Способ стереоселективного ферментативного гидролиза эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты

СПОСОБ СТЕРЕОСЕЛЕКТИВНОГО ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА ЭФИРА 5 МЕТИЛ-3-НИТРОМЕТИЛГЕКСАНОВОЙ КИСЛОТЫ Данное изобретение относится к способам получения эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты и ее солей. Также описаны способы получения соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты и способ получения 3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты. Также описаны (S)-5-метил-3-нитрометилгексановая кислота или (R)-5-метил-3-нитрометилгексановая кислота в энантионасыщенной или энантиочистой форме, а также их соли, эфир (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты или эфир (R)-5 метил-3-нитрометилгексановой кислоты в энантионасыщенной или энантиочистой форме и соединение, а именно соединение формулы (XIII), в рацемической форме, энантионасыщенной или энантиочистой форме. Альберт Мартин, Зерек Фердинанд, Бергер Андреас, Риезорст Ваандер, Шваб Хельмут,Лушниг Дэниел, Ремлер Питер, Салченеггер Джоерг, Осл Дорис, Де Соуза Доминик (AT) Область изобретения Изобретение относится к способу стереоселективного ферментативного гидролиза эфира 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты. Также описаны способ получения эфира 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты, а также способы получения соли 5-метил-3-нитрометилгексановой и 3(аминометил)-5-метилгексановой кислоты. Кроме того, описаны (S)-5-метил-3-нитрометилгексановая кислота в энантионасыщенной форме или энантиочистой форме или (R)-5-метил-3 нитрометилгексановая кислота в энантионасыщенной форме или энантиочистой форме и их соли, эфир(S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты в энантионасыщенной форме или энантиочистой форме или эфир (R)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты в энантионасыщенной форме или энантиочистой форме и соединение, а именно в рацемической форме, энантионасыщенной форме или энантиочистой форме. Уровень техники(S)-3-(аминометил)-5-метилгексановая кислота (прегабалин, соединение (I); фиг. 1) была в первый раз описана в ЕР-А-641330 и в настоящее время присутствует на рынке под торговым названием Lyrica в качестве агента для протиконвульсивной терапии. В ЕР-А-641330 описан путь синтеза этого соединения. Однако описанный способ получения этого соединения является продолжительным (более 10 стадий), имеет низкую эффективность и использует самовоспламеняющиеся или дорогостоящие реагенты,такие как соответственно бутиллитий и (+)-4-метил-5-фенил-2-оксазолидинон, что ограничивает его применение на промышленном уровне. Фиг. 1. Структура прегабалина (I). В работе Hoekstra M.S. et al., Org. Proc.Res. Dev. 1997, 1, 26-38 описаны некоторые методики получения прегабалина. Два способа, которые имеют особый экономический интерес, описаны в ЕР-А 828704 и ЕР-А-830338 соответственно. В патентной заявке '704 3-изобутилглутаровая кислота, полученная с использованием изовалеральдегида и этилцианоацетата, служит в качестве ключевого промежуточного соединения, которое трансформируют через соответствующий циклический ангидрид в амид,который может быть расщеплен классическим способом с помощью энантиочистого фенилэтиламина в качестве расщепляющего агента (схема 1). Амид затем подвергают реакции деградации Гоффмана, что приводит к получению (S)-прегабалина. Улучшение и вариации способа были описаны в Схема 1. Синтез прегабалина (I) в соответствии с ЕР-А-828704. В ЕР-А-830338 получают рацемическую 3-(аминометил)-5-метилгексановую кислоту и рацемат расщепляют с помощью (S)-миндальной кислоты в качестве хирального расщепляющего агента. Рацемический исходный материал получают в пять стадий из изовалеральдегида и диэтилмалоната. Расщепление рацемата на последней стадии делает синтез дорогостоящим, а неэффективным - из-за необходимости удалять нежелательный изомер на протяжении всего процесса (схема 2). Вариация этого процесса с расщеплением рацемата до восстановления циано-группы описана в WO 2007/143152. Оба процессы имеют недостатки, такие как длительный синтез и низкий общий выход. Схема 2. Синтез прегабалина (I) в соответствии с ЕР-А-830338. Асимметрический синтез промежуточного соединения, который ведет к получению прегабалина,включает гомогенное каталитическое гидрирование с хиральными лигандами на основе фосфина, описан в WO 2001/55090 и WO 2005/087370. Исходный материал получают в три стадии, которые включают применение окиси углерода, являющейся опасным реагентом, и Pd, являющегося дорогостоящим катализатором. Схема 3. Синтез прегабалина (I) в соответствии с WO 2001/55090 и WO 2005/087370. В WO 2006/110783 была описана конверсия хирального диалкилового эфира 2-(3-метил-1 нитрометилбутил)малоновой кислоты в прегабалин с использованием стратегии восстановлениядекарбоксилирования. Последовательность реакций аналогична последовательности реакций, которую применяют для синтеза, например, баклофена (Ooi, Т.; Fujioka, S.; Maruoka, K. J. Am. Chem. Soc., 2005,127, 119-125). Процессы очистки, которые ведут к получению прегабалина, не содержащего некоторых сопутствующих включений, описаны в WO 2006/122255 и WO 2006/121557. Во всех вышеописанных способах применяют хиральные вспомогательные агенты, катализаторы или добавки. Такие соединения обычно сложно удалять и поэтому они присутствуют в конечном продукте в нежелательных количествах. Ферментативные кинетические расщепления двух нитрилсодержащих прегабалиновых предшественников (соединения (II) и (III); фиг. 2) описаны в WO 2005/100580 и WO 2006/00904. В этих двух способах описаны синтезы прегабалина, недостатком которых является использование цианида натрия, что не позволяет использование указанных способов в промышленных масштабах из-за необходимости соблюдения мер безопасности, связанных с высокотоксичным компонентом. В WO 2007/143113 описано ферментативное кинетическое расщепление через гидролиз или этерификацию четырех субстратов IV) и (V); R = Н и Et соответственно). Однако не приводятся экспериментальные данные, касающиеся селективности и выхода продуктов. Фиг. 2. Структуры соединений, которые были подвергнуты ферментативному расщеплению. Синтез рацемического прегабалина описан в Andruszkiewicz, R.; Silverman, R.В., Synthesis, 1989,953-955. Синтез начинается с этилового эфира (E)-5-метил-гекс-2-еновой кислоты, который превращают в этиловый эфир 5-метилнитрометилгексановой кислоты путем конъюгированного добавления нитрометана. Это соединение превращают в рацемический прегабалин путем каталитического гидрирования с последующим омылением. Схема 4. Синтез рацемического прегабалина (I) по способу Andruszkiewicz et al. Недавно был описан ферментативный гидролиз этилового эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты, полученного, как описано в Andruszkiewicz et al. (Felluga, F. et al. Tetrahedron Assymetry 2008,19, 945-955, опубл. online 6 мая 2008 г.). В описанном способе используют конкретный фермент: Novozyme 435, который приводит к получению энантиомерно насыщенной (S)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты и энантиомерно насыщенного этилового эфира (R)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты. Хорошая селективность может быть достигнута лишь при конверсии ниже 30% или выше 60% соответственно, что значительно сокращает выход продуктов. Для получения прегабалина конверсию следует останавливать при значении менее 30%, чтобы получить (S)-5-метил-3 нитрометилгексановую кислоту качества, требуемого для последующего трансформирования ее в прегабалин. Более высокая конверсия неизбежно приведет к образованию побочных продуктов из-за того, что имеют место реакции Нефа. Хотя существуют несколько способов синтеза прегабалина, есть насущная потребность в дальнейших улучшениях условий применения реагентов, вредных для окружающей среды, снижении количества выделяемых промежуточных соединений и повышении общего выхода. Особенно интересными являются ферментативные методы, которые обеспечивают синтез (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты с выходом более 30%. Кроме того, особенно желательными является ферменты, которые обеспечивают синтез эфиров (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты путем гидролиза соответствующего эфира(R)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты. Кроме того, особенно желательными является способы, в которых не применяются хиральные вспомогательные агенты или хиральные добавки, которые могут представлять собой вредные примеси в конечном продукте. Сущность изобретения Описаны способы получения эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты и ее солей. Кроме того, описаны способы получения соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты и получения 3(аминометил)-5-метилгексановой кислоты. Также описаны (S)-5-метил-3-нитрометилгексановая кислота или (R)-5-метил-3-нитрометилгексановая кислота в энантионасыщенной форме или энантиочистой форме и ее соли, эфир (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты или эфир (R)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты в энантионасыщенной форме или энантиочистой форме и соединение, а именно в рацемической форме, энантионасыщенной форме или энантиочистой форме. Подробное описание изобретения Стереоселективный ферментативный гидролиз эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты(VIII) можно проводить путем взаимодействия рацемического эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) с ферментом для получения (S)- или (R)-энантиомера эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) и соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты, которая имеет другую стереоконфигурацию. В вышеприведенной формуле R1 может представлять собой алкильную, арильную или арилалкильную группу. "Алкильная" группа может представлять собой моновалентную насыщенную углеводородную группу, которая может быть с прямой или разветвленной цепью или может включать циклические группы. Предпочтительно R1 представляет собой группу с прямой или разветвленной цепью. Хотя алкильная группа может необязательно включать один или более гетероатомов N, О, S в своем углеродном скелете, это не является лучшим вариантом. Алкильная группа может быть необязательно замещенной,например, галогеном, гидрокси-, C1-6-алкокси- или C1-10-арильной группами. Предпочтительными примерами алкильной группы являются углеводородные группы, которые имеют от 1 до 8 атомов углерода,-3 019285"Арильная" группа может представлять собой моновалентный ароматический углеводород, который может необязательно включать в своем кольце один или более гетероатомов N, О или S. Арильная группа может быть необязательно замещенной, например, галогеном, гидрокси-, C1-6-алкоксигруппами. Предпочтительно арильная группа содержит от 6 до 10 атомов углерода. Примерами предпочтительных арильных групп яаляются фенильная, нафтильная и фенатренильная группы."