Связывающие fgf2 пептиды и их применение

В настоящей заявке описаны связывающие FGF2 пептиды, которые были сконструированы, начиная с N-концевого участка РТХ 3, в частности включающие участок РТХ 3(82-110). Синтетические пептиды, родственные этой последовательности, способны связывать FGF2 и ингибировать его проангиогенную активность in vitro и in vivo при отсутствии ожидаемого влияния на врожденный иммунитет. 015339 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к пептидам, связывающим фактор роста фибробластов-2 (FGF2),которые способны связывать FGF2 и ингибировать его проангиогенную активность in vitro и in vivo в отсутствие ожидаемого влияния на врожденный иммунитет. Уровень техники Пентраксины представляют собой суперсемейство белков, характеризующихся пентамерной структурой 1. Классические короткие пентраксины, С-реактивный белок (CRP) и компонент сывороточного амилоида Р (SAP) представляют собой белки острой фазы у человека и мыши соответственно, продуцируемые в печени в ответ на медиаторы воспаления 2,3. Пентраксины связывают различные лиганды и вовлечены во врожденную устойчивость к микробам и в удаление продуктов распада клеток и компонентов внеклеточного матрикса 1,4-6. Длинные пентраксины характеризуются неродственным N-концевым доменом, связанным с пентраксинподобным С-концевым доменом 7. Являющийся прототипом длинный пентраксин РТХ 38,9 представляет собой гликозилированный белок 45 кДа, собранный преимущественно в виде мультимеров из 10-20 мультимеров 10. РТХ 3 продуцируется местно и высвобождается клетками различных типов, в частности мононуклеарными фагоцитами, дендритными клетками и эндотелиальными клетками, в ответ на первичные воспалительные сигналы 11. В исследованиях на мышах ptx3-/- было показано, что эта молекула in vivo выполняет сложные неизбыточные функции, простирающиеся от сборки богатого гиалуроновой кислотой внеклеточного матрикса до способности к оплодотворению у женщин и до врожденного иммунитета против различных микроорганизмов 12,13. По меньшей мере, частично это связано со способностью РТХ 3 связывать с высокой аффинностью компонент комплемента C1q, белок внеклеточного матрикса TSG6 и выбранные микроорганизмы, запуская активацию комплемента и способствуя распознаванию патогена макрофагами и дендритными клетками 1,14. Таким образом, РТХ 3 представляет собой растворимый рецептор распознавания структур, обладающий уникальными неизбыточными функциями в различных патофизиологических условиях 1,14. Фактор роста фибробластов-2 (FGF2) представляет собой связывающий гепарин фактор роста, который индуцирует пролиферацию клеток, хемотаксис и продукцию протеаз в культивируемых эндотелиальных клетках посредством высокоаффинного взаимодействия с рецепторами тирозинкиназ (FGFR)15.FGF2 индуцирует ангиогенез in vivo и регулирует образование новых сосудов в процессе заживления ран, воспаления, атеросклероза и роста опухоли 16. Ряд молекул блокирует FGF2 во внеклеточном пространстве, тем самым предотвращая его взаимодействие с FGFR эндотелиальных клеток и ингибируя его ангиогенную активность (обзор в 16). Многие из этих ингибиторов продуцируются/высвобождаются местно и/или системно, образуя тем самым основу для сложной регуляции процесса ангиогенеза. Длинный РТХ 3 связывает FGF2 с высокой аффинностью и специфичностью. Соответственно,длинный РТХ 3 ингибирует зависимую от FGF2 пролиферацию эндотелиальных клеток in vitro и ангиогенез in vivo17. Кроме того, полноразмерный РТХ 3 ингибирует зависимую от FGF2 активацию гладкомышечных клеток и утолщение интимы после повреждения артерий 18. Таким образом, РТХ 3 теоретически может вносить вклад в регуляцию активности FGF2 в различных патологических условиях, характеризующихся совместной экспрессией двух белков, в том числе при воспалении, заживлении ран, атеросклерозе и неоплазии. Однако учитывая практическую невозможность использовать такую большую молекулу и другие виды активности белка, не описано ни одного варианта терапевтического применения белка. Фактически, РТХ 3 связывает C1q посредством С-концевого домена пентраксина 10. До настоящего времени N-концевому участку РТХ 3 не были приписаны никакие биологические функции. Исходя из этого, авторами изобретения была исследована способность N-концевого участка РТХ 3 взаимодействовать с FGF2. Описание изобретения Было обнаружено, что трансдуцированные ретровирусом клетки эндотелия, сверхэкспрессирующие РТХ 3N-концевой фрагмент (1-178), обладают сниженной митогенной активностью в ответ на FGF2. Очищенный рекомбинантный РТХ 3 (1-178) связывает FGF2 и предотвращает взаимодействиеPTX3/FGF2. Кроме того, моноклональное антитело mAb-MNB4, распознающее эпитоп РТХ 3(87-99),предотвращает взаимодействие FGF2/PTX3 и устраняет активность РТХ 3 как антагониста FGF2. Неожиданно авторами изобретения было обнаружено, что очень короткие пептиды сохраняют такую активность и являются эффективными в качестве терапевтических лекарственных средств. Соответственно,синтетические пептиды РТХ 3(82-110), РТХ 3(97-110), РТХ 3(97-107) и РТХ 3(100-104) связывают FGF2 и ингибируют взаимодействие FGF2 с полноразмерным длинным РТХ 3, иммобилизованным на сенсорном чипе BIAcore, зависимую от FGF2 пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез in vivo. Таким образом, данные позволяют идентифицировать очень короткий, связывающий FGF2 домен в N-концевом удлиняющем участке РТХ 3, охватывающем область РТХ 3(97-110). Синтетические пептиды, родственные этой последовательности, способны связывать FGF2 и ингибировать его проангиогенную активность invitro и in vivo в отсутствие ожидаемого влияния на врожденный иммунитет. Таким образом, главной целью настоящего изобретения является связывающий FGF2 пептид формулы IR1 отсутствует или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 иR2 отсутствует или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2 иSEQ ID NO: 4, при следующих условиях: когда R1 отсутствует, R2 также отсутствует; когда R1 представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, R2 представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; когда R1 представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, R2 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4; функциональное производное, предшественник или фармацевтически приемлемая соль пептида. Предпочтительно X1 представляет собой Arg. Более предпочтительно Х 2 представляет собой Cys. Еще более предпочтительно пептид состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10. Еще одной целью изобретения является конъюгированный химерный пептид, содержащий пептид формулы I или его функциональные производные. Как правило, термин "пептид" используют в отношении полипептидной цепи, содержащей от 4 до 100 или более последовательных аминокислот, обычно от 5 до 20 последовательных аминокислот. Термин "функциональный" обозначает пептид, обладающий связывающими FGF2 свойствами, способный значительно снижать биологическую активность FGF2. Биологическая активность FGF2 включает митогенный и ангиогенный эффекты. В частности, пептиды согласно изобретению способны ингибировать индуцируемую FGF2 пролиферацию эндотелиальных клеток или гладкомышечных клеток."Предшественники" представляют собой соединения, которые могут быть преобразованы в соединения согласно настоящему изобретению посредством метаболической и ферментативной обработки до или после введения в клетки или организм. В рамках настоящей заявки термин "соли" относится к солям, получаемым по карбоксильным группам, и к получаемым при добавлении кислот солям по аминогруппам пептидов, полипептидов или их аналогов согласно настоящему изобретению. Соли по карбоксильной группе можно получать известными в данной области способами, и они включают неорганические соли, например соли натрия, кальция,аммония, железа или цинка и т.п., а также соли с органическими основаниями, такие как соли, получаемые, например, с аминами, например триэтаноламином, аргинином или лизином, пиперидином, прокаином и т.