Ослабленная популяция ротавирусов и содержащая ее вакцинная композиция

005952 Данное изобретение относится к новым вакцинным препаратам, способам их приготовления и их применению в лечении. В частности, настоящее изобретение относится к новым ротавирусным вакцинным препаратам. Острая инфекционная диарея представляет собой основную причину заболевания и смерти во многих областях мира. В развивающихся странах последствия диарейного заболевания ошеломляют. Для Азии, Африки и Латинской Америки установлено, что ежегодно здесь бывает от 3 до 4 миллиардов случаев диареи, и из них приблизительно 5-10 млн случаев заканчиваются смертью (Walsh, J. A. et al.: N.Engl. J. Med., 301: 967-974 (1979. Ротавирусы признаются одной из наиболее важных причин тяжелой диареи у младенцев и маленьких детей (Estes, M. К. Rotaviruses and Their Replication in Fields Virology, Third Edition, edited by Fields etal., Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Установлено, что заболевание, вызываемое ротавирусами, ответственно за более чем один миллион смертей ежегодно. Вызываемое ратавирусами расстройство обычно поражает детей в возрасте от 6 до 24 месяцев, и максимальное распространение заболевания, как правило случается во время более холодных месяцев в зонах с умеренным климатом и круглогодично - в тропических районах. Ротавирусы, как правило, передаются от человека к человеку фекально-оральным путем с инкубационным периодом, составляющим от приблизительно 1 до приблизительно 3 дней. В отличие от инфекции в возрастной группе от 6 до 24 месяцев, новорожденные, как правило, не обнаруживают симптомов заболевания или имеют лишь легкую форму заболевания. В противоположность тяжелому заболеванию, в норме встречающемуся у маленьких детей, большинство взрослых являются защищенными в результате перенесенной ранее ротавирусной инфекции, так что большая часть инфекций у взрослых протекает легко или бессимптомно (Offit, P. A. et al. Соmр. Ther., 8(8): 21-26, 1982). Ротавирусы, как правило, являются сферическими, и их название происходит от их характерной наружной и внутренней частей, или двухоболочечной структуры капсида. Как правило, двухоболочечная структура капсида ротавируса окружает внутреннюю белковую оболочку или сердцевину, которая содержит геном. Геном ротавируса состоит из 11 сегментов двухцепочечной РНК, которые кодируют по меньшей мере 11 характерных вирусных белков. Два из этих вирусных белков, обозначаемые как VP4 иVP7, расположены на внешней части двухоболочечной структуры капсида. Внутренний капсид ротавируса представляет один белок, который является ротавирусным белком, обозначенным как VP6. Относительная важность этих трех конкретных ротавирусных белков для индуцирования иммунного ответа,сопровождающего ротавирусную инфекцию, до сих пор не ясна. Тем не менее, белок VP6 определяет группу и подгруппу антигена, а белки VP4 и VP7 представляют собой детерминанты серотипической специфичности. Белок VP7 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 38000 (с молекулярной массой 34000 - для негликозилированного белка), который является продуктом трансляции геномного сегмента 7, 8 или 9 - в зависимости от штамма. Этот белок стимулирует образование главного нейтрализующего антитела, сопутствующее ротавирусной инфекции. Белок VP4 представляет собой негликозилированный белок, имеющий молекулярную массу приблизительно 88000, являющийся продуктом трансляции геномного сегмента 4. Этот белок также стимулирует нейтрализующее антитело, сопутствующее ротавирусной инфекции. Поскольку белки VP4 и VP7 представляют собой вирусные белки, против которых направлены нейтрализующие антитела, предполагается, что они являются первыми кандидатами для разработки ротавирусных вакцин, обеспечивающих защиту против ротавирусного расстройства. Известно, что естественная ротавирусная инфекция в раннем детстве индуцирует защитный иммунитет. Таким образом, живая ослабленная ротавирусная вакцина является весьма желательной. Предпочтительно она должна представлять собой пероральную вакцину, поскольку пероральный путь является естественным путем инфекции вируса. Ранее разработка вакцины для предотвращения ротавирусных инфекций началась в 1970-х гг. после открытия этого вируса. Сначала были изучены ослабленные штаммы, полученные из животных и людей,что давало смешанные или неутешительные результаты. Более поздние работы были сфокусированы на животно-человеческих псевдовирионах, они оказались более успешными. Штамм ротавируса, известный как 89-12, был описан Уордом (Ward); см. патент США 5474773 иBernstein, D. L et al, Vaccine, 16(4), 381 - 387, 1998. Штамм 89-12 был выделен из образца стула, отобранного у 14-месячного ребенка с естественным ротавирусным расстройством в 1988 году. Согласно патенту США 5474773 ротавирус человека HRV 89-12 затем был адаптирован к условиям культивирования при помощи 2 пассажей в первичных клетках почки африканской зеленой мартышки (ПАЗМ) и 4 пассажей в клетках МА-104 в соответствии с тем как было описано Ward в J. Clin. Microbiol., 19, 748-753,1984. Затем его 3 раза очищали методом бляшек в клетках МА-104 (до пассажа 9) и после 2-х дополнительных пассажей выращивали в этих клетках. Один дополнительный пассаж (пассаж 12) был сделан для депонирования в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под регистрационным номером АТСС VR 2272. Этот депонированный штамм известен как 89-12 С 2. На статью Bernstein et al. в Vaccine 1998 года далее будут ссылки как на статью Vaccine (1998). Эта статья описывает безопасность и иммуногенность перорально вводимого кандидата для вакцины,-1 005952 содержащей живой ротавирус человека. Эта вакцина была получена из штамма 89-12, ослабленного путем пассирования без очистки методом бляшек 26 раз в первичных клетках ПАЗМ и затем еще 7 раз в прижившейся клеточной линии ПАЗМ (в сумме 33 пассажа). В дальнейшем ссылки на Р 26 (пассаж 26) будут относиться к вышеупомянутому материалу, который был последовательно пассирован 26 раз, а ссылки на Р 33 будут относиться к материалу, который пассировали последовательно 33 раза. В общем, ротавирус, полученный путем пассирования 89-12 n раз,будет обозначен как Рn. В последующих примерах материал Р 33 дополнительно пассировали еще 5 раз в клетках Vero. На него ссылаются как на Р 38. Изоляты Р 26 и Р 33, описанные в статье Vaccine (1998), не депонировали в коллекции культур и не анализировали для установления их генетической характеристики. В настоящее время обнаружили, что популяция Р 26, описанная в литературе, включает в себя смесь вариантов. Это было установлено путем установления генетической характеристики, как описано ниже(смотри примеры). Таким образом, Р 26 не представляет собой надежно стабильную популяцию для дальнейших пассажей, в частности для производства партий вакцин. Аналогично, Р 33 включает в себя смесь вариантов и не является надежно стабильным для производства партий вакцин. Было обнаружено, что материал Р 26 представляет собой смесь по меньшей мере трех вариантов гена VP4. Р 33 и Р 38 подобным образом представляют собой смесь двух вариантов. При оценке титров нейтрализующих антител сыворотки крови младенцев, вакцинированных Р 33 против этих вариантов, представляется, что эти варианты антигенно отличаются в отношении вируснейтрализующих антигенных детерминант от штамма 89-12 С 2, депонированного в АТСС. Это проиллюстрировано на фиг. 3. Кроме того, было обнаружено, что когда младенцам вводят материал Р 33, реплицируются и секретируются два идентифицированных варианта. Из 100 вакцинированных младенцев лишь у двух были обнаружены симптомы гастроэнтерита, вызванного ротавирусной инфекцией, в то время как 20% группы, получившей плацебо, были инфицированы. Эти открытия означают, что указанные идентифицированные варианты связаны с