Замороженная в виде гранул культура молочнокислых бактерий, применение культуры и способ ее получения

010855 Настоящее изобретение касается замороженной в виде гранул культуры молочно-кислых бактерий(LAB) в коммерческой упаковке, содержащей по меньшей мере 50 г замороженного материала, причем замороженный материал в виде отдельных гранул характеризуется тем, что при хранении его при температуре ниже температуры начала таяния (Tm') этой культуры, например при -46 С в течение 7-14 дней,указанные отдельные гранулы данной замороженной культуры не слипаются и потому в основном остаются в виде отдельных гранул. Микроорганизмы используют при производстве пищевых и кормовых продуктов, включая большинство молочных продуктов. Бактериальные культуры, в частности культуры бактерий, которые обычно относят к молочно-кислым бактериям, необходимы для получения молочно-кислых продуктов, сыра и масла. Культуры таких бактерий можно рассматривать в качестве заквасок, которые придают специфические свойства разнообразным молочным продуктам, благодаря осуществлению ряда функций. Как правило, молочные закваски состоят из молочно-кислых бактерий. В данном контексте выражение "молочно-кислые бактерии" (LAB) означает группу грамположительных, негативных по каталазе,неподвижных, неспорулирующих, микроаэрофильных или анаэробных бактерий, которые ферментируют сахара с образованием органических кислот, в том числе молочную кислоту в качестве преимущественно образуемой кислоты, муравьиную кислоту и пропионовую кислоту. В данном случае молочно-кислые бактерии включают ряд бактериальных родов в типе Firmicutes. Роды Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Mellissococcus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus и Weisella относят к LAB. Кроме того, продуцирующие молочную кислоту грамположительные бактерии, относящиеся к типу Actinobacteria, такие как представители родов Aerococcus, Micobacterium и Propionobacterium, а также Bifidobacterium, в данном случае рассматривают в качестве LAB. Наиболее промышленно важные молочно-кислые бактерии обнаружены среди видов Lactococcus, видовPediococcus. В дополнение к их применению в молочной промышленности культуры молочно-кислых бактерий находят также широкое применение в мясоперерабатывающей промышленности, а также в ряде других отраслей. Коммерческие закваски могут предлагаться в виде замороженных культур. Высококонцентрированные замороженные культуры представляют большой интерес с коммерческой точки зрения, поскольку такие культуры можно вводить непосредственно в ферментационную среду (например, молочную или мясную) без промежуточного переноса. Иными словами, такие высококонцентрированные замороженные культуры содержат бактерии в количестве, которое делает ненужным выращивание этой культуры конечным потребителем для получения заквасочной массы. "Заквасочная масса" означает здесь культуру, выращиваемую на предприятии пищевой промышленности для введения в среду, подлежащую ферментации. Высококонцентрированные культуры могут быть непосредственно отнесены к DVSкультурам (культурам для прямого внесения в чан). Чтобы включать достаточное количество бактерий,которые используют в качестве DVS-культуры для потребителей, концентрированные замороженные культуры, как правило, имеют вес по меньшей мере 50 г и содержат в 1 г по меньшей мере 109 колониеобразующих единиц (CFU) жизнеспособных бактерий. Важным вопросом для практического использования замороженных культур является удобство работы с ними. Хотя замороженные в виде блока культуры трудны в обращении, было обнаружено, что с культурами, замороженными в виде гранул, очень легко справляться и производителю, и потребителю. В результате возник бурно развивающийся рынок высококонцентрированных замороженных гранулированных культур, так называемых замороженных культур для прямого внесения прямого осаждения (F-DVS). Появился ряд публикаций, касающихся жизнеспособности замороженных культур.Chavarri и соавт. (1988) в своей работе описывают, что жизнеспособность замороженной чистой культуры Streptococcus lactis можно повысить путем добавления 5% лактозы или 5% сахарозы.Carcoba и соавт. (2000) описывают, что жизнеспособность замороженной чистой культуры Lactococcus lactis подвид lactis можно повысить путем добавления различных криозащитных агентов, таких как сахара (лактоза, сахароза и трегалоза), глутаминовая кислота и желатин. Патент США 4140800 (Kline) указывает, что жизнеспособность лиофилизованных культур можно повысить путем введения различных криозащитных агентов. Обсуждается также вопрос о жизнеспособности замороженных культур при добавлении лактозы, сахарозы или мальтозы.WO 00/39281 (Kringelum и др.) указывает на то, что жизнеспособность незамороженных, жидких заквасок можно повысить путем добавления различных криозащитных агентов, аWO 2004/065584 A1 (Bisgaard-Frantzen) показывают повышение жизнеспособности высококонцентрированных замороженных заквасок путем добавления различных криозащитных агентов. Только WO 2004/065584 A1 описывает замороженные в виде гранул культуры, но ни в одной из вышеуказанных публикаций не рассматривается вопрос о физической стабильности замороженных в виде гранул культур при их хранении. Для коммерческих целей замороженную в виде гранул культуру молочно-кислых бактерий (LAB)-1 010855 обычно фасуют в подходящую упаковку (например, в 2-литровые картонные тетрапаки). Их обычно хранят при температуре около -46 С, а замороженный в них материал находится в виде отдельных гранул относительно малого веса. До настоящего изобретения авторы полагали, что не имеется существенных проблем в отношении хранения таких коммерческих замороженных в виде гранул культур молочно-кислых бактерий (LAB). Однако на основе различных исследований авторы выяснили, что при хранении ряда коммерчески важных культур при температуре около -46C в течение 7 дней или более отдельные гранулы слипаются и образуют укрупненные скопления. Для промышленного производства культур комкование создает трудности в работе. К примеру, намного труднее вводить адекватные дозы в упаковку для культуры, если данная культура скомковалась. Иногда даже трудно извлечь скомковавшуюся культуру из такой