Арилалкильные" группы представляют собой группы, которые состоят из ковалентно связанных арильных и алкильных групп, где алкильная группа присоединена к остальной молекуле. Арильный и алкильный остатки арилалкильной группы являются такими, как определены выше. Предпочтительно арилалкильная группа представляет собой бензил или замещенный бензил, такой как C1-4-акилбензил. Из указанных выше R1 групп особое преимущество имеет этил. В стереоселективном ферментативном гидролизе рацемический эфир 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (VIII) контактирует с ферментом. Продукты реакции будут отличаться в зависимости от выбранного фермента. В одном способе рацемический эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) можно превратить в смесь эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(VIII) и соли (R)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты R-(IX). В другом способе рацемический эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) можно превратить в смесь эфира (R)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты R-(VIII) и соли (S)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты S-(IX). Катион М+ соли может представлять собой любой пригодный катион, такой как катион щелочного или щелочно-земельного металла. Его можно легко определить по условиям протекания реакции, и он будет, в частности, соответствовать катиону обычно используемого основания. Для определения фермента, пригодного для стереоселективного ферментативного гидролиза рацемического эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII), можно использовать разные способы скрининга. Пригодные ферменты можно определить путем скрининга доступных ферментов, например используя методики скрининга с высокой пропускной способностью или используя методики обогащенного выделения. В таких методиках обогащенного выделения углерод-ограниченная или азотограниченная среда могут быть дополнены субстратом обогащения, который обычно представляет собой рацемический эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII). Пригодные микроорганизмы можно определить с помощью аналогичной методики, в которой рассчитывают их способность расти на среде, содержащей субстрат обогащения. После этой процедуры предварительного отбора микроорганизмы,которые показали наилучшие результаты, можно идентифицировать путем контактирования суспензий этих микроорганизмов с рацемическим эфиром 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) и определения тех микроорганизмов, которые обеспечивают наивысший выход желательных продуктов реакции - эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(VIII) и соли (R)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты R-(IX) или эфира (R)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты R-(VIII) и соли (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(IX) соответственно. Свойства ферментов и микроорганизмов, которые были определены как эффективные, можно еще дополнительно усилить с помощью ферментативного инжиниринга. Например, ферментный инжиниринг можно применить для улучшения скорости реакции, выхода и селективности реакции, в частности энантиоселективности. Кроме того, ферментный инжиниринг можно применить для расширения значений рН и температурных границ, при которых можно применять ферменты, а также их устойчивости к действию некоторых растворителей. Технологии ферментативного инжиниринга, которые можно применить,включают методы рационального дизайна, такие как сайт-направленный мутагенез и in vitroнаправленные технологии эволюции. Такие технологии описаны, например, в K.M. Koeller и С.-Н. Wong,"Enzymes for chemical synthesis", Nature, 409: 232-240 и в ссылках, приведенных там, которые включены путем ссылки. Фермент может быть использован в форме сырого лизата или в очищенной форме. Альтернативно,фермент может быть в форме целых микробных клеток, пермеабилизированных (с нарушенной проницаемостью мембраны) микробных клеток, экстрактов микробных клеток, частично очищенных ферментов, очищенных ферментов и т.п. Предпочтительно фермент используют в форме сырого лизата или лиофилизата. Альтернативно, фермент может быть иммобилизованным и использоваться как таковой. Методики иммобилизации известны специалисту в данной области. Пригодные твердые носители включают, например, полимерные матрицы, такие как альгинат кальция, полиакриламид, Eupergit и другие полимерные материалы, а также неорганические матрицы, такие как Celite. Методики с иммобилизацией являются оптимальными, потому что фермент и продукт можно легко разделить. Кроме того, иммобилизованный фермент можно рециркулировать и использовать повторно, что делает процесс более экономичным. Другие методики, в которых используют сшитые ферментные агрегаты (CLEAs) или сшитые ферментные кристаллы (CLECs), также могут быть использованы в данном изобретении. Конкретные ферменты, которые были определены как пригодные для использования в данном изобретении, включают липазы и эстеразы. Пригодные ферменты включают гидролазы, как определены классом 3 базы данных ENZYME (Bairoch A. The ENZYME database in 2000; Nucleic Acids Res 28:304-305(2000); см. также http:/us.expasy.org/enzyme/). Лучшими ферментами являются гидролазы, которые, как известно, действуют на эфирные связи (подкласс 3.1 базы данных ENZYME). В пределах этого подкласса предпочтительными являются ферменты, описанные как эстеразы и липазы. Примеры пригодных ферментов включают липазу В из Candida Antarctica, эстеразу из печени борова, липазу С из CandidaAntarctica, липазу А из Candida Antarctica и эстеразу из печени свиньи (ICR-123, BioCatalytics/Codexis). Все они дают более 50% конверсии рацемического эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты(VIII) в соль 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX) в реакции стереоселективного ферментативного гидролиза. Эти ферменты доступны от Сигма-Олдрич (Sigma-Aldrich) (St. Louis, МО), Флука (Fluka)(Buchs, Switzerland), Амано (Amano) (Nagoya, Japan), Ново Нордиск Novo Nordisk (Bagsvaerd, Denmark) или Технического университета Граца (Technical University of Graz). Используя эти ферменты, энантиомерный избыток (эи) оставшегося энантиомера эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) составлял менее 80% эи при конверсии 50%. Кроме того, эстераза EstB из Burkholderia gladioli (Wagner, U.G.; Petersen, E.I.; Schwab, H. Prof. Sci. 2002, 11, 467-478) и эстераза EstC из Burkholderia gladioli (Reiter, В.; Glieder, A.; Talker, D.; Schwab, H.Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000, 54, 778-785) также являются пригодными. EstB из Burkholderia gladioli преимущественно гидролизирует (R)-энантиомер эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты R(VIII), тогда как EstC из Burkholderia gladioli преимущественно гидролизирует (S)-энантиомер эфира 5 метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII). Эти эстеразы были предоставлены Техническим университетом Граца, Австрия (Technical University of Graz, Austria). Эстеразы EstB и EstC из Burkholderia gladioli могут быть подвергнуты рекомбинантной экспрессии на Е.coli, используя стандартные методы клонирования и экспрессии. Полученный клеточный осадок выделяют путем центрифугирования ферментативного бульона. Клетки можно разделить путем гомогенизации или любой другой технологии. Для дальнейшей работы гомогенизированные клетки можно подвергать действию флокулянтов, таких как Sedipur от ВТС (группа BASF). Дополнительно, сырой лизат можно концентрировать, используя ультрафильтрование до фактора 5-25. Этот концентрированный клеточный лизат можно использовать как таковой, лиофилизированным или использовать для любого типа иммобилизации. Процесс "даунстрим" (технология производства и выделения целевого продукта) эстеразы можно отслеживать, используя стандартный субстрат п-нитрофенилацетата для эстераз. Эстеразы катализируют гидролиз п-нитрофенилацетата в п-нитрофенол и уксусную кислоту. В этом тесте активность определяют путем измерения роста абсорбции п-нитрофенола (желтый, 404 нм) в зависимости от времени. Оставшийся энантиомерный избыток (эи) эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) или образованной соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX) при конверсии 50% составлял более 80% в любом случае. В зависимости от условий реакции (конверсия, температура, рН) могут быть достигнуты значения "эи" оставшегося эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) до 99%. Для целей данного изобретения термин "энантиочистый" означает энантиомерное соотношение R/S или S/R более 97,5/2,5, что соответствует значению "эи" более 95%. Для целей данного изобретения термин "энантиомерно насыщенный" означает энантиомерное соотношение R/S или S/R более 75/25, что соответствует значению "эи" более 50%. Могут быть использованы любые приемлемые условия для проведения стереоселективного ферментативного гидролиза. Они будут зависеть от выбранного фермента. Предпочтительно реакцию осуществляют таким способом, чтобы "эи" энантиомера оставшегося эфира 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (VIII) или "эи" образованной соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX) составляли 50% или более, предпочтительно 80% или более и более предпочтительно 90% или более. Стереоселективный ферментативный гидролиз можно проводить в водной системе, такой как раствор, суспензия или эмульсия. Реакционная смесь может содержать одну или множество фаз, например быть двух- или трехфазной системой. Примеры таких двух- или трехфазных систем описаны, например,на с. 30, строки 14-33 в WO 2006/000904. В предпочтительном варианте воплощения реакцию осуществляют в водном растворителе, таком как вода или смесь воды и органического растворителя, такого как этанол, который является смешивае-5 019285 мым с ней. Предпочтительным водным растворителем является вода. Поскольку эфир 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (VIII) является лишь слаборастворимым в воде, реакционная система обычно является гетерогенной. Неожиданно было обнаружено, что стереоселективность ферментативного гидролиза эфира 5 метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) можно с пользой усилить путем использования метанола в качестве сорастворителя в водной системе согласно данному изобретению. Ферментативный гидролиз,осуществленный ферментом EstC из Burkholderia gladioli в присутствии метанола, дал неожиданное повышение стереоселективности ферментативного гидролиза эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) и показал энантиомерный избыток (эи) оставшегося эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) до 98%; см. пример 8b. Результатом ферментативного гидролиза, осуществленного в отсутствии метанола, был энантиомерный избыток (эи) приблизительно 88% или менее; см. пример 8 а. Таким способом, в другом предпочтительном варианте стереоселективный ферментативный гидролиз осуществляют в водной системе, которая содержит метанол. Предпочтительно, когда водная система представляет собой водный раствор. Предпочтительно, когда метанол содержится в водной системе в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 5% (об./об.), предпочтительно в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 3,5% (об./об.), более предпочтительно в концентрации от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5% (об./об.), наиболее предпочтительно в концентрации приблизительно 2,5% (об./об.). Предпочтительно стереоселективный ферментативный гидролиз осуществляют в буферной смеси воды и метанола. В предпочтительном варианте фермент, который используют в комбинации с метанолом, представляет собой эстеразу EstC из Burkholderia gladioli или эстеразу, которая содержит аминокислотную последовательность, по крайней мере на 50% идентичную аминокислотной последовательности EstC изBurkholderia gladioli, предпочтительно идентичную по крайней мере на 60%, еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на 70%, еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на менее 