Ингибитор рецептора фактора роста фибробластов-3 (fgfr-3) и его применение

ИНГИБИТОР РЕЦЕПТОРА ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ-3 (FGFR-3) И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Настоящее изобретение относится к изолированному антителу или фрагменту антитела, которое специфично связывается с FGFR-3(IIIb) и FGFR-3(IIIc) человека или с его мутантными формами. Дополнительные варианты осуществления включают фармацевтические композиции, содержащие указанное антитело, и способы применения указанного антитела для лечения рака. Настоящее изобретение относится к иммунологии и лечению рака. В частности, настоящее изобретение направлено на антитело человека, которое связывается с рецептором фактора роста фибробластов 3 (FGFR-3) человека (SEQ ID NO:11). FGFR также известен как CD333, ACH, CEK2, HSFGFR-3EX иJTK4. Было показано, что FGFR-3 вовлечен в развитие рака, включая множественную миелому, карциному мочевого пузыря и уротелиальную карциному. Связывание лиганда FGF с рецептором вызывает димеризацию рецептора и аутофосфорилирование, что приводит к последующей активации эффекторных молекул. Передача сигнала через FGFR-3 может регулировать широкий спектр клеточных активностей,таких как пролиферация, дифференцировка, миграция, выживаемость/апоптоз, регуляция цитоскелета и цитокинов и эндоцитоз/экзоцитоз. Повышенную активность передачи сигнала через FGFR-3 считают важным событием, которое дает опухолевым клеткам преимущество в росте или выживаемости и, таким образом, способствует развитию злокачественной опухоли. Полноразмерный FGFR-3 имеет две сплайсированные формы, названные FGFR-3(IIIb) и FGFR3(IIIc), которые возникают в результате присутствия альтернативных экзонов, кодирующих третий IgGподобный домен FGFR-3. Описаны также мутантные формы FGFR-3, возникающие вследствие ошибок при репликации ДНК или трансляции. Учитывая активную роль пути передачи сигнала через FGFR-3 в широком диапазоне заболеваний, включая рак, существует потребность в механизме, который позволит регулировать этот путь. Были описаны антитела против FGFR-3, которые блокируют связывание лиганда (Rauchenberger, R.et al., J. Biol. Chem., 3 октября 2003 г.; 278(40):38194-205). Были описаны антитела против FGFR-3, которые связываются как с FGFR-3 дикого типа, так и с его мутантными формами (Martinez-Torrecuadrada, J.et al., Clin. Cancer Res., 1 сентября 2005 г.; 11(17):6280-90; Trudel S. et al., Blood, 15 мая 2006 г.; 107 (10): 4039-46). Были описаны антитела против FGFR-3, которые ингибируют опосредованную лигандом активацию передачи сигнала через FGFR-3 и ингибируют опосредованный FGFR-3 рост опухоли (Trudel S. etal., Blood, 15 мая 2006 г.; 107 (10):4039-46). Были описаны антитела против FGFR-3, которые усиливают противоопухолевое действие цисплатина при введении в виде комбинированной терапии (Deevi, D. et al.,AACR, 21-24 октября 2007 г.; Wang, W. et al., EORTC, 22-26 октября 2008 г.). Тем не менее, в данной области существует потребность в антагонистическом антителе, которое обладает одним или несколькими из следующих свойств: оно высокоспецифично к обеим сплайсированным формам FGFR-3 (FGFR-3(IIIb) и FGFR-3(IIIc, оно интернализует FGFR-3 и предпочтительно также вызывает деградацию FGFR-3(IIIb) и FGFR-3(IIIc) или их мутантных форм, и оно усиливает терапевтическую эффективность и обращает химиорезистентность при применении в комбинации с химиотерапевтическим цитотоксическим средством. Дополнительно, указанное антитело предпочтительно также активно по отношению к мутантным формам FGFR-3, блокирует связывание FGF-лигандов с FGFR-3, ингибирует индуцированную лигандом передачу сигнала через FGFR-3, ингибирует опосредованныеFGFR-3 клеточные активности или ингибирует рост опухоли in vitro и in vivo. Антитело согласно настоящему изобретению удовлетворяет указанные потребности. Указанное антитело высокоспецифично к обеим сплайсированным формам FGFR-3 (FGFR-3(IIIb) и FGFR-3(IIIc, интернализует FGFR-3 и, предпочтительно, также вызывает деградацию рецептора при связывании данного антитела с рецепторами FGFR-3 или мутантными формами рецептора в клетках, экспрессирующих данный рецептор, усиливает терапевтическую эффективность и обращает химиорезистентность при применении в комбинации с химиотерапевтическим цитотоксическим средством, а также указанное антитело активно по отношению к мутантным формам FGFR-3, блокирует связывание FGF-лигандов с FGFR-3,ингибирует индуцированную лигандом передачу сигнала через FGFR-3, ингибирует опосредованныеFGFR-3 клеточные активности и ингибирует рост опухоли in vitro и in vivo. Настоящее изобретение относится к изолированному антителу, которое специфично связывается сFGFR-3(IIIb) и FGFR-3(IIIc) человека. Предпочтительно указанное антитело представляет собой антитело человека, имеющее KD, равную приблизительно 110-8 М или менее при комнатной температуре (20-25 С). Предпочтительно указанное антитело специфично связывается с доменом 2 FGFR-3 человека (SEQID NO:12). Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению, которое специфично связывается сFGFR-3(IIIb) и FGFR-3(IIIc) человека, содержит гипервариабельный участок 1 тяжелой цепи (CDRH1),имеющий последовательность GYMFTSYGIS (SEQ ID NO:1), гипервариабельный участок 2 тяжелой цепи (CDRH2), имеющий последовательность WVSTYNGDTNYAQKFQG (SEQ ID NO:2), гипервариабельный участок 3 тяжелой цепи (CDRH3), имеющий последовательность VLGYYDSIDGYYYGMDVGGNNIGDKSVH (SEQ ID NO:4), гипервариабельный участок 2 легкой цепи (CDRL2), имеющий последовательность LDTERPS (SEQ ID NO:5), и гипервариабельный участок 3 легкой цепи (CDRL3), имеющий последовательность QVWDSGSDHVV (SEQ ID NO:6). Предпочтительно антитело может содержать последовательность аминокислот вариабельной облас-1 021584 и последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи Предпочтительно указанное антитело может содержать последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи или последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи Константную область тяжелой цепи антитела можно получить из IgG1 человека или из фрагмента антитела, который связывает FGFR-3. Предпочтительно указанное антитело содержит тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO:9 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO:10. Предпочтительно указанное антитело содержит тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO:9 и легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO:10 или связывающий FGFR-3 фрагмент антитела. Антитело может также содержать две тяжелые цепи с последовательностью SEQ ID NO:9 и две легкие цепи с последовательностью SEQ ID NO:10. Антитело может также содержать две тяжелые цепи с последовательностью SEQ ID NO:9 и две легкие цепи с последовательностью SEQ ID NO:10. Предпочтительно антитело содержит две тяжелые цепи с последовательностью SEQ ID NO:9 и две легкие цепи с последовательностью SEQ ID NO:10 или связывающий FGFR-3 фрагмент антитела. Антитело может содержать связывающий фрагмент, который способен нейтрализовать FGFR-3 человека. В предпочтительном аспекте настоящее изобретение направлено на изолированное антитело или фрагмент антитела, при этом указанное антитело конкурирует за связывание с внеклеточным доменомFGFR-3 в конкурентном твердофазном иммуноферментном анализе ELISA с конкурирующим антителом,при этом указанное конкурирующее антитело связывает FGFR-3 с KD, равной приблизительно 110-8 М или менее при комнатной температуре (20-25 С). Настоящее изобретение дополнительно относится к антителу, которое связывается с мутантными формами FGFR-3. Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или фрагмент антитела и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Настоящее изобретение также относится к продукту, включающему антитело или фрагмент антитела и дополнительное противораковое средство для комбинированного лечения для одновременного, раздельного или последовательного применения в терапии. В другом аспекте настоящего изобретения указанные антитело или фрагмент антитела предназначены для применения в качестве лекарственного средства. В другом аспекте настоящего изобретения указанные антитело или фрагмент антитела предназначены для применения для лечения рака. В другом аспекте настоящего изобретения указанные антитело или фрагмент антитела применяют в качестве лекарственного средства для лечения рака, когда рак представляет собой рак мочевого пузыря или множественную миелому. В другом аспекте настоящего изобретения указанные антитело или фрагмент антитела применяют для лечения рака совместно с другим средством. Антитело или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению можно вводить пациенту одновременно, раздельно или последовательно с эффективным количеством другого средства. Настоящее изобретение может включать фармацевтическую композицию,содержащую соединение совместно с фармацевтически приемлемым носителем и возможно другими терапевтическими ингредиентами. Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака у пациента, включающему введение указанному пациенту эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению. Рак может представлять собой рак мочевого пузыря или множественную миелому. В другом аспекте настоящее изобретение включает способ лечения рака у пациента, включающий одновременное, раздельное или последовательное введение пациенту эффективного количества антитела согласно настоящему изобретению и другого средства. Другое средство может представлять собой цисплатин. Соответственно, антитело согласно настоящему изобретению связывается природными и мутант-2 021584 ными формами FGFR-3 и индуцирует деградацию FGFR-3, оно способно ингибировать опухоли путем воздействия на опухолевые клетки, а также компоненты стромы, и имеет большое терапевтическое значение для лечения рака. Термин "антитело" включает молекулы иммуноглобулина, содержащие четыре полипептидные цепи, две идентичные тяжелые цепи (Н) и две идентичные легкие цепи (L), связанные друг с другом дисульфидной связью. Отдельные цепи могут образовывать домены, имеющие сходные размеры (110-125 аминокислот) и структуры, но различные функции."