Многодозовые эритропоэтиновые составы

006220 Область изобретения Настоящее изобретение относится к многодозовым эритропоэтиновым (в дальнейшем "ЭПО") составам, содержащим особенно эффективный консервант или сочетание консервантов. В частности, изобретение относится к отдельному или комбинированному применению консервантов бензетониума хлорида, феноксиэтанола и фенилэтилового спирта в многодозовых ЭПО-содержащих составах. Изобретение относится также к способу лечения ЭПО-составом, содержащим бензетониума хлорид, феноксиэтанол и/или фенилэтиловый спирт. Данное изобретение относится также к составу фармацевтического носителя, флакону для подобного состава и способу подавления роста микробов в растворе, причем все составы или растворы содержат ЭПО и один или более консервантов: бензетониума хлорид, феноксиэтанол и фенилэтиловый спирт. Предпосылки изобретения Стерильность является одним из важнейших требований, предъявляемых к парентеральным препаратам. Для стерилизованных парентеральных препаратов, рассчитанных на однодозовую инъекцию, сохранение стерильности должно быть учтено как при стерилизации, так и в процессе упаковки. К составу препаратов, рассчитанных для многократного дозирования, необходимо добавление противомикробных веществ, защищающих препарат от случайного микробного загрязнения во время хранения и/или использования. Стабильные белковые многодозовые фармацевтические составы в фармацевтическом производстве считаются особенно эффективными и коммерчески выгодными. Многодозовые составы в основном, хотя и не всегда, содержатся во флаконах (многодозовых контейнерах), позволяющих в разное время извлекать парциальное количество препарата. Такая система желательна, т.к. позволяет получать много доз из одного контейнера и контролировать введение фармацевтического состава, который можно извлечь и ввести в любом парциальном количестве. Особенность использования многодозовых составов налагает определенные требования. Так, например, сохранение стерильности состава особенно важно, т.к. имеется множество возможностей для проникновения в состав микроорганизмов и других загрязнителей. Многократное введение в многодозовый контейнер чужеродных тел, например игл, увеличивает вероятность проникновения микроорганизмов. Помимо этого, микроорганизмы могут быть занесены во время заполнения контейнера или во время восстановления влагосодержания составов после лиофилизации и перед введением. Для обеспечения длительного хранения контейнера, особенно после многократного введения чужеродных тел и проникновения загрязнителей необходимо, чтобы состав содержал специальные добавки, обеспечивающие стерильность содержимого. Для контроля за оптимальной стерильностью многодозовых составов Управление по контролю за продуктами питания и лекарственными препаратами США (USFDA) и другие органы ведомственного регулирования требуют, чтобы все многодозовые составы содержали консерванты, предотвращающие рост или наверняка убивающие любые микробы, которые могут быть внесены в состав. Ввиду присущей белкам нестабильности и их склонности вступать в реакцию с консервантами, производство белковых многодозовых составов особенно затруднено. Возможные нежелательные взаимодействия консервантов и белков приводят к деградации белка, особенно при длительном хранении; к инактивации белка; формированию белковых агрегаций; и другим взаимодействиям, которые инактивируют состав или делают введение состава людям, особенно в виде инфузий, инъекций или других видах парентерального введения затруднительным, болезненным или с иной точки зрения нежелательным. Кроме того, известно, что сами консерванты при парентеральном введении могут вызвать у человека острые отрицательные реакции, например, аллергические реакции. В наиболее благоприятном варианте консервант, содержащийся в многодозовых фармацевтических составах, должен быть эффективным при низких концентрациях против разнообразных микроорганизмов, растворимым в составе, нетоксичным, совместимым с белком, но не входящим с ним в реакцию, активным и стабильным в течение длительного времени, инертным по отношению к компонентам контейнера или крышки.Sandeep Nema et al. опубликовали перечни различных наполнителей, включенных в составы для инъекций, продаваемых в США. Противомикробные консерванты, перечисленные в этой статье, включены в табл. 1. ЭПО является гликопротеином, стимулирующим выработку гемоглобина и эритроцитов в костном мозге. Он вырабатывается в почках и широко используется при лечении анемии, вызванной различными состояниями, включая, например, почечную недостаточность. Известна аминокислотная последовательность и общие структуры гликозирования ЭПО. См., например, патент США 4703008. Выделение и очистка ЭПО из человеческих тканей и жидкостей описана Miyaka et al. Известны также последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая белок, выделение этой последовательности и получение белка традиционными рекомбинантными способами. См., например, патент США 4703008 (автор Lin), в котором описывается последовательность нуклеиновых кислот, кодирующих ЭПО; патент США 4337513 (авторы Sugimoto et al.), в