75%,еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на 80%, еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на 90%, еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на 95%, еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на 97%, более предпочтительно идентичную по крайней мере на 99%, и наиболее предпочтительно полностью идентичную аминокислотной последовательности EstC изBurkholderia gladioli. Идентичность указанной аминокислотной последовательности определяют как степень идентичности между двумя последовательностями, которая показывает соответствие первой последовательности со второй. Идентичность можно элементарно определить с помощью компьютерной программы в этой области, такой как GAP, которая обеспечивается в программном пакете GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, С.D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). GAP используют с нижеприведенными настройками для сравнения полипептидной последовательности: корреляция на образование GAP составляет 3,0 и корреляция на расширение GAP составляет 0,1, зрелая часть аминокислотной последовательности эстеразы согласно изобретению показывает по крайней мере 50% степень идентичности аминокислотной последовательности EstC из Burkholderia gladioli, предпочтительно по крайней мере 60% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 70% идентичность,еще предпочтительнее по крайней мере менее 75% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 80% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 90% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 95% идентичность, более предпочтительно по крайней мере 97% идентичность, наиболее предпочтительно по крайней мере 99% идентичность аминокислотной последовательности EstC, полученной из Burkholderia gladioli, от позиции 1 до 298 (в нумерации BASBPN). Соответственно, идентичность будет определяться как количество идентичных остатков, разделенное на 298. Данное изобретение относится к способу стереоселективного ферментативного гидролиза хиральных эфиров, которые являются субстратами EstC из Burkholderia gladioli, в присутствии метанола, где хиральные эфиры имеют хиральный или прохиральный центр в кислотном остатке возле карбонильной группы. Предпочтительно хиральный центр находится в ,илиположении к атому углерода карбонильной группы, предпочтительно вилиположении. Кислотный остаток хирального эфира может быть C3-15-алкилом, линейным или разветвленным, необязательно замещенным одним или более -CN,-галогеном, -NO2, -N3, -ОН, -SH, -NH2, -NHR, -NR2, -OR или -SR, где R представляет собой C1-6-алкил илиC1-6-алканоил; C6-10-арил или замещенный арил, ненасыщенный или насыщенный гетероарил или замещенный гетероарил, который содержит один или более гетероатомов. Спиртовый остаток ROH может быть выбран из R = C1-6-линейного или разветвленного алкила; предпочтительно из МеОН, EtOH, 2-пропанола или бутанола; или C1-10-арила или замещенного арила. Стереоселективный ферментативный гидролиз хиральных эфиров в присутствии метанола можно проводить, используя EstC из Burkholderia gladioli или эстеразу, которая содержит аминокислотную последовательность, которая имеет по крайней мере 50% идентичность аминокислотной последовательности EstC, полученной из Burkholderia gladioli, предпочтительно по крайней мере 60% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 70% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 75% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 80% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 90% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 95% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 97% идентичность, более предпочтительно по крайней мере 99% идентичность, наиболее предпочтительно полную идентичность аминокислотной последовательности EstC изBurkholderia gladioli. Стереоселективный ферментативный гидролиз хиральных эфиров в присутствии метанола можно проводить в любых приемлемых условиях, как описано для процесса стереоселективного ферментативного гидролиза эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты. Стереоселективный ферментативный гидролиз можно проводить при любом приемлемом значении рН. Предпочтительно значение pH находится в пределах от приблизительно 5 до приблизительно 11,более предпочтительно от приблизительно 6 до приблизительно 9,5. Значение pH можно регулировать,например, добавлением основания, такого как неорганическое или органическое основание. Примерами органических оснований являются триэтиламин, диизопропилэтиламин, триоктиламин. Предпочтительно добавлять неорганическое основание, такое как гидроксид аммония щелочного или щелочно-земельного металла (например, NH4OH, NaOH, KOH, LiOH) или карбонат аммония щелочного или щелочноземельного металла (например, Na2CO3, K2CO3 или Li2CO3). Основание можно добавлять в растворе,предпочтительно в виде водного раствора. Концентрация этого раствора может варьироваться от насыщенной до высокой степени разведения (например, приблизительно 0,01 М). Предпочтительно концентрация основания варьируется от приблизительно 5 до приблизительно 10 М. При необходимости для регулирования pH реакционная среда может содержать буфер. Пригодные буферы включают фосфат аммония щелочного или щелочно-земельного металла (например, фосфат аммония, фосфат калия и фосфат натрия) или ацетат аммония щелочного или щелочно-земельного металла(например, ацетат аммония и ацетат кальция) или буферы с pKa от приблизительно 5 до приблизительно 10. Температура, при которой можно проводить стереоселективный ферментативный гидролиз, может варьироваться в широких пределах. Например, температура может варьироваться от приблизительно 0 до приблизительно 70C. В предпочтительном варианте температура реакции составляет от приблизительно 5 до приблизительно 30C. Для получения значительного избытка желательного энантиомера предпочтительно требуется остановить реакцию после достижения соответствующей конверсии. Если реакцию проводить до ее завершению, то будет получена соответствующая рацемическая соль 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты(IX). Наиболее пригодная степень конверсии будет зависеть от выбранного фермента и может быть определена специалистом в данной области. Если используют EstB из Burkholderia gladioli, реакцию предпочтительнее останавливать при конверсии от приблизительно 50 до приблизительно 70%. Более предпочтительно реакцию останавливать при конверсии от приблизительно 50 до приблизительно 55%. Реакцию можно остановить путем добавления органического растворителя. Предпочтительнее добавлять несмешивающийся с водой органический растворитель, такой как этилацетат. Реакцию можно также остановить с помощью стандартного метода, известного специалисту в данной области, такого как повышение температуры, добавление кислоты или основания и т.п. Если используют EstC из Burkholderia gladioli, реакцию предпочтительнее останавливать при конверсии от приблизительно 40 до приблизительно 50%. Более предпочтительно реакцию останавливать при конверсии от приблизительно 45 до приблизительно 50%. Реакцию можно остановить путем добавления органического растворителя. Предпочтительнее добавлять несмешивающийся с водой органический растворитель, такой как этилацетат. Если используют Candida Antarctica В, реакцию предпочтительнее останавливать при конверсии от приблизительно 40 до приблизительно 50%. Более предпочтительно реакцию останавливать при конверсии от приблизительно 45 до приблизительно 50%. Реакцию можно остановить путем добавления органического растворителя. Предпочтительнее добавлять несмешивающийся с водой органический растворитель, такой как этилацетат. Предпочтительно значение pH будет больше 7,4. Величину конверсии можно определить с помощью любого пригодного метода, такого как измерение количества используемого основания или с помощью ВЭЖХ. После или во время стереоселективного ферментативного гидролиза не вступивший в реакцию энантиомер эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) (например, эфир (S)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислотыS-(VIII и полученный энантиомер соли 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (IX) (например, соль (R)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты R(IX можно разделить, используя методики, известные специалисту в данной области. Например, не вступивший в реакцию энантиомер эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) можно удалить из реакционной смеси с помощью одной или более экстракций органическим растворителем, который не смешивается с водой, таким как этилацетат или гептан, таким образом, что полученный энантиомер соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX) остается в водном слое. Необязательно нежелательный энантиомер (например, в случае прегабалина - R-энантиомер) может быть подвергнут процессу рацемизации и возвращен в процесс стереоселективного ферментативного гидролиза. Хотя стереоселективный ферментативный гидролиз можно использовать в целом ряде процессов,он особенно хорошо подходит для приготовления энантионасыщенной или энантиочистой 3(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (I), в частности прегабалина. Схема 5 показывает полную реакционную схему получения (S)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (I), где используется заявленный стереоселективный ферментативный гидролиз (реакция (g. Как можно увидеть на реакционной схеме, исходный материал, рацемический эфир 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты рац-(VIII), можно получить различными путями синтеза. Кроме того, конечный продукт заявленной реакции, а именно желательный энантиомер эфира 5 метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII), можно подвергать дальнейшей переработке до получения желательного энантиомера 3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (I), используя различные пути синтеза. Эти реакции, которые приводятся для иллюстрации и не являются исчерпывающими, будут описаны дальше. Для простоты реакции базируются на одном или двух вариантах энантиомеров. Однако подразумевается, что схему реакции можно применить и к другому энантиомеру. Кроме того, хотя все промежуточные соединения показаны на схеме 5, подразумевается, что не все они должны быть выделены до того, как они будут дальше принимать участие в реакции. Схема 6. Общий вид реакций, которые обсуждаются в данном изобретении, используя (S)селективный фермент. Процессы, показанные на схемах 5 и 6, являются быстрыми, экономичными и простыми и обеспечивают получение прегабалина с высоким выходом и высокой оптической чистоты. Предпочтительно процесс включает стадии а) и b) для получения соединения (VIII). Один предпочтительный процесс получения соединения (I) включает стадии последовательного проведения реакций g), h), i) или g), j), k) соответственно. Дополнительным преимуществом является раннее разделение энантиомеров. В уровне техники, например в WO 2008/007145 или US-A-5637767, описаны процессы, в которых разделение энантиомеров происходит на стадии рацемического прегабалина. Одно главное преимущество данного изобретения заключается в том, что для последней стадии нужна лишь половина количества катализатора на основе дорогостоящего переходного металла, потому что нежелательный энантиомер отделяют на более ранней стадии и, таким образом, он не подвергается восстановлению. Преимуществом процесса является то, что для приготовления желательного энантиомера 3(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (I) не