Клонированный штамм вируса осповакцины, способ его получения и применение штамма в качестве вакцины

007656 Настоящее изобретение относится к способам и композициям для применения в вакцинации против натуральной оспы. Предпосылки изобретения Вирус оспы, возбудитель натуральной оспы, относится к роду Orthopoxvirus, который также включает вирусы оспы обезьян, оспы коров и вирусы осповакцины. Заболевание, вызываемое основными штаммами вируса натуральной оспы, характеризуются низкой инфекционной дозой (10-100 вирионов),длительным инкубационным периодом (в среднем 12 дней), лихорадкой, органическими симптомами,резким переходом на стадию пустул, смертностью среди заболевших до 30% и образованием рубцов на лице у выживших. Заболевание передается от человека к человеку респираторным путем при контакте(капельным) и, возможно, воздушным путем. Натуральная оспа была одной из наиболее важных причин заболеваемости и смертности во всем мире в период первой половины XX века. Однако, отчасти вследствие исчерпания животного резервуара для вируса, систематическое применение вакцины (живого, аттенуированного вируса осповакцины) было высокоэффективным в борьбе с данным заболеванием. Действительно, в 1967-1977 гг. проведение глобальной программы по борьбе с натуральной оспой привело к ликвидации естественного заболевания(Fenner et al., WHO, Женева, р.1460, 1988). Ввиду отсутствия натуральной оспы и риска проявления побочных реакций при вакцинации была прекращена поголовная вакцинация детей, персонала больниц и военнослужащих, и в настоящее время иммунизации подвергаются только люди, работающие с вирусами осповакцины и близкими к ним вирусами в лабораториях. Таким образом, подавляющая часть населения планеты не имеет иммунитета к вирусу натуральной оспы. У остальной части населения имеется незначительный остаточный иммунитет, поскольку иммунитет после первичной вакцинации сохраняется только в течение 5 лет и менее 20 лет после повторной вакцинации. Таким образом, ликвидация натуральной оспы и прекращение вакцинации привело к низкой защищенности населения к нападению с использованием в качестве биологического оружия вируса натуральной оспы. В случае, если такое событие произойдет, то эпидемия распространится беспрепятственно при отсутствии иммунного барьера у населения(Anon. (Editorial), Lancet 353:1539, 1999; Henderson, Science 283:1279-1282, 1999; Henderson et al.,J.A.M.A. 218:2127-2137, 1999). В результате неопределенности вокруг ликвидации натуральной оспы для использования в чрезвычайных обстоятельствах создан запас вакцины. Например, в США первоначально был сделан запас 155000 ампул с вакциной (номинально 15,5 млн. доз) производства Wyeth Laboratories под контролем Центров борьбы и профилактики заболеваний (CDC), Atlanta, Georgia, США. На встрече Национального консультативного комитета по вакцинам в январе 1999 г. CDC сообщили о состоянии национального запаса вакцины против натуральной оспы. На тот период времени из 15,5 млн доз производства Wyeth 3,4 млн доз не прошло контроля качества, и значительно истек срок годности 10,3 млн доз, определенного последним контрольным тестированием, и в итоге оставалось 1,7 млн доз, которые соответствовали требованиям (LeDuc, Presentation to the National Vaccines Advisory Committee, Washington D.C., Jan. 1112, 1999). В дополнении к ограниченным запасам вакцину упаковывают в ампулах по 100 доз, что усложняет ее распределение и повышает вероятность ее утраты в чрезвычайном положении. Помимо запаса в США имеется запас вакцины (штамм Элстри, Институт Листера) в Национальном институте здравоохранения, Bilthoven, Нидерланды, и некоторые другие страны имеют запасы вакцины против натуральной оспы, которые к моменту ликвидации могли включать до 300 млн доз. Однако аналогичные проблемы стабильности при хранении уменьшают эти запасы до менее чем 50 млн доз (Henderson, Science 283:1279-1289, 1999). Краткое описание изобретения Изобретение относится к стабильным штаммам вируса осповакцины, выделенным из культивированных клеток, на которых культивируют Dryvax, и обладающим свойствами, которые делают их подходящими для применения в качестве вакцин для человека против натуральной оспы. Также изобретение относится к способам получения таких штаммов и к способам их применения для профилактики инфицирования вирусом натуральной оспы и этого заболевания. Следовательно, в