защитой от ротавирусного заболевания. Таким образом, в задачу настоящего изобретения входило получение ослабленной популяции ротавирусов, обеспечивающей приготовление партий стабильной вакцины. Поставленная задача решается тем, что предложена ослабленная популяция ротавирусов человека,содержащих нуклеотидную последовательность, представляющую собой единственный вариант или по существу единственный вариант гена VP4 и/или единственный или по существу единственный вариант гена VP7. Предпочтительной является популяция ротавирусов по изобретению, полученная путем клонирования исходной ротавирусной популяции Р 33. Предпочтительно популяция ротавирусов по изобретению происходит от популяции, вызывающей ротавирусную инфекцию человека, наиболее предпочтительной является популяция ротавирусов по изобретению, которая реплицируется в людях и экскретируется ими. В предпочтительном аспекте изобретения указанный по существу единственный вариант гена VP4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую: аденин (А) в положении 788, или аденин(А) в положении 802, или тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона. Наиболее предпочтительно ген VP4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую аденин (А) в положениях 788 и 802 и тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона. В еще одном предпочтительном аспекте изобретения указанный по существу единственный вариант гена VP7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605,или аденин (А) в положении 897, или гуанин (G) в положении 897 от стартового кодона. Наиболее предпочтительно ген VP7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605 и аденин (А) или гуанин (G) в положении 897 от стартового кодона. Еще более предпочтительной является популяция ротавирусов по изобретению, где ген VP4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую аденин (А) в положениях 788 и 802 и тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона; а ген VP7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605 и аденин (А) в положении 897 от стартового кодона. Наиболее предпочтительной является популяция ротавирусов по изобретению, обозначенная как Р 43 и депонированная в Европейской коллекции культивируемых клеток животных (ЕСАСС) под регистрационным номером 99081301. Поставленная задача решается также тем, что предложен вариант ротавируса, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP4, приведенную на фиг. 1, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP7, приведенную на фиг. 2. Предпочтительным является вариант ротавируса, входящий в состав популяции Р 43, или его потомство. Согласно еще одному аспекту изобретения предложен иммунологически активный компонент указанного варианта ротавируса. Согласно еще одному аспекту изобретения предложен ротавирусный псевдовирион, содержащий по-2 005952 меньшей мере один указанный иммунологически активный компонент или по меньшей мере один сегмент генома вышеуказанного варианта ротавируса. Задача изобретения решается также тем, что предложена вакцинная композиция, включающая живую ослабленную популяцию ротавирусов по изобретению, смешанную с фармацевтически приемлемым носителем или адъювантом. Для решения поставленной задачи также предложена вакцинная композиция, включающая живой ослабленный вариант ротавируса, его потомство, иммунологически активный компонент или псевдовирион, как они определены выше, смешанные с фармацевтически приемлемым носителем или адъювантом. Предпочтительно вакцинная композиция по изобретению приспособлена для перорального введения, более предпочтительно приготовлена в виде препарата с антацидной композицией, наиболее предпочтительно - в лиофилизированной форме. Особенно предпочтительной является указанная вакцинная композиция, содержащая лиофилизированный живой ослабленный вариант ротавируса и неорганическое антацидное средство, такое как карбонат кальция, и агент, регулирующий вязкость, такой как ксантановая камедь. Целесообразно, когда в указанной вакцинной композиции ослабленный вариант ротавируса и антацидная композиция находятся в отдельных контейнерах для приготовления препарата в виде жидкой вакцинной композиции перед введением. Также целесообразно, когда в указанной вакцинной композиции ослабленный вариант ротавируса и антацидная композиция приготовлены в одном контейнере в лиофилизированной форме, которую нужно разводить водным раствором перед введением. Также особенно предпочтительной является лиофилизированная вакцинная композиция в форме быстрорастворяющейся таблетки для немедленного растворения при помещении на язык. Под популяцией, включающей в себя единственный вариант или по существу единственный вариант, понимают популяцию ротавирусов, которая не содержит более 10% и предпочтительно содержит менее 5% и наиболее предпочтительно менее 1% отличающегося варианта или вариантов. Популяции вируса могут быть очищены до гомогенного состояния или по существу гомогенного состояния путем пассирования в клетках подходящих типов или путем осуществления серий, состоящих из одной или более чем одной стадий клонирования. Преимущество данного изобретения заключается в том, что популяция, включающая в себя единственный вариант, является более пригодной для приготовления партии стабильной вакцины. Конкретные варианты, характеризующиеся нуклеотидными последовательностям, кодирующими основной вирусный белок, также могут быть связаны с повышенной эффективностью предотвращения ротавирусной инфекции. Популяция ротавирусов по изобретению может быть получена способом, при котором пассируют ротавирусный препарат в клетках подходящего типа; возможно выделяют однородную культуру с помощью стадий а) конечных разведений; или б) изолирования отдельных бляшек; и проверяют на присутствие по существу единственного варианта путем выполнения определения последовательности соответствующей области последовательности гена VP4 и/или VP7. Определение последовательности может быть удобным образом осуществлено с использованием методики количественной или полуколичественной гибридизации, такой как слот-блот-гибридизация или гибридизация с вирусными нуклеиновыми кислотами в бляшках. Предпочтительно выделенный вариант представляет собой вариант, который реплицируется и секретируется, когда исходный ротавирусный препарат вводят человеку, в частности ребенку. Клонированная вирусная популяция, полученная способом по данному изобретению, может быть амплифицирована путем дополнительного пассирования в подходящей линии клеток. Типы клеток, подходящие для пассирования ротавирусной популяции в вышеуказанном способе,включают в себя клетки почки африканской зеленой мартышки (ПАЗМ), которые могут представлять собой прижившиеся клеточные линии или первичные клетки ПАЗМ. Подходящие линии клеток ПАЗМ включают в себя, например, Vero (ATCC CCL-81), DBS-FRhL-2 (ATCC CL-160), BSC-1 (ЕСАСС 85011422) и CV-1 (ATCC CCL-70). Также подходят линии клеток МА-104 (макаки резус) и MRC-5 (человека - ATCC CCL-171). Клетки Vero особенно предпочтительны для целей амплификации. Пассирование в клетках Vero дает высокий выход вируса. Методики проверки того, действительно ли в вирусной популяции, полученной в результате осуществления вышеуказанного способа, присутствует единственный вариант, и методики определения природы этого единственного варианта включают в себя стандартные процедуры секвенирования и гибридизации, известные в данной области техники и описанные ниже. Получение ротавирусной популяции по данному изобретению осуществляют с использованием подходящего ротавируса, в частности ротавируса, имеющего характеристики штамма 89-12 или его пассированного производного.