нужны хиральные дополнительные вещества. Такие вещества приводят к появлению примесей в конечном продукте. Для целей данного описания соединение считается рацемическим, если оно включает два возможных энантиомера в соотношении приблизительно 50:50. Соединение считается "в основном энантиочистым" или "энантионасыщенным", если оно содержит приблизительно 90% или более лишь одного энантиомера. Для целей данного описания соединение считается "энантиомерно чистым", если содержание одного энантиомера составляет приблизительно 95% или более, предпочтительно приблизительно 98% или более, более предпочтительно приблизительно 99% или более. Для целей данного описания соединение считается "в основном свободным" от примесей, если соответствующая примесь присутствует в количестве приблизительно 3% или менее, предпочтительно 1% или менее, более предпочтительно приблизительно 0,1% или менее. Реакция (а) В реакции (а) 3-метилбутиральдегид (VI) превращается в эфир 5-метилгекс-2-еновой кислоты (VII). Волнистая линия в формуле (VII) показывает, что двойная связь может иметь цис- или трансориентацию. Для этой реакции могут быть выбраны разные пути синтеза. В одном способе 3-метилбутиральдегид (VI) может быть подвергнут реакции Виттиг-Хорнера. Одна реакция такого типа, в частности, была раскрыта в патентной заявке WO 2003/062185, которая включена путем ссылки. Согласно этой заявке реакция Виттиг-Хорнера 3-метилбутиральдегида (VI) и пригодного фосфоната (RO)2P(=O)-CH2-COOR1 (где R представляет собой алифатическую C1-3-группу и R1 является таким, как определено выше) осуществляют в воде при определенной температуре в присутствии карбоната щелочного металла. Выход продукта, полученного согласно этому процессу, составляет приблизительно 90%. Недостатком процесса, описанного в WO 2003/062185, является использование такого довольно дорогого фосфоната, как C2-синтон. В альтернативном и предпочтительном варианте 3-метилбутиральдегид (VI) может вступать в реакцию с моноалкилмалонатом HOOC-CH2-COOR1 для получения эфира 5-метилгекс-2-еновой кислоты(VII). Реакцию можно проводить в присутствии растворителя или предпочтительнее без растворителя. При необходимости можно добавить каталитическое количество одного или более оснований. Например,в качестве первого основания можно использовать пиперидин в каталитических количествах (например,менее 0,05 экв. (эквивалента) по отношению к 1 экв. альдегида (VI, а пиридин может быть использован в качестве второго основания в количестве от приблизительно 1,0 до приблизительно 5,0 экв. по отношению к 1 экв. альдегида (VI). Реакцию обычно осуществляют при температуре от 50 до 100C. Другие условия для такой конверсии, которые также могут быть применены к данному изобретению, описаны в:Gazz. Chim. Ital. 1953, 53, 1043-1045; или J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 2601; или Tetrahedron 2006, 62, 476482. Эфир 5-метилгекс-2-еновой кислоты (VII) может быть выделен или подвергнут дальнейшей переработке без очистки. Предпочтительно эфир 5-метилгекс-2-еновой кислоты (VII) подвергают очистке путем экстракции кислотой до конверсии в эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII). Реакция (b). В этой реакции R1 является таким, как определено выше. Эфир 5-метилгекс-2-еновой кислоты (VII) можно превратить в эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) путем добавления нитрометана. Предпочтительно используют от приблизительно 1 до приблизительно 5 экв. нитрометана, CH3NO2,еще предпочтительнее от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5 экв. нитрометана по отношению к 1 экв. эфира 5-метилгекс-2-еновой кислоты (VII). Реакцию (b) можно проводить в присутствии растворителя или предпочтительнее без растворителя. Если используют растворитель, его можно выбрать из числа протонных или апротонных органических растворителей. Предпочтительными органическими растворителями являются CH2Cl2, ацетонитрил, этанол, метанол или тетрагидрофуран. Реакцию (b) можно проводить при разных температурах, например при температуре от приблизительно 0 до приблизительно 100C, предпочтительно при температуре от приблизительно 40 до приблизительно 60C. При необходимости реакцию (b) можно выборочно проводить в присутствии основания. Можно использовать любое пригодное основание, которое будет способно к продолжительному депротонированию кислотного протона нитрометильной группы. Основание может быть органическим основанием,таким как триалкиламин (где алкильная группа предпочтительно содержит от 1 до 4 атомов углерода),алкоксид (такой как метоксид натрия или трет-бутоксид натрия), сильные органические основания, такие как 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (ДБУ) или N,N,N',N'-тетраметилгуанидин (ТМГ), или неорганическим основанием, таким как карбонат аммония щелочного или щелочно-земельного металла, гидроксид аммония щелочного или щелочно-земельного металла или гидрокарбонат аммония щелочного или щелочно-земельного металла. Предпочтительно конверсию осуществляют в присутствии сильного органического основания, такого как 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ена (ДБУ) или N,N,N'N'тетраметилгуанидина (ТМГ). Количество основания не является конкретно ограниченным. Но его обычно прибавляют в субстехиометрических количествах. Например, используют от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 экв. основания по отношению к 1 экв. эфира 5-метилгекс-2-еновой кислоты (VII). Эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) в реакции (b) обычно получают с выходом,который превышает приблизительно 80%, более предпочтительно с выходом, который превышает приблизительно 90%. Реакция (с).(XI) путем реакции конденсации Кневенагеля с диалкилмалонатом R1OOC-CH2-COOR2. В этой реакцииR1 и R2 могут быть одинаковыми или разными и могут принимать значения, указанные для R1 выше. Предпочтительно реакцию (с) осуществляют в присутствии основания, такого как ди-н-пропиламин. Предпочтительно используют стехиометрическое количество или небольшой избыток диалкилмалоната(от приблизительно 1,0 до 1,5 экв.) по отношению к 1 экв. 3-метилбутиральдегида (VI). Также лучше использовать стехиометрическое или субстехиометрическое количество амина (приблизительно 1,0 экв. или менее) по отношению к 1 экв. 3-метилбутиральдегида (VI). Синтез диэфира (XI) 2-(3 метилбутилиден)малоновой кислоты с использованием реакции конденсации Кневенагеля, описанной,например, в ЕР-А-830338. При необходимости диэфир 2-(3-метилбутилиден)малоновой кислоты (XI), полученный в этой реакции, можно очистить с помощью методов, известных специалисту в данной области, прежде чем он будет вовлечен в дальнейшей реакции. Однако диэфир 2-(3-метилбутилиден)малоновой кислоты (XI) лучше использовать в дальнейшем процессе без очистки. Реакция (d). В этой реакции R1 и R2 являются такими, как определены выше. Диэфир 2-(3-метилбутилиден)малоновой кислоты (XI) может вступать в реакцию до эфира 5 метилгекс-2-еновой кислоты (VIII) путем декарбоксилирования. Декарбоксилирование предпочтительнее проводить при температуре в пределах от приблизительно 100 до приблизительно 180C в подходящем полярном апротонном растворителе (ДМСО или НМП). Необязательно можно добавлять соль (такую какNaCl или LiCl) для ускорения декарбоксилирования. Другие условия реакции, такие как разная температура, растворитель или добавки, также приемлемы. Примеры таких условий с использованием других субстратов описаны в Tetrahedron 1990, 46, 3929-3940. В этой реакции R1 и R2 являются такими, как определены выше. Диэфир 2-(3-метилбутилиден)малоновой кислоты (XI) можно конвертировать в диэфир 2-(3-метил 1-нитрометилбутил)малоновой кислоты (XII) путем добавления нитрометана. Предпочтительно используют от приблизительно 1 до приблизительно 5 экв. нитрометана, CH3NO2,еще предпочтительнее от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5 экв. нитрометана по отношению к 1 экв. диэфира 2-(3-метилбутилиден)малоновой кислоты (XI). Реакцию (е) можно проводить в присутствии растворителя или предпочтительнее без растворителя. Если используют растворитель, его можно выбрать из группы, которая включает любой протонный или апротонный органический растворитель. Предпочтительными органическими растворителями являютсяCH2Cl2, ацетонитрил, этанол, метанол или тетрагидрофуран. Реакцию (е) можно проводить при различных температурах, например при температуре от приблизительно 0 до приблизительно 100C, предпочтительно при температуре от 40 до приблизительно 60C. Реакцию (е) можно необязательно проводить в присутствии основания. Можно использовать любое пригодное основание, способное к депротонированию кислого протона нитрометана. Основание может быть органическим основанием, таким как триалкиламин (где алкильная группа предпочтительно содержит от 1 до 4 атомов углерода), алкоксид (такой как метоксид натрия или трет-бутоксид натрия), сильным органическим основанием, таким как 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен (ДБУ) или N,N,N',N'тетраметилгуанидин (ТМГ), или неорганическим основанием, таким как карбонат аммония щелочного или щелочно-земельного металла, гидроксид аммония щелочного или щелочно-земельного металла или гидрокарбонат аммония щелочного или щелочно-земельного металла. Предпочтительно конверсию осуществляют в присутствии сильного органического основания, такого как 1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец 7-ена (ДБУ) или N,N,N',N'-тетраметилгуанидина (ТМГ). Количество основания не является конкретно ограниченным. Но его обычно прибавляют в субстехиометрических количествах. Например, используют от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 экв. основания по отношению к 1 экв. диэфира 2-(3 метилбутилиден)малоновой кислоты (XI). Типичные условия добавления нитрометана, которые можно применить в реакции (е), описаны в J.Pharm. Bull. 1995, 43, 1125-1131. Выход реакции (е) обычно составляет более приблизительно 90%, предпочтительно более приблизительно 95%. Реакция (f). В этой реакции R1 и R2 являются такими, как определены выше. Диэфир 2-(3-метил-1-нитрометилбутил)малоновой кислоты (XII) можно превратить в эфир 5-метил 3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) путем декарбоксилирования. Декарбоксилирование предпочтительнее проводить при температуре в пределах от приблизительно 100 до приблизительно 200C в пригодном полярном апротонном растворителе (таком как ДМСО или ДМФ). Для увеличения выхода необязательно можно добавлять соль, такую как NaCl. Такая реакция описана, например, в WO 2006/110783. Реакция (g). Реакция (g) является одним из способов стереоселективного ферментативного гидролиза, описанного выше. Однако следует учитывать, что реакцию (g) можно также применять к другому энантиомеру. В стереоселективном ферментативном гидролизе рацемического эфира (VIII) 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты контактирует с ферментом. Продукты реакции будут различаться в зависимости от выбранного фермента. В одном способе рацемический эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) получают,используя реакции а) и b), описанные выше. В одном способе рацемический эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) превращают в смесь эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(VIII) и соль (R)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты R-(IX). В способе рацемический эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) превращают в смесь эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(VIII) и соль (R)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты R-(IX) путем ферментативного гидролиза при pH 8-14. В способе рацемический эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) превращают в смесь эфира(S)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты S-(IX). Катион М+ соли может представлять собой любой приемлемый катион, такой как катион щелочного или щелочно-земельного металла. Его обычно определяют по условиям, при которых осуществляют реакцию, и он будет, в частности, соответствовать катиону обычно используемого основания. Фермент можно использовать в форме сырого лизата или в очищенной форме. Альтернативно,фермент может быть в форме целых микробных клеток, пермеабилизированных микробных клеток, экстрактов микробных клеток, частично очищенных ферментов, очищенных ферментов и т.