котором описывается использование лимфобластных клеток для получения ЭПО; а также публикация Sherwood et al., в которой описано получение ЭПО из линии клеток человеческой карциномы почек. Кроме этого, получение, выделение и очистка белка возможны также путем генной активации или гомологической рекомбинации, с последующим выделением и очисткой известными способами. Разработку ЭПО-содержащих многодозовых составов особенно усложняла исключительная нестабильность ЭПО и его тенденция к немедленному взаимодействию с обычными фармацевтическими компонентами (патент США 4806524). Были сделаны попытки обойти эти проблемы при разработке ЭПОсодержащих многодозовых составов путем хранения состава при низком рН, или включением различных аминокислотных конструкций - два подхода, которые должны были способствовать стабилизации ЭПО белка; или путем разработки лиофилизированных форм, в которых консервант возгоняется из состава перед употреблением (патент США 5503827 (патент '827), автор Woog). Стабильных стерильных ЭПО-содержащих фармацевтических составов мало. В их число входят составы, описанные в патенте '827. В патенте '827 представлены и испрашиваются в качестве консервантов хлорэтон (хлорбутанол, 1,1,1-трихлор-2-метил-2-пропанол), бензалкониума хлорид или бензиловый спирт. Woog, в частности, указывает на трудности разработки гипоаллергенных ЭПО-содержащих многодозовых составов и подчеркивает, что предложенные им консерванты обладают в этом смысле хорошими качествами. Подчеркивается также, что в сочетании с белком консерванты демонстрируют тенденцию к деградации, а белки - к инактивации, и поэтому наиболее желательно максимально сократить контакт между консервантом и белком. В патенте '827 описаны также некоторые аминокислотные конструкции и другие добавки, использование которых считается необходимым для стабилизации ЭПО в растворе. И наконец, в патенте '827 описывается та наиболее приемлемая реализация, при которой любой консервант возгоняется из первоначального состава путем лиофилизации. Затем, после восстановления раствора, могут быть введены дополнительные консерванты, выбранные из описываемой группы (хлорэтон), как это было определено, бензалкониума хлорид или бензиловый спирт, однако, предназначенный для введения восстановленный раствор должен быть использован в течение 30 дней. Другой пример ЭПО-содержащих многодозовых составов описан в патенте США 5661125 (патент'125). В патенте подробно изложены и подтверждены данные о том, что ЭПО является "нестабильным веществом, особенно в виде раствора" и "при сочетании с известными стабилизаторами, стабильность ЭПО изменчива и непредсказуема". Там же показано и описано, в частности, использование бензилового спирта, парабена и/или фенола и их сочетаний в качестве консервантов в ЭПО-содержащих растворах. Свидетельствуя о сложности распознавания сочетаемых и благоприятных консервантов для использова-2 006220 ния в ЭПО-содержащих многодозовых составах, говорится, что "невозможно ничего особенного получить при использовании консервантов, ранее использованных с другими белками для получения пресервированного эритропоэтинового состава. См., например, Geigert, J., "Overview of the Stability and Handling of Recombinant Protein Drugs,' Journal of Parenteral ScienceTechnology, Vol. 43(5):220-224 (1989)". Следовательно, существует необходимость создания ЭПО-содержащих, пресервированных многодозовых фармацевтических составов, которые (1) сохраняют стабильность белкового компонента и соединения при длительном хранении продукта; (2) сохраняют стерильность состава и соответствуют критериям контрольных тестов Фармакопей США, Европы и Японии на переносимость консервантов; (3) безопасны в используемых концентрациях и (4) могут быть назначены как парентерально, так и перорально - по обстоятельствам - и уменьшают боль и риск побочной, например аллергической, реакции у пациента. Краткое изложение изобретения Настоящее изобретение представляет собой новый и особенно эффективный многодозовый фармацевтический состав, содержащий эритропоэтин и консервант бензетониума хлорид, феноксиэтанол и фенилэтиловый спирт как отдельно, так и в сочетании. Составы по данному изобретению могут иметь различные концентрации во флаконах различных размеров для различных доз. Например, составы, описанные в данном изобретении, могут содержать 10,000, 20,000, 40,000, или около и даже свыше 100,000 ед./мл ЭПО концентраций. Они также могут содержать любые концентрации в промежутке между этими концентрациями, например 5,000, 15,000,25,000 ед./мл и т.