Производные от сурвивина пептиды и их применение

008026 Область изобретения Данное изобретение касается новых пептидов - производных сурвивина и их применения для диагностики и лечения, в особенности, рака. В частности, новые пептиды являются рестриктированными по МНС (главному комплексу гистосовместимости человека) класса I эпитопами Т-клеток, способными элиситировать цитотоксические Т-клеточные ответы у пациентов, больных раком, включая ответы in situ и ex vivo. В частности, такие новые пептиды являются производными от ингибитора апоптоза - белка сурвивина, распознаваемого опухолеассоциированного антигена (ТАА). Уровень техники Процесс распознавания и реагирования иммунной системы млекопитающих на внешние или чужеродные вещества является сложным процессом. Важный аспект системы - Т-клеточный ответ. Для этого ответа необходимо, чтобы Т-клетки распознавали и взаимодействовали с комплексами молекул клеточной поверхности, которые называются лейкоцитарными антигенами человека (HLA), образующими МНС, и пептидов. Пептиды являются производными от более крупных молекул, которые вырабатываются клетками, а также представляют HLA/MHC молекулу. Взаимодействие Т-клеток и комплексовHLA/пептид является ограниченным, Т-клетка должна быть специфической для определенной комбинации HLA молекулы и пептида. Если специфическая Т-клетка отсутствует, то Т-клеточный ответ не произойдет, даже если присутствует указанный комплекс. Аналогичным образом, иммунный ответ не будет развиваться, если Т-клетка присутствует, а специфический комплекс отсутствует. Механизм распознавания Т-клетками клеточных отклонений вовлечен в процесс ракообразования. Например, в WO 92/20356 раскрыто семейство генов, продуктами которых являются пептиды, что, в свою очередь, экспрессируются на поверхностях клеток, и могут приводить к лизису раковых клеток специфическими цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL). Эти гены, известные как семейство меланомных антигенов (MAGE), кодируют молекулы "предшественников антигена отторжения опухоли" или"TRAP" и производные от них пептиды, известные как "антигены отторжения опухоли" или "TRA". В WO 94/05304 описаны нонапептиды, которые связываются с молекулой HLA-A1. В ссылке показано, что данная известная специфичность пептидов к определенным HLA молекулам проявляется в том,что специфический пептид связывается только с определенным HLA. Это важно, потому что различные индивиды обладают различными HLA фенотипами. В результате, несмотря на то, что идентификация специфического пептида, как партнера для определенного HLA, имеет диагностическое и терапевтическое значение, это приемлемо только для индивидов с определенным HLA фенотипом. Охарактеризовано несколько пептидов, представленных молекулами МНС, и обнаружено, что некоторые из них могут нести посттрансляционные модификации, которые, возможно, способны воздействовать на функциональные возможности комплекса HLA/пептид. Таким образом, множество исследований связывают изменения в характере фосфорилирования со злокачественным превращением. Кроме того, показано, что фосфорилирование может не влиять или оказывать отрицательный, или даже положительный эффект на связывание пептида с МНС класса I, и, что может быть получен фосфопептидспецифический CTL, различающий фосфорилированные и не фосфорилированные версии пептида, и такие CTL, наиболее вероятно, являются частью репертуара CTL, рестриктированных по МНС класса I. Ранее показано, что фосфорилированные пептиды действительно преобразованы естественным путем и представлены молекулами МНС класса I in vivo. К тому же, было установлено наличие фосфорилированных пептидов в экстрактах изолированных молекул класса I от нескольких различных ЕВV (вирус Эпштейна-Барра)-трансформированных В-клеток. Таким образом, четко установлено, что пептидные эпитопы, производные от опухолеассоциированных антигенов (ТАА), могут быть распознаны как антигены цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL) в составе МНС (1). Однако, достоверно известно, что не все опухоли являются антигенными, только немногие из них действительно иммуногенные, т. е. полностью контролируются иммунной системой. Чтобы преодолеть это ограничение, были начаты несколько иммуннотерапевтических исследований, например, вакцинация пептидами - производными ТАА. При меланоме, когда было охарактеризовано наибольшее число CTL-типированных ТАА, вакцинация вызвала мощные ответы CTL на антигены, и некоторые пациенты испытали полную ремиссию заболевания (2, 3). Однако большинство пептидных эпитопов, используемых в этих опытах с вакцинацией, являются меланоцит специфическими, и эти пептиды не могут быть применены для опухолей немеланоцитной природы. Кроме того, экспрессия этих ТАА является гетерогенной у опухолей различных пациентов и может меняться в метастазах даже одного пациента. Однако в течение нескольких последних лет было идентифицировано множество специфических опухолевых пептидных антигенов, которые экспрессируются при различных формах рака, например HER-2 (4), Мuс-1 (5) и теломераза (6). Также показано, что соответствующим образом опухолевые антигены, присутствующие в опухолях,могут контактировать с иммунной системой. Исследования показали, что CD8+ CTL ветвь иммунного ответа, одна или в комбинации с CD4+ Th-клетками, составляет первичную антиопухолевую эффекторную ветвь адаптивного иммунного ответа. До настоящего времени внимание, главным образом, было направлено на CTL ветвь иммунного ответа. Однако выясняется, что ответ CD4 Т-клетки играет существенную роль в отторжении опухоли, особенно на стадии индукции или при распространении CTL ответаin vivo. Следовательно, включение опухолевых антигенов, рестриктированных по классу II, в схемы эффективных противоопухолевых вакцинаций могло бы увеличить эффективность вакцинации. Апоптоз - генетическая программа клеточной смерти, и предполагают, что ингибирование апоптоза является важным механизмом при ракообразовании, заключающимся в продлении продолжительности жизни клеток, склонных к накоплению трансформирующих мутаций (7). Сурвивин не так давно идентифицирован как член семейства белков - ингибиторов апоптоза (IAP). Общим анализом экспрессии гена проверено приблизительно 4 миллиона транскрипций, сурвивин был определен как один из главных генов, который неизменно активируется при многих формах рака, но не выявляется в нормальной ткани(8). Солидная злокачественная опухоль, при которой оверхэкспрессируется сурвивин, включает рак легкого, толстого кишечника, молочной железы, поджелудочной железы и простаты, а так же и злокачественную опухоль кроветворных органов (9). К тому же, меланомные и немеланомные формы рака кожи,как сообщается, были неизменно сурвивин позитивными (10, 11). Оверхекспрессия сурвивина при большинстве форм рака человека предполагает общее ингибирование апоптоза при прогрессировании опухоли. Существует обоснованное наблюдением мнение, что при раке ободочной и прямой кишки, мочевого пузыря и нейробластомы экспрессия сурвивина связана с неблагоприятным прогнозом. Напротив, сурвивин не выявляется в нормальных взрослых тканях. Это характеризует сурвивин как приемлемый ТАА и для диагностических и терапевтических целей. Таким образом, на протяжении последнего десятилетия идентифицировано большое количество ТАА, распознавание которых CTL ограничено наличием комплекса антигенов гистосовместимости(МНС). Так как сурвивин оверхэкпрессирован при большинстве форм рака человека, и ингибирование его функции приводит к усилению апоптоза, этот белок может служить мишенью для терапевтических ответов CTL. Сурвивин - белок, потенциальное диагностическое и терапевтическое применение которого раскрыто в (8) и патенте США 6245523, включенных в данное описание в виде ссылки. Сурвивин является цитоплазматическим белком (16,5 кДа), содержащим одиночный BIR (адаптерный домен) и высоко заряженную карбоксильную концевую спиральную область вместо пальцеобразной области кольцевого типа, который ингибирует апоптоз, вызванный изъятием фактора роста (IL-3), если перенесен в предшественники В-клеток. Ген, кодирующий сурвивин, почти идентичен последовательности рецептора-1 Протеазы Эффекторной Клетки (EPR-1), но ориентирован в противоположном направлении. Таким образом, предполагается существование двух отдельных генов, дуплицированных в конфигурации "голова к голове". Соответственно, сурвивин может быть описан как продукт антисмысловой последовательностиEPR-1. Таким образом, ингибирование экспрессии сурвивина путем активирования его природного антисмыслового EPR-1 транскрипта приводит к массовому апоптозу и уменьшению роста клеток. Патент США 6245523 представляет получение очищенного сурвивина, нуклеиново-кислотные молекулы, кодирующие белок сурвивин, антитела и другие молекулы, которые связаны с сурвивином. Патент США 6245523 также раскрывает аниапоптозные активные фрагменты сурвивина и его модификации, где аминокислотный остаток был вставлен на N- или С-конце или внутри описанной последовательности сурвивина. В частности описано, что такие пептиды должны содержать ключевые функциональные остатки, необходимые для апоптоза, например, Тrр в положении 67, Pro в положении 73 и Cys в положении 84. Данное изобретение основывается на открытии того, что пептиды, рестриктированные по МНС класса I, могут быть производными от белка сурвивина, являются способными к связыванию с HLA МНС класса I и, таким образом, к элиситированию и ex vivo и in situ иммунных ответов CTL у пациентов, страдающих раком с широким диапазоном форм. Эти открытия наводят на мысль, что сурвивин действует как молекула TRAP, которая преобразуется клетками в пептиды, обладающими активностьюTRA. Очевидно, эти результаты открывают путь для новых терапевтических и диагностических методов,которые являются общеприменимыми при контроле рака, вследствие того, что, по-видимому, сурвивин экспрессируется во всех случаях опухолевыми клетками. Краткое изложение изобретения Согласно первому аспекту данное изобретение касается эпитопа пептида, рестриктированного по МНС класса I, производного от сурвивина, указанный эпитоп обладает по меньшей мере одной из следующих особенностей:(i) способность к связыванию с молекулой HLA класса I, по которой он рестриктирован, при аффинности, измеряемой как половина максимально возможного количества связанных молекул HLA класса I (значение С 50), что составляет, максимум, 50 М, как определено анализом структурных связей, описанным здесь,(ii) способность к элиситированию INFпродуцирующих (интерферонпродуцирующих) клеток в популяции периферических лимфоцитов крови (PBL) у пациента, больного раком, при частоте по меньшей мере 1 на 104 PBL, как определено иммуноферментным спот-анализом (ELISPOT), и/или(iii) способность к in situ обнаружению в опухолевой ткани CTL, которые взаимодействуют с эпитопным пептидом. Предпочтительно пептид по данному изобретению обладает по меньшей мере двумя, наиболее-2 008026 предпочтительно всеми тремя этими особенностями. Дальнейшие аспекты данного изобретения представляют фармацевтическую композицию и композицию для ex vivo или in situ диагностирования наличия у пациента, больного раком, сурвивинактивных Т-клеток среди PBL или в опухолевой ткани, данная композиция включает пептид, как указано выше. В следующих аспектах данное изобретение касается диагностического набора для ex vivo или in situ диагностирования наличия у пациента, больного раком, сурвивин активных Т-клеток среди PBL или в опухолевой ткани, данный набор включает пептид по изобретению и комплекс такого пептида и молекулы HLA класса I или фрагмент такой молекулы. В другом аспекте также представлен способ выявления у пациента, больного раком, сурвивин реактивных Т-клеток, способ включает контактирование опухолевой ткани или образца крови с комплексом,определенным выше, и определение связывания комплекса с клетками ткани или крови. Следующие аспекты данного изобретения касаются молекулы, которая способна к специфичному связыванию с пептидом по изобретению, таким как антитело или его фрагмент, а также касаются молекулы, способной блокировать связывание вышеуказанной молекулы. Важным аспектом данного изобретения является применения пептидов по изобретению для изготовления лекарственного препарата для лечения рака. Дальнейший аспект касается применения композиции или молекулы, как упомянуто выше, для изготовления лекарственного препарата для лечения рака. Дальнейшие аспекты касаются способа лечения рака у млекопитающего, такого как человек, включая введение пациенту, страдающему от болезни, эффективного количества пептида, композиции или молекулы по изобретению. Детальное описание изобретения Новый пептид по изобретению, рестриктированный по классу I МНС, характеризуется наличием по меньшей мере одной из нескольких особенностей. Одной из особенностей является способность к связыванию с молекулой HLA класса I, по которой он рестриктирован, при аффинности, измеряемой как половина максимально возможного количества связанных молекул класса I HLA (значение С 50), как определено анализом структурных связей, описанным здесь, что составляет, максимум, 50 М. Этот анализ структурных связей выполняли, как ранее описано (12, 13), анализ базируется на стабилизации молекулыHLA после загрузки пептида к линии клеток Т 2, в которых отсутствует переносчик пептидов. Затем правильно свернутые крупные цепочки стабильного HLA иммунопреципитируют с использованием конформационно-зависимых антител и проводят количественный анализ пептидных связей. Этот опыт представляет простой способ обследования кандидатных пептидов по их способности связаться с данным аллелем HLA при вышеупомянутой аффинности. В предпочтительных вариантах осуществления пептид по изобретению имеет значение С 50, составляющее, самое большее, 30 М, например значение С 50, составляющее, самое большее, 20 М, включая значение С 50, составляющее, самое большее, 10 М, самое большее, 5 М и, самое большее, 2 М. Как упомянуто выше, HLA система представляет систему главного комплекса гистосовместимости человека (МНС). Обычно, МНС системы контролируют