Способ получения дипептидов

1 Предпосылки создания изобретения Для крупномасштабного производства соединений, которые хотя бы частично основаны на интермедиатах дипептидной природы, требуется наличие легкодоступных больших количеств ди-пептидного интермедиата с низкой стоимостью. Однако синтез таких дипептидов может быть экономически невыгодным как с точки зрения времени, так и стоимости, что снижает эффективность производственного процесса и повышает его себестоимость. А эти факторы необходимо учитывать при реализации крупномасштабного производства дипептидных интермедиатных соединений. Краткое изложение сущности изобретения Настоящее изобретение относится к способу получения дипептидов Ala-Pro и Lys-Pro. Указанные дипептидные интермедиатные соединения получают с применением метода рекомбинантной ДНК на основе синтетической последовательности ДНК или последовательности ДНК, встречающейся в природе, которые кодируют белок или пептид, имеющий специфическую повторяющуюся дипептидную последовательность. Дипептидные интермедиаты ферментативно получают из более крупных молекул белка или пептида и далее подвергают обработке с получением готового соединения. Подробное описание изобретения Настоящее изобретение относится к способу получения дипептидов Ala-Pro и Lys-Pro. Далее указанные интермедиатные соединения могут быть обработаны с получением конечного готового продукта. Дипептидные интермедиатные соединения продуцируются в рекомбинантных клетках организма хозяина посредством экспрессии молекулы рекомбинантной ДНК,которая кодирует, по меньшей мере, один дипептидный интермедиат. Молекула рекомбинантной ДНК может представлять собой либо синтетическую молекулу ДНК, либо последовательность ДНК, встречающуюся в природе. ДНК, кодирующую дипептид, клонируют в соответствующий вектор с целью экспрессии в рекомбинантной клетке-хозяине. После экспрессии в рекомбинантной клетке-хозяине дипептид очищают для дальнейших стадий обработки. При этом перед очисткой может потребоваться отделение дипептида от более крупного полипептида. Более крупный полипептид,содержащий дипептидный интермедиат, может быть образован за счет множественных повторов дипептидной последовательности, или же указанный дипептид может присутствовать в виде одной или более копий как часть более крупного белка, содержащего аминокислотные последовательности, которые не являются дипептидными последовательностями. Повторяющиеся участки дипептидной последовательности могут быть разделены на отдельные дипептиды с помощью ферментативного или химического расщепления. Индивидуальные ди 000736 2 пептиды могут быть затем очищены для проведения дальнейшей обработки. Используемые для продуцирования дипептида рекомбинантные клетки-хозяева могут быть представлены любой клеткой, которая способна к экспрессии молекул рекомбинантной ДНК. При этом для любого специалиста со средним уровнем знаний в данной области совершенно очевидно, что любой рекомбинантный хозяин приемлем для использования по способу настоящего изобретения. Предпочтительные клетки-хозяева включают, не ограничиваясь ими, клетки бактерий и грибов, в том числе дрожжей. Клетки-хозяева бактерий и грибов, которые могут использоваться в способе настоящего изобретения, а также коммерчески доступны, включают, не ограничиваясь ими,Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Escherichia coli, Asper-gillus niger, Streptomyces lividans и Bacillus subtilis. Для каждого специалиста со средним уровнем знаний в данной области очевидно также то, что вектор для экспрессии ДНК, кодирующей дипептид, может быть фактически представлен любым вектором экспрессии, пригодным для использования в выбранной клетке. Предпочтительные векторы включают, не ограничиваясь указанными, те векторы, которые приемлемы для использования в клетках бактерий и грибов, включая дрожжи. Векторы экспрессии в бактериях и грибах, которые пригодны для использования по способу настоящего изобретения и коммерчески доступны, включают приведенные ниже векторы, не ограничиваясь, однако, этим перечнем. Отделение дипептида от остальных последовательностей не дипептидной природы или выделение индивидуальных дипептидов из дипептидных повторяющихся последовательностей осуществляют ферментативным расщеплением полипептида в соответствующем положении без разрушения дипептидного интермедиата. Ферменты, которые могут использоваться в способе настоящего изобретения, включают соответствующие коммерчески доступные ферменты или ферменты, которые продуцирует организм и которые обладают нужной ферментативной активностью. Выбор соответствующего фермента зависит от особенностей дипептидной последовательности, подлежащей экспрессии. Дипептид может быть очищен либо перед его отделением от остальной части полипептида или выделением из повторяющихся дипептидных последовательностей, либо после этой стадии. Техника, пригодная для использования с целью очистки индивидуальных дипептидов или дипептидсодержащих полипептидов по способу настоящего изобретения, включает