п. Помимо этого, дозы могут содержаться в 1/2, 1 или 2 мл флаконе, или во флаконах любого другого объема или в другой таре, которой фармацевт отдаст предпочтение. Специалисту будет ясно, что возможно использовать любое сочетание доз и флаконов, в зависимости от того, что нужно фармацевту. Например, можно приготовить состав по данному изобретению в концентрации 10,000 ед./1/2 мл в 1 мл флаконе, 40,000 ед./мл дозу в 2 мл флаконе, или любую другую концентрацию ЭПО во флаконе любого размера. Составы могут быть в форме жидкого раствора, суспензии, или могут быть лиофилизированы. Альтернативная реализация по настоящему изобретению представляет собой состав фармацевтического носителя, который используется в качестве носителя ЭПО и который содержит консерванты бензетониума хлорид, феноксиэтанол или фенилэтиловый спирт, причем эти консерванты могут содержаться в ЭПО как отдельно, так и в комбинации. Настоящее изобретение также представляет флакон с многочисленными дозами ЭПО, содержащий ЭПО и эффективное количество одного консерванта или сочетание следующих консервантов: бензетониума хлорид, феноксиэтанол и фенилэтиловый спирт. Другой реализацией по настоящему изобретению является способ ингибирования роста микробов в ЭПО-содержащих растворах. Способ представляет собой добавление в ЭПО-содержащие растворы одного консерванта или сочетания следующих консервантов: бензетониума хлорид, феноксиэтанол и фенилэтиловый спирт. Дополнительные компоненты ЭПО-содержащих многодозовых соединений по данному изобретению включают поверхностно-активные вещества, буферные растворы, вещества, регулирующие осмоляльность и антиадсорбенты. Наиболее эффективными добавками являются полисорбат-20, полисорбат 80, натрия фосфат, натрия хлорид и генапол. Составы данного изобретения могут быть в твердом, полутвердом, жидком или тягучем виде, например в виде таблеток, водных растворов или суспензий, либо могут быть лиофилизированы и восстановлены перед назначением больному. Составы могут быть введены любым парентеральным способом, в том числе внутривенно, подкожно, внутримышечно, трансдермально, внутриартериально, внутрибрюшинно или методом легочной ингаляции. Возможно также назначение внутрь. Подробное изложение изобретения Настоящее изобретение существенно улучшает современное положение науки в этой сфере. Предлагаются новые ЭПО-содержащие многодозовые фармацевтические составы, содержащие консерванты,каждый из которых в отдельности способствует сохранению стабильности, стерильности и удобному введению. Кроме того, неожиданно обнаружено, что феноксиэтанол и бензетониума хлорид при использовании в сочетании с многодозовыми фармацевтическими составами, имеют синергетический эффект,который и обеспечивает особую эффективность состава. В частности, такое сочетание консервантов имеет следующие характеристики: (1) синергетический противомикробный эффект, позволяющий использовать более низкую концентрацию консервантов; (2) стабильность ЭПО при длительном хранении в различных условиях; и (3) местный анестезирующий эффект феноксиэтанола, из-за чего он особенно удобен для подкожного введения. Используемые здесь термины имеют следующие значения. Эритропоэтин - гликопротеин, который в биологически активной и гликосилированной форме обладает способностью стимулировать формирование гемоглобина и красных кровяных клеток в костном мозге. Он может быть получен из тканей или жидкостей человека традиционными рекомбинантными способами или путем генной активации. Парентеральное - любой путь введения, кроме как через желудочно-кишечный тракт; включает-3 006220 внутривенное, подкожное, внутримышечное, через спинно-мозговую жидкость, внутриартериальное,внутрибрюшинное или способом легочной ингаляции. Фармацевтически приемлемые (или фармакологически приемлемые) - относится к молекулярным веществам и составам, которые не вызывают аллергических или иных побочных реакций при назначении животному или человеку. Фармацевтически приемлемый носитель - включает любые и все растворители, дисперсные среды,покрытия, противомикробные, противогрибковые, изотонические, препятствующие абсорбции вещества и т.п., которые могут быть использованы в качестве среды для фармацевтически приемлемого вещества. Единица - единица биологической активности, определенная эксгипоксической полиэйтемической биопробой на мышах и соответствующая стандартами Всемирной организации здравоохранения. Все упомянутые здесь числовые значения включают в себя все значения от меньшего до большего по возрастанию на одну единицу, при условии, что между любым меньшим и любым большим значением есть по крайней мере 2 единицы. Например, если утверждается, что концентрация компонента или показатель процесса, например, осмоляльность, температура, давление, время и т.п. варьируют от 1 до 90, предпочтительно от 20 до 80, более предпочтительно от 30 до 70, то предполагается, что значения от 15 до 85, от 22 до 68, от 43 до 51, от 30 до 32 однозначно включены в это описание. Для значений меньше 1, одна единица - это либо 0,0001, 0,001, 0,01 или 0,1, по обстоятельствам. Это всего лишь примеры предполагаемого осуществления, и все возможные сочетания числовых значений между наименьшим и наибольшим значениями должны быть рассмотрены как прямо указанные в данной заявке. А. Консерванты: феноксиэтанол и бензетониума хлорид. Рассматриваемые данным изобретением консерванты - это предпочтительно бензетониума хлорид,феноксиэтанол и фенилэтиловый спирт, любые варианты этих консервантов и их структурные аналоги. В частности, предполагается, что любой из этих консервантов может быть использован в составах как отдельно, так и в эффективном сочетании. В составах данного изобретения предпочтительны сочетания