первом аспекте изобретение относится к штамму вируса осповакцины, полученный клонированием штамма Dryvax в клеточной системе или культивированием клона, выделенного изDryvax, в клеточной системе, который, при введении человеку в количестве, эффективном для индукции защитного или терапевтического иммунного ответа против вируса натуральной оспы у указанного человека, оказывается в достаточной степени ослабленным и который обладает, в основном, такими же вирулентностью, иммуногенностью и характером расщепления рестриктазой, что и штамм Dryvax, и продуцируется, в основном, в таких же или больших количествах, что и штамм Dryvax, в культуре клеток. Клональный штамм также может обладать, например, в основном такой же вирулентностью и/или иммуногенностью, что и штамм вируса осповакцины АСАМ 1000 (депонирован в Американской коллекции типовых культур под номером РТА-3321 19 апреля 2001 г.; см. клон 2 ниже) при тестировании на соответствующих животных моделях или на людях. Предпочтительно такой вирус осповакцины получают в основном в таких же или больших количествах, что и штамм вируса осповакцины АСАМ 1000, при-1 007656 посеве на клеточных культурах, и/или он обладает в основном таким же характером расщепления, что и штамм вируса осповакцины АСАМ 1000, при расщеплении рестриктазой. Один пример вируса осповакцины, который включен в изобретение, представляет собой АСАМ 1000 (депозитарный номер в Американской коллекции типовых культур РТА-3321). Во втором аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей клональный штамм вируса осповакцины, описанный выше или далее, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В третьем аспекте изобретение относится к способу профилактики или лечения инфекции, вызываемой вирусом натуральной оспы, у пациента введением такой фармацевтической композиции пациенту, а также к применению такой композиции для этой цели, а также к применению такой композиции при получении лекарственного средства для этой цели. Фармацевтическую композицию можно вводить пациенту, например, при скарификации в количестве в пределах, например, от 1 х 104 до 1 х 106 бляшкообразующих единиц. В четвертом аспекте изобретение относится к способу получения клонального штамма аттенуированного вируса осповакцины для применения в качестве вакцины. Этот способ включает: (i) культивирование Dryvax в системе для культивирования клеток и (ii) выделение из системы для культивирования клеток клонального штамма вируса осповакцины, который обладает в основном такой же вирулентностью, иммуногенностью, характеристиками роста в культуре или характером расщепления рестриктазой,что и Dryvax или штамм вируса осповакцины АСАМ 1000. Вирулентность вируса осповакцины можно тестировать данным способом, например, в кожном тесте на кроликах или в тесте нейровирулентности на новорожденных мышах. Характеристики роста в культуре можно определить с использованием, например, человеческих диплоидных клеток (MRC-5). Предпочтительно вирус осповакцины, идентифицированный с использованием данного способа, при введении человеку в количестве, эффективном для индукции защитного или терапевтического ответа против вируса натуральной оспы у человека, является в достаточной степени авирулентным для человека. Изобретение обеспечивает несколько преимуществ. Например, ранее вакцину против натуральной оспы получали введением вируса осповакцины в кожу телят с последующим соскабливанием кожи телят для получения живого вируса. Неочищенный вирусный препарат, полученный при минимальной очистке перед применением для вакцинации людей, оставлял возможность проявления патогенности. Вакцины по настоящему изобретению получают в системе для культивирования клеток, которая приемлема для современных способов производства вакцин, и они являются высокоочищенными, что устраняет данную проблему. Дополнительным преимуществом применения клонированных вирусов, таких как описаны согласно настоящему изобретению, является то, что свойства подобных вирусов с малой вероятностью изменяются во время культивирования и производства вакцины по сравнению со смешанными популяциями вирусов. Действительно заявитель показал, что вирус по изобретению сохраняет свой фенотип при повторных пассажах и культивировании в культуре клеток, не содержит примесей и способен продуцироваться в культуре клеток в количествах, подходящих для широкомасштабного производства вакцин. Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из последующего подробного описания, фигур и формулы изобретения. Краткое описание фигур Фиг. 1 А-1D представляют собой ряд графиков, на которых представлены результаты опытов, в которых новорожденных мышей заражали указанными клонами вируса осповакцины, поликлональным препаратом вируса осповакцины или Dryvax. Показано число выживших мышей и среднее время выживания после заражения. На фиг. 2 представлен анализ расщепления рестриктазой HindIII вакцинных клонов по изобретению по сравнению с поликлональным вирусным препаратом и Dryvax. Подробное описание Изобретение обеспечивает клональные штаммы аттенуированных вирусов осповакцины, которые можно использовать в способах вакцинации против натуральной оспы (т.е. вируса натуральной оспы). Как дополнительно описано ниже, аттенуированные вакцинные штаммы по изобретению получают выделением вакцинных клонов из культур клеток, на которых культивируют Dryvax. Изобретение также обеспечивает способы применения вакцин, которые включают данные вирусы осповакцины, в профилактике натуральной оспы, а также способы получения таких клональных штаммов вирусов осповакцины. Вакцины поизобретению получают из Dryvax, и они имеют свойства, аналогичные свойствамDryvax (штамм Нью-Йоркского отдела здравоохранения, Wyeth Laboratories), который в настоящее время имеет официальное разрешение Управления по санитарному надзору за продуктами питания и лекарственными препаратами (FDA), и представляет собой смешанную популяцию вирусов осповакцины, полученную на коже теленка. Вакцины должны иметь соответствующим образом ослабленную вирулентность для людей, которых вакцинируют ими. Подходящий уровень ослабления может быть, например,уровнем, аналогичным (например, статистически достоверно не отличается от) таковому для Dryvax, и его можно определить любым из тестов в условиях in vitro или in vivo, описанным ниже. Вирус осповак-2 007656 цины обладает нейротропизмом, или способностью к репликации в клетках центральной нервной системы, вызывая воспаление (например, энцефалит). Предпочтительно, вакцины по изобретению являются не более нейротропными по сравнению с Dryvax и не вызывают поствакцинальный энцефалит у подвергшихся вакцинации пациентов. Вакцины и способы по настоящему изобретению дополнительно описаны ниже. Показания для применения Основным показанием для применения вакцин по изобретению является профилактика натуральной оспы у населения, подвергшегося или при имеющейся потенциальной возможности воздействия вируса натуральной оспы после акта терроризма или нападения с применением биологического оружия. Эффективность вакцин по изобретению является преимущественно высокой (95%), и вакцины защищают как от распространения вируса от человека к человеку, так и воздействия биологического оружия через воздух. С учетом данного основного показания вакцины по изобретению можно использовать, например,для создания нового национального запаса вакцины против натуральной оспы (оспы коров), и ее производство должно продолжаться для ежегодного поддержания запаса вакцины на длительный период времени. Вакцины не предназначены для текущего применения, за исключением сотрудников лабораторий,которые подвергаются воздействию вирусов осповакцины, вируса оспы коров, оспы обезьян, натуральной оспы и других вирусов, относящихся к роду Orthopoxvirus. С другой стороны, вакцины следует применять в чрезвычайных ситуациях, что определяют органы национальной безопасности и здравоохранения. В таких чрезвычайных ситуациях риск проявления побочных реакций, связанных с вирусом осповакцины, будет перевешиваться потенциальным преимуществом защиты каждого человека от натуральной оспы и общества в целом от распространения заболевания. Понятно, что при применении вакцины в чрезвычайных ситуациях трудно контролировать, чтобы были вакционированы дети первого года жизни,для которых риск возникновения поствакционального энцефалита более высок, и чтобы учитывались предостережения и противопоказания для применения у людей с определенными состояниями (например, с экземой, у беременных и при иммуносупрессии). По этой причине важно, чтобы полученные в культуре клеток вакцины по изобретению были не более вирулентными по сравнению с официально разрешенными в настоящее время продуктами. В зависимости от событий, развитие которых трудно