ряд характеристик: антигены трансплантации,тимус зависимые иммунные ответы, некоторые комплементы и предрасположенность к некоторым болезням. Более детально, МНС кодирует три различных типа молекул, например, молекулы класса I, II иIII, которые шире характеризуют МНС. Из них молекулы класса I, так называемые HLA-A, HLA-B иHLA-C молекулы, представлены на поверхности большинства клеток, имеющих ядро, и тромбоцитов. Пептиды по данному изобретению характеризуются их способностью связываться (будучи рестриктированными) со специфической молекулой класса I МНС HLA. Таким образом, в данном варианте осуществления пептид является рестриктированным по молекуле HLA-A МНС класса I, включая HLA-A1,HLA-А 2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A10, HLA-A11, HLA-Aw19, HLA-A23 (9), HLA-A24 (9), HLA-A25 (10),HLA-A26 (10), HLA-A28, HLA-A29 (w19), HLA-A30 (w19), HLA-A31 (w19), HLA-A32 (w19), HLA-Aw33(w19), HLA-Aw34 (10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66 (10), HLA-Aw68 (28), HLA-A69 (28). В литературе также применяются упрощенные обозначения, где используется только первое числовое обозначение, например, HLA-A19 или HLA-A24, вместо HLA-Aw19 и HLA-A24 (9), соответственно. В специфических вариантах осуществления пептид по изобретению рестриктирован по видам HLA МНС классаI, выбранным из группы, состоящей из HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 и HLA-A24. Пептиды по изобретению получены из известной последовательности сурвивина, например последовательности, описанной в патенте США 6245523. Отбор пептидов, потенциально имеющих способность связываться со специфической молекулой HLA, может быть осуществлен сравнительным анализом первичной структуры известных последовательностей, которые связываются с данной специфической молекулой HLA, чтобы таким образом показать преобладание нескольких соотнесенных аминокислот в определенных положениях пептидов. Такие преобладающие аминокислотные остатки также упоминаются здесь как "якорные остатки" или "мотивы якорных остатков". Такой относительно простой способ основывается на данных известной последовательности, которые могут быть получены из доступных баз данных, пептиды могут быть производными молекулы белка сурвивина, которые, вероятно, связываются со специфической молекулой HLA. Типичные примеры данных таких анализов для ряда молекул HLA Таким образом, например, нонапептиды, потенциально обладающие способностью связываться сHLA-A1, имеют одну из следующих последовательностей: Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y, Xaa-T-E-XaaXaa-Xaa-L-Xaa-Y, Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y или Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y (Xaa обозначает какой-либо остаток аминокислоты). Таким же образом можно изобразить последовательности, потенциально имеющие способность связываться с любой другой молекулой HLA. Будет оценено то, что специалист в этой области сможет в дальнейшем идентифицировать "мотивы якорных остатков" для данной молекулы HLA. Таким образом, в практических вариантах осуществления пептиды по изобретению включают пептиды, последовательности которых содержат в каждом специфическом HLA аллеле, внесенном в таблицу, любой из аминокислотных остатков, внесенный в таблицу. Таким образом, простой подход к идентифицированию пептидов по изобретению включает следующие этапы: отбор специфической молекулы HLA, например, встречающейся с высокой частотой в данной популяции, выполнение сравнительного анализа первичной структуры, как описано выше, для выявления"мотивов якорных остатков" в белке сурвивине, выделение или построение пептидов подходящего размера, которые включают один или больше выявленных якорных остатков, и тестирование полученных пептидов по (i) способности связывания со специфической молекулой HLA, с использованием анализа-5 008026 структурных связей, как описано здесь, (ii) способности пептидов элиситировать INFпродуцирующие клетки в популяции PBL у пациента, больного раком, при частоте по меньшей мере 1 на 104 PBL, как определено ELISPOT анализом, описанным здесь, и/или (iii) способность пептидов обнаруживать in situCTL в опухолевой ткани, которые взаимодействуют с тестируемыми эпитопными пептидами. В специфических вариантах осуществления пептидом по изобретению является производный от сурвивина пептид, рестриктированный по HLA-A2, имеющий последовательность, выбранную из(Обозначение в скобках указывают на положения остатков в белке сурвивине, как описано в патенте США 6245523). LLLGEFLKL (SEQ ID No: 4) является последовательностью, производной от сурвивин 96104 заменой "Т" в положении 2 пептида на "L", и LMLGEFLKL (SEQ ID No: 5) является последовательностью, производной от сурвивин 96-104 заменой "Т" в положении 2 пептида на "М". В следующих практических вариантах осуществления пептид по изобретению является пептидом,рестриктированным по молекуле МНС HLA-B класса I, включая HLA-B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12,HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLAB35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-Bw41, HLA-Bw42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 и HLA-Bw47. В специфических вариантах осуществления виды HLA-B МНС класса I, с которыми способен связываться пептид по изобретению, выбраны из HLA-B7, HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLAB15, HLA-B27 и HLA-B51. В специфических вариантах осуществления пептид по изобретению является производным сурвивина, рестриктированным по HLA-B35, имеющим последовательность, выбранную из CPTENEPDL (сурвивин 46-54) (SEQ ID No: 6), EPDLAQCFF (сурвивин 51-59) (SEQ ID No: 7), CPTENEPDY (SEQ ID No: 8) иEPDLAQCFY (SEQ ID No: 9). (Обозначения в скобках указывают положения остатков в белке сурвивине как описано в патенте США 6245523). CPTENEPDY (SEQ ID No: 8) является последовательностью, производной от сурвивин 46-54 заменой "L" на С-конце пептида на "Y", и EPDLAQCFY (SEQ ID No: 9) является последовательностью, производной от сурвивин 51-59 заменой "F" остатка на С-конце 2 на "Y". В дальнейших специфических вариантах осуществления пептид по изобретению является рестриктированным по HLA-A1 пептидом с последовательностью, выбранной из сурвивин 38-46 (Sur38Y9) (С заменен на Y в Р 9, MAEAGFIHY) (SEQ ID No: 38), сурвивин 47-56 (Sur47Y10) (Q заменен на Y в Р 10,PTENEPDLAY (SEQ ID No: 39, сурвивин 92-101 (Sur92-101) (QFEELTLGEF) (SEQ ID No: 27) и сурвивин 93-101 (Sur93T2) (Е заменен на Т в Р 2, FTELTLGEF (SEQ ID No: 36. Пептид по изобретению может также быть рестриктированным по HLA-A3, таким как сурвивин 18-24 (Sur18K10) (F заменен на К в Р 10,RISTFKNWPK (SEQ ID No: 57), и/или рестриктированным по HLA-A11, таким как сурвивин 53-62 (Sur5362) (DLAQCFFCFK) (SEQ ID No: 45), и/или рестриктированным по HLA-A2, таким как сурвивин 18-28(Sur18-28) (RISTFKNWPFL) (SEQ ID No: 66). В следующих практических вариантах осуществления пептид по изобретению является пептидом,рестриктированным по молекуле HLA-C МНС класса I, включая HLA-Cw1, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLACw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLA-Cw7 и HLA-Cw16. Предпочтительно, пептид по изобретению включает менее чем 50 аминокислотных остатков, и, более предпочтительно, включает, самое большее, 20 аминокислотных остатков, например, самое большее,10 аминокислотных остатков. В специфических вариантах осуществления пептид является гептапептидом, октопептидом, нонапептидом, декапептидом или андекапептидом. Пептид по изобретению, как упомянуто выше, является производным от белка сурвивина или его фрагментом. Белок сурвивин, из которого может быть получен пептид, является белком каких-либо видов животных, у которых этот белок экспрессирован. В предпочтительных вариантах осуществления стартовый белок сурвивин является белком млекопитающих, включая виды грызунов, кролика и приматов, таких как человек. На основании последовательности выбранного белка сурвивина пептид по изобретению получают любым приемлемым химическим или ферментативным способом из стартового материала сурвивина, в результате получают пептид нужного размера, как описано выше, или синтезируют каким-либо традиционным способом, известным специалисту данной области. Пептид по изобретению может иметь последовательность, которая является естественной последовательностью белка сурвивина, от которого пептид получен. Однако пептиды, имеющие более высокую аффинность к какой-либо данной молекуле HLA, могут быть получены из такой естественной последовательности, путем модификации последовательности заменой, удалением или добавлением по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например способом, описанным выше, с помощью которого идентифицировали мотивы якорных остатков. Соответственно, чтобы увеличить иммуногенность пептидов, производных сурвивина, для усиления связи пептида с молекулой HLA класса I аминокислотные замещения произвели в якорных положениях, а не в контактирующих сегментах TCR (антиген распознающий рецептор Т-клеток). В результате получили более иммуногенные эпитопы, например, усилилась способность индуцировать CTL, реагирующие с раковыми клетками, и более приемлемым образом была продемонстрирована индукция клинически значимых CTL ответов. Тем не менее, важен тот факт, что раковые клетки-мишени экспресси-6 008026 руют и представляют только естественный пептид, производный сурвивина, на поверхности клетки. В этом отношении, принципиально важно, что индуцированные терапевтическим путем CTL, специфические для модифицированных пептидов, производных сурвивина, дают перекрестную реакцию с родственными аналогами. Данное изобретение также охватывает варианты и функциональные эквиваленты пептидов, производных сурвивина, как описано здесь. "Функциональные эквиваленты" в данном контексте определяются посредством ссылки как соответствующие выполняемые функции предетерминированного фрагмента рассматриваемой последовательности. Функциональная эквивалентность может быть установлена, например, сходными аффинностями связей с молекулами HLA класса I, или сходной силой, измереннойELISPOT анализом. Функциональные эквиваленты или варианты пептида, производного сурвивина, как описано здесь,подразумевают аминокислотные последовательности, немного отличающиеся от предпочтительных,предетерминированных последовательностей, как числом, так и размером вставок, удалений и замещений, включая консервативные замещения, прибавления. Это различие измерили как уменьшение гомологичности между предпочтительной, предетерминированной последовательностью и вариантом, производным сурвивина, или функциональным эквивалентом, производным сурвивина. Гомологичность аминокислотных последовательностей можно рассчитать с помощью известных в данной области алгоритмов. Фрагменты, гомологичные фрагментам, включающим или состоящим из последовательных аминокислотных остатков, производных сурвивина, можно рассматривать как находящиеся в рамках данного изобретения, если они являются предпочтительно гомологичными предетерминированному пептиду, производному сурвивина по меньшей мере на приблизительно 90%, например,по меньшей мере на 94%, включая 95, 96, 97, 98 или 99%. Кроме того, может быть эффективным выполнение посттрансляционной модификации пептидов по изобретению. Показано, что воздействие лекарственных препаратов, включая адриамицин, таксол, или ультрафиолетового облучения на клетки карциномы молочной железы MCF-7 или карциномы шейки матки HeLa приводит к увеличению экспрессии сурвивина в 4-5 раз. Изменения в уровнях сурвивина после лечения рака не вызвали модуляцию экспрессии мРНК сурвивина и не зависели от транскрипции гена de novo. Наоборот, ингибирование фосфорилирования сурвивина на Thr34 ингибитором циклинзависимой киназы флавопиридолом привело к потере экспрессии сурвивина, и нефосфорилированный сурвивин Thr34 - Ala продемонстрировал более быстрый процесс апоптической элиминации по сравнению с диким типом сурвивина. Последовательная абляция фосфорилирования сурвивина на Thr34 увеличивало апоптоз опухолевых клеток, индуцированный антираковыми лекарственными препаратами независимо от р 53 и подавило рост опухоли без токсичности в ксенотрансплантатной модели in vivo рака молочной железы. Эти данные наводят на мысль, что фосфорилирование на Thr34 критически регулирует уровни сурвивина в клетках опухоли, и что последовательная абляция активности р 34 сdс 2 киназы может удалить сурвивиновый контроль жизнеспособности и увеличить апоптоз в клетках опухоли. Предполагается, что пептиды, производные сурвивина, по изобретению охватывают фосфорилированные пептиды. Нативные сурвивин фосфопептидные антигены можно идентифицировать при обследовании на присутствие мотивов, пептидов, связанных с МНС, в пределах сайта фосфорилирования Thr34. Таким образом, возможные последовательности сурвивин-производного фосфопептида включаютTPERMAEAGF, предполагаемый рестриктированный по HLA-В 35 и/или HLA-B7 и/или HLA-B51 пептидный антиген. Дополнительные нативные фосфопептиды, упомянутые здесь, включают: HLA-A2: САСТРЕRMA и CTPERMAEA; HLA-A3: FLEGCACTP; HLA-B7/HLA-B35/HLA-B51:WPFLEGCACT(Фосфорилированный Thr остаток выделен жирным шрифтом). Существенной особенностью пептида по изобретению является его способность распознавать или элиситировать INFпродуцирующие Т-клетки-респондеры, т.