п. Получаемые при добавлении кислот соли включают, например, соли с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная кислота или серная кислота, и соли с органическими кислотами,такими как, например, уксусная кислота или щавелевая кислота. Любая из таких солей должна обладать практически такой же активностью, как пептиды и полипептиды согласно изобретению или их аналоги. В рамках настоящей заявки термин "производные" относится к производным, которые могут быть получены известными способами из функциональных групп, присутствующих на боковых цепях молекул аминокислот или на N-/или С-концевых группах. Например, такие производные включают сложные эфиры или алифатические амиды карбоксильных групп, а также N-ацильные производные свободных аминогрупп или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп, и их получают с использованием ацильных групп, таких как, например, алканоильные или ароильные группы. Также настоящее изобретение включает пептидомиметики уже описанных пептидов, в которых природа пептидов была химически модифицирована на уровне боковых цепей аминокислот, хиральности аминокислот и/или пептидного каркаса. Эти изменения предназначены для получения связывающих FGF2 средств со сходными (если не улучшенными) терапевтическими, диагностическими и/или фармакокинетическими свойствами. Например, если пептид подвержен расщеплению пептидазами после введения субъекту, то замена конкретной восприимчивой к воздействию пептидной связи на нерасщепляемый пептидный миметик может обеспечить более стабильный пептид и, соответственно, более функциональный в качестве терапевтического средства. Сходным образом, замена остатка L-аминокислоты является общепринятым способом, чтобы сделать пептид менее чувствительным к протеолизу и, в итоге, более сходным с органическими соединениями, отличными от пептидов. Также эффективными являются аминоконцевые блокирующие группы, такие как трет-бутилоксикарбонильная, ацетильная, сукцинильная, метоксисукцинильная, суберильная, адипильная, азелаильная, дансильная, бензилоксикарбонильная, флуоренилметоксикарбонильная, метоксиазелаильная, метоксиадипильная, метоксисуберильная и 2,4-динитрофенильная группы. В данной области известно множество других модификаций, обеспечивающих повышенную эффективность, пролонгированную активность, легкость очистки и/или увеличенное время полужизни. Свойства пептидов согласно изобретению можно поддерживать или даже усиливать в мутантных пептидах. Мутантные пептиды содержат аминокислотные последовательности, в которых были осущест-2 015339 влены консервативные замены одного или нескольких аминокислотных остатков при условии, что они обладают той же характеризующей настоящее изобретение биологической активностью на эквивалентном или даже более высоком уровнях, как определено известными в данной области способами или описано в представленных ниже примерах. Согласно настоящему изобретению предпочтительные изменения в мутантных пептидах общеизвестны как "консервативные" или "безопасные" замены. Консервативные аминокислотные замены представляют собой замены на аминокислоты с химическими свойствами, в достаточной степени сходными для сохранения структуры и биологической функции молекулы. В литературе представлены многочисленные модели, с использованием которых можно проводить выбор консервативных аминокислотных замен на основе статистических и физико-химических исследований последовательности и/или структуры природного белка. Мутантные пептиды можно получать посредством общепринятого способа сайт-направленного мутагенеза кодирующей ДНК, посредством комбинаторных способов на уровне кодирующей последовательности ДНК (такими как перестановка ДНК, фаговый дисплей/отбор) или аминокислот, посредством исследований на основе компьютерного конструирования или любым другим известным, эффективным для этого способом, обеспечивающим конечный набор практически аналогичных мутированных пептидов, которые специалист в данной области может обычным способом получать и тестировать, используя указания, имеющиеся в предшествующем уровне техники и в примерах настоящей патентной заявки. Другой целью изобретения является слитый химерный пептид, содержащий пептид формулы (I) или его функциональные производные. Связывающие FGF2 пептиды, являясь слитыми и/или химерными пептидами, содержат аминокислотную последовательность пептида формулы (I) или любое из их мутантов/производных, как описано выше, и аминокислотную последовательность, относящуюся к отличной от РТХ 3 последовательности белка, обеспечивая дополнительные свойства без значительного нарушенияFGF2-связывающей активности. Дополнительные последовательности белков, которые можно включать в слитые и/или химерные белки, могут быть выбраны из мембраносвязанных последовательностей, внеклеточных участков мембраносвязанных белков, константных областей иммуноглобулинов, доменов мультимеризации, внеклеточных белков, белков, содержащих сигнальные пептиды, белков, содержащих сигнальные последовательности для выведения. Дополнительные свойства, проявляемые слитыми и/или химерными полипептидами или пептидами, заключаются в способности к более легкой очистке, более продолжительном времени полужизни в жидкостях организма или во внеклеточной локализации. Это последнее свойство обладает особой важностью для определения конкретной группы слитых или химерных белков, включенных в представленное выше определение, поскольку оно позволяет помещать пептиды согласно изобретению в пространство, в котором не только облегчены выделение и очистка этих пептидов, но и в котором происходит природное взаимодействие РТХ 3 и FGF2. Выбор одной или нескольких последовательностей, подлежащих слиянию со связывающими FGF2 пептидами, зависит от конкретного варианта использования пептида. В качестве общего способа слитые белки можно получать, конструируя кодирующие их участки нуклеиновых кислот с использованием общепринятых способов генной инженерии и клонируя в реплицируемые векторы вирусного или плазмидного происхождения, которые используют для модифицирования прокариотической или эукариотической клетки-хозяина с применением эписомальных или не/гомологично встраиваемых векторов, а также с применением способов на основе трансформации, инфекции или трансфекции. Эти векторы должны обеспечивать экспрессию слитого белка, включающего связывающее FGF2 средство, в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине под контролем их собственных регуляторных последовательностей для инициации/терминации транскрипции, которые выбраны таким образом, чтобы быть конститутивно активными или индуцибельными в указанной клетке. Затем можно выделять линию клеток для получения стабильной клеточной линии. В частности, если клетки, модифицированные для экспрессии связывающих FGF2 средств согласно изобретению, используют или вводят непосредственным образом, то, предпочтительно, клетки представляют собой клетки человека, обычно экспрессирующие РТХ 3. Если дополнительная белковая последовательность, как в случае последовательности внеклеточных белков, белков, содержащих сигнальную последовательность для выведения, или белков, содержащих сигнальный пептид, обеспечивает секрецию связывающегоFGF2 домена во внеклеточное пространство, то средство может быть более легко выделено и очищено из культивируемых клеток с учетом последующей обработки, или, альтернативно, клетки могут быть использованы или введены непосредственным образом. Если дополнительный белок, как в случае последовательности мембраносвязанных белков, обеспечивает иммобилизацию связывающего FGF2 средства на поверхности клетки, то средство может быть менее легко выделено и очищено из культивируемых клеток с учетом последующей обработки, однако клетки могут быть использованы или введены непосредственным образом, обеспечивая средство в форме, соответствующей форме природного РТХ 3, возможно, улучшая его свойства. Связывающие FGF2 пептиды согласно изобретению могут быть также идентифицированы спосо-3 015339 бами компьютерного конструирования лекарственных средств, в которых используют структуру и/или последовательность пептидов согласно изобретению или соответствующих мутантов, как описано выше. Пептиды согласно изобретению можно с более высокой эффективностью использовать для исследования взаимодействия РТХ 3 и FGF2, используя способы компьютерного моделирования. Такой анализ с использованием компьютера можно применять для получения улучшенных пептидных или непептидных миметических лекарственных средств в виде синтетических органических молекул или пептидов (например, длиной 4-20 аминокислот). После отбора таких соединений и обнаружения, что они способны связывать FGF2, можно затем оценивать их использование с применением клеточных или животных моделей. Полипептиды согласно изобретению могут находиться в виде активных конъюгатов или комплекса с гетерологичной молекулой, которую можно выбирать из цитотоксических средств, меток (например,биотина, флуоресцентных меток), лекарственных средств или других терапевтических средств, связанных ковалентно или несвязанных, непосредственно или посредством использования связывающих средств или линкеров. Эффективные конъюгаты или комплексы можно получать с использованием известных в данной области молекул и способов (радиоактивных или флуоресцентных меток, биотина, цитотоксических средств, лекарственных средств или других терапевтических средств). Цитотоксические средства включают химиотерапевтические средства, токсин (например, ферментативно активный токсин бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или его фрагменты) или радиоактивный изотоп (т.е. радиоконъюгат). Ферментативно активные токсины и их фрагменты, которые можно использовать, включают цепь дифтерийного токсина А, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь экзотоксина А (из Pseudomonas aeruginosa), цепь рицина А, цепь абрина А,цепь модецина А, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI,PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Saponaria officinalis, гелонин,митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецины. Для получения радиоконъюгированных белков доступно множество радиоактивных изотопов. Примеры включают 212Bi, 131I, 131In, 90Y и 186Re. Кроме того, эффективные конъюгаты или комплексы можно получать для улучшения средств в аспекте эффективности доставки лекарственного средства. С этой целью пептиды согласно изобретению могут находиться в виде активных конъюгатов или комплекса с такими молекулами, как полиэтиленгликоль и другие природные или синтетические полимеры (Harris J.M. and Chess R.B., Nat Rev Drug Discov.