Изолированное антитело" представляет собой антитело, которое (1) было частично, в существенной степени или полностью очищено от смеси компонентов; (2) было идентифицировано и отделено и/или извлечено из компонентов его природного окружения; (3) является моноклональным; (4) свободно от других белков того же вида; (5) экспрессируется клеткой отличного вида животного или (6) не встречается в природе. Контаминирующие компоненты природного окружения представляют собой материалы, которые будут препятствовать диагностической или терапевтической пользе антитела и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. Примеры изолированных антител включают антитело, которое подвергли афинной очистке, антитело, которое было получено из гибридомной или другой линии клеток in vitro, или антитело человека, полученное из трансгенной мыши. Термин "моноклональное антитело" в данном изобретении относится к антителу, полученному из популяции, по существу, гомогенных антител, например отдельные антитела, составляющие указанную популяцию, по существу, идентичны за исключением возможных встречающихся в природе мутаций или незначительных посттрансляционных модификаций, которые могут у них присутствовать. Моноклональные антитела высокоспецифичны, направлены против одного антигенного сайта (также известного как детерминанта или эпитоп). Более того, в противоположность препаратам обычных (поликлональных) антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант,каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Определение"моноклональное" указывает на характер антитела, как полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и оно не должно рассматриваться как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Термин "антитело человека" в данном изобретении включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие последовательностям иммуноглобулинов зародышевой линии человека, описанным у Kabat et al., Chothia et al., и Martin, выше. Антитело человека согласно настоящему изобретению может содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулинов зародышевой линии человека (например, мутации, введенные неспецифическим или сайт-направленным мутагенезом in vitro или посредством соматической мутации in vivo), например, в областях, определяющих комплементарность (гипервариабельных участках). Антитело человека может иметь по меньшей мере одно положение, в котором присутствует с заменой аминокислотного остатка,например, на усиливающий активность аминокислотный остаток, которая не кодируется последовательностью иммуноглобулина зародышевой линии человека. Тем не менее, не предполагается, что в данном изобретении термин "антитело человека" включает антитела, в которых последовательности гипервариабельного участка, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мышь,были привиты на каркасные последовательности человека. Формулировка "рекомбинантное антитело человека" включает антитела человека, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью рекомбинантных способов, таких как, например, антитела, экспрессированные с применением рекомбинантного вектора экспрессии, которым трансфицировали клетку-хозяина, антитела, выделенные из комбинаторной библиотеки рекомбинантных антител человека, антитела, выделенные из животного, которое является трансгенным в отношении генов иммуноглобулина человека, или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, которые включают сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулинов человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Легкая цепь может содержать один вариабельный домен (сокращенно обозначенный в данном изобретении VL) и/или один константный домен (сокращенно обозначенный в данном изобретении CL). Легкие цепи антител представляют собой либо легкие цепи каппа , либо легкие цепи лямбда . Ссылка на VL в данном изобретении предполагается включающей вариабельные участки как из легких цепей типа каппа (V), так и из легких цепей типа лямбда (V). Тяжелая цепь также может содержать один вариабельный домен (сокращенно обозначенный в данном изобретении VH) и/или, в зависимости от класса или изотипа антитела, три или четыре константных домена (CH1, CH2, СН 3 и СН 4). У человека изотипы представляют собой IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, при этом IgA и IgG дополнительно подразделяются на субклассы или субтипы (IgA1-2 и IgG1-4). Настоящее изобретение охватывает антитела, принадлежащие к любым из упомянутых выше клас-3 021584 сов или субклассов. IgG человека представляет собой предпочтительный изотип антитела согласно настоящему изобретению. В каждом из VL и VH находятся три участка, названных гипервариабельными или определяющими комплементарность участками (CDR), которые окружены менее вариабельными участками, названными каркасными участками (сокращенно обозначенными в данном изобретении FR). Аминокислоты относят к конкретному гипервариабельному участку или домену в соответствии с условным обозначением Rabat (Rabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382-93 (1971); Rabat, et al., SequencesSequence Database by Computer PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133.) Каждый VH и VL состоит из трех гипервариабельных участков и четырех FR, расположенных в направлении от аминоконца к карбоксильному концу в следующем порядке: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3CDR3-FR4. Часть антитела, состоящая из доменов VL и VH, обозначается как Fv (вариабельный фрагмент) и образует сайт связывания антигена. Одноцепочечный Fv (scFv) представляет собой фрагмент антитела, содержащий домен VL и домен VH в виде одной полипептидной цепи, при этом N-конец одного домена и С-конец другого домена соединены гибким линкером (см., например, патент США 4946778 (Ladner et al.), WO 88/09344 (Huston et al Фрагменты обладают характеристиками связывания такими же или сравнимыми с характеристиками для целого антитела. Подходящие фрагменты антитела включают любой фрагмент, который содержит часть гипервариабельного (т.е. определяющего комплементарность) участка, достаточную для специфичного связывания, и имеет достаточную аффинность, чтобы ингибировать рост клеток. Такие фрагменты могут включать, например, один или оба Fab-фрагмента или F(ab')2-фрагмент. Предпочтительно фрагменты антитела содержат все шесть гипервариабельных участков целого антитела, хотя функциональные фрагменты, содержащие не все такие участки, как, например, три, четыре или пять гипервариабельных участков, также включены. Предпочтительные фрагменты представляют собой одноцепочечные антитела, или Fv-фрагменты. Более предпочтительные фрагменты представляют собой двухвалентные фрагменты. Одноцепочечные антитела представляют собой полипептиды, которые содержат, по меньшей мере, вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи, с соединяющим их друг с другом линкером или без него. Таким образом, Fv-фрагменты включают весь антигенсвязывающий активный центр антитела. Данные цепи можно получить в бактериях или в эукариотических клетках.Fab (антигенсвязывающий фрагмент) относится к фрагментам антитела, состоящим из доменов VL,CL, VH, CH1. Фрагменты, полученные после расщепления только папаином называют Fab, и в них не сохраняется шарнирная область тяжелой цепи. После расщепления пепсином получаются различныеFab-фрагменты, в которых сохраняется шарнирная область тяжелой цепи. Фрагменты, в которых дисульфидные связи между цепями остались интактными, называют F(ab')2, тогда как отдельный Fab'фрагмент получают, когда дисульфидные связи не сохраняются. F(ab')2-фрагменты обладают более высокой авидностью к антигену, чем моновалентные Fab-фрагменты.Fc (фрагмент, способный к кристаллизации) обозначает часть или фрагмент антитела, который включает парные константные домены тяжелой цепи. В антителе класса IgG, например, Fc содержит домены СН 2 и СН 3. Fc антител класса IgA или IgM дополнительно содержит домен СН 4. Fc ассоциирован со связыванием Fc-рецептора, активацией комплемент-опосредованной цитотоксичности и антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). В антителах, таких как антитела классаIgA и IgM, которые представляют собой комплексы множества IgG-подобных белков, для образования комплекса требуются константные домены Fc. Шарнирная область отделяет Fab- и Fc-области антитела, обеспечивает при этом подвижность Fabфрагментов относительно друг друга и относительно Fc, а также включает множество дисульфидных связей для ковалентного связывания двух тяжелых цепей. Таким образом, антитело согласно настоящему изобретению включает, но не ограничено ими, природные антитела, антитела человека, рекомбинантные антитела человека, моноклональные антитела,расщепленные фрагменты, двухвалентные фрагменты, такие как (Fab')2, моновалентные фрагменты, такие как Fab, одноцепочечные антитела, одноцепочечные Fv (scFv), однодоменные антитела, поливалентные одноцепочечные антитела, бивалентные одноцепочечные вариабельные фрагменты антител (diabodies), тривалентные одноцепочечные вариабельные фрагменты антител (triabodies) и т.п., которые специфично связываются с антигенами. Антитело согласно настоящему изобретению специфично к FGFR-3. Специфичность антитела означает селективное узнавание указанным антителом конкретного эпитопа антигена. Антитело может проявлять как селективность к определенному виду, так и к определенной молекуле, или может быть селективным только по отношению к молекуле и связываться с FGFR-3 более чем одного вида. Антитело согласно настоящему изобретению может связываться с FGFR-3 человека, мыши, крысы, собаки и/или кролика. Предпочтительно указанное антитело связывается с FGFR-3 человека. Были разработаны такие форматы антител, которые сохраняют специфичность связывания, но которые также проявляют другие свойства. Антитело согласно настоящему изобретению, например, может быть моноспецифичным, биспецифичным или полиспецифичным. Биспецифичные антитела (BsAb) представляют собой антитела, которые проявляют две различные специфичности связывания антигена или имеют два антигенсвязывающих сайта. Полиспецифичные антитела проявляют более чем две различные специфичности связывания антигена или содержат более чем два антигенсвязывающих сайта. Если антитело проявляет более чем одну специфичность, узнаваемые эпитопы могут принадлежать одному антигену или более чем одному антигену. Специфичность антител к FGFR-3 можно определить на основании аффинности и/или авидности. Аффинность, представленная константой равновесия для диссоциации антигена от антитела (KD), представляет собой меру силы связывания между антигенной детерминантой и сайтом связывания на антителе. Авидность представляет собой меру силы связывания между антителом и антигеном. Авидность связана как с аффинностью между эпитопом и сайтом связывания антигена на молекуле антитела, так и с валентностью антитела, которая представляет собой количество сайтов связывания антигена для конкретного эпитопа. Антитела обычно связываются с константой диссоциации (KD), равной от приблизительно 10-5 до приблизительно 10-11 моль/л (например, KD100 М). Любую KD, большую чем приблизительно 10-4 моль/л, как правило, считают показателем неспецифичного связывания: чем меньше значение KD, тем сильнее связывание между антигенной детерминантой и сайтом связывания на антителе. В некоторых аспектах антитело согласно настоящему изобретению связывается с FGFR-3 с KD,предпочтительно