п. Предпочтительно фермент используют в форме сырого лизата или лиофилизата. Альтернативно, фермент может быть иммобилизованным и использоваться в таком виде. Методики иммобилизации известны специалисту в данной области. Пригодные твердые носители включают, например, полимерные матрицы, такие как альгинат кальция, полиакриламид, Eupergit и другие полимерные материалы, а также неорганические матрицы, такие как Celite. Методики с иммобилизацией являются предпочтительными, потому что фермент и продукт можно легко разделить. Кроме того, иммобилизованный фермент можно рециркулировать и использовать повторно, что делает процесс более экономичным. Другие методики, в которых используют сшитые ферментные агрегаты (CLEAs) или сшитые ферментные кристаллы (CLECs), также могут быть использованы в данном изобретении. Оставшийся энантиомерный избыток (эи) эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) или образованной соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX) при конверсии 50% был более 80% в любом случае. В зависимости от условий реакции (конверсия, температура, рН) могут быть достигнуты значения "эи" оставшегося эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) до 99%. Условия проведения стереоселективного ферментативного гидролиза будут обычно зависеть от выбранного фермента. Предпочтительно реакцию осуществляют так, чтобы "эи" оставшегося энантиомера эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) или "эи" образованной соли 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (IX) составляли 50% или более, предпочтительно 80% или более, более предпочтительно 90% или более. Стереоселективный ферментативный гидролиз можно проводить в водной системе, такой как раствор, суспензия или эмульсия. Реакционная смесь может содержать одну или множество фаз, и, например, быть двух- или трехфазной системой. Примеры таких двух- или трехфазных систем описаны, например, на с. 30, строки 14-33 в WO 2006/000904. В предпочтительном варианте реакцию осуществляют в водном растворителе, таком как вода или смесь воды и органического растворителя, такого как этанол, который является смешиваемым с ней. Лучшим водным растворителем является вода. Поскольку эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) является лишь слаборастворимым в воде, реакционная система является обычно гетерогенной. Как описано выше, стереоселективность ферментативного гидролиза эфира 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (VIII) можно с пользой усилить путем использования метанола в качестве сорастворителя в водной системе согласно данному изобретению. Таким образом, в другом предпочтительном варианте стереоселективный ферментативный гидролиз осуществляют в водной системе, содержащей метанол. Предпочтительно водная система представляет собой водный раствор. Предпочтительно метанол содержится в водной системе в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 5% (об./об.), более предпочтительно в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 3,5% (об./об.), еще более предпочтительно в концентрации от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5% (об./об.), наиболее предпочтительно в концентрации приблизительно 2,5% (об./об.). Предпочтительно стереоселективный ферментативный гидролиз осуществляют в буферной смеси воды и этанола. В предпочтительном варианте фермент, который используют в комбинации с метанолом согласно этому изобретению, представляет собой эстеразу EstC из Burkholderia gladioli или эстеразу, которая содержит аминокислотную последовательность, по крайней мере на 50% идентичную аминокислотной по- 12019285 следовательности EstC из Burkholderia gladioli, предпочтительно идентичную по крайней мере на 60%,еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на 70%, еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на менее 75%, еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на 80%, еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на 90%, еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на 95%, еще предпочтительнее идентичную по крайней мере на 97%,более предпочтительно идентичную по крайней мере на 99%, наиболее предпочтительно полностью идентичную аминокислотной последовательности EstC из Burkholderia gladioli. Идентичность указанной аминокислотной последовательности определяют как степень идентичности между двумя последовательностями, которая показывает соответствие первой последовательности со второй. Идентичность можно элементарно определить с помощью компьютерной программы в этой области, такой как GAP, которая обеспечивается в программном пакете GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin,USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). GAP используют с нижеприведенными настройками для сравнения полипептидной последовательности: корреляция на образование GAP составляет 3,0 и корреляция на расширение составляет GAP 0,1, зрелая часть аминокислотной последовательности эстеразы согласно изобретению показывает по крайней мере 50% степень идентичности аминокислотной последовательности EstC из Burkholderia gladioli, предпочтительно по крайней мере 60% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 70% идентичность,еще предпочтительнее по крайней мере менее 75% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 80% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 90% идентичность, еще предпочтительнее по крайней мере 95% идентичность, более предпочтительно по крайней мере 97% идентичность, наиболее предпочтительно по крайней мере 99% идентичность аминокислотной последовательности EstC, полученной из Burkholderia gladioli, от позиции 1 до 298 (в нумерации BASBPN). Соответственно, идентичность будет определяться как количество идентичных остатков, разделенное на 298. Стереоселективный ферментативный гидролиз можно проводить при любом пригодном значении рН. Предпочтительно выбирают, чтобы значение pH находилось в пределах от приблизительно 5 до приблизительно 11, более предпочтительно от приблизительно 6 до приблизительно 9,5. Значение pH можно регулировать, например, добавлением основания, такого как неорганическое или органическое основание. Примерами органических оснований являются триэтиламин, диизопропилэтиламин, триоктиламин. Предпочтительно добавляют неорганическое основание, такое как гидроксид аммония щелочного или щелочно-земельного металла (например, NH4OH, NaOH, KOH, LiOH) или карбонат аммония щелочного или щелочно-земельного металла (например, Na2CO3, K2CO3 или Li2CO3). Основание можно добавлять в растворе, предпочтительно в водном растворе. Концентрация этого раствора может варьироваться от насыщенной до сильноразбавленной (например, приблизительно 0,01 М; предпочтительно концентрация основания варьируется от приблизительно 5 до приблизительно 10 М). При необходимости реакционная среда может содержать буфер. Пригодные буферы включают фосфат аммония щелочного или щелочно-земельного металла (например, фосфат аммония, фосфат калия и фосфат натрия) или ацетат аммония щелочного или щелочно-земельного металла (например, ацетат аммония и ацетат кальция) или буферы с pKa от приблизительно 5 до приблизительно 10. Температура, при которой можно проводить стереоселективный ферментативный гидролиз, может варьироваться в широких пределах. Например, температура может варьироваться от приблизительно 0 до приблизительно 70C. В предпочтительном варианте температура реакции составляет от приблизительно 5 до приблизительно 30C. Для того чтобы получить значительный избыток желательного энантиомера, реакцию следует остановить после достижения соответствующей конверсии. Если реакцию проводить до ее завершения, то будет получена соответствующая рацемическая соль 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX). Наиболее пригодная степень конверсии будет зависеть от выбранного фермента и может быть определена специалистом в данной области. Если используют EstB из Burkholderia gladioli, реакцию предпочтительнее останавливать при конверсии от приблизительно 50 до приблизительно 60%. Более предпочтительно реакцию останавливать при конверсии от приблизительно 50 до приблизительно 55%. Реакцию можно остановить путем добавления органического растворителя. Предпочтительно добавлять несмешивающийся с водой органический растворитель, такой как этилацетат. Реакцию можно также остановить с помощью стандартного метода, известного специалисту в данной области, такого как повышение температуры, добавление кислоты или основания и т.п. Если используют EstC из Burkholderia gladioli, реакцию предпочтительно следует останавливать при конверсии от приблизительно 40 до приблизительно 50%. Более предпочтительно реакцию следует останавливать при конверсии от приблизительно 45 до приблизительно 50%. Реакцию можно остановить путем добавления органического растворителя. Предпочтительно добавлять несмешивающийся с водой органический растворитель, такой как этилацетат. Если используют Candida Antarctica В, реакцию предпочтительно следует останавливать при конверсии от приблизительно 40 до приблизительно 50%. Предпочтительно реакцию следует останавливать при конверсии от приблизительно 45 до приблизительно 50%. Реакцию можно остановить путем добавления органического растворителя. Предпочтительно добавлять несмешивающийся с водой органический растворитель, такой как этилацетат. Предпочтительно значение pH будет выше приблизительно 7,4. Величину конверсии можно определить с помощью любого пригодного метода, такого как измерение количества используемого основания или с помощью ВЭЖХ. После или во время стереоселективного ферментативного гидролиза не вступивший в реакцию энантиомер эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) (например, эфир (S)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислотыS-(VIII и полученный энантиомер соли 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (IX) (например, соль (R)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты R(IX можно разделить. Например, не вступивший в реакцию энантиомер эфира 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (VIII) можно удалить из реакционной смеси с помощью одной или более экстракций органическим растворителем, который не смешивается с водой, таким как этилацетат или гептан, таким образом полученный энантиомер соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX) остается в водном слое. Необязательно нежелательный энантиомер (например, в случае прегабалина - R-энантиомер) может быть подвергнут процессу рацемизации и возвращен в процесс стереоселективного ферментативного гидролиза. Хотя стереоселективный ферментативный гидролиз можно использовать в целом ряде