упаковки обычным путем. Последующие исследования выявили, что "проблемные" культуры могут характеризоваться из-за наличия у замороженной в виде гранул культуры молочно-кислых бактерий (LAB) температуры начала таяния Tm', как определено Roos (1995) ниже температуры хранения, около -46 С. Tm' является стандартным физико-химическим термином, используемым в пищевой промышленности и в других областях. Tm' обычно измеряют методом дифференциальной сканирующей калориметрии, описанным Roos(1991). Она относится к температуре начала таяния пищевого продукта (в данном случае - замороженнойLAB-культуры). Более подробно это изложено в руководствах Fennema "Food Chemistry" (1996) и RoosHe связывая себя теорией, авторы полагают, что если замороженная культура имеет Tm' ниже ее температуры хранения, например около -46 С, начинается фазовый переход (таяние), что вызывает слипание отдельных гранул и образование более крупных комков. Резюмируя, авторы идентифицировали неизвестные до сих пор проблемы хранения, связанные с появлением некоторых видов коммерческих высококонцентрированных замороженных в виде гранул культур молочно-кислых бактерий. После того как данная проблема была выявлена, авторы изобретения попытались решить ее. Не связывая себя теорией, авторы изобретения установили, что при введении некоторых подходящих добавок к проблемной замороженной в виде гранул культуре, можно получить замороженную в виде гранул культуру, которая после хранения в течение 7-14 дней при -46 С, не образует комков из отдельных гранул. Такие культуры характеризуются тем, что отдельные гранулы данной замороженной культуры не слипаются и потому в основном остаются в виде отдельных гранул даже после длительного хранения при около -46 С. Вообще, подходящие добавки могут характеризоваться тем, что они увеличивают Tm данной замороженной культуры до значения, которое выше температуры хранения, например -46 С, увеличивая, например, Tm от диапазона от -70 до -46 С до диапазона от -45 до -15 С. Представленные здесь примеры описывают предпочтительные примеры подходящих добавок. Описываемые соединения содержат трегалозу, мальтодекстрин, циклодекстрин, порошковую камедь, рыбий желатин, а также мальтит. На основании общеизвестных сведений специалист в данной области вполне способен идентифицировать дополнительные подходящие добавки, которые способны увеличить m' замораживаемой культуры до величины, которая выше температуры хранения, например -46 С. Как указано выше, для включения достаточного количества бактерий коммерческая высококонцентрированная замороженная культура обычно должна иметь вес по меньшей мере 50 г и содержать жизнеспособных бактерий по меньшей мере 109 колониеобразующих единиц (CFU) на грамм. Бактериальные культуры, описываемые в статьях Chavarri (1988) и Carcoba (2000), ориентированы не на физическую стабильность замороженных в виде гранул культур, а на жизнеспособность замороженных бактерий, в данном случае не рассматриваемых коммерчески значимых высококонцентрированных замороженных культур, поскольку их культуры произведены в гораздо меньшем объеме и имели существенно меньший вес (в граммах) для замороженной культуры, да к тому же эти описанные культуры не были замороженными в виде гранул культурами. Кроме того, культуры, описанные Chavarri (1988) и Carcoba (2000), вообще не ориентированы на физическую стабильность замороженных в виде гранул культур, а ориентированы на жизнеспособность замороженных бактерий. Соответственно, первый объект изобретения относится к культуре замороженных в виде гранул молочно-кислых бактерий (LAB) в коммерчески удобной упаковке, которая содержит по меньшей мере 50 г замороженного материала, причем данный замороженный материал находится в виде отдельных гранул,содержит жизнеспособные бактерии в количестве по меньшей мере 109 колоннеобразующих единиц(CFU) на грамм замороженного материала и включает добавку в количестве от 0,5 до 13 вес./вес.% от веса замороженного материала. Подходящую добавку выбирают из группы соединений, которые, благодаря использованию добавки в количестве 10 вес./вес.% от веса замороженного материала, способны увеличить Tm' (температуру начала таяния) данной культуры замороженных молочно-кислых бактерий (LAB), которая без указанной добавки имеет Tm' от -70 до -46 С, до значения Tm' от -45 до -15 С (измеряемую с помощью DSC).-2 010855 Кроме того, данная замороженная культура молочно-кислых бактерий (LAB) характеризуется тем,что при хранении около -46 С в течение 7-14 дней, отдельные гранулы данной замороженной культуры не слипаются и потому в основном остаются в виде отдельных гранул, причем это оценивают с помощью следующего теста: отдельные гранулы данной замороженной культуры являются гранулами, замороженными в жидком азоте, затем 100 таких отдельных гранул (около 5-100 г гранул) насыпают в чашку Петри, образующих, таким образом, тонкий слой из отдельных одиночных гранул, причем данный слой характеризуется тем, что большинство этих гранул физически контактируют с одной или несколькими соседними гранулами, этот слой гранул выдерживают около при -46 С в течение 7-14 дней для того, чтобы удостовериться, что данные гранулы все еще обособлены, или же они образовали скопления, либо слиплись, и где данный критерий для отдельных гранул данной замороженной культуры, сохраняющейся в значительной степени в виде отдельных гранул, заключается в том, что по меньшей мере 80 из 100 отдельных гранул сохраняются в виде отдельных одиночных гранул. Вместе с тем, из первого объекта изобретения специально исключены замороженные молочнокислые бактериальные (LAB) культуры, которые содержат LAB, способные утилизировать сахарозу, и в которых данная культура включает криозащитный агент, выбранный из группы, состоящей из сахарозы в количестве от 2 до 13% сахарозы, измеряемом в виде вес./вес. замороженного материала; и трегалозы в количестве от 4 до 6% трегалозы, измеряемом в виде вес./вес. замороженного материала; а также смеси трегалоза/сахароза, обе в количестве от 12 до 14%, измеряемом в виде вес./вес. замороженного материала. Исключение ("дисклеймер"), приведенное в конце первого объекта, относится к РСТ-заявке WO 2004/065584 A1. Данная заявка была подана 19 января 2004 г. Ко времени подачи, устанавливающей приоритет заявки к настоящей заявке, указанная РСТ-заявка WO 2004/065584 A1 не была опубликована. Заявка WO 2004/065584 A1 связана с повышением жизнеспособности в период хранения замороженной культуры. Она не описывает проблему "слипания гранул", представленную в настоящем изобретении. Собственно, главный п.1 формулы изобретения связан с "замороженной культурой молочнокислых бактерий (LAB), которая включает LAB, которые способны утилизировать сахарозу, имеет вес по меньшей мере 50 г замороженного материала и содержит жизнеспособные бактерии в количестве по меньшей мере 109 колониеобразующих единиц (CFU) на грамм замороженного материала, характеризующейся тем, что данная замороженная культура включает от 0,5 до 80 вес./вес.