Стабильные готовые формы инсулина

1 Настоящее изобретение относится к медицинской области, в частности к лечению диабета и гипергликемии посредством введения мономерных инсулиновых аналогов. Более конкретно, настоящее изобретение относится к мономерным аналогам инсулина, которые обладают улучшенной физической стабильностью при длительном хранении в условиях сильного механического воздействия и наличия высоких температур. Стабильные готовые формы (композиции) терапевтических средств особенно необходимы при использовании их в устройствах доставки лекарств, которые подвергаются воздействию повышенных температур и/или механического стресса. Например, стабильные инсулиновые композиции необходимы при использовании в системах непрерывной инфузии лекарственных средств и в устройствах типа шприц-ручка. Однако имеющиеся в настоящее время композиции имеют весьма ограниченную стабильность в устройствах доставки лекарств указанного типа. В системах непрерывной инфузии жидкость, содержащая терапевтическое средство,нагнетается насосом из резервуара обычно в подкожное, внутривенное или внутрибрюшинное депо. Резервуар, который при этом должен периодически наполняться, подсоединяют к пациенту или имплантируют в его организм. В любом случае, тепло тела пациента и его двигательная активность в сочетании с турбулентностью потока в трубках и в насосе вносят определенный вклад в высокий уровень тепловой и механической энергии, воздействующей на вводимую лекарственную композицию. С целью минимизации необходимой частоты наполнения резервуара и предельно допустимого снижения размера резервуара чрезвычайно выгодно применять композиции, обладающие относительно высокой концентрацией терапевтического средства. Мессей и Шелига в патенте США 4 839 341 (Messey and Sheliga, (Eli Lilly and Company,1989 рассматривают проблемы, возникающие при разработке стабильных готовых форм (композиций) инсулина для целей проведения непрерывной инфузии, и приводят обширный обзор литературы по этому вопросу, начиная примерно с 1984 г. В настоящее время указанная проблема приобрела еще большую выраженность, поскольку сейчас уже требуются композиции, которые обладали бы стабильностью в течение времени от 1 до 3 месяцев. Инъекционные шприцы-ручки также были разработаны для того, чтобы помочь людям,страдающим диабетом, осуществлять более точное измерение и введение контролируемой дозы инсулина. Обычно указанные шприцыручки снабжены картриджем, который содержит определенное количество закрытого в нем жидкого лекарственного препарата. Картридж включает плунжер и механизм установки плун 002880 2 жера в картридже, с тем чтобы распределять лекарственное средство. Инъекционные шприцы-ручки могут быть многоразовые или одноразовые. В ручках для многоразового применения пользователь может заменять отработанный картридж, вернув винт подачи в исходное положение. В одноразовых шприцах-ручках картридж постоянно закрепляют в шприце и затем выбрасывают после опустошения его содержимого. Композиции инсулина, используемые в таких шприцах-ручках, подвергаются воздействию физического стресса и чаще всего в этих случаях отмечается ограниченная стабильность. С внедрением новых мономерных аналогов инсулина для лечения диабета возникает потребность использовать эти соединения в рамках таких терапевтических режимов, которые могут рассматриваться как фактор риска в отношении присущей используемым композициям стабильности. Быстродействующие инсулины, представляющие собой мономерные аналоги инсулина, будучи хорошо известными на достигнутом уровне техники, раскрыты в патенте США 5 514 646, опубликованном 7 мая 1996 г. (Chance, et al.) и других источникахBrange, et al., Current Opinion in Structural Biology 1:934-940 (1991. Мономерные аналоги инсулина всасываются гораздо быстрее, чем инсулин, и в этой связи идеально подходят при применении их, при наличии такой необходимости, для контроля уровня глюкозы в крови после приема пищи. Кроме того, они также, в связи с быстрым всасыванием непосредственно в месте введения, хорошо подходят для введения их посредством непрерывной инфузии в целях контроля как базального, так и связанного с приемом пищи уровня глюкозы в крови. К сожалению, готовые формы мономерного аналога инсулина при воздействии термомеханического стресса имеют предрасположенность к агрегации и развитию в этой связи нестабильности [Bakaysa, et аl., патент США 5 474 978, опубликованный 12 декабря 1995 г.]. Агрегация может проявляться даже в виде образования осадка инсулина из представителей видов высшего порядка. Таким образом, агрегация может препятствовать воспроизводимой доставке эффективных терапевтических доз мономерных аналогов инсулина и вызывать в связи с этим развитие раздражения в месте введения или других более системных иммунологических реакций. Таким образом, в связи с вышеуказанным, весьма желательны композиции на основе аналога инсулина, стабилизированные тем или иным способом против агрегации. Композиции на основе аналогов инсулина,предназначенные для использования в системах непрерывной инфузии, должны оставаться стабильными и, по существу, не демонстрировать 3 признаков агрегации даже в условиях воздействия тепла человеческого тела и двигательной активности пациента в течение периодов времени, варьирующих от нескольких дней до нескольких месяцев. Нестабильность провоцируется повышенными концентрациями белка, сохранение которых желательно в системах для проведения непрерывной инфузии, а также воздействием термомеханического стресса, который развивается в таких системах непрерывной инфузии. Исходя из этого, улучшение физической и химической стабильности концентрированных композиций аналогов инсулина рассматривается как весьма актуальная задача, решение которой необходимо для принятия решения о возможности использования их в системах непрерывной инфузии. Улучшение стабильности мономерных композиций инсулина с целью применения их по назначению, отличному от непрерывной инфузии, также является желательным. Известны быстродействующие стабилизированные композиции мономерных аналогов инсулина. Бакайса с соавт. (Bakaysa, et al.) в патенте США 5 474 978 раскрывают и заявляют комплекс, содержащий аналог человеческого инсулина, который включает шесть молекул аналога человеческого инсулина (гексамерный комплекс), два атома цинка и, по меньшей мере,три молекулы фенольного консерванта, а также композиции, содержащие гексамерный комплекс, и методы лечения сахарного