процессов,он особенно хорошо подходит для получения энантионасыщенной или энантиочистой 3-(аминометил)-5 метилгексановой кислоты (I), в частности прегабалина. Реакция (h). Реакция (h) приводится для реакции (S)-энантиомера. Однако подразумевается, что все объяснения одинаково справедливы и для (R)-энантиомера. В этой реакции R1 и R2 являются такими, как определены выше. Катион М+ соли может представлять собой любой пригодный катион, такой как катион щелочного или щелочно-земельного металла. Его можно легко определить по условиям, при которых протекает реакция, и он будет, в частности, соответствовать катиону основания, которое обычно используют. Эфир (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(VIII) можно подвергать реакции с получением соответствующей соли (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(IX) путем щелочного гидролиза. Эту реакцию можно проводить, используя, например, водный раствор основания. Основания,пригодные для этой цели, включают, например, гидроксид щелочных или щелочно-земельных металлов,карбонат щелочных или щелочно-земельных металлов и оксид щелочных или щелочно-земельных металлов. Основание обычно используют в количестве, которое является избыточным к эфиру (S)-5-метил 3-нитрометилгексановой кислоты S-(VIII), предпочтительно количество основания составляет от приблизительно 2 до приблизительно 4 экв., более предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 2,2 экв. по отношению к 1 экв. эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(VIII). Реакцию можно проводить при любой приемлемой температуре. Например, она может быть в пределах от приблизительно 0 до приблизительно 50C, предпочтительно в пределах от приблизительно 20 до приблизительно 30C. Если температура реакции составляет менее приблизительно 20C, скорость реакции снижается. Выход реакции (h) обычно составляет приблизительно 90% или выше. Полученную соль (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(IX) можно выделить, например,удалением растворителя и кристаллизацией или ее можно подвергать дальнейшей переработке без очистки. Предпочтительно соль (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(IX) напрямую вступает в реакцию до образования (S)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (I) без предварительной очистки. Альтернативно, водный раствор соли (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(IX) можно промыть несмешивающимся с водой растворителем для удаления неполярных примесей перед реакцией(I). 5-Метил-3-нитрометилгексановая кислота в форме свободной кислоты подвержена необратимой перегруппировке, которая дает соединение формулы (XIII). Такая перегруппировка не происходит, если используют соответствующие соли, например соль 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX). Образование этого побочного продукта снижает выход реакции. Для подавления образования соединения (XIII) значение pH во время реакции (h) нужно поддерживать в пределах от приблизительно 8 до приблизительно 14, предпочтительно в пределах от приблизительно 9 до приблизительно 10. В результате контроля значения pH в вышеуказанных границах можно получить соль (S)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (IX), которая в основном не содержит соединение (XIII), которое можно подвергать дальнейшей трансформации до (S)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (I), которая не будет в основном содержать соединение (XIII). Реакция (i). Реакция (i) изложена относительно реакции (S)-энантиомера. Однако подразумевается, что все объяснения одинаково справедливы и для (R)-энантиомера. В этой реакции М является таким, как определено выше. Соль (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(IX) можно восстановить до (S)-3(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (I) (прегабалина) любым пригодным способом. Примеры пригодных способов включают, но не ограничиваются, каталитическое гидрирование с использованием газообразного водорода в присутствии пригодного катализатора на основе переходного металла, такого какPt, PtO2, Pd, Rh, Ru, Ni или Ni Ренея, необязательно на твердом носителе, таком как углерод, кремнезем или карбонат кальция; Zn, Sn или Fe в присутствии кислоты; сложные гидриды, такие как LiAlH4,AlH3/AlCl3, NaBH4 или NaBH4 в комбинации с солью; или гидрирование с каталитическим переносом с использованием донора водорода, такого как муравьиная кислота или ее соли, гидразина, 1,4 циклогексадиена, циклогексена, цис-декалина или силанов в присутствии катализатора на основе переходного металла, определенного выше; или сульфиды, такие как NaHS, Na2S, (NH4)2S, или полисульфиды. Предпочтительно восстановления осуществляют с газообразным водородом и никелевым катализатором Ренея. Для того чтобы избежать образования нежелательного соединения (XIII), значение pH во время реакции (i) также нужно поддерживать в пределах от приблизительно 8 до приблизительно 14, предпочтительно в пределах от приблизительно 9 до приблизительно 14. Смесь продуктов этой химической реакции редко представляет собой одно соединение с чистотой,достаточной для соответствия фармацевтическим стандартам. В смеси продуктов также присутствуют нежелательные продукты, побочные продукты и дополнительные реагенты, которые используются в реакции. На некоторых стадиях переработки АФИ (активные фармацевтические ингредиенты), такого как(S)-прегабалин, продукты реакции следует анализировать на чистоту, обычно с помощью анализов ВЭЖХ или ТСХ для того, чтобы убедить в целесообразности дальнейшей переработки и, в итоге, в его использовании в фармацевтическом продукте. Не требуется, чтобы АФИ был абсолютно чистым, поскольку абсолютная чистота является теоретическим идеалом, чего обычно достичь невозможно. Вместо этого, стандарты чистоты устанавливают с намерением гарантировать, что АФИ настолько свободный от примесей, насколько это возможно, и, таким образом, настолько безопасный для клинического применения, насколько это возможно. Как указано выше, национальные нормы рекомендуют, чтобы содержание некоторых примесей было ограничено до значений менее 0,1%. С использованием вышеописанных процессов побочные продукты, такие как соединение X, присутствуют в АФИ в количестве менее 0,1%. В реакции (j) применяются вышеприведенные определения R1. Эфир (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(VIII) можно подвергать реакции до соответствующего энантиомера лактама (X), используя разные методы. Восстановление рацемического эфира 5 метил-3-нитрометилгексановой кислоты рац-(VIII) до рацемической 3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты рац-(I) описано в Andruszkiewicz, R. Silverman, R.В. Synthesis 1989, 953-955. В этой публикации восстановление осуществляют, используя водород с Pd/C в качестве катализатора. Восстановление эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты S-(VIII) можно проводить, используя этот процесс. Однако также приемлемы и другие способы восстановления нитро-группы при других условиях. Примеры, но без ограничения, включают каталитическое гидрирование с использованием газообразного водорода в присутствии пригодного катализатора на основе переходного металла,такого как Pt, PtO2, Pd, Rh, Ru, Ni или Ni Ренея, необязательно на твердом носителе, таком как углерод,кремнезем или карбонат кальция; Zn, Sn или Fe в присутствии кислоты; сложные гидриды, такие как LiAlH4, AlH3/AlCl3, NaBH4 или NaBH4 в комбинации с солью; или гидрирование с каталитическим переносом с использованием донора водорода, такого как муравьиная кислота или ее соли, гидразина, 1,4 циклогексадиена, циклогексена, цис-декалина или силанов в присутствии катализатора на основе переходного металла, определенного выше; или сульфиды, такие как NaHS, Na2S, (NH4)2S или полисульфиды. Реакция (k). Реакция (k) изложена относительно реакции (S)-энантиомера. Однако подразумевается, что все объяснения одинаково справедливы и для (R)-энантиомера. Энантиомер лактама (X) можно гидролизировать до (S)-3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты S-(I), используя соответствующие условия реакции. В работе Andruszkiewicz, R.; Silverman, R.B. (Synthesis 1989, 953-955) для этой реакции можно использовать кипячение с обратным холодильником в 6 н. водной HCl на протяжении 3 ч. Однако также можно гидролизировать лактам X в присутствии основания, такого как водный NaOH. Реакция (m). Реакция (m) изложена относительно реакции (S)-энантиомера. Однако подразумевается, что все объяснения одинаково справедливы и для (R)-энантиомера. Вышеприведенные определения R1 также используются и в реакции (m). Другой способ, который приведен в WO 2008/007145, описывает восстановление рацемического эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) до рацемической 3-(аминометил)-5 метилгексановой кислоты (I). Восстановление трансформирует нитро-группу в амин и одновременно с восстановлением расщепляется бензиловый эфир. Соответствующую реакцию можно также применить к энантиомерной форме эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII). Выделение 3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (I). Независимо от того, как желательный энантиомер 3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты (I) был получен, его лучше выделить из реакционной смеси. Можно применить любой пригодный способ,как описано, например, в уровне техники (см., например, WO 2005/100580, WO 2006/00904, ЕР-А-828704 или ЕР-А-830338). Предпочтительно 3-(аминометил)-5-метилгексановую кислоту (I) выделяют путем кристаллизации из воды или воды в комбинации с органическим растворителем, таким как 2-пропанол. Нижеследующие примеры приводятся для иллюстрации данного изобретения. Они не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения, который исключительно определяется формулой изобретения, которая прилагается. Примеры Пример 1. Синтез диэтилового эфира 2-(3-метилбутилиден)малоновой кислоты (XI, R1 = R2 = этил). 3-Метилбутиральдегид (145,2 г; 1,69 моль, соединение VI) растворили в 400 мл гексана, добавили 9,6 г уксусной кислоты (0,16 моль) и 8,1 г ди-н-пропиламина (0,08 моль). К этому раствору добавили 256,3 г (1,60 моль) диэтилмалоната. Реакционную смесь нагревали до температуры дефлегмации. Постоянно удаляли воду, используя ловушку Дина-Старка, до того, как начали наблюдать полную конверсию исходного материала. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и промывали дважды 200 мл воды, один раз 160 мл 1 М водным NaOH и один раз 5% водным NH4Cl. Органический слой высушивали путем азеотропной дистилляции и растворитель удаляли при пониженном давлении для получения 374 г сырого диэтилового эфира 2-(3-метилбутилиден)малоновой кислоты (выход 97%; соединение XI, R1 = R2 = Et). Небольшую часть сырого продукта очищали с помощью вакуумной дистилляции(t, СН 3, 3H, J=7,0 Гц), 1,31 (m, CH, 1H), 2,18 (dd, CH2, 2H, J=8,1 Гц и 6,5 Гц), 4,22 (q, СН 2, 2 Н, J=7,0 Гц),4,29 (q, СН 2, 2 Н, J=7,0 Гц), 7,00 (t, CH, 1H, J=8,0 Гц). 