Парентеральный фармацевтический препарат длительного действия, содержащий мономерный аналог инсулина, кристаллический аналог инсулина и способ получения кристаллического аналога.

1 Настоящее изобретение относится к мономерным аналогам инсулина человека и парентеральным композициям, содержащим такой мономерный аналог, обладающим длительным пролонгированным действием. В течение многих лет было известно, что инсулин можно успешно кристаллизовать с ионами цинка, чтобы получать различные типы стабильных кристаллов с более длительным временем действия по сравнению с растворимым или аморфным, некристаллизованным инсулином. В начале 50-х годов был разработан новый препарат кристаллов бычьего инсулина,который содержал только инсулин и цинк в ацетатном буфере с нейтральной реакцией среды.Hallas-Moller et al., Science 116, 394-398 (1952). Этот препарат инсулина не содержит фосфатионов, которые активно взаимодействуют с ионами цинка, с образованием нерастворимых производных фосфата цинка. Препараты, содержащие только кристаллический инсулин в ацетатном буфере, называются Ultralente. Кристаллы, полученные этим способом, будут упоминаться в описании как кристаллы Ultralente. Недавно были разработаны мономерные аналоги инсулина, которые сохраняют биологическую активность нативного инсулина человека, но менее склонны к димеризации и самоассоциации с образованием более высокомолекулярных форм. Это отсутствие самоассоциации приводит к сравнительно более быстрому началу действия. Эти аналоги инсулина обеспечивают быстрое всасывание, что дает возможность приводить время инъекции и пик действия инсулина в более тесное соответствие с возникающими после приема пищи колебаниями уровней глюкозы в крови. Настоящее изобретение обеспечивает получение препаратов мономерного аналога инсулина, которые обладают длительным действием. Поскольку мономерные аналоги инсулина не агрегируют и не ассоциируют подобно инсулину, неожиданно было обнаружено, что можно получать стабильные кристаллы аналога. Неожиданно препараты настоящего изобретения предлагают предсказуемую длительность действия. Настоящее изобретение относится к парентеральному фармацевтическому препарату, обладающему длительным действием, который состоит, по существу, из стерильной водной суспензии приблизительно от 20 до 500 ЕД/мл аналога инсулина, приблизительно от 5 до 10 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 0,2 до 2,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера,приблизительно от 0,04 до 20,0 мг/мл ионов цинка и физиологически приемлемого консерванта при рН приблизительно от 6,5 до 7,8, так,что менее 5% указанного аналога присутствует в суспензии в растворенном состоянии. Настоящее изобретение также относится к кристаллическому аналогу инсулина, получен 000970 2 ному осаждением кристаллов из раствора, состоящего по существу из приблизительно от 200 до 1200 Ед/мл аналога инсулина, приблизительно от 50 до 100 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 2,0 до 20,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера и молярного избытка ионов цинка при рН приблизительно от 5,0 до 6,0. Все сокращения аминокислот, используемые в этом описании, соответствуют нормам,принятым Национальным ведомством США по патентам и товарным знакам (37 C.F.R.1.822(b) (2). Используемые в описании термины "аналог инсулина" или "мономерный аналог инсулина" означают аналог инсулина, который менее склонен к димеризации или самоассоциации, чем инсулин человека. Мономерный аналог инсулина представляет инсулин человека, в котором Pro в положении В 28 замещен на Asp, Lys,Leu, Val или Ala, a Lys в положении В 29 представляет собой лизин или пролин; дез(В 28 - В 30) или дез(В 27). Мономерные аналоги инсулина описаны в патентной заявке США 07/388201 (опубликованная заявка EP 383472) и опубликованная заявка EP 214826. Специалисту в данной области ясно, что возможны и другие модификации мономерного аналога инсулина. Эти модификации широко распространены в данной области и включают замещение остатка