точно предугадать, может быть принято решение о проведении профилактической обработки некоторых групп населения еще перед воздействием вируса, включая военнослужащих, гражданский медицинский персонал и так называемых "сил быстрого реагирования". Свойственная данной вакцине безопасность для данных групп, имеющая большое значение, повышается при осторожном применении продукта и избежании ее применения у индивидуумов с факторами риска в отношении проявления побочных реакций. При таких обстоятельствах основной риск происходит от самозаражения, попадания вируса осповакцины на слизистую глаз и случайного заражения, при всех этих обстоятельствах имеется минимальное проявление побочных эффектов. Существует незначительный риск случайного заражения других людей. Конечно, если ход событий в стране или во всем мире изменится таким образом, что будет желательной текущая вакцинация других групп населения (например, детей) или даже всего населения, то вакцины по настоящему изобретению можно использовать для этих целей. Способы и количества для введения Вакцины по изобретению готовят культивированием желаемого штамма вируса осповакцины (например, штамма АСАМ 1000; депозитарный номер РТА-3321 в Американской коллекции типовых культур; смотри ниже) в системе культивирования клеток и выделением культивированного штамма с использованием обычных методов. Например, штамм можно культивировать на диплоидных фибробластах легких человека таких, как клетки MRC-5, первичных фибробластах куриного эмбриона или на любом другом подходящем типе клеток, который может определить специалист в данной области. Культивирование можно проводить с использованием соответствующей системы, например, такой как Nunc CellFactory. Выделенный вирус можно лиофилизовать для дальнейшего использования или сразу приготовить его в виде фармацевтического раствора. Многочисленные фармацевтически приемлемые растворы для применения в препарате вакцины хорошо известны в данной области, и их может легко адаптировать для применения по настоящему изобретению специалист в данной области (например, см. Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed A.Gennaro, 1990, Mack Publishing Co., Easton, PA). Однако вирусы можно просто разбавить в физиологически приемлемом растворе, таком как стерильный физиологический раствор или стерильный забуференный физиологический раствор, с или без адъюванта или носителя. В случае необходимости, фармацевтический раствор может содержать компонент, который обеспечивает вязкость (например, глицерин) и/или компонент, обладающий бактерицидными свойствами (например, фенол). Вакцины можно хранить при титре 107-109 бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл, например 108 БОЕ/мл. Вакцины по изобретению можно вводить пациентам, например, при скарификации кожи с использованием обычных методов. Например, при таком подходе можно использовать бифуркационную иглу.-3 007656 Альтернативно вакцину можно вводить с использованием любого другого обычного пути, который признан приемлемым специалистом в данной области. Например, вакцину можно вводить подкожной или внутрикожной инъекцией или другим парентеральным путем, таким как внутримышечный. Количество вакцины для введения взрослому человеку средней массы тела может составлять, например, 1 х 104-1 х 106 бляшкообразующих единиц. В качестве конкретного примера можно использовать 2,5 х 105 бляшкообразующих единиц. Предпочтительно вакцинацию проводят до воздействия вируса натуральной оспы, но вакцинацию можно также проводить у пациентов, уже подвергшихся воздействию вируса натуральной оспы, предпочтительно в течение нескольких дней после воздействия. Вакцинацию можно проводить только один раз в течение жизни человека или можно повторить после периода времени, исчисляемого несколькими годами (например, 5-10 лет), что определяет, как подходящий вариант, специалист в данной области. Идентификация возможных кандидатов для вакцины Изобретение также включает способы идентификации возможных кандидатов в качестве вируса осповакцины для вакцины. Подобные кандидаты могут быть установлены выделением клональных штаммов из культур клеток, на которые был проведен посев Dryvax, и характеристикой этих клонов с использованием любого из методов в условиях in vitro или in vivo, описанных ниже. Например, возможный кандидат для вакцинного штамма можно сравнить с Dryvax по величине