стандартные хроматографические методы. Указанные методы включают, не ограничиваясь 3 указанными, солевое фракционирование, ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию,адсорбционную хроматографию на гидроксилапатите и хроматографию, основанную на гидрофобном взаимодействии. Клонированная ДНК, полученная с помощью методов, приведенных в настоящем описании, может быть экспрессирована в рекомбинантной форме посредством вектора экспрессии, содержащего подходящий промотор и другие соответствующие регуляторные элементы транскрипции, в прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах и продуцированием в них рекомбинантного пептида. Техника такого рода манипуляций исчерпывающе описана в работе Сэмбрука с соавт. (Sambrook, J., etal., supra) и хорошо известна специалистам. Векторы экспрессии определены в настоящем описании как последовательности ДНК, которые используются для транскрипции клонированных копий генов и трансляции соответствующих мРНК в клетке подходящего хозяина. Указанные векторы могут использоваться для экспрессии эукариотических генов в разнообразных клетках-хозяевах, таких как клетки бактерий, сине-зеленых водорослей, растений,насекомых, грибов и животных. Сконструированный соответствующим образом вектор должен содержать: точку инициации репликации для автономной репликации в клетках-хозяевах, селективные маркеры, ограниченное количество сайтов для соответствующих рестрикционных ферментов, последовательность для получения выеококопийного варианта и активные промоторы. Промотор определяется в настоящем контексте настоящего изобретения как последовательность ДНК, которая направляет РНК-полимеразу на связывание с ДНК и на инициирование синтеза РНК. Активный промотор - это такой промотор, который инициирует образование мРНК с высокой частотой. Векторы экспрессии могут включать,не ограничиваясь перечисленными, векторы клонирования, модифицированные векторы клонирования, специальным способом сконструированные плазмиды или вирусы. Для экспрессии рекомбинантного пептида в клетках млекопитающих могут использоваться различные векторы экспрессии млекопитающих. Коммерчески доступные векторы экспрессии млекопитающих, пригодные для экспрессии рекомбинантного пептида, включают, не ограничиваясь перечисленными, pcDNA3 (Инвитроген), pMClneo (Стратаген), рХТ 1 (Стратаген),pSG5 (Стратаген), EBO-pSV2-neo (АТСС 37593), pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPVMMTneo(342-12) (АТСС 37224), pRSVgptZD35 (АТСС 37565). Для экспрессии рекомбинантного пептида в бактериальных клетках могут использоваться 4 многочисленные бактериальные векторы экспрессии. Коммерчески доступные векторы бактериальной экспрессии, пригодные для экспрессии рекомбинантного пептида, включают, не ограничиваясь указанными, рЕТ 11 а (Новаген),лямбда gt11 (Инвитроген), pcDNAII (Инвитроген), рКК 223-3 (Фармация). Для экспрессии рекомбинантного пептида в клетках грибов также могут использоваться многочисленные векторы экспрессии. Коммерчески доступные векторы экспрессии в клетках грибов, пригодные для экспрессии рекомбинантного пептида, включают, не ограничиваясь указанными, pYES2 (Инвитроген) и вектор экспрессии в дрожжах Рichia (Инвитроген). Для экспрессии рекомбинантного пептида в клетках насекомых могут использоваться различные векторы экспрессии. Коммерчески доступные векторы экспрессии в клетках насекомых, пригодные для экспрессии рекомбинантного пептида, включают, не ограничиваясь указанными, векторы pBlue Вас III (Инвитроген). Вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую дипептидный интермедиат, может использоваться для экспрессии пептида в рекомбинантной клетке организма-хозяина. Рекомбинантные клетки-хозяева могут быть представлены прокариотами или эукариотами,включая, но не ограничиваясь указанными, бактерии, такие как E.coli, клетки грибов, такие как дрожжи, клетки млекопитающих, включающие,не ограничиваясь перечисленными, клеточные линии человеческого происхождения, бычьи,свиные клеточные линии, клеточные линии,полученные из тканей обезьян и грызунов, а также линии клеток насекомых, которые включают, не ограничиваясь указанными, клеточные линии дрозофилы и тутового шелкопряда. Коммерчески доступные, пригодные для осуществления настоящего изобретения клеточные линии из различных видов млекопитающих, включают,не ограничиваясь указанными, L клетки LM(TK-) (ATCC CCL 1.3), L клетки L-M (ATCCMRC-5 (ATCC CCL 171). Вектор экспрессии может быть введен в клетки организма-хозяина с использованием различных методик, которые включают, не ограничиваясь перечисленными, трансформацию,трансфекцию, липофекцию, слияние протопластов и электропорацию. Клетки, содержащие вектор экспрессии, размножают в виде клонов,каждый из которых анализируют на определение наличия продукции белка. Идентификация клонов хозяйских клеток, экспрессирующих пептид, может быть произведена с помощью ряда методов, которые включают, не ограничи 5 ваясь перечисленными, методы определения иммунологической реактивности с антителами к