13 С-ЯМР (CDCl3, 75,47 МГц)(ч./млн) = 14,3 (2 С); 22,5 (2 С); 28,3; 38,7; 61,3; 129,4; 148,5; 164,1; 165,8. Пример 2. Синтез диэтилового эфира 2-(3-метил-1-нитрометилбутил)малоновой кислоты (XII, R1 = этил). Диэтиловый эфир 2-(3-метилбутилиден)малоновой кислоты (30,0 г, 0,131 моль, соединение XII, R1= этил) растворяли в 35 мл нитрометана. Раствор охлаждали до 0C и добавляли на протяжении 30 мин 3,3 мл 1,1,3,3-тетраметилгуанидина (0,026 моль). Реакционную смесь перемешивали при 0C на протяжении 1 ч, а после этого на протяжении 4 ч при 25C. Анализ методом ГХ показал полную конверсию. Добавляли 40 мл 2 М водной HCl и после перемешивания на протяжении 5 мин слои разделяли (для ускорения разделения слоев добавляли 20 мл насыщенного водного NaCl). Водный слой дважды промывали 100 мл метил трет-бутилового эфира. Объединенные органические слои промывали 50 мл насыщенного водного NaHCO3 и 25 мл воды. Органическую фазу высушивали и после этого концентрировали при пониженном давлении для получения диэтилового эфира 2-(3-метил-1-нитрометилбутил)малоновой кислоты (XII, R1 = R2 = этил) в виде бледно-желтого масла (37,8 г, выход 99%).H-ЯМР (CDCl3, 300 МГц)(ч./млн) = 0,90 (d, СН 3, 3H, J=7,0 Гц), 0,91 (d, CH3, 3H, J=7,0 Гц), 1,26 (t,2 хСН 3, 6 Н, J=7,0 Гц), 1,63 (m, СН, 1H), 2,94 (m, СН, 1H), 3,60 (d, CH, 1H, J=5,7 Гц), 4,20 (q, 2 хСН 2, 4 Н,J=7,0 Гц), 4,50 (dd, СН 2, 1 Н, J=7,0 Гц и 14 Гц), 4,69 (dd, СН 2, 1H, J=5,0 Гц и 14 Гц),13 С-ЯМР (CDCl3, 75,47 МГц)(ч./млн) = 14,1 (2 С); 22,3; 22,4; 25,1; 34,9; 39,0; 52,8; 61,9; 62,0; 76,9; 167,9; 168,1. Пример 3. Синтез этилового эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = R2 = этил). 10,0 г (34 ммоль) диэтилового эфира 2-(3-метил-1-нитрометилбутил)малоновой кислоты (XII, R1 = этил) растворяли в 140 мл ДМСО. Добавляли воду (10,4 мл) и твердый NaCl (14,6 г) и смесь нагревали на протяжении 6 ч при 150C. После завершения конверсии реакционную смесь охлаждали до 25C и добавляли 150 мл метил трет-бутилового эфира. Медленно добавляли 100 мл воды. Гетерогенную смесь перемешивали на протяжении 5 мин перед разделением слоев. Водный слой промывали один раз 75 мл метил трет-бутилового эфира. Органические слои объединяли и промывали один раз 50 мл воды. Объединенные органические слои высушивали и летучие вещества удаляли при пониженном давлении для получения 7,0 г этилового эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил, выход 93%).(t, CH3, 3H, J=7,0 Гц), 1,52 (m, СН, 1 Н), 2,29 (d, СН 2, 2 Н J=6,6 Гц), 2,54 (m, СН, 1H), 4,01 (q, СН 2, 2 Н,J=7,2 Гц), 4,29 (dd, СН 2, 1 Н, J=5,7 Гц и 12,4 Гц), 4,36 (dd, CH2, 1H, J=6,8 Гц и 12,4 Гц). 13 С-ЯМР (CDCl3, 75,47 МГц)(ч./млн) = 14,2; 22,3; 22,6; 25,1; 36,1; 40,6; 60,8; 78,9; 171,6. Пример 4. Синтез этилового эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил). 5,0 г (21,9 ммоль) диэтилового эфира 2-(3-метилбутилиден)малоновой кислоты (соединение XI,R1 = R2 = Et) растворяли в 35 мл ДМСО. Добавляли 2,6 мл воды и 3,65 г NaCl. Гетерогенную смесь перемешивали на протяжении 7 ч при 150C для получения после фильтрации 55 г раствора этилового эфира 5-метил-гекс-2-еновой кислоты (VII, R1 = этил) в ДМСО. К раствору ,-ненасыщенного эфира (VII) в ДМСО добавляли 7,0 г нитрометана и 3,3 мл ДБУ(1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен). Реакционную смесь перемешивали до полной конверсии, как опре- 17019285 делено с помощью ГХ. Добавляли 20 мл CH2Cl2 и полученную смесь промывали 220 мл 1 М воднойH2SO4 и 120 мл 0,5 М водного NaHCO3. Органический слой высушивали и растворитель удаляли при пониженном давлении. Получили 3,6 г -нитроэфира (выход за две стадии: 75%).H-ЯМР (CDCl3, 300 МГц)(ч./млн) = 0,76 (d, СН 3, 3H, J=7,0 Гц), 0,80 (d, CH3, 3H, J=7,0 Гц), 1,12 (t,CH2, 2H, J=7,0 Гц), 1,13 (t, СН 3, 3H J=7,0 Гц), 1,52 (m, CH, 1H), 2,29 (d, СН 2, 2 Н J=6,6 Гц), 2,54 (m, СН,1H), 4,01 (q, СН 2, 2 Н, J=7,2 Гц), 4,29 (dd, СН 2, 1H, J=5,7 Гц и 12,4 Гц), 4,36 (dd, СН 2, 1H, J=6,8 Гц и 12,4 Гц). 13 С-ЯМР (CDCl3, 75,47 МГц)(ч./млн) = 14,2; 22,3; 22,6; 25,1; 36,1; 40,6; 60,8; 78,9; 171,6. Пример 5. Синтез этилового эфира 5-метилгекс-2-еновой кислоты (VII, R1 = этил). 3-Метилбутиральдегид (64 мл; 0,58 моль, соединение VI) добавляли к 115 г (0,87 моль) моноэтилмалоната в 165 мл (2,0 моль) пиридина. К этому раствору добавляли 0,15 мл (0,25 мол.%) пиперидина. Реакционную смесь нагревали до 80C и перемешивали при этой температуре на протяжении 90 мин. Анализ методом ГХ показал полный расход исходного материала. Добавляли метил трет-бутиловый эфир (200 мл) и органический слой промывали три раза 150 мл 2 М водной H2SO4, а после этого два раза 100 мл 0,5 М водного NaHCO3. Растворитель удаляли при пониженном давлении для получения 85,6 г в основном чистого ,ненасыщенного эфира (VII) (чистота, определенная с помощью ГХ, 99%; E/Z 6/1; выход 94%).H-ЯМР главного изомера (CDCl3, 300 МГц)(ч./млн) = 0,91 (d, 2xCH3, 6H, J=7,0 Гц), 1,27 (t, СН 3,3H, J=7,1 Гц), 1,73 (m, CH, 1H), 2,06 (bt, CH2, 2H, J=7,0 Гц), 4,16 (q, СН 2, 2 Н, 7,1 Гц), 5,78 (bd, СН, 1H,J=15,6 Гц), 6,92 (bt, CH, 1H, J=15,6 Гц, 7,7 Гц и 7,4 Гц). 13 С-ЯМР главного изомера (CDCl3, 75,47 МГц)(ч./млн) = 14,4; 22,4; 27,9; 41,6; 60,2; 122,4; 148,4; 166,8. Пример 6. Синтез этилового эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил). Этиловый эфир 5-метилгекс-2-еновой кислоты (VII, R1 = этил) (123,9 г; 0,79 моль) растворяли в 112 мл (1,98 моль) нитрометана. К этому раствору добавляли 36 мл ДБУ (0,24 моль). Реакционную смесь нагревали до 60C и перемешивали при этой температуре на протяжении 150 мин. Анализ методом ГХ показал полный расход исходного материала. Добавляли метил трет-бутиловый эфир (100 мл) и органический слой промывали 200 мл 2 М водной HCl. Водный слой дважды экстрагировали 50 мл метил трет-бутилового эфира. Органические слои объединяли и промывали 50 мл насыщенного водного NaHCO3. Растворитель удаляли при пониженном давлении для получения 172,4 г в основном чистого -нитро эфира (VIII) (чистота, определенная с помощью ГХ, 97%; выход 98%).(t, СН 3, 3H, J=7,0 Гц), 1,52 (m, СН, 1H), 2,29 (d, СН 2, 2 Н, J=6,6 Гц), 2,54 (m, СН, 1 Н), 4,01 (q, СН 2, 2 Н,J=7,2 Гц), 4,29 (dd, СН 2, 1H, J=5,7 Гц и 12,4 Гц), 4,36 (dd, CH2, 1H, J=6,8 Гц и 12,4 Гц). 13 С-ЯМР (CDCl3, 75,47 МГц)(ч./млн) = 14,2; 22,3; 22,6; 25,1; 36,1; 40,6; 60,8; 78,9; 171,6. Пример 7. Синтез этилового эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил) и натриевой соли (R)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX). 100 г этилового эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил) добавили к водному раствору EstB (500 мл клеточного экстракта; 5 г общей концентрации протеинов). При температуре 25C pH поддерживали на уровне 7,0 путем непрерывного добавления 5 М водного NaOH. После 55% конверсии (соответствует потреблению 50,6 мл NaOH) реакцию остановили путем добавления 100 мл этилацетата. Добавляли 100 мл 5 М водного NaOH и слои разделяли. Водный слой один раз промывали 100 мл этилацетата. Объединенные органические слои концентрировали при пониженном давлении для получения 43 г этилового эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1= этил; эи = 98%). Пример 8. Синтез этилового эфира (R)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил) и натриевой соли (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX). 100 г этилового эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил) добавляли к водному раствору EstC (250 мл клеточного экстракта;10 г общей концентрации протеинов). При температуре от 5 до 10C pH поддерживали на уровне 9,0 путем непрерывного добавления 5 М водного NaOH. После 45% конверсии (соответствует потреблению 41,4 мл NaOH) реакцию остановили путем добавления 100 мл этилацетата. Добавляли 100 мл 5 М водного NaOH и слои разделяли. Водный слой один раз промывали 100 мл этилацетата. Объединенные водные слои фильтровали и концентрировали при пониженном давлении для получения приблизительно 200 мл раствора натриевой соли (S)-5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты в воде (эи = 92%). Пример 8 а. Синтез натриевой соли (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX). В химическом стакане в 10 мл буфера фосфата натрия (1 мМ, pH 7,2) растворяли/суспендировали 100 мг EstC (лиофилизированной). Значение pH упало до pH6,8, а после этого его установили на уровне pH 7,4 с помощью водного NaOH (0,1 М). Затем добавляли 200 мг этилового эфира 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил) и pH поддерживали на уровне 7,4 путем непрерывного добавления водного NaOH (0,1 М). После 45% конверсии (соответствует использованию 4,0 мл 0,1 МNaOH) реакцию остановили путем добавления 10 мл этилацетата. Слои разделяли и водный слой экстрагировали один раз 10 мл этилацетата. Затем водный слой концентрировали для получения соединения,указанного в названии, с эи 88%. Пример 8b. Синтез натриевой соли (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX). В химическом стакане в 10 мл буфера фосфата калия (1 мМ, pH 7,2) растворяли/суспендировали 100 мг EstC (лиофилизированной). Значение pH упало до pH6,8, а после этого его установили на уровне pH 7,4 с помощью водного NaOH (0,1 М). Затем добавляли 250 мкл метанола и 200 мг этилового эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил) и pH поддерживали на уровне 7,4 путем непрерывного добавления водного NaOH (0,1 М). После 45% конверсии (соответствует использованию 4,0 мл 0,1 М NaOH) реакцию остановили путем добавления 10 мл этилацетата. Слои разделяли и водный слой экстрагировали один раз 10 мл этилацетата. Затем водный слой концентрировали для получения соединения, указанного в названии, с эи 98%. Пример 9. Синтез (S)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты (I, прегабалина). 150 г этилового эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил; анализ: 97,2%) суспендировали в 300 мл Н 2 О. Добавили KOH (90,1 г; анализ: 2,05 экв.). Сначала мутная реакционная смесь стала прозрачной, что указывало на то, что реакция была близка к завершению. После завершения конверсии (определено с помощью ВЭЖХ) реакционную смесь переместили в реактор гидрирования. Добавили 90,0 г водной суспензии никелевого катализатора Ренея. При давлении водорода 12 бар и температуре 45C смесь перемешивали до полной конверсии, что определено с помощью ВЭЖХ,что дало 88,0 г прегабалина в водном растворе. Раствор фильтровали и после этого концентрировали до приблизительно 270 г при пониженном давлении и добавляли 400 мл 2-пропанола. При температуре 45C добавляли уксусную кислоту до pH 7,0. Прегабалин начал кристаллизоваться. После приблизительно 60 мин реакционную смесь охлаждали до 10C. Перемешивание продолжали на протяжении 1 ч, а после этого продукт выделили путем фильтрования. Остаток на фильтре промывали 90 мл смеси холодных H2O/2-пропанола в соотношении 1:1. После высушивания получили 75 г в основном чистого (чистота 99,6%) прегабалина (выход: 70%). Часть прегабалина перекристаллизовали, как описано в WO 2006/000904, для повышения чистоты от 99,6 до 99,9%. Аналитические данные соответствовали тем, которые приводятся в литературе. Пример 10. Синтез (S)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты (I, прегабалина). 150 г этилового эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил; анализ: 97,2%) суспендировали в 300 мл H2O. Добавили KOH (90,1 г; анализ: 86,1%, 2,05 экв.). Сначала мутная реакционная смесь стала прозрачной, что указывало на то, что реакция была близка к завершению. После завершения конверсии (определено с помощью ВЭЖХ) добавили NH4-формиат и Pd/C. Реакционную смесь перемешивали до того, как начали наблюдать завершение конверсии. Раствор фильтровали, а после этого концентрировали до приблизительно 250 г при пониженном давлении и добавили 400 мл 2 пропанола. При температуре 45C добавляли уксусную кислоту до достижения pH 7,0. Прегабалин начал кристаллизоваться. После приблизительно 60 мин реакционную смесь охлаждали до 10C. Перемешивание продолжали на протяжении 1 ч, а после этого продукт выделили путем фильтрования. Остаток на фильтре промывали 90 мл смеси холодных Н 2 О/2-пропанола в соотношении 1:1. После высушивания получили 65 г в основном чистого (чистота 97,9%) прегабалина (выход: 61%). Пример 11. Дикалиевая соль (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX - динатриевая соль). 