-3 005952 Особенно предпочтительная популяция единственного варианта представляет собой Р 43, которая получена из Р 33 (выделенный ротавирус человека 33 раза пассируется в культуре в клетках подходящего типа) с помощью ряда стадий клонирования путем конечных разведений с последующим пассированием клонированного материала в клетках Vero для амплификации. Популяция Р 43 была депонирована в Европейской коллекции культивируемых клеток животных(ЕСАСС), Лаборатория исследования и производства вакцин, Лабораторная служба общественного здравоохранения, Научно-производственный центр микробиологии, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4OJG, United Kingdom, 13 августа 1999 г. под регистрационным номером 99081301 по условиям Будапештского договора. Хотя эта указанная общедоступность представляет собой самый простой способ получения ротавирусов человека Р 43, в целом вполне возможно или вероятно, что соответствующие и по существу функционально идентичные ротавирусы могут быть получены этими или другими способами с учетом данного изобретения. Полагается, что такие по существу функционально идентичные ротавирусы являются биологическим эквивалентом ротавирусу человека Р 43 по данному изобретению и, следовательно, входят в объем настоящего изобретения. Следовательно, понятно, что данное изобретение охватывает ротавирусные популяции, обладающие характеристиками варианта Р 43 в соответствии с тем, как описано в материалах данной заявки. Также следует понимать, что данное изобретение охватывает материалы, полученные из депонированного Р 43 ЕСАСС 99081301, путем подвергания их дополнительной обработке, например, размножению их путем дополнительного пассирования, клонирования или других процедур с использованием живого вируса, или путем модифицирования Р 43 любым путем, в том числе методами генной инженерии или методами псевдовирионов. Такие стадии и методы хорошо известны в данной области техники. Материалы, полученные из депонированного Р 43, которые охватываются данным изобретением,включают в себя белок и генетический материал. Особенный интерес представляют ротавирусные псевдовирионы, которые содержат по меньшей мере один антиген или по меньшей мере один сегмент Р 43,например псевдовирионы, которые представляют собой вирулентный штамм ротавируса, в котором один или часть одного из 11 сегментов генома замещена сегментом генома Р 43 или его частью. Конкретно,полезные свойства может иметь ротавирусный псевдовирион, в котором сегмент или часть сегмента, кодирующая NSP4, представляет собой сегмент или часть сегмента Р 43. Ротавирусные псевдовирионы и методики их получения хорошо известны (Foster, R. H. and Wagstaff, A. J. Tetravalent Rotavirus Vaccine, areview. ADIS drug evaluation, BioDrugs, Gev, 9(2), 155-178, 1998). Материалами, представляющими особенный интерес, являются потомство Р 43 и иммунологически активные производные Р 43. Под иммунологически активными производными подразумевают материалы,полученные из вируса Р 43 или с ним, в частности антигены этого вируса, которые способны вызвать иммунный ответ против ротавирусов при введении в животное-хозяина. При адаптации ротавируса к подходящей клеточной линии, например к клеткам Vero, может быть необходимо обработать вирус таким образом, чтобы избавиться от любого возможного загрязнения, как,например, от любых случайных агентов, которые могут присутствовать и которые могут иным образом вызвать загрязнение. В случае случайных вирусов, чувствительных к эфиру, это можно сделать путем обработки эфиром как описано ниже. Настоящее изобретение также относится к включению такой обработки эфиром в качестве возможной стадии в общую процедуру получения ослабленного живого ротавируса или приготовленной с ним вакцины. Также в объем данного изобретения входят смеси Р 43 с другими ротавирусными вариантами, например с другими клонированными вариантами, или с другими вирусами, в частности с другими ослабленными вирусами. Такие смеси полезны в вакцинах по изобретению, которые описаны ниже. Предпочтительно ротавирусная вакцина по изобретению представляет собой моновалентную ротавирусную вакцину, содержащую единственный штамм ротавируса. Настоящее изобретение является особенно полезным, предлагая живую ротавирусную вакцину, в которой живой ослабленный ротавирус представляет собой ротавирус человека и не вызывает инвагинации. Подходящие фармацевтические носители для использования в вакцине по данному изобретению включают в себя известные в данной области носители, про которые известно, что они подходят для перорального введения, особенно младенцам. Такие носители включают в себя углеводы, полиспирты,аминокислоты, гидроксид алюминия, гидроксид магния, гидроксиапатит, тальк, оксид титана, гидроксид железа, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, желатин, растительный пептон, ксантан, каррагенан, гуммиарабик, -циклодекстрин,но не ограничиваются ими. Ротавирусная вакцина по изобретению может быть получена, например, с помощью сублимационной сушки вируса в присутствии подходящих стабилизаторов или путем смешивания вируса по данному изобретению с подходящим адъювантом или фармацевтическим носителем. Также может быть полезно приготовить препараты вируса по изобретению в носителях на основе липидов, таких как виросомы или липосомы, в эмульсиях типа масло в воде или с частицами носителя.-4 005952 В качестве альтернативы или в дополнение в препарат могут быть включены иммуностимуляторы, такие как известные в данной области иммуностимуляторы для пероральных вакцин. Такие иммуностимуляторы включают в себя бактериальные токсины, в частности холерный токсин (XT) в форме голотоксина(целая молекула) или только как цепь В (ХТВ) и термолабильный энтеротоксин Е. coli (ЛТ). Мутантные ЛТ (мЛТ), которые превращаются в свою активную форму с меньшей вероятностью чем нативный ЛТ,также описаны в WO 96/06627, WO 93/13202 и US 5182109. Дополнительные иммуностимуляторы, которые может быть полезным включить, представляют собой производные сапонина, такие как QS21 и монофосфориллипид А, в частности 3-де-Оацилированный монофосфориллипид A (3D-MPL). Очищенные сапонины как пероральные адъюванты описаны в WO 98/56415. Сапонины и монофосфориллипид А можно использовать по отдельности или в комбинации (см., например WO 94/00153), и можно включать в состав препарата в адъювантных системах вместе с другими агентами. 3D-MPL является хорошо известным адъювантом, производимым RibiImmunochem, Montana, и его производство описано в GB 2122204. Общее обсуждение носителей и адъювантов для пероральной иммунизации можно найти в VaccineDesign, The Subunit and Adjuvant Approach, edited by Powell and Newman, Plenum Press, New York, 1995. Вакцинацию людей, особенно младенцев, осуществляют путем введения эффективного количества вакцинной композиции по изобретению. Предпочтительно вводят живую ослабленную вакцину пероральным путем. В соответствии с предпочтительным аспектом, композицию вакцины по данному изобретению готовят с антацидным средством, чтобы минимизировать инактивацию вакцины кислотой в желудке. Подходящие антацидные компоненты включают в себя неорганические антацидные средства, например гидроксид алюминия Аl(ОН)3 и гидроксид магния Мg(ОН)2. Имеющиеся в продаже антацидные средства,которые подходят для использования по данному изобретению, включают в себя Mylanta (товарный знак), который содержит гидроксид алюминия и гидроксид магния. Они нерастворимы в воде и поставляются в суспензии. Гидроксид алюминия представляет собой особенно предпочтительный компонент композиции вакцины по данному изобретению, поскольку он может обеспечивать не только антацидное действие, но также и адъювантное действие. Также для использования в качестве антацидных средств в вакцине по данному изобретению подходят органические антацидные средства, такие как соли органических кислот по карбоксильной группе. Предпочтительное антацидное средство для вакцинной композиции