% криозащитного агента от веса замороженного материала". Несмотря на то, что замороженные в виде гранул культуры с криозащитными агентами описаны вWO 2004/065584 A1, ее можно исключить, потому что квалифицированный специалист неминуемо придет к результату, вписывающемуся в рамки WO 2004/065584 A1, так как заявка WO 2004/065584 A1 конкретизирована лишь в отношении заявляемых культур, которые способны утилизировать сахарозу. Что касается замороженной культуры по изобретению, то указанную добавку следует предпочтительно добавлять к указанным жизнеспособным бактериям перед их замораживанием. Соответственно, второй объект изобретения относится к способу получения замороженной в виде гранул культуры молочно-кислых бактерий (LAB) из первого объекта изобретения и к описанным здесь вариантам изобретения, предусматривающему следующие стадии:(i) добавления добавки к жизнеспособным бактериям, чтобы получить по меньшей мере 50 г материала с содержанием жизнеспособных бактерий в количестве по меньшей мере 109 колониеобразующих единиц (CFU) на грамм материала, и включение добавки в количестве от 0,5 до 13 вес./вес.% от веса материала,(ii) замораживания указанного материала, чтобы получить замороженный в виде гранул материал, и(iii) упаковки полученного замороженного материала подходящим способом, чтобы получить упакованную замороженную в виде гранул культуру молочно-кислых бактерий (LAB) по первому объекту изобретения и осуществление вариантов изобретения, как описано здесь. Третий объект изобретения относится к замороженной в виде гранул культуре молочно-кислых бактерий (LAB), получаемой с помощью способа получения замороженной в виде гранул культуры молочно-кислых бактерий (LAB) по второму объекту изобретения. Четвертый объект изобретения относится к применению замороженной в виде гранул культуры молочно-кислых бактерий (LAB), как описано выше, в процессе получения пищевого или кормового продукта. Определения Перед подробным обсуждением вариантов изобретения приведем определение конкретных терминов, связанных с основными объектами изобретения. Используемый термин "LAB, которые способны утилизировать сахарозу" означает LAB, которые способны ферментировать сахарозу с образованием кислот. Это то же самое определение, что и в РСТзаявке с порядковым номером WO 2004/065584 A1. Используемый термин "материал" в отношении к данной культуре соответствует значимым веществам данной культуры, включающей жизнеспособные бактерии, а также криозащитный агент. Потенци-3 010855 ально возможная упаковка не включена. Поэтому вес (масса) материала культуры не включает вес (массу) потенциально возможной упаковки. Используемый термин "упаковка" или "емкость" следует понимать широко. Он означает, что замороженную в виде гранул культуру молочно-кислых бактерий (LAB) следует упаковать, чтобы передать ее потребителю. Она может быть упакована в бутылку, термосвариваемую картонную упаковку Тетрапак и т.п. Используемый в данном случае термин "добавка" может быть единственной конкретной добавкой или может представлять собой две или более различных добавок. Соответственно, процентное содержание вес./вес. добавки (добавок) в материале культуры следует понимать как суммарное количество добавки (добавок). Предпочтительно данный термин относится к добавке, добавляемой к культуре после ферментации. Соответственно, добавка может не присутствовать в значительном количестве в культуральном ферментационном бульоне. Используемые термины "замороженный в виде гранул" и "замороженная в виде гранул культура" относится к культуре, замороженной путем применения способа, который дает в результате зернистую или замороженной в виде гранул культуру. Такую культуру можно легко получить путем капельного введения данной культуры в жидкий азот с образованием замороженных капелек или зерен этой культуры. Обычно, но не обязательно, данный процесс осуществляют в кюветах традиционной промышленной установки для лиофилизации. Используемые термины "зерна" или "гранулы" относятся к небольшим затвердевшим объектам, полученным в результате замораживания жидкости, со средним размером между 0,1 и 10 мм. Варианты изобретения описаны ниже исключительно в виде примеров. На прилагаемых чертежах фиг. 1 - корреляция между температурой, при которой наблюдается таяние, Tm', и количеством добавляемых дисахаридов. Более подробно см. представленный пример 3. Температура хранения, -46 С,указана пунктирной линией. Фиг. 2 - температура начала таяния (Tm') (ось Y) для ряда культур в виде функции от концентрации(% вес./вес.) мальтодекстрина (Glucidex 12) (ось X). Культура, именуемая "А", означает, что в данную культуру перед замораживанием ее в виде гранул был добавлен глицерин, а культура под именем "В" соответствует культуре, в которую перед ее замораживанием в виде гранул, глицерин не добавляли. Температура начала таяния (Tm') Как указано выше, Tm' является хорошо известным термином, используемым в физической химии,для обозначения температуры, при которой начинается таяние. В данном случае Tm' означает температуру, при которой начинается таяние замороженной LAB-культуры. Предпочтительно Tm' измеряют путем использования DSC-протокола, описанного в разделе под названием "Измерение Tm'" в приведенном здесь примере 1. Тест на слипание гранул Как указано в первом объекте изобретения, используемый тест, в котором проверяют, представляет ли данная замороженная