Водная композиция амфотерицина в

006241 Область изобретения Настоящее изобретение относится к низкотоксичной водной композиции амфотерицина В. Данное изобретение, конкретно, относится к низкотоксичной водной композиции амфотерицина В, содержащей фосфолипиды, пригодной для парентерального введения. Предпосылки изобретения Амфотерицин В представляет собой полиеновое противогрибковое антибиотическое лекарственное средство, пригодное для лечения инвазивных грибковых инфекций. Однако, оно имеет высокую нефротоксичность. Токсичность амфотерицина В снижают различными способами: из них обычно используются (а) инкапсулирование лекарственного средства в липосомы и (b) преобразование лекарственного средства в липидный комплекс с высоким содержанием лекарственного средства (HDLC). Приготовление липосомального амфотерицина В: В патенте США 4973465 (1990) описано приготовление комплексов HDLCs, в которых используют или исключительно стерины, подобные холестерину, или в сочетании с природными фосфолипидами,фосфатидилхолином. В патенте США 5616334 (1997) описан способ приготовления липосомального амфотерицина В, который вначале заключается в получении пустых многослойных везикул (пузырьков) (MLVs) и затем смешивании MLVs с обработанной ультразвуком суспензией амфотерицина В в воде. Этот способ не предполагает использование каких бы то ни было растворителей. Тем не менее, эта процедура, в частности, производит липосомальный амфотерицин В, который является более токсичным, чем амфотерицин В в составе HDLC. Процедура заключается в продавливании (экструзии) пустых липосом для калибровки через уложенные поликарбонатные фильтры снова и снова десять раз. Она также заключается в удалении не включенного амфотерицина В центрифугированием после наполнения лекарственным средством. Этот патент США описывает также способ изготовления HDLC в Низкотоксичных лекарственнолипидных комплексах. В этом патенте описан способ приготовления липидного комплекса амфотерицина В. В общих чертах эта процедура является следующей: Получение HDLCs: сначала препарат амфотерицина В растворяют в растворителе, таком как диметилсульфоксид (DMSO) или метанол. Липиды, предпочтительно димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) и димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG) растворяют в молярном соотношении 7:3 в растворителях,таких как метанол, этанол, хлорсодержаще углеводороды. Раствор лекарственного средства и липидный раствор смешивают. Растворители выпаривают при пониженном давлении, что дает в результате тонкую пленку липидов с лекарственным препаратом. Пленку гидратируют водным раствором, таким как вода,физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер, или глициновый буфер до образования HDLCs. В одном варианте упомянутого выше процесса получающуюся сухую пленку, состоящую из липидов и лекарственного средства, ресуспендируют в растворителе, например, в метиленхлориде, и снова выпаривают при пониженном давлении перед гидратированием пленки. В другом варианте упомянутого выше процесса получающуюся сухую пленку, состоящую из липидов и лекарственного средства, дегидратируют (обезвоживают) до образования хлопьев; затем хлопья гидратируют водным раствором. В другом способе водный раствор, например, физиологический раствор, буфер, или воду прибавляют к раствору, содержащему лекарственное средство и липид, и затем растворитель удаляют выпариванием до получения HDLCs. В этом способе образование тонкой пленки фосфолипидов не требуется. В альтернативном способе образования HDLCs, описанном в этом патенте США, липидные частицы (или липосомы), содержащие биологически активные агенты, такие как амфотерицин В, образуют путем производства сначала многослойных везикул (MLVs), содержащих от 6-50 молярных процентов биологически активного агента. Затем MLVs подвергают циклу нагрева от приблизительно 25 С до приблизительно 60 С, наиболее предпочтительно приблизительно 60 С. Такой цикл образует более высоко упорядоченный и менее токсичный липидный комплекс амфотерицина В. В этом патенте США также описан другой альтернативный способ производства липидного комплекса амфотерицина В. В том способе липиды смешивают с раствором хлорида натрия (0,9%) и гомогенизируют с использованием гомогенизатора. Амфотерицин В растворяют в DMSO и добавляют к раствору липидов при гомогенизации и продолжают гомогенизировать в течение около тридцати минут, до тех пор, пока размер частицы уменьшится до меньше чем приблизительно 10 мкм, предпочтительно, до приблизительно 10 мкм. Образующиеся в результате липидные частицы отбирают по размеру последующей тангенциальной проточной фильтрацией. Недостатком этого способа является то, что используемый растворитель DMSO имеет высокую точку кипения и, следовательно, является трудноудаляемым из продукта. Кроме того, следовые количества DMSO остаются в конечном продукте. Не желательно иметь такой растворитель в следовых количествах в композиции для внутривенного введения, поскольку этот растворитель, как сообщали, был токсичным для печени (The journal of Infectious diseases 1991 : 164,стр. 418-421).HDLCs являются полезными препаратами для снижения токсичности амфотерицина