пептидам, а также методы определения связанной с хозяйскими клетками B1 активности, такие, например, как определение связывания пептидспецифичного лиганда или обнаружение сигнальной трансдукции, определяемой как реакция, опосредованная взаимодействием с рецептором B1-специфичных лигандов. Экспрессия ДНК может быть произведена также in vitro с использованием синтетической мРНК или нативной мРНК. Синтетическая мРНК или нативная мРНК может эффективно транслироваться в различных бесклеточных системах, которые включают, не ограничиваясь перечисленными, экстракты из зародышей пшеницы и экстракты из ретикулоциотов, а также может использоваться для осуществления эффективной трансляции в клеточных системах,которые могут включать, но не ограничиваются указанной, ооциты лягушек, при этом предпочтительно применение техники микроинъекции в ооциты лягушек. Определяют последовательность(и) ДНК,которые обеспечивают получение оптимального уровня белка. Подходящие сконструированные молекулы ДНК включают, не ограничиваясь указанными, открытую рамку считывания ДНК полной длины и какие-либо конструкции, содержащие участки ДНК, кодирующей белок. Уровень белковой экспрессии может быть определен после введения указанных конструкций в соответствующие клетки-хозяева. После определения кластера ДНК, который приводит к оптимальной экспрессии, определяемой, например, при анализе на промежуточной стадии,такая конструкция ДНК переносится в различные векторы экспрессии для экспрессии в клетках организма-хозяина, которые включают, не ограничиваясь перечисленными, клетки млекопитающих, клетки насекомых, E.coli и дрожжевые клетки, такие как S.cerevisiae. Полученная после трансфекции клеткахозяин, а также ооциты после проведения микроинъекции могут быть дальше подвергнуты анализу на определение уровня белка с применением следующих методов. По прошествии определенного периода времени, нужного для осуществления экспрессии, измеряют уровень пептида. Один из методов обнаружения пептида включает непосредственное измерение уровня пептида в целых клетках или клеточных лизатах, полученных из хозяйских клеток, подвергнутых трансфекции ДНК. Дипептид аланил-пролин, Ala-Pro (АлаПро), представляет собой исходный материал,применяемый для синтеза ингибитора АСЕэналаприла. А дипептид Lys-Pro (Лиз-Про) является исходным материалом для синтеза ингибитора АСЕ - лизиноприла. Коммерчески доступный дипептид получают в настоящее время химическим синтезом. Был разработан новый 6 биопроцесс, который успешно устраняет необходимость в химических стадиях, применяемых для получения Ала-Про или Лиз-Про. В указанном способе используется рекомбинантная клетка-хозяин для обеспечения сверхпродукции пептида, содержащего повторяющиеся последовательности дипептида Ала-Про или Лиз-Про,которые затем с использованием бактериальных пролилпептидаз гидролизуют на составляющие их Ала-Про или Лиз-Про единицы. В качестве хозяина была выбрана Escherichia coli в связи с доступностью для нее векторов экспрессии. В коммерчески доступном векторе экспрессииpMAL клонируют синтезированный химически олигонуклеотид, кодирующий повторяющиеся последовательности Ала-Про и соответствующие сайты для лигирования. Осуществление процесса ферментаций рекомбинантной E.coli,которая содержит конструкцию, приводящую к получению нужного продукта слияния, определяется анализом белков в гелях. Затем применяют ферментативное расщепление с высвобождением Ала-Про единиц. Для высвобождения(Ала-Про)n-20 пептида используют коммерчески доступный фактор X, хотя могут также применяться и пролилпептидазы. Перед скринингом пролилпептидаз осуществляют идентификацию штаммов Lactobacillus helveticus и Xanthomonasmaltophiliа, обладающих активностью относительно Ала-Про-pNA и синтетических (АлаПро)n субстратов. Было показано с использованием метода ВЭЖХ, что применяя грубые экстракты каждой из этих культур, можно успешно провести процесс расщепления (Ала-Про)n до Ала-Про. А при объединении экстрактов из обеих культур наблюдается синергический эффект. Пролилпептидазная активностьX. maltophiliа, для которой была показана эндопептидазная природа рассматриваемой активности. Описанный биологический процесс имеет то преимущество, что позволяет избежать использования токсичных материалов для проведения химического синтеза, а также его адаптированность для других пептидов. После экспрессии дипептидного интермедиата в рекомбинантной клетке-хозяине рекомбинантный белок может быть восстановлен с получением дипептидного интермедиата в очищенном виде. Доступны и применимы несколько процедур для осуществления такого процесса. Как указано в настоящем описании, рекомбинантные дипептидные интермедиаты могут быть получены и далее очищены из клеточных лизатов и экстрактов с помощью различных комбинаций методов или с применением по отдельности таких процедур, как солевое фракционирование, ионообменная хроматография,гель-фильтрация, адсорбционная хроматография на гидроксилапатите и хроматография, основанная на гидрофобном взаимодействии. 