е. цитотоксические Т-клетки (CTL), которые специфически распознают специфический пептид в PBL популяции или клетках опухоли (клеткахмишенях) пациента, больного раком. Эту активность легко определили с помощью ELISPOT анализаPBL или клеток опухоли пациента, как описано в ссылке (16) и в последующих примерах. Является эффективным предварительное стимулирование анализируемой популяции PBL или клеток опухоли тестируемым пептидом. Предпочтительно, чтобы пептид был способен к элиситированию или распознаваниюINFпродуцирующих Т-клеток при частоте по меньшей мере 1 на 104 PBL, как определено ELISPOT анализом, применяемым здесь. Более предпочтительно, чтобы частота составляла по меньшей мере 5 на 104 PBL, наиболее предпочтительно по меньшей мере 10 на 104 PBL, например по меньшей мере 50 или 100 на 104 PBL.ELISPOT анализ представляет собой надежный инструмент исследования сурвивин пептид специфического Т-клеточного ответа. Однако, хотя показано, что реакционная способность ELISPOT в большинстве случаев кореллирует со способностью хронической лимфоцитной лейкемии (CLL) лизировать клетки-мишени. Можно привести явное убедительное доказательство этого утверждения. Прямое доказательство представлено (см. пример 2) тем, что сурвивин активные клетки, выделенные с помощью комплексов HLA/пептид, обладают функциональной способностью лизировать клетки-мишени. К тому-7 008026 же продемонстрировано, что изолированные CTL, специфически распознающие пептид по изобретению,способны лизировать сингенные по HLA клетки опухоли различной природы, например меланомы и рака молочной железы. Этот результат убедительно говорит о том, что раковые клетки участвуют в общем процессе и представляют собой тот же самый эндогенный сурвивин пептид. Поэтому, главное значение результатов заключается в том, что пептиды по изобретению являются экспрессированными и сопряженными с молекулами HLA в различных раковых клетках различного гистологического происхождения. Это делает раковые клетки восприимчивыми к разрушению CTL и подтверждает потенциальную пригодность сурвивина в иммунизации для контроля роста различных новообразований. Наличие спонтанных CTL-ответов в PBL и клетках опухоли эпитопов пептидов, производных сурвивина, рестриктированных по HLA, у пациентов, страдающих тремя несвязанными между собой формами рака, т.е. раком молочной железы, меланомой и CLL, также доказывает универсальный иммунотерапевтический потенциал этого опухолевого антигена. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, пептид по изобретению способен к элиситированию INFпродуцирующих клеток в PBL популяции пациента, больного раком, где сурвивин экспрессирован, включая злокачественное новообразование кроветворных органов, хроническую лимфацитную лейкемию и хроническую миелоидную лейкемию, меланому, рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак легкого, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы и рак простаты. В частности, пептид по изобретению способен элиситировать иммунный ответ в форме Т-клетки,обладающей цитотоксической активностью к линии раковых клеток, экспрессирующих сурвивин, включая выбранную из линии клеток рака молочной железы MCF-7 и линии клеток меланомы FM3. В дополнение к способности элиситировать иммунные ответы в популяциях PBL и линиях раковых клеток было показано, что пептиды по изобретению также способны к элиситированию цитолитических иммунных ответов in situ, т.е. в тканях солидных опухолей. Это было показано с помощью комплексовHLA/пептид, взаимодействующих с эпитопом пептида по изобретению, которые, например, мультимеризированы, мечены и иммуногистохимически окрашены, для обнаружения CTL в опухолевой ткани. Соответственно, следующая существенная особенность пептида по изобретению заключается в том, что он является способным к in situ определению CTL в опухолевой ткани, которые взаимодействуют с эпитопом пептида. Предполагается, что пептиды по изобретению, дополнительно к их способности связываться с молекулами HLA, что приводит к образованию комплексов HLA и пептидов на поверхностях клеток, причем комплексы, в свою очередь, действуют как эпитопы или мишени для цитолитических Т-клеток, могут элиситировать другие типы иммунных ответов, такие как В-клеточные ответы, приводящие к выработке антител против комплексов и/или реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH). Последний тип иммунного ответа проявляется как покраснение и ощутимое затвердение на участке инъекции пептида по изобретению. Как известно, различные молекулы HLA преобладают в основных популяциях человека. Соответственно, для идентификации эпитопов пептидов, рестриктированных по нескольким молекулам HLA класса I, необходимо расширить группу пациентов, которых можно лечить способами по данному изобретению. Исследование многочисленных эпитопов сурвивина с различными элементами рестрикции HLA расширяет клинический потенциал этого антигена мишени благодаря двум важным особенностям. (i) Увеличение числа пациентов, которым подходит иммунотерапия, основанная на пептидах, производных сурвивина. HLA-A2 антиген экспресируется у приблизительно 50% популяций Кавказа и Азии, HLA-A1 иHLA-A3 антигены экспрессируются у приблизительно 25% кавказцев и 5% азиатов, тогда как HLA-A11 антиген экспресируется у приблизительно 15% кавказцев и 30% азиатов. Даже при том, что эти показатели нельзя суммировать из-за коэкспрессии, композиция пептидов, ограниченная их разнообразием,конечно, позволила бы охватить большинство пациентов, больных раком. (ii) Коллективное нацеливание нескольких рестриктированных элементов у каждого пациента вероятно уменьшит риск иммунного ускользания потерей HLA-аллеля. Потеря одиночного HLA-аллеля является существенным компонентом изменений МНС, описанных для раковых клеток, тогда как полная потеря экспрессии класса I происходит довольно редко. Таким образом, с идентификацией эпитопов сурвивина, рестриктированных по различным HLA-аллелям, стало возможным нацеливать более чем одну молекулу HLA одновременно у пациентов с перекрыванием аллелей. Следовательно, на основании описания данного изобретения специалист в данной области сможет разработать высоко иммуногенные эпитопные вакцины. Предпочтительно, такие вакцины должны быть предназначены для облегчения одновременной доставки приемлемых пептидов, производных сурвивина, необязательно в композиции с другими приемлемыми пептидами и/или вспомогательными веществами, как описано далее. Кроме того, как ранее описано, увеличили фокус при элиситировании иммунитета опухолеспецифических Т-хелперов, т.е. при вакцинировании эпитопами, рестриктированными по классу II МНС, несмотря на то, что опухоли обычно не экспрессируют МНС класса II. Это основывается на ранее обнаруженном факте, что индукция и эффективность индуцированного вакциной противоопухолевого ответа во многих случаях требуют взаимодействия опухолеспецифических CD4+ Тh-клеток. Таким образом, важным фактором, стимулирующим разработку вакцин, имеющих комплексный состав, является необходи-8 008026 мость наличия нескольких опухолевых антигенов, например, разработка вакцин, включающих или кодирующих набор тщательно отобранных эпитопов CTL и Тh-клеток. Очевидно, мультиэпитопные вакцины представляют эффективный способ повысить устойчивость к эпитопам, полученным из нескольких различных антигенов, без необходимости применения (кодируемых генами) потенциально опасных белков, таких как онкобелки. Такие вакцины также обеспечивают селективную индукцию иммунитета против субдоминантных и криптэпитопов Т-клеток, которые могут быть особенно важны в случае опухолеассоциированных аутоантигенов, когда может наблюдаться толерантность к эпитопам, заметно представленным в нормальных тканях. Кроме того, антигенпрезентирующие клетки могут быть не в состоянии презентировать некоторые эпитопы, которые экспрессируются в опухолевых клетках, из-за функциональных различий между иммунопротеосомами антигенпрезентирующих клеток и "конституционных" протеосом, представленных в большинстве опухолевых клеток. В случае пептид-основных вакцин, такие эпитопы могут вводиться в "МНС-готовой" форме, которая позволяет введение с помощью экзогенной загрузки независимо от антигенного поглощения и процессирования антигенпрезентирующими клетками-хозяевами. Очевидно, что результаты данного изобретения являются обоснованием для терапевтического и диагностического применений пептидов, производных сурвивина. Согласно следующему аспекту данное изобретение представляет фармацевтическую композицию,включающую один или более пептидов по изобретению, по одному или в приемлемой композиции с другими белками или фрагментами пептида. В специфических вариантах осуществления такие белки или фрагменты пептида включают, но не ограничиваются, белки или фрагменты пептида, вовлеченные в регуляцию клеточного апоптоза. Приемлемыми примерами таких белков могут быть белки, выбранные из семейства белков Bcl-2, например, Всl-2 белок, Bcl-w белок, Мсl-1 белок, Bcl-XL белок и фрагменты пептида, производного от какого-либо из этих белков. Другие известные ингибиторы апоптоза включают членов семейства белков-ингибиторов апоптоза (IAP), таких как X-IAP, C-IAP1 и C-IAP2, эти белки относительно убиквитарно экспрессированы, тогда как ингибитор апоптоза полипептид ML-IAP имеет довольно селективную экспрессию, и, в основном, обнаруживается в меланомах. Таким образом, фрагменты ML-IAP, способного к элиситированию специфического Т-клеточного ответа, т.е. цитостатического ответа Т-клетки или ответа Т-хелпера, могут необязательно быть включены в композицию по данному изобретению. Применимые пептидные фрагменты ML-IAP включают ML-IAP245 (RLQEERTCKV) (SEQML-IAP200 (ELPTPRREV) (SEQ ID No: 85). К тому же, композиция по данному изобретению может быть представлена как мультиэпитопная вакцина, включающая рестриктированный по классу I эпитоп и/или рестриктированные по классу II эпитопы, как определено выше. Пример представленных предпочтительных мультиэпитопных вакцин включает комбинации специального назначения эпитопа пептида, производного сурвивина, в зависимости от типа ткани данного пациента, например индивид, несущий HLA-A2, HLA-A3 и HLA-B35 фенотипы, может быть привит вакциной, включающей Sur1M2, Sur9, Sur18K10, Sur46Y9, Sur51Y9. К тому же, фармацевтическая композиция по изобретению может преимущественно включать также по меньшей мере один иммуногенный белок или пептидный фрагмент его, выбранный из белка или пептидного фрагмента, не принадлежащего к сурвивину или не являющегося его производным. В специфических вариантах осуществления иммуногенный белок или пептидный фрагмент его является производным от семейства белка Всl-2, как описано выше. Следующим иммуногенным Bcl-2-производным пептидом является рестриктированный по HLAA2 пептид, имеющий последовательность, выбранную из Bcl172, Bcl180, Bcl208 и Bcl214. Поскольку пептиды по изобретению - относительно маленькие молекулы, может возникнуть потребность в таких композициях, сочетающих пептиды с различными веществами, такими как адъюванты, для производства вакцин, иммуногенных композиций и т.д. Адъюванты, в широком смысле, являются веществами, создающими благоприятные условия для иммунных ответов. Часто адъювант выбора является полным адъювантом Фрейнда или неполным адъювантом, или инактивированным В. pertussis, используемым, например, в композиции с антигеном, осаждаемым квасцами. Общий обзор адъювантов представлен в Goding, Monoclonal Antibodies: Principles amp; Practice (2nd edition, 1986) на стр. 61-63. Однако Goding отмечает, что, если антиген имеет низкий молекулярный вес или является слабо иммуногенным, рекомендуется связывание с иммуногенным носителем. Примеры таких молекул носителей включают гемоцианин фисурелла, бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин и куриный иммуноглобулин. Для применения в качестве адъювантов в иммуногенных композициях сапонина были также предложены различные экстракты. Ранее, было предложено использовать как адъювант фактор, стимулирующий гранулоцитарно-макрофагальную колонию (GM-CSF), хорошо известный цитокин (WO 97/28816). Соответственно, данное изобретение охватывает терапевтическую композицию, также включающую какое-либо адъювантное вещество, включая какое-либо вещество из вышеупомянутых или их ком-9 008026 позиции. Предполагается, что антиген, т.е. пептид по изобретению и адъювант могут вводиться отдельно в какой-либо приемлемой последовательности. Выбор антигена в фармацевтической композиции по изобретению будет зависеть от параметров,которые определяются специалистом в данной области. Как было упомянуто, каждый из различных пептидов по изобретению представлен на поверхностях клеток специфической молекулой HLA. По существу, если HLA фенотип индивида, который будет принимать лечение, определен, то пептид/пептиды выбирают в зависимости от специфической молекулы HLA. Альтернативно, антиген, представляющий интерес, выбран на основании преобладания различныхHLA фенотипов в данной популяции. Например, HLA-А 2 - самый распространенный фенотип в кавказской популяции, и поэтому композиция, содержащая пептид, производный сурвивина, связанный с HLAA2, будет активной для большой части той популяции. Впрочем, композиция по изобретению может также содержать комбинацию двух или больше пептидов, производных сурвивина, каждый из которых специфически взаимодействует с различными молекулами HLA, для того чтобы охватить большую часть целевой популяции. Таким образом, например, фармацевтическая композиция может содержать комбинацию пептида, рестриктированного по молекуле HLA-A и пептида, рестриктированного по молекулеHLA-B, например, включая те молекулы HLA-A и HLA-B, которые соответствуют преобладанию фенотипов HLA в целевой популяции, такие как HLA-A2 и HLA-B35. К тому же, композиция может содержать пептид, рестриктированный по молекуле HLA-C. Предполагается, что применимые иммуногенные композиции по изобретению вдобавок к пептиду,производному сурвивина, как определено здесь, могут также включать иммунологически эффективное количество белка сурвивина, как определено здесь, или иммуногенный фрагмент его. Количество иммуногенного пептида по изобретению в фармацевтической композиции может изменяться, в зависимости от специфического применения. Однако, отдельная доза иммуногена составляет,предпочтительно, от приблизительно 10 до приблизительно 5000 г, более предпочтительно от приблизительно 50 до приблизительно 2500 г, например приблизительно от 100 до приблизительно 1000 г. Способы введения включают внутрикожное, подкожное и внутривенное введение, имплантат в форме замедленного высвобождения и т.д. Все упомянутые здесь способы введения известны в этой области. Также здесь упомянуты все известные формы дозировки, которые известны в этой области как приемлемые для введения иммуногенной пептидной композиции, иммуногенного пептида, например лиофильные формы и растворы, суспензии или эмульсии, если необходимо, общепринятых фармацевтически приемлемых носителей, разжижителей, консервантов, адъювантов, буферных компонентов и т.