в виде гранул культура молочно-кислых бактерий (LAB) культуру, которая может характеризоваться тем, что при хранении приблизительно при -46 С (в данной ситуации морозильник, запрограммированный на -50 С, определяет температуру образца, равную -46 С) в течение 7-14 дней, полученные отдельные гранулы данной замороженной культуры не слипаются и потому в основном остаются в виде отдельных гранул в любом тесте, включающем следующее: отдельные гранулы данной замороженной культуры представляют собой гранулы, замороженные в жидком азоте, после чего 100 отдельных гранул (около 5-100 г гранул) насыпают в чашку Петри, создавая, таким образом, тонкий слой отдельных единичных гранул, причем данный слой характеризуется тем, что большинство этих гранул находится в физическом контакте с одной или несколькими соседними гранулами, помещаемыми при около -46 С на 7-14 дней, чтобы удостовериться, что данные гранулы все еще обособлены или же эти гранулы образовали скопления либо слиплись, и в соответствии с данным критерием, эти отдельные гранулы замороженной культуры в основном остаются в виде отдельных гранул и по меньшей мере 80 из 100 таких отдельных гранул сохраняются в виде отдельных одиночных гранул. Более предпочтительно по меньшей мере 90 из 100 отдельных гранул и еще более предпочтительно по меньшей мере 95 из 100 отдельных гранул сохраняются в виде отдельных одиночных гранул. Просмотр и подсчет отдельных гранул, которые сохраняются в виде отдельных одиночных гранул, можно осуществлять визуально. Специалист в данной области может осуществлять это последовательно, причем предполагаемые результаты в рамках стандартных технических ограниченний должны быть непротиворечивыми и повторяемыми. В приведенном здесь примере 1 представлены дополнительные технические подробности. Замороженная в виде гранул культура молочно-кислых бактерий (LAB) Предпочтительно используемый термин "культура замороженных молочно-кислых бактерий(LAB)" означает культуру, которая, без включения введенной в культуру описанной здесь добавки, имеетTm' от -70 до -46 С. Данную культуру можно заморозить в виде зерен или гранул, образующих "замороженной в виде гранул культуру молочно-кислых бактерий (LAB)". Культуру замороженных в виде гра-4 010855 нул молочно-кислых бактерий (LAB) можно легко получить путем капельного внесения данной культуры в жидкий азот, получая замороженные зерна или гранулы данной культуры.LAB данной культуры могут представлять собой любые, в частности, коммерчески важные LAB, не утилизирующие сахарозу в соответствии с международным IDF-стандартом 146 А:1998 "Identification ofCharacteristic Microorganisms" при использовании подходящих наборов для API-теста (bioMerieux SA,Lyon, Франция). Набор API "rapid ID 32 STREP" и "50 CHL Medium" используют для определения способности большинства представителей родов LAB утилизировать сахарозу. Предпочтительно данная культура LAB выбрана из группы, включающей Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp., в том числе Lactococcus lactis subsp. lactis и Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus spp., в том числе Lactobacillus acidophilus, Streptococcus spp.,Enterococcus spp., Pediococcus spp., Leuconostoc spp., Oenococcus spp., и виды грибов, в том числе Peniciliun spp., Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., Klyveromyces spp. и Saccharomyces spp. Хотя некоторые из этих видов в большинстве случаев описаны как виды, способные утилизировать сахарозу, при их культивировании постоянно выделяют мутанты, не способные утилизировать сахарозу. Сколько бы ни было изолировано или получено таких мутаций, все они, тем не менее, являются объектом изобретения. Наиболее пригодные в промышленном отношении молочно-кислые бактерии обнаружены среди видов Lactococcus, видов Streptococcus, видов Enterococcus, видов Lactobacillus, видов leuconostoc и видов Pediococcus. Используемый термин "смешанная культура молочно-кислых бактерий (LAB)" означает смешанную культуру, которая включает два или несколько разных видов LAB. Используемый термин "чистая культура молочно-кислых бактерий (LAB)" означает чистую культуру, которая включает исключительно одну разновидность LAB. Описываемая здесь бактериальная культура может представлять собой мезофильную культуру, состоящую из мезофильных бактерий, имеющих оптимальную температуру роста около 30 С. "Мезофильная культура" представляет собой культуру, которая включает два или несколько разных мезофильных вида LAB. Типичные организмы, относящиеся к мезофильной группе, включают Lactococcus subsp. lactis, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis и Lactobacillus casei subsp. casei. Термофильные виды молочно-кислых бактерий включают, например, Streptococcus thermophilus, Enterococcus faecium, Lactobacilluslactis, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Lactobacillus acidophilus. Описываемая здесь бактериальная культура может включать LAB, которые неспособны утилизировать сахарозу. Для получения сыра без дырочек (Cheddar, Cheshire, Feta) используют так называемую Окультуру, которая обычно включает один или несколько организмов, выбранных из группы, включающей Lactococcus lactis subsp. lactis и Lactopcoccus lactis subsp. cremoris. B большинстве случаев считают,что О-культуры не утилизируют сахарозу. Высококонцентрированные и замороженные в виде гранул культуры молочно-кислых бактерий Описанные здесь замороженные культуры представляют собой культуры, которые в пищевой промышленности могут быть названы высококонцентрированными замороженными в виде гранул культурами молочно-кислых бактерий. Чтобы содержать достаточное количество бактерий, такие культуры должны быть относительно большими (иметь достаточный вес) в сочетании с относительно высокой концентрацией жизнеспособных бактерий. Понятно, что если требуется больше бактерий, то вес и/или концентрацию жизнеспособных бактерий следует увеличить. Предпочтительно описываемая здесь замороженная в виде гранул культура молочно-кислых бактерий (LAB) содержит по меньшей мере 100 г замороженного материала, более предпочтительно по меньшей мере 250 г замороженного материала, еще более предпочтительно по меньшей мере 500 г