фенилаланина в положении В 1 аспарагиновой кислотой; замещение остатка треонина в положении В 30 аланином; замещение остатка серина в положении В 9 аспарагиновой кислотой; удаление аминокислот только в положении В 1 или совместно с удалением в положении В 2 и удаление треонина из положения В 30. Особенно предпочтительными мономерными аналогами инсулина являются: LysB28ProB29 инсулин человека (В 28 представляет Lys; В 29 представляет Pro) и AspB28-инсулин человекаHallas-Moller et al., Science 116, 394-398 (1952). Кристаллы, полученные этим способом, будут упоминаться как кристаллы инсулина Ultralente. Термин "кристаллы аналога инсулина" относится к кристаллам аналога инсулина, полученным способом, раскрытым в настоящем описании. Термин "ЕД" относится к стандартной международной единице активности инсулина. Термин "по существу" означает более чем приблизительно 95%, предпочтительно 98%. Например, "по существу кристаллический" означает, что более 95% материала является кристаллическим. Термин "лечение" означает уход и оказание помощи пациенту в борьбе с болезнью, состоянием или нарушением и включает введение 3 соединения, полученного в соответствии с настоящим изобретением, для предупреждения возникновения симптомов или осложнений,облегчения симптомов или осложнений или излечение болезни, состояния или нарушения. Термин "физиологически приемлемый консервант" означает м-крезол, метилпарабен,резорцин, фенол или другой консервант, известный в данной области. Термин "физиологически приемлемый буфер" также известен в данной области. Физиологически приемлемые буферы включают ацетат натрия или аммония или другой буфер, который не взаимодействует активно с цинком. Термин "ион цинка" понятен специалисту. Источником ионов цинка предпочтительно является соль цинка. Примерами солей цинка являются ацетат цинка, бромид цинка, хлорид цинка, фторид цинка, иодид цинка и сульфат цинка. Квалифицированному специалисту будет понятно, что существует еще множество других солей цинка, которые также можно использовать для получения заявленных композиций. Как отмечалось выше, настоящее изобретение обеспечивает кристаллы аналога инсулина и препараты аналога инсулина, обладающие длительным действием. Кристаллы аналога инсулина получают осаждением кристаллов из раствора, состоящего по существу из приблизительно от 200 до 1200 ЕД/мл аналога инсулина,приблизительно от 50 до 100 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 2,0 до 20,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера и молярного избытка ионов цинка при изоэлектрическом значении рН аналога, обычно при рН приблизительно от 5,0 до 6,0. Предпочтительно, кристаллы аналога инсулина получают осаждением кристаллов из раствора, состоящего по существу из приблизительно от 400 до 1000 ЕД/мл аналога инсулина,приблизительно от 65 до 75 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 5,0 до 10,0 мг/мл ацетата натрия и приблизительно от 0,1 до 0,5 мг/мл ионов цинка при рН приблизительно от 5,5 до 5,9. Наиболее предпочтительно кристаллы аналога инсулина получают осаждением кристаллов из раствора, состоящего по существу из 400 ЕД/мл аналога инсулина, приблизительно 70 мг/мл хлорида натрия, приблизительно 8,0 мг/мл ацетата натрия и 0,15 мг/мл ионов цинка при рН приблизительно от 5,5 до 5,6. Кристаллы образуются, когда рН доводят до изоэлектрической точки аналога. рН доводят до 5,0 - 6,0 от более кислого рН путем подщелачивания раствора физиологически приемлемым основанием, таким как гидроксид натрия. Подобно этому рН доводят до 5,0-6,0 от более щелочного рН путем подкисления раствора физиологически приемлемой кислотой, такой как хлористоводородная кислота. Предпочтительно получают два раствора,чтобы после их объединения получить раствор, 000970 4 состоящий по существу из приблизительно от 200 до 1200 ЕД/мл аналога инсулина, приблизительно от 50 до 100 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 2,0 до 20,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера и молярного избытка ионов цинка при