д. Иммунопротективный эффект композиции по изобретению может быть определен с использованием нескольких подходов, проиллюстрированных следующими примерами. Пример определения ответаCTL, вызванного иммуногенной композицией, представлен в WO 97/28816, выше. Успешный иммунный ответ может также быть определен путем возникновения DTH после иммунизации и/или обнаружения антител, специфически распознающих пептид(ы) композиции вакцины. В предпочтительных вариантах осуществления фармацевтическая композиция по изобретению является иммуногенной композицией или вакциной, способной элиситировать иммунный ответ при раке. Используемое здесь выражение "иммуногенная композиция или вакцина" относится к композиции, элиситирующей по меньшей мере один тип иммунного ответа, направленного против раковых клеток. Следовательно, такой иммунный ответ может быть каким-либо из упомянутых выше: CTL ответ, при котором образуют ся CTL, что является способностью распознания HLA/пептид комплекса, представленного на клеточной поверхности, и приводит к лизису клетки, т.е. вакцина элиситирует продуцирование у вакцинированного индивида эффекторных Т-клеток, обладающих цитотоксическим эффектом против раковых клеток; В-клеточный ответ, повышающий продуцирование противораковых антител; и/или DTH тип иммунного ответа. В практических вариантах осуществления иммуногенный ответ, направленный против рака, элиситируется ведением пептида по изобретению или нанесением молекулы МНС класса I на антигенпрезентирующие клетки (АРС) пациента, изолированием PBL пациента и инкубированием клеток с пептидом до инъекции клеток пациенту, или изолированием предшественников АРС пациента и дифференцированием клеток в выполняющие функции АРС с использованием цитокинов и антигена перед инъекцией клеток пациенту обратно. Таким образом, в одном варианте осуществления данного изобретения способ лечения пациентов, страдающих раком, заключается в том, что пептид вводят в антигенпрезентирующие клетки (АРС) пациента ex vivo с последующим введением таким образом обработанных АРС назад пациенту. Существует по меньшей мере два альтернативных способа выполнения такой задачи. Один заключается в изолировании АРС пациента, больного раком, и инкубировании молекул МНС класса I с пептидом. Нанесение молекул МНС класса I означает инкубирование АРС с пептидом так, чтобы АРС с молекулами МНС класса I, специфическими для пептида, связали пептид и, таким образом, стали способными предоставить его Т-клеткам. Затем АРС вводятся обратно пациенту. Другой альтернативный путь опирается на недавние открытия, сделанные в области биологии дендритных клеток. В этом случае, моноциты(будучи клетками-предшественниками дендритов) выделяются у пациента и дифференцируются in vitro в профессиональные АРС (или дендритные клетки) при помощи цитокинов и антигена. Это описано вvitro вместе с GM-CSF, IL-4 и TNF- (фактор некроза опухоли ). Затем in vitro произведенные дендритные клетки сенсибилизируются пептидом и вводятся обратно пациенту. Вследствие того, что сурвивин, очевидно, экспрессируется при большинстве форм рака, вероятно, что вакцины по изобретению могут обеспечивать контроль над каким-либо типом рака, при котором экспрессирован сурвивин. Таким образом, например, композиция вакцины по изобретению является иммунологически активной против злокачественной опухоли кроветворных органов, включая хроническую лимфатическую лейкемию и хроническую миелоидную лейкемию, меланому, рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника, рак легкого, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы и рак простаты. Из вышеупомянутого описания квалифицированному специалисту будет понятно, что пептиды по изобретению применяются в качестве средств диагностики рака, особенно, поскольку пептиды являются производными от сурвивина, экспрессированного при всех формах рака. Поэтому пептиды по изобретению являются основанием для развития универсально применимых диагностических и прогностических процедур относительно рака. Таким образом, в других приемлемых вариантах осуществления композиция по изобретению является композицией для ex vivo и in situ диагностики наличия у пациента рака,например, базируется на обнаружении сурвивин активных Т-клеток среди PBL или в опухолевой ткани. Согласно следующим аспектам, предусматривается диагностический набор для ex vivo и in situ диагностики присутствия сурвивин реактивных Т-клеток среди PBL или в опухолевой ткани, включающий один или более пептидов по изобретению, и способ обнаружения у пациента, больного раком, присутствия сурвивин активных Т-клеток, способ, включающий контактирование опухолевой ткани или образца крови с комплексом пептида по изобретению и молекулы HLA класса I или фрагментом такой молекулы и обнаружение связи комплекса с тканью или клетками крови. Следующий применимый диагностический или прогностический подход базируется на продуцировании антител у гетерологических видов животных, например антитела крысы, направленные против пептида человека, производного сурвивина, по изобретению, что может использоваться, например, для диагностирования наличия раковых клеток, презентирующих пептид. Для иммунизации количество пептида может быть меньше, чем используемое в терапии in vivo, как описано выше. В общем, предпочтительная доза может составлять от приблизительно 1 до приблизительно 750 г пептида. Также возможно продуцирование моноклональных антител, основанное на иммунизации пептидом по изобретению. Соответственно,данное изобретение также касается молекулы, в особенности моноклонального или поликлонального антитела, включая его фрагмент, которая способна к специфическому связыванию с пептидом по изобретению и с молекулой, способной к блокированию такого связывания, например, индуцирование антитела против моноклонального или поликлонального антитела, направленного против пептида по изобретению. В одном из аспектов изобретение представляет комплекс пептида по изобретению и молекулы HLA класса I или фрагмента такой молекулы, который применяется в качестве диагностического реактива, как описано выше. Комплекс получен каким-либо удобным способом, включая описанные в следующих примерах. Такой комплекс может быть мономерным или мультимерным. Данное изобретение представляет способы облегчения или лечения рака. Следовательно, следующим аспектом изобретения является применение пептидов, как определено выше, для изготовления лекарственного препарата для лечения рака. Другой аспект данного изобретения касается применения молекулы или композиции, как определено выше, для изготовления лекарственного препарата для лечения рака. Предпочтительно, рак ассоциируется с экспрессией сурвивина, включая в качестве примеров: злокачественную опухоль кроветворных органов, в том числе хроническую лимфатическую лейкемию и хроническую миелоидную лейкемию, меланому, рак молочной железы, рак шейки матки, рак яичника,рак легкого, рак толстого кишечника, рак поджелудочной железы и рак простаты. Применение включает введение пациенту, страдающему раком, эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению, молекула, которой способна к специфическому связыванию с пептидом по изобретению,и/или молекула, котора способна блокировать данное связывание. В некоторых случаях будет уместно комбинировать применение по изобретению с традиционным лечением рака, таким как радиотерапия или химиотерапия. Изобретение ниже будет описано в деталях, неограничивающих примерах и фигурах, где Фиг. 1 иллюстрирует Т-клеточный ответ, проанализированный с помощью ELISPOT анализа у пациента, страдающего CLL1, на отсутствие пептида, пептид Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID No: 10) и пептидSur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID No: 3). PBL простимулировали однократно пептидом прежде, чем высеять на чашку Петри по 6x105 клеток в лунку в двух повторностях. Среднее число пятен на пептид рассчитали с помощью прибора с зарядовой связью (CCD) и компьютерной системы. Фиг. 2 иллюстрирует Т-клеточный ответ, проанализированный с помощью ELISPOT анализа у пациента, страдающего CLL1, на отсутствие пептида, аналог пептида Sur1L2 (LLLGEFLKL, SEQ ID No: 4) и аналог пептида Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID No: 5). PBL простимулировали однократно пептидом прежде, чем высеять на чашку Петри по 1 х 104 клеток в лунку в двух повторностях. Среднее число пятен на пептид рассчитали с помощью прибора с зарядовой связью (CCD) и компьютерной системы.- 11008026 Фиг. 3 показывает Т-клеточный ответ, проанализированный с помощью ELISPOT анализа у пациента, страдающего CLL2 и CLL3, на отсутствие пептида (черный столбик), на пептид Sur1 (LTLGEFLKL,SEQ ID No: 10) (серый столбик), на пептид Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID No: 3) (белый столбик), на аналог пептида Sur1L2 (LLLGEFLKL, SEQ ID No: 4) (светло-серый столбик) и на аналог пептида Sur1M2(LMLGEFLKL, SEQ ID No: 5) (темно-серый столбик). Каждый эксперимент выполняли на 1 х 105 клеток в лунку в двух повторностях. Рассчитали среднее число пятен на пептид. Фиг. 4 представляет Т-клетки, которые выделили из инфильтрующей опухоли лимфатического узла пациента, страдающего Mel1, Mel2, и Меl3, простимулированы однократно in vitro, и проанализировали с помощью ELISPOT анализа их ответ на отсутствие пептида (черный столбик), на пептиды Sur1 (LTLGEFLKL,SEQ ID No: 10) (серый столбик) и Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID No:3) (белый столбик). Каждый эксперимент выполняли на 1x105 клеток в лунку в двух повторностях. В каждый эксперимент были включены по две лунки без добавления пептида. Среднее число пятен на пептид рассчитали для каждого пациента. Фиг. 5 показывает функциональную активность сурвивин специфических CTL. CTL выделили из инфильтрующей меланомы лимфатического узла с использованием покрытых сурвивином магнитных гранул. (А) Специфический лизис линий клеток меланомы; HLA-A2 позитивный FM3 (треугольник) иHLA-А 2 негативный FM45 (квадрат). (В) Специфический лизис линий клеток рака молочной железы;HLA-A2 позитивный MCF-7 (треугольник) и HLA-A2 негативный ВТ-20 (квадрат). Фиг. 6 показывает частоту сурвивин активных CTL в PBL пациентов, больных раком. Активность проанализировали с помощью ELISPOT анализа у трех пациентов, больных раком молочной железы(вершина, середина и основание, соответственно). Для каждого пациента анализ выполняли на отсутствие пептида, на присутствие пептида Sur1, на присутствие Sur9 и на присутствие модифицированного пептида Sur1M2. Использовали 1x104 эффекторных клеток на лунку. График показывает определение количества активных клеток; серые колонки представляют среднее количество IFNпродуцирующих клеток. Фиг. 7 иллюстрирует связывание HLA-35 пептидов, производных сурвивина, и анализ пептидопосредованного связывания молекул HLA-B35 пептидами, производными сурвивина. Продукты лизиса метаболически маркированных Т 2-В 35 клеток инкубировали при 4 С в присутствии 50, 5, 0,5, 0,05 и 0,005 мМ пептида. Связывание HLA-B35 проанализировали методом структурных связей и количество затем определили электрофорезом на IEF-геле, используя программное обеспечение ImageGauge аппарата для визуализации (FUJI photo film Co., LTD., Япония). Значение С 50 представляет концентрацию пептида, необходимую для связывания половины максимально возможного количества молекул HLA-B35. Фиг. 8 показывает спонтанные ответы Т-клеток, наблюдаемые в PBL у пациентов, больных раком. А) Число IFNпродуцирующих клеток, формирующих пятна, проанализировали с помощью ELISPOT анализа без пептида (белые столбики), с Sur51-59 (черные столбики) или Sur46-54 (серые столбики), среди простимулированных in vitro PBL пациента, страдающего CLL5 (105 клеток/лунка), НЕМ 12 (105 клеток/лунка) и НЕМ 8 (5x104 клеток/лунка). В) Число клеток, формирующих пятна, среди 1,7x105 PBL из НЕМ 12, культивируемых в течение 10 дней с сенсибилизированными пептидом зрелыми аутологическими дендритными клетками. Столбики представляют среднее число измерений в двух повторностях. Фиг. 9 показывает спонтанные ответы Т-клеток на нативные и модифицированные сурвивиновые пептиды у пациентов с меланомой. А) Число клеток, продуцирующих пятна, проанализировали с помощью ELISPOT анализа по Sur51-59 и Sur51Y9 у пациента, страдающего FM25, в PBL (4x103 клеток/лунка) и TIL (7x104 клеток/лунка), так же как TIL от FM45 (104 клеток/лунка). В) Число клеток, формирующих пятна, проанализировали с помощью ELISPOT анализа по Sur46 и Sur46Y9 в TIL от FM74(5x103 клеток/лунка). Столбики представляют среднее число измерений в двух повторностях с вычетом высвобождения неспецифических IFN-. Фиг. 10 иллюстрирует аффинность связывания пептидов, производных сурвивина, с HLA-A1. Полосы тяжелых цепей МНС класса I количественно определили на аппарате для визуализации. Подъем стабилизированной тяжелой цепи HLA-A1 прямо пропорционально связан с аффинностью связывания добавленного пептида. Пептид-опосредованное связывание HLA-A1 (произвольно выбранные единицы) индуцируется 40, 4,0,4, 0,04 мМ Sur93-101 (линия), Sur93T2 (квадрат), Sur49-58 (кружок) или Грипп А, РВ 1 591-599 (треугольник). Фиг. 11 показывает спонтанные ответы на пептиды, рестриктированные по HLA-A1. Спонтанные Тклеточные ответы на пептиды, производные сурвивина, проанализировали с помощью ELISPOT. Показано среднее число пептид специфических IFN- пятен, сформированных в ответ на Sur92-101, Sur38Y9,Sur47Y10 и Sur93T2 у 5 х 104 in vitro простимулированных PBL или TIL у пациентов, больных меланомой. Пептид специфические ответы наблюдались в 6 исследуемых образцах PBL и 3 образцах TIL у пациентов с меланомой (Mel). Неспецифические IFN-y пятна вычитались. Столбики: амплитуда повторностей. Фиг. 12 показывает спонтанные ответы на пептиды, рестриктированные по HLA-A11. Спонтанные Т-клеточные ответы на пептиды, производные сурвивина, проанализировали с помощью ELISPOT. Показано