В, но способы,описанные в патенте США N 5616334 (1997), требуют применения больших объемов органических рас-1 006241 творителей, поскольку амфотерицин В имеет низкую растворимость в большинстве обычно применяемых парентерально приемлемых органических растворителях. Следовательно, способ заключается в удалении больших количеств органических растворителей выпариванием. Альтернативно, апротонные растворители, такие как диметилсульфоксид, диметилформамид, также используют для растворения амфотерицина В. Эти апротонные растворители имеют высокую точку кипения и следы этих растворителей должны остаться в конечной композиции. Так как сообщают, что эти апротонные растворители являются токсичными для печени, то нежелательно использование этих растворителей в процессе производства. Поэтому существует необходимость улучшения процесса крупномасштабного производства таких композиций амфотерицина В путем снижения количества используемых растворителей. Это также снизит себестоимость. Основным объектом настоящего изобретения является разработка низкотоксичной парентеральной водной композиции, содержащей амфотерицин В и фосфолипиды, с целью сделать ее простой и с целью снижения стоимости производства. Дальнейшей задачей настоящего изобретения является разработка низкотоксичной парентеральной водной композиции, содержащей амфотерицин В и фосфолипиды, и не содержащей следовые количества DMSO и/или хлорсодержащих углеводородов. Сущность изобретения Таким образом, настоящее изобретение относится к низкотоксичной, парентеральной, не содержащей диметилсульфоксид, водной композиции, содержащей амфотерицин В, хлорид натрия и фосфолипиды. Помимо того, настоящее изобретение относится к способу изготовления низкотоксичной парентеральной, свободной от диметилсульфоксида, водной композиции, содержащей амфотерицин В, хлорид натрия и фосфолипиды, предусматривающему стадии:(i) растворения одного или нескольких фосфолипидов в одном или нескольких органических растворителях, выбранных из группы парентерально приемлемых растворителей, таких как метанол, этанол,изопропиловый спирт, хлороформ, четыреххлористый углерод и метиленхлорид и затем удаления растворителей выпариванием при пониженном давлении до образования сухой пленки простых или смешанных фосфолипидов;(ii) суспендирования амфотерицина В в парентерально приемлемой водной фазе, не содержащей хлорид натрия, или суспендирования микронизированного амфотерицина В в парентерально приемлемой водной фазе, которая может содержать хлoрид натрия;(iii) добавления водной фазы, содержащей суспендированный амфотерицин В, образованный в конце стадии (ii), к указанной пленке фосфолипидов, полученной в конце стадии (i), и смешивания обеих для получения суспензии указанного амфотерицина В вместе с указанными фосфолипидами в указанной водной фазе;(iv) доведения рН указанной суспензии, полученной в конце стадии (iii), до 6,0-8,0 и затем гомогенизации ее до тех пор, пока она станет фильтруемой через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 2 мк;(v) добавления достаточного количества раствора хлорида натрия в воде в конце стадии (iv), так чтобы содержание хлорида натрия в конечном продукте составляло по меньшей мере 0,1% ( мас./об.);(vi) фильтрования указанной гомогенизированной суспензии, полученной в конце стадии (v),через стекловолоконный фильтр 2 мк и заполнения фильтрата во флаконы под азотным покрытием, герметизации флаконов и стерилизации запечатанных флаконов автоклавированием для получения конечного продукта, пригодного для парентерального введения. Настоящее изобретение также относится к низкотоксичной парентеральной водной композиции амфотерицина В, содержащей по меньшей мере 0,1% (мас./об.) хлорида натрия и фосфолипидов, как описано здесь, и изготовленной способом настоящего изобретения, как описано выше. Подробное описание вариантов осуществления изобретения Содержание амфотерицина В в композиции настоящего изобретения варьирует от 0,1 до 1,0%(мас./об.) композиции, предпочтительно содержание амфотерицина В равно 0,5% (мас./об.) композиции. Общее содержание фосфолипидов варьирует от 0,1 до 1,0% (мас./об.) композиции. Предпочтительное содержание составляет от приблизительно 0,4 до приблизительно 0,6% (мас./об.). Соотношение массы амфотерицина В к массе фосфолипидов составляет от приблизительно 1:0,5 до приблизительно 1:1,5. Предпочтительное соотношение масс составляет от приблизительно 1:0,8 до приблизительно 1:1,2. В данном способе фосфолипиды выбраны из яичного фосфатидилхолина или из смеси димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) и натриевой соли димиристоилфосфатидилглицерина (DMPG). При использовании смеси двух фосфолипидов DMPC и DMPG соотношение масс фосфолипидов DMPC:DMPG равно между 7:1 и 7:15, предпочтительно 7:3. Использованные для растворения фосфолипидов растворители выбраны из спиртовых растворителей, таких как этанол, метанол, изопропиловый спирт с добавлением или без добавления хлорсодержащих углеводородов, таких как хлороформ, метиленхлорид, четыреххлористый углерод. Спиртовые растворители сами по себе, или сами по себе хлорсодержащие углеводороды могут быть использованы для-2 006241 