диабета посредством введения указанной композиции. Бакайса с соавт. (Bakaysa et al.) также заявляют композиции на основе гексамерного комплекса,которые также включают средство поддержания изотоничности раствора и физиологически толерантный буфер. В описании патента США 5 474 978 раскрывается, что цинксодержащие комплексы мономерных аналогов инсулина могут быть приготовлены в присутствии "физиологически толерантного буфера". В числе упомянутых с точки зрения пригодности для использования в рассматриваемых композициях буферов указаны фосфат натрия, ацетат натрия, цитрат натрия и Трис. Однако примеры, приведенные в патенте США 5 474 978 описывают только композиции, в которых в качестве буфера используют фосфат натрия, и в формуле изобретения имеется указание только на фосфат натрия (п.5). Ни один из примеров, приведенных в патенте США 5 474 978, не раскрывает специфически использование Трис-буфера в композициях на основе комплексов цинк-мономерного аналога инсулина. Были разработаны композиции мономерного аналога инсулина, содержащие протамин,для использования его в качестве препарата промежуточной скорости действия. Композиции мономерного аналога инсулина с протамином описаны в патенте США 5 461 031. Методы 4 кристаллизации мономерных аналогов инсулина с основным по свойствам пептидом протамином известны в технике. Кроме того, могут быть приготовлены двухфазные смеси, содержащие раствор мономерного аналога инсулина и суспензию мономерного аналога инсулинапротамина. Указанные смеси обладают оптимальным профилем время-действие, свойственным аналогам, в сочетании с активностью основного по свойствам ингредиента. Мономерные смеси на основе аналога инсулина также описаны в патенте США 5 461 031. Готовые формы на основе суспензии мономерного аналога инсулина с протамином и двухфазные смеси пригодны для использования в контейнере картриджа. При этом, в связи с тем, что такие устройства подвергаются частым манипуляциям со стороны пациентов, композиции подвергаются еще большему стрессу. Композиции, содержащие соль протамина, характеризуются особенно ограниченной стабильностью в случае воздействия термомеханического стресса. Таким образом, имеется потребность в разработке стабильных композиций мономерного аналога инсулина с протамином промежуточной скорости действия, а также композиций из двухфазных смесей. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что при использовании некоторых физиологически толерантных буферов, отличных от фосфата, используемого в композициях на основе комплексов цинк-мономерный аналог инсулина, в композициях, содержащих соль протамина, или в двухфазных смесях мономерного аналога инсулина, физическая стабильность композиции неожиданно и значительно повышается, по сравнению с использованием фосфатного буфера. Наиболее преимущественным является открытие нами того, что в то время как растворимые композиции комплексов цинкмономерный аналог инсулина в случае использования фосфатного буфера, такого как конкретно приводится в примерах патента США 5 474 978, не обладают физической стабильностью, достаточной для целей длительного введения в системах непрерывной инфузии с использованием насосного устройства, растворимые композиции, приготовленные по настоящему изобретению, достаточно стабильны с точки зрения возможности их безопасного и длительного использования для инфузии инсулина. Мы также обнаружили, что добавление аргинина к содержащим соль протамина композициям мономерных аналогов инсулина приводит к резкому усилению как физической, так и химической стабильности композиции. В соответствии с вышесказанным, настоящее изобретение относится к раствору готовой формы, включающей физиологически толерантный буфер, выбранный из группы, состоящей из Триса и аргинина, а также мономерный аналог инсулина, цинк и фенольный консервант. 5 Изобретение также включает в свои рамки готовую форму на основе инсулинового аналога, включающую мономерный аналог инсулина,цинк, фенольный консервант, протамин и буфер, выбранный из группы, состоящей из Триса и аргинина. Изобретение относится также к способам применения готовых форм аналога инсулина для лечения диабета и гипергликемии у пациентов, нуждающихся в таком лечении, готовых форм на основе аналога инсулина, которые включают введение пациенту стабильной готовой формы по настоящему изобретению. В целях настоящего изобретения в описании и формуле изобретения использованные термины и сокращения имеют следующие значения. Термин "вводить" относится к введению готовой формы по настоящему изобретению в организм пациента, при наличии необходимости в лечении заболевания или болезненного состояния. Различные формы глагола "агрегировать" относятся к способу, посредством которого индивидуальные молекулы или комплексы ассоциируют с образованием агрегатов. Агрегат представляет собой полимерную конструкцию,включающую молекулы или комплексы мономерного аналога инсулина. В контексте настоящего описания гексамер мономерного аналога инсулина является не агрегатом, а комплексом. Мономерные аналоги инсулина и их гексамерные комплексы имеют склонность к агрегированию при воздействии на них термомеханического стресса. Агрегация может зайти так далеко, что становится видимой по образованию осадка. Термин "аргинин" относится к аминокислоте и включает D-и L-энантиомеры, равно как и их смеси. Термин также охватывает их любые фармакологически приемлемые соли. На достигнутом уровне техники аргинин известен также как 1-амино-4-гуанидиновалериановая кислота. Аргинин легко образует соли, такие как соли хлористо-водородной кислоты. Термин "комплекс" относится к соединению, в котором переходный металл находится координационно связанным, по меньшей мере, с одним лигандом. Лиганды включают азотсодержащие молекулы, такие как белки, пептиды,аминокислоты и Трис, к числу которых относятся многие соединения. Мономерный аналог инсулина может рассматриваться как лиганд двухвалентных ионов цинка. Термин "непрерывная система инфузии" относится к устройству для непрерывного введения жидкости в организм пациента парентеральным способом в течение продолжительного периода времени или для перемежающегося введения жидкости в организм пациента парентеральным способом в течение продолжительного периода времени без установления каждый 6 раз, как при новом акте введения жидкости, соответствующего места для ее поступления в организм. Жидкость содержит терапевтическое(ие) средство или средства. Устройство