(2003), 2(3):214-21; Greenwald R.B. et al., Adv Drug Deliv Rev. (2003), 55(2):217-50; Pillai О. and Panchagnula R., Curr Opin Chem Biol. (2001), 5(4):447-51). В этом отношении настоящее изобретение включает химически модифицированные пептиды, как описано в настоящей заявке, в которых пептид связан с полимером. Как правило, полимер является водорастворимым, вследствие чего конъюгат не осаждается в водной среде, такой как физиологическая среда. Используемые для лечения конъюгаты могут содержать фармацевтически приемлемые водорастворимые полимерные молекулы. Приемлемые водорастворимые полимеры включают полиэтиленгликоль (PEG), монометокси-PEG, моно(C1-С 10)алкокси-PEG, арилоксиPEG, поли(N-винилпирролидон)-PEG, трезилмонометокси-PEG, PEG-пропиональдегид, бис-сукцинимидилкарбонат-PEG, гомополимеры пропиленгликоля, сополимер полипропиленоксид/этиленоксид,полиоксиэтилированные многоатомные спирты (например, глицерин), поливиниловый спирт, декстран,целлюлозу или другие полимеры на основе углеводов. Приемлемые PEG могут иметь молекулярную массу от приблизительно 600 до приблизительно 60000, в том числе, например, 5000, 12000, 20000 и 25000. Также конъюгат может содержать смесь таких водорастворимых полимеров. Примеры конъюгатов включают пептиды согласно изобретению и группу полиалкилоксида, присоединенную к N-концевому участку указанной молекулы полипептида. Одним из приемлемых полиалкилоксидов является PEG. В качестве иллюстрации, пептиды согласно настоящему изобретению можно модифицировать с использованием PEG, применяя способ, известный как "пегилирование". Пегилирование можно проводить с использованием любой из известных в данной области реакций пегилирования. Например, пегилирование можно осуществлять реакцией ацилирования или реакцией алкилирования с использованием реакционноспособной молекулы полиэтиленгликоля. В альтернативном способе конъюгаты получают конденсацией активированного PEG, при которой концевую гидрокси- или аминогруппу в PEG заменяют активированным линкером. Другой целью изобретения являются нуклеиновые кислоты, которые кодируют связывающие FGF2 пептиды согласно изобретению, нуклеиновые кислоты, которые гибридизуются с указанными выше нуклеиновыми кислотами, нуклеиновые кислоты, которые имеют вырожденные последовательности. Также изобретение относится к векторам экспрессии вирусного или плазмидного происхождения,обеспечивающим экспрессию нуклеиновой кислоты согласно изобретению, к прокариотическим или эукариотическим клеткам-хозяевам, трансформированным такими векторами, и к получаемым из них стабильным линиям клеток, экспрессирующим связывающее FGF2 средство, которое может секретироваться или экспрессироваться на поверхности мембран. Примерами являются В-клетки человека. Связывающие FGF2 пептиды согласно изобретению можно получать способом, в котором описанные выше клетки-хозяева культивируют в соответствующих культуральных средах и получают связы-4 015339 вающее FGF2 средство. Последовательность ДНК, кодирующую пептиды согласно изобретению, можно вставлять и лигировать в приемлемый вектор. После получения вектор экспрессии вводят в приемлемую клетку-хозяина,которая затем экспрессирует пептид. Экспрессию любого из рекомбинантных пептидов согласно изобретению, как описано в настоящей заявке, можно осуществлять в эукариотических клетках (например, клетках дрожжей, насекомых или млекопитающих) или прокариотических клетках с использованием соответствующих векторов экспрессии. Можно использовать любой известный в данной области способ. Для того чтобы быть способным экспрессировать желаемый белок, вектор экспрессии должен также содержать специфические нуклеотидные последовательности, которые включают информацию для регуляции транскрипции и трансляции, связанные с ДНК, кодирующей желаемый белок, таким образом,чтобы обеспечивать экспрессию гена и продукцию белка. Прежде всего, для того чтобы ген транскрибировался, ему должен предшествовать распознаваемый РНК-полимеразой промотор, с которым полимераза связывается и запускает тем самым процесс транскрипции. Существует множество таких используемых промоторов, которые действуют с различной эффективностью (сильные и слабые промоторы). В случае эукариотических организмов-хозяев, в зависимости от природы организма-хозяина, можно использовать различные регулирующие транскрипцию и трансляцию последовательности. Они могут быть получены из вирусных источников, таких как аденовирус, вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус обезьяны или т.п., где регуляторные сигнальные последовательности связаны с конкретным геном, экспрессирующимся на высоком уровне. Примеры представляют собой промотор TK вируса герпеса, ранний промотор SV40, дрожжевой промотор гена ga14 и т.д. Можно выбирать такие регуляторные сигнальные последовательности для инициации транскрипции, которые обеспечивают репрессию и активацию таким образом, чтобы можно было регулировать экспрессию генов. Молекулу ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок согласно изобретению, вставляют в вектор(ы), имеющий регуляторные сигнальные последовательности для транскрипции и трансляции, который способен встраивать желаемые последовательности генов в клеткухозяина. Клетки, которые были стабильно трансформированы введенной ДНК, можно отбирать посредством дополнительного введения одного или нескольких маркеров, обеспечивающих селекцию клеток-хозяев,которые содержат вектор экспрессии. Кроме того, маркер может обеспечивать фототрофию для ауксотрофного организма-хозяина, устойчивость к биоцидам, например антибиотикам или тяжелым металлам,таким как медь, или т.п. Селектируемый ген-маркер можно непосредственно связывать с подлежащими экспрессии последовательностями ДНК для генов или вводить в ту же самую клетку посредством совместной трансфекции. Дополнительные элементы векторов также могут быть эффективными для достижения оптимального получения белков согласно изобретению, в частности для отбора конкретной клетки, содержащей плазмидный или вирусный вектор: легкость, с которой содержащие вектор клетки-реципиенты могут быть распознаны и отделены от клеток-реципиентов, не содержащих вектор; количество копий вектора,которое желаемо в конкретном организме-хозяине; а также желательна ли способность вектора к "челночным перемещениям" между клетками-хозяевами различных видов. После того как для экспрессии конструкции(ий) ДНК были получены содержащий конструкцию(ии) вектор(ы) или последовательность ДНК, их можно вводить в соответствующую клетку-хозяин любым из множества приемлемых способов: трансформацией, трансфекцией, конъюгацией, слиянием протопластов,электропорацией, осаждением посредством фосфата кальция, прямой микроинъекцией и т.д. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими. Предпочтительными являются эукариотические организмы-хозяева, например клетки млекопитающих, такие как клетки человека,обезьяны, мыши и клетки яичника китайского хомячка (СНО), поскольку они обеспечивают посттрансляционные модификации белковых молекул, в том числе надлежащую укладку или гликозилирование надлежащих участков. Клетки дрожжей также могут осуществлять посттрансляционные модификации пептидов, в том числе гликозилирование. Существует множество способов рекомбинантной ДНК, в которых используют последовательности сильных промоторов и большое число копий плазмид, которые можно применять для получения желаемых белков в дрожжах. Дрожжи распознают лидерные последовательности в продуктах клонированных генов млекопитающих и секретируют пептиды, содержащие лидерные последовательности (т.е. препептиды). После введения вектора(ов) клетки-хозяева выращивают в селективной среде, посредством которой проводят селекцию на предмет роста клеток, содержащих вектор. Экспрессия последовательности(ей) клонированного гена приводит к получению желаемых белков. Во многих обзорах и книгах представлены указания относительно того, как клонировать и получать рекомбинантные белки с использованием векторов и прокариотических или эукариотических клетокхозяев, например в некоторых документах из серий "A Practical Approach", опубликованных Oxford University Press ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mammalian Systems", 1996;"Protein Expression", 1999; "Protein Purification Techniques", 2001). Примеры способов химического синтеза, которые более всего показаны для получения связывающего FGF2 средства согласно изобретению, когда оно находится в виде пептида или пептидных миметиков, представляют собой твердофазный синтез и жидкофазный синтез. Например, в случае твердофазного синтеза аминокислоту, соответствующую С-концевому участку подлежащего синтезу пептида, связывают с носителем, который не растворим в органических растворителях, и посредством поочередного повтора реакций удлиняют таким образом пептид, где в ходе одной реакции аминокислоты вместе с их аминогруппами и функциональными группами боковых цепей, защищенные соответствующими защитными группами, конденсируют одну за другой в порядке от С-концевого участка к N-концевому участку,а в ходе другой реакции высвобождают связанные со смолой аминокислоты или защитную группу на аминогруппах пептидов. В основном, способы твердофазного синтеза в зависимости от используемого типа защитной группы подразделяют на способ tBoc и способ Fmoc. Как правило, используемые защитные группы включают(бензил), Fmoc (9-флуоренилметоксикарбонил), Mbh (4,4'-диметоксидибензгидрил), Mtr (4-метокси-2,3,6 триметилбензолсульфонил), Trt (тритил), Tos (тозил), Z (бензилоксикарбонил) и Cl2-Bzl (2,6 дихлорбензил) для аминогрупп; NO2 (нитрогруппу) и Pmc (2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил) для гуанидиногрупп и tBu (трет-бутил) для гидроксильных групп). После синтеза желаемого пептида его подвергают реакции снятия защиты и отделяют от твердого носителя. Такую реакцию отделения пептида можно проводить с использованием фтороводородной кислоты или трифторметансульфоновой кислоты в случае способа Boc и с использованием ТФА в случае способа Fmoc. В конечном итоге связывающие FGF2 средства, полученные способами рекомбинантной ДНК или химического синтеза, подвергают одной или нескольким стадиям очистки. Очистку можно проводить любым из известных для этой цели способов, т.