среднее число пептид специфических IFN- пятен, сформированных в ответ на Sur53-62 у 5 х 104 invitro простимулированных PBL или TIL у пациентов, больных раком. Пептид специфические ответы наблюдались у 5 обследуемых пациентов с меланомой (Mel) (5 PBL, 1 TIL) и 2 пациентов с CLL (CLL)- 12008026 Фиг. 13 показывает спонтанные ответы на пептиды, рестриктированные по HLA-A3. Спонтанные Тклеточные ответы на пептиды, производные сурвивина, проанализировали с помощью ELISPOT. Показано среднее число пептид специфических IFN- пятен, сформированных в ответ на Sur18K10 у 5 х 104 invitro простимулированных PBL или TIL у пациентов, больных меланомой. Пептид специфические ответы наблюдались в 23 исследуемых образцах PBL и 4 образцах TIL пациентов с меланомой (Mel). Неспецифические IFN- пятна вычитались. Столбики: амплитуда повторностей. Фиг. 14 показывает спонтанные ответы на пептиды, рестриктированные по HLA-A2. Спонтанные Тклеточные ответы на пептиды, производные сурвивина, проанализировали с помощью ELISPOT. Показано среднее число пептид специфических IFN- пятен, сформированных в ответ на пептиды, содержащие 11 мономеров, Sur18-28 у 5 х 104 in vitro простимулированных PBL у пациентов, больных раком. Пептид специфические ответы наблюдались в 10 исследуемых образцах PBL у пациентов с меланомой (Mel),6 образцах у пациентов с CLL (CLL) и 2 образцах у пациентов с раком молочной железы (МС). Неспецифические IFN- пятна вычитались. Столбики: амплитуда повторностей. Фиг. 15 показывает спонтанные ответы на пептиды, производные сурвивина, проанализированные с помощью ELISPOT. Показано среднее число пептид специфических IFN- пятен, сформированных в ответ на Sur6-14 (LPPAWQPFL) у 105 in vitro простимулированных PBL у 5 пациентов с меланомой (mel25,mel26, mel3, mel6, mel39), 2 пациентов с CLL (CLL1, CLL54) и 2 пациентов с раком молочной железы(МС 11, МС 15). Неспецифические IFN- пятна вычитались. Фиг. 16 иллюстрирует лабораторные значения стабильного измерения лактат дегидрогеназы (LDH),холинэстеразы, креатинина, гемоглобина, лейкоцитов и тромбоцитов после вакцинирования четырех пациентов ( RW,KN, - WWE,GB). Фиг. 17 демонстрирует кинетический анализ иммунности к сурвивиновым пептидам, оцененнымIFN- ELISPOT анализом. РВМС (мононуклеары периферической крови) получили перед первой DC прививкой и спустя 3 месяца. Показаны количества IFNпродуцирующих клеток, формирующих пятна. В следующую таблицу внесены аминокислотные последовательности для применяемых здесь пептидов и соответствующие им номера SEQ ID No. Пример 1. Идентификация цитостатического ответа Т-лимфоцитов на белок сурвивин, ингибирующий апоптоз, у пациентов, больных раком. Резюме С помощью ELISPOT анализа изучалось применение эпитопов CTL, полученных из сурвивина специфической Т-клетки, активной против таких антигенов в периферической крови пациентов с хронической лимфацитной лейкемией (CLL) и в лимфатических узлах при инфильтрующей опухоли у пациентов с меланомой. CTL ответы на эпитопы пептида, производного сурвивина, обнаружены у 3 из 6 пациентов с меланомой и у 3 из 4 пациентов с CLL. Отсутствие Т-клеточной активности наблюдали в PBL у 6 здоровых контрольных индивидов. Таким образом, пептиды, производные сурвивина, могут служить важными и широко применимыми мишенями в антираковой иммунотерапевтической стратегии.- 15008026 Введение Белок сурвивин изучили на предмет присутствия связанных с HLA-A0201 (HLA-A2) пептидных мотивов, и после успешной идентификации пептиды использовались для тестирования специфической Т-клеточной активности у пациентов с лейкемией и меланомой с помощью ELISPOT анализа. В обеих группах пациентов обнаружили CTL ответы на два эпитопа пептида, производного сурвивина, тогда как у здоровых контрольных индивидов Т-клеточная активность отсутствовала. Эти данные предлагают, что сурвивин представляет широко экспрессированный опухолевый антиген, распознаваемый аутологическими Т-клетками. Материалы и способы Пациенты и нормальный контроль У 4 пациентов с обнаруженной CLL (CLL1-4) и у 6 здоровых индивидов в гепаринизированные пробирки отобрали образцы периферической венозной крови. PBL выделили путем сепарации лимфы и заморозили в эмбриональной сыворотке теленка (FCS) с 10% диметилсульфоксидом. Дополнительно у 6 пациентов с меланомой (mel1-6) получили Т-лимфоциты из инфильтрующей опухоли лимфатических узлов. Свежерезецированные лимфатические узлы измельчили на маленькие фрагменты, раздавили, чтобы выпустить клетки в культуру и криоконсервировали. PBL были взяты у 4 пациентов с меланомой. С помощью анализа диаграммы рассеяния возбужденной флуоресценции сортированных клеток (FACS),используя HLA-A2 специфическое антитело ВВ 7.2, определили, что все индивиды были HLA-A2 положительными. Антитело выделили из супернатанта гибридомы. Образцы у пациентов получили в Больнице Государственного университета, Херлев, Дания. Перед каким-либо из данных исследований на основе информированности получили согласие пациентов. Пептиды, производные сурвивина Все пептиды были получены из Research Genetics (Хантсвилл, Алабама, США) и обеспечили их 90% чистоту, проверенную высоко разрешающей жидкостной хроматографией (HPLC) и Массспектрометрией (MS). Используемые пептиды внесены в табл. 1. Таблица 1. Пептиды, проанализированные в данном исследовании, и их связывающая аффинность с Диапазон значений, записанных в нижнем индексе, указывает положение пептида в последовательности сурвивина, как раскрыто в патенте США 6245523. в С 50 - концентрация пептида, необходимого для связывания половины максимального количества молекул HLA-A2, как определено ниже. Анализ структурных связей пептида с молекулами МНС класса I Анализ структурных связей синтетического пептида с молекулами МНС класса I, метаболически помеченными [35S]-метионином, выполняли, как описано в (12, 13). Анализ структурных связей основывается на стабилизации молекул класса I после загрузки к линии клеток Т 2, в которых отсутствует переносчик пептидов. Затем правильно свернутые стабильные тяжелые цепи МНС осадили с помощью кон- 16008026 формационно-зависимых антител. После электрофореза на IEF гели проверили на аппарате для визуализации, и связывание пептида определили количественно с помощью программы Imagequant PhosphorImager (Molecular Dynamics, Саннивал, Калифорния). Антигенная стимуляция PBL Чтобы увеличить чувствительность ELISPOT анализа, PBL простимулировали однократно in vitro до анализа (14, 15). Свежие и предварительно замороженные PBL дали подобные результаты при ELISPOT анализе. В день 0 PBL или измельченный лимфатический узел разморозили и поместили на 24-луночный планшет (Nunc, Дания) по 2 мл/лунка при концентрации 2x106 клеток на среду AIM V (Life Technologies,Роскилд, Дания), с добавлением 5% инактивированной высокой температурой человеческой сыворотки и 2 мМ L-глутамина в присутствии 10 М пептида. В каждый опыт включили лунки без пептида. 2 дня спустя к культурам добавили 300 международных единиц(МЕ)/мл рекомбинантного интерлейкина-2 (IL-2)(Chiron, Ратинген, Германия). Активность культивируемых клеток проверили ELISPOT анализом на 12 день.ELISPOT анализ для определения количества эпитопа пептида специфических интерферон-продуцирующих эффекторных клеток выполняли, как описано в (16). Вкратце, нитроцеллюлозные 96 луночные планшеты (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Хедехузен, Дания) покрыли анти-IFN- антителом (1-D1K, Mabtech, Нака, Швеция). Лунки промыли, наполнили средой AIM V и поместили клетки в двух повторностях при различных концентрациях клеток. Затем в каждую лунку добавили пептиды, и планшеты инкубировали на протяжении ночи. На следующий день среду удалили и лунки промыли перед добавлением биотинилированного вторичного антитела (7-В 6-1-Биотин, Mabtech). Планшеты инкубировали в течение 2 ч, промыли и в каждую лунку добавили авидин-ферментный конъюгат (AP-Avidin,Calbiochem, Life Technologies). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, затем в каждую лунку добавили ферментный субстрат NBT/BCIP (Gibco, Life Technologies) и выдержали при комнатной температуре 5-10 мин. Реакцию остановили промыванием водопроводной водой после появления темно-фиолетовых пятен. Пятна подсчитали с помощью системы AlphaImager (Alpha Innotech,Сан-Леандро, Калифорния, США) и частоту пептид специфических CTL можно было рассчитать по числу клеток, формирующих пятна. Анализы выполнялись в двух повторностях для каждого пептидного антигена. Результаты Связывание пептидов, производных сурвивина, с HLA-A2 Аминокислотную последовательность белка сурвивина изучили для определения наиболее вероятного девяти- и десятимерных пептидных эпитопов HLA-A2, используя главные HLA-A2 специфические якорные остатки (17). Синтезировали десять пептидов, производных сурвивина, и исследовали их связывание с HLA-A2. Эпитоп от HIV-1 pol476-484 (ILKEPVHGV, SEQ ID No: 11) (табл. 1) использовали как положительный контроль. В положительном контроле концентрация пептида, необходимая для связывания половины максимально возможного количества молекул МНС класса I (значение С 50), составила 0,7. Для сравнения, пептид, обозначаемый Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID No: 3), связывался с аффинностью С 50=10 М. Пептиды, обозначаемые Sur6 (FLKLDRERA, SEQ ID No: 1) и Sur8 (TLPPAWQPFL, SEQ ID No: 2), соответственно, связывались с HLA-A2 при С 50=30 М, тогда как у Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID No: 10) и Sur3(KVRRAIEQL, SEQ ID No: 13) наблюдалось более слабое связывание (С 50100 М). Пять из исследованных пептидов (Sur2, Sur4, Sur5, Sur7, и Sur10) не связывались с HLA-A2. Так как Sur1 слабо связывается с HLA-A2, синтезировали два аналоговых пептида, обозначенныхSur1L2 и Sur1M2, соответственно, в которых улучшенным якорным остатком (лейцином или метионином) заменили нативный треонин в положении 2. Оба эти пептида связываются с HLA-A2 с почти одинаковой высокой аффинностью, как в положительном контроле (С 50=1 М).CTL ответ на сурвивин у пациентов, больных CLLvitro перед ELISPOT анализом. Эта процедуру провели для увеличения чувствительности ELISPOT анализа. Все 10 пептидов, производных сурвивина, включили в первую линию экспериментов. Ответы определили для Sur1 и Sur9, данные этих пептидов представлены в фигурах. Фиг. 1 показывает активностьCTL к Sur1 и Sur9, как определено у пациента CLL1. Каждое пятно представляет пептидную активностьINFпродуцирующей клетки. Среднее число пятен на пептид рассчитали с помощью устройства CCD и компьютерной системы. У пациента CLL1 обнаружили пятьдесят два специфических пятна пептида Sur9(после вычитания пятен, появившихся без добавления пептида) на 6x105 клеток (фиг. 1). На слабо связывающийся с HLA-А 2 пептид Sur1 не обнаружили ответ, однако, пациент отвечал на прочно связывающийся с HLA-A2 аналоговый пептид Sur1M2 (35 пептидных специфических пятен на 104 клеток) (фиг. 2). Не обнаружили ответ на другой прочно связывающийся с HLA-A2 аналоговый пептид Sur1L2 у этого пациента (фиг. 2). Пациент CLL2 заметно отвечал на Sur9 (128 пептид специфических пятен на 105 клеток) и слабо - на Sur1 (22 пептид специфических пятна на 105 клеток) (фиг. 3). Ответ на аналоговый пептид Sur1L2 только немного увеличен по сравнению с нативным эпитопом, тогда как пациент отвечал одинаково сильно на пептид Sur1M2 и десятимерный пептид Sur9. У пациента CLL3 наблюдали слабый- 17008026 ответ на Sur9 (фиг. 3). Не было ответа у пациента на пептиды Sur1 или модифицированный Sur1. He обнаружили ответы у последнего пациента CLL4 (данные не показаны). PBL 6 здоровых индивидов HLAA2 положительного контроля проанализировали на возможность ответа на сурвивин. Не обнаружили ответ ни в одном контроле, ни на один из пептидов, производных сурвивина.CTL ответ на сурвивин у пациентов, больных меланомой Исследовали Т-лимфоциты, выделенные из инфильтрующей опухоли лимфатического узла у HLAA2 положительных пациентов с меланомой. Свеже резецированный лимфатический узел измельчили на мелкие фрагменты и раздавили, чтобы выпустить клетки в культуру. Перед ELISPOT анализом клетки однократно простимулировали пептидом in vitro. Сурвивин специфические Т-клетки определили у трех из шести анализируемых пациентов. Заметный ответ на Sur9 наблюдали у пациента Mel2 и Меl3. Также у этих пациентов определили более слабый ответ на пептид Sur1 (фиг. 4). У пациента Mel1 ответ на слабо связанный пептид Sur1 был заметнее, чем ответ на более сильно связывающийся с HLA-A2 пептид Sur9(фиг. 4). Не обнаружили ответ в инфильтрующей опухоли лимфатических узлов последних 3 пациентов с меланомой (Меl4-6). Исследовали PBL двух сурвивин активных пациентов Mel1 и Меl2 и двух пациентов Меl4 и Меl5, не имеющих активности. В PBL ни одного из этих пациентов не мог быть обнаружен никакой ответ ни на Sur9, ни на Sur1 (данные не показаны). Пример 2. Спонтанные цитостатические ответы Т-клетки на рестриктированные по МНС классу I Т-клеточные эпитопы, производные сурвивина, in situ и ex vivo у пациентов, больных раком. Резюме Показаны in situ и ex vivo спонтанные цитостатические ответы Т-клетки на рестриктированные по МНС классу I Т-клеточные эпитопы, производные сурвивина, у пациентов с раком молочной железы,лейкемией и меланомой. Кроме того, сурвивин активные Т клетки, изолированные с помощью магнитных гранул, покрытых комплексами МНС/пептид, оказались цитостатическими к HLA-совместимым опухолям различных типов ткани. Являясь универсальным опухолевым антигеном, сурвивин может служить широко применимой мишенью для антираковой иммунотерапии. Материалы и способы Конструкция комплекса HLA-пептид для окрашивания и отбора Т-клеток В Е. coli BL21 (DE3) с помощью биотин белоковой лигазы (BirA) в связке с 5'-концами экстрацеллюлярных доменов HLA А 0201 (остатки 1-275) экспрессировали сайт узнавания для ферментативного биотинилирования. Рекомбинантный белок очистили гель хроматографией (Sephadex G25, Pharmacia) и ионно обменной хроматографией (mono-Q, Pharmacia) от включений, растворенных в 8 М мочевины.HLA А 0201 свернули in vitro растворением в присутствие модифицированного сурвивин