равной приблизительно 110-8 М или менее, более предпочтительно приблизительно 110-9 М или менее, более предпочтительно приблизительно 110-10 М или менее и наиболее предпочтительно приблизительно 110-11 M или менее. См. табл. 1. Таблица 1 Аффинности связывания антитела 1 со сплайсированными вариантами FGFR-3 человека и мыши В некоторых аспектах антитело согласно настоящему изобретению предпочтительно имеет KD,равную от приблизительно 5,010-10 до приблизительно 1,510-11 М, от приблизительно 1,010-10 до приблизительно 1,010-11 М или от приблизительно 1,510-11 до приблизительно 7,510-10 М. В данном изобретении термины "блокирует связывание" и "ингибирует связывание" применяются взаимозаменяемо и относятся к блокированию/ингибированию связывания цитокина с рецептором, что приводит к полному или частичному ингибированию или снижению биологической функции сигнального пути цитокина/рецептора. Блокирование/ингибирование связывания FGF с FGFR-3 оценивают путем измерения полного или частичного ингибирования или уменьшения одного или нескольких показателей активности FGF in vitro или in vivo, таких как связывание с рецептором, ингибрующее воздействие на клеточный рост, хемотаксис, апоптоз, внутриклеточное фосфорилирование белка или передача сигнала. Способность блокировать связывание FGF с FGFR-3 можно измерить с помощью ELISA, как описано в данном изобретении. Антитело согласно настоящему изобретению представляет собой антагонист, который блокирует рецептор FGFR-3, при индуцированной лигандом активации живых клеток. Анализы на связывание можно осуществить, применяя целый ряд способов, известных в данной области, включающих, но не ограниченных ELISA. В данном изобретении формулировка "конкурирует за связывание" относится к случаю, когда антитело уменьшает связывание или передачу сигнала по меньшей мере на приблизительно 20, 30, 50, 70 или 90%, что измеряют с помощью способа, доступного в данной области,например, с помощью конкурентного ELISA или путем измерения KD с помощью BIAcore, при этом не предполагается, что антитело полностью предотвращает связывание. Последовательность аминокислот тяжелой цепи показана в SEQ ID NO:9. Последовательность аминокислот легкой цепи показана в SEQ ID NO:10. В другом аспекте антитело согласно настоящему изобретению содержит одну, две, три, четыре, пять или все шесть гипервариабельных областей любого из гипервариабельных участков антитела 1. Антитело согласно настоящему изобретению также включает такие антитела, свойства связывания которых были улучшены путем направленной мутации, с помощью способов созревания аффинности,фагового дисплея или перетасовки цепей. Аффинность и специфичность можно модифицировать или улучшить путем мутирования остатков гипервариабельной области и/или каркасных остатков и скрининга сайтов связывания антигена, обладающих желательными свойствами (см., например, Yang et al., J.Mol. Biol. 254:392-403 (1995. Одним способом является неспецифический мутагенез отдельных остатков или комбинаций остатков таким образом, что в популяции в противном случае идентичных сайтов связывания антигена обнаруживаются в определенных положениях подгруппы от двух до двадцати от-5 021584 личных аминокислот. В качестве альтернативы, мутации в ряде остатков можно осуществить с помощью способов ошибочно-направленной ПЦР (см., например, Hawkins et al., J. Mol. Biol. (1992), 226:889 96). В другом примере, векторы для фагового дисплея, содержащие гены вариабельной области тяжелой и легкой цепи, можно репродуцировать в мутаторных штаммах Е.coli (см., например, Low et al., J. Mol. Biol. 250:359 68 (1996. Процесс селекции in vitro затем можно подходящим способом применять для скрининга таких дополнительных последовательностей аминокислот вариабельной области для обнаружения Fabфрагментов, обладающих заявленной перекрестной реактивностью in vitro. Таким образом, были идентифицированы дополнительные Fab-фрагменты, которые подходят для получения гуманизированного антитела в соответствии с настоящим изобретением. Предпочтительно замена аминокислот в каркасных областях ограничена одним, двумя или тремя положениями в пределах одной или каждой из каркасных последовательностей, описанных в данном изобретении. Предпочтительно замена аминокислот в пределах гипервариабельных участков ограничена одним-тремя положениями в пределах одного или каждого гипервариабельного участка, более предпочтительно осуществляют замену аминокислот в одном или двух положениях в пределах одного или каждого гипервариабельного участка. Дополнительно предпочтительно, чтобы замена аминокислот осуществлялась по одному или двум положениям аминокислот в гипервариабельных участках вариабельной области тяжелой цепи. Подходящая методика комбинирования замен в гипервариабельной области и каркасе для получения альтернативных антител согласно настоящему изобретению с применением антитела, описанного в данном изобретении в качестве исходного антитела, приведена в Wu et al., J. Mol. Biol., 294:151-162. Антитело согласно настоящему изобретению можно получить с помощью способов, известных в данной области. Данные способы включают иммунологические способы, описанные у Kohleer и Milstein в Nature 256:495-497 (1975) и Campbell в "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas", у Burdon et al., ред., Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology, том 13, Elsevier Science Publishers, Амстердам (1985); а также способ рекомбинантной ДНК, описанный у Huse et al., в Science 246:1275-1281 (1989). Антитела человека также можно получить, применяя различные методики, известные в данной области, включая библиотеки фагового дисплея (Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Markset al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991. Методики, описанные в Cole et al., и Boemer et al., также доступны для получения моноклональных антител человека (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, AlanR. Liss, с. 77 (1985) и Boemer et al., J. Immunol. 147(1):86-95 (1991. Антитело согласно настоящему изобретению, секретированное субклонами, можно выделить или очистить из культуральной среды или перитонеальной жидкости с помощью обычных процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, белок А-сефароза, гидроксиапатитовая хроматография, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. Последовательность нуклеиновых кислот, которая кодирует антитело согласно настоящему изобретению, получают с помощью стандартных способов молекулярной биологии. Настоящее изобретение также включает клетки-хозяева для их трансформирования векторами и экспрессии антител. Предпочтительные клетки-хозяева включают клетки млекопитающих, такие как клетки миеломы мыши NSO (несекретирующие (о, клетки 293 и СНО и другие линии клеток лимфоидного происхождения, такие как клетки лимфомы, миеломы или гибридомные клетки. Можно использовать другие эукариотические хозяева, такие как дрожжи. Известны векторы для экспрессии белков в бактериях, особенно в Е.coli. Такие векторы включают векторы PATH, описанные у Dieckmann и Tzagoloff in J. Biol. Chem. 260:1513-1520 (1985). Данные векторы включают последовательности ДНК, которые кодируют антранилатсинтетазу (TrpE), за которой на карбоксильном конце следует полилинкер. Другие векторные системы экспрессии основаны на бетагалактозидазе (рЕХ); лямбда PL; связывающем мальтозу белке (pMAL) и глутатион-S-трансферазе(pGST). См. Gene 67:31 (1988) и Peptide Research 3:167 (1990). Доступны векторы, подходящие для экспрессии в дрожжах. Подходящий пример представляет собой плазмиду лямбда ZAP. Также известны подходящие векторы для экспрессии в клетках млекопитающих. Такие векторы включают хорошо известные производные SV-40, аденовируса, полученные из ретровируса последовательности ДНК и челночные векторы, полученные из комбинации функциональных векторов млекопитающих, таких как описанные выше, и функциональные плазмиды и фаговую ДНК. Векторы, подходящие для настоящего изобретения, содержат по меньшей мере один регуляторный элемент, который связан с последовательностью или фрагментом ДНК, который нужно экспрессировать. Указанный регуляторный элемент вставляют в вектор, чтобы контролировать и регулировать экспрессию клонированной последовательность ДНК. После экспрессии в клетке-хозяине, культивированной в подходящей среде, полипептид, который нужно экспрессировать, можно получить из среды и очистить с помощью способов, известных в данной области. Если полипептид или пептид не секретируется в культуральную среду, клетки-хозяева лизируют перед выделением и очисткой. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую антитело, нуклеиновую кислоту, вектор или клетку-хозяина согласно настоящему изобретению совместно с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или разбавителем. Фармацевтическая композиция может включать дополнительное терапевтическое средство. Указанное дополнительное средство может представлять собой химиотерапевтическое средство, например, цисплатин. Термин "носитель" при использовании в данном изобретении включает фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или стабилизаторы, которые нетоксичны в используемых дозировках и концентрациях для клетки или млекопитающего, которое подвергают их действию. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный рН-буферный раствор. В другом аспекте настоящего изобретения антитела против FGFR-3 или фрагменты антител могут быть соединены химическим или биосинтетическим способом с противоопухолевыми средствами или детектируемыми генерирующими сигнал средствами, особенно когда антитело интернализуется. Антитело к FGFR-3 может ингибировать активацию рецептора (фосфорилирование FGFR-3), а также активацию молекул, расположенных ниже по пути передачи сигнала, включая фосфорилированную MAPK и фосфорилированную АКТ в некоторых раковых клетках, таких как раковые клетки мочевого пузыря, что приводит к ингибированию способности клеток пролиферировать. Антитело согласно настоящему изобретению может связываться с природным FGFR-3 или с его сплайсированными формами или мутантами. Формулировка "сплайсированные формы" FGFR-3 обозначает формы экзонов, кодирующих третий IgG-подобный домен FGFR-3, названные FGFR-3(IIIb) и FGFR3(IIIc). Мутантный FGFR-3 включает такие формы рецептора, которые были изменены в результате репликации ДНК или ошибок трансляции. Мутации могут представлять собой мутации с приобретением функций, которые повышают активность мутантных рецепторов с помощью механизмов, таких как конститутивная активация, увеличенное время полужизни и повышенная чувствительность к лиганду. Антитело согласно настоящему изобретению может связываться с доменом 2 FGFR-3 дикого типа(SEQ ID NO:12). Остаток аргинина в положении 173 последовательностей FGFR-3 человека и мыши не обнаруживается в других членах семейства, что позволяет предложить, что этот остаток, вероятно, отвечает за специфичность антитела 1 к FGFR-3. Антитело согласно настоящему изобретению вызывает деградацию FGFR-3. Деградация означает расщепление рецептора таким образом, что он больше не может осуществлять функцию передачи сигнала. Антитело согласно настоящему изобретению может нейтрализовать активацию FGFR-3. Нейтрализация рецептора означает инактивирование свойственной рецептору киназной активности, необходимой для передачи сигнала. Нейтрализация, например, может произойти в результате блокирования антителом доступа некоторых эпитопов к лиганду или в результате изменения конформации FGFR-3 некоторым способом, благодаря чему лиганд, особенно FGF, не может активировать рецептор, даже если он может связаться с рецептором. Понижающая регуляция может осуществляться, когда на поверхности клеток,которые экспрессируют FGFR-3, снижается количество рецепторов FGFR-3, например, в результате стимулировании интернализации или деградации рецептора, или ингибировании экспрессии FGFR-3. Следовательно, нейтрализация приводит к различным эффектам, включая ингибирование, уменьшение,инактивирование и/или нарушение роста (пролиферации и дифференцировки), ангиогенеза (возникновения кровеносных сосудов, прорастания и метастазирования), подвижности клеток и метастазирования(адгезии клеток и инвазивности). Одной мерой нейтрализации FGFR-3 является ингибирование тирозин-киназной активности рецептора. Ингибирование тирозинкиназы можно определить, применяя хорошо известные способы; например, путем измерения уровня аутофосфорилирования рекомбинантного рецептора с киназной активностью и/или фосфорилирования природных или синтетических субстратов. Таким образом, анализ фосфорилирования полезен для определения нейтрализующих антител в контексте настоящего изобретения. Фосфорилирование можно обнаружить, например, применяя антитело, специфичное к фосфотирозину, в анализе способом ELISA или на вестерн-блоте. Некоторые анализы на тирозинкиназную активность описаны у Panek et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 283:1433-44 (1997) и Batley et al., Life Sci. 62:143-50 (1998). Дополнительно, антитело согласно настоящему изобретению может ингибировать передачу сигнала самими опухолевыми клетками, так как многие опухолевые клетки содержат FGFR-3 на своей поверхности. Антитело согласно настоящему изобретению можно применять для лечения млекопитающего, нуждающегося в этом. "Лечение" заболевания означает ингибирование заболевания, купирование или задержку его развития; ослабление заболевания или ослабление выраженности симптомов заболевания. Антитело и композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения рака. Рак может представлять собой рефракторный рак или впервые возникший рак. Виды рака включают, но не ограничены перечисленными, рак мозга, легких, плоскоклеточный рак, рак мочевого пузыря, желудочнокишечного тракта, поджелудочной железы, груди, головы, шеи, почечно-клеточный рак, рак почки, яичников, предстательной железы, толстой кишки, колоректальный рак, рак пищевода, гинекологический рак (овариальный, эндометриальный), рак предстательной железы, желудка или щитовидной железы,лейкоз и лимфому. Дополнительно, виды рака, которые можно лечить антителом и композициями со-7 021584 гласно настоящему изобретению, включают множественную миелому, колоректальную карциному, саркому Юинга, хориокарциному. Введение осуществляют любым подходящим путем введения, включая инъекцию, инфузию, пероральный, парентеральный, подкожный, внутримышечный или внутривенный пути введения. Способ лечения, описанный в данном изобретении, можно осуществить, применяя совместное введение антитела с другим лекарственным средством, таким как противоопухолевые средства. Противоопухолевое лекарственное средство может включать малые органические молекулы. Примеры таких малых органических молекул включают цитотоксические и/или химиотерапевтические средства, такие как таксол, доксорубицин, актиномицин-D, цисплатин, метотрексат, иринотекан (СРТ-111), гемцитабин, оксиплатин, фторурацил (5-FU), лейковорин (LU), цисплатин, паклитаксел, доцетаксел, винбластин, эпотилон, цисплатин/карбоплатин и пегилированный адриамицин. Предпочтительное лечение согласно настоящему изобретению представляет собой введение антитела совместно с цисплатином. Противоопухолевое средство также может представлять собой облучение, источник облучения может быть либо внешним (дистанционная лучевая терапия - EBRT), либо внутренним (брахитерапия - ВТ) по отношению к пациенту, которого лечат. Доза вводимого антибластомного средства зависит от множества факторов, включая, например, тип средства, тип и тяжесть опухоли, от которой лечат, и путь введения средства. Настоящее изобретение не ограничено какой-либо конкретной дозой. Введение антител к FGFR-3 совместно с другими антителами и/или способами лечения можно осуществлять одновременно или раздельно, одним и тем же или различными путями, в один и тот же или различные моменты времени. Дополнительно, антитело можно конъюгировать с одним или несколькими другими средствами для введения. Способы лечения, описанные в данном изобретении, можно применять для лечения любого подходящего млекопитающего, включая приматов, таких как обезьяны и люди, лошадей, коров, котов, собак,кроликов и грызунов, таких как крысы и мыши. Предпочтительно млекопитающее, которое нужно лечить, представляет собой человека. Примеры Следующие примеры предложены исключительно в качестве иллюстрации и не предполагаются каким-либо образом ограничивающими объем настоящего изобретения. Приведенные примеры не включают подробные описания обычных способов, которые используют для конструирования векторов и плазмид, вставки генов, кодирующих полипептиды, в такие векторы и плазмиды или введения плазмид в клетки-хозяева. Такие способы хорошо известны средним специалистам в данной области и описаны во множестве публикаций, включая Sambrook, J., Fritsch, E.F. и Maniatis, Т. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е издание, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Пример 1. Получение специфичного к FGFR-3 антагонистического антитела. Рекомбинантный FGFR-Fc человека, рекомбинантный FGF человека, синтезированные на заказ праймеры, рестрикционные ферменты и ДНК-полимеразы можно получить от поставщиков или получить известными способами. Библиотеку интактных Fab человека в бактериофагах подвергали пэннингу против внеклеточного домена FGFR-3 человека с помощью пробирок, покрытых 10 мкг рекомбинантных белков внеклеточного домена FGFR-3(IIIc)-(ECD)-Fc - согласно опубликованным протоколам пэннинга. Удержанные в процессе пэннинга фаги элюировали, и такими удержанными фагами инфицировали бактериальные клеткихозяева. Собирали фаги, продуцированные клетками-хозяевами. Повторяли описанные выше процедуры еще один раз. Переносили отдельные колонии инфицированных клеток-хозяев в 96-луночные планшеты,содержащие 100 мкл/лунку 2YTAG, и растили фаги в присутствии 10 мкл M13KO7 фага-помощника(51010 бляшкообразующих единиц/мл). Инкубировали планшеты при 37 С в течение 30 мин без встряхивания, а затем 30 мин при встряхивании (100 об/мин). Получали осадки клеток путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 10 мин, ресуспендировали в 200 мкл 2YTAK и инкубировали при 30 С при встряхивании (100 об/мин) в течение ночи. Центрифугировали планшеты при 2500 об/мин в течение 10 мин. Переносили супернатанты в чистые планшеты и смешивали с 6 блокирующим буфером (18% молоко/ФБР) в течение 1 ч. Фаговые клоны подвергали скринингу, используя анализы связывания и блокирования ELISA, описанные ниже. Отбирали клоны фагов, которые связываются с FGFR-3(IIIb) илиFGFR-3(IIIc), затем из этой совокупности отбирали такие клоны, которые блокируют связывание рецепторов с лигандом FGF-1. Определяли последовательности ДНК клонов, которые как связываются, так и блокируют рецептор, с помощью стандартных методик секвенирования. Сохраняли каждую уникальную последовательность ДНК, и соответствующий фаговый клон обозначали как фаг-кандидат, блокирующий FGFR-3. Из данных фагов-кандидатов получали растворимые Fab. Повторяли анализы связывания и блокирования ELISA, используя очищенные Fab, чтобы подтвердить блокирующую активность. На основе подтвержденных блокаторов Fab разрабатывали полноразмерные антитела путем клонирования гипервариабельных участков (SEQ ID NO:1-6) в каркас IgG1 человека согласно опубликованным методикам. Анализ связывания ELISA применяли для определения связывания антитела 1 с рекомбинантны-8 021584 ми растворимыми белками внеклеточного домена FGFR-1(IIIb), FGFR-1(IIIc), FGFR-2(IIIb), FGFR-2(IIIc) и FGFR-4. Отбирали антитела, которые проявили высокую аффинность связывания как с "b", так и с "с" сплайсированными формами FGFR-3, но низкую аффинность связывания с другими рецепторами FGFR. Пример 2. Антитело 1. Антитело 1 можно получить путем биосинтеза в подходящей системе экспрессии млекопитающего,с применением хорошо известных способов, и полученное антитело можно очистить с помощью хорошо известных способов. Последовательности аминокислот для антитела 1 приведены ниже. Таблица 2 Способы анализа Анализ связывания ELISA. Рекомбинантные FGFR наносили на 96-луночные планшеты при концентрации 1 мкг/мл в ФБР при комнатной температуре в течение 2 ч. Промывали планшеты 3 раза 0,2% Tween-20/ФБР и блокировали в 5% молоке/ФБР в течение 2 ч перед использованием. В планшет добавляли фаги, Fab или антитела и делали серию разведений в 0,2% Tween-20/ФБР. Инкубировали планшет при комнатной температуре в течение дополнительных 2 ч. Захваченные молекулы детектировали, применяя подходящее доступное для приобретения вторичное антитело, согласно рекомендациям поставщика. Анализ блокирования ELISA. Рекомбинантные FGF наносили на микротитрационные планшеты Immulon 2B (ThermoLab Systems, Франклин, Массачусетс) при концентрации 0,5-2 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре. Промывали планшеты 0,2% Tween-20/ФБР и блокировали в 5% молоке/ФБР в течение 2 ч перед использованием. Делали серию разведений фагов, Fab или антител в 5 мкг/мл гепарина, 5% молока, ФБР. Добавляли растворимые рекомбинантные белки ECD (внеклеточного домена) FGFR-3(IIIb) или (IIIc), меченные с Fc, до конечной концентрации 1 мкг/мл. Инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 1 ч перед тем, как перенести на покрытые FGF-1 планшеты, и инкубировали при комнатной температуре в течение дополнительных 2 ч. Планшеты промывали 3 раза 0,2% Tween-20/ФБР. Связавшиеся рецепторы детектировали, используя раствор моноклонального антитела против Fc человека, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP), полученный согласно инструкциям