феноксиэтанола и бензетониума хлорида. Бензетониума хлорид, феноксиэтанол и фенилэтиловый спирт в испрашиваемых составах могут быть использованы в любых эффективных количествах. Общая концентрация консервантов предпочтительно составляет приблизительно от 0,0001 до 4,0% от общего состава. Особенно благоприятной является как можно более низкая общая концентрация консерванта, при которой достигается требуемый противомикробный эффект, а возможность побочных реакций ниже. Хотя бензетониума хлорид, феноксиэтанол и фенилэтиловый спирт могут быть использованы самостоятельно в качестве консервантов, однако, при этом требуется их более высокая концентрация, чем в случае использования их в сочетании. В предпочтительных реализациях настоящего изобретения, бензетониума хлорид и феноксиэтанол используются вместе. Неожиданно эти консерванты проявили синергетический эффект. Для достижения эквивалентного противомикробного эффекта при самостоятельном использовании концентрация бензетониума хлорида и феноксиэтанола в отдельности должна быть примерно в два раза больше, чем общая концентрация консервантов в сочетании. Так, например, когда бензетониума хлорид или феноксиэтанол используются отдельно, требуется примерно в два раза большее их количество для достижения результата, который достигается при использовании бензетониума хлорида в сочетании с феноксиэтанолом. Кроме того, даже при этих высоких концентрациях бензетониума хлорида или феноксиэтанола, самостоятельные составы консервантов могут не соответствовать критериям контрольного тестирования США,Европы или Японии. Предпочтительные составы содержат бензетониума хлорид в концентрациях приблизительно от 0,001 до 0,1% в сочетании с феноксиэтанолом в концентрациях приблизительно от 0,01 до 0,1%. Наиболее предпочтительные составы содержат бензетониума хлорид в концентрациях приблизительно от 0,01 до 0,02% в сочетании с феноксиэтанолом концентрациях приблизительно от 0,25 до 0,5%. В другой реализации данного изобретения бензетониума хлорид сочетается с фенилэтиловым спиртом. Предпочтительные составы содержат бензетониума хлорид в концентрациях приблизительно от 0,001 до 0,1% в сочетании с фенилэтиловым спиртом в концентрациях приблизительно от 0,01 до 0,1%. Наиболее предпочтительные составы содержат бензетониума хлорид в концентрациях приблизительно от 0,15 до 0,25% в сочетании с фенилэтиловым спиртом в концентрациях приблизительно от 0,2 до 0,5%. Самым предпочтительным составом, в котором бензетониума хлорид и фенилэтиловый спирт используются вместе, содержит бензетониума хлорид в концентрации приблизительно 0,02% в и фенилэтиловый спирт в концентрации приблизительно 0,25%.B. Эритропоэтин. Известны последовательности нуклеиновых кислот, аминокислот, трехмерная структура и типичные модели гликозирования ЭПО. Известен также выделенный из различных источников и очищенный ЭПО. Следовательно, специалист может получить ЭПО для использования в соответствии с данным изобретением путем выделения его и очищения из человеческих тканей или жидкостей традиционными рекомбинантными способами, а также с помощью генной активации. Все эти способы входят в объем данного изобретения. Кроме того, любой другой ЭПО, полученный из любого другого источника, также может быть использован в соответствии с данным изобретением.C. Другие активные компоненты. Оптимальный состав по данному изобретению может изменяться в зависимости от таких факторов,как длительность хранения, условия хранения и использования, популяции больных и т.д. Приспособление состава путем выбора компонентов, иных чем консерванты бензетониума хлорид, феноксиэтанол,фенилэтиловый спирт и ЭПО, как описано выше, и их сравнительных концентраций, может быть сделано в зависимости от потребностей фармацевта, лечащего врача или пациента. Дополнительные компоненты многодозовых ЭПО составов данного изобретения включают воду, буфер, поверхностно-активное вещество или антиадсорбент, смачивающее вещество и вещество, регулирующее осмоляльность. Характеристиками состава, которые могут быть изменены, являются, например, рН и осмоляльность, уровень которых должен быть доведен до уровня рН и осмоляльности человеческой крови или тканей. Помимо других целей, буферы в данном изобретении используются для регулирования общего рН фармацевтического состава. В данных составах могут быть использованы различные известные буферы,такие как различные соли органических или неорганических кислот, основания или аминокислоты, а также различные формы ионов цитрата, фосфата, тартрата, сукцината, адипата, малеата, лактата, ацетата,бикарбоната или карбоната. Для данного изобретения особенно предпочтительны следующие буферы: буферы натрия или калия, в частности натрия фосфат. В предпочтительной реализации натрия фосфат применяется в концентрации около 20 мМ. Особенно эффективная буферная система натрия фосфата содержит одноосновный моногидрат натрия фосфата и двухосновный гептагидрат натрия фосфата. При использовании этого сочетания одноосновного и двухосновного фосфата натрия, предпочтительные концентрации составляют приблизительно от 0,5 до 1,5 мг/мл одноосновного и