7 После очистки дипептидного интермедиата с применением одной или более приведенных в настоящем описании методик, которые известны каждому специалисту со средним уровнем знаний в области очистки пептидов, дипептидные интермедиаты подвергают дальнейшей обработке до получения готового продукта. В случае дипептидного интермедиата Ала-Про дальнейшую обработку его с получением готового продукта, известного как эналаприл, и родственных ему соединений, осуществляют по методу, описанному в патенте США 4 374 829 и патенте США 4 555 502, оба из которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки для целей иллюстрации указанного положения. В случае дипептидного интермедиата Лиз-Про дальнейшую обработку его с получением готового продукта, известного как лизиноприл, и родственных ему соединений, осуществляют по методу, описанному в патенте США 4 374 829 и патенте США 4 555 502,оба из которых приведены в настоящем документе в качестве ссылки для целей иллюстрации указанного положения. Ниже приведены примеры, которые иллюстрируют настоящее изобретение, не ограничивая его объем. Пример 1. Конструирование вектора для экспрессии дипептида. Выбирается соответствующая плазмида для конструирования вектора экспрессии последовательности ДНК, содержащей дипептидные повторы. Выбранный вектор должен иметь ориджин репликации для рассматриваемого хозяина; в альтернативном варианте такой вектор может содержать ориджины экспрессии для более чем одного гена, что позволяет ему функционировать как "шаттл-вектор". Необходимо,чтобы плазмида содержала гены устойчивости к антибиотику и/или ауксотрофные маркеры для установления того, что трансформация или встраивание вектора в клетку были осуществлены, а также с целью поддержания стабильности вектора по отношению к селективным факторам воздействия. Сильный промотор, такой как tac промотор, который является индуцибельным,позволяет осуществлять максимальный уровень экспрессии в прямом направлении по линии расположения генов. В вектор также включается консенсусный рибосомальный сайт связывания,который распознается предпочтительным хозяином. Кроме того, могут быть встроены терминирующие последовательности в направлении прямой транскрипции для гарантии образования рекомбинантного пептида соответствующей длины. Альтернативно, белок-продукт слияния может кодироваться вектором экспрессии. Интересующий вектор будет при этом кодировать усеченный пептид, который в целом характеризуется высоким уровнем экспрессии в предпочтительном хозяине с его нативным промотором 8 или при использовании другого сильного промотора. Сайты клонирования для гена или олигонуклеотида, кодирующего дипептидный интермедиат, такой как Ала-Про или Лиз-Про повторы, может быть создан с применением техники синтеза или они уже могут находиться на 5' или 3' конце ДНК последовательностей таких повторов. Полученная конструкция ДНК в результате экспрессии приводит к образованию белка, содержащего усеченный фермент или белок для связывания, такой как белок, связывающий мальтозу в E.coli, слитый с последовательностью дипептидного интермедиата. Отделение может быть легко осуществлено на стадии последующего процессинга c удалением 5' пептида. В случае некоторых хозяев могут использоваться также сигналы или лидирующие пептиды для осуществления соответствующего внеклеточного транспорта с тем, чтобы секретировать нужный продукт. Может осуществляться также манипулирование кодонами с целью усиления экспрессии. Использование кодона в клетке-хозяине обычно осуществляется с некоторым их (перекрытием) смещением, так что в ходе экспрессии специфичных генов используются в подавляющем большинстве случаев один или более кодонов. Высоко экспрессируемые гены, приводящие к образованию высокого уровня белков или пептидов, кодируются кодонами, которым отдается предпочтение, и которые используются чаще, чем другие. Так, в клетке E.coll для лизина доступны два кодона: ААА и ААГ; а для пролина доступны четыре кодона: ЦЦА, ЦЦЦ,ЦЦГ и ЦЦУ. При этом кодон ЦЦГ используется чаще других, и поэтому остаток пролина в синтетическом Лиз-Про олигонуклеотиде может быть обозначен как ЦЦГ. Лизин кодируется только двумя кодонами, при этом не отдается явного предпочтения какому-либо одному из них, поэтому оба кодона и ААА, и ААГ, могут быть выбраны при конструировании олигонуклеотида с целью получения Лиз-Про повтора,который будет экспрессироваться в виде ЛизПро полипептида. В случае Ала-Про олигонуклеотида предпочтительны кодоновые последовательности ГЦТ и ГЦА, поэтому именно они и отбираются для целей достижения максимальной экспрессии в E.coli. Пример 2. Клонирование ДНК в векторах экспрессии Е.coli. Рекомбинантный пептид продуцируется вE.coli после переноса кластера экспрессии пептида в векторы экспрессии E.coli, которые включают, не ограничиваясь указанными, векторы серии рЕТ (Новаген). Векторы рЕТ обеспечивают пептидную экспрессию под строгим контролем промотора бактериофага Т 7. После переноса указанной конструкции в клеткухозяина E.coli, которая