пептидаSurlM2 (LMLGEFLKL, SEQ ID No: 5) или пептида МАА gp100154-163, и затем биотинилировали, как описано выше (35, 36). После гель-фильтрации на колонке Pharmacia Sephadex G25 для удаления несвязанного биотина белок мультимеризировали со стрептавидин-FITC (флуоресцентный изотиоцианат) конъюгированными молекулами декстрана, (любезно предоставленными L. Winther, DAKO, Дания), чтобы получить мультиспецифическое соединение HLA/декстран для иммуногистохимии. Конструкцию HLA А 0201 любезно предоставил доктор Mark M. Davis (факультет микробиологии и иммунологии Станфордского университета, Пало-Альто, Калифорния). Разделение клеток выполнили, как описано ранее (37). Вкратце,5 х 106 меченных стрептавидином магнитных гранул (Dynal, Осло, Норвегия) промыли дважды 200 л холодным PBS (натрий фосфатный буфер), добавили 0,5 г мономеров пептид/А 0201, и смесь инкубировали 15 мин при комнатной температуре. После двух промываний эти гранулы смешали с PBL в отношении 1:10, затем инкубировали 1 ч, с последующим осаждением связанных гранулами клеток в магнитном поле. Этап осаждения провели однократно. Иммуногистохимическое окрашивание Для окрашивания FITC-коньюгированных мультимерных пептид/МНС комплексов участки ткани высушили на протяжении ночи и затем зафиксировали холодным ацетоном в течение 5 мин. Все этапы инкубации выполняли при комнатной температуре и в темноте: (i) первичное антитело - 45 мин (разбавление 1: 100), (ii) конъюгат Су 3 с козьими антителами к IgG мыши (разбавление 1:500; код 115-165-100,Jackson Immuno Research, полученный от Dianova, Гамбург, Германия) - 45 мин, и, наконец, (iii) мультимеры - 75 мин. Между каждым этапом предметные стекла промыли 2 раза по 10 мин 0,1% PBS/BSA. Слайды поместили в Vectashield и хранили в холодильнике до изучения под софокусным микроскопом. Цитотоксический анализ Традиционные [51 Сr]-высвобождающие анализы CTL-опосредованной цитотоксичности выполняли, как описано в (13). Клетки-мишени являются аутологическими EBV-трансформированными линиями В-клеток, HLA-A2 положительными линиями клеток рака молочной железы MCF-7 (доступные из американской коллекции типовых культур (АТСС, HLA-A2 положительными линиями клеток меланомыFM3 (38), HLA-A2 отрицательными линиями клеток рака молочной железы ВТ-20 (доступные из АТСС) и HLA-A2 отрицательной линией клеток меланомы FM45 (38). Все линии раковых клеток экспрессировали сурвивином, как исследовали с помощью RT-PCR (ревертазо-полимеразная цепная реакция) (дан- 18008026 ные не показаны).ELISPOT анализ применяли для определения количества эпитопа пептида специфических интерферонпродуцирующих эффекторных клеток, как было описано ранее (39). Вкратце, нитроцеллюлозные 96-луночные планшеты (MultiScreen MAIP N45, Millipore) покрыли анти-IFN- антителом (1-D1K, Mabtech,Швеция), и неспецифическое связывание блокировали, используя AIM V (GibcoBRL, Life TechnologiesInc., Гайтерсбург, Мэриленд, США). Лимфоциты добавляли при различной концентрации клеток вместе со специфическими пептидами и Т 2 клетками и инкубировали на протяжении ночи при 37 С. После двухразового промывания добавили биотинилированное антитело (7-В 6-1-Биотин, Mabtech). Специфическое связывание визуализировали с помощью авидин-щелочной фосфатазы вместе с соответствующим субстратом (GibcoBRL). Реакция остановили при появление темных фиолетовых пятен, которые подсчитали с помощью системы AlphaImager (Alpha Innotech, СанЛеандро, Калифорния, США). Для ELISPOT анализа использовали пептиды Sur1, Sur9 и Sur1 аналоговый пептид Sur1M2, как описано в примере 1. РезультатыIn situ окрашивание НLА-А 2/сурвивин активных Т-клеток В примере 1 два пептидных эпитопа, производного сурвивина, распознавались Т-клетками при лейкемии и меланоме, т. е., был идентифицирован Sur1. Слабая аффинность связывания Sur1 с HLA-A2 была убедительно доказана заменой треонина в положении 2 на лучший якорный остаток (метионин;Sur1M2). Эта мера позволила получить стабильные HLA-А 2/пептид комплексы. Эти комплексы мультимеризировали с помощью стрептавидин-FITC конъюгированной молекулы декстрана. Мультимеризированные МНС-комплексы использовали для окрашивания зафиксированного ацетоном замороженного материала. Используя софокусный лазерный микроскоп, можно было обнаружить insitu в микроокружающей среде опухоли Sur1M2/HLA-A0201 активные CTL. Такие клетки обнаружили в первичной опухоли и в сторожевом лимфатическом узле у пациента с меланомой III стадии, а так же и в первичном повреждении раком молочной железы. Чтобы гарантировать специфичность окрашивания,выполнили серию отрицательного контроля. Положительное окрашивание не наблюдали ни в случае применения пептид/HLА-декстран мультимеров с пептидами, полученными из меланомного дифференцированного антигена gp100 в той же опухоли, ни в случае Sur1 М 2/НLА-декстран мультимеров образца опухоли, полученного от HLA-A2 отрицательного донора. Лизис линии клеток опухоли различной природы изолированными сурвивин активными CTL Чтобы охарактеризовать функциональную способность сурвивин активных CTL, эти клетки выделили с помощью магнитных гранул, покрытых HLA-А 2/Sur1 М 2-комплексами (36). Свежерезецированный лимфатический узел инфильтрующей меланомы измельчили на маленькие фрагменты и раздавили,чтобы выпустить клетки в культуру. Перед выделением клетки стимулировали однократно пептидом invitro. Спустя 1 день после изоляции добавили IL-2, а на 5 день способность этих клеток убивать опухолевые клетки проанализировали либо ELISPOT анализом, либо стандартным анализом с 51 Сr-меткой. Вопервых, посредством ELISPOT анализа стало возможным установить, что CTL, изолированные с помощью модифицированного Sur1 М 2/НLА-А 2-комплекса также отвечают на нативный пептид Sur1 (данные не показаны). Во-вторых, проверили цитотоксичность сурвивин активных CTL против HLA-A2 положительной линии клеток меланомы FM3 (фиг. 5 А) и HLA-А 2 положительной линии клеток рака молочной железы MCF-7 (фиг. 5 В). Изолированные Т-клетки, эффективно лизировали обе линии клеток HLAА 0201. В отличие от этого, не обнаружили цитотоксичность по отношению к HLA-A2 отрицательной линии клеток меланомы FM45 (фиг. 5 А) или HLA-A2 отрицательной линии клеток рака молочной железы ВТ-20 (фиг. 5 В). Сурвивиновая активность, измеренная в PBL ELISPOT анализом Присутствие сурвивин активных Т-клеток в PBL у 10 пациентов с HLA-А 2 положительным раком молочной железы исследовали ELISPOT анализом. Перед анализом PBL простимулировали однократноin vitro, чтобы увеличить чувствительность анализа. Исследовали активность к следующим сурвивиновым пептидам: Sur1, Sur9 и Sur1M2. Сурвивин специфические Т-клетки обнаружили у 6 из 10 пациентов сHLA-A2 положительным раком молочной железы. Типичные примеры представлены на фиг. 6. В PBL 2 пациентов обнаружили ответ на Sur1 и модифицированный аналог Sur1M2, но не на Sur9 (фиг. 6, вершина,середина), у 3 пациентов обнаружили ответ на Sur9, но не на Sur1 или Sur1M2 (основание фиг. 6), и 1 пациент отвечал только на Sur1M2. Напротив, ответы на сурвивин не были обнаружены в PBL 20 здоровых HLA-A2 положительных доноров. Так же исследовали PBL у 14 HLA-A2 положительных пациентов с меланомой. Сурвивин ответы наблюдались у 7 из этих пациентов (табл. 2). Два пациента отвечали на пептид Sur9, трое - на пептид Sur1M2, один - и HaSur1, и на Sur1M2, и один - на все три пептида. В примере 1 протестировали ответ Т-клетки на сурвивин у 3 пациентов с хронической лимфатической лейкемией (CLL) (табл. 2; CLL1, CLL2, CLL3). Эти исследования расширили, используя PBL трех дополнительных пациентов с CLL. Примечательно то, что у всех пациентов наблюдался ответ Т-клеток по меньшей мере на один эпитоп сурвивина (табл. 2; CLL5, CLL6, CLL7). Кроме того, исследовали PBL одного пациента, страдающего хронической миелоидной лейкемией (CML). У этого пациента идентифицирова- 19008026 ли ответ на все три пептида (данные не показаны). Данные помещены в табл. 2. Таблица 2. Пациенты с сурвивин пептид-специфическими Т-лимфоцитами в PBL, измеренными ELISPOT анализом а) Частота активных клеток на 104; обследованы 14 пациентов. б) Частота активных клеток на 104; обследованы 10 пациентов. в) Частота активных клеток на 105; обследованы 7 пациентов. Пример 3. НLА-В 35-рестриктированные иммунные ответы на пептиды, производные сурвивина, у пациентов, страдающих раком. Резюме В данном исследовании идентифицировали и охарактеризовали два эпитопа, производного сурвивина, рестриктированных по HLA-B35. У пациентов с различными формами опухоли кроветворных органов и меланомой в периферической крови присутствовала специфическая Т-клеточная активность на оба эти эпитопа. Замещение якорного остатка на С-конце улучшили распознавание лимфоцитами инфильтрующей опухоли у пациентов с меланомой. Кроме того, продемонстрированы спонтанные цитотоксические ответы Т-клеток на сурвивин in situ при первичном меланомном повреждении. Эти эпитопы- 20008026 расширяют возможность применения стратегий вакцинирования, основанных на пептидах сурвивина, по отношению к злокачественным опухолям, так же как HLA профиль вовлеченных пациентов. В примерах 1 и 2 изучались рестриктированные по HLA-A2 эпитопы Т-клеток, производные сурвивина. Так как HLA-A2 экспрессирован только у приблизительно 30% кавказской популяции (63), чтобы расширить группу пациентов, которых можно будет вылечить, необходимо определить пептидные эпитопы, рестриктированные по другим молекулам HLA класса I. В данном исследовании идентифицировали два новых Т-клеточных эпитопа сурвивина, рестриктированного по HLA-B35, который экспрессирован у 9% кавказской популяции (63), и определили спонтанные иммунные ответы на эти пептиды сурвивина у пациентов с различными опухолями кроветворных органов и меланомой. Материалы и способы Пациенты У пациентов, больных раком, отобрали образцы периферической венозной крови, выделили PBL,используя Lymphoprep сепарацию, определили HLA-тип (Отделение Клинической Иммунологии, университетская больница, Копенгаген) и заморозили в FCS с 10% диметилсульфоксидом. Для дальнейшего обследования отобрали десять HLA-B35 положительных пациентов. Эти пациенты страдали меланомой,CLL, фолликулярной лимфомой (FL), диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой (DLBCL) и множественной миеломой (ММ), соответственно. На момент отбора образцов крови пациенты не получали лечения в течение предыдущих 4 месяцев. Дополнительно у 3 пациентов с меланомой из лимфатических узлов выделили лимфоциты инфильтрующей опухоли (TIL) и заморозили их в FCS с 10% диметилсульфоксидом. Пептиды В исследовании использовали семь синтетических пептидов, производных сурвивина: Sur6-14,Sur11-19, Sur34-43, Sur46-54, Sur51-59, Sur46Y9, Sur51Y9, и один EBV-производный пептид, EBNA3A 457-466 (63). Все пептиды были получены от Research Genetics (Хантсвилл, Алабама) и обеспечили чистоту 90%, проверив высокоэффективной жидкостной хроматографией (HPLC) и масс-спектрометрическим анализом (MS). Пептиды внесены в табл. 3, ниже. Таблица 3. HLA-B35 связывание пептидов, производных сурвивина Анализ структурных связей пептидного связывания с молекулами МНС класса I. Для измерения аффинности синтетических пептидов с молекулами HLA-В 35, метаболически меченными [S35] метионином, применили анализ структурных связей, описанный в примерах 1 и 2. Вкратце, анализ основывается на пептид-опосредованной стабилизации свободных молекул HLA, выделенных при лизисе клетки из линии ТАР дефицитных клеток Т 2, стабильно трансфекцированных с HLA-B35(любезно предоставленная Доктором Дж. Haurum, Symphogen ApS, Лингби, Дания). Стабильно свернутые молекулы HLA осадили с помощью конформационно-зависимого моноклонального антитела W6/32. Молекулы HLA отделили IEF электрофорезом, гели исследовали аппаратом визуализации (Imaging plate,FUJI photo film Co., LTD, Япония), проанализировали и количество правильно свернутых молекул HLA определили с помощью программного обеспечения ImageGauge phosphorimager (FUJI photo film Co.,LTD, Япония). Стимуляция антигена PBL Чтобы увеличить чувствительность ELISPOT анализа, лимфоциты однократно простимулировали invitro с пептидом до анализа (14, 15). PBL или TIL оттаяли и простимулировали 50 М эпитопов пептида в 96-луночном планшете 2 ч при 26 С (5x105-106 клеток на пептид) и объединили для дальнейшего 10- 21008026 дневного культивирования при 37 С на среде x-vivo с 5% человеческой сывороткой (HS) в 24-луночном планшете (Нанк, Роскилд, Дания) с 2x106 клетками в лунке. На второй день инкубации добавили 40 г/млIL-2 (Apodan A/S, Дания). На 10 день культуральные клетки проверили на активность ELISPOT анализом.ELISPOT анализ для определения количества специфического пептида IFN- продуцирующих эффекторных клеток в PBL или TIL, отобранных у пациентов, страдающих раком, выполняли, как описано в примере 1. Вкратце, нитроцеллюлозные 96-луночные планшеты (MultiScreen MAIP N45; Millipore, Хедехузен, Дания) покрыли моноклональными антителами против IFN- человека, 7,5 г/мл (1-DlK; Mabtech, Нака, Швеция). Лунки промыли, заполнили средой x-vivo (x-vivo 15TM BioWhittacker, MolecularApplications Aps, Дания) и добавили клетки в двух повторностях при различных концентрациях. Для демонстрации антигена в каждую лунку добавили 104 Т 2-В 35 клетки без пептида и с 10 М пептида. Планшеты инкубировали на протяжении ночи, клетки удалили, а лунки промыли до добавления биотинилированного вторичного антитела (7-В 6-1-Биотин; Mabtech). Планшеты инкубировались 2 ч при комнатной температуре, и добавили конъюгат авидин-щелочной фосфатазы (AP-Avidin; Calbiochem, LifeTechnologies, Inc.). После 1 ч инкубации при комнатной температуре добавили субстрат фермента нитросиний тетразолий/5-бром-4-хлор-3-индолил фосфат (Кодовый Номер К 0598, DakoCytomation NordenA/S), темно-фиолетовые пятна появились через 3-7 мин. Реакцию остановили промыванием водопроводной водой. Пятна подсчитали с помощью системы Alpha Imager (Alpha Innotech, СанЛеандро, Калифорния), и частота пептид специфических Т-клеток рассчитали по числу клеток, формирующих пятна. Все анализы выполняли в двух повторностях для каждого антигена пептида, и