приблизительно от 2,0 до 4,0 мг/мл двухосновного и наиболее предпочтительны концентрации приблизительно 0,9 мг/мл одноосновного и приблизительно 3,4 мг/мл двухосновного фосфата. Уровень рН в составе изменяется в соответствии с количеством используемого буфера. Предпочтительнее, чтобы уровень рН достигал между 5,0 и 8,0, наиболее предпочтительно приблизительно от 6,0 до 7,5 и самое предпочтительное разработать состав с уровнем рН приблизительно 7,0. В данных составах может быть полезно использование поверхностно-активных веществ. Поверхностно-активные вещества или антиадсорбенты, полезные в соответствии с данным изобретением, включают полиоксиэтиленсорбитаны, полиоксиэтиленсорбитан монолаурат, полисорбат-20, например Tween20, полисорбат-80, гидроксицеллюлоза и генапол. В предпочтительной реализации используется полисорбат-20. При использовании любого поверхностно-активного вещества, предпочтительна его концентрация приблизительно от 0,01 до 0,5 мг/мл. Особенно полезна реализация, в которой используется полисорбат-20 в концентрации приблизительно 0,1 мг/мл. Дополнительные полезные добавки легко будут определены специалистами в зависимости от индивидуальных потребностей или предполагаемого использования испрашиваемых многодозовых ЭПО составов. Одним из таких дополнительных веществ является натрия хлорид, который регулирует осмоляльность состава, доводя ее до нужной величины. Предпочтительна осмоляльность в диапазоне приблизительно от 270 до 330 мОсм/кг. Оптимальной для данных составов осмоляльностью является приблизительно 300 мОсм/кг. Для достижения этой осмоляльности требуется натрия хлорид в концентрациях приблизительно от 6,5 до 7,5 мг/мл, особенно эффективен натрия хлорид в концентрации приблизительно 7,0 мг/мл. Натрия хлорид может также быть добавлен или подведен для достижения осмоляльности приблизительно от 270 до 330 мОсм/кг, предпочтительнее 300 мОсм/кг. Другие вещества, регулирующие осмоляльность, включают манит и сорбит.D. Приготовление композиций. Описанные здесь ЭПО-составы могут быть приготовлены на воде смешанной с поверхностноактивным веществом, например с гидроксипропилцеллюлозой или полиоксиэтиленсорбитаном. В большинстве случаев, предпочтительнее включить в состав изотонические вещества, например сахарозу или натрия хлорид, как описано выше. Продолжительное поглощение инъецируемых составов может быть осуществлено с помощью веществ, замедляющих абсорбцию, например алюминия моностеарата или желатина. Другие вещества, используемые в данном случае, включают, но не ограничиваются лецитином,мочевиной, этиленоксидом, пропиленоксидом, гидроксипропилцеллюлозой, метилцеллюлозой или полиэтиленгликолем. Описанные здесь водные составы (inocula) могут включать эффективное количество ЭПО, растворенного или диспергированного в фармацевтически приемлемой водной среде. Такие составы называются также inocula. Хорошо известно использование фармацевтически приемлемой среды носителя и реактивов для фармацевтически активных веществ. За исключением тех случаев, когда условная среда или вещество несовместимо с активным компонентом, его использование в лечебных составах рассматривается в рамках данного изобретения. Дополнительные активные компоненты также могут быть включены в составы, как описано выше. Протеогликаны, как, например, ЭПО, могут быть включены в состав в нейтральной форме или в виде соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, повышающие кислотность (полученные из свободных аминогрупп белка) и соли, которые получаются из неорганических кислот, как, например,соляная кислота или фосфорная кислота, или таких органических кислот как уксусная, щавелевая, вин-5 006220 ная, миндальная кислоты и т.п. Соли из свободных карбоксильных групп могут также быть выведены из неорганических оснований, например из натрия, калия, аммония, кальция или гидроксидов железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и т.п. Лечебные составы настоящего изобретения преимущественно назначаются в форме инъекционных составов в виде жидких растворов или суспензий; возможно изготовление твердых форм для последующего растворения или суспензирования в жидкости перед инъекцией. Типичный для этих целей состав содержит фармацевтически приемлемый носитель. Например, состав может содержать 10 мг, 25 мг, 50 мг и вплоть до приблизительно 100 мг сывороточного альбумина человека на 1 мл буферированной соли фосфата. Описанные здесь составы могут содержаться во флаконе, бутылке, тюбике, шприце или другом контейнере для одноразового или многоразового назначения. Такие контейнеры могут быть сделаны из стекла или полимера, например, полипропилена, полиэтилена или поливинилхлорида. Предпочтительные контейнеры включают герметичные или другие закрывающие системы, например, резиновые пробки, в которую можно воткнуть иглу для извлечения одноразовой дозы и затем закупорки после извлечения иглы. Все известные контейнеры с жидкостями для инъекций, лиофилизированных составов, восстановленных лиофилизированных составов или восстанавливаемых порошков для инъекций рассматриваются для использования с описанными здесь составами и способами. Примеры