изоэлектрическом значении рН аналога. Первый раствор, содержащий аналог инсулина, включает приблизительно от 300 до 2000 ЕД/мл аналога инсулина и молярный избыток ионов цинка при кислотном рН приблизительно от 2,0 до 3,0. Второй раствор - буфер,включает приблизительно от 130 до 270 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 5,0 до 55,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера при рН приблизительно от 10,5 до 12,5. После объединения рН растворов уравновешивается до изоэлектрической точки аналога, рН приблизительно от 5,0 до 6,0. Из раствора выпадают кристаллы. Далее раствор называют фракцией, содержащей кристаллы. При рН приблизительно от 5,0 до 6,0 кристаллы осаждаются при перемешивании в течение приблизительно от 6 до 72 ч. Тем не менее,точное время для завершения роста кристаллов зависит от выбранного аналога и созданных условий. Заявляемые кристаллы хорошо огранены и имеют ромбоэдрическую форму. Предпочтительно в раствор добавляют затравочные кристаллы, чтобы получить более однородное распределение размеров кристаллического материала, а также для ускорения кристаллизации. Получение затравочных кристаллов известно, они могут быть получены из инсулина человека, бычьего инсулина, инсулина свиньи или аналога инсулина. Поскольку мономерные аналоги инсулина не склонны к самоассоциации, физические свойства и характеристики аналога не соответствуют таковым инсулина. Например, различные мономерные аналоги не обладают или обладают малой Zn-индуцированной ассоциацией. Это является разительным отличием от инсулина, который в присутствии цинка находится почти исключительно в виде гексамера. Поскольку требуется, по меньшей мере, два атома цинка для комплексообразования внутри каждого гексамера инсулина для образования нужного кристалла инсулина Ultralente, совершенно удивительно, что кристаллы аналога инсулина образуются при условиях, аналогичных условиям,необходимым для получения инсулина Ultralente. Помимо этого, настоящие кристаллы предпочтительно получают в присутствии малых концентраций фенола, приблизительно от 500 до 3000 миллионных долей. Поскольку связывание с консервантом, которое наблюдается при молярных соотношениях, инициирует самоассоциацию аналога, удивительно, что наблюдается кристаллизация с мономерным аналогом в отсутствие высокой концентрации консерван 5 та. Соответственно, образование кристаллов является неожиданным вследствие ограниченной тенденции мономерных аналогов к формированию гексамеров. Это происходит в противоположность инсулину, который в присутствии цинка легко образует гексамеры без консерванта. Более того, известно, что фенольные консерванты мешают кристаллизации Ultralente. Следовательно, удивительно, что кристаллы аналога формируются в присутствии фенольного консерванта при описанных условиях. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает получение препаратов кристаллического аналога инсулина, удобных для лечения диабета путем подкожных инъекций. Парентеральный фармацевтический препарат состоит по существу из стерильной водной суспензии приблизительно от 20 до 500 ЕД/мл аналога инсулина, приблизительно от 5 до 10 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 0,2 до 2,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера, приблизительно от 0,04 до 20,0 мг/мл ионов цинка и физиологически приемлемого консерванта при рН приблизительно от 6,5 до 7,8, так, что менее 5% указанного аналога присутствует в суспензии в растворенном состоянии. Предпочтительно менее 2% указанного аналога присутствует в препарате в растворенном состоянии. Препараты аналога инсулина получают по методике, которая известна специалистам для получения препаратов человеческого инсулинаUltralente. Суспензию кристаллов аналога инсулина разводят разбавляющим раствором, содержащим физиологически приемлемый буфер и консервант, рН композиции доводят приблизительно до 7,3 - 7,4. Заявляемые препараты аналога инсулина обеспечивают медленное всасывание аналога так, что, если это желательно, можно делать не