазматическую сеть, белок будет нацелен на эндоплазматическую сеть, но будет, в конечном счете, секвестрирован в апопласте. Пример 6. Экспрессия гена axmi100 в E.coli и Bacillus. Полную ORF гена axmi100 (размером 3,45 т.п.н., которая кодирует белок размером 1156 аминокислот) клонировали в экспрессирующий вектор E.coli на основе плазмиды pRSF1b (для получения рАХ 5445) и вектор Bacillus на основе плазмиды рАХ 916 (для получения рАХ 5444). Полученные клоны подтверждали рестрикционным анализом и в заключение полным секвенированием клонированного гена. Для экспрессии в E.coli клетки BL21DE3 трансформировали с помощью рАХ 5445. Единичную колонию инокулировали в среду LB, дополненную канамицином, и выращивали в течение ночи при 37 С. На следующий день свежую среду инокулировали в двух повторах 1% ночной культурой и выращивали при 37 С до логарифмической фазы. После чего культуры индуцировали с помощью 1 мМ IPTG в течение 3 ч при 37 С или в течение ночи при 20 С. Каждый клеточный осадок суспендировали в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 10,5, дополненном 1 мМ DTT, и обрабатывали ультразвуком. Анализ посредством электрофореза в SDS-PAGE детектировал экспрессию белка размером 130 кДа, соответствующего белку Axmi100. Для экспрессии в Bacillus штамм Bacillus thuringiensis трансформировали с помощью рАХ 5444 и единичную колонию выращивали в среде CYS-glu в течение 3 дней до споруляции. Клеточный осадок затем экстрагировали с помощью 50 мМ натрий-карбонатного буфера, рН 10,5, дополненного 1 мМ DTT. Растворимая фракция показала наличие белка Axmi100 размером 130 кДа наряду с несколькими полосами белков меньшей молекулярной массы вследствие процессинга белка Axmi100. Трипсинизация белкаAxmi100 дала 2 четких полосы белков размером около 65 и 55 кДа. Пример 7. Биоанализ белка Axmi100. Получение образцов. Бесклеточные экстракты клеток, экспрессирующих AXMI-100, обычно ресуспендировали в 50 мМ натрий-карбонатном буфере, рН 10,5, как правило, с включением 1 мМ DTT в качестве восстанавливающего агента. Для тестирования посредством биоанализа готовили трипсинизированные и нетрипсинизированные образцы. Обзор методологии биоанализа. В 24-луночные планшеты для культивирования тканей (продукция фирмы Corning) помещали по 1 мл диеты для большого числа видов (продукция фирмы Bio-Serv) и оставляли до затвердевания. После затвердевания на поверхность каждой лунки с кормом помещали 40 мкл образца белка и оставляли для впитывания/высушивания при комнатной температуре. В зависимости от эксперимента в каждую лунку помещали либо кладки кукурузного мотылька ЕСВ, десять новорожденных личинок, либо одну новорожденную личинку. Планшеты покрывали газопроницаемыми мембранами (продукция фирмы ResearchProducts International) и инкубировали при 25 С и 90% RH. Через пять или семь дней (в зависимости от эксперимента) образцы оценивали визуально, сравнивая с одним буфером или контролем экстракта нетрансформированных клеток. Повышенная активность AXMI-100 наблюдалась в отношении кукурузного мотылька и табачной листовертки. Активность в отношении совки-ипсилона наблюдалась при высоких концентрациях белка. Некоторая активность также наблюдалась при высоких концентрациях в отношении гусеницы бархатного боба, но активность как в отношении совки-ипсилона, так и гусеницы бархатного боба оказалась менее отчетливой и более вариабельной, чем в отношении других протестированных насекомых. Трипсинизация белка Axmi100 дала 2 четких полосы белков около 65 и 55 кДа, и не наблюдалось требуемого для активности Axmi100. Пример 8. Дополнительные анализы на пестицидную активность. Способность пестицидного белка действовать в качестве пестицида на вредителя часто оценивают большим числом способов. Один из способов, хорошо известных в данной области, представляет собой осуществление анализа с подкормкой. В таком анализе с подкормкой экспонируют вредителя с образцом, содержащим либо тестируемые соединения, либо контрольные образцы. Часто это осуществляют помещением тестируемого материала или подходящего разведения такого материала на материал, который вредитель проглотит, такой как искусственная питательная среда. Тестируемый материал может быть составлен из жидкости, твердого вещества или взвеси. Тестируемый материал может быть помещен на поверхность и затем оставлен для высушивания. Альтернативно, тестируемый материал может быть смешан с растопленной искусственной питательной средой, затем разложен в камере для проведения анализа. Камера для проведения анализа может представлять собой, например, чашку, тарелку или лунку планшета для микротитрования. Анализы с сосущими вредителями (например, тлей) могут включать разделение тестируемого материала в зависимости от насекомого