включает резервуар, в котором жидкость содержится до момента инфузии, насос, катетер или другое трубочное устройство для соединения с помощью насоса резервуара с местом введения, а также контрольные элементы для регулирования работы насоса. Устройство может быть сконструировано пригодным для имплантирования, обычно подкожным способом. В каждом случае инсулиновый резервуар, как правило, приспосабливают для возможности чрескожного наполнения. Очевидно, что когда устройство имплантировано, содержимое резервуара имеет температуру тела пациента и испытывает воздействие от его двигательной активности. Термин "средство поддержания изотоничности раствора" относится к соединению, которое будучи физиологически толерантным, придает раствору соответствующую изотоничность для предупреждения потока жидкости через клеточные мембраны, которые контактируют с готовой формой. Для таких целей широко используют соединения, такие как глицерин, которые используют в уже известных концентрациях. Другие возможные средства поддержания изотоничности раствора включают соли, например хлорид натрия, декстрозу и лактозу. Термины "мономерный аналог человеческого инсулина", "мономерный аналог инсулина" и "аналог человеческого инсулина" хорошо известны из уровня техники и относятся в целом к быстродействующим аналогам человеческого инсулина, которые включают человеческий инсулин, в котором Pro в положении В 28 замещен ASP, Lys, Leu, Val илиAla и в котором положение В 29 занимает Lys или он замещен Pro; АlаВ 26-человеческий инсулин;des(B27) человеческий инсулин. Такие мономерные аналоги инсулина описаны в ряде источников (Chance, et al., Патент США 5 514 646, опубликованный 7 мая 1996 г.; Chance, et al., заявка на патент США, серийный 08/255 297; Brems, et al., Protein Engineering, 6:527-533 (1992); Brange, et al., публикация ЕРО 214 826 (опубликованная 18 марта 1987 г.) and Brange, et al., Current Opinion inStructural Biology 1:934-940 (1991. Мономерные аналоги инсулина, применяемые в настоящих готовых формах, соединены соответствующими сшивками. Сшитый надлежащим образом аналог инсулина содержит три дисульфидных мостика: один между 7-ым положением в А-цепи и 7-ым положением в Вцепи, второй - между 20-ым положением в Ацепи и 19-ым положением в В-цепи, и третий между положениями 6 и 11 в А-цепи. 7 Термин "фенольный консервант" в контексте настоящего описания относится к хлоркрезолу, м-крезолу, фенолу или их смесям. В контексте настоящего описания термин"стабильность" относится к физической стабильности готовых форм мономерных аналогов инсулина. Физическая нестабильность белковой композиции может быть вызвана агрегацией молекул белка с образованием полимеров более высокого порядка или даже с выпадением осадка. "Стабильной" является такая композиция, в которой степень агрегации белков контролируется на надлежащем уровне, так что она не повышается со временем до неприемлемых значений. Готовые формы мономерных аналогов инсулина имеют тенденцию к агрегации при воздействии на них термомеханического стресса. При этом физическая стабильность может быть оценена с помощью известных в технике методов, включающих измерение видимого ослабления световых характеристик образцов (поглощения или оптической плотности). Такое измерение ослабления световых характеристик имеет отношение к мутности композиции. Тогда как мутность возникает при агрегировании или осаждении белков или комплексов в композиции. В технике хорошо известны также другие методы оценки физической стабильности. Термин "лечение" относится к терапевтическому ведению больных с диабетом или гипергликемией и уходу за ними, а также с другим состоянием, в случае которых показано введение инсулина в целях борьбы или облегчения симптомов и осложнений, характерных для таких состояний. Лечение включает введение готовой формы по настоящему изобретению для предупреждения начала развития симптомов или осложнений, для облегчения течения симптомов или осложнений или для устранения заболевания, состояния или нарушения. Термин "Трис" относится к 2-амино-2 гидроксиметил-1,3-пропандиолу и к его любой фармакологически приемлемой соли. Обычными формами Триса являются свободное основание и гидрохлорид. Трис известен в технике также как триметилола аминометан, трометамин и трис(гидроксиметил)аминометан. Из приведенных ниже данных видно, что готовые формы мономерных аналогов инсулина по настоящему изобретению обладают значительно улучшенной физической стабильностью в сравнении с таковыми, известными в настоящее время в технике. Приготовленные принципиально по процедуре примера 3 настоящего описания готовые формы, включающие мономерный инсулиновый аналог - LysB28ProB29 - аналог человеческого инсулина и Трис, подвергают испытаниям на стабильность в тесте с ускорением, как приведено ниже. Образцы приготовленных композиций помещают в очищенные стеклянные аутосамплерные флаконы для ВЭЖХ емкостью 2 8 мл. Каждый флакон содержит три тефлоновых шарика диаметром примерно 3/16 дюйма(0,00476 м). Воздух полностью удаляют из флакона, замещая его образцом испытуемой композиции. После закрытия флаконы непрерывно встряхивают при 40 Гц (среднее линейное ускорение 20 х g) с амплитудой от пика к пику в 12 мм, и при температуре 37 С сообщают готовым формам относительно высокий уровень механической энергии, т.е. при такой температуре, которая благоприятствует агрегированию и физической нестабильности. Флаконы помещают на вибратор, так чтобы они в своем длинном измерении (т.е. от вершины к донышку) были ориентированы параллельно направлению линейного ускорения, иными словами, их укладывают на бок на поверхности вибратора. Для инсулиновых композиций было показано, что повышенная стабильность в описанных условиях ускорения коррелирует со значительно улучшенной стабильностью их при использовании. Периодически на спектрофотометре Shimadzu 1201 измеряют оптическую плотность образцов опытных и контрольных композиций. Образцы контрольных композиций готовят тем же способом, что и опытные композиции, но хранят их при 4 С без встряхивания. Вычисляют результирующее значение оптической плотности, вычитая от величины оптической плотности опытного образца величину оптической плотности контрольного образца. В табл. 1 показаны средние значения результирующей оптической плотности и значения стандартного отклонения для ряда (n) образцов. Образцы опытной и контрольной композиций, содержащие в качестве буфера фосфат (рН 7,40,1), готовят, по