замороженного материала и наиболее предпочтительно по меньшей мере 900 г замороженного материала. Предпочтительно вес замороженного материала составляет менее 500 кг. Предпочтительно описываемая здесь замороженная в виде гранул культура молочно-кислых бактерий (LAB) содержит в 1 г замороженного материала жизнеспособных бактерий по меньшей мере 5109 колониеобразующих единиц (CFU), более предпочтительно содержит в 1 г замороженного материала жизнеспособных бактерий по меньшей мере 101010 колониеобразующих единиц (CFU) и наиболее предпочтительно содержит в 1 г замороженного материала жизнеспособных бактерий по меньшей мере 21010 колониеобразующих единиц (CFU). Условия ферментации и подходящие для LAB ферментационные среды известны в данной области техники, и квалифицированные специалисты умеют выбирать подходящие среды и условия ферментации применительно к конкретным LAB. Состав подходящих сред и условия ферментации представлены в данном описании в разделе рабочих примеров. Для получения достаточного количества бактерий в данном случае предпочтительно осуществить масштабную ферментацию в подходящих больших ферментерах. Предпочтительны ферментеры объе-5 010855 мом по меньшей мере 50 л, предпочтительно по меньшей мере 90 л, еще более предпочтительно по меньшей мере 500 л или более. После осуществления ферментации культивированные жизнеспособные бактерии выделяют путем удаления жидкости (супернатанта) из данной ферментационной среды (например, путем центрифугирования). Эти выделенные жизнеспособные бактерии можно называть выделенной биомассой. Указанные выделенные жизнеспособные бактерии предпочтительно содержат в 1 г замораживаемого материала по меньшей мере 109 колониеобразующих единиц (CFU), более предпочтительно по меньшей мере 5109CFU и наиболее предпочтительно содержат в 1 г замораживаемого материала по меньшей мере 1010 CFU. Затем в концентрированную культуру вводят добавку (см. ниже). Данную культуру можно легко заморозить путем введения полученной смеси по каплям в жидкий азот, получая зерна или гранулы данной смеси. Подходящий способ замораживания описан в DE 2805676 и FR 2393251. Затем замороженную в виде гранул культуру подходящим образом упаковывают для использования потребителем. Добавка Как указано выше, предпочтительно подходящие добавки характеризуются тем, что они способны увеличивать Tm' данной замороженной культуры до величины выше температуры хранения, например-46 С, до Tm' от -45 до -15 С, более предпочтительно до Tm' от -43 до -15 С и еще более предпочтительно до Tm' от -39 до -15 С. Приведенный здесь пример 2 иллюстрирует быстрый экспериментальный способ для идентификации подходящих добавок. К "модельной" замораживаемой культуре со значением Tm' ниже -46 С (в примере 2 "модельная" культура имеет Tm'=54 С) вводят различные добавки (10% вес./вес.), и даннуюTm' измеряют с помощью DSC до и после введения добавки. Используемая в примере 2 "модельная" культура и протокол опыта в данном примере 2 предпочтительно применяют для оценки всякий раз, когда конкретные представляющие интерес добавки могут характеризоваться тем, что они способны увеличить температуру начала таяния (Tm') замороженной культуры до величины выше -46 С, например до Tm' от -45 С до -15 С, более предпочтительно до Tm' от-43 С до -15 С, еще более предпочтительно до Tm' от -39 С до -15 С. В рабочем примере 2 можно видеть, что циклодекстрин увеличивает Tm' до -44 С, мальтит увеличивает Tm' до -42 С, трегалоза увеличивает Tm1 до -38C, рыбий желатин увеличивает Tm' до -37C,мальтодекстрин увеличивает Tm' до -32 С, аэрозольая камедь увеличивает Tm' до -31 С. Предпочтительно используемая добавка является соединением с молекулярной массой (MW) от 150 до 100000 г/моль, более предпочтительно 250-100000 г/моль, еще более предпочтительно от 300 до 40000 г/моль и наиболее предпочтительно от 500 до 15000 г/моль. В предпочтительном варианте изобретения используемая добавка также является криозащитным агентом. Используемый термин "криозащитный агент" означает вещество, которое способно улучшить стабильность данной замороженной культуры при ее хранении, что определяют по жизнеспособности данной культуры. Согласно изобретению, указанный агент может быть единственным конкретным криозащитным агентом или же он может быть представлен двумя или более разными агентами. Соответственно, весовое содержание (% вес./вес.) данного криозащитного агента(ов) в материале культуры следует воспринимать как суммарное количество криозащитного агента(ов). Подходящий криозащитный агент можно предпочтительно выбрать из белков или белковых гидролизатов. Предпочтительные подходящие примеры включают белки или белковые гидролизаты, выбранные из группы, состоящей из солодового экстракта, порошкового обезжиренного молока, порошковой сыворотки молока, дрожжевого экстракта, глютена, коллагена, желатины, эластина, кератина и альбуминов. Более предпочтительно криозащитный агент представляет собой углевод или соединение, участвующее в биосинтезе нуклеиновых кислот. Предпочтительные подходящие углеводы включают углеводы, выбранные из группы, состоящей из пентоз (например, рибоза, ксилоза), гексоз (например, фруктоза,манноза, сорбоза), дисахаридов (например, сахароза, трегалоза, мелибиоза, лактулоза), олигосахаридов(например, раффиноза), олигофруктоз (например, actilight, fribroloses), полисахаридов (например, мальтодекстрины, ксантановая камедь, пектин, альгинат, микрокристаллическая целлюлоза, декстран, ПЭГ), а также сахарные спирты (сорбит, маннит). Наиболее предпочтительно криозащитный углевод представляет собой углевод с молекулярной массой (MW) от 150 до 100000 г/моль, более предпочтительно 250100000 г/моль, еще более предпочтительно от 300 до 40000 г/моль и наиболее предпочтительно от 500 до 15000 г/моль. В самом предпочтительном варианте изобретения добавка выбрана из группы, состоящей из циклодекстрина, мальтита, рыбного желатина, мальтодекстрина (предпочтительно мальтодекстрин DE2 мальтодектрин DE19), аэрольной камеди (например, порошковая камедь IRX 51693), инозин-5'монофосфата (IMP) и инозина. Используемая замороженная культура включает от 0,5 до 13 вес./вес.