бляшек, выходу в культуре клеток (с использованием, например, клеток MRC-5), вирулентности по кожной реакции у кроликов,нейровирулентности у новорожденных мышей, нейровирулентности у обезьян или защите на мышиной модели с заражением. Предпочтительными кандидатами являются такие, которые обладают вирулентностью, близкой или ниже, чем у Dryvax, которые индуцируют защитный иммунитет, близкий или выше,чем Dryvax, и которые также обладают характеристиками роста, близкими или выше, чем Dryvax. До настоящего изобретения выделение клонального штамма, который обладал бы удовлетворительными характеристиками кандидата для вакцины, было непредсказуемым, поскольку длительная история пассажей вируса осповакцины привела к получению множественных субпопуляций вариантов (т.е. генетического скопления) с потенциально различными биологическими свойствами. Также является неопределенным, насколько отдельный вариант, полученный при выделении бляшек (т.е. биологическим клонированием), будет обладать теми же фенотипическими характеристиками, что и сумма многих вариантов в исходной смешанной популяции вирусов. Фактически до настоящего изобретения было бы удивительным само осуществление этого. Разработка и доклиническая характеристика вакцин по изобретению описана ниже. Разработка и доклиническая характеристика вакцин на основе вируса осповакцины Как описано выше, Dryvax представляет собой вакцину на основе вируса осповакцины, которая в настоящее время официально разрешена FDA, она происходит из штамма Нью-Йоркского отдела здравоохранения (NYCBH) и до 1982 года производилась Wyeth-Lederle способом с лимфой теленка (также см. депозитарный номер VR-352 в Американской коллекции типовых культур). Dryvax состоит из живого аттенуированного вируса осповакцины и не существует в виде продукта из культуры клеток. Заявитель адаптировал штамм вируса осповакцины для культивирования в контролируемых условиях в выращенных в лаборатории культурах фибробластов легких человека таким образом, что для производства вакцины можно использовать современные методы. Для разработки вакцины в культуре клеток заявитель должен был отделить Dryvax от возможных случайных загрязняющих вирусов пассажем при конечном разбавлении и сделал это с и без клонирования, как обсуждается дополнительно ниже. Из смеси вариантов (генетического скопления) в Dryvax заявитель выбрал возможные кандидаты для вакцины,которые обладают аналогичными биологическими свойствами на животных и геномной гомологией с официально разрешенной вакциной, обеспечив тем самым высокую степень уверенности, что они проявляют такую же эффективность в клинике, что и исходный продукт, полученный с лимфой теленка. При одной стратегии, использованной для адаптации, вирус осповакцины клонировали для отделения вируса от возможных загрязняющих микроорганизмов из кожи теленка. При использовании этой стратегии было выделено шесть клонов. Клонированные вирусы проявляли разнообразные свойства с большей или меньшей вирулентностью по сравнению с Dryvax. С учетом предполагаемой смеси вариантов в Dryvax в опытах по определению вирулентности на животных с удивлением было установлено,что три клона аналогичны Dryvax, и в основном они различаются только по скорости роста в культуре клеток. Любой из этих штаммов, а также другие с аналогичными характеристиками, можно использовать в способах вакцинации против натуральной оспы по изобретению. При другой стратегии вирус не клонировали, предполагая, что вирус, полученный данным способом, вероятно, будет в большей степени вести себя как штамм, из которого он получен. Однако заявитель с удивлением установил, что штамм, полученный без клонирования, обладая сходным с Dryvax поведением в тестах in vitro, не имеет свойств вакцинного штамма, и фактически является более вирулентным при тестировании на лабораторных животных. Таким образом, заявитель сконцентрировал свои усилия по разработке на клонированных вирусах со свойствами, аналогичными вакцинному штаммуDryvax. Детали характеристики заявителей являются следующими. Проводили посев Dryvax на культуры клеток MRC-5 и выделением бляшек получали шесть клонов-4 007656 вируса осповакцины. Каждый клон реклонировали дважды для гарантии клональности и отсутствия загрязняющих микроорганизмов. Dryvax также высевали на культуры клеток MRC-5 при титре (MOI) 0,001 БОЕ на клетку для получения неклонированного (поликлонального) вирусного препарата. Затем данный вирус еще раз дважды пассировали на клетках MRC-5 при низком значении MOI. Все шесть клонов и поликлональный препарат тестировали в широком ряду сравнительных тестов в сравнении с Dryvax на свойства, проявляемые в условиях in vitro и in vivo. В частности, для каждого клона и поликлонального препарата определяли морфологию бляшек, выход на клетках MRC-5, проводили картирование после обработки рестриктазой, оценивали образование оспинных пустул на коже у кроликов и нейровирулентность на мышах. Подгруппу клонов затем тестировали на индукцию защитного иммунитета у мышей. Целью исследований был отбор вакцинного штамма из пула Dryvax с биологическими свойствами, аналогичными Dryvax. В табл. 1 обобщены результаты этих исследований. Таблица 1. Характеристика 7 возможных кандидатов вируса осповакцины БОЕ/млх 106 По результатам этих исследований клоны 2 и 4 были идентифицированы, как обладающие свойствами, которые делают эти клоны подходящими для применения в качестве вакцины против натуральной оспы. Клон 6 также обладал подходящими характеристиками, но он не показывал такой же хороший рост в культуре, как клоны 2 и 4. Нейровирулентность на новорожденных мышах Было показано, что взрослые мыши не чувствительны к внутричерепному (IC) введению немодифицированного Dryvax. Следовательно, разработали тест на новорожденных мышах. Новорожденным мышам (в возрасте 3-4 дней) вводили десятикратные разведения вируса и определяли время выживания. Проводили три опыта, и в каждом в качестве стандарта использовали Dryvax. Заявители установили,что у новорожденных мышей, которым внутрь черепа вводили Dryvax, во всех случаях развивался энцефалит со смертельным исходом при LD50, равной 1,0 log10 БОЕ, и средним временем выживания, равным 7 суткам. Было установлено, что данный тест является подходящим для сравнения нейровирулентности возможных кандидатов для использования в качестве вакцины с исходным Dryvax. Результаты данных опытов обобщены в табл. 2, а число выживших мышей и установленное среднее время выживания в данном тесте представлены на фиг. 1 А-1D. Таблица 2. Нейровирулентность возможных кандидатов для использования в качестве вакцины на новорожденных мышах 50% летальная доза при внутричерепном введении 0,02 мл инокулята на 10 день после заражения,90% летальная доза при внутричерепном введении 0,02 мл инокулята на 10 день после заражения. 2 Среднее значение времени выживания, дней (стандартное отклонение) при 10-100 LD50. Для анализа вирулентности кандидатов для вакцины можно использовать дополнительные тесты. Например, заявитель разработал тест с вирулентностью на коже у кроликов. Данный тест был с успехом разработан для внутрикожного введения непассажированного Dryvax, который приводил к развитию зависимых от дозы пустулезных образований на коже, характеризующихся покраснением, индурацией и в некоторых случаях центральным участком поражения. В качестве другого примера можно использовать тест нейровирулентности на обезьянах. В этом тесте клонированный, происходящий от Dryvax,кандидат тестировали по сравнению с самим Dryvax при внутричерепном введении откалиброванных доз вируса. Заявитель также разработал тест по оценке защитного действия на модели с заражением мышей. На данной модели штамм вируса осповакцины WR использовали для заражения 6-8-недельных мышей при внутриназальном введении. LD50 равняется 4,5log10 БОЕ, и среднее время выживания составляет 6-7 суток после заражения. Тест является достаточно четким для применения в доклинических исследованиях новых кандидатов для вакцины. Также можно использовать аналогичные модели с другими Orthopoxviruses, такими, как вирус оспы коров. Тестировали способность Dryvax и клонов 2 и 4 индуцировать защитный иммунитет против заражения вирусом осповакцины WR у мышей. Клон 3 также тестировали для определения того, насколько клон с более высокой вирулентностью также индуцирует более сильный иммунный ответ. Мышей в возрасте четырех недель иммунизировали откалиброванными дозами каждого вирусного штамма. Вирус вводили внутрикожно скарификацией бифуркационной иглой, данный метод используют для инокуляции людей Dryvax. Через 3 недели после иммунизации мышей заражали 6,5 log10 БОЕ (100 LD50) вируса осповакцины WR интраназально. Определяли степень выживаемости в течение 14 суток после заражения. Имело место