существу, так, как описано в примере 4. Таблица 1. Влияние буфера и времени экспозиции под действием механической энергии при 37 С на мутность (оптическую плотность при 450 нм) композиций LysB28ProB29 аналога человеческого инсулина Оптическая плотность при 450 нм 16 ч 70 ч 100 ч 500 ч Пример 3 0,020,01 0,030,02 0,010,01 0,040,01 В описанных выше условиях мутность готовых форм, включающих фосфатный буфер,достигает очень высоких значений, которые становятся неприемлемыми к 16 ч (табл. 1, пример 4), в сравнении с контрольными готовыми формами, содержащими фосфат, но которые хранятся при 4 С без встряхивания. С другой стороны, оптическая плотность готовых форм,включающих Трис в качестве буфера, остается практически такой же, как и оптическая плотность контроля в течение 500 ч хранения композиций, содержащих Трис (пример 3). Данные,приведенные в табл. 1, отчетливо демонстрируют, что замещение фосфатного буфера на Трис 9 буфер в готовых формах на основе LysB28ProB29 аналога человеческого инсулина сильно повышает стабильность готовых форм. На основе наблюдений, сделанных с использованием других инсулиновых готовых форм, можно полагать, что столь неожиданно и значительно возросшая стабильность готовых форм на основе мономерного инсулинового аналога в Трисбуфере в тесте с ускорением будет перенесена на стабильность при их практическом использовании в течение периода времени более 500 ч,поскольку в проведенном ускоренном испытании оказывается более сильное воздействие, чем при использовании таких средств в ожидаемом режиме. Готовые формы, включающие мономерный аналог инсулина -LysB28ProB29 - аналог человеческого инсулина, и либо Трис, либо фосфат, либо аргинин в качестве буфера, готовятся,по существу, в соответствии с процедурами,описанными в примерах 3, 4 и 5, соответственно. Для приготовления готовых форм используют три лота LysB28ProB29 - аналога человеческого инсулина. Полученные комбинации каждого из лотов аналога и буфера испытывают в виде шести образцов в тесте на стабильность,как описано выше. Для сообщения флаконам с образцами механической энергии используют четыре вибратора. Стабильность готовых форм оценивают при периодическом измерении оптической плотности опытных и контрольных образцов, как описано выше. Результаты приведены в табл. 2. В табл. 2 показаны средние значения результирующей оптической плотности и значения стандартного отклонения для шести образцов, включающих каждый из лотов и буфер. Таблица 2. Влияние буфера, лота аналога и времени экспозиции под сильным механическим воздействием при 37 С на мутность (оптическую плотность при 450 нм) композиций LysB28ProB29 - аналога человеческого инсулина. Буфер Лот Оптическая плотность при 450 нм аналога 23 ч 47 ч 87 ч 139 ч Трис Лот 1 0,020,02 0,060,02 0,050,02 0,000,02 Лот 2 0,000,01 0,040,02 0,030,01 0,000,02 Лот 3 0,020,02 0,050,03 0,040,03 0,010,02 Аргинин Лот 1 0,010,02 0,040,02 0,040,02 2,121,03 Лот 2 0,010,02 0,040,02 0,060,08 1,800,60 Лот 3 0,000,02 0,030,02 1,840,66 Н.О. Фосфат Лот 1 0,130,06 2,680,17 2,610,11 Н.О. Лот 2 0,210,24 2,140,75 2,750,14 Н.О. Лот 3 0,290,23 2,750,14 2,790,11 Н.О. В описанных выше условиях мутность готовых форм, включающих фосфатный буфер,достигает очень высоких значений, которые становятся неприемлемыми к 23 ч, независимо от используемого лота аналога (табл. 2). И напротив, мутность готовых форм, содержащих Трис в качестве буфера, остается практически без изменений в течение 139 ч, независимо от использованного лота инсулина. Композиции,содержащие L-аргининовый буфер, демонстри 002880 10 руют лучшую физическую стабильность в сравнении с композициями, содержащими фосфат, и длительность периода их стабильности несколько зависит от использованного лота инсулина. Данные, приведенные в табл. 2, отчетливо показывают, что композиции на основе LysB28ProB29 аналога человеческого инсулина, включающие Трис-буфер или аргининовый буфер при рН 7,4,остаются стабильными в течение заметно более продолжительных периодов времени, чем готовые формы, содержащие фосфатный буфер. И здесь вновь можно полагать, что столь неожиданно и значительно возросшая стабильность готовых форм на основе мономерного аналога инсулина в Трис и L-аргининовом буфере будет перенесена на стабильность при их практическом использовании, причем в большей степени, чем отмечалось в тесте с ускорением, поскольку в проведенном ускоренном испытании оказывается более сильное воздействие, чем при планируемом использовании таких средств. Чувствительность, проявляющуюся в изменениях морфологии и внешнем виде готовых форм суспензии LysB28Pro,B29 оценивают в стрессовом испытании на физическую стабильность (СИФС (PSST. В рамках указанного термомеханического метода препараты закрывают без свободного пространства над продуктом в контейнерах фиксированного объема, содержащих внутри стеклянные шарики. Контейнеры помещают в камеры в условия повышенных температур (приблизительно 37 С), которые вращают с фиксированной скоростью (примерно 30 об/мин) в течение заданного периода времени (примерно 4 ч) и затем оставляют в покое на оставшиеся 24 ч. Контейнеры оценивают на наличие изменений и удаляют из тестирования, если обнаруживается агрегирование(сгустки). Более продолжительные сроки испытания, равно как большее число остающихся для дальнейшего тестирования контейнеров, соотносятся с увеличением физической стабильности. Испытывают две различные смеси, содержащие кристаллы LysB28ProB29 и LysB28ProB29 протамина. Коэффициент соотношенияLysB28ProB29 к LysB28ProB29-протамину составляет для смеси с низким содержанием LysB28ProB29 25:75 и для смеси с высоким содержаниемLysB28ProB29 - 75:25. Смеси готовят по процедурам, описанным в примерах 6 и 7. При испытании по СИФС-методу смеси с низким содержанием после 18 дней остаются только контейнеры, содержащие готовые формы с аргинином. В двух исследованных образцах имелись контейнеры, которые оставались вплоть до 44 дней. СИФС-метод на образцах с высоким содержанием продемонстрировал сходные результаты на готовых формах, содержащих аргинин, когда примерно 50% контейнеров оставалось по истечении 36 дней тестирования, тогда как в случае контрольных композиций, содержащих фосфат 11 ный буфер, после 36 дней оставалось всего от 0 до 5% контейнеров. Для использования в готовых формах по настоящему изобретению предпочтительными мономерными аналогами инсулина являютсяLysB28ProB29 - человеческий инсулин, АspB28 человеческий инсулин и АlaB26-человеческий инсулин. Концентрация мономерного аналога инсулина в готовых формах по настоящему изобретению варьирует от 1,2 до 50 мг/мл. Предпочтительный диапазон концентраций аналога составляет от примерно 3,0 до примерно 35 мг/мл. Более предпочтительные концентрации составляют примерно 3,5 мг/мл, примерно 7, примерно 14, примерно 17,5 и примерно 35 мг/мл, что приблизительно соответствует композициям,имеющим активность инсулина примерно 100,примерно 200, примерно 400, примерно 500 и примерно 1000 единиц на мл, соответственно. Концентрация цинка в готовых формах по настоящему изобретению варьирует от примерно 4,5 до примерно 370 мг/мл, при этом она должна быть такой, чтобы для целей образования комплекса с шестью молекулами инсулина в каждом гексамере были доступны, по меньшей мере, два атома цинка. Коэффициент отношения общего количества цинка (т.