% добавки от веса замороженного материала, предпочтительно от 1 до 12%, более предпочтительно от 2 до 10% и еще более предпоч-6 010855 тительно от 5 до 10 вес./вес.% добавки от веса замороженного материала. По окончании ферментации введение определенной добавки, которая также может являться криозащитным агентом, в выделенные жизнеспособные бактерии (т.е. в биомассу) можно осуществить путем смешивания твердой добавки с выделенной биомассой в течение, например, 30 мин при подходящей температуре. Если используемая добавка является, например, мальтодекстрином, то подходящей температурой может быть комнатная температура. Альтернативно, стерильный раствор добавки можно смешать с выделенной биомассой. Способ получения культуры замороженных в виде гранул молочно-кислых бактерий (LAB) Как указано выше, второй объект изобретения относится к способу получения культуры замороженных в виде гранул молочно-кислых бактерий (LAB) из первого объекта изобретения, предусматривающему следующие стадии:(i) добавления к жизнеспособным бактериям добавки для получения по меньшей мере 50 г материала с содержанием жизнеспособных бактерий по меньшей мере 109 колониеобразующих единиц (CFU) в 1 г материала и включающего добавку в количестве от 0,5 до 13% вес./вес. от веса материала,(ii) замораживания материала для получения гранулированного замороженного материала и(iii) упаковывания гранулированного замороженного материала подходящим способом. Как указано выше, наиболее подходящие "проблематичные" культуры по изобретению являются гранулированными замороженными культурами молочно-кислых бактерий (LAB), которые без включения описанной здесь добавки имеют температуру начала таяния (Tm') от -70 до -46 С. Соответственно, в предпочтительном варианте изобретения перед введением добавки в соответствии с вышеуказанной стадией (i), установлено, что измеряемую Tm в данной замороженной культуре молочно-кислых бактерий (LAB), не включающей эту добавку, составляет от -70 до -46 или даже ниже. Перед введением определенной добавки в соответствии с вышеуказанной стадией (i) осуществляют тест на слипание (см. выше) и определяют, что отдельные гранулы молочно-кислых бактерий в данной замороженной культуре слипаются при температуре хранения -46 С. Предпочтительно после введения добавки измеряют Tm' в культуре замороженных молочно-кислых бактерий (LAB), включающей эту добавку, и подтверждают, что Tm' превышает -46 С, составляя предпочтительно от -45 до -15 С, более предпочтительно от -43 до -15 С и еще более предпочтительно от-39 до -15 С. Наконец, после введения добавки данную культуру замораживают в виде гранул и проводят тест на слипание гранул (см. выше), обеспечивая, чтобы по меньшей мере 80 из 100 отдельных гранул сохранялись в виде не связанных между собой, отдельных одиночных гранул. Применение замороженной культуры молочно-кислых бактерий (LAB) Описанную здесь замороженную культуру молочно-кислых бактерий (LAB) можно использовать в процессе получения пищевого или кормового продукта в соответствии с областью техники, в которой используют настоящее изобретение. Примеры Пример 1. R604-E (коммерчески доступная замороженная О-культура, Chr. Hansen A/S, Дания) обнаруживает тенденцию к слипанию гранул во время хранения в замороженном состоянии. В настоящем исследовании данная проблема граничит с близкой точкой зрения на температуру начала таяния и попытку увеличить ее добавлением казеината, сахарозы или мальтодектрина. Цель. Определить, если это возможно, как поднять температуру начала таяния F-DVS R604-E путем применения добавок. Эффект от применения добавок для увеличения температуры начала таяния R604-E определяют визуально и путем измерения Tm' с помощью DSC для каждой испытываемой композиции.i) Материал. 2 кг коммерчески доступной культуры F-DVS R 604-E (Chr. Hansen A/S, Hoersholm, Дания, партия 2441258, композит 616581).ii) Растворы добавок, используемые для композиции, которые повышают температуру начала таяния. 50% (вес./вес.) раствор сахарозы (Danisco, Дания). 10% (вес./вес.) раствор Na-казеината (Arla, Дания). 30% (вес./вес.) раствор мальтодекстрина DE 10 (Glucidex 10, Roquette Freres, Lestrem, Франция). 30% (вес./вес.) раствор мальтодектрина DE 2 (Glucidex 2, Roquette Freres, Lestrem, Франция).iii) Рецепт составления композиции F-DVS R604-E. Данный замороженный концентрат оттаивают и смешивают с добавками в соответствии с табл. 1.) г сухого вещества добавки/г концентрата Визуальное определение температуры начала таяния F-DVS R604. В жидком азоте замораживают в виде гранул бактериальные клетки 6 композиций F-DVS R-604 E,после чего в чашки Петри насыпают 100 отдельных гранул (около 20-30 г), образующих, таким образом,тонкий слой отдельных, одиночных гранул. Один образец каждой композиции помещают в морозильник, установленный на температуру -50 С,при этом действительная температура каждого образца составляет -46 С. После 7 дней хранения замороженные образцы обследуют, чтобы определить, обособлены ли они или же данные гранулы создали скопления или кажутся слипшимися, и если это так, то увидеть их способность вновь расслоиться на отдельные частицы при встряхивании. Таблица 2 Визуальный осмотр замороженных гранул и измерение Tm'- = Скопление, уплотненное или слипшееся (менее 20 из 100 отдельных гранул сохраняются в виде отдельных одиночных гранул).+ = Частично отдельные частицы (менее 60 из 100 гранул сохраняются в виде отдельных одиночных гранул).= Почти отдельные частицы (по меньшей мере 80 из 100 отдельных гранул сохраняются в виде отдельных одиночных гранул).= Отдельные частицы (по меньшей мере 90 из 100 гранул сохраняются в виде отдельных одиночных гранул).