по данному изобретению содержит соль органической кислоты по карбоксильной группе, предпочтительно соль лимонной кислоты, такую как цитрат натрия или цитрат калия. Особенно предпочтительное антацидное средство, которое может быть использовано в вакцинной композиции по настоящему изобретению, представляет собой нерастворимую неорганическую соль карбонат кальция (СаСО 3). Карбонат кальция способен образовывать ассоциаты с ротавирусом, и активность ротавируса сохраняется во время ассоциации с карбонатом кальция. Для предотвращения осаждения карбоната кальция во время стадии заполнения в препарате предпочтительно присутствуют агенты, регулирующие вязкость. Возможные агенты, регулирующие вязкость, которые могут быть использованы, включают в себя псевдопластические эксципиенты. Псевдопластический раствор определяют как раствор, обладающий более высокой вязкостью при стоянии по сравнению с его вязкостью при перемешивании. Эксципиенты этого типа представляют собой природные полимеры, такие как гуммиарабик, трагакантовая камедь,агар-агар, альгинаты, пектины или полусинтетические полимеры, например карбоксиметилцеллюлозу(Tyloses С), метилцеллюлозу (Methocels A, Viscotrans MC, Tylose MH и MB), гидроксипропилцеллюлозу (Klucels) и гидроксипропилметилцеллюлозу (Methocels E и К, Viscontrans MPHC). Как правило, эти псевдопластические эксципиенты используют вместе с тиксотропными агентами. Альтернативные агенты, регулирующие вязкость, которые можно использовать, представляют собой псевдопластические эксципиенты, обладающие низкой текучестью. Эти полимеры, взятые в достаточной концентрации, приводят к структурной перегруппировке в жидкости, приводящей в результате к раствору с высокой вязкостью, обладающему низкой текучестью при стоянии. Некоторое количество энергии требуется подвести к системе для того, чтобы дать ей возможность течь и обеспечить перемещение. Требуется энергия извне (перемешивание) для временного разрушения структурной перегруппировки в жидкости,чтобы получить жидкий раствор. Примеры таких полимеров представляют собой Carbopols и ксантановую камедь. Тиксотропные эксципиенты приобретают структуру геля при стоянии, тогда как при перемешивании они образуют жидкий раствор. Примеры тиксотропных эксципиентов представляют собой:Veegum (Магниево-алюминиевый силикат) и Avicel RC (приблизительно 89% микрокристаллической целлюлозы и 11% Na-карбоксиметилцеллюлозы). Вакцинная композиция по настоящему изобретению предпочтительно включает в себя агент, регулирующий вязкость, выбранный из ксантановой камеди или крахмала. Таким образом, вакцинную композицию по настоящему изобретению предпочтительно готовят в-5 005952 виде препарата с комбинацией карбоната кальция и ксантановой камеди. Другие компоненты композиции, используемые в данном изобретении, соответственно, включают сахара, например сахарозу и/или лактозу. Вакцинная композиция по данному изобретению может содержать дополнительные компоненты,включая, например корригенты (особенно для пероральной вакцины) и бактериостатические агенты. Предусмотрено различное воспроизведение вакцинной композиции по данному изобретению. В одном предпочтительном воплощении вакцину вводят в виде жидкого препарата. Предпочтительно жидкий препарат получают разведением перед введением из по меньшей мере двух компонентов: 1) вирусного компонента 2) жидкого компонента. В этом воплощении вирусный компонент и жидкий компонент, как правило, содержатся в отдельных контейнерах, которые могут удобным образом представлять собой отдельные отсеки одной емкости или отдельные емкости, которые могут быть соединены таким образом, что конечную вакцинную композицию получают разведением без открытия доступа воздуха. Перед разведением вирус может находиться в сухой форме или жидкой форме. Предпочтительно вирусный компонент является лиофилизированным. Лиофилизированный вирус является более стабильным, чем вирус в жидком растворе. Лиофилизированный вирус может быть соответствующим образом разведен с использованием жидкой антацидной композиции для получения жидкого вакцинного препарата. Или же лиофилизированный вирус может быть разведен в воде или водном растворе, причем в этом случае лиофилизированная вирусная композиция предпочтительно содержит антацидный компонент. Предпочтительно, вакцинный препарат включает в себя вирусный компонент, приготовленный в виде препарата с карбонатом кальция и ксантановой камедью в одном отсеке емкости, который разводят водой или водным раствором, находящимся во втором отсеке емкости. В еще одном предпочтительном воплощении вакцинная композиция представляет собой твердый препарат, предпочтительно лиофилизированный брикет, который пригоден для растворения непосредственно при помещении его в ротовую полость. Лиофилизированные препараты могут быть удобным образом предложены в форме таблеток в фармацевтической блистерной упаковке. Предпочтительно быстрорастворимая таблетка по данному изобретению растворяется в ротовой полости субъекта достаточно быстро для того, чтобы предотвращалось проглатывание нерастворившейся таблетки. Этот подход особенно предпочтителен для педиатрических ротавирусных вакцин. Предпочтительно вирус представляет собой живой ослабленный ротавирус человека, который приготовлен в виде препарата с неорганическим антацидным средством, таким как карбонат кальция, и агентом, регулирующим вязкость, таким как ксантановая камедь. Вакцины по данному изобретению могут быть приготовлены и введены известными способами с применением подходящего количества живого вируса для обеспечения эффективной защиты от ротавирусной инфекции без значительных неблагоприятных побочных эффектов типичных вакцин. Подходящее количество живого вируса, как правило, составляет от 104 до 107 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на дозу. Типичная доза вакцины может включать в себя 105 - 106 БОЕ на дозу и может быть введена в виде нескольких доз в течение периода времени, например в виде двух доз, вводимых с двухмесячным интервалом. Польза, тем не менее, может быть получена при использовании схемы приема, включающей более 2 доз, например 3 или 4 дозы, особенно в развивающихся странах. Длительность интервала между дозами может составлять больше или меньше двух месяцев. Оптимальное количество живого вируса для схемы приема в виде однократной дозы или множественных доз и оптимальное время для этих доз могут быть установлены путем стандартных исследований, включающих в себя наблюдение за титром антител и другими реакциями у субъектов. Вакцина по данному изобретению может также включать в себя другие подходящие живые вирусы для защиты от других заболеваний, например полиовирус. Или же можно давать другие подходящие живые вирусные вакцины для перорального введения в виде отдельной дозы, но в том же самом случае, что и ротавирусную вакцинную композицию по данному изобретению. Подпись к фиг. 3 Образцы сыворотки крови, полученные от двенадцати 4-6-месячных младенцев, вакцинированных материалом Р 33 в соответствии с тем, как описано в статье Vaccine (1998), тестировали в отношении нейтрализации Р 33, Р 38, Р 43 и 89-12 С 2. Диапазон титров нейтрализации для всех протестированных образцов сыворотки крови является одним и тем же для Р 33, Р 38 и Р 43. Статистический анализ не продемонстрировал значимого различия в общих титрах нейтрализации в отношении всех трех вирусов. Это свидетельствует о том, что конформационные и неконформационные вируснейтрализующие антигеннные детерминанты Р 33, Р 38 и Р 43 в равной степени хорошо распознаются антителами против Р 33 в образцах сыворотки крови младенцев, вакцинированных Р 33. Это наблюдение косвенно свидетельствует о том, что вируснейтрализующие антигенные детерминанты, выявленные в этом анализе in vitro, не различаются у Р 33, Р 38 и Р 43. Диапазон