Терапия 3-гидроксиантраниловой кислотой (3-haa) для профилактики и лечения гиперлипидемии и ее сердечно-сосудистых осложнений

(3-НАА) или ее функционального аналога для профилактического и/или терапевтического лечения млекопитающих, особенно людей, от гиперлипидемии и ее сердечно-сосудистых осложнений,т.е. образования атеросклеротических бляшек, инфаркта миокарда и сердечной недостаточности,ишемического инсульта и транзиторной ишемической атаки, поражения почек, аневризм аорты и критической ишемии конечностей. Область изобретения Изобретение относится к применению метаболита триптофана 3-гидроксиантраниловой кислоты (3 НАА) или ее функционального аналога для лечения гиперлипидемии. В частности изобретение включает: применение 3-НАА или ее функционального аналога, как таковой или вместе с подходящим носителем, в качестве гиполипидемической терапии для профилактики и/или лечения гиперлипидемии и сердечнососудистых осложнений, ассоциированных с гиперлипидемией, в частности, образования атеросклеротических бляшек, инфаркта миокарда, ишемического инсульта и транзиторных ишемических атак,поражения почек, аневризмы аорты и критической ишемии конечностей, вызванных атеросклерозом. Предшествующий уровень техники изобретения Сердечно-сосудистые заболевания ССЗ) (CVD, преимущественно вызванные образованием атеросклеротических бляшек в артериях, являются основной причиной смерти в Западном мире и также нарастают в развивающихся странах 1. Однако прогресс в профилактике гиперлипидемии с использованием гиполипидемических лекарственных препаратов, например статинов, обладает доказанным преимуществом в выживаемости в случае первичной профилактики (т.е. у лиц без клинических признаков ССЗ) и вторичной профилактики (т.е. у пациентов с установленными ССЗ)2-4. Кроме того, другие классы лекарственных средств, например фибраты, которые повышают уровень ЛПВП, показали уменьшение прогрессирования ишемической болезни в клинических исследованиях 5,6 и снижение частоты сердечнососудистых событий в исследованиях исходов 7,8. Атеросклероз представляет собой хроническое воспалительное состояние, опосредованное захватом и накоплением аполипопротеин В 100 (ApoB100)-содержащих липопротеинов, в частности липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), в стенке артерий, приводящим к неадекватным ответам макрофагов и Т-клеток и образованию атеросклеротических бляшек в артериях 9,10. Следовательно, снижение циркулирующих липопротеинов ApoB100 может обладать другими полезными эффектами в добавление к снижению вероятности накопления липидов в артериальной стенке. Высокие уровни ЛПНП и их частиц предшественников, липопротеинов очень низкой плотности(ЛОНП (VLDL, ассоциированы с повышенным риском инфаркта миокарда, инсульта и других осложнений атеросклеротических бляшек. Повышенные уровни ЛПНП и ЛОНП отражаются высокими уровнями холестерина и триглицеридов в образцах сыворотки крови или плазмы. Такие повышенные уровни липидов крови представляют собой состояние гиперлипидемии, которое, как упомянуто, ассоциировано с повышенным риском инфаркта миокарда, инсульта и других атеросклеротических осложнений. Гиперлипидемические уровни определяются критериями SCORE Европейского Общества Кардиологов, которые также определяют целевые уровни, которые необходимо достичь гиполипидемической терапией 11. Сердечно-сосудистый риск, обусловленный высоким холестерином ЛПНП или общим холестерином, снижается, когда уровень холестерина ЛПВП высокий, что подчеркнуто в той же публикации. Наоборот, низкий уровень ЛПВП увеличивает сердечно-сосудистый риск повышенного общего холестерина или холестерина ЛПНП. Существующие уровни гиперлипидемии, как определяют Swedish MedicalProducts