-8 010855 Измерение Tm'. Образцы приготавливают в 100 мкл тиглях из глинозема и замораживают в жидком азоте. Один образец из каждой композиции и F-DVS R604 помещают на 6 дней при -46C. Фазовый переход измеряют на дифференциальном сканирующем калориметре (DSG) Mettler Toledo 822e в 100 мкл тиглях из глинозема, с программируемой температурой, температура при их помещении в калориметр -90 С, программируемая температура при сканировании 5 С/мин -130-0C. Измеряют Tm' (температуру начала таяния, Roos (1995. Результаты представлены в табл. 2. Авторами обнаружено, что использование 6% сахарозы и 6% мальтодекстрина (2 или 10) увеличивает Tm' замороженных гранул. Какой-либо эффект Na-казеината заметить не представляется возможным. При визуальном осмотре 10% сахароза и два разных мальтодекстрина демонстрируют положительный эффект, противоположный тенденции образования слежавшихся гранул. Пример 2. Цель. Чтобы выяснить, какого рода добавки могли бы увеличить температуру начала таяния замороженной культуры, осуществляют скрининговое исследование. Тестируют следующие добавки: трегалозу,мальтодекстрин 12, циклодекстрин, порошковую камедь, ПЭГ, рыбий желатин, мальтит, хлорид натрия,глицерин.F-DVS R604-Е (партия 2471755, композит 616581); что касается подробностей - обращайтесь к примеру 1.ii) Используемые в композиции растворы добавок для повышения температуры начала таяния. 50% (вес./вес.) трегалоза. 30% (вес./вес.) мальтодекстрин DE 12 (Glucidex 12, Roquette Freres, Lestrem, Франция). 30% (вес./вес.) циклодекстрин. 30% (вес./вес.) ПЭГ (ПЭГ 6000, Merck, Германия). 30% (вес./вес.) рыбий желатин 200 (SKW Biosystems, Франция). 30% (вес./вес.) мальтит. 30% (вес./вес.) хлорид натрия. 30% глицерин.iii) Рецепт составления композиции F-DVS R604-E. Замороженный концентрат F-DVS R604-E оттаивают и смешивают с разными добавками до конечного соотношения 10% (вес./вес.). Измерение Tm'. Образцы приготавливают в 100 мкл тиглях из глинозема и замораживают в жидком азоте. Кривые фазового перехода для 9 композиций регистрируют на дифференциальном сканирующем калориметреMettler Toledo 822e и сравнивают со стандартным образцом (R604E без добавок). Образцы вставляют вDSC при -90 С и запускают, используя температурную программу: температура при помещении тигля в сканирующий калориметр -90 С; температура сканирования 7 С/мин от -130 до 0 С. Результат. Получают кривые фазового перехода и определяют Tm' по Roos (1991), которые приведены ниже в табл. 3. Таблица 3 Наблюдаемые Tm' (C) Установлено, что Tm' для стандартного образца составляет -54C (начало плавления). Нижеследующие добавки увеличивают Tm': ПЭГ (-53C). Циклодекстрин (-44C).-9 010855 Мальтит (-42C). Трегалоза (-38C). Рыбий желатин (-37C). Мальтодекстрин 12 (-32C). Порошковая камедь (-31C). Глицерин и хлорид натрия не повышают температуру начала таяния замороженных гранулированных культур. Пример 3. В данном опыте определяют взаимосвязь между количеством добавки и увеличением Tm', измеряемой в DSC.ii) Используемые для композиции растворы добавок, повышающих температуру начала таяния. Концентрация сахарозы на 1 г биомассы варьирует от 3% (вес./вес.) до 13% (вес./вес.). Трегалозу тестируют только на уровне 5% (вес./вес.). Все концентрации сахарозы готовят из 50%-го (вес./вес.) раствора сахарозы, приливаемого к данной биомассе. Концентрацию трегалозы готовят из 40%-го (вес./вес.) раствора. Измерение Tm'. Замороженный концентрат F-DVS R604-E оттаивают и смешивают с разными добавками, как указано в табл. 4. Затем образцы переносят в 100 мкл-овые тигели из оксида алюминия и замораживают в жидком азоте, после чего хранят до анализа при -46 С. Кривые фазового перехода регистрируют в DSC для тестируемых 8 композиций и сравнивают со стандартным образцом (R604E без добавок). Данные образцы вставляют в DSC при температуре -90 С и запускают с использованием температурной программы: температура при вставлении в DSC -90 С; температура сканирования: 5 С/мин -130-0C.Tm' определяют, исходя из кривых фазового перехода. Корреляция между Tm' и количеством добавляемых дисахаридов показана на фиг. 1. Из фиг. 1 следует, что 8% сахарозы и более концентрированные сахарозы гарантируют, что данная замороженная культура не начнет таять при -46 С. Пример 4. Коммерчески доступные культуры из Chr. Hansen A/S, Дания (HP, HPS, HP-1, LP, LL-2) анализируют в отношении температуры начала таяния перед и после добавления мальтодекстрина (Glucidex 12 изRoquette Freres, Lestrem, Франция). Данные продукты продают в виде замороженных гранулятов, и они должны сохраняться отдельными для надежной защиты температуры начала таяния выше температуры хранения. Цель настоящего исследования состоит в повышении температуры начала таяния выше температуры хранения с тем, чтобы обеспечить отдельные гранулы. Материалы и методы.Glucidex 12 (Roquette Freres, Lestrem, Франция) используют в качестве добавки. Используют 100 г каждой культуры, перечисленных в табл. 5. В указывает на то, что глицерин не приливают к данной культуре, тогда как А указывает на то, что перед замораживанием гранулята к нему приливают 10% об./об. глицерина.ii) Состав композиционных образцов. Концентраты замороженных культур оттаивают и смешивают с разными количествами раствораGlucidex 12 до конечного соотношения 3,5%-10,1 (вес./вес.). В табл. 6 представлен перечень разных композиций. Таблица 6 Образцы композиций, температура начала таяния (Tm') и визуальный осмотр замороженных гранул- означает скомковавшийся, слежавшийся или слипшийся (менее 20 из 100 отдельных гранул сохраняются в виде отдельных одиночных гранул) материал.означает отдельные частицы (по меньшей мере 90 из 100 отдельных гранул сохраняются в виде отдельных одиночных гранул).iii) Измерение Tm'. Соответствующие образцы приготавливают в 100 мкл тиглях из глинозема. Кривые фазового перехода у всех данных композиций регистрируют в DSC Mettlet. Данные образцы вставляют в DSC при-90 С. Программируемая сканирующая температура 7 С/мин -100-0 С.iii) Визуальное определение температуры начала таяния F-DVS R604. Данные композиции замораживают в виде гранул в жидком азоте, после чего 100 отдельных гранул(около 20-30 г) из полученного гранулята насыпают в чашки Петри, создавая, таким образом, тонкий слой отдельных единичных гранул. Один образец из каждой композиции помещают в температуру-46 С. После 14 дней хранения данные образцы обследуют, чтобы удостовериться, что они все еще обособлены или, в том случае, если они образовали скопления или видятся слипшимися, удостовериться в их способности вновь расслоиться на отдельные частицы при встряхивании. Результаты. Результаты добавления мальтодекстрина (Glucidex 12) к разным культурам в различном количестве представлены на фиг. 1. Очевидно, что увеличение концентрации мальтодекстрина увеличивает Tm'. В табл. 2 приведены результаты оценок слипания/комкования. Образцы с Tm' выше температуры хранения-46 С представляют собой отдельные гранулы, тогда как образцы, имеющие Tm' ниже -46 С, оказываются слипшимися.