е. любым общепринятым способом, в том числе экстракцией, осаждением, хроматографией, электрофорезом или т.п. Например, можно использовать ВЭЖХ(высокоэффективную жидкостную хроматографию). Элюцию можно проводить с использованием растворителя на основе вода-ацетонитрил, обычно применяемого для очистки белков. Изобретение относится к очищенным препаратам связывающих FGF2 средств согласно изобретению. В рамках настоящей заявки очищенные препараты относятся к препаратам, которые содержат по меньшей мере 1%, предпочтительно по меньшей мере 5% сухой массы соединений согласно изобретению. Описанные выше соединения согласно изобретению (белки, пептиды, органические соединения) можно использовать в качестве лекарственного средства, предпочтительно в качестве средства против заболевания, обусловленного измененным ангиогенезом. Более предпочтительно измененный ангиогенез вызван измененной активацией фактора роста FGF2. Еще более предпочтительно заболевание выбирают из группы, состоящей из артрита, метастазирования опухоли, диабетической ретинопатии, псориаза,хронического воспаления, артериосклероза или опухоли. Предпочтительно опухоль выбирают из группы саркомы, карциномы, карциноидной опухоли, опухоли костной ткани или нейроэндокринной опухоли. Описанные выше соединения согласно изобретению (белки, пептиды, органические соединения) можно использовать в качестве средств против заболеваний, связанных с неконтролируемой, зависимой от FGF2 пролиферацией фибробластов или гладкомышечных клеток, рубцевания, связанного с чрезмерной реакцией фибробластов, и рестеноза после ангиопластики. Действительно, связывающие FGF2 пептиды согласно изобретению, связываясь с FGF2, действуют как ингибитор FGF2. В самом деле, пептиды способны ингибировать индуцируемую FGF2 пролиферацию эндотелиальных клеток или гладкомышечных клеток. Поэтому терапевтический потенциал такой молекулы заключается в профилактике и/или лечении заболеваний, при которых ингибирование FGF2 является благоприятным. Этот последний эффект также можно использовать для уменьшения популяции клеток, экспрессирующих FGF2. Связывающие FGF2 пептиды согласно изобретению можно использовать в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях для профилактики и/или лечения заболеваний, обусловленных измененным ангиогенезом, где измененный ангиогенез вызван измененной активацией FGF2. Примером указанных заболеваний является: артрит, метастазирование опухоли, диабетическая ретинопатия, псориаз, хроническое воспаление, артериосклероз или опухоль, где опухоль, например, представляет собой саркому, карциному, карциноидную опухоль, опухоль костной ткани или нейроэндокринную опухоль. Связывающие FGF2 средства согласно изобретению можно также использовать в качестве активных ингредиентов в фармацевтических композициях для профилактики и/или лечения заболеваний, связанных с неконтролируемой, зависимой от FGF2 пролиферацией фибробластов или гладкомышечных клеток, например, рубцеванием, связанным с чрезмерной реакцией фибробластов, и рестеноза после ангиопластики. Также настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пептида формулы I или его функциональных производных, а также приемлемые разбавители и/или наполнители, и/или вспомогательные фармацевтические средства для про-6 015339 филактики и/или лечения указанных выше заболеваний. Эти фармацевтические композиции можно составлять в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями, стабилизаторами или разбавителями. В зависимости от свойств средства фармацевтическая композиция может быть эффективна при заболеваниях, связанных с Т-клетками CD4+, например при аутоиммунных заболеваниях,воспалениях или инфекциях. Фармацевтические композиции, которые содержат связывающие FGF2 пептиды согласно настоящему изобретению, включают все композиции, где указанное соединение содержится в терапевтически эффективном количестве, т.е. количестве, эффективном для достижения желаемого медицинского эффекта у животного, которому проводят лечение. Фармацевтические композиции могут содержать эффективные фармацевтически приемлемые носители, биологически совместимые инертные вещества, приемлемые для введения животному (например, физиологический раствор), а также при соответствующих условиях композиции содержат вспомогательные средства (такие как наполнители, стабилизаторы или разбавители), способствующие преобразованию активных соединений в препараты, которые можно использовать в фармацевтических целях. Фармацевтические композиции можно составлять любым приемлемым образом, удовлетворяющим требованиям конкретного способа введения. В литературе описано использование биоматериалов и других полимеров для доставки лекарственного средства, а также различные способы и модели для подтверждения правильного выбора конкретного способа введения. Также эффективны модификации соединений согласно изобретению для улучшения проникновения через гематоэнцефалический барьер. Любой приемлемый способ введения может быть использован и определен специалистами в данной области. Например, введение можно осуществлять различными парентеральными способами, такими как подкожное, внутривенное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, интраназальное, трансдермальное, пероральное или буккальное введение. Парентеральное введение можно осуществлять болюсной инъекцией или постепенной перфузией в течение определенного времени. Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии, которые могут содержать известные в данной области вспомогательные средства или наполнители и могут быть получены общепринятыми способами. Кроме того, можно вводить суспензию активных соединений в виде соответствующих масляных суспензий для инъекции. Приемлемые липофильные растворители или носители включают жирные масла, например кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, например этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекции, которые могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, включают, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Необязательно,суспензия может также содержать стабилизаторы. Фармацевтические композиции включают растворы,приемлемые для введения инъекцией, и содержат от приблизительно 0,01 до 99%, предпочтительно от приблизительно 20 до 75% активного соединения вместе с наполнителем. Композиции, которые можно вводить ректально, включают суппозитории. Понятно, что вводимая доза зависит от возраста, пола, состояния здоровья и массы реципиента, вида сопутствующего лечения, при наличии такого, частоты проведения лечения и природы желаемого эффекта. Дозу подбирают для конкретного субъекта, как понимает и определяет специалист в данной области. Суммарную дозу, необходимую для каждого лечения, можно вводить в виде многократных доз или в виде разовой дозы. Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить отдельно или в сочетании с другими терапевтическими средствами, направленными против заболевания или направленными против других симптомов заболевания. Как правило, суточная доза активного ингредиента составляет от 0,01 до 100 мг на 1 кг массы организма. Соединения согласно настоящему изобретению можно вводить пациенту внутривенно в фармацевтически приемлемом носителе, таком как физиологический раствор. Можно использовать общепринятые способы внутриклеточной доставки пептидов, например доставку посредством липосом. Такие способы хорошо известны специалистам в данной области. Препараты согласно этому изобретению эффективны для парентерального введения, такого как внутривенное, подкожное, внутримышечное и внутрибрюшинное. Как хорошо известно в области медицины, дозы для любого пациента зависят от множества факторов, в том числе размера пациента, площади поверхности тела, возраста, конкретного соединения,подлежащего введению, пола, времени и способа введения, общего состояния здоровья и других параллельно вводимых лекарственных средств. Все цитируемые в настоящей заявке ссылки включены сюда в качестве ссылки в полном объеме,включая все данные, таблицы, фигуры и текст, представленные в цитируемых ссылках. Кроме того, полное содержание ссылок, которые цитируются в цитируемых в настоящей заявке ссылках, также приведено здесь полностью в качестве ссылки. Ссылки на известные стадии способов, стадии общепринятых способов, известные способы или общепринятые способы никаким образом не являются признанием того, что какой-либо