растворения фосфолипидов. Альтернативно, спиртовые растворители и хлорсодержащие углеводороды в сочетании также могут быть использованы для растворения фосфолипидов. В тех случаях, когда хлорсодержащие углеводороды не выбирают, то композиция является свободной от хлорсодержащих углеводородов. Предпочтительным растворителем, используемым для растворения фосфолипидов, является этанол. Микронизированный амфотерицин В, где-либо использованный в этом изобретении, является микроизмельченным с использованием воздушной струйной мельницы до частиц размером менее чем 10 мкм. рН водной фазы, используемой для диспергирования амфотерицина В, доводят до 6,0-8,0 с использованием разбавленного раствора гидроксида натрия, когда бы ни использовали буферный раствор в композиции. Водная фаза, используемая для суспендирования амфотерицина В, является парентерально приемлемой основой, такой как вода, или фосфатный буфер. При использовании микронизированного амфотерицина В, водной фазой, используемой для суспендирования амфотерицина В, может быть физиологический раствор, фосфатно-солевой буфер, вода или фосфатный буфер. Хлорид натрия добавляют в виде раствора в воде после гомогенизации и перед фильтрацией. Однако, хлорид натрия может быть добавлен на любой стадии изготовления от (ii) до (iv), предусмотренной в Сущности изобретения при использовании микронизированного амфотерицина В. Концентрация хлорида натрия равна от около 0,1 до 0,9% (мас./об.) композиции предпочтительно от 0,4 до 0,9% (мас./об.) композиции. Гомогенизацию производят с использованием гомогенизатора высокого давления при давлении не меньше чем 5000 фунтов/кв.дюйм до тех пор, пока продукт станет фильтруемым через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 2 мкм. В другом варианте осуществления изобретения липидную суспензию амфотерицина В обрабатывают ультразвуком в водяной бане с ультразвуком перед гомогенизацией для получения однородной суспензии после доведения рН до приблизительно 6,0-8,0. Разбавленный раствор гидроксида натрия используют для установления рН всякий раз, когда бы ни использовали буферный раствор в композиции. Гомогенизированную липидную суспензию амфотерицина В фильтруют через стекловолоконные фильтры 2 мк обычной процедурой фильтрования под давлением, или с использованием фильтрованного азота, или фильтрованного сжатого воздуха. После фильтрования гомогенизированную суспензию помещают во флаконы под азотным покрытием и стерилизуют обычным автоклавированием при 110 С до 121 С, предпочтительно при 121 С в течение 20 мин, или при 110 С в течение 40 мин. Стерилизация может быть также произведена особым способом автоклавирования, при котором время цикла нагрева и охлаждения снижают системой быстрого нагрева и быстрого охлаждения. В прежних способах получения HDLCs, описанных в патентах США 4973465 (1990) и 5616334(1997), амфотерицин В растворяют в очень большом объеме органических растворителей. В одном из примеров в патенте США 5616334 (1997) для приготовления 1 флакона с 20 мл липидного комплекса амфотерицина В, эквивалентного 100 мг амфотерицина В, используют один литр метанола. В другом примере для уменьшения объема растворителя использовали 5 мл DMSO на 100 мг амфотерицина В, ноDMSO не является рекомендуемым растворителем для внутривенной инъекции, так как сообщали, чтоDMSO является токсичным для печени. В способе настоящего изобретения амфотерицин В является не полностью растворенным ни в каких растворителях, тогда как общепринятый способ использует DMSO для растворения амфотерицина В. В способе настоящего изобретения при добавлении амфотерицина В, суспендированного в водной фазе, содержащей хлорид натрия, к липидной пленке и гомогенизации, наблюдали образование агрегатов, и гомогенизированный продукт не был фильтруемым через стекловолоконный фильтр 2 мк посредством обычной процедуры фильтрования. После широкого экспериментирования обнаружили, что при использовании водной фазы для суспендирования амфотерицина В, которую готовили без добавления в нее какого-либо количества хлорида натрия, гомогенизация протекала гладко, без какого бы то ни было агрегатирования суспензии, и гомогенизированная масса была способна к фильтрованию. Однако, в ходе данного изобретения обнаружили, что хлорид натрия является существенным в композиции для снижения токсичности. Водные композиции амфотерицина В, содержащие различные концентрации хлорида натрия в дозе 80 мг/кг массы тела, вводили мышам, по 8 мышей в каждой группе. Водную композицию амфотерицина В без какого бы то ни было количества хлорида натрия, как описано ниже в примерах, готовили и вводили раздельно. Перед каждой инъекцией объем, эквивалентный дозе 80 мг/кг массы тела, разводили до 0,5 мл 5%-ной инъекционной глюкозой для превращения его в изотонический. Летальность, выраженная в процентах, наблюдаемая в конце 72 ч, показана в табл. 1. Из табл. 1 понятно, что минимальная концентрация 0,1% хлорида натрия является существенной для снижения токсичности. Поэтому во время гидратации фосфолипидной пленки используют водную фазу без каких бы то ни было количеств хлорида натрия, чтобы сделать гомогенизацию гладкой и облегчить фильтрование через