лимфоциты, культивируемые в тех же лунках, тестировали в равных количествах клеток с пептидом и без пептида, чтобы измерить число пептид специфических клеток в культуре. Созревание дендритных клеток (DC) Адгезивные клетки изолировали от PBL после 2 ч культивирования. Их культивировали еще 10 дней на питательной среде RPMI 1640 (GibcoTM Invitrogen corporation, Великобритания) с 10% FCS. Каждый третий день добавляли 800 нг/мл GM-CSF (гранулоцит-макрофаг колонне стимулирующий фактор)(PreproTech, Лондон, Великобритания) и 40 нг/мл IL-4 (PreproTech). На 10 день DC довели до полного созревания, добавляя 50 нг/мл TNF- в течение 24 ч (PreproTech). После созревания DC высвободили и сенсибилизировали 20 М пептида в присутствии 3 г/мл 2-микроглобулина в течение 2 ч при 26 С. Выделение пептид специфических Т-клеток Антиген специфические клетки изолировали с помощью покрытых Sur51Y9/HLA-B35 магнитных гранул, как описано в примере 2. Биотинилированные мономеры HLA-B35 с Sur51Y9 (получено от ProImmune, Оксфорд, Великобритания) соединили с покрытыми стрептавидином магнитными бусинкамиPBS 20 мин при комнатной температуре. Магнитные комплексы трижды промыли в PBS, используя магнитное устройство (Dynal A/S, Осло, Норвегия) и затем смешали с PBL в отношении 1:10 в PBS с 5%BSA при очень мягком вращение в течение 1 ч. Антиген специфические CD8+ Т-клетки, связавшиеся магнитными комплексами, мягко промыли дважды или трижды. Изолированные клетки ресуспендировали несколько раз in vivo добавлением 5% сывороткой человека и инкубировали 2 ч прежде, чем магнитные гранулы были освобождены и удалены из клеточной суспензии. Изолированные антиген специфические CD8+ Т-клетки подвергли ELISPOT анализу для изучения перекрестной отвечаемости между нативным и модифицированным пептидом. Картирование клонотипа электрофорезом в денатурирующем градиентном геле (DGGE) Картирование TCR клонотипа электрофорезом в денатурирующем градиентном геле TCR BV участков 1-24 человека подробно описано в (66). Вкратце, РКН изолировали с помощью набора для выделения Purescript (Gentra Systems Inc. MN) и транскрибированную кДНК амплифицировали ПЦР (полимеразно цепная реакция) с помощью праймеров для переменных областей TCR-B цепи в конъюгации с праймером известной константной области. Чтобы убедиться, что амплифицированные молекулы ДНК были охвачены DGGE анализом, к 5'-концу константной области праймера присоединили 50 пар нуклеотидов GC-богатой последовательности (GC-clamp). DGGE анализ сделали на 6% полиакриламидных гелях, содержащих градиент мочевины и формамида от 20 до 80%. Электрофорез выполнили при 160 V в течение 4,5 ч в 1-кратном ТАЕ буфере (трис-ацетат-этилендиаминтетраацетат) при постоянной температуре 54 С. Для идентификации антиген специфических Т-клеток in situ в опухолевых повреждениях у пациентов, страдающих раком, применили иммуногистохимическое окрашивание мультимеризированных пептид/HLA комплексов, как описано в примере 2. Биотинилированный мономер Sur51Y9/HLA-B35 был предоставлен Proimmune limited, Оксфорд, Великобритания. Биотинилированный мономерSur51Y9/HLA-B35 мультимирезировали со стрептавидин-FIТС-конъюгированными молекулами декстрана (любезно предоставленными L. Winther, DAKO, Глоструп, Дания), чтобы получить мультивалентные HLA/декстран соединения для иммуногистохимии. Кусочки ткани высушили в течение ночи и затем зафиксировали в холодном ацетоне 5 мин. Все этапы инкубации выполняли при комнатной температуре- 22008026 и в темноте: (i) первичное антитело - 45 мин (разбавление 1:100), (ii) конъюгат Су 3 с козьими антителами к IgG мыши (разбавление 1:500; код 115-165-100, Jackson Immuno Research, полученный от Dianova,Гамбург, Германия) - 45 мин, и, наконец, (iii) мультимеры - 75 мин. Между каждым этапом предметные стекла промыли 2 раза по 10 мин 0,1% PBS/BSA. Предметные стекла поместили в Vectashield и хранили в холодильнике до изучения под софокусным микроскопом (Leica). Результаты идентификации связанных с HLA-B35 пептидов, производных сурвивина Аминокислотную последовательность сурвивина исследовали на предмет 9- и 10-мерных пептидов с якорными остатками, согласно пептид-связывающему мотиву HLA-B35 (67). Отобрали пять пептидов,содержащих пролин, как якорный остаток N-конца в положении 2, фенилаланин, лейцин, изолейцин или тирозин, как якорные остатки С-конца (табл. 3). Анализ структурных связей показал два пептида, Sur5159 (EPDLAQCFF, SEQ ID No: 7) и Sur46-54 (CPTENEPDL, SEQ ID No: 6), которые способны эффективно стабилизировать HLA-B35. Кроме того, два пептида, Sur34-43 (TPERMAEAGF, SEQ ID No: 20) и Sur6-14(LPPAWQPFL, SEQ ID No: 18), показали слабую стабилизацию, тогда как оставшийся пептид не стабилизировал HLA-B35 вообще. Концентрация пептида, необходимая для связывания половины максимального количества молекул HLA-B35 (С 50) составила 13 М для Sur51-59 и 20 М для Sur46-54. Для сравнения, значение С 50 для эпитопа С 24 от EBNA3A458-466 (YPLHEQHQM, SEQ ID No: 21) - положительного контроля, составило 0,81 М. Чтобы усилить аффинность Sur46-54 и Sur51-59, С-конец аминокислоты заместили тирозином,лучшим якорным остатком (67). Связывание HLA-B35 модифицированными пептидами исследовали анализом структурных связей, и значения С 50 составили 1,51 М - для Sur51Y9 и 4 М - для Sur46Y9(фиг. 7). Спонтанные иммунные ответы на нативные пептидные эпитопы Первоначально, проанализировали 5 пациентов на предмет спонтанных иммунных ответов на четыре нативных связанных с HLA-B35 пептидов: Sur51-59, Sur46-54, Sur34-43 и Sur6-14. Эти 5 пациентов имели различные опухоли кроветворных органов: НЕМ 8 и НЕМ 18, страдающий MM, HEM12, страдающий FL, HEM9, страдающий DLBCL, и CLL5, страдающий CLL.INF- ELISPOT анализ выполняли на PBL после 10 дней стимулирования in vitro для определения пептидного предшественника CTL. Спонтанные иммунные ответы выявили против двух из нативныхHLA-B35 связанных пептидов, Sur51-59 и Sur46-54. Два пациента НЕМ 12 и CLL5 показали ответ и наSur51-59 и на Sur46-54, тогда как НЕМ 8 показал ответ только на Sur51-59 (фиг. 8 А и В). У остальных двух пациентов, НЕМ 9 и НЕМ 18, не обнаружили ответ, а также ответ не обнаружили к слабо связывающим пептидам Sur34-46 и Sur6-14 ни у одного из пациентов. Альтернативный подход к in vitro стимуляции применили у пациента НЕМ 12, т.е. PBL культивировали с созревшими аутологическими дендритными клетками, сенсибилизированными Sur51-59 для стимулирования CTL ответа in vitro. PBL из этой культуры показали сильную активность к Sur51-59 приELISPOT анализе (фиг. 8 В). Усиленное распознавание модифицированных пептидов Как описано выше, аффинность HLA-B35 к модифицированным пептидам превышает в 5-10 раз аффинность HLA-B35 к нативным пептидам. Группу пяти пациентов с меланомой проанализировали на предмет спонтанных иммунных ответов на нативные и модифицированные пептиды с помощью ELISPOT анализа. Образцы PBL проанализировали после in vitro стимуляции, тогда как образцы TIL проанализировали без стимуляции. Спонтанные иммунные ответы наблюдались и в PBL, и в TIL у 3 из 5 пациентов.FM25 показал активность к Sur51-59 и Sur51Y9 и в образцах PBL и TIL (фиг. 9 А). У FM45 обнаружили мощный ответ в TIL только на модифицированный пептид Sur51Y9. PBL у этого пациента не рассматривали (фиг. 9A). FM74 показал мощный ответ на Sur46Y9 в TIL, но ответ на нативный пептид не обнаружили (фиг. 9 В). А также наблюдали слабый ответ на Sur46Y9 в PBL FM74 (данные не показаны). Перекрестная активность между нативным и модифицированным пептидом Высокая аффинность Sur51Y9 к HLA-B35 позволяет продуцировать стабильные мономеры HLAB35 с Sur51Y9. Установлено присутствие сурвивин активных Т-лимфоцитов в инфильтрующей опухоли лимфатических узлов в PBL различных пациентов, больных раком. Магнитные гранулы покрыли комплексом HLA-B35/Sur51Y9 и применили для выделения сурвивин активных Т-лимфоцитов PBL у пациента CLL5. Этот пациент показал мощный ответ на Sur51-59. С помощью микроскопа наблюдали, как гранулы плотно прикрепились к клеточной поверхности определенных клеток (данные не показаны),обеспечивая осаждение антиген специфических клеток магнитным полем. Изолированные Sur51Y9 специфические клетки мощно отвечали на Sur51-59 (фиг. 9), тогда как в остальных PBL не обнаружили ответ (данные не показаны). Изолированные клетки проанализировалиRT-PCR/DGGE, основанном на картировании TCR клонотипа. Эта методика позволяет анализировать Тклеточную клональность в популяциях комплексных клеток, даже при наличии небольшого числа клеток. Эти исследования показали, что изолировано 8 отдельных клонов (данные не показаны).- 23008026 Присутствие антиген специфических Т-клеток in situ в меланомных повреждениях Мономеры Sur51Y9/HLA-B35 мультимеризировали с помощью молекул декстрана, конъюгированных со стрептавидином и FITC. Мультимеризированные комплексы МНС использовали для окрашивания фиксированного ацетоном, замороженного материал с помощью методики, описанной в примере 2. Антиген специфические клетки наблюдали с помощью софокусного лазерного микроскопа. Проанализировали участки первичной меланомы трех пациентов, и Sur51Y9/HLA-B35-aктивные CTL легко определялись in situ в микроокружающей среде опухоли у одного из пациентов. Совместное окрашивание с mAb по гранзиму В показало, что эти сурвивин специфические CTL производят гранзим В, проявляя цитотоксическую активность,HLA-B35 отрицательные пациенты с меланомой использовались как контроль (данные не показаны). Пример 4. Идентификация новых CTL эпитопов, производных сурвивина, с различными HLA-Aрестрикционными профилями. Резюме На основании CTL ответа у пациентов, страдающих раком, охарактеризовали новые HLA-A1-,HLA-A2-, HLA-А 3-и HLA-A11-ретрикционные эпитопы сурвивина. Эти эпитопы значительно увеличивают число пациентов, имеющих показание к иммунотерапии, основанной на пептидах, производных сурвивина. К тому же, совместное нацеливание нескольких элементов рестрикции, вероятно, уменьшит риск ускользания от иммунного ответа из-за потери HLA-аллеля. Материалы и способы Образцы у пациентов были получены в Вирзбургском Университете, Германия, и Университетской Больницы в Херлеве, Дания. Согласие проинформированных пациентов на участие в исследовании было получено предварительно до начала какого-либо из данных мероприятий. Типирование ткани проводили в Отделе Клинической Иммунологии Университетской Больницы, Копенгаген, Дания. С помощью Lymphoprep сепарации выделили лимфоциты периферической крови (PBL) пациентов с меланомой, раком молочной железы и хронической лимфоцитарной лейкемией (CLL) и заморозили их в эмбриональной сыворотке теленка (FCS) с 10% диметилсульфоксидом. Кроме того, получили Т-лимфоциты из первичных повреждений и из инфильтрующей опухоли лимфатических узлов пациентов с меланомой. Свежерезецированную опухолевую ткань измельчили на мелкие фрагменты и раздавили, чтобы выпустить лимфоциты инфильтрующей опухоли (TIL) для криоконсервации. Пептиды Все пептиды приобрели у Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США), довели до чистоты 80%, проверенной HPLC и MS анализом. Все используемые пептиды внесены в табл. 4, пример 5 ниже. Линии клеток Линия клеток человека Т 2 является дефицитным по ТАР 1 и ТАР 2 гибридом B-LCL174 и T-LCL СЕМ клеток, и, таким образом, экспрессируют низкие уровни молекул HLA класса I (HLA-A0201 иHLA-B5101) на клеточной поверхности. Т 2 клетки, трансфектированные с HLA-A0301, были любезно предоставлены доктором McMicheael (IMM, John Radcliffe Hospital, Оксфорд). T2 клетки, трансфектированные с HLA-A1101 были любезно предоставлены доктором М. Masucci (МТС, Karolinska Institute,Стокгольм, Швеция). Линия клеток ВМ 36.1 также дефицитна по ТАР функции, и имеет фенотип сходный с фенотипом Т 2 с низкой экспрессией HLA класса I (HLA-A0101, HLA-B3501) на поверхности. ВМ 36.1 клетки были любезно предоставлены доктором Ziegler (Humboldt University, Берлин, Германия). Анализ структурных связей пептидного связывания молекул МНС класса I Аффинность синтетических пептидов (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) к HLA-A1,-A2, A3, или -А 11 молекулам, метаболически меченным [35S]-метионином, измерили анализом структурных связей, как описано ранее (12). Анализ основывается на пептид-опосредованной стабилизации свободных молекул HLA, высвобожденных при лизисе клеток, из ТАР-дефицитных клеточных линий. Стабильно свернутые молекулы HLA иммунно осадили с помощью HLA класса I специфического, конформационно-зависимого mAb W6/32, и отделили изоэлектрофокусировкой (IEF) гель электрофореза. Количество полос тяжелой цепи МНС определили, используя программу ImageGauge Phosphorimager (FUJIphoto film Co., Каролтон, Техас, США). Интенсивность полосы пропорциональна количеству комплексов пептид/МНС класса I, образованных в течение опыта. Впоследствии, степень стабилизации молекулыHLA непосредственно связана с аффинностью добавленного пептида. Концентрация пептида использовалась для анализа связывания молекул HLA и составляла 40, 4, 0,4, 0,04 М для HLA-A1 и HLA-A11 и 100, 10, 1, 0,1, 0,01 М для HLA-A2 и HLA-A3. Значение С 50 рассчитали впоследствии для каждого пептида как концентрацию пептида, достаточную для половины максимальной стабилизации. Антигенное стимулирование PBL Чтобы увеличить чувствительность ELISPOT анализа, PBL однократно простимулировали in vitro до анализа. В день начала опыта PBL или измельченные лимфатические узлы оттаяли и были высеяны с концентрацией 2 х 106 клеток в 2 мл/лунка на 24-луночные планшеты (Нанк, Роскилд, Дания) на среду xvivo (Bio Whittaker, Волкерсвиль, Мэриленд) с 5% инактивированной высокой температурой человеческой сывороткой и 2 мМ L-глутамина в присутствии 10 М пептида. Спустя 2 дня к культурам добавили- 24008026 20 МЕ (международная единица)/мл рекомбинантного интерлейкина-2 (IL-2) (Chiron, Ратинген, Германия). На 10 день культуральные клетки проверили на активность ELISPOT анализом.ELISPOT анализ использовали для количественного определения пептидных эпитопов специфических интерферонпродуцирующих эффекторных клеток, как описано ранее (16). Вкратце, нитроцеллюлозный 