аспект, описание или вариант осуществления настоящего изобретения описан, указан или предположен в соответствующей области. Поняв особенности способов и продуктов, описанных в настоящей заявке, можно легко вывести необходимость и тип дополнительных стадий из обзора предшествующей области, а также из следующих ниже неограничивающих фигур и примеров, в которых-7 015339 описаны основные детали и некоторые варианты использования изобретения. Описание чертежей Фиг. 1 - ингибирование митогенной аткивности FGF2 посредством трансдуцированных ретровирусом Nterm-PTX3. (A) Анализ посредством вестерн-блоттинга для кондиционированной среды из клеток эндотелия аорты мыши (МАЕ), инфицированных EGFP, полноразмерным ретровирусом человека РТХ 3,ретровирусами sCterm-PTX3 или Nterm-PTX3. Две иммунореактивные полосы, присутствующие на дорожке для sCterm-PTX3, соответствуют гликозилированной и негликозилированной формам рекомбинантного белка 10. (В) Инфицированные ретровирусом клетки МАЕ стимулировали с использованием FGF2 (0,55 нМ). Через 48 ч клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали. Данные выражают в виде процента пролиферации, наблюдаемой у псевдоинфицированных клеток, обрабатываемых FGF2 (0,8 удвоения клеточной популяции). (С) Клетки GM7373 инкубировали с использованием кондиционированной среды от инфицированных клеток МАЕ и сразу обрабатывали посредством 0,55 нМ FGF2. Через 24 ч клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали. Данные выражают в виде процента пролиферации, наблюдаемой у клеток GM7373, инкубируемых в свежей среде вместе с FGF2 (1,0 удвоения клеточной популяции). В В и С данные представляют собой среднее значение SD для 3 независимых экспериментов в трех сериях. Фиг. 2 - ингибирование взаимодействия FGF2/PTX3 посредством рекомбинантного Nterm-PTX3. (А) Рекомбинантный 6His-меченный Nterm-PTX3 и Cterm-PTX3 экспрессировали и очищали из трансформированных клеток Е. coli (во вставке представлено окрашивание серебром геля SDS-PAGE, в который поместили очищенные белки). Затем покрытые посредством FGF2 лунки инкубировали вместе с полноразмерным РТХ 3, Nterm-PTX3 или Cterm-РТХ 3 (все при концентрации 44 нМ) в течение 30 мин при 37 С. Относительное количество белка, связавшегося с иммобилизованным FGF2, регистрировали иммунологическим способом посредством инкубации с поликлональным антителом кролика против РТХ 3, как описано в "Веществах и способах". (В) Покрытые посредством FGF2 лунки инкубировали вместе с биотинилированным РТХ 3 (bPTX3, 22 нМ) в отсутствие или при наличии 10-кратного молярного избытка полноразмерного РТХ 3, Nterm-PTX3 или Cterm-PTX3. Затем измеряли количество bPTX3, связавшегося с иммобилизованным FGF2, а данные выражали в виде процента связывания, измеряемого в отсутствие какоголибо конкурентного вещества. Все данные представляют собой среднее значение SD для 3 независимых экспериментов в трех сериях. Фиг. 3 - картирование эпитопа РТХ 3. (А) Полноразмерный РТХ 3, Nterm-РТХ 3 и Cterm-РТХ 3 (200 нг/дорожка) анализировали вестерн-блоттингом с использованием моноклональных антител mAb-MNB4 и mAb-16 В 5. (В) 128 перекрывающихся пептидов, состоящих из 13 мономеров, покрывающих всю последовательность РТХ 3 человека, группировали на целлюлозных мембранах посредством способа SPOTсинтеза. Затем на мембраны воздействовали антителами mAb-MNB4 (черные столбцы) и mAb-16B5 (серые столбцы) и количественно определяли иммунокомплексы денситометрическим анализом мембран. Аминокислотная последовательность пептидов РТХ 3, распознаваемая двумя антителами, представлена в виде однобуквенного кода курсивным шрифтом с подчеркиванием. Фиг. 4 - mAb-MNB4 препятствует взаимодействию FGF2/PTX3. (А) Покрытые посредством FGF2 лунки инкубировали вместе с 22 нМ bPTX3 в отсутствие или в присутствии полноразмерного РТХ 3,mAb-MNB4 или mAb-16B5 (все в концентрации 220 нМ). Затем измеряли количество bPTX3, связавшегося с иммобилизованным FGF2, а данные выражали в виде процента связывания, измеряемого в отсутствие какого-либо конкурентного вещества. (В) Клетки GM7373 инкубировали вместе с FGF2 (0,55 нМ) вместе с РТХ 3 (220 нМ) в отсутствие или в присутствии mAb-MNB4 или mAb-16B5 (оба в концентрации 2,2 мкМ). Через 24 ч клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали. Данные выражают в виде процента пролиферации, наблюдаемой у клеток GM7373, которые инкубируют только с FGF2. Все данные представляют собой среднее значение SD для 3 независимых экспериментов в трех сериях. Фиг. 5 - ингибирование взаимодействия FGF2/PTX3 синтетическими пептидами РТХ 3. (А) Схематическое представление N-концевого РТХ 3 человека и родственных синтетических пептидов РТХ 3. (В) В лунки, покрытые указанными пептидами РТХ 3 (200 мкг/лунка), добавляли FGF2 (80 нМ) и оценивали количество связавшегося FGF2. Данные, выраженные в виде процента количества FGF2, связавшегося с покрытыми РТХ 3 лунками, представляют собой среднее значение SD для 3 независимых экспериментов в трех сериях. (С) Верхняя панель: вспрыскивали FGF2 (0,8 мкМ) над покрытыми РТХ 3 или покрытыми желатином сенсорными чипами BIAcore. Нижняя панель: лист сенсограммы, на котором представлено связывание FGF2 (0,1, 0,5, 0,8 и 1,1 мкМ) в возрастающих количествах с иммобилизованным РТХ 3. Реакцию (в RU, резонансных единицах) регистрировали как функцию времени. (D) впрыскивали FGF2(0,8 мкМ) над покрытым РТХ 3 сенсорном чипом BIAcore в присутствии возрастающих концентраций полноразмерного РТХ 3 или синтетических пептидов РТХ 3 (82-110)смешанного РТХ 3(82-110)или РТХ 3(57-85) ( ). Регистрировали ответную реакцию по окончании впрыскивания и наносили на график как функцию концентрации антагониста. Для каждого пептида получали сходные результаты в 2-3 независимых экспериментах. (Е) Клетки GM7373 инкубировали вместе с FGF2 (0,55 нМ) в отсутствие или в присутствии РТХ 3 (220 нМ) или указанных пептидов РТХ 3 (все в концентрации 66 мкМ). Данные,-8 015339 выраженные в виде процента пролиферации, наблюдаемой у клеток GM7373, которые инкубируют только с FGF2, представляют собой среднее значение SD для 3 независимых экспериментов в трех сериях. Фиг. 6 - пептид РТХ 3(97-110) как антагонист FGF2. (А) Схематическое представление перекрывающих пептидов РТХ 3(82-110). (В) Лунки, покрытые указанными пептидами РТХ 3 (200 мкг/лунка),инкубировали вместе с FGF2 (80 нМ) и оценивали количество связавшегося FGF2. Данные, выраженные в виде процента количества FGF2, связавшегося с покрытыми РТХ 3 лунками, представляют собой среднее значение SD для 3 независимых экспериментов в трех сериях. (С) Впрыскивали FGF2 (0,8 мкМ) над покрытым РТХ 3 сенсорным чипом BIAcore в присутствии возрастающих концентраций РТХ 3(82-110) РТХ 3(97-110) (о), РТХ 3 (82-101)или РТХ 3(82-96) . Регистрировали ответную реакцию по окончании впрыскивания и наносили на график как функцию концентрации антагониста. Для каждого пептида получали сходные результаты в 2-3 независимых экспериментах. (D) Клетки GM7373 инкубировали вместе с FGF2 (0,55 нМ) в отсутствие или в присутствии указанных пептидов РТХ 3 (все в концентрации 66 мкМ). Данные, выраженные в виде процента пролиферации, наблюдаемой у клеток GM7373,которые инкубируют только с FGF2, представляют собой среднее значение SD для 3 независимых экспериментов в трех сериях. (Е) Впрыскивали FGF2 (0,8 мкМ) над покрытым РТХ 3 сенсорным чипомBIAcore в присутствии возрастающих концентраций РТХ 3(97-110) , РТХ 3(100-110) , РТХ 3 (97-104) или РТХ 3 (97-107) , РТХ 3(104-113) , РТХ 3(100-113) , РТХ 3(100-104) . Регистрировали ответную реакцию по окончании впрыскивания и наносили на график как функцию концентрации антагониста. Для каждого пептида получали сходные результаты в 2-3 независимых экспериментах. Фиг. 7 - антиангиогенная активность пептида РТХ 3(82-110). Фотографировали на 14 сутки хорионаллантоисную мембрану эмбриона цыпленка (САМ), имплантированную на 11 сутки вместе с гранулами альгината, содержащими носитель (а) или 16 пмоль FGF2 в отсутствие (b) или в присутствии (с) 3 нмоль РТХ 3(82-110). Исходное увеличение, 5. Примеры Пример 1. Вещества и способы. Химические вещества. Рекомбинантный FGF2 человека (уникальный идентификатор 09038) и РТХ 3 (уникальный идентификатор Swiss-Prot P26022) экспрессировали в Е. coli и клетках яичника китайского хомячка соответственно и очищали, как описано в 10,19. Синтетические пептиды РТХ 3(31-60), РТХ 3(57-85) и РТХ 3(107-132) человека получали из Primm (Milan, Italy), все остальные пептиды получали из Tecnogen (Piana di Monteverna, Caserta, Italy) (степень чистоты ВЭЖХ 95%). Аминокислотная последовательность для всех пептидов представлена в табл. 1 в виде однобуквенного кода, а нумерация начинается с метионинового остатка в положении 1 в лидерной последовательности РТХ 3. Таблица 1 Синтетические пептиды, покрывающие N-концевой РТХ 3 человека Ранее были описаны моноклональные антитела крысы, направленные против очищенного РТХ 3 человека 10,20 (MNB1, номер в каталоге ALX-804-463, MNB4, номер в каталоге ALX-804-464, Alexis Biochemicals). Культуры клеток. Эндотелиальные клетки аорты бычьего эмбриона GM737321 выращивали на MEM Игла, содержа-9 015339 щей 10% эмбриональную телячью сыворотку (FCS). Клетки-упаковщики эмбриональной почки человека(EcoPack2-293) (Clontech, C.A., USA) выращивали на DMEM (Life Technologies, Gaithersburg, M.D.), содержащей 