Agency (Lakemedelsverket) представляют собой: общий холестерин 5 ммоль/л, холестерин ЛПНП 3 ммоль/л, и холестерин ЛПВП 1 ммоль/л 12. Частицы ЛПВП проявляют свой защитный эффект в отношении артерий, опосредуя удаление холестерина из клеток. После включения в ЛПВП молекулы холестерина переносятся в печень, преобразуются в желчные кислоты и удаляются через кишечник. В существующей терапии гиперлипидемии доминирует группа лекарственных средств, называемых статинами. Указанные соединения обладают хорошими эффектами в отношении холестерина ЛПНП у большинства пациентов, но только минимальными эффектами в отношении ЛПВП 13. Более того, некоторые пациенты не переносят статины или другие гиполипидемические препараты. По указанным причинам существует необходимость в разработке новых гиполипидемических препаратов. Модифицированные фосфолипиды ЛПНП, такие как лизофосфатидилхолин и 1-пальмитоил-2-(5'оксовалероил)-sn-глицеро-3-фосфохолин (POVPC), могут стимулировать эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и макрофаги 14,15. В настоящее время известно, что такие атерогенные липиды запускают естественный иммунный ответ посредством активации Toll-подобных рецепторов 16-18. Более того холестерин, накапливающийся в макрофагах, которые интернализируют частицы ЛПНП, может образовывать микрокристаллы, которые непосредственно активируют инфламмасому, приводя к продукции провоспалительного цитокина, интерлейкина-1 бета 18. В общем, представленные данные показывают, что модификация ЛПНП дает эндогенные лиганды, которые запускают активацию естественного иммунного ответа, которая может запускать образование атеросклеротических бляшек. Адаптивный иммунитет также играет ключевую роль в развитии атеросклеротических бляшек. Антиген-представляющие клетки встречаются с и интернализуют антигены в интиме, включая частицы ЛПНП, которые интернализуются посредством фагоцитарных рецепторов 19. После протеолиза фрагменты белка ApoB100 ЛПНП ассоциируются внутриклеточно с белками МНС класса II, переносятся к поверхности клеток и представляются Т клеткам. Последнее событие приводит к активации Т клеток и продукции цитокинов, которые запускают и поддерживают местное воспаление 20. В добавление к эффектам в отношении местного патологического процесса иммунные клетки и ме-1 023954 диаторы модулируют метаболизм липидов на системном уровне. Таким образом, провоспалительный цитокин фактор некроза опухоли (TNF) ингибирует липопротеинлипазу, ключевой фермент в метаболизме триглицеридов, приводя к гипертриглицеридемии 21. Другой TNF-подобный белок LIGHT ингибирует другую липазу, печеночную липазу, действуя в печени 22,23. Это приводит к сниженному катаболизму триглицеридов и накоплению в крови крупных липопротеинов, которые содержат триглицериды и холестерин. В качестве третьего примера гиполипидемические препараты класса статинов проявляют существенные иммуномодулирующие эффекты, снижая активацию Т-клеток и ингибируя некоторые аутоиммунные заболевания 24,25. Все представленные данные демонстрируют сложную взаимосвязь между иммунной и метаболической системами и предполагают возможность лечения гиперлипидемии и предотвращения образования атеросклеротических бляшек с использованием путей, зависимых от иммунных клеток. Последние данные показывают, что IDO (индолеамин 2,3-диоксигеназа) и IDO-катализируемый метаболизм триптофана играют критическую роль в индукции иммуносупрессии и переносимости (описано в 26). IDO кодируется геном IDO1 (кодируемым у людей 10 экзонами в хромосоме 8, 8 р 12-р 11). Фермент метаболизирует L-триптофан (L-Trp) в N-формилкинуренин, продукт, который быстро преобразуется формамидазой в L-кинуренин (KYN), который в свою очередь может