титров нейтрализации Р 89-12 С 2 тем не менее значительно отличается от Р 33, Р 38 и Р 43. Это наблюдение свидетельствует о том, что конформацонные и неконформационные вируснейтрали-6 005952 зующие антигенные детерминанты Р 33, Р 38 и Р 43 не распознаются в равной степени хорошо антителами против Р 33 в образцах сыворотки крови младенцев, вакцинированных Р 33. Это наблюдение косвенно свидетельствует о том, что вируснейтрализующие антигенные детерминанты, выявленные в этом анализеin vitro, отличались у 89-12 С 2 и Р 33, Р 38 и Р 43. Следующие примеры иллюстрируют изобретение. Примеры Пример 1. Демонстрация того, что штамм 89-12 в пассаже 26 (Р 26) представляет собой смесь вариантов Секвенирование генов VP4 и VP7 из партий разных пассажей Было осуществлено секвенирование генов VP4 и VP7 из пассажа Р 26 (первичные клетки ПАЗМ),пассажа Р 33 (прижившаяся (как противоположность первичной) линия клеток ПАЗМ), пассажа Р 41 и пассажа Р 43. Экстракт тотальной РНК был подвергнут обратной транскрипции и амплифицирован путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) в одной пробирке/в одну стадии. Праймеры Rota 5bis и Rota 29bis обеспечивали амплификацию полного гена VP4, и праймеры Rota 1 и Rota 2bis обеспечивали амплификацию полного VP7. Материал после ПЦР секвенировали с использованием различных праймеров (см. табл. 1). Последовательность пассажа Р 26 отличалась от последовательности пассажа Р 33 на 3 основания (в положениях 501, 788 и 802 п.н. от стартового кодона) в VP4 и на три основания в VP7 (108, 605 и 897 п.н. от стартового кодона). Развертки последовательности пассажа Р 26 для VP4 и VP7 демонстрируют в мутированных положениях наличие последовательности пассажа Р 33 как фона. Таким образом, можно видеть, что пассаж Р 26 представляет собой смесь по меньшей мере 2 вариантов. Развертки последовательностей пассажа Р 33 представляются однородными для VP4 и разнородными для VP7 (см. табл. 2). Пассаж Р 38 (полученный из пассажа 33) был пассирован 5 раз в клетках Vero и продемонстрировал тот же самый набор последовательностей VP4 и VP7, что и пассаж Р 33 (линия клеток ПАЗМ). Таким образом, у популяции Р 38 не было значительного изменения по сравнению с Р 33. Таблица 1: Олигонуклеотиды, используемые для полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ПЦР-ОТ) и секвенирования Основания, выделенные в табл. 2 жирным шрифтом, представляют собой места специфического изменения последовательностей у VP4 и VP7. Таблица 3. изменение последовательности генов VP4 и VP7 3.1N.B. Во втором клоне из 3-х клонов, которые были развиты до уровня продуцирующей партии,нуклеотид в положении 897 VP7 представляет собой скорее G, чем А, как в выделенном клоне Р 43. В результате это дает метионин вместо изолейцина в аминокислотной последовательности. Варианты, соответствующие как выделенному клону Р 43, так и клону, у которого в VP7 в положении 897 п.н. от стартового кодона находится G, экскретировались в стуле младенцев, которые были вакцинированы материалом Р 33. В табл. 3.1 там, где в определенном положении указаны два альтернативных основания, первое из этих двух представляет собой основание, которое обнаруживается в значительной популяции, и второе представляет собой основание, которое обнаруживается в незначительной популяции. Значительные и незначительные популяции вариантов расцениваются по силе сигнала при секвенировании. 3.2 Табл. 3.2 демонстрирует аминокислотные замены, являющиеся результатом различий в нуклеотидах между вариантами. Таблица 4-8 005952 Слот-блот-гибридизация Изменения в популяциях от пассажа Р 26 к пассажу Р 33 в клетках ПАЗМ в дальнейшем были подтверждены слот-блот-гибридизацией. Фрагменты генов VP4 и VP7, произведенные при помощи полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ПЦР-ОТ), гибридизовали с олигонуклеотидными зондами, специфичными для каждого варианта (см. табл. 3.1 и 3.2). В отличие от Р 26, который гибридизовался с Rota 16, Rota 35 и Rota 36, но не с Rota 15, ПЦР-фрагмент VP4 материала Р 33 в положениях 788 и 802 гибридизовался только с Rota 16, но не с Rota 15, или Rota 35, или Rota 36. Эти результаты установили наличие по меньшей мере 3 вариантов в Р 26 (см. табл. 4). Для ПЦР-фрагмента VP7 материала Р 33 в положении 897 происходила гибридизация с Rota 41 иRota 42. Эти результаты установили наличие по меньшей мере двух вариантов в материале Р 33. Пример 2. Выделение и характеристика клона Р 43 Для выделения компонентов Р 33 в виде однородной вирусной популяции осуществляли три конечных разведения Р 33/ПАЗМ в клетках Vero и полученный в результате вирус использовали для инфицирования клеток Vero. Лунки с положительным результатом были отобраны с использованием двух критериев: рост, демонстрируемый самым большим числом очагов, обнаруживаемых в лунках, и наиболее выделяющиеся лунки с положительным результатом на планшетах в соответствии с тем как это делается классически. После 3 пассажей путем конечных разведений в 96-луночных титрационых микропланшетах 10 лунок с положительным результатом были последовательно амплифицированы в клетках Vero и оценены в отношении их выхода. Основываясь на выходе, три клона развили до уровня пассирования производящей партии. Было показано, что иммунологическое распознавание поликлональными антителами близко как между тремя клонами, так и между этими клонами и Р 33. Однородность клонов оценивали слот-блот-гибридизацией. Конечное выделение единственного клона было основано на выходе и последовательности. Выделенный клон амплифицировали путем последовательных пассажей в клетках Vero для получения контрольного посевного материала, рабочего посевного материала и конечных производящих партий. Выделенный клон генетически характеризовали на различных уровнях пассирования путем секвенирования VP4 и VP7 (идентичность) и путем специфичной слот-блот-гибридизации VP4 и VP7 (гомогенность) материалов, амплифицированных ПЦР. Последовательности генов VP4 и VP7 материала Р 43 представлены на фиг. 1 и 2 соответственно, и они идентичны Р 41. Однородность выделенного клона оценивали путем избирательной гибридизации с использованием олигонуклеотидных зондов, способных различать нуклеотидные замены в областях VP4 и/или VP7 для каждого варианта, идентифицированного при секвенировании Р 26/первичные ПАЗМ (см. табл. 4). Фрагмент VP4 гибридизовался с Rota 16, но не с Rota 15, Rota 35 или Rota 36. Фрагмент VP7 гибридизовался с Rota 41, но не с Rota 42. Эти результаты подтвердили, что Р 43 представляет собой однородную популяцию. Пример 3. Удаление потенциального случайного вируса Эфир добавляли к Р 33 (рост в ПАЗМ) до конечной концентрации 20% в течение 1 ч. Затем эфир выдували N2 в течение 35 мин. Не наблюдали никакого влияния на титр посевного материала Р 33. Пример 4. Приготовление препарата живой ослабленной вакцины Производящие партии, описанные выше, готовили в виде препарата для перорального введения младенцам следующим способом. 1. Лиофилизированный вирус Для приготовления доз вируса используются стандартные способы. Замороженный очищенный сыпучий материал вируса размораживают и разводят подходящей композицией среды, в данном случае средой Игла, модифицированной по Дульбекко, до желаемой стандартной концентрации вируса, в данном случае составляющей 106,2 БОЕ/мл. Разведенный вирус затем дополнительно разводят лиофилизационным стабилизатором (сахароза 4%, декстран 8%, сорбит 6%, аминокислота 4%) до намеченного титра вируса, в данном случае составляющего 105,6 БОЕ/мл. Аликвоты по 0,5 мл стабилизированной вирусной композиции асептически переносят во флаконы на 3 мл. Каждый флакон затем частично закрывают резиновой пробкой, образец сушат вымораживанием в вакууме, затем флакон закрывают полностью и обжимают вокруг флакона алюминиевую крышку, чтобы поддерживать пробку на месте. Для использования вирус разводят в одном из следующих антацидных разбавителей:(а) Цитратный разбавитель: Цитрат натрия растворяют в воде, стерилизуют путем фильтрации и асептически переносят в емкости для разведения в количестве по 1,5 мл при концентрации 544 мг Na3 Цитрат 2 Н 2 О на дозу 1,5 мл. Емкости для разведения могут представлять собой, например, флаконы на 3 мл, или флаконы на 4 мл, или шприцы на 2 мл, или сжимаемые мягкие пластиковые капсулы для перорального введения. В качестве варианта поддержания стерильных компонентов в стерильных условиях, конечную емкость можно автоклавировать.