10% FCS. Эндотелиальные клетки аорты мыши Balb/c 22106 (клетки МАЕ) получали от R.Auerbach (University of Wisconsin, Madison, W.I.) и выращивали на DMEM с добавкой 10% FCS. Ретровирусная инфекция. кДНК, кодирующие РТХ 3 человека и улучшенный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) получали, как описано в 17. кДНК, кодирующие N-концевой фрагмент РТХ 3 (1-178) (Nterm-PTX3) и С-концевой фрагмент РТХ 3(179-381), слитые с лидерной последовательностью для секреции РТХ 3 (1-17) (sCtermPTX3), получали из pLX-РТХ 317 с использованием ПЦР общепринятых способов клонирования. Все кДНК клонировали в ретровирусный вектор рВАВЕ, получая таким образом рВАВЕ-РТХ 3, pBABE-NtermРТХ 3, pBABE-sCterm-PTX3 и pBABE-EGFP, которые использовали для трансфицирования клетокупаковщиков EcoPack2-293 в присутствии липофектамина 17. Трансдуцированные клетки отбирали в течение 2 недель с использованием пуромицина (1 мкг/мл, Sigma). Для дальнейших экспериментов использовали клоны с титром вирусов, превышающим 106 колониеобразующих ед./мл. Затем достигшие смыкания монослоя культуры клеток МАЕ инкубировали в течение 24 ч вместе с кондиционированной средой от рВАВЕ-РТХ 3, рВАВЕ-Nterm-РТХ 3, pBABE-sCterm-РТХ 3 или клеток-упаковщиков pBABE-EGFP в присутствии полибрена (8 мкг/мл, Sigma). Популяции инфицированных клеток отбирали в течение 7 суток с использованием пуромицина. При наблюдении инфицированных EGFP клеток посредством эпифлуоресцентной микроскопии (микроскоп Axiovert S100, 10/0,25; Zeiss, Gottingen, Germany) было выявлено, что эффективность ретровирусной инфекции превышала 80%. Для оценки уровней экспрессии и высвобождения трансгенного белка инфицированными клетками выращивали в течение 2 суток клеточные культуры в не содержащих сыворотку условиях. Затем кондиционированные среды собирали, очищали центрифугированием, 10-кратно концентрировали с использованием фильтров Centricon YM-10 (Millipore) и анализировали аликвоты 100 мкл посредством анализа вестерн-блоттингом. Анализ пролиферации клеток. Анализ клеточной пролиферации для эндотелиальных клеток проводили, как описано в 22. Вкратце,клетки GM7373 или МАЕ высевали в 96-луночные планшеты при 75000 клеток/см 2 или 25000 клеток/см 2 соответственно. Через 16 ч клетки инкубировали в свежей среде, содержащей 0,4% FCS вместе с FGF2(0,55 нМ), в отсутствие или в присутствии различных антагонистов. Через 24 или 48 ч соответственно клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали в камере Бюркера. Экспрессия и очистка фрагментов рекомбинантного 6His-меченного РТХ 3 из E. Coli. Амплифицировали кДНК Nterm-PTX3 и Cterm-РТХ 3 из pLX-РТХ 3 посредством ПЦР с использованием праймеров, содержащих дополнительные нуклеотиды Эти кДНК клонировали в вектор pENTR TOPO (набор для клонирования pENTR Directional TOPO,Invitrogen) и проводили секвенирование. Затем с использованием способа Gateway (Invitrogen) кДНКNterm-PTX3 и Cterm-PTX3 из вектора pENTR TOPO клонировали в вектор pDEST17, обеспечивая вставку 6His-метки в С-концевой участок рекомбинантных белков. Затем клетки Е. coli BL21-AI (Invitrogen) трансформировали посредством двух рекомбинантных плазмид и выращивали при 37 С в среде LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Экспрессию рекомбинантного белка индуцировали посредством инкубации в течение ночи при 30 С в присутствии 0,2% L-арабинозы. После индукции клетки ресуспендировали в буфере для связывания (20 мМ фосфата натрия, 0,5 М NaCl, 10 мМ имидазола, рН 7,4) и лизировали воздействием ультразвука. Очищенные супернатанты фильтровали через фильтр 0,45 мкм и помещали для очистки в аффинную колонку с иммобилизованным металлом (IMAC) HiTrap, с никелем,объемом 3,0 мл (Amersham Biosciences). Колонку промывали 100 мМ имидазола в буфере для связывания и элюировали связавшиеся белки с использованием 300 мМ имидазола в соответствии с указаниями производителя. Фракции анализировали на предмет наличия рекомбинантного белка посредством иммуноблоттинга, а положительные фракции собирали и обессоливали гельфильтрационной хроматографией (колонка сефадекс G25 PD10, Amersham) в PBS. Степень чистоты рекомбинантных белков превышала 90%, как оценивали посредством SDS-PAGE с последующим окрашиванием геля серебром (см. вставку в фиг. 2 А). Твердофазный анализ связывания. Микропланшеты для ELISA инкубировали в течение 16 ч при 4 С вместе с 100 мкл/лунка 100 мМNaHCO3, рН 9,6 (буфер для нанесения покрытия), содержащим FGF2 (270 нМ). Затем лунки в течение 2 ч при комнатной температуре покрывали 5% сухим молоком в буфере для нанесения покрытия. После этого аликвоты PBS 100 мкл, содержащие полноразмерный РТХ 3, рекомбинантный Nterm-РТХ 3 или Cterm- 10015339PTX3 (все в концентрации 44 нМ), инкубировали в течение 30 мин при 37 С в лунках, покрытых FGF2. Затем лунки последовательно инкубировали в течение 1 ч при 37 С вместе с поликлональным антителом кролика против РТХ 3 (разведение 1:2000), распознающим оба фрагмента РТХ 3 с одинаковой эффективностью в вестерн-блоттинге и ELISA, биотинилированным антителом против кролика (1:2000) и 100 мкл стрептавидин-пероксидазы хрена (1:5000, Amersham) в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого добавляли 100 мкл/лунка хромогенного субстрата в виде 2,29-азин-бис(3 этилбензтиазолинсульфоновой кислоты). Величины поглощения регистрировали при 405 нм на автоматическом считывающем устройстве для ELISA. В некоторых экспериментах аликвоты PBS 100 мкл, содержащие меченный биотином РТХ 3 (bPTX3) (22 нМ), инкубировали в течение 30 мин при 37 С в покрытых FGF2 лунках в присутствии или отсутствие конкурирующих веществ. Затем лунки промывали и оценивали количество связавшегося bPTX3, как описано в 17. Альтернативно, фиксировали синтетические пептиды РТХ 3 в лунках микропланшета для ELISA (200 мкг/лунка), как описано выше. После этого добавляли FGF2 (80 нМ) и оценивали количество FGF2, связавшегося с иммобилизованными пептидами,посредством инкубации в течение 1 ч при 37 С вместе с поликлональным антителом кролика противFGF2 (1:7000) с последующей регистрацией иммунокомплекса, как описано выше. Картирование эпитопа РТХ 3. Для выявления аминокислотной последовательности эпитопов, связывающихся с моноклональными антителами против РТХ 3, группировали 128 пептидов на целлюлозных мембранах с использованием способа SPOT-синтеза 23. Длина пептидов составляла 13 аминокислот при 3-аминокислотном сдвиге рамки считывания. Мембраны блокировали 2% молоком в Tween-TBS (MBS) в течение 16 ч при 4 С. После промывки мембраны инкубировали в течение 90 мин при 37 С вместе с моноклональными антителамиmAb MNB4 или mAb 16B5 (оба при разведении 1:1000 в MBS), а затем инкубировали в течение 90 мин при 37 С вместе с конъюгированным со щелочной фосфатазой IgG кролика против крысы (1:30000,Sigma) в MBS. Получали реакцию окрашивания, как описано в 23, и оценивали интенсивность сигнала денситометрическим анализом мембраны. Анализ связывания BIAcore. Использовали устройство BIAcore X (BIAcore Inc, Piscataway, NJ). Для измерения изменений показателя преломления, которые обусловлены способностью FGF2 связываться с РТХ 3, иммобилизованным на сенсорном чипе BIAcore, использовали поверхностный плазмонный резонанс. С этой целью позволяли РТХ 3 (2,2 мкМ) взаимодействовать с проточной ячейкой в сенсорном чипе СМ 4, которая была предварительно активирована посредством 50 мкл смеси 0,2 М гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и 0,05 М N-гидроксисукцинимида. Эти экспериментальные условия обеспечивали иммобилизацию 5000 резонансных единиц (RU), соответствующих приблизительно 0,1 пмоль РТХ 3. Сходные результаты получали для иммобилизации желатина, используемого в настоящей заявке в качестве отрицательного контроля, и для вычитания фоновых значений. Затем FGF2 в возрастающих концентрациях в присутствии или отсутствие синтетических пептидов РТХ 3 в буфере для разведения (PBS вместе с 0,005% поверхностно-активным веществом Р 20, 5,0 мкг/мл CaCl2 и MgCl2) впрыскивали в течение 4 мин над поверхностью РТХ 3 (для обеспечения их связывания с иммобилизованным РТХ 3), а после этого промывали до тех пор, пока не наблюдали диссоциации. Анализ с использованием хорионаллантоисной мембраны эмбриона цыпленка (САМ). Альгинатные гранулы (5 мкл), содержащие носитель или 16 пмоль FGF2 в присутствии или отсутствии синтетических пептидов РТХ 3, получали, как описано в 24, и помещали на верхнюю поверхность САМ из оплодотворенных яиц цыплят породы белый леггорн после 11 суток инкубации (10 яиц на экспериментальную группу). Через 72 ч подсчитывали количество сходящихся к имплантату кровеносных сосудов посредством двух наблюдений двойным слепым способом с использованием стереомикроскопаN-Концевой участок РТХ 3 связывает FGF2. Белок РТХ 3 характеризуется С-концевым доменом из 203 аминокислот (Cterm-PTX3), обладающим гомологией с классическими короткими пентраксинами CRP и SAP, и N-концевым удлиняющим участком из 178 аминокислот (Nterm-PTX3), для которого не показано какой-либо значительной гомологии с каким-либо известным белком 8. При попытке выявить антиангиогенный, связывающий FGF2 домен(ы) РТХ 3 оценивали два участка Cterm или Nterm-PTX3 на предмет их способности взаимодействовать с FGF2. В ходе предшествующих наблюдений было показано, что сверхэкспрессия полноразмерного