содержит хромосомальную копию гена РНК-полимеразы Т 7, функционирующую под действием индуцибельного laclac субстрата (IPTG) в культуру, индуцируется экспрессия. Уровень экспрессии пептида определяют, как раскрыто в настоящем описании. кДНК, полностью кодирующую открытую рамку считывания для пептида, вводят в сайтNdel вектора pET11a. Конструкции, расположенные в нужном "положительном" направлении, определяют методом анализа последовательностей, и затем используют их для трансформации экспрессии штамма-хозяинаBL21. Затем полученные трансформанты используют для инокулирования их в культуры,используемые для продуцирования белка. Культуры могут выращиваться на средах М 9 или ZB,состав которых известен каждому специалисту со средним уровнем знаний в данной области. После роста до OB600=1,5 индуцируют экспрессию пептида добавлением 1 мM IPTG при поддержании температуры 37 С в течение 3 ч. Пример 3. Клонирование ДНК в векторах экспрессии насекомых. Бакуловирусные векторы, полученные наocнове генома вируса AcNPV, конструируют таким образом, чтобы обеспечить высокий уровень экспрессии кДНК в клеточной линии Sf9 насекомых (АТСС CRL 1711). Рекомбинантные бакуловирусы, которые экспрессируют ДНК, кодирующую дипептидный интермедиат,получают с применением следующих стандартных методик (InVitrogen Max-bac Manual): ДНКконструкции лигируют в ген полигедрина в различных векторах переноса бакуловирусов,включая рАСЗ 60 и BlueBac векторы (ИнВитроген). Рекомбинантные бакуловирусы получают в результате гомологичной рекомбинации с последующей совместной трансфекцией вектора переноса бакуловируса и линеаризованной геномной ДНК AcNPV [Kitts, P.A., Nucl. Acid.Res. 18, 5667 (1990)] в клетки Sf9. Рекомбинантные вирусы рАСЗ 60 идентифицируют по отсутствию телец включения в инфицированных клетках, а рекомбинантныеBlueBac вирусы идентифицируют на основании экспрессии -галактозидазы (Summers, M.D. andSmith, G.E., Texas Agriculture Exp. Station Bulletin No 1555). После очистки бляшек измеряют уровень экспрессии пептида с помощью приведенных в настоящем описании методов. кДНК, кодирующую полноразмерную открытую рамку считывания пептида, встраивают в BamHI сайт вектора pBlueBacII. Конструкции, имеющие положительную ориентацию цепи, идентифицируют с помощью анализа последовательностей и далее применяют их для трансфекции клеток Sf9 в присутствии линеаризованной ДНК AcNPV дикого типа. Аутентичный пептид был обнаружен в ассоциации с инфицированными клетками. Пептид экстрагируют из инфицированных клеток посредством гипотонического лизиса или лизиса детергентами. 10 Альтернативно, пептид экспрессируется в клеточной линии Drosophila Шнейдер 2 при проведении совместной трансфекции клеток Шнейдер 2 вектором, содержащим ДНК, кодирующую пептид, в прямом направлении и под контролем индуцибельного металлотионеинового промотора, а также вектором, кодирующим ген устойчивости к неомицину G418. После роста в присутствии G418 получают устойчивые клетки, в которых индуцируют экспрессию пептида добавлением CuSO4. Пример 4. Планирование ДНК в дрожжевом векторе экспрессии. Рекомбинантный пептид получают в дрожжах S.cerevisiae после вставки оптимального цистрона ДНК в векторы экспрессии, разработанные таким образом, чтобы осуществлять внутриклеточную или внеклеточную экспрессию гетерологичных белков. В случае внутриклеточной экспрессии векторы, такие как EmBLyex4 или подобные им, лигируют с цистроном [Rinas, U. et al., Biotechnology 8, 543 - 545- 4192 (1989)]. Для внеклеточной экспрессии указанный цистрон лигируют с дрожжевыми векторами экспрессии, которые слиты с сигналом секреции. При этом уровни экспрессии пептида определяют с помощью методов, приведенных в настоящем описании. Пример 5. Очистка рекомбинантного пептида. Пептид, полученный с применением рекомбинантной техники, может быть очищен с помощью аффинной хроматографии с антителами. Колонки с антителами для аффинной хроматографии пептидов готовят добавлением антител к пептиду в Аффигель-10 (Affigel-10)[Биорад (Biorad)], гелевую основу, которая представляет собой предварительно активированные N-гидроксисукцинимидные эфиры, так что антитела образуют ковалентную связь с основой из гелевых шариков агарозы. Затем антитела связывают с гелем посредством амидных связей с выделением спейсерных областей. Оставшиеся активированные эфиры гасят добавлением 1 М этаноламина-НСl (рН 8). Колонку промывают водой, затем 0,23 М глицином-НСl(рН 2,6) для удаления неконъюгированных антител или внешних белков. После этого колонку уравновешивают фосфатно-буферным раствором (рН 7,3) вместе с соответствующими солюбилизирующими мембраны агентами, такими как детергенты, и медленно пропускают через колонку супернатанты клеточных культур или клеточные экстракты, содержащие солюбилизированный пептид. После этого колонку промывают фосфатно-буферным раствором вместе с детергентами до достижения оптической плотности (А 280), соответствующей фоновому уровню, после чего элюируют белок с применением 0,23 М глицин-НСl (рН 2,6) вместе