зависимое от дозы защитное действие для всех вирусных штаммов, и все клоны защищали мышей по меньшей мере так же, как Dryvax. Среди клонов отсутствовали различия в протективной активности. Значения среднего времени выживания при различных иммунизирующих дозах представлены в табл. 3, и значения 50% защитных доз (PD50) - в табл. 4. Таблица 3. Время выживания иммунизированных мышей после заражения 100 LD50 вируса осповакцины WR Анализ после обработки рестриктазой Выделяли ДНК из Dryvax и каждого кандидата для вакцины и подвергали расщеплению рестриктазой HindIII для определения того, имеются ли генетические различия между штаммами. Различий не было установлено, что было показано при анализе электрофорезом расщепленной геномной ДНК, как представлено на фиг. 2.-6 007656 Отбор клеточного субстрата Проводили исследования по репликации Dryvax и выходу на клетках MRC-5 и первичных фибробластах куриного эмбриона (CEF), и было показано, что выход на клетках CEF ниже, чем на MRC-5. Таким образом, выбрали клетки MRC-5 в качестве субстрата для получения вакцины. Кандидаты для вакцины можно тестировать на CEF или других клетках для сравнения выхода вакцины. Также проводили сравнение культуральной среды для клеток MRC-5. Среда Уильямса, минимальная базальная среда (MEM) и среда Игла в модификации Дульбекко давали одинаковые результаты. Обогащение сред дополнительным количеством фетальной бычьей сыворотки (FBS), заменимых аминокислот, витаминов и пирувата натрия не обеспечивало преимуществ по сравнению со средой с 10% FBS в отношении жизнеспособности клеток или роста. Кинетика роста MRC-5 при соответствующей плотности посева клеток была адекватной. Плотность посева клеток составляла 2 х 104 клеток/см 2. Было установлено, что время разложения составляет 3-5 суток, и соотношение удвоения популяции/разложения составляет 1-1,5. Определяли способ получения банка клеток и размножения клеток для роста вируса. Было установлено, что для разделения клеток подходит обычная обработка трипсином. Было показано, что можно использовать альтернативный метод с использованием проназы бактерий, и при этом можно избежать применения продуктов животного происхождения в производстве вакцин. Другие варианты осуществления изобретения представлены в последующей формуле изобретения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Штамм вируса осповакцины, полученный клонированием штамма Dryvax в клеточной системе или культивированием клона, выделенного из Dryvax, в клеточной системе, который при введении человеку в количестве, эффективном для индукции защитного или терапевтического иммунного ответа против вируса натуральной оспы у указанного человека, оказывается в достаточной степени ослабленным и который обладает, в основном, такими же вирулентностью, иммуногенностью и характером расщепления рестриктазой, что и штамм Dryvax, и продуцируется, в основном, в таких же или больших количествах, что и штамм Dryvax, в культуре клеток. 2. Штамм по п.1, представляющий собой штамм АСАМ 1000 РТА-3321. 3. Штамм по любому из пп.1 и 2, обладающий, в основном, такими же вирулентностью, иммуногенностью и характером расщепления рестриктазой, что и штамм АСАМ 1000 РТА-3321, и который продуцируется, в основном, в таких же или больших количествах, что и штамм АСАМ 1000 РТА-3321. 4. Фармацевтическая композиция, включающая штамм по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. 5. Применение фармацевтической композиции по п.4 для профилактики или лечения инфекции, вызванной вирусом натуральной оспы. 6. Применение по п.5, в котором указанную фармацевтическую композицию вводят указанному пациенту скарификацией. 7. Применение по п.5, в котором указанную фармацевтическую композицию вводят указанному пациенту в количестве в пределах от 1104 до 1106 бляшкообразующих единиц. 8. Способ получения штамма по любому из пп.1-3, включающий выращивание штамма Dryvax или клона, выделенного из Dryvax, в клеточной культуре, его клонирование и выделение клонированного штамма. 9. Способ по п.8, где вирулентность указанного вируса осповакцины определяют кожным тестом на кроликах. 10. Способ по п.8, где вирулентность указанного вируса осповакцины определяют тестом на нейровирулентность на новорожденных мышах. 11. Способ по п.8, где указанные характеристики роста в культуре указанного вируса осповакцины определяют с использованием клеток MRC-5.