стекловолоконный фильтр 2 мк. Хлорид натрия добавляют в виде раствора после процесса гомогенизации. Добавление хлорида натрия в композицию настоящего изобретения является существенным для снижения токсичности амфотерицина В. Даже при добавлении 0,1% (мас./об.) хлорида натрия полулетальная доза (LD50) была 80 мг/кг, эта полулетальная доза гораздо выше, чем у общепринятых препаратов амфотерицина В, содержащих дезоксихолат натрия, которая, как сообщают, находится около 4 мг/кг. После многочисленных дальнейших экспериментов обнаружили, что снижение среднего размера частиц амфотерицина В до менее чем 10 мкм микронизированием, помогло в преодолении проблемы агрегатирования в ходе гомогенизации. Анализ размера частиц амфотерицина В до и после микроизмельчения проводили при помощи анализатора размера частиц Sympatic HELOS. Микронизирование амфотерицина В также помогло в преодолении проблемы фильтрования, связанной с наличием хлорида натрия в гомогенизированной водной суспензии, содержащей немикронизированный амфотерицин В и фосфолипид. Фильтрование гомогенизированной массы, приготовленной с использованием микронизированного амфотерицина В, является легким, и могут использоваться общепринятые фильтры; в аналогичном способе, например в патенте США 5616334 (1997) фильтрование HDLC производят через извилистый контур, или прямо через мембранный фильтр, например, через поликарбонатный фильтр. Таким образом, в одном варианте осуществления изобретения смогли преодолеть проблему агрегатирования и фильтрования с использованием немикронизированного амфотерицина В путем отмены добавления хлорида натрия к водной фазе. Однако обнаружили, что добавление хлорида натрия по меньшей мере в минимальной концентрации 0,1% (мас./об.), является существенным для снижения токсичности водной композиции амфотерицина В. Применяя хлорид натрия в композиции, разрешили проблему агрегатирования и фильтрования путем переноса добавления хлорида натрия до стадии гомогенизации. Таким образом, в первом варианте осуществления изобретения в способе изготовления низкотоксичной стерильной водной композиции амфотерицина В, содержащей по меньшей мере 0,1% (мас./об.) хлорида натрия, водная фаза, применяемая для диспергированного немикронизированного амфотерицина В, представляет собой воду, или фосфатный буфер, не содержащий хлорид натрия. Хлорид натрия добавляют только после гомогенизации водной суспензии, содержащей немикронизированный амфотерицин В и фосфолипиды. Во втором варианте осуществления изобретения проблему агрегатирования и фильтрования суспензии фосфолипидной и водной фазы, содержащей амфотерицин В, разрешают использованием микроизмельченного (микронизированного) амфотерицина В. В сочетании двух вариантов осуществления изобретения при использовании микроизмельченного амфотерициа В и суспендирования в водной фазе, не содержащей хлорид натрия, хлорид натрия добавляют внутрь водной фазы перед, во время, или после стадии гомогенизации. Примеры Теперь изобретение будет проиллюстрировано в виде примеров. Примеры служат только в качестве иллюстрации и ни в коей мере не ограничивают сферы применения изобретения. Ниже в табл. 2 описывают 4 группы примеров. Используемым растворителем для растворения фосфолипидов является только этанол. Все сырье, используемое в этих примерах, было парентерального качества. Используемое оборудование было общепринятым. Взятый в целом процесс проделан в зоне с контролируемыми условиями окружающей среды, необходимыми для производства стерильной продукции. Амфотерицин В, используемый в этих примерах, был парентерального качества, получен от фирмыAlpharma, соответствующий спецификациям Фармакопеи США (USP). Микронизированный амфотерицин В везде, где используется в этих примерах, получали путем тонкого измельчения амфотерицина В с использованием воздушной струйной мельницы до размеров частиц меньше чем 10 мкм. Фосфолипиды DMPC и DMPG, применяемые в примерах, были парентерального качества и поставлены фирмой Avanti Polar Lipids. Фосфолипид, яичный фосфатидилхолин, используемый в примерах, был парентерального качества и поставлен фирмой Lipoids. Органические растворители, используемые в примерах, были качества AR (реактив для аналитических исследований). Фосфатный буфер, используемый в примерах, готовили согласно Индийской Фармакопее. Фосфатно-солевой буферный раствор рН 7,4, используемый в примере, готовили растворением 1,19 г натрия фосфорнокислого двузамещенного, 0,095 г калия фосфорнокислого однозамещенного и 4 г хлорида натрия в 400 мл воды. Воду добавляли до объема 500 мл. Группа А. Примеры I и II Ингредиенты, используемые в этих примерах, представлены в табл. 3. Процедура: В примере 1 амфотерицин В суспендировали в 150 мл воды при перемешивании и при барботировании азотом. рН доводили до приблизительно 6,95 использованием 0,1 N раствора гидроксида натрия. В примере II амфотерицин В суспендировали в 150 мл фосфатного буфера рН 7,2 при перемешивании и при барботировании азотом. Фосфолипиды DMPC и DMPG растворяли в хлороформе в роторной колбе. Этанол добавляли после полного растворения фосфолипидов и предусматривали перемешивание вращением колбы при умеренной скорости