е. цинка,участвующего и не участвующего в образовании комплекса) к инсулиновому аналогу в гексамере должен составлять от 2 до 4. Предпочтительным является коэффициент, характеризующий наличие в гексамерном комплексе от примерно 3 до примерно 4 атомов общего цинка на один инсулиновый аналог. Для образования гексамера мономерного аналога инсулина в готовых формах по настоящему изобретению требуется минимальная концентрация фенольного консерванта. Для некоторых целей, например достижения полной консервирующей эффективности в готовых формах,предназначенных для многократного использования, концентрация фенольного консерванта в композициях по настоящему изобретению может быть увеличена сверх количества, необходимого для образования гексамеров, до того уровня, которое требуется для поддержания консервирующей эффективности. Концентрация консерванта, необходимая для достижения эффективной сохранности, зависит от природы используемого консерванта, рН композиции и от того, присутствуют ли также вещества, которые связываются или образуют комплексы с консервантом. В общем случае, данные о необходимом количестве консерванта имеются, например, в руководстве по биологической стандартизации (Wallhauser, K.DH., Develop. Biol.Standard. 24, pp. 9-28 (Basel, S. Krager, 1974. При изготовлении композиции используемый в композициях по настоящему изобретению гексамерный комплекс аналога инсулина связывает до семи молекул фенольного консерванта, хотя 12 обычно с гексамером связывается шесть молекул фенольного соединения. Для образования гексамера требуется минимум три молекулы фенольного соединения. В том случае, когда консервант применяют для достижения антимикробной эффективности, предпочтительная концентрация фенольного консерванта составляет примерно от 23 до примерно 35 мМ. Предпочтительными консервантами являются мкрезол и фенол, либо по отдельности, либо в смеси друг с другом. Готовые формы могут необязательно содержать средство для поддержания изотоничности раствора. Композиции предпочтительно содержат средство для поддержания изотоничности раствора, при этом глицерин является наиболее предпочтительным средством для поддержания изотоничности раствора. Концентрация глицерина, в случае его использования,варьирует в диапазоне, известном специалистам по созданию инсулиновых композиций, составляя предпочтительно примерно 16 мг/мл. рН готовых форм контролируется буферным агентом, таким как Трис или L-аргинин. Вряд ли концентрация буферов играет решающую роль в достижении цели настоящего изобретения, однако она должна быть такой, чтобы обеспечивать забуферивающее действие и поддерживать рН при хранении на уровне целевом значения рН 0,1 рН единиц. Предпочтительное значение рН находится в диапазоне от примерно 7 до примерно 8, в случае измерения его при температуре примерно 22 С. В готовую форму необязательно могут быть внесены и другие добавки, такие как фармацевтически приемлемые солюбилизаторы типа Твин 20 (полиоксиэтилен (20) сорбитана монолаурат), Твин 40 (полиоксиэтилен (20) сорбитана монопальмитат), Твин 80 (полиоксиэтилен (20) сорбитана моноолеат), ПлуроникF68 (блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена) и ПЭГ (полиэтиленгликоль). Указанные добавки не требуются для получения дополнительных преимуществ в рамках настоящего изобретения, однако они могут быть полезны в том случае, если композиции будут контактировать с пластическими материалами. Настоящее изобретение также включает в свои рамки препараты на основе протаминовой соли с варьирующими пропорциями растворимых фракций мономерных аналогов инсулина. Для целей стабилизации готовой формы с аргинином отсутствуют какие-либо специфические требования относительно конформации инсулиновой молекулы, хотя наполнители, такие как цинк и консерванты, обычно добавляемые в инсулиновые композиции (что обсуждалось выше), могут согласованно работать с аргинином, приводя к повышению стабильности. В готовых формах, содержащих протамин, концентрации аргинина варьируют в диапазоне от 1 до 100 мМ. Наиболее предпочтительны концен 13 трации аргинина от 5 до 25 мМ. Аргинин может быть внесен как добавочный ингредиент в растворы или осажденные суспензии, которые уже содержат ионы цинка и фенольные консерванты. Введение может быть осуществлено через любой привычный способ, который, по мнению врача, являются эффективным. Предпочтительно парентеральное введение. При этом под парентеральным введением обычно подразумевается способ введения, отличный от режима приема через желудочно-кишечный тракт. Предпочтительные парентеральные способы для введения готовых форм по настоящему изобретению включают внутривенный, внутримышечный, подкожный,внутрибрюшинный, внутриартериальный, назальный, легочный и трансбуккальный способы. Более предпочтительными способами парентерального введения композиций по настоящему изобретению являются внутривенный, внутрибрюшинный,внутримышечный и подкожный способы введения. Еще более предпочтительными способами являются внутривенный, внутрибрюшинный и подкожный способы введения готовых форм по настоящему изобретению. Употребление с использованием определенных парентеральных путей может включать введение готовых форм по настоящему изобретению в организм пациента через иглу или катетер, под напором стерильного шприца или ряда других механических устройств, таких как непрерывная система инфузии. Готовая форма по настоящему изобретению может быть введена с использованием шприца, инжектора, насоса или любого другого известного в практике устройства, которое применяют для целей парентерального введения. Готовая