или выходить в кровоток или дополнительно метаболизироваться до нижележащих кинуренинов (Kyns). Такие Kyns включают 3 гидроксикинуренин (3-НК), 3-гидроксиантраниловую кислоту (3-НАА) и хинолиновую кислоту(QUIN)27. Было показано, что нижележащие метаболиты триптофана, такие как 3-гидроксиантраниловая кислота (3-НАА, фиг. 1), могут ингибировать функцию Th1 и Th2 клеток и увеличивать процент регуляторных Т клеток (Tregs). Кроме того, было показано, что введение 3-НАА снижает воспаление,индуцированное Th17 клетками, и защищает мышей от аутоиммунного энцефалита 28,29. Действительно,данные предполагают, что 3-НАА может регулировать аутоиммунность в результате непосредственного воздействия на Т клетки или посредством непрямых эффектов при помощи изменения презентации антигена на дендритных клетках и макрофагах 30. Сущность изобретения Гиперлипидемия представляет собой состояние патологически повышенного уровня липидов крови, в частности холестерина и триглицеридов, переносимых в липопротеинах плазмы ЛПНП и ЛОНП. За высоким уровнем липидов следует суб-эндотелиальное удержание и накопление ЛПНП в артериальной стенке; это приводит к хроническому неадекватному воспалительному ответу макрофагов и Т-клеток и образованию атеросклеротических бляшек. В указанном контексте профилактика гиперлипидемии с использованием гиполипидемических лекарственных средств, например статинов и фибратов, доказала снижение количества сердечно-сосудистых событий и повышение выживаемости пациентов с риском ССЗ или установленными ССЗ 2-4,7,8. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что иммуномодулирующее соединение 3-НАА демонстрирует неожиданный сильный эффект в отношении гиперлипидемии и в ряде экспериментов достоверно снижает уровень общего холестерина и триглицеридов плазмы. Кроме того, 3-НАА достоверно повышает уровень ЛПВП и снижает соотношения ЛОНП/ЛПВП и ЛПНП/ЛПВП. Таким образом, полезные изменения липидов плазмы сопровождались достоверным уменьшением развития атеросклеротических бляшек. Следовательно, 3-НАА и ее функциональные аналоги могут расцениваться как новый класс гиполипидемических средств для профилактики и лечения гиперлипидемии и ее сердечно-сосудистых осложнений, т.е. образования атеросклеротических бляшек, инфаркта миокарда, ишемического инсульта и транзиторных ишемических атак, поражения почек, аневризмы аорты и критической ишемии конечностей, вызванных атеросклерозом. Следовательно, настоящее изобретение относится к применению 3-НАА или ее функциональных аналогов в лечении гиперлипидемии или в профилактике сердечнососудистых осложнений гиперлипидемии. Под функциональными аналогами 3-НАА предусматриваются продукты окисления и восстановления 3-НАА и замещенные варианты 3-НАА, которые сохраняют тот же или практически тот же эффект на метаболизм липидов, как 3-НАА. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения гиперлипидемию выбирают из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, гипертриглицеридемии и комбинированной (формы) гиперлипидемии. В предпочтительном варианте осуществления изобретения гиперлипидемия ассоциирована с низким уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в плазме. В предпочтительном варианте осуществления изобретения сердечно-сосудистым осложнением гиперлипидемии является образование атеросклеротических бляшек. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения сердечно-сосудистым осложнением гиперлипидемии является клиническая манифестация образования атеросклеротических бляшек. В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения 3-НАА или ее функциональный аналог используют для профилактики инфаркта миокарда и/или сердечной недостаточности. В одном варианте осуществления изобретения 3-НАА или ее функциональный аналог предназначе-2 023954 ны для профилактики стенокардии. В предпочтительном варианте осуществления изобретения 3-НАА предназначена для применения в профилактике ишемического инсульта и/или транзиторных ишемических атак. В другом варианте осуществления изобретения 3-НАА или ее функциональный аналог предназначены для профилактики периферической ишемии, гангрены, поражения почек, аневризмы аорты и/или критической ишемии конечностей. В соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, осложнением гиперлипидемии является дерматологическое осложнение гиперлипидемии. В соответствии с другим вариантом осуществления изобретения дерматологическим осложнением гиперлипидемии является ксантома. Краткое описание чертежей Фиг. 1. Молекулярное изображение 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-НАА). Молекулярная формула: C7H7NO3. Молярная масса 153,14 г/моль. IIUPAC наименование: 2-амино 3-оксибензойная кислота. Фиг. 2. Поглощение FITC-окЛПНП перитонеальными макрофагами. Перитонеальные макрофаги от мышей Ldlr-/-, которым вводили 3-HAA (200 мг/кг) или PBS (8 недель лечения), инкубировали с FITC-окЛПНП в концентрации 20 мкг белка/мл в течение 2 ч при 37C. Поглощение оценивали количественно поточной цитометрией. (А) Заданными значениями являются MFIFITC-окЛПНП, среднееSE трех ячеек для каждой мыши (n=5 и 6, для 3-НАА или PBS соответственно)(В) График показывает репрезентативные гистограммы перитонеальных макрофагов от мышей/ получавших 3-НАА или PBS. ) Р 0/01. Фиг. 3. Анализ липидов плазмы. Уровни общего холестерина (А) и триглицеридов (В) оценивали в плазме мышей, получавших 3 НАА или PBS (8 недель лечения). (С) Гранулометрический анализ профилей липопротеинов плазмы мышей, получавших 3-НАА или PBS. Концентрации холестерина в каждой фракции (ось y) наносили на график относительно номера удержанной фракции (ось x); кривые показывают средниеSEM для мышей, получавших 3-НАА и PBS. Значения выражены как среднееSEM (n=5 и 6, для 3-НАА или PBS соответственно). ) Р 0,01. Фиг. 4. 3-НАА уменьшает развитие атеросклеротических бляшек. Мышам Ldlr-/- в возрасте двадцати недель давали 3-НАА или PBS в качестве контроля. Мышей умерщвляли после 8 недель на западном питании. Иссеченные дуги окрашивали Судан IV анфас и % площади поражения всей сосудистой области рассчитывали с использованием программного обеспечения анализа изображений Image J (NIH, Bethesda, MD). Аддитивную площадь всех атеросклеротических бляшек в конкретной дуге аорты рассчитывали как процент всей площади поверхности дуги. (n=7 и 10,для 3-НАА или PBS соответственно). ) Р 0,001. Эксперименты Методика. Предположили, что индукция защитного иммунитета, который влияет на метаболизм и воспаление,может быть достигнута путем введения 3-НАА (200 мг/кг) интраперитонеально, 3 раза в неделю, в течение 8 недель. Мышам Ldlr-/- в возрасте двадцати недель давали 3-НАА или PBS в качестве контроля. Мышей кормили питанием с высоким содержанием жира, начиная через 2 дня после первой инъекции до умерщвления через 8 недель с помощью CO2. Холестерин и триглицериды плазмы измеряли с использованием ферментативных колориметрических наборов в соответствии с протоколом производителя. Иссеченные дуги аорты окрашивали Судан IV анфас и рассчитывали % площади поражения общей сосудистой области. Кроме того, действие 3-НАА на поглощение окЛПНП оценивали в культурах перитонеальных макрофагов от мышей, получавших 3 НАА или PBS. Материалы и методы Животные и лечение животных. Мышей Ldlr-/- выводили и помещали в Экспериментальный блок для животных в центре Молекулярной Медицины, больница Университета Каролины. Мыши (n=7-10 на группу) получали 3 