(б) Разбавитель Аl(OH)3 Стерильную суспензию гидроксида алюминия (товарный знак Mylanta) асептически разводят стерильной водой, асептически переносят в емкости для разведения (например шприцы на 2 мл или сжимаемые мягкие пластиковые капсулы) в количествах по 2 мл, содержащих по 48 мл Аl(ОН)3. Альтернативой использования стерильных компонентов в стерильных условиях является -облучение суспензии гидроксида алюминия (предпочтительно на стадии разведения). Для предотвращения осаждения суспензии включают стандартные ингредиенты. Такие стандартные ингредиенты включают в себя, например, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу и кремниевые полимеры. Также можно включать бактериостатические агенты, например бутилпарабен, пропилпарабен или другие стандартные бактериостатические агенты, используемые в продуктах питания, а также корригенты. 2. Лиофилизированный вирус с Аl(OH)3 в жидком препарате Стандартные способы используют для приготовления доз вируса. Замороженный очищенный сыпучий материал вируса размораживают и разводят подходящей композицией среды, в данном случае средой Игла, модифицированной по Дульбекко, до желаемой стандартной концентрации вируса, в данном случае составляющей 106,2 БОЕ/мл. Суспензию гидроксида алюминия добавляют для достижения конечного количества 48 мг/дозу и вирусную композицию разводят лиофилизационным стабилизатором (сахароза 4%, декстран 8%, сорбит 6%, аминокислота 4%) до намеченного титра вируса, в данном случае составляющего 105,6 БОЕ/мл. Аликвоты по 0,5 мл стабилизированной вирусной композиции асептически переносят во флаконы на 3 мл. Затем осуществляют лиофилизацию и закупорку флаконов как описано в части 1. 3. Лиофилизированный вирус с Аl(OH)3 для представления в блистерной форме Для приготовления доз вируса используют стандартные способы. Замороженный очищенный сыпучий материал вируса размораживают и разводят подходящей композицией среды, в данном случае средой Игла, модифицированной по Дульбекко, до желаемой стандартной концентрации вируса, в данном случае составляющей 106,2 БОЕ/мл. Добавляют суспензию гидроксида алюминия для достижения конечного количества 48 мг/дозу и эту вирусную композицию разбавляют лиофилизационным стабилизатором, который может представлять собой сахарозу, декстран или аминокислоту 4%, или желатин, или растительный пептон, или ксантан до намеченного титра вируса, в данном случае составляющего 105,6 БОЕ/мл. Осуществляют операцию асептического заполнения, чтобы перенести дозы по 0,5 мл или, предпочтительно, меньшие в углубления блистерных упаковок. Композицию подвергают лиофилизации и углубления блистерных упаковок термически запаивают. Для предотвращения осаждения суспензии гидроксида алюминия возможно включают стандартные ингредиенты. Такие стандартные ингредиенты включают в себя, например, стеарат магния, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу и кремниевые полимеры. Можно также включать корригенты. Пример 5. Вирусное титрование ротавирусов для различных препаратов 5.1: Сравнение препаратов на основе лактозы и сахарозы Ротавирус Р 43 был приготовлен в виде препарата или с сахарозой или с лактозой в соответствии с тем как показано в таблице, представленной выше. Вирусное титрование до лиофилизации представляет собой титр вируса в полностью приготовленной в виде препарата жидкости (содержащей сахарозу, декстран, сорбит, аминокислоты) без осуществления стадии лиофилизации. Хорошие результаты являются такими, когда достигается уменьшение на стадии лиофилизации 0,5 log и уменьшение за 1 неделю при 37 С (ускоренный тест на стабильность)0,5 log. Точность вирусного титрования составляет приблизительно +/- 0,2 log.- 10005952 Результаты указывают на то, что вместо лактозы может использоваться сахароза. 5.2: Влияние аргинина и замены сорбита на мальтит: Эти результаты демонстрируют, что добавление аргинина (который, как известно, улучшает стабильность вируса во время лиофилизации и также обеспечивает основную среду, для того чтобы компенсировать кислотность желудка) поддерживает титр вируса. Сорбит стремится уменьшить температуру стеклования лиофилизированного брикета в слишком большой степени. Это можно преодолеть, используя мальтит вместо сорбита, как показано выше, и титр вируса все так же поддерживается. 5.3: Композиции различных препаратов Этот эксперимент демонстрирует, что возможно большое количество препаратов. Аl(ОН)3 используется в качестве антацидного средства. Это показывает, что ротавирус ассоциирует с нерастворимой неорганической солью (Аl(ОН)3), поскольку он центрифугируется вместе с Аl(ОН)3(уменьшение вирусной активности в супернатанте). 5.5: Растворение антацидного средства Аl(ОН)3 в цитрате натрия перед титрованием вируса Когда ротавирус ассоциирован с Аl(ОН)3, можно все подвергнуть лиофилизации (включая Аl(ОН)3). После лиофилизации можно выделить ротавирус путем растворения Аl(ОН)3 в цитрате натрия. Эта стадия не вредит ротавирусу и позволяет сохранить его активность после этой стадии растворения. 5.6: Инфекционность ротавируса после высвобождения из ассоциации Аl(ОН)3-ротавирус: Механизм высвобождения вируса (путем растворения носителя) может очень хорошо происходитьin vivo. Действительно, при значениях рН ниже 6 гидроксид алюминия становится полностью растворимым, и, таким образом, ротавирус будет высвобождаться в желудке. Аl(ОН)3 + 3 Н+Аl (водорастворимый) + 3 Н 2 О В желудке ионы Аl не всасываются (J.J.Powell, R. Jugdaohsingh and R. P. H. Thompson, The regulation ofmineral adsorption in the gastrointestinal track, Proceedings of the Nutrition Society (1999), 58, 147-153). В кишечнике вследствие увеличения рН выпадают в осадок нерастворимые формы алюминия(Аl(ОН)3 или AlPO4), и они удаляются естественным путем. Не известно, способен ли вновь образующийся осадок Аl(ОН)3 (или AlPO4) повторно ассоциировать с ротавирусом. Вследствие этого возникает вопрос об инфекционности самой ассоциации Аl(ОН)3 ротавирус. Возможно также высвобождение ротавируса из ассоциации Аl(ОН)3-ротавирус по другим механизмам. Например, лизин мешает адсорбции вируса на Аl(OН)3. Известно, что другие анионы, как, например, борат, сульфат, карбонат и фосфат, специфически адсорбируются на гидроксиде алюминия, таким образом, теоретически должно быть возможно вытеснение (ввиду конкуренции за сайт адсорбции) ротавируса из ассоциации Аl(ОН)3-ротавирус. ниже предела обнаружения 3,8 Таким образом, ротавирус может быть высвобожден из ассоциации ротавирус- Аl(ОН)3, и высвобожденный ротавирус остается активным. Это высвобождение можно осуществлять или путем растворения Аl(ОН)3 (HCl в желудке, илиNa3 Цитратом in vitro) или путем вытеснения ротавируса основной аминокислотой (лизином). 