посредством фрагментации, желателен участок, который может быть проколот частями сосущего ротового аппарата сосущего насекомого для заглатывания тестируемого материала. Часто тестируемый материал смешивают со стимулятором кормления, таким как сахароза, для усиления поглощения тестируемого соединения. Другие виды анализов могут включать микроинъекцию тестируемого материала в ротовой аппарат или кишечник вредителя, а также разработку трансгенных растений с последующим тестированием способности вредителя съедать трансгенное растение. Тестирование растения может включать выделение обычно поедаемых частей растения, например небольшие садки, прикрепленные к листу, или выделение целых растений в садках, содержащих насекомых. В данной области известны и другие способы и подходы к анализу вредителей, и их можно найти,например, в руководстве Robertson, J.L. Preisler H.K. 1992. Pesticide bioassays with arthropods. CRC, BocaRaton, FL. Альтернативно, анализы часто описываются в журналах "Arthropod Management Tests" и"Journal of Economic Entomology" или обсуждаются членами энтомологического общества Америки(ESA). Пример 9. Биоанализ белков Axmi079 и Axmi082. Экспрессия и очистка гена. ДНК-области, кодирующие токсиновые домены белков Axmi079 и Axmi082, по отдельности клонировали в экспрессирующий вектор Е. coli pMAL-C4x позади гена malE, кодирующего белок, связывающий мальтозу (МВР). Эти слияния внутри рамки считывания привели к экспрессии в Е. coli слитых белков МВР-Axmi. Для экспрессии в Е. coli клетки BL21DE3 трансформировали отдельными плазмидами. Единичную колонию инокулировали в среду LB, дополненную карбенициллином и глюкозой, и выращивали в течение ночи при 37 С. На следующий день свежую среду инокулировали 1% ночной культуры и выращивали при 37 С до логарифмической фазы. Затем культуры индуцировали с помощью 0,3 мМ IPTG в течение ночи при 20 С. Каждый клеточный осадок суспендировали в 20 мМ буфере Трис-HCl, рН 7,4 + 200 мМ DTT + ингибиторы протеазы и обрабатывали ультразвуком. Анализ посредством электрофореза вSDS-PAGE подтвердил экспрессию слитых белков. Суммарные бесклеточные экстракты загружали на колонку с амилозой, присоединенную к FPLC для аффинной очистки слитых белков MBP-axmi. Связавшийся слитый белок элюировали со смолы с помощью 10 мМ раствора мальтозы. Очищенные слитые белки затем расщепляли либо с помощью фактора Ха, либо трипсина для удаления аминоконцевого МВР-хвоста с белка Axmi. Расщепление и растворимость белков определяли с помощью SDS-PAGE. Биоанализы с насекомыми. Расщепленные белки тестировали в анализах с насекомыми с подходящими контролями. Считывание 5-дневных планшетов показало следующие активности этих белков. Результаты дополнительного биоанализа на насекомых= представлено в виде задержки роста и процента смертности, где задержку роста оценивают по следующей шкале: Пример 10. Нацеливание пестицидных генов по изобретению на экспрессию в растениях. Каждый из кодирующих регионов генов по изобретению соединяют независимо с подходящими промоторными и терминаторными последовательностями для экспрессии в растениях. Такие последовательности хорошо известны в данной области, и к ним могут относиться актиновый промотор риса или убиквитиновый промотор кукурузы для экспрессии в однодомных растениях, промотор ArabidopsisUBQ3 или промотор CaMV 35S для экспрессии в двудомных растениях и терминаторные последовательности nos или PinII. Техники продукции и подтверждения конструкций промотор-ген-терминатор также хорошо известны в данной области. Пример 11. Трансформация генов по изобретению в растительные клетки посредством Agrobacterium-опосредованной трансформации. Початки собирают через 8-12 дней после опыления. Зародыши выделяют из початков и эти зародыши размером 0,8-1,5 мм используют для трансформации. Зародыши помещают щитком вверх на подходящую инкубационную среду и инкубируют в течение ночи при 25 С в темноте. Тем не менее, необязательно непосредственно инкубировать зародыши в течение ночи. Зародыши приводят в контакт со штаммом Agrobacterium, содержащим подходящие векторы для опосредованного плазмидой Ti переноса,в течение 5-10 мин и затем помещают на среду для совместного культивирования в течение 3 дней (25 С в темноте). После совместного культивирования эксплантаты переносят на среду для периода восстановления в течение пяти дней (при 25 С в темноте). Эксплантаты инкубируют в среде для селекции до восьми недель, в зависимости от особенностей и характеристик конкретной используемой селекции. После периода селекции полученный каллюс переносят на среду для созревания зародыша до обнаружения образования зрелых соматических зародышей. Полученные зрелые соматические зародыши затем помещают в слабоосвещенное помещение и начинают