поставщика. Активность блокирования приводила к уменьшению сигналов. Аффинность связывания антитела 1 с FGFR-3(IIIb) и FGFR-3(IIIc) человека и мыши. Кинетику связывания антитела с FGFR-3(IIIb) и (IIIc) определяли, используя биосенсор BiaCore 3000 (BiaCore, Inc., Пискатавэй, Нью-Джерси), при комнатной температуре, следуя стандартным протоколам, предложенным производителем. Краткое описание результатов, приведенное в таблице 1, указывает на то, что антитело связывается с обеими сплайсированными формами b и с FGFR-3 человека, а также перекрестно взаимодействует в полной мере с рецептором FGFR-3(IIIc) мыши с аффинностью менее чем 10-9 М. Специфичность антитела 1 к связанному с мембраной FGFR-3. кДНК FGFR-3(IIIc) мыши клонировали в вектор экспрессии рВАВЕ, содержащий селективный маркер - ген устойчивости к пуромицину. Осуществляли ретровирусную экспрессию полученных плазмид в клетках L6. Клетки подвергали селекции и культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS и 2 мкг/мл пуромицина. Суспендировали клетки L6, экспрессирующие FGFR-3, в 1% БСА/ФБР. Добавляли антитело 1 до конечных концентраций 1-30 мкг/мл. После одночасового инкубирования на льду клетки промывали 1% БСА/ФБР и инкубировали с подходящим вторичным детектирующим антителом или Fab-фрагментами в том же буфере в течение 1 ч на льду. Контрольные образцы окрашивали только вторичным антителом. Все образцы анализировали,-9 021584 применяя проточный цитометр FACSvantage SE (BD Biosciences). Антитело 1 оказалось специфичным кFGFR-3, о чем свидетельствовали сигналы положительного окрашивания только для клеток, трансфицированных FGFR-3 (R3-L6), но не для исходных клеток L6, отрицательных по FGFR-3. Эмбриональные клетки почки человека (HEK) 293, 293fectin, среду Freestyle 293 и среду OptiMEM можно приобрести у Invitrogen (Карлсбад, Калифорния). Среды для аффинной очистки на белке-А можно приобрести у GE Healthcare. Разработали конструкцию ДНК для FGFR(IIIb)-Fc. Получение FGFR-3(IIIb)-Fc, FGFR-3(IIIb)-Fc с укороченными Ig-доменами и мутантов FGFR3(IIIb)-Fc с заменой одного остатка на аланин. Границы домена FGFR-3(IIIb) можно определить на основании трехмерной модели внеклеточного домена (ECD) FGFR-3(IIIb), a также известных кристаллических структур FGFR. Разработали пять укороченных конструкций ECD FGFR-3(IIIb), а именно D1 (25-148), D2 (149-245), D3 (250-372), D1-2 (25245) и D2-3 (149-372), наряду с D1-3 (25-372) FGFR-3(IIIb) дикого типа. Конструкции субклонировали в вектор pGS с Fc-меткой, встроенной в 3'-конец сайта множественного клонирования, и подтверждали последовательности. Двадцать остатков FGFR-3(IIIb) вблизи от предполагаемого участка связывания лиганда, а также остатки, вовлеченные в связывание гепарина и димеризацию рецептора, выбирали на основании известной модели ECD FGFR-3(IIIb) и структуры FGFR-3(IIIc). Мутанты с заменой одного остатка на аланин ECD FGFR-3(IIIb) получали с помощью перекрывающихся ПЦР, используя конструкцию с полноразмерным ECD FGFR(IIIb) в качестве матрицы, а затем субклонировали в вектор pGS-Fc. Мутанты с укороченным доменом и мутанты с заменой остатков на аланин временно экспрессировали в клетках 293 после трансфекции с применением 293fectin (Invitrogen). Культуральные супернатанты собирали через 6 дней после трансфекции и Fc, содержащие указанные белки, очищали путем пропускания через аффинную колонку с белком-А, буфер заменяли на ФБР, производили количественный анализ и оценивали с помощью анализа на электрофорезе в ПААГ/ДСН для подтверждения целостности конструкции. Среднемасштабный анализ связывания FGFR-3(IIIb)-Fc. Очищенный раствор антитела 1 разбавляли до концентрации 2 мг/мл в ФБР. Восстанавливали влагосодержание MSD Sulfo-TAG NHS-Ester (MesoScale Discovery, R91AN2), N-гидроксисукцинимидового эфира трис-бипиридин-рутения, с помощью холодной дистиллированной воды до концентрации 10 нмоль/мкл. Для реакции использовали молярное отношение MSD Sulfo-TAG NHS-Ester к антителу 1 12:1. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре с защитой от света в течение 2 ч. Непрореагировавший MSD Sulfo-TAG NHS-Ester удаляли от конъюгированного антитела 1, применяя обессоливающую смолу. Антитело 1, конъюгированное с рутением, хранили при -80 С. Концентрацию конъюгированного антитела 1 определяли, используя бычий сывороточный альбумин для построения стандартной кривой. Укороченный, мутантный FGFR-3(IIIb)-Fc или FGFR-3(IIIb)-Fc дикого типа разбавляли в фосфатносолевом буферном растворе (ФБР) до 5 мкг/мл. На стандартные 96-луночные планшеты наносили рецептор в концентрации 25 нг/лунку и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Для блокирования неспецифичного связывания в лунках, в каждую лунку добавляли 150 мкл 5% MSD Blocker A(MesoScale Discovery, R93Ba-1). Планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Блокирущий раствор удаляли и планшеты промывали пять раз 200 мкл ФБР, рН 7,4, 0,02% Tween-20. Серии трехкратных разведений (250-0,001 нм) меченного рутением антитела 1 добавляли в объем, равный 25 мкл, в трех повторениях для каждого тестируемого белка. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре при легком помешивании и защите от света свободное меченное рутением антитело удаляли с помощью еще пяти промывок в ФБР, рН 7,4, 0,02% Tween-20, 200 мкл на лунку. После этой промывки в каждую лунку добавляли 150 мкл 1 буфера для считывания (MesoScale Discovery,R92TC-2). При электрохимическом возбуждении рутениевая метка на связанном антителе испускала люминесцентное излучение на 620 нм. Сигналы электрохемилюминесценции (ECL) детектировали с помощью камеры на базе устройства с зарядовой связью (ПЗС-камеры) в планшет-ридере SECTOR Imager 2400 (MesoScale Discovery, 1250) и выражали в виде ECLU. Сигналы ECL наносили на график в программном обеспечении GraphPad Prism версии 5.0. Значения KD рассчитывали с помощью метода подгонки нелинейной кривой регрессии в функции программного обеспечения "один сайт специфичное связывание". Связывание меченного рутением антитела 1 с FGFR-3(IIIb)-Fc дикого типа использовали в качестве стандарта для анализа относительной аффинности связывания укороченных или мутантныхFGFR, которую наносили на график в виде процента от связывания дикого типа. Анализ связывания ELISA Mab B9. Лунки 96-луночного микротитрационного планшета ELISA покрывали в течение ночи 200 нг моноклонального антитела B9 против FGFR-3 (Santa Cruz sc-13121) в 100 мкл ФБР, рН 7,2, при легком помешивании при 4 С. После покрытия раствор антитела сливали и лунки блокировали 100 мкл фосфатносолевого буферного раствора с 0,1% Tween (ФБРТ) и 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 2 ч при комнатной температуре при легком помешивании. После блокирования лунки промывали 5 раз 200 мкл ФБРТ. Затем добавляли серии трехкратных разведений (100-0,006 нм) мутантного FGFR- 10021584 3(IIIb)-Fc или FGFR-3(IIIb)-Fc дикого типа в 100 мкл ФБРТ с 1% БСА в трех повторениях для каждого тестируемого белка и инкубировали при легком помешивании в течение 1 ч при комнатной температуре. Лунки снова промывали 5 раз 200 мкл ФБРТ. Разведенные 1:5000 в 100 мкл ФБРТ с 5% БСА IgG против антител мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), инкубировали в каждой лунке в течение 1 ч при комнатной температуре, при легком помешивании. Лунки промывали последние 5 раз 200 мкл ФБРТ, затем проявляли с помощью 100 мкл хромогенного субстрата для пероксидазы 3,3',5,5'тетраметилбензидина (ТМВ) в течение 5 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1 н. H2SO4 на лунку. Поглощение измеряли спектрофотометрически на 450 нм. Результаты считывания поглощения наносили на график в программном обеспечении GraphPad Prism версии 5.0. Значения KD рассчитывали с помощью метода подгонки нелинейной кривой регрессии в функции программного обеспечения "один сайт специфичное связывание". Связывание В 9 с FGFR-3(IIIb)-Fc дикого типа использовали в качестве стандарта для анализа относительной аффинности связывания укороченных или мутантных FGFR, которую наносили на график в виде процента от связывания дикого типа. Молекулярное моделирование FGFR-3(IIIb) человека. Для определения направления исследований мутагенеза создали трехмерную модель доменов 2 и 3ECD FGFR-3(IIIb), применяя SWISS-MODEL. Последовательности FGFR-3(IIIb) человека и FGFR3(IIIc) человека выравнивали, используя способ CLUSTALW, и модель сконструировали, используя рентгеновскую кристаллическую структуру FGFR-3(IIIc) в качестве шаблона (номер в банке данных белков 1RY7). Эпитоп антитела 1 содержится во втором иммуноглобулин-подобном (Ig) домене FGFR-3. Сайты связывания лиганда на рецепторах семейства FGFR содержатся в пределах трех N-концевыхIg-доменов, которые определяют внеклеточный домен (Chellaiah, et al., J. Biol. Chem. 1999, Dec. 3; 274(49): 34785-34794). Чтобы определить, который из трех Ig-доменов включает эпитоп антитела 1, получили набор укороченных доменов. Последовательности ДНК, кодирующие Ig-домены человека, укорачивали с получением различных форм и экспрессировали в виде гомодимерных слитых белков с Fc человека. Кодированные белки очищали из кондиционированного супернатанта временно трансфицированных клеток, и гомодимерную структуру каждого очищенного укороченного домена подтверждали с помощью ПААГ/ДСН. Затем проверяли связывание укороченных доменов с антителом 1 в среднемасштабном анализе связывания (Meso Scale Discovery, Гейтесбург, Мэриленд). Хотя антитело 1 не проявило детектируемого связывания с укороченными доменами D1 и D3, оно показало существенное связывание с укороченными доменами D1-2 и D2, что определили в среднемасштабном анализе связывания (Meso ScaleDiscovery, Гейтесбург, Мэриленд) и с помощью BIAcore (Pharmacia, Пискатавэй, Нью-Джерси). В 9 узнавало конформационно чувствительный эпитоп в домене 1 рецептора, следовательно, ожидали, что укороченные домены, содержащие домен 1, будут связывать антитело, если вся его структура не нарушена. Укороченные домены D1 и D1-2 проявили существенное связывание с контрольным Mab B9,что подтвердило структурную целостность этих двух белков, при определении в среднемасштабном анализе связывания (Meso Scale Discovery, Гейтесбург, Мэриленд) и с помощью BIAcore (Pharmacia,Пискатавэй, Нью-Джерси). Результаты связывания укороченных доменов выявили, что второго Igдомена FGFR-3 достаточно для связывания антитела 1, и таким образом, этот домен содержит остатки,важные для эпитопа. Определение аминокислот FGFR-3 в пределах эпитопа, узнаваемого антителом 1. Построили трехмерную модель доменов 2 и 3 ECD FGFR-3(IIIb) на основании кристаллической структуры FGFR-3(IIIc). На основании молекулярной модели и введения мутации с заменой одного остатка на аланин идентифицировали двадцать аминокислот (D160, K161, K162, L163, L164, V166, Р 167,Р 