форма по настоящему изобретению может также быть введена в виде аэрозоля с целью последующей абсорбции в легких или носовой полости. Готовые формы могут также вводиться в виде, пригодном для целей абсорбции через слизистые мембраны,например посредством трансбуккального способа. Количество вводимой для лечения диабета или гипергликемии готовой формы по настоящему изобретению зависит от множества факторов, в число которых включаются, не ограничиваясь ими, пол больного, его вес и возраст, а также причины, лежащие в основе заболевания или состояния, которое подлежит лечению, способ введения и биологическая доступность, устойчивость в организме вводимого мономерного аналога инсулина, вид препарата и активность мономерного аналога инсулина. В том случае, когда введение осуществляется в перемежающемся режиме, для определения поступающей в ходе одного введения количества композиции следует принимать во внимание интервалы между дозами и биологическую доступность мономерного аналога инсулина в данной готовой форме. Введение готовой формы по настоящему изобретению может осуществлять 002880 14 ся в непрерывном режиме. При этом любой врач со средним уровнем знаний может определить дозу и скорость инфузии или частоту введения готовой формы по настоящему изобретению, с тем чтобы достигнуть желаемого клинического результата. Используемые в рамках настоящего изобретения мономерные аналоги инсулина могут быть получены с использованием любой из множества признанных методик пептидного синтеза, включая классические методы синтеза в растворе, методы твердофазного синтеза, полусинтетические методы и методы, основанные на применении рекомбинантной ДНК. Чанс с соавт. (Chance, et al.) в патенте США 5 514 646, опубликованном 7 мая 1996 г., раскрывают получение мономерных аналогов инсулина,причем достаточно детально, что позволяет любому специалисту со средним уровнем знаний в данной области готовить мономерные аналоги инсулина по настоящему изобретению. И цинк, и фенольный консервант используют в количествах, достаточных для получения комплекса, который характеризовался бы стабильностью и способностью к быстрой диссоциации с запуском действия. Гексамерный комплекс включает два иона цинка на гексамер человеческого аналога инсулина, и, по меньшей мере, три молекулы фенольного консерванта,выбранного из группы, состоящей из хлоркрезола, м-крезола, фенола и их смесей. Растворимый мономерный аналог инсулина превращают в гексамерный комплекс растворением при рН от примерно 1 до примерно 8 мономерного аналога инсулина в разбавителе,содержащем в надлежащем количестве фенольный консервант, и затем добавляют цинк. Цинк добавляют предпочтительно в виде соли цинка,такой как, не ограничивая список приведенными примерами, ацетат цинка, бромид цинка,хлорид цинка, фторид цинка, иодид цинка и сульфат цинка. При этом для любого специалиста со средним уровнем знаний в данной области очевидно, что имеется множество других солей цинка, которые также могут использоваться для изготовления комплексов на основе мономерного аналога инсулина как части настоящего изобретения. Предпочтительно используют ацетат цинка, оксид цинка или хлорид цинка, поскольку внесение указанных соединений не сопровождается добавлением новых ионов химических веществ в коммерчески отработанный процесс. Растворение мономерного аналога инсулина может сопровождаться тем, что широко известно как "кислое растворение". При кислом растворении рН растворителя понижают до значений примерно от 3,0 до 3,5 с использованием физиологически толерантной кислоты, предпочтительно НСl, для помощи в растворении мономерного аналога. Другие физиологически толерантные кислоты включают, не ограничиваясь 15 ими, уксусную кислоту, лимонную кислоту и серную кислоту. При изготовлении композиций по настоящему изобретению предпочтительно не используют фосфорную кислоту для подведения рН. Затем рН корректируют, подводя до значения примерно от 7,3 до 7,5, с использованием физиологически толерантного основания,предпочтительно гидроксида натрия. Другие физиологически толерантные основания включают, не ограничиваясь ими, гидроксид калия и гидроксид аммония. После этого добавляют фенольный консервант и цинк. Парентеральные композиции по настоящему изобретению могут быть получены с использованием традиционных процедур растворения и смешивания. Для получения приемлемой композиции, например, отмеренное количество мономерного аналога инсулина в воде смешивают с желательным консервантом, соединением цинка и забуферивающим агентом в воде, беря все в достаточных количествах для образования гексамерного комплекса. Перед введением полученную композицию фильтруют в стерильных условиях. Некоторые вариации этого процесса возможны, и они известны специалистам в данной области. Так, например,порядок добавления компонентов, режим корректировки рН, если она проводится, температура и ионная сила раствора могут быть оптимизированы с точки зрения концентрации и используемых способов введения. Приведенные ниже примеры и способы получения даны лишь для иллюстрации возможных способов изготовления готовых форм по настоящему изобретению. При этом рамки настоящего изобретения не ограничиваются указанными примерами. Пример 1. Получение растворимой готовой формы с активностью 100 Ед., содержащейLysB28ProB29- аналог человеческого инсулина и Трис. Вычисляют количество кристалловLysB28ProB29- аналог человеческого инсулинацинка, которое соответствует активности 100 Ед. инсулина на миллилитр готовой композиции и суспендируют его в водном растворе, содержащем 0,715 мг/мл фенола, 1,76 мг/мл мкрезола, 16 мг/мл глицерина и оксид цинка. Кристаллы инсулинового аналога-цинка содержат примерно 0,36 вес.% цинка. Концентрацию оксида цинка в водном разбавителе подбирают так, чтобы обеспечить конечную концентрацию ионов цинка в композиции примерно на уровне 0,025 мг на 100 единиц активности инсулина. Добавляют некоторый объем 10% соляной кислоты, с тем чтобы подвести рН до значений примерно 2,8-3,0. После перемешивания для растворения кристаллов осторожно добавляют аликвоты 10% раствора гидроксида натрия для подведения рН до значений 7,4-7,7. К раствору инсулинового аналога добавляют объем основного раствора Трис (50 мг/мл, рН 7,4, отмеренный при температуре окружающей среды, т.