5.7: Инфекционность ассоциации Аl(ОН)3-ротавирус Разовую дозу лиофилизированного ротавируса развели в воде и разделили на две части. В первую часть, принятую за эталон, добавили дополнительный объем воды. Во вторую часть добавили 24 мг Аl(ОН)3, суспендированного в 0,240 мл воды (преклиническое титрование вируса). В присутствии Аl(ОН)3 ротавирус является активным и значение титра вируса выше по сравнению с эталонным образцом. Этот эксперимент был повторен без разделения лиофилизированной дозы и с добавлением 12 мгAl(OH)3 или 24 мг Al(OH)3. В данном случае эталонным образцом является тот, который развели цитрат-бикарбонатным буфером. Таким образом, титр вируса снова оказывается выше в присутствии Аl(ОН)3. Как показано в приведенном выше примере, ротавирус ассоциирует с частицами Аl(ОН)3, поскольку вирус может быть удален центрифугированием. DRVC003A46 представляет собой лиофилизированный приготовленный в виде препарата ротавирус (сахароза 2%; декстран 4%; сорбит 3%; аминокислоты 2%). В соответствии с титрованием вируса, проведенным в супернатанте, количество Аl(ОН)3, необходимое для адсорбции ротавируса, по-видимому, будет небольшим (начиная с одной лиофилизированной дозы 5,7 log и увеличивая титрование вируса): Необходимый для адсорбции ротавируса на Аl(ОН)3 промежуток времени, по-видимому, является коротким. Одну доза лиофилизированного ротавируса растворили в присутствии 24 мг Аl(ОН)3 и центрифугировали через 0, 15, 60 мин и 24 ч. Осадок ресуспендировали в СДСАК перед титрованием вируса: 5.8: Использование СаСО 3 в качестве антацидного средства Для того, чтобы избежать присутствия алюминия в вакцине, антацидное средство Аl(ОН)3 заменяли другой нерастворимой неорганической солью -СаСО 3 (карбонат кальция). Явления, наблюдаемые при использовании СаСО 3, подобны явлениям, описанным для Аl(ОН)3: ассоциация ротавируса с неорганической солью; поддержание активности ротавируса, когда он ассоциирован с неорганической солью; возможность высвобождения ротавируса из ассоциации путем растворения неорганического основания в кислоте; возможность совместной лиофилизации антацидного средства и ротавируса. Ассоциация СаСО 3 и ротавируса В первом испытании лиофилизированный ротавирус (титр вируса 5,7) разводили суспензией СаСО 3 в воде (50 мг в 1,5 мл), затем центрифугировали и титр вируса в супернатанте сравнивали с осадком. Это указывает на то, что более 90% ротавируса ассоциировало с СаСО 3. Также, когда вирус был ассоциирован, можно было осуществить титрование и извлечь исходные количества вируса. Кроме того, титры вируса слегка превышают титры, полученные без СаСО 3. Количество СаСО 3 и ассоциация ротавируса Лиофилизированный ротавирус разводили суспензией СаСО 3 в воде (1,5 мл): 10 мг 50 мг 100 мг,затем центрифугировали и титр вируса в супернатанте сравнивали с осадком. Таким образом, очевидно, что чем больше СаСО 3, тем больше вируса ассоциировано и меньше обнаруживается в супернатанте. Тем не менее, вся доза полностью не высвобождается (ожидается в сумме по меньшей мере, 5,3 или даже 5,8, как получалось ранее - описано выше). Защита ротавируса с использованием СаСО 3 во время малого антацидного титрования Россета-Райса(Baby Rossett-Rice antacid titration) Используя 10 доз лиофилизированного ротавируса (DRVC003A46) и 50 мг СаСО 3, осуществляли два типа малого титрования Россета-Райса: В классическом титровании Россета-Райса антацидное средство смешивают с ротавирусом и в эту- 17005952 среду выливают HCl. В "обратном" малом титровании Россета-Райса, ситуация противоположная: антацидное средство прикапывают в HCl (как это происходит in vivo). Таким образом, в этом эксперименте in vitro карбонат кальция способен защитить приблизительно 20% ротавируса от присутствующей HCl, тогда как гидроксид алюминия не способен это делать. 5.9: Лифилизация ротавируса в присутствии антацидного средства СаСО 3 Это представляет собой "все в одном" - лиофилизация ротавируса и антацидного средства (СаСО 3) вместе в одном флаконе. Для предотвращения осаждения СаСО 3 во время стадии заполнения необходимы агенты, регулирующие вязкость. Примеры таких агентов, регулирующих вязкость, включают ксантановую камедь и крахмал. 5.10 Лиофилизированные таблетки для быстрого распада после помещения в ротовую полость: Следующие препараты демонстрируют концепцию лиоб, то есть быстрое растворение лиофилизированного брикета в ротовой полости. В "концепции "лиоб" может быть использован как ксантан, так и крахмал (они поддерживают свойство лиофилизированного брикета быстро растворяться). Пример 6. Применение карбоната кальция в качестве антацидного средства для ротавирусной вакцинной композиции Когда для ротавируса используется суспензия СаСО 3 в качестве антацидного средства, существует проблема, заключающаяся в том, что частицы карбоната кальция быстро осаждаются при помещении в воду, поскольку величина плотности порошка достигает 2,6 и средний размер частиц составляет 30 мкм. Осаждение можно замедлить путем 1. увеличения плотности окружающей среды 2. увеличения вязкости окружающей среды 3. уменьшения размера частиц 4. удерживая частицы на расстоянии друг от друга 6.1: Увеличение плотности окружающей среды: Когда суспензию СаСО 3-вода (помещенную в шприц) вносят на лиофилизированный осадок (содержащий сахарозы 2%, декстрана 4%, сорбита 3%, аминокислот 2%), плотность окружающей среды увеличивается, но скорость осаждения СаСО 3 не очень сильно отличается от суспензии СаСО 3-вода. 6.2 Увеличение вязкости окружающей среды: Псевдопластические эксципиенты Псевдопластический раствор определяют как раствор, имеющий более высокую вязкость при стоя- 20005952 нии по сравнению с его вязкостью при перемешивании. Обычными эксципиентами этого типа являются следующие: природные полимеры, например: гуммиарабик трагакантовая камедь агар-агар альгинаты пектины полусинтетические полимеры, например: карбоксиметилцеллюлоза (Tyloses С) метилцеллюлоза (Methocels A, Viscotrans MC, Tylose МН и MB) гидроксипропилцеллюлоза (Klucels) гидроксипропилметилцеллюлоза (Methocels E и К, Viscontrans MPHC) Как правило, эти псевдопластические эксципиенты используют вместе с тиксотропными агентами. Псевдопластические эксципиенты с низкой текучестью Эти полимеры, взятые в достаточной концентрации, приводят к структурной жидкостной перегруппировке, приводящей в результате к раствору с высокой вязкостью, обладающему низкой текучестью при стоянии. Некоторое количество энергии необходимо подвести к системе для того, чтобы дать ей возможность течь и обеспечить перемещение. Требуется энергия извне (перемешивание) для временного разрушения структурной жидкостной перегруппировки для получения жидкого раствора. Примеры таких полимеров представляют собой Carbopols и ксантановую камедь. Тиксотропные эксципиенты С этими эксципиентами при стоянии образуется структура геля; тогда как при перемешивании образуется жидкий раствор. Примеры тиксотропных эксципиентов представляют собой: Veegum (Магниево-алюминиевый силикат) и Avicel RC (приблизительно 89% микрокристаллической целлюлозы и 11% Naкарбоксиметилцеллюлозы). 6.3 Уменьшение размера частиц Уменьшение размера частиц СаСО 3 приводило в результате к уменьшению антацидной способности этого соединения. 6.4 Удерживание частиц на расстоянии друг от друга Это происходит в Veegum и Avicel, нерастворимые частицы которых, меньшие (приблизительно 1 мкм) чем частицы СаСО 3, помещают между частицами СаСО 3 для предотвращения аггрегации. Пример 7: Исполнение продукта Следующие схемы демонстрируют примеры возможных вариантов исполнения продукта. 7.1 СаСО 3 в шприце Уже имея клинические партии ротавируса в лиофилизированных флаконах, антацидное средство можно помещать в жидкость для разведения, содержащуюся в шприце. При таком исполнении продукта осаждение СаСО 3 должно контролироваться не только во время стадий заполнения, но также и в течение всего срока хранения продукта (по меньшей мере 2 г.). 