более одной инъекции в день. Эти препараты содержат консервирующий агент, такой как метилпарабен, и цинк в количестве приблизительно от 0,04 до 20,0 мг/мл при рН приблизительно от 7,1 до 7,5. Хлорид натрия, присутствующий в кристаллах, служит изотоническим агентом. Однако специалисту в данной области будет ясно, что, если необходимо, изотоничность препарата можно обеспечивать как хлоридом натрия, так и другим известным изотоническим агентом, таким как глицерин. Квалифицированному специалисту в данной области ясно, что в настоящем изобретении можно использовать и многие другие консерванты. В предпочтительных вариантах осуществления общая концентрация цинка составляет приблизительно от 0,04 до 0,1 мг/мл, предпочтительно 0,08 мг/мл для препарата U40 и приблизительно от 0,1 до 0,24 мг/мл, предпочтительно 0,14 мг/мл для препарата U100. 6 рН композиции можно доводить с помощью физиологически приемлемого буфера. Физиологически приемлемый буфер включает ацетат натрия или другой буфер, который не взаимодействует активно с цинком. Самое важное, что время действия препарата дополнительно продлевается путем добавления к препарату дополнительного количества цинка так, что общая концентрация цинка составляет приблизительно от 0,5 до 20 мг на 100 единиц, предпочтительно приблизительно от 0,5 мг до 7 мг на 100 единиц инсулина. Дополнительное количество цинка добавляют после комплексообразования и образования кристаллов. Усиленные цинком препараты имеют более 50% цинка в растворимой фракции препарата, а не в комплексе с инсулином. рН усиленного цинком препарата обычно составляет от 6,0 до 7,4. Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает препарат аналога инсулина, состоящий по существу из смеси кристаллического и аморфного материала, Lente-подобный(Lente-like) препарат; а также исключительно аморфный препарат,semiLente-подобный(semiLente-like) препарат. Эти смеси обеспечивают предсказуемое время действия с более быстрым клиренсом. Помимо этого, эти препараты обеспечивают большую длительность действия по сравнению с растворимым аналогом инсулина. Особые условия кристаллизации обеспечивают получение исключительно кристаллических препаратов. Если эти условия изменяются,образуются различные количества некристаллического, аморфного материала. В общем, удаление галогенида из буфера или кристаллизация при нейтральном значении рН вместо изоэлектрической точки приводят к образованию некристаллического материала. Предпочтительно для получения аморфного продукта используют комбинацию этих изменений, чтобы полностью гарантировать образование аморфного материала. Поскольку для каждого мономерного аналога оптимальные условия образования исключительно кристаллического продукта будут слегка отличаться от других, квалифицированному специалисту будет ясно, что другие способы или условия получения аморфного материала также пригодны. Например, включение буфера,обладающего сильным сродством к ионам цинка, будет мешать кристаллизации. Предпочтительно,концентрированную аморфную цинксодержащую суспензию аналога получают путем осаждения частиц аморфного аналога цинк-инсулина из раствора, состоящего по существу из приблизительно от 200 до 1200 ЕД/мл аналога инсулина, приблизительно от 2,0 до 20,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера, приблизительно от 50 до 100 мг/мл хлорида натрия и молярного избытка ионов цинка при рН приблизительно от 7,0 до 7,5.SemiLente-подобный препарат аналога получают путем разведения концентрированной суспензии аморфного аналога цинк-инсулина до получения аморфного препарата, который состоит по существу из приблизительно от 20 до 500 ЕД/мл аналога инсулина, приблизительно от 5 до 10 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 0,2 до 2,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера, приблизительно от 0,07 до 20,0 мг/мл ионов цинка, и физиологически приемлемого консерванта при рН приблизительно от 6,5 до 7,8, так, что менее 5% указанного аналога присутствует в суспензии в растворенном состоянии.Lente-подобный