с де 11 тергентами. Затем очищенный белок диализуют против фосфатно-буферного раствора. Пример 6. Получение рекомбинантными методами Ала-Про дипептида. Экспрессия Ала-Про. Получение Ала-Про полипептида в E.coli включает клонирование последовательности, кодирующей повторы АлаПро. Для этого имеются многочисленные коммерчески доступные системы. С целью экономии времени от Нью Инглэнд Биолэбс (NewEngland Blolabs) получают коммерчески доступную систему экспрессии - p-MAL. Систему используют в качестве вектора, содержащего ген для белка, связывающего мальтозу, который соседствует с сайтом полилинкера, в котором клонируют интересующую последовательность ДНК, такую как повторяющийся кодон АлаПро. После индукции клона, содержащего вышеуказанный вектор, должен экспрессироваться слитый белок (мальтоза-Ала-Про), при этом домен связывания с мальтозой используют для связывания мальтозы с колонкой, а мальтозный домен затем расщепляют фактором Х с последующим его выделением. В этом случае для кодирования 14 АлаПро единиц и стоп-кодона разработаны два комплементарных олигонуклеотида(87 нуклеотидов и 91 нуклеотид). Олигонуклеотиды синтезируют с использованием стандартных методов. Олигонуклеотиды очищают с помощью ДСН-ПААГ и затем экстрагируют из геля. Применяют направленное клонирование с использованием тупых и липких концов, которое позволяет достичь соответствующего сравнительного анализа и лигирования гена ала-про в плазмиду. Отбирают клоны с последующей трансформацией их в E.coli. Анализ белков и эксперименты, проведенные по индуцированию экспрессии в одном клоне АР/2, показывают,что после индукции осуществляется продуцирование слитых белков. Размеры полос в ДСНПААГ геле позволяют предположить, что образуется более чем один продукт. Тем не менее индуцирование и продуцирование слитого белка явным образом происходит. Секвенирование встроенной ДНК основано на перегруппировке клонированной последовательности и соответствующем распознавании стоп-кодона, генерированного в олигонуклеотиде. ДНК из клона секвенируют с помощью универсального праймера М 13. Интересно отметить, что последовательность вставки кодирует 20 Ада-Про повторов вместо 14 Ада-Про повторов. Стоп кодон TAG представлен на конце последовательности из 20 повторов. Присутствие(Ала-Про)20 связано, по всей видимости, с наличием двух олигонуклеотидов, несущих участки отжига, которые расположены с разрывами, при этом имеющиеся пробелы заполняются с участием полимеразы во время рекомбинации. Отжиг происходит в связи с наличием высокого уровня повторов в последовательности. В дан 000736 12 ном случае это может быть выгодно, поскольку приводит к образованию более длинного гена(и, следовательно, большего числа Ала-Про повторов). Гидролиз Ала-Про субстратов. В литературе имеются сообщения о том, что три бактериальные культуры Lactobacillus helveticus, L.sp. и Xanthomonas maltophilia, полученные из АТСС, обладают пролилпептидазной активностью. Культуры выращивают в 250-мл колбах и исследуют на наличие гидролитической активности с использованием коммерчески доступного колориметрического субстрата Ала-Про-pNA(источник). Все три культуры обладают активностью, с которой связана большая часть клеток(таблица 1). Культуру, пригодную для хранения,получают на скошенном агаре ("косячке") и замораживают в FVM. Для достижения оптимального роста лактобациллы нуждаются в микроаэрофильной камере в случае выращивания на косячках и в стационарной жидкой культуральной среде при выращивании в колбах. Таблица 1. Специфическая активность пролилпептидаз в отношении (Ала-Про)2 Спец. акт. Темп. 4 Ед/л 1 рН опт.2 КультураX. maltophilia 0,446 107 6,6 45 1. Ед - количество мкмолей высвобождаемого АлаПро в минуту при 37 С и оптимальном рН. 2. Цитрат-фосфатный буфер при оптимальной температуре. 3. Выполняют при рН 8,0. 4. Экстракты ферментов из гомогенизированных клеток. Желательно получать экстракты, которые могли бы соответствовать истинному олигомерному субстрату Ала-Про, что представляется возможным при выращивании рекомбинантнойE.coli. В этой связи следует отметить, что в Байосинтезис Инк. (Biosynthesis Inc.) синтезированы пептидные олигомеры для целей использования их в качестве пролилпептидазных субстратов. Был разработан метод ВЭЖХ для отделения низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот с целью определения ферментативной активности относительно аутентичных Ала-Про субстратов. Впоследствии с использованием метода ВЭЖХ была очищена пептидполимераза, полученная от Байосинтезис. При сборе фракций методом ВЭЖХ удается получить Ала-Про пептиды, включающие 2, 4 и 6 повторов. Для грубых экстрактов полученных пептидов был определен оптимум температуры и рН (таблица 2). При этом для L. helveticus были отмечены наивысшие значения энзиматического титра и специфической активности. Во всех исследованиях использовались рекомендованные в литературе данные по составу сред(см. ссылки), при этом не проводилось оптимизации или скрининга. Основываясь на различи 13 ях по виду получаемого гидролитического продукта, можно полагать, что лактобациллы продуцируют эндо-пролилпептидазу, a Xanthomonas продуцирует экзопептидазу. Обоснованность этих предположений была продемонстрирована в процессе объединения ферментов, когда удалось достичь синергического эффекта при гидролизе Ала-Про 6. Таблица 2 Источник Белок Ед/литр 1 Специфическая активность (Ед/мг)1 ферментаmaltophilia 0,70 28 0,17 0,35 0,43 1 Единицы обозначают количество мкмолей Ала-Про,высвобожденного в минуту при 37 С и рН 7,0. 