е. 16 примерно 22 С), вычисленный так, чтобы обеспечить в готовой композиции концентрацию Трис на уровне 2 мг/мл. Добавляют воду для разбавления композиции до конечного объема. Затем готовую форму стерильно фильтруют с использованием фильтра с диаметром пор 0,2 микрона. Пример 2. Получение растворимой готовой формы с активностью 100 Ед., содержащейLysB28ProB29- аналог человеческого инсулина и Lаргинин. Следуют процедуре, описанной в примере 1, вплоть до добавления буфера. Затем, вместо добавления основного раствора Трис-буфера, в раствор аналога инсулина вносят основной раствор L-аргинина (200 мM, pH 7,4) в таком объеме, чтобы расчетная концентрация L-аргинина в готовой форме составляла 20 мМ. Добавляют воду для разбавления готовой формы до конечного объема. Полученную композицию подвергают стерильному фильтрованию с использованием фильтра с размером пор 0,2 микрон. Пример 3. Получение растворимой готовой формы с активностью 400 Ед., содержащейLysB28ProB29-аналога человеческого инсулинацинка, которое соответствует активности 400 Ед. инсулина на миллилитр готовой формы и суспендируют его в водном растворе, содержащем 0,715 мг/мл фенола, 1,76 мг/мл м-крезола,16 мг/мл глицерина и оксид цинка. Кристаллы инсулинового аналога-цинка содержат примерно 0,36 вес.% цинка. Концентрацию оксида цинка в водном разбавителе подбирают так,чтобы обеспечить конечную концентрацию ионов цинка в готовой форме примерно на уровне 0,025 мг на 100 единиц активности инсулина. Добавляют некоторый объем 10% соляной кислоты, с тем чтобы подвести pH до значений примерно 2,8-3,0. После перемешивания для растворения кристаллов осторожно добавляют аликвоты 10% раствора гидроксида натрия для подведения pH до значений 7,4-7,7. К раствору инсулинового аналога добавляют объем основного раствора Трис (50 мг/мл, pH 7,4, отмеренный при температуре окружающей среды, т.е. примерно 22 С), вычисленный так, чтобы обеспечить в готовой форме концентрацию Трис на уровне 2 мг/мл. Добавляют воду для разбавления готовой формы до конечного объема. Затем композицию стерильно фильтруют с использованием фильтра с диаметром пор 0,2 микрона. Пример 4. Получение растворимой готовой формы с активностью 400 Ед., содержащейLysB28ProB29- аналог человеческого инсулина и фосфат. Вычисляют количество кристалловLysB28ProB29-аналога человеческого инсулинацинка, которое соответствует активности 400 Ед. инсулина на миллилитр готовой формы и 17 суспендируют его в водном растворе, содержащем 0,715 мг/мл фенола, 1,76 мг/мл м-крезола,16 мг/мл глицерина и оксид цинка. Кристаллы инсулинового аналога-цинка содержат примерно 0,36 вес.% цинка. Концентрацию оксида цинка в водном разбавителе подбирают так,чтобы обеспечить конечную концентрацию ионов цинка в готовой форме примерно на уровне 0,025 мг на 100 единиц активности инсулина. Добавляют некоторый объем 10% соляной кислоты, с тем чтобы подвести рН до значений примерно 2,8-3,0. После перемешивания для растворения кристаллов осторожно добавляют аликвоты 10% раствора гидроксида натрия для подведения рН до значений 7,4-7,7. К раствору инсулинового аналога добавляют основной раствор вторичного кислого фосфата натрия, в таком объеме, чтобы обеспечить в готовой форме концентрацию вторичного кислого фосфата натрия на уровне 3,78 мг/мл, рН 7,40,1. Добавляют воду для разбавления готовой формы до конечного объема. Затем готовую форму стерильно фильтруют с использованием фильтра с диаметром пор 0,2 микрона. Пример 5. Получение растворимой готовой формы с активностью 400 Ед., содержащейLysB28ProB29-аналог человеческого инсулина и Lаргинин. Следуют процедуре, описанной в примере 3, вплоть до добавления буфера. Затем, вместо добавления основного раствора Трис-буфера, в раствор аналога инсулина вносят основной раствор L-аргинина (200 мМ, рН 7,4) в таком объеме, чтобы расчетная концентрация L-аргинина в готовой форме составляла 20 мМ. Добавляют воду для разбавления готовой формы до конечного объема. Полученную готовую форму подвергают стерильному фильтрованию с использованием фильтра с размером пор 0,2 микрон. Пример 6. Получение смеси готовых форм в 100 Ед. с высоким содержанием LysB28ProB29 аналога человеческого инсулина (75 объемн.% растворимого, 25 объемн.% нейтрального протамин-LysB28ProB29), содержащей L-аргинин. А. Получение нейтрального протаминLysB28ProB29. Вычисляют количество кристалловLysB28ProB29-цинк-инсулина, которое соответствует активности 200 Ед./мл и суспендируют его в водном растворе, содержащем 0,715 мг/мл фенола, 1,76 мг/мл м-крезола, 16 мг/мл глицерина и оксид цинка, подкисленном соляной кислотой, так чтобы обеспечить конечную концентрацию ионов цинка в композиции примерно на уровне 0,025 мг/100 Ед. Добавляют некоторый объем 10% соляной кислоты, с тем чтобы подвести рН до значений примерно 2,8-3,0. После растворения с помощью перемешивания,добавляют 10% раствор гидроксида натрия для подведения рН до значений 7,4-7,7. Затем добавляют основной раствор вторичного кислого фосфата натрия с концентрацией 75,6 мг/мл при 18 рН 7,2, в количестве, эквивалентном его концентрации в готовой композиции в 3,78 мг/мл. После растворения осадка твердого вещества и титрования для поддержания значения рН на уровне 7,4 добавляют воду для разбавления готовой формы до конечного объема, после чего раствор фильтруют. Рассчитывают количество твердого протамин-сульфата, содержащего 0,6 мг/100 Ед. протамина-основания, и растворяют его в водном растворе, содержащем 0,715 мг/мл фенола, 1,76 мг/мл м-крезола и 16 мг/мл глицерина. Добавляют вторичный кислый фосфат натрия в таком количестве, чтобы конечная концентрация его в готовой форме составила 3,78 мг/мл. Величину рН раствора подводят до 7,4 с помощью 10% соляной кислоты, разбавляют его водой до нужного объема и фильтруют. Раствор LysB28ProB29 с активностью 200 Ед. и раствор протамина уравновешивают при 15 С. Раствор протамина добавляют к растворуLysB28ProB29 и полученную суспензию инкубируют ненарушенной при 15 С в течение 24 ч. Б. Получение смеси с высоким содержанием LysB28ProB29. Полученный по процедуре примера 2 раствор LysB28ProB29 с активностью 100 Ед., в количестве, соответствующем его 75% содержанию в конечном объеме, добавляют к расчетному объему нейтрального протамин-LysB28ProB29 с активностью 100 Ед./мл. Суспензию перемешивают при температуре окружающей среды. Пример 7. Получение смеси готовых форм в 100 Ед. с низким содержанием LysB28ProB29 аналога человеческого инсулина (25 объемн.% растворимого, 75 объемн.