препарат аналога инсулина является смесью 70% кристаллического и 30% аморфного материала. Кристаллическую часть получают способом, описанным для получения кристаллов аналога инсулина. Аморфный материал изготавливают способом, описанным для semiLente-подобного аналога инсулина. Кристаллическую и аморфную части объединяют с помощью обычных способов. Аналог инсулина можно получить с помощью любой из множества известных методик синтеза пептидов, включая классические способы (растворы), твердофазные способы, полусинтетические способы и наиболее современные способы рекомбинантной ДНК. Следующие примеры приводятся только с целью иллюстрации получения аналогов инсулина и настоящего изобретения. Объем настоящего изобретения не должен истолковываться как состоящий только лишь из следующих примеров. Способ получения 1. Получение затравочных кристаллов. Методика изготовления затравочных кристаллов Lente известна и описана в JorganSuspensions", Acta Chemica Scandinavica, 11: 299-302 (1957). Пример 1. Получение кристаллов мономерного аналога. Часть LysB28 ProB29 -инсулина человека. В затемненный химический стакан, снабженный магнитной мешалкой, добавляли 1,034 г кристаллов LysB28ProB29 -инсулина человека (эндогенное содержание цинка 0,51%, концентрация фенола 939 миллионных долей). Эти кристаллы были суспендированы приблизительно в 30 мл воды Milli-QTM. К этому раствору добавляли аликвоту 0,464 мл кислого раствора оксида цинка в концентрации 10 мг/мл, чтобы общее количество цинка доставило 4,64 мг. рН доводили до 2,77 с помощью 10% хлористоводородной кислоты. После того, как раствор становился полностью прозрачным, добавляли водуMilli-QTM, чтобы конечный вес раствора составил 40 г. Конечный раствор аналога фильтрова 000970 8 ли через 0,22 мкм фильтр (фильтрующая установка Millipore Sterivex-GV). Буферная часть. В затемненный химический стакан, снабженный магнитной мешалкой, добавляли 0,565 г ацетата натрия и 4,947 г хлорида натрия. Для растворения солей использовали приблизительно 25 г воды Milli-QTM, а рН доводили приблизительно до 11 с помощью 10% гидроксида натрия. После получения нужной величины рН раствор доводили до конечной массы 30 г с помощью воды Milli-QTM. Этот раствор фильтровали через 0,22 мкм фильтр (фильтрующая установка Millipore SterivexTM-GV). Величину рН буферного раствора доводили до 12,01 с помощью 0,25 мл 10% гидроксида натрия, в результате чего после объединения с раствором аналога рН составляла 5,6. Кристаллизация. Для получения 50 мл раствора кристаллов в концентрации 400 ЕД/мл использовали следующие условия. В кристаллизатор добавляли 29,716 мл раствора аналога. Затем в кристаллизатор при перемешивании добавляли 18,75 мл буфера. Через 60 с в кристаллизатор добавляли 1,544 мл затравочной смеси инсулина человека(функциональность = 4), рассчитанная как 1/2 функциональности, умноженная на количество граммов аналога. Перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 24 ч. Пример 2. Фармацевтический препарат аналога инсулина, обладающий длительным действием (40 ЕД/мл). Разбавляющий раствор. Маточный раствор метилпарабена (2 мг/г) получали путем растворения 0,6 г метилпарабена в воде Milli-QTM до конечной массы 300 г. В затемненный химический стакан, снабженный магнитной мешалкой, добавляли 277,78 г маточного раствора метилпарабена, 0,444 ацетата натрия и 4,785 мл кислого раствора оксида цинка в концентрации 100 мг/мл. Величину рН раствора доводили до 5,53 с помощью 10% гидроксида натрия. Добавляли воду Milli-QTM до конечной массы раствора 500 г, и, наконец, раствор фильтровали через 0,22 мкм фильтр (фильтрующая установка Millipore SterivexTM-GV). Препарат. К разбавляющему раствору добавляли 0,020 мл 10% хлористоводородной кислоты и 0,750 мл 10% гидроксида натрия, чтобы величина рН составила 7,72, таким образом, что в результате объединения кристаллов и разбавляющего раствора конечная величина рН составила 7,3 - 7,4. В затемненный контейнер, снабженный магнитной мешалкой, добавляли 360 г разбавляющего раствора (рассчитанная