220, R223, D244, N170, Т 171, R158, R173, R175, K205, R207, L246, Е 247, S249) в пределах второго домена FGFR-3, расположенные поблизости или непосредственно вовлеченные в связывание лиганда, димеризацию рецептора или связывание гепарина. Определили последовательность домена 2 FGFR-3 дикого типа (SEQ ID NO:12). Каждую указанную аминокислоту по отдельности мутировали на аланин путем сайт-направленного мутагенеза и экспрессировали в контексте белка FGFR(IIIb)-Fc с целым ECD. Кодированные мутантные белки очищали из кондиционированного супернатанта, временно трансфицированных клеток, и подтверждали гомодимерную структуру каждого очищенного мутанта с помощью ПААГ/ДСН. Остаток считали важным для эпитопа, если его замена на аланин, описанная выше, приводила к существенной потере связывания с антителом 1. Все мутантные белки, которые проявили существенную потерю связывания, затем проверяли на связывание с Mab B9, чтобы проверить на наличие грубых изменений в общей структуре белка. Из 20 исследованных положений, замена аргинина на аланин в положении 173 (R173A) приводила к почти полной потере связывания с антителом 1 (снижение связывания 90% по сравнению с диким типом); тогда как при других заменах связывание сохранялось (снижение связывания 20% по сравнению с диким типом). Последующее тестирование показало, что связывание сMab B9 не нарушалось заменой R173A, что позволило предложить, что в положении 173 находится остаток, важный для специфичного узнавания рецептора антителом 1. Аффинность антитела 1 к мутантуR173A определяли с помощью анализа BIAcore. Связывание антитела 1 с мутантом R173A было в 7 раз хуже, чем аффинность указанного антитела к белку дикого типа. Сравнение последовательностей показало, что остаток аргинина в положении 173 последовательностей FGFR-3 человека и мыши отсутствует у других членов семейства, позволяя предположить, что этот остаток может отвечать за специфичность в отношении FGFR-3, проявляемую антителом 1. Антагонистическое антитело к FGFR-3 блокирует опосредованное FGFR-3(IIIb) и FGFR-3(IIIc) связывание FGF и передачу сигнала в клетке. Результаты указанного выше анализа блокирования ELISA показали, что антитело 1 блокирует связывание FGF-1/FGFR-3 с IC50 в диапазоне 1-10 нМ. Клетки L6, экспрессирующие FGFR-3, описанные выше, применяли для проверки активности данного антитела по отношению к передаче сигнала FGFR-3 в живых клетках. Экспрессирующие FGFR-3 клетки L6 переводили в состояние покоя в течение ночи в среде с очень низкой концентрацией сыворотки (0,1%). На следующий день клетки разделяли на пять образцов с одинаковым количеством клеток. Образцы 1 и 2 обрабатывали в течение 1 ч изотипически сходным неспецифичным контрольным антителом (200 нМ) и антителом 1 (200 нМ), соответственно. Образец 3 подвергали воздействию 0,6 нМ FGF-9 в течение 15 мин. Образцы 4 и 5 сначала обрабатывали в течение 1 ч изотипически сходным неспецифичным контрольным антителом (200 нМ) и антителом 1(200 нМ), соответственно, а затем подвергали воздействию 0,6 нМ FGF-9 в течение 15 мин. После таких обработок и воздействий, клетки лизировали и подвергали их электрофорезу в ПААГ/ДСН и вестернблотингу. Проверяли активацию FGFR-3 с помощью антитела к фосфотирозину. Антитело 1 отдельно ни ослабляло, ни усиливало сигналы активированного FGFR-3 и MAPK, а воздействие лиганда FGF-9 усиливало сигналы активированного FGFR-3 и MAPK в той же степени. Таким образом, данные результаты демонстрируют, что антитело 1 представляет собой антагонист, который блокирует рецептор FGFR-3 при индуцированной лигандом активации в живых клетках.FGFR-3 на поверхности клетки интернализуется при связывании с антителом 1. Антитело 1 запускает интернализацию FGFR-3, что является механизмом негативной модуляции передачи сигнала через данный рецептор. Чтобы это проверить, пометили указанное антитело коммерчески доступным красителем Alexa Fluor (Invitrogen) с целью проследить положение комплекса антитело 1/FGFR-3. Конъюгировали антитело 1 и изотипически сходное неспецифичное контрольное антитело с флуоресцентным красителем. Экспрессирующие FGFR-3 клетки L6 переводили в состояние покоя в течение ночи в среде с очень низкой концентрацией сыворотки (0,1%). Клетки разделяли на 8 образцов с одинаковым количеством клеток и высевали в лунки 6-луночного культурального планшета. Данные образцы подвергали трем различным процедурам: 1) связыванию, при котором клетки инкубировали с 1 мл 200 нМ конъюгированных антител в течение 1 ч при 4 С. Такая температура слишком низка для эндоцитоза, но благоприятна для взаимодействия антитело-антиген; 2) интернализации, при которой клетки инкубировали с 1 мл 200 нМ конъюгированных антител в течение 1 ч при 37 С. Эта температура позволяет эндоцитоз; 3) снятию антител, при котором клетки обрабатывали 1 мл 0,2 М глицина-0,15 М NaCl, pH 3, в течение 30 мин при 4 С. При таких условиях антитела, которые не интернализовались, не могут больше связываться с поверхностным рецептором и высвобождаются в среду. Восемь образцов трансфицированных FGFR-3 клеток L6 обрабатывали согласно следующему протоколу: образец 1 инкубировали с конъюгированным контрольным антителом (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 4 С; образец 2 инкубировали с конъюгированным контрольным антителом (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 4 С, после чего следовало снятие антитела; образец 3 обрабатывали конъюгированным контрольным антителом (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 37 С; образец 4 обрабатывали конъюгированным контрольным антителом (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 37 С, после чего следовало снятие антитела; образец 5 обрабатывали конъюгированным антителом 1 (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 4 С; образец 6 обрабатывали конъюгированным антителом 1 (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 4 С, после чего следовало снятие антитела; образец 7 обрабатывали конъюгированным антителом 1 (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 37 С; образец 8 обрабатывали конъюгированным антителом 1 (200 нМ, 1 мл) в течение 1 ч при 37 С, после чего следовало снятие антитела. После данных обработок все клетки промывали три раза 1 мл ледяного ФБР и использовали систему визуализации в инфракрасной области Odyssey для детектирования относительной интенсивности флуоресценции. Зарегистрированные показания для образцов 1-8 приведены далее: 1,5, 0,6, 1,1, 1, 3,3, 1,5, 5 и 5,8. Условия, в которых обрабатывали образцы 1 и 5, допускают связывание антитело-поверхность клетки, но не интернализацию. Условия, в которых обрабатывали образцы 2 и 6, не допускают ни связывание с поверхностью клетки, ни интернализацию. Условия, в которых обрабатывали образцы 3 и 7, допускают связывание с поверхностью клетки и интернализацию. Условия, в которых обрабатывали образцы 4 и 8, допускают интернализацию, но не связывание с поверхностью клетки. Сигналы, полученные от образцов 1-4, а также образца 6, считали фоновыми вследствие неспецифичности. Для некоторых образцов после инкубирования осуществляли этап "кислотной промывки" для снятия связанных с поверхностью антител, без воздействия на антитела, которые переместились в клетки. Это позволяло осуществить количественный анализ интернализованных антител. Помеченное аналогичным способом контрольное антитело (неспецифичное IgG человека) не удерживалось вне зависимости от температуры инкубации или присутствия этапа промывки. При этом антитело 1 удерживалось при обеих температурах перед промывкой, после промывки оставалось только то, с которым инкубировали при 37 С; что демонстрирует интернализацию указанного антитела клетками. Антитело 1 вызывает деградацию рецептора FGFR-3 в клетках. ОРМ-2 представляет собой линию клеток, изначально выделенную из раковых клеток множественной миеломы. Известно, что клетки ОРМ-2 экспрессируют рецепторы FGFR-3, несущие точечную мутацию K650E с приобретением функции. Клетки ОРМ-2 переводили в состояние покоя в культуральной среде с низким содержанием сыворотки (0,1% FBS) в течение ночи. На следующий день эти клетки разделяли на 5 групп. Клетки из группы 1 сразу лизировали и лизат хранили при -20 С до момента проведения вестерн-блоттинга. Эту группу, следовательно, обозначили как образец в момент времени 0 ч. В каждой из групп 2-5 было по 3 образца с равным количеством клеток, названных образец А, В и С группы 2, 3, 4 и 5. Образцы А групп 2-5 не подвергали какой-либо дополнительной обработке, но инкубировали при 37 С. Образцы В групп 2-5 обрабатывали 30 нг/мл FGF-1 при 37 С. Образцы С групп 2-5 обрабатывали 30 мкг/мл антитела 1 при 37C. Все образцы группы 2 лизировали через 1 ч после обработки и полученные лизаты хранили при -20 С до момента проведения вестерн-блоттинга. Эту группу обозначили как образцы в момент времени 1 ч. Все образцы группы 3 лизировали через 4 ч после обработки и полученные лизаты хранили при -20 С до момента проведения вестерн-блоттинга. Эту группу обозначили как образцы в момент времени 4 ч. Все образцы группы 4 лизировали через 8 ч после обработки и полученные лизаты хранили при -20 С до момента проведения вестерн-блоттинга. Эту группу обозначили как образцы в момент времени 8 ч. Все образцы группы 5 лизировали через 24 ч после обработки и полученные лизаты хранили при -20 С до момента проведения вестерн-блоттинга. Эту группу обозначили как образцы в момент времени 24 ч. Когда все лизаты были готовы, их подвергали электрофорезу в ПААГ/ДСН, а затем вестерн-блоттингу. Сигналы FGFR-3 группы 1 и всех образцов группы 2 были аналогичными. В группе 3 сигналы FGFR-3 образцов А и С были аналогичными таковым для группы 1; однако сигнал образца В был значительно ниже. В группе 4 сигнал FGFR-3 образца А был аналогичным таковому для группы 1; однако сигналы образцов В и С были значительно ниже. В группе 5 сигнал FGFR-3 образца А был ниже, чем таковой для группы 1; однако сигналы образцов В и С практически отсутствовали. Следовательно, аналогично FGF-1, который, как известно, вызывает деградацию FGFR, антитело 1 также способно вызывать деградацию FGFR-3 зависимым от времени образом; это свойство, как полагают заявители, до сих пор не было показано. Антитело 1 вызывает уменьшение количества мутантного рецептора FGFR-3 на поверхности клетки. Большинство активирующих FGFR-3 мутаций, идентифицированных при раке мочевого пузыря,расположено во внеклеточном домене рецептора. Данные мутации (например, R248C или S249C) приводят к возникновению нового неспаренного остатка цистеина, что приводит к образованию связанных дисульфидными связями димеров FGFR-3 независимо от наличия лиганда. Наиболее частые мутации представляют собой S249C, Y375C и R248C, которые в совокупности составляют 91% всех мутацийFGFR-3 при раке мочевого пузыря. Вдобавок, S249C на FGFR-3(IIIc) также приводит к конститутивной активации FGFR3(IIIc). Антитело 1 может способствовать интернализации и уменьшению количества не только FGFR-3 дикого типа (WT), но также наиболее распространенных связанных с опухолью мутантовFGFR-3. Для получения линий клеток NIH-3T3 и Ba/F3, стабильно экспрессирующих каждый из трех наиболее распространенных мутантных вариантов FGFR-3 и FGFR-3 дикого типа, клонировали кДНК, кодирующую полноразмерный FGFR-3(IIIb) или (IIIc) человека, в ретровирусный вектор pMSCVpuro (Clontech Laboratories, Маунтин-Вью, Калифорния) с получением pMSCVpuro-FGFR-3(IIIb) или (IIIc). Определенные мутации, т.