7.2 СаСО 3 в лиофилизированном флаконе 7.3. Лиофилизация в блистерной упаковке В этом случае ротавирус, СаСО 3 и ксантановую камедь лиофилизируют вместе непосредственно в блистерной упаковке. Пример 8. Лиофилизация различных штаммов ротавируса Штаммы DS-1, Р и VA70 описаны в качестве стандартных штаммов ротавирусов человека для серотипов G2, G3 и G4 соответственно на странице 1361 в Fields Raven press 1990, second edition. В этом эксперименте лиофилизировали различные штаммы ротавирусов. Для всех штаммов поддерживали титр вирусов во время лиофилизации и демонстрировали уско- 22005952 ренную стабильность (одна неделя при 37 С). Пример 9. Исследования фазы I безопасности одного перорального введения ротавирусной вакцины взрослым людям Исследования фазы I осуществляли, чтобы оценить безопасность и реактогенность одной пероральной дозы Р 43-вакцины, составляющей 106,0 БОЕ, для здоровых людей в возрасте от 18 до 45 лет. Клиническое испытание было дважды слепым и рандомизированным. Исследование включало плацебо-контроль и было изолированным. Это исследование проводилось в одном отдельном центре в Бельгии. Исследуемая группа Было зарегистрировано в общей сложности 33 субъекта, из них 11 в группе плацебо и 22 в вакцинируемой группе, и все они полностью прошли исследование. Все добровольцы были представителями кавказской расы. Их средний возраст к моменту вакцинации составлял 35,3 года, при диапазоне от 18 до 44 лет. Испытание началось в январе и продолжалось в течение чуть более одного месяца. Материал Вакцина Клинические партии Р 43-вакцины были произведены, очищены, приготовлены в виде препарата и лиофилизированы в соответствии с GMP (Good Manufacturing Practice, Качественная производственная практика). Партии были предоставлены для употребления с осуществлением контроля качества и гарантии качества. Каждый флакон вакцины содержал следующие компоненты: Активный ингредиент: Штамм Р 43 минимум 105,8 БОЕ Эксципиенты. стабилизаторы: Сахароза 9 мг Декстран 18 мг Сорбит 13,5 мг Аминокислоты 9 мг Плацебо Флаконы плацебо были приготовлены и предоставлены для употребления. Каждый флакон плацебо содержал следующие компоненты: Эксципиенты. стабилизаторы: Сахароза 9 мг Декстран 18 мг Сорбит 13,5 мг Аминокислоты 9 мг Разбавитель Вода для инъекций использовалась в качестве разбавителя для разведения вакцины и плацебо. Введение Приблизительно за 10-15 мин до введения вакцины или плацебо субъектам в обоих группах давали перорально по 10 мл Mylanta. Mylanta представляет собой зарегистрированное антацидное средство. Антацидное средство повышает рН желудка и предотвращает инактивацию ротавируса в процессе его прохождения через желудок. Для приготовления вакцины содержимое двух флаконов лиофилизированного Р 43, содержащих 105,8 БОЕ на флакон, разводили 1,5 мл разбавителя - воды для инъекций. Это позволило достигнуть рассчитываемого титра вируса, составляющего 106,1 БОЕ/дозу. Разведенную вакцину сразу же вводили в виде разовой пероральной дозы. Приготовляя плацебо, два флакона лиофилизированного плацебо разводили 1,5 мл воды для инъекций и вводили перорально в виде разовой дозы. Безопасность и реактогенность Применялись следующие критерии безопасности и реактогенности: Наиболее важные общие симптомы представляли собой лихорадочное состояние, диарею, рвоту,тошноту, боль в животе и потерю аппетита. Их регистрировали в течение восьми дней после введения. Симптомы, которые имели меньшую важность, регистрировали в течение 30 дней после введения. Серьезные побочные явления регистрировали в течение всего периода исследования. Образцы стула при диарее собирали в течение восьми дней после введения. Результаты были следующими: В течение соответствующих периодов наблюдения не было зарегистрировано никаких важных симптомов, никаких менее важных симптомов и никаких серьезных побочных явлений. Не было зарегистрировано случаев диареи. Заключение Р 43-Вакцина SB Biologicals является безопасной сравнительно с плацебо в дважды слепом испытании при пероральном введении в виде разовой дозы 106,1 БОЕ здоровым взрослым добровольцам в возрасте от 18 до 44 лет. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Ослабленная популяция ротавирусов человека, содержащих нуклеотидную последовательность,представляющую собой единственный вариант, или, по существу, единственный вариант гена VP4 и/или единственный или, по существу, единственный вариант гена VP7. 2. Популяция ротавирусов по п.1, полученная путем клонирования исходной ротавирусной популяции Р 33. 3. Популяция ротавирусов по любому из пп.1 или 2, которая происходит от популяции, вызывающей ротавирусную инфекцию человека. 4. Популяция ротавирусов по любому из пп.1-3, которая реплицируется в людях и экскретируется ими. 5. Популяция ротавирусов по любому из пп.1-4, где указанный, по существу, единственный вариант гена VP4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую аденин (А) в положении 788, или аденин (А) в положении 802, или тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона. 6. Популяция ротавирусов по п.5, где ген VP4 содержит нуклеотидную последовательность, включающую аденин (А) в положениях 788 и 802 и тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона. 7. Популяция ротавирусов по любому из пп.1-6, где указанный, по существу, единственный вариант гена VP7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605, или аденин (А) в положении 897, или гуанин (G) в положении 897 от стартового кодона. 8. Популяция ротавирусов по п.7, где ген VP7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605 и аденин (А) или гуанин (G) в положении 897 от стартового кодона. 9. Популяция ротавирусов по пп.5-8, где ген VP4 содержит нуклеотидную последовательность,включающую аденин (А) в положениях 788 и 802 и тимин (Т) в положении 501 от стартового кодона; а ген VP7 содержит нуклеотидную последовательность, включающую тимин (Т) в положении 605 и аденин (А) в положении 897 от стартового кодона. 10. Популяция ротавирусов по любому из пп.1-9, обозначенная как Р 43 и депонированная в Европейской коллекции культивируемых клеток животных (ЕСАСС) под регистрационным номером 99081301. 11. Вариант ротавируса, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белокVP4, приведенную на фиг. 1, и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок VP7, приведенную на фиг. 2. 12. Вариант ротавируса, входящий в состав популяции по п.10, или его потомство. 13. Иммунологически активный компонент варианта ротавируса по п.12. 14. Ротавирусный псевдовирион, содержащий по меньшей мере один иммунологически активный компонент по п.13 или по меньшей мере один сегмент генома варианта ротавируса по п.12. 15. Вакцинная композиция, включающая живую ослабленную популяцию ротавирусов по любому из пп.1-10, смешанную с фармацевтически приемлемым носителем или адъювантом. 16. Вакцинная композиция, включающая живой ослабленный вариант ротавируса, его потомство,иммунологически активный компонент или псевдовирион по любому из пп.11-14, соответственно, смешанный с фармацевтически приемлемым носителем или адъювантом.- 25005952 17. Вакцинная композиция по любому из пп.15-16, приспособленная для перорального введения. 18. Вакцинная композиция по п.17, приготовленная в виде препарата с антацидной композицией. 19. Вакцинная композиция по любому из пп.15-18 в лиофилизированной форме. 20. Вакцинная композиция по п.19, содержащая лиофилизированный живой ослабленный вариант ротавируса и неорганическое антацидное средство, такое как карбонат кальция, и агент, регулирующий вязкость, такой как ксантановая камедь. 21. Вакцинная композиция по п.20, где ослабленный вариант ротавируса и антацидная композиция находятся в отдельных контейнерах для приготовления препарата в виде жидкой вакцинной композиции перед введением. 22. Вакцинная композиция по п.20, где ослабленный вариант ротавируса и антацидная композиция приготовлены в одном контейнере в лиофилизированной форме, которую нужно разводить водным раствором перед введением. 23. Вакцинная композиция по п.19 в форме быстрорастворяющейся таблетки для немедленного растворения при помещении на язык.