при продувании азотом. Этот спиртовой раствор выпаривали в роторном испарителе при сниженном давлении до полного сухого состояния. Азот продували в течение 30 мин после полного удаления растворителей. Сухую липидную пленку гидратировали в роторной колбе водной суспензией амфотерицина В,приготовленного также, как и выше, выдерживая колбу при непрерывном вращении с непрерывным продуванием азотом. рН липидной суспензии амфотерицина В, полученной в примере I, доводили до приблизительно 6,80 раствором 0,1 N гидроксида натрия. Содержимое колбы обрабатывали ультразвуком на бане с ультразвуком в течение 1 ч. Объем доводили до 180 мл водой в примере I, и фосфатным буфером рН 7,2 в примере II. Липидную суспензию амфотерицина В затем гомогенизировали с использованием гомогенизатора высокого давления APV до тех пор, пока гомогенизированный продукт становился фильтруемым через стекловолоконный фильтр с размером пор 2 мк. Хлорид натрия растворяли в воде и разводили до 20 мл водой в примере I. В примере II хлорид натрия растворяли в фосфатном буфере и разводили до 20 мл фосфатным буфером рН 7,2. Этот раствор хлорида натрия добавляли к гомогенизированной липидной суспензии амфотерицина В при слабом перемешивании и продувании азотом. Этот продукт переносили обратно в гомогенизатор и рециркулировали в течение 5 мин, не применяя давление. Затем этот продукт фильтровали через стекловолоконный фильтр 2 мк и помещали в стеклянные контейнеры под азотом, закупоривали и автоклавировали при 110 С в течение 40 мин. В примере II автоклавирование вели при 110 С в течение 40 мин циклами быстрого нагревания и быстрого охлаждения. Группа В: 1) Примеры от III до VI Ингредиенты, используемые в этих примерах, представлены в табл. 4 вместе с процедурой, данной ниже, количество добавляемого хлорида натрия было изменено от 1,8 до 0,2 г. Процедура: Фосфолипиды DMPC и DMPG растворяли в хлороформе в роторной колбе. Этиловый спирт добавляли после полного растворения фосфолипидов и оставляли при перемешивании вращением колбы при умеренной скорости при продувании азотом. Этот спиртовый раствор выпаривали в роторном испарителе при пониженном давлении до полного высыхания. Азот продували в течение 30 мин после полного удаления растворителей. Хлорид натрия растворяли в 175 мл воды. Этот раствор барботировали азотом в течение 15 мин. Микронизированный амфотерицин В суспендировали в растворе хлорида натрия при перемешивании и при барботировании азотом. рН доводили добавлением раствора 0,1 N гидроксида натрия до значений,как показано в табл. 4 для каждого примера. Сухую липидную пленку гидратировали в роторной колбе водной суспензией амфотерицина В, приготовленной, как выше указано, поддерживая колбу в условиях вращения с постоянным продуванием азотом. рН этого полученного липидного комплекса амфотерицина В устанавливали, как показано в табл. 4. Содержимое колбы обрабатывали ультразвуком на бане с ультразвуком в течение 1 ч. Объем доводили водой вплоть до 200 мл. Затем липидную суспензию амфотерицина В гомогенизировали с использованием гомогенизатора высокого давления до тех пор, пока продукт становился фильтруемым через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 2 мк. Гомогенизированную липидную суспензию амфотерицина В фильтровали через стекловолоконный фильтр 2 мк и заполняли в стеклянные контейнеры под азотом, герметизировали и автоклавировали при 110 С в течение 40 мин циклами быстрого нагрева и быстрого охлаждения. Изучение токсичности на мышах продукта примеров III, IV и V при дозе 80 мг/кг массы тела не обнаружило любой смертности, в то время как это же примера IV обнаружило 50% смертность. Группа В продолжение 2) Примеры с VII по IX Ингредиенты, используемые в этих примерах, представлены в табл. 5 с процедурой, данной ниже. Процедура: В примере VII фосфолипиды DMPC и DMPG растворяли в этиловом спирте в роторной колбе вращением колбы при умеренной скорости при продувании азотом. В примере VIII фосфолипид, яичный фосфатидилхолин, растворяли в хлороформе в роторной колбе и в примере IX фосфолипиды DMPC и DMPG растворяли в хлороформе в роторной колбе. Этанол добавляли после полного растворения фосфолипидов в хлороформе и предусматривали перемешивание вращением колбы при умеренной скорости при продувании азотом. В этих примерах таким образом полученные растворы фосфолипидов выпаривали при вращении при сниженном давлении до полного высыхания. Азот продували в течение 30 мин после полного удаления растворителя. В примерах VII и VIII хлорид натрия растворяли в 175 мл воды. Азот барботировали в этот раствор в течение 15 мин. Микронизированный амфотерицин В суспендировали в растворе хлористого натрия при перемешивании и при барботировании азотом, рН доводили до приблизительно 7,15 раствором 0,1N гидроксида натрия. В примере IX микронизированный амфотерицин В суспендировали в 175 мл фосфатно-солевого буферного раствора рН 7,4 (PBS) при перемешивании. Азот барботировали в течение 15 мин. PBS вносит приблизительно 2 г хлорида натрия. Сухую липидную пленку гидратировали в роторной колбе водной суспензией микронизированного амфотерицина В, приготовленного как указано выше, поддерживая колбу при