96-луночный планшет (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Дания) покрыли анти-IFNантителом (1-D1K, Mabtech, Нака, Швеция). Лунки промыли, заполнили средой X-vivo, и поместили клетки в двух повторностях при различных концентрациях клеток. В каждую лунку добавили пептиды, и планшеты инкубировали на протяжении ночи. На следующий день среду удалили, и лунки промыли перед добавлением биотинилированного вторичного антитела (7-В 6-1-Биотин, Mabtech). Планшеты инкубировали в течение 2 ч, промыли, и добавили в каждую лунку конъюгированную авидин-щелочную фосфатазу (Calbiochem, Life Technologies, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение часа. Затем промыли, добавили в каждую лунку ферментный субстрат NBT/BCIP (нитросиний тетразолий/бромохлороиндолилфосфат) (DakoCytomation Norden A/S, Глоструп, Дания) и инкубировали при комнатной температуре 5-10 мин. После появления темнофиолетовых пятен реакцию остановили промыванием водопроводной водой. Пятна подсчитали, используя Анализатор ImmunoSpot серии 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Кливленд, США), и частоту пептид специфической CTL рассчитали по числу клеток, формирующих пятно. Все анализы выполняли в двух повторностях для каждого пептидного антигена. Результаты Идентификация рестриктированных по HLA-A1 эпитопов сурвивина Связывание пептидов, производных сурвивина, с HLA-A1 Аминокислотную последовательность белка сурвивина обследовали на предмет наиболее вероятного HLA-A1 9-мерного или 10-мерного пептидного эпитопа, используя основные якорные остатки HLAA1, аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е) в положении 3 и тирозин (Y), фенилаланин(F) на С-конце. Соответственно, шесть пептидов, производных сурвивина, синтезировали и исследовали на связывание с HLA-A1 (табл. 4). Дополнительно, включили два пептида Sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQID No: 23) и Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID No: 25), не смотря на то, что они содержат только один из основных якорных остатков, так как оба были идентифицированы как вероятно хорошие связывающие по прогнозирующему алгоритму Rammensee и др. доступным в http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/. Значение С 50 получили для каждого пептида, как концентрацию пептида, необходимую для связывания половины от максимального количества молекул HLA-A1 (табл. 4). Однако только один из этих пептидов Sur92-101 (QFEELTLGEF) (SEQ ID No: 27), связанный с почти такой же высокой аффинностью как у известного эпитопа положительного контроля белка Гриппа А основной полимеразы 1 (РВ 1)(VSDGGPNLY), как показано на фиг. 10. Sur93-101 (FEELTLGEF) (SEQ ID No: 24) показал низкую аффинность к HLA-A1, поскольку ни один из других пептидов не анализировали на связывание с HLA-А 1(табл. 4). Следовательно, было синтезировано множество аналоговых пептидов, в которых лучшие якорные остатки заменяли нативные аминокислоты. Было модифицировано два пептида Sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQ ID No: 23) и Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID No: 25) введением тирозина (Y) вместо цистеина (С) или глутамина (Q), соответственно, на С-конце. Оба модифицированных пептида прочно связались с HLA-A1 (табл. 4). К тому же в двух пептидах, Sur92-101 и Sur93-101, были замещены аминокислоты в положении 2 вспомогательными якорными треонином (Т) или серином (S). Эти модификации не имели положительного эффекта связывания Sur92-101 с HLA-A1. Напротив, Sur93T2 (FTELTLGEF)(SEQ ID No: 36) связывался с высокой аффинностью с HLA-A1 (табл. 4). Фиг. 10 иллюстрирует связывание нативного пептида Sur93-101 с низкой аффинностью, высокую аффинность модифицированного пептида Sur93T2 и отсутствие связывания у пептида Sur49-58 по сравнению с положительным контролемSur93-101 с тирозином (Y) на С-конце, однако, это не улучшило связывающую аффинность с HLA-A1 какого-либо из этих пептидов (данные не показаны). Ответ рестриктированного по HLA-A1 CTL на пептиды, производные сурвивина, у пациентов,страдающих раком.PBL шести пациентов с меланомой и TIL трех пациентов с меланомой проанализировали на присутствие CTL, специфического к какому-либо из четырех пептидов, производных сурвивина, с высокой аффинностью - Sur38Y9, Sur47Y10, Sur92-101, и Sur93T2, посредством ELISPOT анализа. Активность Тклеток на по меньшей мере один из пептидов, производных сурвивина, наблюдалась в трех образцахPBL, и в одном образце TIL из общего количества образцов девяти обследованных пациентов. Как видно из фиг. 11, PBL одного пациента, Mel.A1-3, выполнял главную роль при Т-клеточном ответе на все четыре пептида, Sur38Y9, Sur47Y10, Sur92-101 и Sur93T2. MelbA1-2 показал ответы на Sur47Y10, Sur92-101 иSur93T2, тогда как у Mel.A1-1/TIL и Mel.А 1-4/PBL наблюдались ответы на Sur47Y10 и Sur93T2, соответственно (фиг. 11). Кроме того, 10 пациентов с меланомой обследовали на иммунную активность к нативным пептидамSur93-101, Sur38-46 и Sur47-56 посредством ELISPOT анализа; однако у всех этих пациентов не обнаружили пептид-специфические ответы (данные не показаны). Идентификация эпитопа сурвивина, рестриктированного по HLA-A11 Связывание пептидов, производных сурвивина, с HLA-A11 Аминокислотная последовательность белка сурвивина изучалась на предмет наличия 9-мерных или 10-мерных пептидов со связывающими мотивами, соответствующими данному суперсемейству HLA-A3,включая HLA-A3 и HLA-А 11. Пептидные последовательности с основными якорными остатками, лейцин (L) в положении 2 и лизин (К) на С-конце, выбрали вместе с пептидными последовательностями,имеющими соответственные аминокислоты в этих положениях согласно прогнозирующему алгоритмуRammensee и др. (табл. 4). Тринадцать пептидов были предсказаны в последовательности белка сурвивина и проанализированы на связывание с HLA-A11 и HLA-A3. Три из этих пептидов, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID No: 47), Sur54-62 (LAQCFFCFK) (SEQ ID No: 42) и Sur112-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID No: 44), связывалиHLA-A11 с высокой аффинностью, сопоставимой с аффинностью вирусного эпитопа ядерного антигена 4 (AVFDRKSDAK) (SEQ ID No: 63) EBV. Кроме того, один пептид, Sur112-121 (KIAKETNNKK) (SEQ IDPBL пяти пациентов с меланомой и двух пациентов с CLL протестировали на Т-клеточную активность к четырем связывающимся с HLA-A11 пептидам - Sur53-62, Sur54-62, Sur112-120 и Sur112-121. Обнаружили ответы на пептид Sur53-62, производный сурвивина, у PBL двоих пациентов с меланомой,Меl.А 11-1, Ме 1.А 11-2, посредством ELISPOT анализа (фиг. 12). К тому же, обнаружили Sur53-62 специфические Т-клетки среди лимфоцитов в инфильтрующей опухоли (TIL) из инфильтрующей опухоли лимфатических узлов у пациента Меl.А 11-2 (фиг. 12). У пациента Меl.А 11-1 наблюдался мощный иммунный ответ на пептид сурвивина Sur53-62 в пяти различных образцах крови, взятых в течение двух лет(данные не показаны). Идентификация эпитопа сурвивина, рестриктированного по HLA-A3 Связывание пептидов, производных сурвивина, с HLA-A3 Пептиды, производные сурвивина, предположительно связывающиеся с суперсемейством HLA-A3,дополнительно проанализировали на связывание с HLA-A3. Только два из этих пептидов, Sur112-120(KIAKETNNK) (SEQ ID No: 44) и Sur112-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID No: 57), связывали HLA-A3 с высокой аффинностью, подобной аффинности вирусного эпитопа, нуклеопротеина 265-273 Гриппа ANo: 47) и Sur95-103 (ELTLGEFLK) (SEQ ID No: 43), слабо связывались с HLA-A3. Некоторые из пептидов, у которых обнаружили связывание, были модифицированы для усиления аффинности связывания с HLA-A3. Таким образом, синтезировали два аналоговых пептида, Sur54-62 иSur113-122, у которых лучший якорный лейциновый остаток (L) заменил нативный аланин (А) в положении 2. Sur54L2 (LLQCFFCFK) (SEQ ID No: 56) связывал HLA-A3 с высокой аффинностью, тогда какSur113L2 (ILKETNNKKK) (SEQ ID No: 59) связывался слабо (табл. 4). Кроме того, синтезировали четыре аналоговых пептида, Sur5-13, Sur13-22, Sur18-27 и Sur53-61, у которых лучший якорный остаток лизин (К) заменил естественный фенилаланин (F) на С-конце. Sur5K9 (TLPPAWQPK) (SEQ ID No: 54) иSur18K10 (RISTFKNWPK) (SEQ ID No: 58) связывался с HLA-A3 при высокой аффинности, тогда как замещения ощутимо не повлияли на связывание Sur13K9 (FLKDHRISTK) (SEQ ID No: 57) и Sur53K9(DLAQCFFCK) (SEQ ID No: 55) с HLA-A3 по сравнению с нативными аналогами. Ответы CTL, рестриктированных по HLA-A3, на пептиды, производные сурвивина, у пациентов,страдающих раком Девять образцов пациентов с меланомой (пять PBL и четыре TIL) проанализировали на предмет иммунной активности на два нативных пептида с высокой аффинностью к HLA-A3 - Sur112-120 иSur112-121, а так же два нативных пептида Sur53-62 и Sur95-103 со слабым связыванием. Однако ни у одного из пациентов не обнаружили иммунные ответы на эти пептиды ELISPOT анализом. Впоследствии, тех же пациентов обследовали на спонтанную иммунную активность на три высоко аффинных модифицированных пептидов, производных сурвивина, Sur5K9, Sur18K10 и Sur54L2. В образцах TIL трех пациентов, Mel.A3-l, Mel.A3-2, Mel.A3-3, обнаружили активность CTL на Sur18K10 (фиг. 13). Ответы на два других пептида, Sur5K9 и Sur54L2, не обнаружили. Для дальнейшей проверки этих ответов на активность CTL реактивности к Sur18K10 проанализировали PBL еще восемнадцати пациентов с меланомой. Среди них обнаружили трое пациентов с ответами, Меl.А 3-4, Меl.А 3-5 и Меl.А 3-6, в результате найдены всего шесть пациентов с ответами среди двадцати семи обследованных (фиг. 13). Идентификация нового рестриктированного по HLA-A2 эпитопа сурвивина Связывание 11-мерных пептидов, производных сурвивина, с HLA-A2 Аминокислотную последовательность белка сурвивина обследовали на предмет высокой вероятности HLA-A2 11-мерных пептидных эпитопов, используя основные HLA-A2 специфические якорные остатки. Синтезировали и исследовали на связывание с HLA-A2 шесть пептидов, производных сурвивина.- 26008026 Ни один из исследованных пептидов не связывался с такой же высокой аффинностью как у известного эпитопа BMLF280-288 пептида (GLCTLVAML) (SEQ ID No: 72) вируса Эпштейна-Барра (табл. 4), который служил положительным контролем. Концентрация пептида, необходимая для связывания половины из возможного максимального количества молекул HLA-А 2 (значение С 50), составила в положительном контроле 0,9 М. Для сравнения, пептиды Sur18-28 (RISTFKNWPFL) (SEQ ID No: 67) и Sur86-96(FLSVKKQFEEL) (SEQ ID No: 69) слабо связывались с HLA-A2 (C50=69 и 72 М, соответственно). Однако два известных, рестриктированных по HLA-A2 эпитопа сурвивина связывались также слабо с HLAA2; Sur95-104 (ELTLGEFLKL) (SEQ ID No: 43) связывался с промежуточной аффинностью (С 50=10 М),тогда как Sur96-104 (LTLGEFLKL) (SEQ ID No: 10) связывался слабо (С 50100 М). Остальные четыре исследуемые 11-мерные пептиды (Sur4-14 (PTLPPAWQPFL) (SEQ ID No: 66), Sur54-64 (LAQCFFCFKEL)PBL десяти пациентов, страдающих раком (двое - меланомой (Mel), шесть - CLL (CLL) и двое - раком молочной железы (МС были изначально обследованы на предмет связывания с HLA-A2 слабо связывающихся пептидов Sur18-28 и Sur86-96 и распознавания их иммунной системой больных раком. ВPBL двух из десяти обследованных пациентов (CLL-1, CLL-2, фиг. 14) обнаружили CTL ответы на Sur1828, тогда как ответы на Sur86-96 не наблюдались (данные не показаны). Для дальнейшей проверки этихSur18-28 специфических ответов, проанализировали PBL еще двенадцати пациентов (семи с меланомой,одного с CLL и четырех с раком молочной железы) на предмет CTL активности на этот пептид. Среди них четыре пациента (CLL-3, МС-1, МС-2, Меl.А 2-1) имели Sur 18-28 специфическую иммунную активность, определяемую ELISPOT анализом (фиг. 14). Таким образом, в целом, PBL шести из двадцати двух обследованных пациентов проявляли CTL ответ на Sur18-28. Идентификация рестриктированного по HLA-B7 эпитопа сурвивина Связывание пептидов, производных сурвивина, с HLA-B7 Обследовали аминокислотную последовательность белка сурвивина на предмет пептидов с 9-10 аминокислотами, с якорными остатками согласно связывающему пептидному мотиву HLA-B7. Выбрали и анализом структурных связей изучили пять пептидов на способность стабилизировать HLA-B7. Для каждого пептида значение С 50 оценивали как концентрацию пептида, необходимую для стабилизации половины максимального количества молекул HLA-B7 (табл. 4). Два пептида, производных сурвивина,Sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID No: 18) и Sur11-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID No: 19), слабо стабилизировали HLA-B7 с С 50 около 100 М; тогда как Sur46-54 (CPTENEPDL) (SEQ ID No: 6), Sur51-59HLA-B7 положительный PBL пяти пациентов с меланомой (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), двух пациентов с CLL (CLL1, CLL54), и двух пациентов с раком молочной железы (breast11, breast15) протестировали на Т-клеточную активность на слабо связывающиеся с HLA-B7 пептиды Sur6-14(LPPAWQPFL) (SEQ ID No: 18) и Sur11-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID No: 19). Обнаружили мощный спонтанный CTL ответ на пептид Sur6-14, производный сурвивина, в PBL у пациента с CLL и у пациента с раком молочной железы (фиг. 15). Дополнительно, обнаружили слабый ответ на этот пептид у пациента с меланомой - mеl3 (фиг. 15). Резюме аллель-рестриктированных по HLA иммунных ответов на пептиды, производные сурвивина, у пациентов, страдающих раком Ряд пептидов, производных сурвивина, включающих 9-11 аминокислотных остатков, протестировали на связывание со следующими HLA аллелями: HLA-A1, HLA-A3, HLA-A11 и HLA-B7 с помощью анализа структурных связей для связывания пептидов, описанных в предыдущих примерах, с молекулами МНС класса I. Кроме того, с помощью ELISPOT анализа протестировали некоторые из пептидов на их способность элиситировать CTL иммунный ответ, как описано выше. Итоговые результаты, включая результаты, полученные в предыдущих примерах, приведены ниже в табл. 4. Таблица 4. С 50 и данные ELISPOT анализа для выбора пептидов, производных сурвивина