процесс регенерации, известный в данной области. Полученные побеги оставляют для укоренения на среде для укоренения и полученные растения переносят в горшки для рассады и размножают как трансгенные растения. Пример 12. Трансформация клеток кукурузы пестицидными генами по изобретению. Кукурузные початки собирают через 8-12 дней после опыления. Из початков выделяют зародыши и эти зародыши размером 0,8-1,5 мм используют для трансформации. Зародыши помещают щитком вверх на подходящую инкубационную среду, такую как среда DN62A5S (соли N6 в концентрации 3,98 г/л; витамины N6 в концентрации 1 мл/л (1000-кратного матричного раствора); L-аспарагин в концентрации 800 мг/л; мио-инозитол в концентрации 100 мг/л; L-пролин в концентрации 1,4 г/л; казаминокислоты в концентрации 100 мг/л; сахароза в концентрации 50 г/л; 2,4-D в концентрации 1 мл/л (1 мг/мл матричного раствора и инкубируют в течение ночи при 25 С в темноте. Полученные эксплантаты переносят в квадратные лунки (30-40 на чашку), переносят в осмотическую среду в течение 30-45 мин, затем переносят на пластину для инжекции (см., например, публикацию РСТ WO/0138514 и патент США 5240842). ДНК-конструкции, предназначенные для экспрессии генов по изобретению в растительных клетках,ускоряют в ткани растения, используя ускоритель струи аэрозоля, используя условия, по существу, описанные в публикации РСТ WO/0138514. После инжекции зародыши инкубируют в течение 30 мин на осмотической среде, затем помещают в инкубационную среду в течение ночи при 25 С в темноте. Чтобы избежать чрезмерного повреждения эксплантатов процедурой инжекции, их инкубируют в течение по меньшей мере 24 ч перед переносом в среду для регенерации. Зародыши затем помещают в среду для восстановительного периода в течение 5 дней при 25 С в темноте, затем переносят на среду для селекции. Эксплантаты инкубируют в среде для селекции в течение до восьми недель в зависимости от природы и особенностей конкретной используемой селекции. После периода селекции полученный каллюс переносят на среду для созревания зародыша до обнаружения образования зрелых соматических зародышей. Полученные зрелые соматические зародыши затем помещают в слабоосвещенное место и инициируют процесс регенерации способами, известными в данной области. Полученные побеги оставляют для укоренения в среде для укоренения и полученные растения переносят в горшки для рассады и размножают как трансгенные растения. С помощью 1N KOH/1N KCl доводят рН раствора до величины 5,8, добавляют Gelrite (Sigma) до 3 г/л и автоклавируют. После охлаждения до 50 С добавляют 2 мл/л матричного раствора нитрата серебра концентрацией 5 мг/мл (продукция фирмы Phytotechnology Labs). Рецепт позволяет получить около 20 чашек. Все публикации и патентные заявки, упомянутые в описании, указывают на уровень специалистов в области техники, к которой данное изобретение относится. Все публикации и патентные заявки приводятся в данный документ в качестве ссылки в той степени, как если бы было конкретно и отдельно указано, что каждая отдельная публикация или патентная заявка приводится в качестве ссылки. Несмотря на то, что вышеизложенное изобретение для лучшего понимания было описано в некоторых подробностях с помощью иллюстрации и примера, должно быть понятно, что некоторые изменения и модификации могут быть осуществлены в объеме прилагаемой формулы изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Выделенная или рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, содержащая нуклеотидную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:b) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 36, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с пестицидной активностью;c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96; иd) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 90% идентичен по аминокислотной последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 96,где указанный полипептид обладает пестицидной активностью. 2. Выделенная или рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.1, где указанная нуклеотидная последовательность представляет собой синтетическую последовательность, которая была получена для экспрессии в растении. 3. Выделенная или рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п.2, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из любой последовательности SEQ ID NO: 206, 207, 282 и 283. 4. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.1. 5. Вектор по п.4, дополнительно содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный полипептид. 6. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.4. 7. Клетка-хозяин по п.6, которая представляет собой бактериальную клетку-хозяин. 8. Клетка-хозяин по п.6, которая представляет собой растительную клетку. 