постоянном вращении с постоянным продуванием азотом. рН этой полученной липидной суспензии амфотерицина В доводили до 7,05 в примере VII и до 6,95 в примере VIII раствором 0,1N гидроксида натрия. Объем доводили до 200 мл водой в примерах VII и VIII. Объем доводили до 200 мл фосфатно-солевым буфером рН 7,4 в примере IX. Липидную суспензию амфотерицина В затем гомогенизировали с использованием гомогенизатора высокого давления APV до тех пор, пока гомогенизированный продукт становился фильтруемым через-8 006241 стекловолоконный фильтр с диаметром пор 2 мк. Гомогенизированную липидную суспензию амфотерицина В фильтровали через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 2 мк и помещали в стеклянные контейнеры под азотом, герметизировали и автоклавировали при 121 С в течение 20 мин в примере IX и при 110 С в течение 40 мин в примерах VII иVIII. Стерильную водную композицию амфотерицина В, полученную в примере VII, подвергали изучению на токсичность на мышах и изучению устойчивости. Результаты исследования токсичности представлены в табл. 6, а изучения устойчивости представлены в табл. 7. Анализ размера частиц: Размер частиц водной композиции амфотерицина В, полученной в примере VII, определяли в Системе определения размера частиц AccuSizer Model 770, Inc., США. Обнаружили, что 95% частиц были размерами ниже 1,63 мк и обнаружили, что 90% частиц были размерами ниже 1,28 мк. Изучение токсичности на мышах: Изучение токсичности водной композиции амфотерицина В, полученной в примере VII, изучали на мышах вместе с обычным продуктом амфотерицина В, содержащим дезоксихолат натрия. Результаты наблюдений представляют собой нижеследующее: Таблица 6. Изучение острой токсичности на мышах Средняя летальная доза (LD50) водной композиции амфотерицина В, приготовленного в данной лаборатории, после однократного введения была 80 мг/кг на мышах. Это было более чем в 20 раз выше,чем LD50 после однократного введения обычного продукта амфотерицина В, содержащего дезоксихолат натрия. Таблица 7. Результаты стабильности водной композиции амфотерицина В примера VII при рекомендованной температуре хранения 2-8 С Этот пример ясно показывает, что парентеральная водная композиция амфотерицина В, не имею-9 006241 щая даже следов DMSO или хлорсодержащего углеводорода, при приготовлении путем улучшенного способа согласно настоящему изобретению, где эти растворители совсем не используются, подчиняется общим требованиям товарного продукта инъецируемой суспензии. Новая водная композиция, приготовленная способом примера VII, является абсолютно свободной от вредных растворителей, напримерDMSO и хлорсодержащих углеводородов. Группа С. Примеры с X по XII Ингредиенты, используемые в этих примерах, представлены в табл. 8 с процедурой, данной ниже Таблица 8 Процедура: Фосфолипиды DMPC и DMPG растворяли в хлороформе в роторной колбе. Этанол добавляли после полного растворения фосфолипидов и предусматривали перемешивание путем вращения колбы при умеренной скорости при продувании азотом. Этот спиртовый раствор выпаривали на роторном испарителе при пониженном давлении до полного высыхания. Азот продували в течение 30 мин после полного удаления растворителей. Микронизированный амфотерицин В суспендировали в 150 мл воды в примере X и XI и в 150 мл фосфатного буфера рН 7,2 в примере XII при перемешивании и при барботировании азотом. рН доводили добавлением 0,1 N гидроксида натрия до значений, как указано в табл. 8 для примеров X и XI. Сухую липидную пленку гидратировали в роторной колбе микронизированной суспензией амфотерицина В, приготовленной, как указано выше с использованием роторного испарителя с непрерывным продуванием азота. рН полученной липидной суспензии амфотерицина В устанавливали раствором 0,1 N гидроксида натрия, как показано в табл. 8. В примерах X и XI объем доводили до 180 мл водой, в то время как в примере XII объем доводили до 180 мл фосфатным буфером рН 7,2. В примере XI содержимое колбы диспергировали с помощью ультразвука на бане с ультразвуком в течение 1 ч. В примере X и XII липидную суспензию амфотерицина В гомогенизировали с использованием гомогенизатора высокого давления APV пока гомогенизируемый продукт становился поддающимся фильтрованию через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 2 мк. Хлорид натрия растворяли в воде и разводили до 20 мл водой в примере X. Хлорид натрия растворяли в фосфатном буфере рН 7,2 и разводили до 20 мл фосфатным буфером рН 7,2 в примере XII. Раствор хлорида натрия добавляли к гомогенизированной липидной суспензии при низкоскоростном пере- 10006241 мешивании и продувании азотом. Этот продукт переносили обратно в гомогенизатор и подвергали рециркуляции в течение 5 мин без приложения давления. В примере XI липидную суспензию амфотерицина В после обработки ультразвуком пропускали через гомогенизатор 3 раза под давлением с использованием гомогенизатора высокого давления APV. Хлорид натрия растворяли в воде и разводили водой до 20 мл. Раствор хлорида натрия добавляли при слабом перемешивании к липидной суспензии амфотерицина В, полученной к концу 3-го пропускания. Этот продукт переносили обратно в гомогенизатор и рециркулировали в