Следующие примеры всего лишь пояснительные и не должны быть истолкованы как намеренное ограничение объема изобретения. Пример 1. Выбор консервантов и тест на стабильность. Вещества и способы. Одноосновной фосфат натрия моногидрат USP, двухосновной фосфат натрия гептагидрат USP,хлорид натрия USP/EP и полисорбат 20 USP/NF получены у J.T. Baker, отделение Mallinckrodt Baker,Inc., Phillipsburg, NH 08865. Бензалкониума хлорид USP/NF, 2-феноксиэтанол ВР, фенилэтиловый спирт USP/NF, ТимеросалUSP/NF, бензиловый спирт USP, хлорбутанол USP, метилпарабен USP/NF и пропилпарабен USP/NF получены у Spectrum Quality products INC., Gardena, СА 90248. Миристил гамма-пиколиния хлорид получен у PharmaciaUpjohn Company, Kalamazoo, Michigan 49001. Многодозовые ЭПО-содержащие растворы - это стерильные, апирогенные, бесцветные водные растворы для инъекций в концентрациях 10,000 единиц и 20,000 единиц. Растворы содержат 20 мМ фосфатного буфера (одноосновной моногидрат натрия фосфата и двухосновной гептагидрат натрия фосфата),0,01% вес/об. полисорбат-20 в качестве антиадсорбента, 0,45-0,8% вес/об. хлорида натрия (в зависимости от используемого комплекса консервантов, количество хлорида натрия приспосабливают для достижения осмоляльности приблизительно 300 мОсм/кг), и комплекс консервантов. Приготовленные растворы имеют рН приблизительно 7,0, и осмоляльность приблизительно 300 мОсм/кг. Растворы стерилизованы фильтрацией через стерильный 0,22-микронный миллипористый фильтр. Затем они закупорены в стерильные 2 мл стеклянные флаконы типа USP 1 и сохранены при 5 и 25 С для проверки химической стабильности и в 250-500 мл пропиленовых высокой прочности (HDPP) стерильных бутылках для бактериального тестирования. Изученные консерванты включают Бензиловый спирт 1,0% вес/об. Бензалкониума хлорид 0,01% вес/об. 2-Феноксиэтанол 0,5% вес/об. Фенилэтиловый спирт 0,5% вес/об. Тимеросал 0,005% и 0,01% вес/об. Кристаллы фенола 0,4% вес/об. Бензетониума хлорид 0,01% и 0,02% вес/об.m-Крезол 0,4% вес/об. Ртути фениловый нитрат 0,002% вес/об. Метилпарабен 0,1% и 0,18% вес/об. Пропилпарабен 0,03% и 0,035% вес/об. Миристил гамма-пиколиния хлорид 0,02% вес/об. Изучены также следующие сочетания: (1) бензетониума хлорид 0,005% вес/об. с феноксиэтанолом 0,25% вес/об.; (2) бензетониума хлорид 0,005% и феноксиэтанол 0,5% вес/об.; (3) бензетониума хлорид 0,01% вес/об. с феноксиэтанолом 0,5% вес/об. и (4) фенилэтиловый спирт 0,25% вес/об. и бензетониума хлорид 0,02% вес/об. Исследование. При добавлении в состав эритропоэтина метилпарабен, пропилпарабен, m-крезол и фенол давали непрозрачные растворы (забуференный раствор). Причиной этой непрозрачности считается несовмести-6 006220 мость адсорбента полисорбата-20 и каждого из этих консервантов (Handbook of Pharmaceutical Excipients,1994). Хотя хлорбутанол в составе давал прозрачный раствор, его определение было приостановлено, т.к. он не стабилен при рН 3, период полураспада при рН 7.5 составляет около 3 мес. (Handbook of Pharmaceutical Excipients, 1994). При наличии ртути фенилнитрата получался мутный раствор. Причиной мутности считается несовместимость осмотического вещества натрия хлорида и ртути фенилнитрата (Handbook of PharmaceuticalExcipients, 1994). В ЭПО-составах тимеросал давал прозрачный раствор. Он показал также хорошее консервирующее действие. Кроме того, ЭПО-составы при наличии тимеросала имеют хорошую химическую стабильность. Однако из-за наличия в нем ртути его применение скорее всего будет запрещено в Европе, Японии и США. Составы, содержащие бензиловый спирт, бензетониума хлорид, феноксиэтанол, фенилэтиловый спирт, бензалкониума хлорид и миристил гамма-пиколиния хлорид, дают прозрачные растворы. Учитывая минимум концентраций ингибитора для этих консервантов, безопасность и частоту их использования, для последующего химического анализа стабильности белка и противомикробной активности ЭПОсоставов выбраны следующие консерванты: бензиловый спирт, феноксиэтанол, фенилэтиловый спирт и несколько сочетаний бензетониума хлорида и феноксиэтанола. В. Пример 2. Тест на стабильность белка. Вещества и способы. С использованием выбранных консервантов созданы прототипные серии и проверены на стабильность при 5 и 25 С. Образцы протестированы обратно-фазовой ЖХВР (жидкостная хроматография высокого разрешения). Результаты опыта (% от меченого заявленного вещества) ЭПО-содержащих составов при наличии этих консервантов показаны в табл. 2. Меченое вещество определено обратно-фазовой ЖХВР с использованием колонки С 18 WatersDelta-PakJ и градиентного элюирования в водном растворе, содержащем 0,05% TFA и ацетонитрил, концентрация которого повышается от 23 до 86%. Белок ЭПО обнаруживался при 210 нм. Таблица 2 Результаты опыта по концентрациям (% от меченого заявленного вещества) Как видно из табл. 2, данные обратно-фазовой ЖХВР показывают, что при хранении в 5 С в течение 3-7 мес., концентрация ЭПО полностью сохраняется во всех составах. Однако в составах только с бензиловым спиртом или бензетониума хлоридом при хранении при 25 С в течение 3-7 мес. наблюдалась потеря до 10% ЭПО. В составах, содержащих феноксиэтанол