9. Трансгенное растение, содержащее клетку-хозяин по п.8. 10. Трансгенное растение по п.9, где указанное растение выбрано из группы, состоящей из кукурузы, сорго, пшеницы, капусты, подсолнечника, томата, огурцов, перца, картофеля, хлопка, риса, сои, сахарной свеклы, сахарного тростника, табака, ячменя и масличного рапса.a) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96;b) полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична по последовательности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 96, где указанный полипептид обладает пестицидной активностью;c) полипептида, который кодируется любой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 36,206, 207, 282 и 283; иd) полипептида, который кодируется нуклеотидной последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична по нуклеотидной последовательности любой последовательности SEQ ID NO: 36, 206,207, 282 и 283, где указанный полипептид обладает пестицидной активностью. 12. Полипептид по п.11, дополнительно содержащий гетерологичные аминокислотные последовательности. 13. Антитело, которое селективно связывается с полипептидом по п.11. 14. Композиция, содержащая полипептид по п.11. 15. Композиция по п.14, где указанная композиция выбрана из группы, состоящей из порошка, дуста, таблетки, гранулы, спрея, эмульсии, коллоидного соединения и раствора. 16. Композиция по п.14, где указанная композиция получена высушиванием, лиофилизацией, гомогенизацией, экстракцией, фильтрацией, центрифугированием, осаждением и концентрированием культуры клеток Bacillus thuringiensis. 17. Композиция по п.14, содержащая от около 1 до около 99 мас.% указанного полипептида. 18. Способ контроля популяции чешуекрылых или жесткокрылых насекомых-вредителей, включающий приведение в контакт указанную популяцию и пестицидно эффективное количество полипептида по п.11. 19. Способ уничтожения чешуекрылого или жесткокрылого насекомого-вредителя, включающий приведение в контакт указанного вредителя или подкормку указанного вредителя пестицидно эффективным количеством полипептида по п.11. 20. Способ получения полипептида с пестицидной активностью, включающий культивирование клетки-хозяина по п.6 в условиях, в которых экспрессируется молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая данный полипептид. 21. Растение, имеющее стабильно встроенную в свой геном ДНК-конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок с пестицидной активностью, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:a) любой нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 36, 206, 207, 282 и 283;b) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична по последовательности любой нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 36, 206, 207, 282 и 283, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид с пестицидной активностью;c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий любую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96; иd) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 90% идентичен по аминокислотной последовательности с любой аминокислотной последовательностью SEQID NO: 96, где указанный полипептид обладает пестицидной активностью; где указанную нуклеотидную последовательность функционально связывают с промотором, который запускает экспрессию кодирующей последовательности в растительной клетке. 22. Растение по п.21, в котором указанное растение представляет собой растительную клетку. 23. Трансгенное семя растения по п.22. 24. Способ защиты растения от вредителя, включающий введение в указанное растение или его клетку по меньшей мере одного экспрессирующего вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, которая кодирует пестицидный полипептид, где указанная нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:a) любой нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 36, 206, 207, 282 и 283;b) нуклеотидной последовательности, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности с любой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 36, 206, 207, 282 и 283, где указанная нуклеотидная последовательность кодирует полипептид, обладающий пестицидной активностью;c) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий любую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 96; иd) нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, который по меньшей мере на 90% идентичен по аминокислотной последовательности с любой аминокислотной последовательностью SEQID NO: 96, где указанный полипептид обладает пестицидной активностью. 25. Способ по п.24, где указанное растение продуцирует пестицидный полипептид, обладающий пестицидной активностью против чешуекрылого или жесткокрылого насекомого-вредителя.