течение 5 мин без приложения давления. Продукт опять гомогенизировали под давлением до тех пор пока продукт становился поддающимся фильтрованию через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 2 мк. Продукт фильтровали через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 2 мк. Профильтрованный продукт помещали в стеклянные контейнеры под азотом, герметизировали и автоклавировали при 110 С в течение 40 мин циклом быстрого нагревания и быстрого охлаждения. Группа D: Примеры XIII и XIV Ингредиенты, используемые в этих примерах, показаны в табл. 9 вместе с процедурой, данной ниже. Таблица 9 Процедура: Фосфолипиды DMPC и DMPG растворяли в хлороформе в роторной колбе. Этанол добавляли после полного растворения фосфолипидов и предусматривали перемешивание путем вращения колбы при умеренной скорости при продувании азотом. Спиртовый раствор выпаривали на роторном испарителе при пониженном давлении до полного высушивания. Азот продували в течение 30 мин после полного удаления растворителей. В примере XIII микронизированный амфотерицин В суспендировали в воде при перемешивании и при барботировании азотом. В примере XIV немикронизированный амфотерицин В суспендировали в воде при перемешивании и при барботировании азотом. рН устанавливали раствором 0,1N гидроксида натрия, как показано в табл. 9. Сухую липидную пленку гидратировали в роторной колбе суспензией амфотерицина В, приготовленной, как указано выше с использованием роторного испарителя при постоянном продувании азотом. рН устанавливали раствором 0,1N гидроксида натрия, как показано в табл. 9. В примере XIV содержимое колбы обрабатывали ультразвуком в течение 1 ч. Объем доводили до 200 мл водой. Затем липидную суспензию амфотерицина В гомогенизировали с использованием гомогенизатора высокого давления APV до тех пор, пока гомогенизируемый продукт становился поддающимся фильтро- 11006241 ванию через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 2 мк. Гомогенизированную липидную суспензию амфотерицина В фильтровали через стекловолоконный фильтр 2 мк. Профильтрованный продукт помещали в стеклянные контейнеры под азотом, герметизировали и автоклавировали. Автоклавирование проводили при 121 С в течение 20 мин. Изучение токсичности на мышах: Токсичность водной композиции амфотерицина В (без хлорида натрия), полученной в примере XIII и XIV, изучали на мышах наряду с водной композицией амфотерицина В, содержащей хлорид натрия,как в примере III. Результаты наблюдения следующие: Таблица 10. Изучение острой токсичности на мышахLD50 водной композиции амфотерицина В, приготовленной без хлорида натрия, согласно примерамXIII и XIV после однократного инъецирования была 40 мг/кг массы тела у мышей по сравнению с 80 мг/кг с водной композицией амфотерицина В, приготовленной с хлоридом натрия согласно примеру III. Это подтверждает, что хлорид натрия является необходимым для образования водной композиции амфотерицина В низкой токсичности. Преимущества изобретения: Преимущества настоящего изобретения приведены ниже:i) В настоящем изобретении водную композицию амфотерицина В готовили без использованияDMSO, который, как сообщалось, является токсичным для печени.ii) Благодаря низкой растворимости амфотерицина В в парентерально приемлемых органических растворителях (0,1 мг/мл в метаноле) требуется большой объем органического растворителя, который делает процесс более утомительным, трудоемким и коммерчески не оправданным. Способ согласно настоящему изобретению не требует растворения амфотерицина В в каком-нибудь органическом растворителе.iii) Процесс предшествующего уровня техники требует специализированного способа фильтрования, аналогичного тангенциальной проточной фильтрации или экструзии. В способе настоящего изобретения используют общепринятое фильтрование.iv) Продукт, приготовленный способом настоящего изобретения, является устойчивым к стерилизации автоклавированием, таким образом делая его пригодным для внутривенного применения. Способ данного изобретения является простым и рентабельным с точки зрения стоимости и усовершенствованным над уже известным способом. Наиболее важным свойством способа данного изобретения является высочайшая чистота полученного продукта без риска сохранения любых следов вредных растворителей, поскольку такие растворители вовсе не используются в способе. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ производства низкотоксичной парентеральной, не содержащей диметилсульфоксид, водной композиции, содержащей амфотерицин В, хлорид натрия и фосфолипиды, предусматривающий стадии:(i) растворения одного или нескольких фосфолипидов в одном или нескольких парентерально приемлемых органических растворителях и затем удаления растворителей выпариванием при пониженном давлении до образования сухой пленки простых или смешанных фосфолипидов;(ii) суспендирования амфотерицина В в парентерально приемлемой водной фазе, не содержащей хлорид натрия, или суспендирования микронизированного амфотерицина В в парентерально приемлемой водной фазе, которая может содержать хлорид натрия;(iii) добавления водной фазы, содержащей суспендированный амфотерицин В, образованной в кон- 12006241 це этапа (ii), к указанной пленке фосфолипидов, полученной в конце этапа (i), и смешивания обеих до получения суспензии указанного амфотерицина В вместе с указанными фосфолипидами в указанной водной фазе;(iv) доведения рН указанной суспензии, полученной в конце этапа (iii), до 6,0-8,0 и затем гомогенизации ее до тех пор, пока она станет поддающейся фильтрованию через стекловолоконный фильтр с диаметром пор 2 мк; и(v) добавления достаточного количества хлорида натрия в воде в конце этапа (iv), так что содержание хлорида натрия конечного продукта равно по меньшей мере 0,1% (мас./об.). 