или сочетание феноксиэтанола с бензетониума хлоридом, потери ЭПО не наблюдалось при хранении при 25 С в течение 3-4 мес. Эти результаты доказывают, что феноксиэтанол или сочетание феноксиэтанола с бензетониума хлоридом обладают стабилизирующим действием на ЭПО, а это качество чрезвычайно важно. С. Пример 3. Тест на проверочное заражение консервантов. Тесты на эффективность консервантов - это опыты по краткому руководству (Compendial-guided),которые определяют эффективность консервантов в многодозовых фармацевтических составах. В по-7 006220 добных опытах составы тестируются стандартизированными суспензиями индикатора аэробных бактерий, плесени и микроорганизмов, выживших в течение 28 дней. В табл. 3 показаны результаты контрольных тестов консервантов Фармакопеи Соединенных Штатов (USP) и Европейской Фармакопеи (ЕР). Все протестированные составы соответствовали критериямUSP для контрольных тестов консервантов. Составы, содержащие 0,01% вес/об. бензетониума хлорида,0,5% вес/об. феноксиэтанола или 0,5% вес/об. фенилэтилового спирта не прошли тестов на проверочное заражение по критериям ЕР. Составы, содержащие бензетониума хлорид и феноксиэтанол в различных сочетаниях, а также содержащие бензетониума хлорид в сочетании с фенилэтиловым спиртом, соответствовали как критериям USP, так и критериям ЕР. Основываясь на данных табл. 3, можно сказать, что противомикробное действие бензетониума хлорида значительно повышается при добавлении феноксиэтанола в результате синергетического эффекта. Таблица 3 Тест на проверочное заражение консервантовSherwood et al., "Establishment of a Human Erythropoietin-Producing Renal Carcinoma Cell Line." Clinical Research, 31:323A, 1983 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Фармацевтический состав, содержащий эритропоэтин и эффективное количество бензетониума хлорида в концентрации от приблизительно 0,001 до приблизительно 1,0% для ингибирования роста микробов в составе. 2. Состав по п.1, отличающийся тем, что состав содержит также феноксиэтанол. 3. Состав по п.1, отличающийся тем, что содержит также фенилэтиловый спирт. 4. Состав по п.1, отличающийся тем, что эффективная концентрация бензетониума хлорида состав-8 006220 ляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1%. 5. Состав по п.1, отличающийся тем, что эффективное количество бензетониума хлорида составляет 0,005%. 6. Состав по п.1, отличающийся тем, что эффективное количество бензетониума хлорида составляет 0,01%. 7. Состав по п.1, отличающийся тем, что эффективное количество бензетониума хлорида составляет 0,02%. 8. Состав по п.2, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации от приблизительно 0,001 до приблизительно 1,0% и феноксиэтанол в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 1,0%. 9. Состав по п.2, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1% и феноксиэтанол в концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,75%. 10. Состав по п.2, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации 0,005% и феноксиэтанол в концентрации 0,25%. 11. Состав по п.2, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации 0,005% и феноксиэтанол в концентрации 0,5%. 12. Состав по п.2, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации приблизительно 0,01% и феноксиэтанол в концентрации приблизительно 0,5%. 13. Состав по п.3, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации 0,02% и фенилэтиловый спирт в концентрации 0,25%. 14. Состав по п.3, отличающийся тем, что содержит приблизительно 0,02% бензетониума хлорид и приблизительно 0,25% фенилэтилового спирта. 15. Состав по п.1, отличающийся тем, что содержит также соль. 16. Состав по п.15, отличающийся тем, что соль - это натрия хлорид. 17. Состав по п.1, отличающийся тем, что содержит также буфер. 18. Состав по п.17, отличающийся тем, что буфер - это натрия фосфат. 19. Фармацевтический носитель для эритропоэтина, отличающийся тем, что носитель содержит эффективное количество бензетониума хлорида для ингибирования роста микробов в составе в концентрации от приблизительно 0,001 до приблизительно 1,0%. 20. Фармацевтический носитель по п.19, отличающийся тем, что содержит также феноксиэтанол. 21. Фармацевтический носитель по п.19, отличающийся тем, что содержит также фенилэтиловый спирт. 22. Фармацевтический носитель по п.19, отличающийся тем, что эффективная концентрация бензетониума хлорида составляет от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1%. 23. Фармацевтический носитель по п.19, отличающийся тем, что эффективная концентрация бензетониума хлорида составляет 0,005%. 24. Фармацевтический носитель по п.19, отличающийся тем, что эффективная концентрация бензетониума хлорида составляет 0,01%. 25. Фармацевтический носитель по п.19, отличающийся тем, что эффективная концентрация бензетониума хлорида составляет 0,02%. 26. Фармацевтический носитель по п.20, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 1,0%, и феноксиэтанол в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 1,0%. 27. Фармацевтический носитель по п.20, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1% и феноксиэтанол в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,75%. 