2 Экстракты ферментов из "разбитых шариков" ("bead Было показано, что в случае введения в Ала-Про избытка фермента (600-кратная концентрация относительно используемого в тесте нормального значения), субстрат Ала-Про гидролизуется до аланина и пролина. Ингибиторы металло- и цистеин-протеаз демонстрируют свою эффективность в ингибировании гидролиза Ала-Про, тогда как в случае гидролиза АлаПро 6 до Ала-Про отмечена их низкая эффективность, что указывает на то, что расщепление Ала-Про облегчается отдельным ферментом. Частичная очистка также приводит к удалению из грубых экстрактов нежелательной активности. При использовании дипептидного интермедиата Ала-Про дальнейший его процессинг,ведущий к получению готового продукта, известного как эналаприл, и родственных ему соединений, осуществляют по способу, описанному в патенте США 4,374,829 и патенте США 4,555,502, приведенных в настоящем описании в качестве ссылки. Пример 7. Рекомбинантное продуцирование дипептида Лиз-Про из рекомбинантного растительного белка. Встречающиеся в природе последовательности, обогащенные последовательностями,которые кодируют Лиз-Про, можно найти в семействе генов белка клеточной стенки растений вида, близкого к соевым бобам (Glycine max)[См.: Hong et al., J. Biol. Chem., 1990]. Три гена,кодирующие белок сои, обогащенный пролином, представлены SbPRP1, SbPRP2 и SbPRP3,которые соответствуют аминокислотным последовательностям длиной 256, 230 и 90 аминокислот. Аминокислотный состав этих белков указывает на то, что от 34 до 40% остатков представляет собой пролин, а от 18 до 25% лизин. Особый интерес представляет SbPRP1,которому соответствует пептидная последовательность, содержащая 37 Лиз-Про аминокис 000736SbPRP3 кодирует 12 Лиз-Про дипептидных последовательностей, включая 2 Лиз-Про-Лиз-Про повторяющиеся последовательности, кодируемые парами оснований от 183 до 195 в гене. Клонирование гена SbPRP1, обогащенного Лиз-Про, сопровождается генерацией, на основании имеющихся данных о последовательностях ДНК, праймеров ПЦР. Фрагменты ДНК,содержащие интересующие последовательности, генерируют с использованием праймеров и библиотеки, содержащей фрагменты соевой ДНК. Полученную ДНК, обогащенную Лиз-Про кодонами, лигируют в соответствующих сайтах рестрикции вектора экспрессии. С использованием E.coli в качестве клетки-хозяина осуществляют экспрессию пептидов сои и выделяют их из лизированных клеток. Далее с помощьюLactobacillus helveticus или пролилпептидазы,полученной из этого штамма, белок гидролизуют до составляющих аминокислот и малых пептидов, включающих Лиз-Про остатки. Хроматографией или экстракцией получают относительно чистый Лиз-Про. Альтернативный метод заключается в синтезе олигонуклеотидов, соответствующих повторяющимся Лиз-Про-Лиз-Про последовательностям в SbPRP3 [или в использовании двух наборов, расположенных вплотную, но не соприкасающихся в природной последовательности], которые содержат соответствующие сайты рестрикции для вставки в интересующий вектор экспрессии. Экспрессия в подходящем хозяине приводит к выходу значительных количеств Лиз-Про в виде олигонуклеотидов. Далее с использованием Lactobacillus helveticus или пролилпептидазы, выделенной из этого штамма,обогащенные лизином и пролином пептиды гидролизуют до Лиз-Про остатков. Альтернативно, используют специфичную пролиновую пептидазу из Flavobacterium menigosepticum[Yoshimoto, T. et al., Agric. Biol. Chem., 42: 2417,1978] для гидролиза пептида. С помощью хроматографии или экстракции получают относительно чистый Лиз-Про. При использовании дипептидного интермедиата Лиз-Про дальнейший его процессинг,ведущий к получению готового продукта, известного как лизиноприл, и родственных ему соединений, осуществляют по способу, описанному в патенте США 4,374,829 и патенте США 4,555,502, приведенных в настоящем описании в качестве ссылки. Пример 8. Рекомбинантное продуцирование дипептида Ала-Про из рекомбинантного белка амфибий. Кислый полипептид размером примерно 75 кДа, обнаруженный в кожных железах Xenopus laevis, можно рассматривать как APEG белок, обогащенный Ала-Про дипептидами 15 По меньшей мере, 80% всей его массы представляет собой аланин, пролин, глутаминовую кислоту и глицин в соотношении 2:2:1:1. Библиотеку экспрессируемых фрагментов кДНК в векторе, производном от лямбда вектора, можно подвергнуть скринингу с применением олигонуклеотидных проб, полученных из известных по публикациям источников с целью выделения интересующего фрагмента. Альтернативно, антитела к APEG