интраперитонеальных инъекции PBS (200 мкл) или 3-НАА (2 00 мг/кг в PBS) в неделю в течение 6 недель и 1 инъекцию в неделю в течение следующих двух недель (всего 24 инъекции) и их умерщвляли CO2. Мышей кормили питанием с высоким содержанием жира (кукурузный крахмал, масло какао, казеин, глюкоза,сахароза, целлюлозная мука, минералы и витамины; 17,2% белка, 21% жира (62,9% насыщенных, 33,9 ненасыщенных и 3,4% полиненасыщенных), 0,15% холестерина, 43% углеводов, 10% Н 2 О и 3,9% волокон целлюлозы; R638 Lantmannen, Sweden), начиная через 2 дня после начала лечения. Выделение липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). ЛПНП (d=1,019-1,063 г/мл) выделяли из собранной плазмы здоровых доноров путем ультрацентрифугирования, как описано в 31. 2 мМ бензамидина, 0,5 мМ PMSF и 0,1 ЕД/мл апротинина добавляли непосредственно после получения плазмы и ЛПНП активно диализировали относительно PBS после выде-3 023954 ления. Одно-миллимолярную ЭДТА добавляли к аликвоте ЛПНП для предотвращения модификации частиц ЛПНП. Получение меченных FITC (флуоресцеин изотиоцианат) окисленных ЛПНП (FITC-окЛПНП). ЛПНП метили с использованием модификации ранее описанного метода 32. Коротко, ЛПНП (1,5-2 мг/мл) диализировали в течение ночи относительно 500 мМ NaHCO3 рН 9,5. Затем, 50 мкг FITC (SigmaAldrich, St. Louis, МО, USA), растворенного в DMSO (1 мг/мл), добавляли на каждый мг белка в ЛПНП и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. После инкубации конъюгаты отделяли от свободного флуорохрома путем гель-фильтрации с использованием колонки PD10 (GE Healthcare, Uppsala,Sweden) и PBS для элюции. FITC конъюгат оценивали абсорбционной спектроскопией относительно стандартной кривой FITC при 495 нм. Концентрацию белка определяли анализом Bradford (Biorad, CA,USA). Окисленные FITC-ЛПНП (FITC-окЛПНП) получали путем инкубации 1 мл FITC-ЛПНП (1 мг/мл) в присутствии 20 мкМ CuSO4 в течение 18 ч при 37C. Выраженность окисления оценивали анализомTBARS, как описано 33. Поглощение окЛПНП перитонеальными макрофагами. Через двадцать четыре часа после последней инъекции 3-НАА или PBS, перитонеальные макрофаги выделяли от мышей Ldlr-/-посредством перитонеального лаважа с помощью PBS. После 2-3 ч в PBS,макрофагов помещали в 96-луночные планшеты с плотностью 1105 клеток на ячейку с 20 мкг/мл FITCокЛПНП в среде RPMI 1640, содержащей 1% FCS. После 2 ч инкубации при 37C клетки дважды промывали PBS и фиксировали 4% параформальдегидом в PBS. Клетки анализировали на поточном цитометреCyAn ADP (Dako, Glostrup, Denmark). Анализ липидов плазмы. Холестерин и триглицериды плазмы измеряли с использованием ферментативных колориметрических наборов (Randox Lab. Ltd. Crumin, UK) в соответствии с протоколом производителя. Профили липопротеинов. Профили холестерина липопротеинов плазмы определяли с использованием модификации методаGFC-500 в качестве пре-колонки (5 см 7,8 i.d.; Supelco,Sigma-Aldrich, PA, USA) соединенной с системой Prominence UFLC (Shimadzu, Kyoto, Japan) и уравновешивали с помощью Tris-буферного солевого раствора, рН 7,4. Фракции по 200 мкл собирали с использованием коллектора фракций Foxy Jr (Teledyne Isco Inc, NE, USA) и общий холестерин определяли в каждой фракции с использованием ферментативного колориметрического набора (Randox Lab. Ltd. Crumin, UK). Анализ поражений. Накопление липидов анфас определяли в дуге аорты от мышей, получавших 3-НАА и PBS, с использованием окрашивания Судан IV. Коротко, иссеченные дуги фиксировали в 4% нейтральном буферном формалине. Затем образцы разрезали продольно и подвергали окрашиванию Судан IV (красный цвет). Изображения фиксировали с использованием камеры Leica DC480, соединенной со стереомикроскопом Leica MZ6 (Leica, Wetzlar, Germany). Суммарную площадь всех атеросклеротических бляшек в заданной дуге аорты рассчитывали как процент общей площади поверхности дуги (не включая ответвляющиеся сосуды). Количественное определение атеросклеротических бляшек проводили с использованием программного обеспечения Image J (NIH, Bethesda, USA). Статистический анализ. Значения выражены как среднеестандартная ошибка среднего (SEM), если не указано иначе. Непараметрический критерий Манн-Уитни U использовали для сравнений между группами. Различия расценивали достоверными при значениях Р ниже 0,05. Результаты 3-Гидроксиантраниловая кислота ингибирует поглощение окЛПНП. Поглощение флуоресцентных FITC-окЛПНП оценивали количественно поточной цитометрией, как описано в разделе Методы. Как показано на фиг. 2, перитонеальные макрофаги от мышей, получавших 3 НАА, показали приблизительно 79% снижение поглощения FITC-окЛПНП. Следовательно, 3-НАА ингибирует поглощение модифицированных частиц ЛПНП, ключевое событие в образовании пенистых клеток. 3-Гидроксиантраниловаяя кислота обладает сильным гиполипидемическим эффектом. Неожиданно для иммуномодулирующего соединения введение 3-НАА мышам Ldlr-/- было ассоциировано с заметным, статистически достоверным снижением общего холестерина плазмы (приблизительно 50%) и триглицеридов (приблизительно 72%) (фиг. 3). Кроме того, 3-НАА эффективно повышает уровень ЛПВП и снижает ЛОНП/ЛПВП (4,00,55 и 1,410,31/ среднееSEM мышей, получавших PBS и 3-НАА соответственно; Р 0,01) и соотношения ЛПНП/ЛПВП (2,30,24 и 1,40/16, среднее 1 SEM мышей, получавших PBS и 3-НАА соответственно; Р 0,05). Полученные данные подтверждают 3-НАА как новое гиполипидемическое средство. Введение 3-НАА не оказывало эффекта на массу тела (данные не показаны). Снижение липидов плазмы, индуцированное 3-гидроксиантраниловой кислотой, приводит к уменьшению образования атеросклеротических бляшек. Наконец, авторы исследовали, может ли 3-НАА влиять на образование бляшек. Мышам Ldlr-/-, у которых развились атеросклеротические поражения при получении питания с высоким содержанием жира, вводили 3-НАА в течение 8 недель. Существенное снижение уровня общего холестерина плазмы и триглицеридов приводило к приблизительно 90% снижению площади атеросклеротических поражений в анфас препаратах дуги аорты (фиг. 4). ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение 3-гидроксиантраниловой кислоты (3-НАА) для лечения гиперлипидемии или профилактики сердечно-сосудистых осложнений гиперлипидемии. 2. Применение по п.1, где указанную гиперлипидемию выбирают из группы, состоящей из гиперхолестеринемии, гипертриглицеридемии и комбинированной (формы) гиперлипидемии. 3. Применение по п.1 или 2, где указанная гиперлипидемия ассоциирована с низким уровнем липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в плазме. 4. Применение по любому из предшествующих пунктов, где указанным сердечно-сосудистым осложнением гиперлипидемии является образование атеросклеротических бляшек. 5. Применение по любому из пп.1-3, где указанным сердечно-сосудистым осложнением гиперлипидемии является клиническая манифестация образования атеросклеротических бляшек, указанную клиническую манифестацию выбирают из инфаркта миокарда и/или сердечной недостаточности. 6. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики стенокардии. 7. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики ишемического инсульта и/или транзиторных ишемических атак. 8. Применение по любому из пп.4, 5 для профилактики периферической ишемии, гангрены, поражения почек, аневризмы аорты и/или критической ишемии конечностей, вызванных атеросклерозом. 9. Применение по п.1 или 2, где осложнением гиперлипидемии являются ксантомы.