% нейтрального протамин-LysB28ProB29), содержащей L-аргинин А. Получение нейтрального протаминLysB28ProB29. Вычисляют количество кристалловLysB28ProB29-цинк-инсулина, которое соответствует активности 200 Ед./мл и суспендируют его в водном растворе, содержащем 0,715 мг/мл фенола, 1,76 мг/мл м-крезола, 16 мг/мл глицерина и оксид цинка, подкисленном соляной кислотой, так чтобы обеспечить конечную концентрацию ионов цинка в готовой форме примерно на уровне 0,025 мг/100 Ед. Добавляют некоторый объем 10% соляной кислоты, с тем чтобы подвести рН до значений примерно 2,83,0. После растворения с помощью перемешивания, добавляют 10% раствор гидроксида натрия для подведения рН до значений 7,4-7,7. Затем добавляют основной раствор вторичного кислого фосфата натрия с концентрацией 75,6 мг/мл при рН 7,2, в количестве, эквивалентном его концентрации в готовой форме в 3,78 мг/мл. После растворения осадка твердого вещества и титрования для поддержания значения рН на уровне 7,4 добавляют воду для разбавления формы до конечного объема, после чего раствор фильтруют. 19 Рассчитывают количество твердого протамин-сульфата, содержащего 0,6 мг/100 Ед. протамина-основания, и растворяют его в водном растворе, содержащем 0,715 мг/мл фенола, 1,76 мг/мл м-крезола и 16 мг/мл глицерина. Добавляют вторичный кислый фосфат натрия в таком количестве, чтобы конечная концентрация его в готовой форме составила 3,78 мг/мл. Величину рН раствора подводят до 7,4 с помощью 10% соляной кислоты, разбавляют его водой до нужного объема и фильтруют. Раствор LysB28ProB29 с активностью 200 Ед. и раствор протамина уравновешивают при 15 С. Раствор протамина добавляют к растворуLysB28ProB29 и полученную суспензию инкубируют ненарушенной при 15 С в течение 24 ч. Б. Получение смеси с низким содержаниемLysB28ProB29. Полученный по процедуре примера 2 раствор LysB28ProB29 с активностью 100 Ед., в количестве, соответствующем его 25% содержанию в конечном объеме, добавляют к расчетному объему нейтрального протамин-LysB28ProB29 с активностью 100 Ед./мл. Суспензию перемешивают при температуре окружающей среды. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Готовая форма в виде раствора, включающаяa) физиологически толерантный буфер,выбранный из группы, состоящей из Трис и аргинина;b) мономерный аналог человеческого инсулина, выбранный из группы, состоящей из человеческого инсулина, в котором Pro в положении В 28 замещен Asp, Lys, Leu, Val или Ala и в котором Lys в положении В 29 представляет собой Lys или замещен Pro; AlaB26-человеческий инсулин, дез-(В 28-В 30)человеческий инсулин и дез-(В 27)человеческий инсулин;d) фенольный консервант. 2. Готовая форма по п.1, в которой мономерный аналог инсулина представляет собойLysB28ProB29-человеческий инсулин, а буфер представляет собой Трис. 3. Готовая форма по п.2, которая дополнительно включает средство для поддержания изотоничности раствора и рН которой, измеренный при температуре 22 С, имеет значение от рН 7,0 до рН 8,0. 4. Готовая форма по п.3, в которой концентрация LysB28ProB29-человеческого инсулина составляет от примерно 1,2 до примерно 50 мг/мл. 5. Готовая форма по п.4, в которой концентрация LysB28ProB29-человеческого инсулина составляет от примерно 3,0 до примерно 35 мг/мл. 6. Готовая форма по п.5, в которой Трис присутствует в концентрации примерно 2 мг/мл; 20 глицерин представляет собой средство для поддержания изотоничности раствора и присутствует в концентрации примерно 16 мг/мл; мкрезол присутствует в концентрации примерно 1,76 мг/мл и фенол присутствует в концентрации примерно 0,715 мг/мл. 7. Стабильная растворимая готовая форма мономерного аналога человеческого инсулина для использования в системе непрерывной инфузии, которая, по существу, состоит изa) средства для поддержания изотоничности раствора;b) буфера, выбранного из группы, состоящей из Трис и аргинина;c) мономерного аналога инсулина, выбранного из группы, состоящей из человеческого инсулина, в котором Pro в положении В 28 замещен Asp, Lys, Leu, Val или Ala и в которомe) фенольного консерванта. 8. Готовая форма аналога инсулина по п.1,которая дополнительно включает протамин. 9. Готовая форма по п.8, в которой аналог инсулина представляет собой LysB28ProB29 чeлoвeчecкий инсулин. 10. Готовая форма по любому из пп.8 и 9, в которой буфер представляет собой аргинин. 11. Готовая форма по любому из пп.1-7 для использования в системе непрерывной инфузии. 12. Способ лечения диабета, включающий введение эффективной дозы готовой формы по любому из пп.1-10 пациенту, нуждающемуся в таком лечении. 13. Способ лечения диабета, включающий введение эффективной дозы готовой формы по любому одному из пп.1-7 пациенту, в котором композицию вводят с использованием системы непрерывной инфузии. 14. Способ лечения гипергликемии, включающий введение нуждающемуся в таком лечении пациенту эффективной дозы готовой формы по любому одному из пп.1-10. 15. Способ лечения гипергликемии, включающий введение нуждающемуся в таком лечении пациенту эффективной дозы готовой формы по любому одному из пп.1-7, в котором композицию вводят с использованием системы непрерывной инфузии. 16. Готовая форма мономерного аналога инсулина по любому из пп.1-10 для использования в качестве лекарственного средства при лечении диабета. 17. Готовая форма мономерного аналога инсулина по любому одному из пп.1-10 для использования в качестве лекарственного средства при лечении гипергликемии. 18. Способ получения композиции на основе мономерного аналога инсулина по п.1,включающий стадии смешиванияa) физиологически толерантного буфера,выбранного из группы, состоящей из Трис и аргинина;b) мономерного аналога человеческого инсулина, выбранного из группы, состоящей из человеческого инсулина, в котором Pro в положении В 28 замещен Asp, Lys, Leu, Val или Ala и в котором Lys в положении В 29 представляет собой Lys или замещен Pro; AlaB26-человеческий инсулин, дез-(В 28-В 30)человеческий инсулин и дез(В 27)человеческий инсулин;d) фенольного консерванта. 19. Способ по п.18, в котором мономерный аналог инсулина представляет собойLysB28ProB29-человеческий инсулин, а буфер представляет собой Трис. 22 20. Способ получения композиции на основе мономерного аналога инсулина по п.1,включающий стадии смешиванияa) буфера, выбранного из группы, состоящей из Трис и аргинина;b) мономерного аналога инсулина, выбранного из группы, состоящей из человеческого инсулина, в котором Pro в положении В 28 замещен Asp, Lys, Leu, Val или Ala, и в которомe) фенольного консерванта. 21. Способ по п.20, в котором мономерный аналог инсулина представляет собой