- 11010855 Полученный результат иллюстрируется в табл. 6 и на фиг. 2 и показывает, что мальтодекстрин является эффективным агентом, который увеличивает Tm' в культурах, содержащих 10% об./об. глицерина(А-серия), а также в культурах, не содержащих глицерина (В-серия). Кроме того, данный эксперимент демонстрирует, что хорошо известный криопротектор (т.е. глицерин) не может использоваться для увеличения физической стабильности во время хранения замороженных в виде гранул культур. БиблиографияWO 2004/065584 A1 (Bisgaard-Frantzen et al.) 5 August 2004 (similar to International Application Number PCT/DK 2004/000025). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Замороженная в виде гранул культура молочно-кислых бактерий (LAB) в коммерческой упаковке, которая включает по меньшей мере 50 г замороженного материала, причем данный замороженный материал представлен отдельными гранулами, имеет содержание бактерий, составляющее по меньшей мере 109 колониеобразующих единиц (CGU) на грамм замороженного материала и включает от 0,5 до 13 вес.% добавки от веса замороженного материала, причем указанная добавка выбрана из группы, состоящей из циклодекстрина, мальтита, трегалозы, рыбьего желатина, мальтодекстрина, дрожжевого экстракта и порошковой камеди, и при использовании 10 вес.% добавки от веса замороженного материала она способна увеличить Tm' (температуру начала таяния) замороженной культуры LAB, которая без добавки имеет Tm' от -70 до -46 С, до значения Tm' выше -46 С, например от -45 до -15 С (измеряемого дифференциальной сканирующей калориметрией), при этом указанная замороженная культура LAB характеризуется тем, что при хранении при температуре около -46 С в течение 7-14 дней отдельные гранулы не слипаются, и потому культура в значительной мере сохраняется в виде отдельных гранул, что определяется нижеследующим тестом: 100 отдельных гранул культуры, полученных замораживанием в жидком азоте (около 5-100 г гранул), насыпают в чашку Петри, образуя при этом тонкий слой отдельных одиночных гранул, причем этот слой характеризуется тем, что большая часть данных гранул находится в физическом контакте с одной или несколькими соседними гранулами, оставляют на 7-14 дней при температуре около -46 С и проверяют, являются ли данные гранулы все еще отдельными или образовали комки или слипшиеся гранулы,причем критерием сохранения отдельных гранул является то, что по меньшей мере 80 из 100 гранул сохраняются в виде отдельных гранул; за исключением замороженной культуры LAB, которая включает молочно-кислые бактерии, способные утилизировать сахарозу, и которая включает криозащитный агент, выбранный из группы, состоящей из сахарозы в количестве от 2 до 13 вес.% от веса замороженного материала, трегалозы в количестве от 4 до 6 вес.% от веса замороженного материала, а также из смеси трегалоза/сахароза в количестве 13 вес.% от веса замороженного материала. 2. Замороженная в виде гранул культура по п.1, представляющая собой смешанную мезофильную культуру, состоящую из мезофильных бактерий, имеющих оптимальную температуру роста около 30 С. 3. Замороженная в виде гранул культура по п.1 или 2, в которой используемые LAB выбраны из группы, включающей Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp., в том числе Lactococcus lactis subsp. lactis и Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus spp., в том числеLactobacillus acidophilus, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Oenococcus spp., и виды грибов, включающие Penicillium spp., Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., Klyveromyces spp. и Saccharomyces spp. 4. Замороженная в виде гранул культура по любому из пп.1-3, которая включает от 5 до 10 вес.% добавки от веса замороженного материала. 5. Способ получения замороженной в виде гранул культуры молочно-кислых бактерий (LAB) по(i) добавления к жизнеспособным бактериям добавки для получения по меньшей мере 50 г материала с содержанием жизнеспособных бактерий в 1 г материала по меньшей мере 109 колониеобразующих единиц (CFU), и включающего добавку в количестве от 0,5 до 13 вес.%, предпочтительно от 5 до 10 вес.% от веса замороженного материала, причем указанная добавка выбрана из группы, состоящей из циклодекстрина, мальтита, трегалозы, рыбьего желатина, мальтодекстрина, дрожжевого экстракта и порошковой камеди;(ii) замораживания материала для получения замороженного в виде гранул материала и(iii) упаковки замороженного в виде гранул материала подходящим способом для получения упакованной культуры замороженных молочно-кислых бактерий (LAB) по любому из пп.1-4,при этом перед введением добавки на стадии (i) измеряют Tm' замороженной в виде гранул культуры молочно-кислых бактерий (LAB), не включающей эту добавку, и определяют, что она имеет Tm' от-70 до -46 С; и после введения добавки измеряют Tm' в замороженной в виде гранул культуре молочнокислых бактерий (LAB), включающей эту добавку, и проверяют, чтобы данная Tm' составляла от -49 до-15 С, более предпочтительно от -39 до -15 С. 6. Способ по п.5, в котором указанная культура является смешанной мезофильной культурой, состоящей из мезофильных бактерий с оптимальной температурой роста около 30 С. 7. Способ по любому из пп.5, 6, в котором указанные LAB выбраны из группы, включающей Bifidobacterium spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp., Lactococcus spp., в том числе Lactococcuslactis subsp. lactis и Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus spp., в том числе Lactobacillus acidophilus, Streptococcus spp., Enterococcus spp., Pediococcus spp., Oenococcus spp., и виды грибов, в числе которых Penicillium spp., Cryptococcus spp., Debraryomyces spp., Klyveromyces spp. и Saccharomyces spp. 8. Замороженная в виде гранул культура молочно-кислых бактерий (LAB), полученная способом по пп.5-7. 9. Применение замороженной в виде гранул культуры молочно-кислых бактерий (LAB) по любому из пп.1-4 и 8 в процессе получения пищевого или кормового продукта.