РТХ 3 приводит к ингибированию зависящей от FGF2 пролиферации клеток эндотелия, что обусловлено связыванием высвобождаемого РТХ 3 с экзогенным фактором роста и его блокированием во внеклеточной среде 17. Исходя из этого, эндотелиальные клетки аорты мыши (МАЕ) инфицировали ретровирусами, содержащими полноразмерный РТХ 3 человека, N-концевой удлиняющий участок РТХ 3 Nterm-PTX3 или Сконцевой участок РТХ 3, слитые с лидерной последовательностью РТХ 3 для секреции (sCterm-PTX3). Контрольные клетки инфицировали посредством ретровируса, содержащего EGFP. Инфицированные клетки сверхэкспрессировали и высвобождали соответствующие белки в сходных количествах (фиг. 1 А), и для них наблюдали сходную скорость роста в основных условиях. Однако сверхэкспрессия Nterm-PTX3 вы- 11015339 звала значительное снижение способности инфицированных клеток к пролиферации в ответ на экзогенный FGF2, что является сходным со сверхэкспрессией полноразмерного РТХ 3 (фиг. 1 В). В отличие от этого, сверхэкспрессия sCterm-PTX3 не вызывала ингибирования в сравнении с контрольными клетками,инфицированными посредством EGFP. Для дополнительной оценки способности Nterm-PTX3 действовать в качестве антагониста FGF2 оценивали кондиционированные среды от инфицированных клеток МАЕ на предмет способности воздействовать на зависящую от FGF2 пролиферацию эндотелиальных клеток GM7373 (фиг. 1 С). Как и предполагали, инкубация клеток GM7373 вместе с FGF2 в присутствии кондиционированной среды от клеток МАЕ, инфицированных посредством Nterm-PTX3 или РТХ 3, вызывала значительное ингибирование митогенной активности фактора роста, тогда как кондиционированные среды от клеток МАЕ, инфицированных посредством sCterm-PTX3 и EGFP, были неэффективными (фиг. 1 С). Ни одна из кондиционированных сред не вызывала значительного ингибирования пролиферации клеток GM7373, запускаемой посредством 10% FCS, что тем самым подтверждает специфичность эффекта. Для подтверждения того, что активность Nterm-PTX3 как антагониста FGF2 была обусловлена его способностью непосредственно взаимодействовать с фактором роста, Nterm-PTX3 экспрессировали и очищали из трансформированных клеток Е. coli в виде рекомбинантного 6His-меченного белка; в качестве контроля использовали очищенный рекомбинантный 6His-меченный Cterm-PTX3 (фиг. 2 А, вставка). При оценке взаимодействия FGF2 у полноразмерного РТХ 3 и фрагмента рекомбинантного Nterm-PTX3 наблюдали способность связываться с FGF2, иммобилизованным на пластмассе для нетканевых культур. В отличие от этого, для рекомбинантного Cterm-PTX3 взаимодействия не наблюдали (фиг. 2 А). Соответственно, 10-кратный молярный избыток рекомбинантного Nterm-РТХ 3 или полноразмерного РТХ 3, но неCterm-PTX3, предотвращал связывание биотинилированного РТХ 3 (bPTX3) с иммобилизованным FGF2(фиг. 2 В). Взятые вместе эти результаты означают, что за связывание с FGF2 ответственен N-концевой участок РТХ 3. Ингибирование взаимодействия FGF2/PTX3 моноклональным антителом против Nterm-PTX3. При скрининге набора моноклональных антител крысы, получаемых против полноразмерного РТХ 3 человека, были выявлены антитела mAb-MNB420 (MNB4, номер в каталоге ALX-804-464, Alexis Biochemicals) и mAb-16B510 (MNB1, номер в каталоге ALX-804-463, Alexis Biochemicals), которые при вестернблоттинге избирательно связывают рекомбинантный Nterm-PTX3 и Cterm-PTX3, соответственно (фиг. 3 А). Для картирования эпитопов РТХ 3, распознаваемых двумя антителами, авторы изобретения использовали преимущество способа SPOT-синтеза 23, посредством которого на целлюлозной мембране группировали 128 перекрывающихся, состоящих из 13 мономеров пептидов, охватывающих всю последовательность РТХ 3 человека. В случае воздействия на мембрану двумя моноклональными антителами при регистрации иммунокомплекса было выявлено, что mAb-MNB4 распознает эпитоп РТХ 3(87-99), представленный на N-концевом удлиняющем участке РТХ 3, тогда как mAb-16B5 распознает эпитоп РТХ 3(306-312), расположенный на С-концевом участке РТХ 3 (фиг. 3 В). При тестировании способности воздействовать на взаимодействие FGF2/PTX3 mAb-MNB4, но неmAb-16B5, препятствует способности bPTX3 связывать зафиксированный FGF2, что сходно со случаем молярного избытка свободного немеченого РТХ 3 (фиг. 4 А). Соответственно, mAb-MNB4 устраняет способность полноразмерного РТХ 3 ингибировать митогенную активность, вызываемую FGF2 у эндотелиальных клеток GM7373, тогда как mAb-16B5 является неэффективным (фиг. 4 В). Таким образом, mAbMNB4, распознающее N-концевой эпитоп РТХ 3(87-99), нейтрализует взаимодействие FGF2/PTX3. Синтетические Nterm-PTX3-родственные пептиды как антагонисты FGF2. Для дальнейшего определения связывающего FGF2 участка в N-концевом удлиняющем участке РТХ 3 авторы изобретения оценивали активность синтетического пептида РТХ 3(82-110) как антагонистаFGF2, где пептид содержит эпитоп РТХ 3(87-99), распознаваемый нейтрализующим mAb-MNB4 (см. выше), вместе с тремя отдельными синтетическими пептидами РТХ 3(31-60), РТХ 3(57-85) и РТХ 3(107-132),частично покрывающих аминокислотную последовательность Nterm-PTX3 (фиг. 5 А). В первом наборе экспериментов четыре синтетических фрагмента РТХ 3 оценивали на предмет их способности взаимодействовать с FGF2 в твердофазном анализе связывания. Как представлено на фиг. 5 В, свободный FGF2 связывается с РТХ 3(82-110), иммобилизованным на пластмассе для нетканевых культур, но не с иммобилизованным РТХ 3(31-60) или РТХ 3(57-85), проявляя лишь ограниченное взаимодействие с иммобилизованным РТХ 3(107-132). Затем использовали поверхностный плазмонный резонанс для оценки способности четырех пептидов воздействовать на взаимодействие FGF2/PTX3. Результаты показывают, что FGF2 (0,8 мкМ) с высокой эффективностью связывается с РТХ 3, иммобилизованным на сенсорном чипе BIAcore, (350-400 резонансных единиц, связавшихся по окончании стадии впрыскивания) (фиг. 5 С, верхняя панель). Специфичность взаимодействия показывают посредством отсутствия связывания с сенсорным чипом, покрытым желатином. Кроме того, для оценки кинетических параметров взаимодействия FGF2/PTX3 на поверхность РТХ 3 впрыскивали FGF2 в возрастающих концентрациях (от 0,1 до 1,1 мкМ, фиг .5 С, нижняя- 12015339 панель). Данные по связыванию показывают, что взаимодействие происходит с кинетической константой диссоциации (kдис), составляющей 610-5 с-1, и кинетической константой ассоциации (kас), составляющей 0,2103 с-1 М-1, тем самым приводя к величине Kd, равной 0,310-6 M-1. Исходя из этого, четыре синтетических пептида РТХ 3 оценивали на предмет их способности блокировать FGF2 в подвижной фазе, предотвращая тем самым его взаимодействие с сенсорным чипом РТХ 3. Как представлено на фиг. 5D,РТХ 3(82-110) ингибирует связывание FGF2 с поверхностью РТХ 3 зависящим от дозы образом при эффективности в 30 раз ниже, чем эффективность, наблюдаемая для свободного полноразмерного РТХ 3(ID50 равно 1,0 мкМ и 30 мкМ для свободного РТХ 3 и пептида РТХ 3(82-110) соответственно). В отличие от этого, в тех же самых экспериментальных условиях не наблюдали ингибирующего эффекта, вызываемого пептидами РТХ 3(31-60), РТХ 3 (57-85) и РТХ 3(107-132) (фиг. 5D и другие полученные данные). Кроме того, для смешанного синтетического пептида с аминокислотным составом, совпадающим с РТХ 3(82-110) [sPTX3(82-110), табл. 1], наблюдали ограниченный ингибирующий эффект (ID503000 мкМ) (фиг. 5D), что тем самым указывает на важность первичной аминокислотной последовательности в РТХ 3(82-110) для взаимодействия с FGF2. Способность пептида РТХ 3(82-110) связывать FGF2 побудила авторов изобретения оценить его способность действовать в качестве антагониста FGF2. При тестировании на эндотелиальных клеткахGM7373 и полноразмерный РТХ 3, и РТХ 3(82-110) ингибируют митогенную активность, вызываемую экзогенным FGF2, тогда как смешанный пептид РТХ 3(82-110), пептиды РТХ 3(31-60), РТХ 3(57-85) и РТХ 3(107-132) были неэффективны (фиг. 5 Е). Кривые доза-эффект подтверждали, что активность РТХ 3(82-110) как антагониста FGF2 являлась зависящей от дозы (ID50 равно 30 мкМ и 30 нМ для РТХ 3(82-110) и РТХ 3 соответственно). Выявление минимальной линейной связывающей FGF2 последовательности в N-концевом удлиняющем участке РТХ 3. Взятые вместе представленные выше данные указывают на то, что линейная последовательность аминокислот 82-110 в N-концевом удлиняющем участке РТХ 3 играет важную роль во взаимодействии сFGF2. При попытке выявить минимальную линейную связывающую FGF2 последовательность три перекрывающихся синтетических пептида РТХ 3(82-96), РТХ 3(82-101) и РТХ 3(97-110), охватывающих всю последовательность РТХ 3(82-110) (фиг. 6 А и табл. 1), оценивали на предмет способности взаимодействовать с FGF2 в твердофазном анализе связывания. В одних и тех же экспериментальных условиях свободный FGF2 связывается с иммобилизованным РТХ 3(97-110), а также с родительским РТХ 3(82-110) и полноразмерным РТХ 3 при отсутствии взаимодействия с РТХ 3(82-96) или РТХ 3(82-101) (фиг. 6 В). Соответственно, РТХ 3(97-110) связывает FGF2 в подвижной фазе, предотвращая тем самым его взаимодействие с РТХ 3, иммобилизованным на сенсорном чипе BIAcore (фиг. 6 С). Ингибирующая активность РТХ 3(97-110) была сходной с активностью, наблюдаемой для родительского пептида РТХ 3(82-110), тогда как РТХ 3(82-96) и РТХ 3(82-101) были неэффективны (фиг. 6 С). В соответствии с этими наблюдениями РТХ 3(97-110), но не РТХ 3(82-96) или РТХ 3(82-101), ингибирует митогенную активность, вызываемую FGF2 у эндотелиальных клеток GM7373 (фиг. 6D). Для дальнейшего исследования минимальной линейной связывающей FGF2 последовательности,охватывающей пептид РТХ 3(97-110), авторы изобретения анализировали связывание представленных ниже более коротких пептидов с FGF2 посредством измерения их взаимодействия с РТХ 3, иммобилизованным на сенсорном чипе BIAcore: РТХ 3(97-107), РТХ 3(97-104), РТХ 3(100-104) и РТХ 3(100-110) (фиг. 6 Е). Для пептидов РТХ 3(97-107) и РТХ 3(100-104) наблюдали значительное связывание с FGF2. В отличие от этого пептиды РТХ 3(97-104) и РТХ 3(100-110) не предотвращали связывание свободного FGF2 с РТХ 3, иммобилизованным на сенсорном чипе BIAcore (фиг. 6 Е). Таким образом, по-видимому,РТХ 3(100-104) представляет собой минимальную линейную связывающую FGF2 последовательность аминокислот в N-концевом удлиняющем участке РТХ 3. Соответственно, РТХ 3(100-104) ингибирует индуцируемую FGF2 пролиферацию эндотелиальных клеток. Синтетические Nterm-РТХ 3-родственные пептиды ингибируют ангиогенную активность FGF2. Для оценки способности Nterm-РТХ 3-родственных пептидов воздействовать на индуцируемое FGF2 образование новых сосудов in vivo на верхнюю поверхность САМ эмбриона цыпленка в возрасте 11 суток имплантировали желатиновые губки с адсорбированным FGF2 в отдельности или с добавкой пептидов РТХ 3. Как представлено на фиг. 7, альгинатные гранулы с адсорбированным FGF2 (16 пмоль/эмбрион) вызывают сильную ангиогенную реакцию при сравнении с гранулами, на которых адсорбирован носитель (число макроскопических сосудов, сходящихся по направлению к имплантату, равно 447 и 115 сосудов/эмбрион для двух экспериментальных групп соответственно). В соответствии с наблюдениями in vitro зависящая от FGF2 ангиогенная реакция in vivo была значимо снижена (285 сосудов/эмбрион, р 0,05 при ANOVA) в результате добавления 3,0 нмоль пептида РТХ 3(82-110) к имплантатам FGF2 (фиг. 7). Соответственно, 80 нмоль РТХ 3(97-110) вызывали 50% ингибирование ангиогенной реакции, вызываемой посредством FGF2; в отличие от этого РТХ 3(82-96) эффекта не оказывал. Обсуждение. Авторами изобретения показано, что взаимодействие с FGF2 опосредуется N-концевым удлиняю- 13015339 щим участком в РТХ 3. Кроме того, в экспериментах, проведенных с использованием нейтрализующих моноклональных антител и синтетических, родственных РТХ 3 пептидов, выявлена линейная последовательность аминокислот РТХ 3(97-110) как ответственная за это взаимодействие. Эти выводы основаны на следующих экспериментальных данных: i) короткие пентраксины CRP и SAP являются неэффективными связывающими FGF2 веществами 17, несмотря на гомологию их последовательностей с С-концевым участком РТХ 37; ii) ретровирусная трансдукция N-концевого фрагмента РТХ 3(1-178) (Nterm-PTX3), но неsCterm-PTX3, ингибирует митогенную активность, вызываемую экзогенным FGF2 у эндотелиальных клеток; iii) рекомбинантный Nterm-PTX3, но не Cterm-PTX3, связывается с иммобилизованным FGF2 и ингибирует взаимодействие PTX3/FGF2; iv) моноклональное антитело mAb-MNB4, посредством которого картировали линейный эпитоп РТХ 3(87-99), предотвращает взаимодействие FGF2/PTX3 и устраняет активность РТХ 3 как антагониста FGF2 у эндотелиальных клеток; v) синтетический пептид РТХ 3(82-110) и более короткие пептиды РТХ 3(97-110), РТХ 3(97-107) и РТХ 3(100-104), но не другие пептиды на основе различных областей N-концевого участка РТХ 3, предотвращают взаимодействие FGF2/PTX3 посредством связывания FGF2, ингибируя тем самым зависящую от FGF2 пролиферацию эндотелиальных клетокin vitro и ангиогенез in vivo. РТХ 3 продуцируется макрофагами 27, фибробластами 9, миобластами 28, микроглией 29 и эндотелиальными клетками 8, что указывает на то, что РТХ 3 может обладать паракринной и аутокринной функциями в отношении эндотелия. Сходным образом, различные стимулирующие сигналы, в том числе медиаторы воспаления IL-1 и оксид азота 30,31, индуцируют экспрессию FGF2 в эндотелиальных клетках, вовлеченных в аутокринную петлю стимуляции. Таким образом, эндотелиальные клетки и клетки других типов могут экспрессировать и РТХ 3, и FGF2. Соответственно, РТХ 3, продуцируемый воспалительными клетками или самими эндотелиальными клетками, может воздействовать на аутокринное и паракринное действие, оказываемое FGF2 на эндотелий in vitro и in vivo. Это должно обеспечивать точную регуляцию образования новых сосудов посредством продукции и ингибиторов и стимуляторов ангиогенеза.FGF2 представляет собой плейотропный фактор роста, стимулирующий различные типы клеток энтодермального и мезодермального происхождения 32. Соответственно, роль, которую играет FGF2 при различных патофизиологических состояниях, не ограничена его ангиогенной активностью. Например,FGF2 стимулирует миграцию и пролиферацию фибробластов в ходе заживления ран, а также гладкомышечных клеток в ходе атеросклероза 33,34 и рестеноза 35. Кроме того, он способствует выживанию нейронов и пролиферации глиальных клеток в поврежденной центральной нервной системе 36. При всех этих состояниях сопутствующая продукция РТХ 337,38 регулирует действие, оказываемое FGF2 на такие клетки. Действительно, РТХ 3 ингибирует зависящую от FGF2 активацию гладкомышечных клеток in vitro и утолщение интимы после повреждения артерий in vivo18. В заключение, авторами изобретения впервые показано, что N-концевой участок РТХ 3 вовлечен во взаимодействие с FGF2. РТХ 3 представляет собой полифункциональный растворимый рецептор распознавания структур на пересечении врожденного иммунитета, воспаления, отложения матрикса и способности к оплодотворению у женщин. Он проявляет свою полифункциональную активность посредством взаимодействия с множеством лигандов с различными молекулярными свойствами. Ссылки 1. Garlanda С., Bottazzi В., Bastone A., Mantovani A. Pentraxins at the crossroads between innate immunity, inflammation, matrix deposition, and female fertility. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337-366. 2. Steel D.M., Whitehead A.S. The major acute phase reactants: C-reactive protein, serum amyloid P component and serum amyloid A protein. Immunol Today. 1994; 15:81-88. 3. Pepys M.B., Baltz M.L. Acute phase proteins with special reference to C-reactive protein and relatedR1 отсутствует или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 1 иR2 отсутствует или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2 иSEQ ID NO: 4, при следующих условиях: когда R1 отсутствует, R2 также отсутствует; когда R1 представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, R2 представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; когда R1 представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, R2 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4; или фармацевтически приемлемая соль. 2. Пептид по п.1, в котором X1 представляет собой Arg. 3. Пептид по п.1 или 2, в котором Х 2 представляет собой Cys. 4. Пептид по любому из предшествующих пунктов, состоящий из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 10. 5. Слитый химерный пептид, содержащий пептид по любому из предшествующих пунктов, где слитая аминокислотная последовательность относится к отличной от РТХ 3 человека последовательности белка, выбранной из группы мембраносвязанных белков, внеклеточных участков мембраносвязанных белков, константных областей иммуноглобулинов, доменов мультимеризации, внеклеточных белков,белков, содержащих сигнальные пептиды, белков, содержащих сигнальные последовательности для выведения. 6. Конъюгированный химерный пептид, содержащий пептид или его функциональные производные по любому из предшествующих пунктов. 7. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид по любому из предшествующих пунктов,или гибридизующаяся с указанной выше нуклеиновой кислотой, или включающая ее вырожденную последовательность. 8. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.7. 9. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии по п.8. 10. Клетка-хозяин по п.9, где пептид секретируется или экспрессируется на поверхности мембраны клетки. 11. Применение пептида по пп.1-6 в качестве лекарственного средства. 12. Применение по п.11, где лекарственное средство представляет собой средство против заболевания, обусловленного измененным ангиогенезом. 13. Применение по п.12, где измененный ангиогенез обусловлен измененной активацией фактора роста FGF2. 14. Применение по п.12 или 13, где заболевание выбрано из группы, состоящей из артрита, метастазирования опухоли, диабетической ретинопатии, псориаза, хронического воспаления, артериосклероза или опухоли. 15. Применение по п.14, где опухоль выбрана из группы саркомы, карциномы, карциноидной опу- 16015339 холи, опухоли костной ткани или нейроэндокринной опухоли. 16. Применение по п.11, где лекарственное средство представляет собой средство против заболевания, связанного с неконтролируемой, зависимой от FGF2 пролиферацией фибробластов или гладкомышечных клеток, рубцевания, связанного с чрезмерной реакцией фибробластов, и рестеноза после ангиопластики. 17. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество пептида по любому из пп.1-6, а также приемлемые разбавители, и/или наполнители, и/или адъюванты.