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно предусматривает фильтрование указанной гомогенизированной суспензии, полученной в конце этапа (v), через стекловолоконный фильтр 2 мк и заполнение фильтрата во флаконы под азотным покрытием, герметизацию флаконов и стерилизацию запечатанных флаконов автоклавированием до получения конечного продукта, пригодного для парентерального введения. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что фосфолипиды выбраны из яичного фосфатидилхолина (ЕРС) или смеси димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) и натриевой соли димиристоилфосфатидилглицерина (DMPG). 4. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанный органический растворитель выбран из спиртовых растворов, хлорсодержащих углеводородов и их смесей. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный органический растворитель выбран из метанола, этанола, изопропилового спирта, хлороформа, четыреххлористого углерода и метиленхлорида. 6. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный органический растворитель представляет собой этанол. 7. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что содержание амфотерицина В равно от приблизительно 0,1 до 1% (мас./об.) композиции. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что содержание амфотерицина В равно 0,5% (мас./об.) композиции. 9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что содержание хлорида натрия равно между 0,1 и 0,9% (мас./об.) композиции. 10. Способ по п.9, отличающийся тем, что содержание хлорида натрия равно между 0,4 и 0,9%(мас./об.) композиции. 11. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что содержание фосфолипидов равно от приблизительно 0,1 до 1% (мас./об.) композиции. 12. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что содержание фосфолипидов равно от приблизительно 0,4 до 0,6% (мас./об.) композиции. 13. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что соотношение масс амфотерицина В к фосфолипидам равно от приблизительно 1:0,8 до приблизительно 1:1,2. 14. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что фосфолипиды представляют собой димиристоилфосфатидилхолин (DMPC) и димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG) в массовом соотношении DMPC:DMPG от приблизительно 7:1 до приблизительно 7:15. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что массовое соотношение DMPC:DMPG составляет 7:3. 16. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что используют немикронизированный амфотерицин В, и парентерально приемлемой водной фазой, используемой на этапе (ii) п.1,является вода или фосфатный буфер. 17. Способ по любому из пп.1-15, отличающийся тем, что используют микронизированный амфотерицин В, и парентерально приемлемой водной фазой, используемой на этапе (ii) п.1, является вода, фосфатный буфер, физиологический раствор или фосфатно-солевой буфер. 18. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что рН указанной водной фазы,используемой для суспензии амфотерицина В на этапе (ii), доводят до 6,0-8,0. 19. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что стерилизацию гомогенизированной фильтрованной суспензии проводят общепринятым автоклавированием. 20. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что температура стерилизации равна 110 С. 21. Способ по любому из пп.1-18 и 20, отличающийся тем, что стерилизацию проводят способом автоклавирования, при котором время нагрева и охлаждения снижено циклом быстрого нагрева и быстрого охлаждения. 22. Способ по любому из пунктов с 1 по 15 и с 17 по 21, отличающийся тем, что амфотерицин В является микронизированным, и хлорид натрия добавляют на любом из этапов (ii) пo (iv), так что содержания хлорида натрия конечного продукта равно по меньшей мере 0,1% (мас./об.) 23. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что продукт водной композиции является полностью свободным от любых хлорсодержащих углеводородов. 24. Низкотоксичная парентеральная, не содержащая диметилсульфоксид, водная композиция, содержащая амфотерицин В, хлорид натрия и фосфолипиды, полученная способом по любому из преды- 13006241 дущих пунктов. 25. Низкотоксичная парентеральная, не содержащая диметилсульфоксид, водная композиция, содержащая амфотерицин В, хлорид натрия и фосфолипиды по п.24, и как по существу здесь описанная в любом из примеров c I по XII. 26. Способ производства низкотоксичной парентеральной, не содержащей диметилсульфоксид водной композиции, содержащей амфотерицин В, хлорид натрия и фосфолипиды, по п.1, и как по существу здесь описанный в любом из примеров I-XII.