830 мг этилового эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил) суспендировали в 0,8 мл Н 2 О. Добавили 900 мг 50% водного KOH. После 5 ч при 25C конверсия была завершена(определено с помощью ВЭЖХ). При пониженном давлении растворитель удалили для получения твердого остатка, который состоит из соединения, указанного в названии, и небольшого количества KOH. С-ЯМР (D2O, 75,47 МГц)(ч./млн) = 21,9; 22,8; 26,0; 33,9; 40,9; 41,6; 123,5; 181,7. Пример 12. Монокалиевая соль (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX - мононатриевая соль). 830 мг этилового эфира (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил) суспендировали в 0,8 мл H2O. Добавили 900 мг 50% водного KOH. После 5 ч при 25C конверсия была завершена(определено с помощью ВЭЖХ). Добавили 4,2 мл 1 М водной HCl и растворитель удалили при пониженном давлении для получения твердого остатка, который состоит из соединения, указанного в названии, и KCl. С-ЯМР (D2O, 75,47 МГц)(ч./млн) = 23,0; 23,3; 25,2; 32,5; 36,7; 41,0; 79,9; 173,8. Пример 13. Синтез (S)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты (I, прегабалина). Для восстановления с использованием никелевого катализатора Ренея 5,0 г этилового эфира (S)-5 метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил) растворили в 10 мл этанола и 0,4 мл воды и добавили 3,0 г водной суспензии никелевого катализатора Ренея. Реакционную смесь перемешивали при 40C под давлением 4 бар водорода. После завершения конверсии исходного материала реакционную смесь фильтровали и растворитель удаляли при пониженном давлении для получения 3,02 г сырого лактона X в виде маслянистого остатка, который кристаллизовался при хранении. 30 мл 6 н. водной HCl добавляли к сырому лактону и реакционную смесь нагревали до температуры дефлегмации. После 4 ч реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении для получения 4 г маслянистого остатка. Добавляли воду (5 мл) и значение pH установили на уровне 6 путем добавления 50% водного KOH. Смесь нагревали до 50C и медленно охлаждали до 10C. Образованные кристаллы удаляли фильтрацией. Концентрация маточного раствора дала возможность еще дополнительно собрать кристаллы с выходом 2,5 г прегабалина (72%). Пример 14. Синтез (S)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты (I, прегабалина). Этиловый эфир (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII, R1 = этил) (10,4 г) растворили в 160 мл МеОН. Добавили 4 г 10% Pd/C и 20 г формиата аммония. После нескольких минут наблюдали экзотермическую реакцию. После 30 мин анализ методом ВЭЖХ показал полную конверсию. Катализатор удалили фильтрацией. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении до объема приблизительно 20 мл. Добавили воду (20 мл) и раствор снова концентрировали при пониженном давлении до приблизительно 20 мл. Затем добавили 50 мл 6 н. водной HCl и смесь кипятили с обратным холодильником на протяжении 6 ч. После завершения конверсии реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении до объема приблизительно 20 мл. Добавляли воду (20 мл) и 2-пропанол (40 мл) и реакционную смесь нагревали при 45C. Добавляли KOH, пока не было достигнуто pH 7. Продукт начал кристаллизоваться. После 60 мин реакционную смесь охладили до 10C. Перемешивание продолжали на протяжении 1 ч, а после этого продукт выделили путем фильтрации. Остаток на фильтре промывали 90 мл смеси холодных Н 2 О/2-пропанола, взятых в соотношении 1:1. После высушивания получили 5,9 г в основном чистого (чистота 98,0%) прегабалина (выход: 81%). Часть прегабалина перекристаллизовали, как описано в WO 2006/000904, для повышения чистоты от 98,0 до 99,9%. Пример 15. Синтез (S)-3-аминометил-5-метилгексановой кислоты (I, прегабалина). 3-Метилбутиральдегид (100 мл; 0,91 моль, соединение VI) добавляли до 180 г (1,36 моль) моноэтилмалоната в 260 мл (3,1 моль) пиридина. К этому раствору добавили 0,23 мл (0,25 мол.%) пиперидина. Реакционную смесь нагревали до 80C и перемешивали при этой температуре на протяжении 90 мин. Анализ методом ГХ показал полный расход исходного материала. Добавляли метил-трет-бутиловый эфир (300 мл) и органический слой промывали три раза 200 мл 2 М водной H2SO4, после этого дважды 150 мл 0,5 М водной NaHCO3. Основную часть растворителя удалили при пониженном давлении и добавили нитрометан (120 мл). К этому раствору добавили 40 мл ДБУ. Реакционную смесь нагревали при 60C и перемешивали при этой температуре на протяжении 150 мин. Анализ методом ГХ показал полный расход исходного материала. Добавляли метил-трет-бутиловый эфир (100 мл) и органический слой промывали 200 мл 2 М водной HCl. Водный слой экстрагировали дважды 50 мл метил-трет-бутилового эфира. Органические слои комбинировали и промывали 50 мл насыщенного водного NaHCO3. ДБУ восстанавливали из водного слоя путем добавления 50% водного NaOH и экстракции метил-трет-бутиловым эфиром (выход восстановления после двух экстракций, каждый 100 мл метил-трет-бутилового эфира, составлял 75%; pH водного слоя более 12). Растворитель органического слоя удаляли при пониженном давлении для получения 188,2 г в основном чистого -нитроэфира VIII (чистота, определенная методом ГХ, составляет более 95%; метилтрет-бутиловый эфир менее 5%). Эфир может быть трансформирован в прегабалин, как описано в примерах 7, 8 и 9. Пример 16. Быстрый скрининг пригодных ферментов, используя коммерчески доступные ферменты. Скрининг ферментов осуществляли, как описано в статье М. Ivancic et al., J. of Biotechnology, 2007,129, 109-122, полное содержание которой включено путем ссылки для всех целей. Все ферменты были получены от Сигма-Олдрич (Sigma-Aldrich) (St. Louis, МО), Флука (Fluka) (Buchs, Switzerland), Амано(Biocatalytics/Codexis) или Технического университета Граца (Technical University of Graz). Для анализа коммерчески доступных эстераз или липаз использовали быстрый скрининг, который базировался на сдвиге значения рН. Анализ проводился в два этапа: (I) активные ферменты были идентифицированы; (II) активные ферменты анализировали относительно их активности по отношению к Rи S-энантиомерам этилового эфира нитрометилгексановой кислоты. Растворы индивидуальных ферментов размещали на фильтровальную бумагу и высушивали при 30C на протяжении 30 мин. Высушенную фильтровальную бумагу пропитывали скрининговым раствором, который включал Triton X 100 (0,6%), фенольный красный (2 г/л), буфер Трис-HCl pH 7,5 и 50 мМ рацемического этилового эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты. Гидролиз эфира определяли путем визуального мониторинга по изменению цвета с красного на желтый при падении рН, вызванного высвобожденной кислотой. Положительные образцы, которые показывали активность эстеразы, отбирали и подвергали дальнейшему анализу путем размещения их на фильтровальной бумаге, которую высушивали и после этого пропитывали R и S скрининговыми растворами, которые содержали в качестве субстратов вместо рацемических чистых энантиомеров. Активность ферментов устанавливали путем мониторинга на основе времени, необходимого для изменения цвета pH индикатора. Выбранные ферменты подвергали дальнейшему анализу путем проведения ферментативного гидролиза на препаративной шкале, используя 200 мг рацемического субстрата в 5 мл буфера Трис-HCl приpH 7,5. Ферментный препарат добавляли в достаточном количестве для того, чтобы время реакции составляло менее 24 ч. Конверсию определяли путем измерения количества потребленного 1 М водногоNaOH. При потреблении, которое соответствует 50% конверсии, реакцию останавливали путем добавления 5 мл этилацетата. Слои разделяли и органический слой анализировали путем хиральной ГХ. Пример 17. Рекомбинантная экспрессия EstC из Burkholderia gladioli в Е.coli. 377 г клеток Е.coli, которые подвергают надэкспрессии EstC из Burkholderia gladioli, суспендировали в 830 мл 200 мМ раствора фосфата/цитрата натрия (рН 7,0) и дважды подвергали гомогенизации. Суспензию клеток разбавляли 1:2 Sepipur CL930, что дало 4000 ч./млн флокулянта. Активность эстеразы влажных клеток определяли, используя п-нитрофенил ацетат как субстрат. Эстеразы катализируют гидролиз п-нитрофенил ацетат в п-нитрофенол и уксусную кислоту. Активность фермента определяют путем измерения увеличения абсорбции п-нитрофенола (желтый, 404 нм) в зависимости от времени. Для влажных клеток была определена активность 826 ед./г. После центрифугирования получили прозрачный сырой лизат с удельной активностью 158 ед./г. Разбавленный сырой лизат концентрировали, используя систему ультрафильтрации от Pall Corporation (Centramate) с отрезком мембраны 50 кДа. Фактор концентрации составлял 8, что дало ретентат с удельной активностью 855 ед./мл и пермеат с удельной активностью 6,3 ед./мл. Лиофилизированный остаток составлял 23,3 г и имел удельную активность 9125 ед./г. Общий выход составил 68,3%. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ стереоселективного ферментативного гидролиза эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII), в котором рацемический эфир 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) контактирует с ферментом с получением (R)-энантиомера эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) и (S)-энантиомера соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX), где R1 представляет собой C1-C8-алкильную группу, а фермент выбирают из группы, состоящей из эстеразы из печени борова, липазы А из Candida Antarctica, эстеразы из печени свиньи (ICR-123) и эстеразы EstC из Burkholderiagladioli. 2. Способ по п.1, где фермент представляет собой эстеразу EstC из Burkholderia gladioli. 3. Способ по п.1 или 2, где конверсия составляет от 40 до 50%. 4. Способ по любому из пп.1-3, где энантиомерный излишек (эи) оставшегося эфира 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (VIII) или образованной соли (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX) при конверсии 50% составляет более 80%. 5. Способ по п.4, где энантиомерный излишек (эи) оставшегося эфира 5-метил-3 нитрометилгексановой кислоты (VIII) или образованной соли (S)-5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX) при конверсии 50% составляет более 95%. 6. Способ по любому из пп.1-5, где стереоселективный ферментативный гидролиз проводят в водной системе, которая содержит метанол. 7. Способ по любому из пп.1-6, где стереоселективный ферментативный гидролиз проводят в водном растворе при pH в пределах от 7 до 9. 8. Способ по п.7, где стереоселективный ферментативный гидролиз проводят при pH в пределах от 7 до 7,5. 9. Способ получения 3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты, в котором: а) (R)-энантиомер эфира 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (VIII) и (S)-энантиомер соли 5 метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX), полученные по способу стереоселективного ферментативного гидролиза по пп.1-8, разделяют и б) (S)-энантиомер соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты (IX) далее подвергают реакции для получения 3-(аминометил)-5-метилгексановой кислоты. 10. Способ по п.9, где (S)-энантиомер соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты восстанавливают. 11. Способ по п.10, где (S)-энантиомер соли 5-метил-3-нитрометилгексановой кислоты восстанавливают при pH в пределах от 8 до 14.