е. S249C, Y375C и R248C, вводили в кДНК с помощью QickChange (Stratagene, ЛаХойя, Калифорния). Для получения клеток NIH3T3 и Ba/F3, стабильно экспрессирующих FGFR-3 дикого типа или мутантный FGFR-3, трансфицировали различными конструкциями pMSCVneo упаковывающие клетки Phoenix-Eco (ATCC, Манассас, Вирджиния) путем липофекции с помощью Lipofectamin (Invitrogen). Ретровирус собирали и использовали для инфицирования клеток NIH-3T3 и Ba/F3. После селекции на 2 мкг/мкл пуромицина в течение двух недель, клетки, экспрессирующие дикий тип или мутантныйFGFR-3, окрашивали конъюгированным с Alexa Fluor 488 антителом против FGFR-3 человека и анализировали, применяя сортировку клеток с возбуждением флуоресценции (FACS). Для индуцирования антителом 1 интернализации/уменьшения количества мутантного FGFR-3 иFGFR-3 дикого типа на поверхности клетки в лунки 6-луночных культуральных планшетов (Costar,3598) высевали 1,5105 клеток NIH-3T3, экспрессирующих мутантный FGFR-3 (NIH-3 Т 3-мутантныйFGFR-3), в 2 мл культуральной среды (DMEM (Invitrogen), дополненной 10% (в объемном отношении) эмбриональной телячей сыворотки (FCS) (Invitrogen); 2 мМ L-глутамином (Invitrogen); 100 ед./500 мл пенициллина G и 100 мкг/500 мл стрептомицина (Invitrogen). Планшеты инкубировали в течение 24 ч при 37 С при 95% относительной влажности и 5% (в объемном отношении) СО 2. Затем добавляли в лун- 13021584 ки антитело 1 до конечной концентрации 5 мкг/мл. После двухчасовой обработки культуральную среду удаляли из лунок и добавляли в них 1 мл свободного от ферментов раствора для диссоциации клеток(Chemicon, S-014-B). Клетки собирали в центрифужные пробирки после инкубирования в течение 5 мин при комнатной температуре и промывали один раз культуральной средой, а затем еще один раз промывали буфером для связывания (DPBS с 1% (в отношении веса к объему) БСА и 0,01% (в отношении веса к объему) азида натрия). Перед окрашиванием клеток, антитело против FGFR-3, которое узнает эпитоп,отличный от эпитопа антитела 1, метили Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Юджин, Орегон), применяя набор для мечения моноклональных антител, согласно рекомендациям производителя. 100 мкл буфера для связывания, содержащего 2 мкг/мл меченного Alexa Fluor 488 антитела, добавляли к клеткам, а затем инкубировали в течение 60 мин на льду. Клетки затем промывали один раз буфером для связывания и ресуспендировали в DPBS, содержащем 2 мкг/мл йодида пропидия (чтобы окрасить мертвые клетки). Количество молекул FGFR-3, оставшихся на поверхности клеток, анализировали с помощью FACSанализа и собирали данные для 10000 событий для каждого образца. Средняя интенсивность флуоресценции на поверхности клеток отражает количество молекулFGFR-3, которые остались на поверхности клеток после обработки антителом 1. Процент уменьшения количества FGFR-3 на поверхности клеток рассчитывали путем деления средней интенсивности флуоресценции обработанных антителом 1 клеток на среднюю интенсивность флуоресценции обработанныхIgG1 человека клеток. Антитело 1 значительно уменьшало количество как FGFR-3 дикого типа, так и мутантного FGFR-3 на поверхности клеток. Для анализа пролиферации клеток Ba/F3-FGFR3 высевали 80000 клеток/лунку в среду RPMI 1640 с добавлением 10% FBS. Антитело 1 добавляли при концентрации от 0,005 до 10 мкг/мл с гепарином(StemCell Technologies, Ванкувер, Канада). После инкубирования в течение 72 ч клетки обрабатывали 20 мкл (2 мкКи)/200 мкл метил-3 Н-тимидина в течение 6 ч при 37 С, 5% СО 2. Клетки собирали и считывали включение 3 Н-тимидина. Антитело 1 значительно ингибировало пролиферацию Ba/F3-FGFR-3-R248C. Антагонистическое антитело к FGFR-3 ингибирует передачу сигнала FGF в экспрессирующихFGFR-3 опухолевых клетках in vitro. Идентифицировали опухолевые линии клеток, которые экспрессируют FGFR-3 дикого типа (IIIb и/или IIIc) или мутантный FGFR-3(IIIb и/или IIIc), применяя проточную цитометрию, при этом антитело 1 выступало в качестве первичного антитела. Три линии клеток опухоли мочевого пузыря, RT112, RT4 иBFTC905, проявили существенную экспрессию FGFR-3. Клетки ОРМ-2, которые, как известно, экспрессируют рецепторы FGFR-3, несущие точечную мутацию К 650 Е с приобретением функции, также проявили высокий уровень экспрессии в данном исследовании. Обнаружили, что две дополнительные линии клеток, GEO и FADU, экспрессируют умеренные, но при этом существенные уровни рецептора. Характеристики пути передачи сигнала через FGFR-3 в данных опухолевых клетках получали, применяя вестерн-блоттинг. ОРМ-2 представляет собой линию клеток, полученную из опухолей множественной миеломы человека. Клетки ОРМ-2 переводили в состояние покоя в культуральной среде с низким содержанием сыворотки (0,1% FBS) в течение ночи. На следующий день эти клетки разделяли на четыре образца с равным количеством клеток. Отставляли и хранили образец 1 при 37 С в течение 1 ч в качестве контрольного образца. Инкубировали образец 2 с 200 нМ антитела 1 при 37 С в течение 1 ч. Оставляли образец 3 при 37 С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,2 нМ лиганда FGF-9 при 37 С в течение 15 мин. Инкубировали образец 4 с 200 нМ антитела 1 при 37 С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,2 нМ FGF-9 при 37 С в течение 15 мин. Далее, лизировали все четыре образца и подвергали их ПААГ/ДСН, а затем вестерн-блоттингу. Измеряли активацию FGFR-3 с помощью антитела к фосфотирозину. Измеряли активацию эффекторной молекулы MAPK, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной MAPK. Измеряли активацию эффекторной молекулы Akt, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированнойAkt. Сигналы фосфорилированного FGFR-3 из образцов 2 и 4 были сравнимы с таковыми для образца 1,который представляет нестимулированное состояние рецептора. Сигнал образца 3 был более чем в три раза сильнее, чем таковой для образца 1. Можно прийти к заключению, что антитело 1 антагонизирует влияние FGF-9 на активацию FGFR-3. Сигналы фосфорилированной MAPK для образцов 2 и 4 были сравнимы с сигналами для образца 1, который представляет нестимулированное состояние рецептора. Сигнал образца 3 был более чем в два раза сильнее, чем для образца 1. Можно прийти к заключению, что антитело 1 антагонизирует влияние FGF-9 на активацию MAPK.GEO представляет собой линию клеток, полученную из колоректальных опухолей человека. Указанные клетки переводили в состояние покоя в культуральной среде с низким содержанием сыворотки (0,1%FBS) в течение ночи. На следующий день эти клетки разделяли на шесть образцов с равным количеством клеток. Отставляли и хранили образец 1 при 37 С в течение 1 ч в качестве контрольного образца. Инкубировали образец 2 с 200 нМ изотипически сходного неспецифичного контрольного антитела при 37 С в течение 1 ч. Инкубировали образец 3 с 200 нМ антитела 1 при 37 С в течение 1 ч. Оставляли образец 4 при 37 С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,67 нМ лиганда FGF-1 при 37 С в течение 15 мин. Инкубировали образец 5 с 200 нМ контрольного антитела при 37 С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,67 нМ FGF-1 при 37 С в течение 15 мин. Инкубировали образец 6 с 200 нМ антитела 1 при 37 С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,67 нМ FGF-1 при 37 С в течение 15 мин. Лизировали все шесть образцов и подвергали их электрофорезу в ПААГ/ДСН, а затем вестерн-блоттингу. Измеряли активацию FGFR-3 с помощью антитела к фосфотирозину. Образцы 1, 2 и 4 проявили одинаково низкие уровни фосфорилированного FGFR-3, тогда как лишь образец 3 проявил значительно более сильные сигналы, соответствующие всем трем видам молекул. Следовательно, 1) воздействие FGF-9 увеличивает фосфорилирование FGFR-3; 2) антитело 1 антагонизирует указанное увеличение; 3) антитело 1 отдельно не проявляет какую-либо агонистическую активность.RT-112 представляет собой линию клеток, полученную из опухолей мочевого пузыря человека. Указанные клетки переводили в состояние покоя в культуральной среде с низким содержанием сыворотки (0,1% FBS) в течение ночи. На следующий день эти клетки разделяли на четыре образца с равным количеством клеток. Отставляли и хранили образец 1 при 37 С в течение 1 ч в качестве контрольного образца. Инкубировали образец 2 с 200 нМ антитела 1 при 37 С в течение 1 ч. Оставляли образец 3 при 37 С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 1,3 нМ лиганда FGF-1 при 37 С в течение 15 мин. Инкубировали образец 4 с 200 нМ антитела 1 при 37 С в течение 1 ч, затем этот образец подвергали воздействию 0,13 нМ FGF-1 при 37 С в течение 15 мин. Далее, лизировали все четыре образца и подвергали 10% каждого лизированного образца электрофорезу в ПААГ/ДСН, а затем вестернблоттингу. Измеряли активацию эффекторной молекулы MAPK, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной MAPK. Измеряли активацию эффекторной молекулыAkt, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной Akt. Подвергали остальные 90% каждого лизата иммунопреципитации. Смешивали образец с доступным для приобретения антителом против FGFR-3 при 4 С в течение 4-16 ч, чтобы позволить антителу связаться с рецепторами FGFR-3 в лизатах, а затем извлекали FGFR-3, связанный с антителом против FGFR-3, путем смешивания 20 мкг смеси гранул с белком А-белком G (50:50, в объемном отношении) с образцами при 4 С в течение ночи. Эти гранулы промывали 3 раза в ФБР перед осуществлением ПААГ/ДСН и вестернблоттинга. Измеряли активацию FGFR-3 с помощью антитела к фосфотирозину. Образцы 1, 2 и 4 проявили одинаково низкие уровни фосфорилированного FGFR-3 и фосфорилированной MAPK, тогда как лишь образец 3 проявил значительно более сильные сигналы, соответствующие всем трем видам молекул. Следовательно, 1) воздействие FGF-1 повышает фосфорилирование FGFR-3 и MAPK; 2) антитело 1 антагонизирует данное повышение; 3) антитело 1 отдельно не проявляет какую-либо агонистическую активность. В образце 4 сигнал фосфорилированной Akt был слабее, чем в остальных образцах, что указывает на то, что антитело 1 может также антагонизировать передачу сигнала через Akt. Клетки GEO использовали для получения шести образцов, описанных выше, затем их лизировали