28. Фармацевтический носитель по п.20, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации 0,005% и феноксиэтанол в концентрации 0,25%. 29. Фармацевтический носитель по п.20, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации 0,005% и феноксиэтанол в концентрации 0,5%. 30. Фармацевтический носитель по п.20, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации приблизительно 0,01% и феноксиэтанол в концентрации приблизительно 0,5%. 31. Фармацевтический носитель по п.21, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации 0,02% и фенилэтиловый спирт в концентрации 0,25%. 32. Фармацевтический носитель по п.19, отличающийся тем, что содержит одну или более добавок,выбранных из группы, содержащей буфер, соль, антиадсорбент или поверхностно-активное вещество. 33. Флакон для многочисленных доз эритропоэтина, отличающийся тем, что содержит раствор эритропоэтина и эффективное количество бензетониума хлорида для ингибирования роста микробов в составе в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 1,0%. 34. Флакон по п.33, отличающийся тем, что указанный раствор содержит также феноксиэтанол. 35. Флакон по п.33, отличающийся тем, что указанный раствор содержит также фенилэтиловый спирт.-9 006220 36. Флакон по п.33, отличающийся тем, что эффективная концентрация бензетониума хлорида составляет от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1%. 37. Флакон по п.33, отличающийся тем, что эффективная концентрация бензетониума хлорида составляет 0,005%. 38. Флакон по п.33, отличающийся тем, что эффективная концентрация бензетониума хлорида составляет 0,01%. 39. Флакон по п.33, отличающийся тем, что эффективная концентрация бензетониума хлорида составляет 0,02%. 40. Флакон по п.34, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 1,0% и феноксиэтанол в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 1,0%. 41. Флакон по п.34, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1% и феноксиэтанол в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,75%. 42. Флакон по п.34, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации 0,005% и феноксиэтанол в концентрации 0,25%. 43. Флакон по п.34, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации 0,005% и феноксиэтанол в концентрации 0,5%. 44. Флакон по п.34, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации приблизительно 0,01% и феноксиэтанол в концентрации приблизительно 0,5%. 45. Флакон по п.35, отличающийся тем, что содержит бензетониума хлорид в концентрации 0,02% и фенилэтиловый спирт в концентрации 0,25%. 46. Флакон по п.35, отличающийся тем, что содержит приблизительно 0,02% бензетониума хлорида и приблизительно 0,25% фенилэтилового спирта. 47. Флакон по п.33, отличающийся тем, что данный раствор содержит также соль. 48. Флакон по п.47, отличающийся тем, что соль - это хлорид натрия. 49. Флакон по п.33, отличающийся тем, что данный раствор содержит также буфер. 50. Флакон по п.49, отличающийся тем, что буфер - это фосфат натрия. 51. Способ ингибироавния роста микробов в растворе, содержащем эритропоэтин, отличающийся тем, что в раствор добавляют бензетониума хлорид в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 1,0%. 52. Способ по п.51, отличающийся тем, что в раствор добавляют также феноксиэтанол. 53. Способ по п.51, отличающийся тем, что в раствор добавляют также фенилэтиловый спирт. 54. Способ по п.51, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1%. 55. Способ по п.51, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации 0,005%. 56. Способ по п.51, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации 0,01%. 57. Способ по п.51, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации oт 0,02%. 58. Способ по п.52, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 1,0%, а феноксиэтанол - в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 1,0%. 59. Способ по п.52, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,1%, а феноксиэтанол - в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,75%. 60. Способ по п.52, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации 0,005%, а феноксиэтанол в концентрации 0,25%. 61. Способ по п.52, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации 0,005%, а феноксиэтанол - в концентрации 0,5%. 62. Способ по п.52, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации приблизительно 0,01%, а феноксиэтанол - в концентрации приблизительно 0,5%. 63. Способ по п.53, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации 0,02%,а фенилэтиловый спирт - в концентрации приблизительно 0,25%. 64. Способ по п.53, отличающийся тем, что бензетониума хлорид добавляют в концентрации приблизительно 0,02%, а фенилэтиловый спирт - в концентрации приблизительно 0,25%. 65. Способ по п.51, отличающийся тем, что в раствор добавляют также соль. 66. Способ по п.65, отличающийся тем, что соль - это хлорид натрия. 67. Способ по п.51, отличающийся тем, что в раствор добавляют также буфер. 68. Способ по п.67, отличающийся тем, что буфер - это фосфат натрия. Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6