величина 90% конечного объема, удельный вес = 1,000), а затем 42,40 г фракции кристаллов (рассчитанная величина - 10% конечного объема, удельный вес= 1,060). Конечную величину рН с 7,27 до 7,34 доводили с помощью 0,010 мл 10% гидроксида натрия. Пример 3. Определение характеристик кристаллов и конечный препарат. Полученные кристаллыLysB28ProB29 инсулина человека исследовали под микроскопом и обнаружили, что после 24 ч процесса кристаллизации они содержат преимущественно кристаллы ромбоэдрической формы приблизительно 10 мкм в диаметре. Конечный препарат LysB28ProB29 - инсулина человека в концентрации 40 ЕД/мл изучали под микроскопом и исследовали также с помощью ряда аналитических тестов для проверки препарата и результатов процесса. Микроскопическая оценка показала присутствие в препарате ромбоэдрических кристаллов. Аликвоту 1 мл тщательно ресуспендированного препарата центрифугировали в течение 30 мин при скорости 14000 об./мин. Надосадочную жидкость тщательно удаляли и к 800 мкл добавляли 1 мкл 9,6 М хлористоводородной кислоты. Аликвоту 20 мкл этой смеси затем инъецировали в систему ЖХВР с обращенной фазой. Результаты этого исследования показали, что надосадочная жидкость содержала 0,034 ЕД/мл некристаллизованного LysB28ProB29 -инсулина человека. Общий потенциал препарата определяли путем подкисления 1 мл ресуспендированного препарата с помощью 3 мкл 9,6 М хлористоводородной кислоты, а затем разведения образца до 5 мл 0,01 М хлористоводородной кислотой. Аликвоту 20 мкл этого образца инъецировали в систему ЖХВР с обращенной фазой. Обнаружено, что общий потенциал составлял 43,6 ЕД/мл. Чистоту композиции определяли с помощью хроматографии с обращенной фазой путем прямой инъекции 20 мкл подкисленной (3 мкл 9,6 М хлористоводородной кислоты) 1-мл аликвоты образца. Чистота составила 98,3% на пике по сравнению с общим исходным уровнем. Содержание высокомолекулярных полимеров определяли с помощью вытеснительной ЖХВР путем прямой инъекции 20 мкл подкисленной аликвоты 1 мл. Общий уровень полимеров составил 0,17% на пике по сравнению с общим исходным уровнем. Пример 4. Исследование растворения invitro. Эта методика является модификацией метода анализа, описанного Graham and Pomeroy,J. Pharm. Pharmacol. 36, 427-430 (1983). Этот способ, принятый в данной области как позволяющий предсказать биологический ответ, использует скорость растворения кристаллов после значительного разведения буфером, не связывающим цинк, как способ предсказания скорости, при которой кристаллический препарат будет растворяться после подкожной инъекции у животных. Кристаллический препарат LysB28ProB29 инсулина человека (40 ЕД/мл) (LysPro в таблице 10 1) изучали в сравнении с HumulinTM Ultralente и двумя препаратами инсулина человека Lente,содержащими 40 ЕД/мл. Части (0,2 мл) этих суспензий добавляли каждую к 20 мл 0,1 М Трис(трис-гидроксиметиламинометан, Mallinckrodt,Paris, KY) буфера с рН 7,5, который перемешивали при комнатной температуре в стеклянном химическом стакане. Через промежутки времени в 0,5, 3 и 8 ч отбирали аликвоты перемешиваемых образцов по 0,2 мл и пропускали через 0,2 мкм фильтр Acrodisc . Количество инсулина в фильтрате определяли с помощью ЖХВР с обращенной фазой. Максимальное содержание инсулина определяли с помощью первоначального анализа неотфильтрованной подкисленной аликвоты. Данные представлены в виде процентов от максимального содержания инсулина для каждого образца. Таблица 1. Исследование растворения in vitro в зависимости от времени Время (ч) Образец 0,5 3 8 Результаты, представленные в таблице 1,показывают, что по свойствам растворимости кристаллы LysB28ProB29-инсулина человека обладают более длительным действием. Пример 5. Получение кристалловLysB28ProB29 -инсулина человека. Суспензия кристаллов для U400LysB28ProB29-инсулина человека (концентрация фенола определению не поддавалась). Кристаллы суспендировали приблизительно в 30 мл воды и добавляли аликвоту 0,942 мл кислого раствора оксида цинка в концентрации 10 мг/мл. рН доводили до 2,6 