и подвергали электрофорезу в ПААГ/ДСН, а затем вестерн-блоттингу, описанным выше. Тем не менее,измеряли активацию эффекторной молекулы MAPK, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной MAPK. Измеряли активацию эффекторной молекулы Akt, нижестоящей в сигнальном каскаде, с помощью антитела против фосфорилированной Akt. Образцы 1, 2, 3 и 6 проявили одинаково низкие уровни фосфорилированной MAPK, тогда как образцы 4 и 5 проявили значительно более сильные сигналы, соответствующие всем трем видам молекул. Следовательно, 1) воздействие FGF-1 увеличивает фосфорилирование MAPK; 2) антитело 1 антагонизирует указанное увеличение; 3) антитело 1 отдельно не проявляет какую-либо агонистическую активность. Антитело 1 ингибирует рост и выживаемость опухолевых клеток in vitro. Анализ пролиферации клеток применяют, чтобы показать ингибиторное действие антитела 1 на рост опухолевых клеток. Монослой клеток RT112 переводили в состояние покоя в культуральной среде с низким содержанием сыворотки (0,1% эмбриональной бычьей сыворотки, 5 мкг/мл гепарина) в течение 24-72 ч. Клетки разделяли на 4 образца. Добавляли FBS (эмбриональную бычью сыворотку) в образец 1 до конечной концентрации 10% (в объемном отношении). Оставляли образец 2 в обедненной среде. Добавляли FGF-1 в образец 3 до конечной концентрации 1 нМ. Добавляли антитело 1 в образец 4 до конечной концентрации 200 нМ, инкубировали при 37 С в течение 1 ч. Далее, добавляли FGF-1 до конечной концентрации 1 нМ. После подготовки образцов 1-4, как описано выше, инкубировали образцы в термостате для культуры ткани при 37 С и 5% СО 2 (в объемном отношении) в течение 48 ч. Рост клеток прослеживали, применяя стандартный анализ включения 3 Н-тимидина. Рост опухолевых клеток ускорялся в два раза, когда клетки RT112 стимулировали in vivo 1 нМ экзогенного FGF-1. Данный эксперимент также показал, что антитело 1 эффективно снижает этот экзогенно стимулированный рост. Анализ в мягком агаре, также известный как анализ образования колоний или колониегенный анализ, применяют, чтобы показать ингибиторное действие антитела 1 на выживаемость опухолевых клеток. Клетки RT112, которые растили в мягком агаре, содержащем 200 нМ антитела 1 (в культуральной среде с 10% FBS), образовывали на приблизительно 50% меньше колоний, чем клетки, которые растили в мягком агаре, содержащем только культуральную среду с 10% FBS, или содержащем 200 нМ изотипически сходного неспецифичного контрольного антитела (в культуральной среде с 10% FBS). Этот анализ показал действие антитела 1, направленное против выживаемости опухолевых клеток. Антитело 1 оказывает противоопухолевое действие на несущие FGFR-3 солидные опухоли. Ксенотрансплантатные модели опухоли RT112 и GEO разрабатывали с помощью обычных способов, в которых 1-20 млн опухолевых клеток, смешанных с 0-100% Матригелем (Matrigel), инъецировали подкожно каждой самке бестимусной "голой" мыши. Лечение антителом начинали, когда средний объем подкожных опухолей достигал приблизительно 400 мм 2. Обе соответствующие опухолевым линиям клеток RT112 и GEO ксенотрансплантатные опухоли эффективно ингибировались лечением путем внутрибрюшинной инъекции три раза в неделю 40 мг/кг антитела 1, по сравнению с теми же типами опухолей в контрольных группах. Для того чтобы продемонстрировать, чтоданные эффекты происходят в результате изменения пути передачи сигнала через FGFR-3, проводили исследование эффективности, применяя ортотопическую модель опухоли РС-3, в которой опухолевые клетки были лишены передачи сигнала через FGFR-3, что предположили по отрицательным результатам вестерн-блоттинга фосфорилирования рецептора FGFR-3. Ортотопическую модель РС-3 получали путем инъецирования трансфицированных люциферазой клеток РС-3 (PC-3LP) непосредственно в верхнюю долю предстательной железы мышейNu/nu (самцы, 7-8 недель, 1106 клеток/мышь) путем хирургического вмешательства. Через две недели после имплантации клеток регистрировали биолюминесцентные изображения животных со стороны брюшка (животные лежали на спине) и осуществляли количественный анализ, применяя систему IVIS,согласно рекомендациям производителя (Caliper Life Sciences, Хопкинтон, Массачусетс). Мышей с удачными имплантатами произвольно разделяли на группы, чтобы вводить им внутрибрюшинно различные тестируемые средства по заранее определенному расписанию. Сигналы, зарегистрированные с помощьюIVIS, использовали в качестве идентификаторов опухолевой массы и регистрировали их еженедельно. Статистический анализ осуществляли, применяя дисперсионный анализ повторных измерений. Антитело 1 не оказало существенного влияния на рост опухолей РС-3. Следовательно, антитело 1 ингибирует рост только тех солидных опухолей, в которых есть функциональные пути передачи сигнала через FGFR-3. Антитело 1 оказывает противоопухолевое действие на миелоидные опухоли с мутантными рецепторами FGFR-3. ОРМ-2 и KMS-11 представляют собой экспрессирующие FGFR-3 линии клеток множественной миеломы. Вдобавок, рецепторы в обеих линиях клеток представляют собой мутанты, несущие по одной точечной мутации: K650 Е в ОРМ-2 и Y373C в KMS-11. Две указанные мутации представляют собой мутации с приобретением функции, и они повышают активность мутантных рецепторов посредством таких механизмов, как конститутивная активация, увеличение времени полужизни и повышение чувствительности к лиганду. Создавали ксенотрансплантатную модель ОРМ-2 с помощью обычных способов, в которых 1-20 млн опухолевых клеток, смешанных с 0-100% матригелем, инъецировали подкожно каждой самке бестимусной "голой" мыши. Лечение инъекциями начинали, когда средний объем подкожных опухолей достигал приблизительно 400 мм 2. Введение осуществляли 3 раза в неделю. Измеряли объемы опухолей 3 раза в неделю. Последнее измерение осуществляли через 4 недели лечения. Средний размер опухоли животных, которых лечили антителом 1, был на 64% меньше, чем таковой у контрольной группы. Применяли критерий Стьюдента. Значение р было меньше чем 0,0001. Следовательно, открытие было высокозначимым. Модель приживления кости KMS-11 создали, как описано у Xin X. et al., Clin CancerRes. 15 августа 2006 г.; 12(16):4908-15. Лечение антителом начинали через 1 неделю после инъекций опухолевых клеток. Введение осуществляли 3 раза в неделю. Измеряли сигналы, испускаемые опухолевыми клетками, несколько раз во время исследования. Последнее измерение осуществляли через 33 дня после первой инъекции. Средний сигнал для животных, которых лечили антителом 1, составлял 1/4 от такового для контрольных животных. Применяли логарифмический ранговый критерий (Mantel-Cox). Значение р составляло 0,0002. Следовательно, открытие было высокозначимым. В обеих моделях лечение интраперитонеальными инъекциями 40 мг/кг антитела 1 три раза в неделю значительно ингибировало рост опухоли по сравнению с контрольными группами. Антитело 1, похоже, первое проявило противоопухолевую активность in vivo против опухолевых клеток, которые несут как K650 Е, так и Y373C мутантные формы FGFR-3. Антитело 1 повышает терапевтическую эффективность цитотоксических средств. Цисплатин представляет собой широко используемое цитотоксическое средство в методах лечения рака. Он вызывает образование поперечных связей в ДНК и индуцирует апоптоз клеток. Исследовали терапевтическую пользу комбинирования цисплатина с антителом против FGFR-3 в трех ксенотрансплантатных моделях опухоли мочевого пузыря. Ксенотрансплантатные модели опухолей RT112, RT4 иBFTC905 получали с помощью обычных способов, в которых 1-20 млн опухолевых клеток, смешанных с 0-100% матригелем, инъецировали подкожно каждой самке бестимусной "голой" мыши. Лечение антителом начинали, как только средний объем подкожных опухолей достигал приблизительно 400 мм 2. Осуществляли инъекции 40 мг/кг антитела 1 и максимально переносимой дозы (MTD) цисплатина три раза в неделю. Измеряли объемы опухолей 3 раза в неделю до окончания исследований. Краткое описание результатов для модели опухоли RT112 приведено в следующей таблице. Таблица 3 Отдельные объемы опухолей RT-112 (мм 3) - лечение цисплатином Осуществляли дисперсионный анализ повторных измерений. Сравнивали эффективность лечения цисплатином с таковой для комбинации цисплатин-антитело 1. Значение р составляло 0,018. Следовательно, влияние антитела 1 на повышенную эффективность цисплатина было высокозначимым. Краткое описание результатов для модели опухоли RT4 приведено в следующей таблице. Таблица 4 Отдельные объемы опухолей RT4 (мм 3) - лечение цисплатином Осуществляли дисперсионный анализ повторных измерений. Сравнивали эффективность лечения цисплатином с таковой для комбинации цисплатин-антитело 1. Значение р составляло 0,0162. Следовательно, влияние антитела 1 на повышенную эффективность цисплатина было высокозначимым. Краткое описание результатов для модели опухоли BFTC905 приведено в следующей таблице. Таблица 5 Отдельные объемы опухолей BFTC-905 (мм 3) - лечение цисплатином Осуществляли дисперсионный анализ повторных измерений. Сравнивали эффективность лечения цисплатином с таковой для комбинации цисплатин-антитело 1. Значение р составляло 0,0209. Следовательно, влияние антитела 1 на повышенную эффективность цисплатина было высокозначимым. Ни одно из животных не погибло в результате лечения на протяжении всех описанных исследований, что позволило предложить, что добавление антитела 1 к максимальной переносимой дозе цисплатина повышает эффективность последнего, не вызывая значительного усугубления неблагоприятного действия двух указанных лекарственных средств. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Антитело или его фрагмент, которое специфично связывается с FGFR-3(IIIb) и FGFR-3(IIIc) человека, содержащее CDRH1, имеющий последовательность GYMFTSYGIS (SEQ ID NO:1), CDRH2,имеющий последовательность WVSTYNGDTNYAQKFQG (SEQ ID NO:2), CDRH3, имеющий последовательность VLGYYDSIDGYYYGMDV (SEQ ID NO:3), CDRL1, имеющий последовательностьCDRL3, имеющий последовательность QVWDSGSDHVV (SEQ ID NO:6). 2. Антитело по п.1, где антитело содержит последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи и последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи 3. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое является антителом человека, имеющим KD приблизительно 110-8 M или менее при комнатной температуре (20-25 С). 4. Антитело по любому из предшествующих пунктов, которое специфически связывается с доменом 2 FGFR-3 человека (SEQ ID NO:12). 5. Фармацевтическая композиция для использования при лечении рака, содержащая эффективное количество антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-4 и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. 6. Применение антитела или фрагмента антитела по любому из пп.1-4 в качестве лекарственного средства для лечения рака.