могут быть использованы для скрининга такой библиотеки экспрессируемых фрагментов кДНК. Интересующий фрагмент может быть выделен из клона и вставлен в вектор экспрессии. (Процессинг полученного пептида осуществляется, как и в случае примера 6 "Гидролиз Ала-Про субстратов"). Предпочтительный метод заключается в синтезе олигонуклеотида, включающего последовательности, соответствующие натуральным последовательностям APEG ДНК, кодирующей Ала-Про-Ала-Про-Ала-Про(ЦАЦЦАГЦТЦЦАГЦАЦЦАГ). ДНК, имеющую в олигонуклеотиде соответствующие сайты рестрикции, клонируют в векторе экспрессии, введенном в рекомбинантную клетку-хозяина, в соответствии с описанным выше методом. Полипептид, содержащий повторяющиеся дипептидные последовательности в интермедиате, подвергают ферментативному гидролизу по описанной выше процедуре, и дипептидный интермедиат Ала-Про выделяют для дальнейшего процессинга продукта. При использовании дипептидного интермедиата Ала-Про дальнейший его процессинг,ведущий к получению готового продукта, известного как эналаприл, и родственных ему соединений, осуществляют по способу, описанному в патенте США 4,374,829 и патенте США 4,555,502, приведенных в настоящем описании в качестве ссылки. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ получения дипептидов Ala-Pro,представляющий собой а) введение экспрессирующего ДНКвектора в подходящие клетки-хозяева, при этом указанный экспрессирующий ДНК-вектор содержит молекулу ДНК, кодирующую олигопептид или полипептид, содержащий множественные прямые повторы указанного дипептида AlaPro; б) культивирование указанных клетокхозяев в условиях, необходимых для экспрессии указанных олигопептида или полипептида; в) расщепление экспрессированных олигопептида или полипептида с помощью фермента,способного отделять указанные дипептиды AlaPro друг от друга, для высвобождения указанных дипептидов Ala-Pro; и г) выделение и очистку указанных дипептидов Ala-Pro. 16 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанные олигопептид или полипептид содержат, примерно, от 14 до 20 прямых повторовAla-Pro. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что фермент выбирают из группы, состоящей из пропилпептидазыmeningosepticum или их смеси. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный экспрессирующий ДНК-вектор экспрессирует олигопептид Ala-Pro-Ala-Pro-AlaPro. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что фермент выбирают из группы, состоящей из пропилпептидазыmeningosepticum или их смеси. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанный экспрессирующий ДНК-вектор кодирует слитый белок, содержащий отщепляемый фрагмент, соединенный с указанным олигопептидом или полипептидом, содержащим множественные прямые повторы дипептидаAla-Pro. 7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный отщепляемый фрагмент представляет собой домен связывания мальтозы. 8. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный олигопептид или полипептид содержит, примерно, от 14 до 4 повторов Ala-Pro. 9. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанный экспрессирующий ДНК-вектор экспрессирует олигопептид Ala-Pro-Ala-Pro-AlaPro. 10. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный олигопептид или полипептид содержит, примерно, от 14 до 20 прямых повторовAla-Pro. 11. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанный экспрессирующий ДНК-вектор экспрессирует олигопептид Ala-Pro-Ala-Pro-AlaPro. 12. Способ по п.6, отличающийся тем, что фермент выбирают из группы, состоящей из пропилпептидазыmeningosepticum или их смеси. 13. Способ получения дипептида Lys-Pro,представляющий собой а) введение экспрессирующего ДНКвектора в подходящие клетки-хозяева, при этом указанный экспрессирующий ДНК-вектор содержит молекулу ДНК, кодирующую олигопептид или полипептид, содержащий множественные прямые повторы указанного дипептида LysPro; б) культивирование указанных клетокхозяев в условиях, необходимых для экспрессии указанных олигопептида или полипептида; в) расщепление экспрессированных олигопептида или полипептида с помощью фермента, 17 способного отделять названные дипептиды LysPro друг от друга для высвобождения указанных дипептидов Lys-Pro; и г) выделение и очистку указанных дипептидов Lys-Pro. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный экспрессирующий ДНК-вектор экспрессирует олигопептид Lys-Pro-Lys-Pro. 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что фермент выбирают из группы, состоящей из пропилпептидазыmeningosepticum или их смеси. 16. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанный экспрессирующий ДНК-вектор ко 18 дирует слитый белок, содержащий отщепляемый фрагмент, соединенный с указанным олигопептидом или полипептидом, содержащим множественные прямые повторы дипептидаLys-Pro. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что указанный экспрессирующий ДНК-вектор экспрессирует олигопептид Lys-Pro-Lys-Pro. 18. Способ по п.17, отличающийся тем, что фермент выбирают из группы, состоящей из пропилпептиды