с помощью 10% хлористоводородной кислоты и 10% гидроксида натрия. После того как раствор становился полностью прозрачным, добавляли воду так, чтобы конечный вес раствора составил 38,95 г. Конечный раствор фильтровали через 0,22 мкм фильтр(фильтрующая установка Millipore SterivexGV). Буферный раствор. В затемненный химический стакан, снабженный магнитной мешалкой, добавляли 0,565 г ацетата натрия и 4,947 г хлорида натрия. Для растворения солей использовали приблизительно 25 г воды, а рН доводили приблизительно до 11,52 с помощью 10% гидроксида натрия. После доведения рН раствора до нужной величины добавляли воду до конечной массы 30 г. Конечный раствор фильтровали через 0,22 мкмLysB28ProB29-инсулина человека и 0,45 мл буфера) приготавливали для определения правильной величины рН буфера, которая требовалась для достижения конечной величины рН 5,5 - 5,6 для конечной кристаллизации. Величину рН буфера доводили до 12,13 с помощью 0,28 мл 10% гидроксида натрия, получая рН 5,6 при объединении с LysB28ProB29-инсулина человека. Для получения 50 мл раствора LysB28ProB29 инсулина человека Ultralente в концентрации 400 ЕД/мл (кристаллы) использовали следующие условия. В кристаллизатор добавляли 30,61 г LysB28ProB29-инсулина человека, рассчитанных как LysB28ProB29-инсулин человека плюс затравка, равная 62,5% объема кристаллов. Затем в кристаллизатор при перемешивании добавляли общее количество 18,75 мл буфера, рассчитанное как 37,5% кристаллов. Через 60 с к кристаллам добавляли 0,824 мл затравочной смеси инсулина человека (функциональность = 2), рассчитанная как 1/2 функциональности, умноженная на количество граммов LysB28ProB29 инсулина человека. Перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 48 ч. Через 48 ч эту суспензию исследовали под микроскопом (увеличение 600 х) и обнаружили,что она содержала смесь хорошо ограненных ромбоэдрических кристаллов, плохо сформировавшихся кристаллов и аморфного материала. Пример 6. Получение аморфного преципитата.LysB28ProB29-инсулин человека. В затемненный химический стакан, снабженный магнитной мешалкой, добавляли 0,994 г кристаллов LysB28ProB29-инсулина человека, содержащих цинк (эндогенный цинк 0,43%, концентрация фенола 2663 миллионных долей). Кристаллы суспендировали в приблизительно 30 мл воды и добавляли к раствору аликвоту 0,515 мл кислого раствора оксида цинка в концентрации 10 мг/мл. рН доводили до 3,6 добавлением 0,220 мл 10% хлористо-водородной кислоты. После того как раствор становился полностью прозрачным, добавляли воду так, чтобы конечный вес раствора составил 40 г. Конечный раствор фильтровали через 0,22 мкм фильтрGV). Буферный раствор. В затемненный химический стакан, снабженный магнитной мешалкой, добавляли 0,565 г ацетата натрия и 4,947 г хлорида натрия. Для растворения солей использовали приблизительно 25 г воды, а рН доводили приблизительно до 12,6 добавлением 10% гидроксида натрия. После получения нужной величины рН раствор 12 доводили водой до конечной массы 30 г и фильтровали через 0,22 мкм фильтр (фильтрующая установка Millipore Sterivex-GV). Аморфная суспензия. Испытуемые комбинации LysB28ProB29 инсулина человека и буфера (0,75 млLysB28ProB29-инсулина человека и 0,45 мл буфера) приготавливали для определения правильной величины рН буфера, которая требовалась для достижения конечной величины рН 7,2 - 7,4 конечного раствора. К буферу для получения рН 12,2 добавляли дополнительное количество 10% НСl. Конечный объединенный раствор содержал 31,25 мл LysB28ProB29-инсулина человека и 18,75 мл буфера при рН 7,3. Перемешивание продолжали при комнатной температуре в течение 24 ч. Через 48 ч эту суспензию исследовали под микроскопом (увеличение 600 х) и обнаружили,что она содержала исключительно аморфный материал. Пример 7. Смешанный кристаллический и аморфный препарат. Для изготовления Lentе-подобного препарата 70% кристаллической суспензииLysB28ProB29-инсулина человека примера 1 смешивали с аморфной суспензией LysB28ProB29 инсулина человека примера 6. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Парентеральный фармацевтический препарат длительного действия с рН 6,5-7,8,содержащий стерильную водную суспензию аналога инсулина, хлорид натрия, физиологически приемлемый буфер, физиологически приемлемый консервант и ионы цинка, отличающийся тем, что он содержит мономерный аналог инсулина в количестве около 20-500 Ед/мм, хлорид натрия в количестве около 5-10 мг/мл, физиологически приемлемый буфер в количестве около 0,2-2,0 мг/мл и ионы цинка в количестве около 0,04-20,0 мг/мл, причем в суспензии в растворенном состоянии присутствует менее 5% указанного аналога инсулина. 2. Парентеральный фармацевтический препарат по п.1, отличающийся тем, что мономерный аналог инсулина представляет собойLysB28ProB29-инсулин человека. 3. Парентеральный фармацевтический препарат по п.1, отличающийся тем, что аналог инсулина, присутствующий в суспензии в нерастворенном состоянии, представляет собой кристаллический инсулин. 4. Парентеральный фармацевтический препарат по п.3, отличающийся тем, что он содержит мономерный аналог инсулина в количестве около 40 Ед/мл, хлорид натрия в количестве около 7 мг/мл, в качестве физиологически приемлемого буфера натрий-ацетатный буфер в количестве около 1,6 мг/мл, и рН препарата составляет приблизительно 7,0 - 7,4. 5. Парентеральный фармацевтический препарат по п.3, отличающийся тем, что он содержит мономерный аналог инсулина в количестве около 100 Ед/мл, хлорид натрия в количестве около 7 мг/мл, в качестве физиологически приемлемого буфера натрий-ацетатный буфер в количестве около 1,6 мг/мл, и рН препарата составляет приблизительно 7,0-7,4. 6. Парентеральный фармацевтический препарат по п.1, отличающийся тем, что аналог инсулина, присутствующий в суспензии в нерастворенном состоянии, представляет собой аморфный инсулин. 7. Парентеральный фармацевтический препарат по п.1, отличающийся тем, что аналог инсулина, присутствующий в суспензии в нерастворенном состоянии, примерно на 70% представляет собой кристаллический инсулин и примерно на 30% представляет собой аморфный инсулин. 8. Парентеральный фармацевтический препарат по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что в качестве физиологически приемлемого консерванта содержит m-крезол или резорцин или фенол в количестве менее 3000 миллионных долей. 9. Кристаллический аналог инсулина, получаемый осаждением кристаллов из раствора,состоящего по существу из приблизительно от 200 до 1200 Ед/мл аналога инсулина, приблизительно от 50 до 100 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 2,0 до 20,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера и молярного избытка 14 ионов цинка при рН приблизительно от 5,0 до 6,0, используемый для получения препарата по любому из пп.1-5, 7, 8 формулы. 10. Кристаллический аналог инсулина, полученный объединением первого раствора, состоящего по существу из приблизительно от 300 до 2000 Ед/мл аналога инсулина и молярного избытка ионов цинка при рН приблизительно от 2,0 до 3,0, и второго раствора, состоящего по существу из приблизительно от 130 до 270 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 5,0 до 55,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера при рН приблизительно от 10,5 до 12,5, так, что рН объединенных растворов составляет от 5,0 до 6,0, используемый для получения препарата по любому из пп.1-5, 7, 8 формулы. 11. Кристаллический аналог инсулина, по любому из пп.9-10, отличающийся тем, что аналогом инсулина является LysB28ProB29-инсулин человека. 12. Способ получения кристалловLysB28ProB29-инсулина человека по п.11 формулы, включающий объединение первого раствора, состоящего по существу из приблизительно от 300 до 2000 Ед/мл аналога инсулина и молярного избытка ионов цинка при рН приблизительно от 2,0 до 3,0, и второго раствора, состоящего по существу из приблизительно от 130 до 270 мг/мл хлорида натрия, приблизительно от 5,0 до 55,0 мг/мл физиологически приемлемого буфера при рН приблизительно от 10,5 до 12,5, так, что рН объединенных растворов составляет от 5,0 до 6,0.