Применение фитоэстрогенсодержащих экстрактов, селективно модулирующих бета-рецептор эстрогена

008708 Настоящее изобретение относится к применению экстрактов, содержащих фитоэстроген, которые селективно модулируют бета-рецептор эстрогена [ER-beta] при отсутствии утеротропного действия, согласно отличительной части п.1 формулы изобретения. Экстракты Vitex Agnus Castus (витекс священный, авраамово дерево) уже давно используют для лечения нарушений менструального цикла, мастодинии, предменструального синдрома, нарушений менструации (вследствие первичной и вторичной недостаточности желтых тел), однако, экстракты такого рода до сих пор не использовали для эстрогенозаместительной терапии. В менопаузе происходит снижение уровня эстрадиола вследствие снижения функции яичников. Это приводит к ослаблению пролиферативных процессов и в гипоталамусе ведет к усилению активности пульсирующей секреции гонадотропин-рилизинг-гормона (GnRH - Gonadotropine Releasing Hormone).(Пульсирующая секреция гонадотропин-рилизинг-гормона - это своего рода синхрогенератор в гипоталамусе, который управляет пульсообразным выбросом ЛГ, при этом амплитуда и частота выброса регулируется стероидами.) Являющийся результатом этого стимулированный выброс ЛГ у климактерической женщины приводит к периодическим нарастающим тепловым волнам, которые воспринимаются как помеха и называются приливами. При отсутствии достаточно высокого уровня эстрадиола в крови в костной ткани преобладает активность остеокластов, сопровождающаяся снижением костной массы и, как следствие, повышенной опасностью перелома костей. Одновременно существует долгосрочная опасность образования бляшек в системе сосудов, что приводит к повышенному риску инфарктов. Эстрогенподобное действие оказало бы негативное действие на матку, влагалище, ткани груди и печень. Нежелательным здесь является то, что до сих пор при данном уровне техники не было фитолекарства, которое можно было бы использовать для орган-селективной профилактики или терапии в случаях эстрогенного дефицита. Поэтому, исходя из этого уровня техники, задачей настоящего изобретения является создание растительного лекарственного средства с эстрогеноподобным действием, которое будет оказывать органселективное воздействие, при этом незначительно воздействуя на матку. Решением этой задачи является применение фитоэстрогенсодержащих экстрактов согласно п.1 формулы изобретения. С помощью фитоэстрогеносодержащих экстрактов согласно настоящему изобретению, в частности экстрактов Vitex Agnus castus, предпочтительно плодов Vitex Agnus castus, впервые стало возможно получить селективное действие ER-beta без утеротропного эффекта. Благодаря применению экстрактов Vitex Agnus castus стало возможным посредством модуляции ER-beta лечить состояние, выбранное из группы, включающей ожирение и, возможно, обусловленный им метаболический синдром; гипертонию, артериосклероз, инфаркт миокарда, гиперандрогенемию; менопаузные нарушения способности регулирования экскреторных функций; менопаузальные приливы, связанные с гиперстимуляцией гипотоламной пульсирующей секреции гонадотропин-рилизинг-гормона; нарушения синтеза стероидного гормона, в частности синтеза прогестерона, желтым телом человека как причины лютериальной недостаточности; болезнь Альцгеймера, связанную с повышенной экспрессией бета-рецептора эстрогена в гиппокампусных нейронах. Экстракты для применения согласно изобретению можно использовать в виде стандартных фармацевтических препаратов, например в форме капель, таблеток, таблеток с покрытием, капсул, гранулятов,драже, суппозиториев, мазей, крема и тому подобных формах. Предпочтительно экстракты получают из Vitex Agnus Castus (VAC), в частности из его плодов и/или листьев, посредством спиртовой экстракции или экстракции посредством СО 2 из растения или частей растения и используют для применения согласно изобретению. Для выявления наличия фитоэстрогенов в экстрактах Vitex Agnus castus (VAC) использовали конкурентный анализ рецептора эстрогена, при котором радиоактивно маркированный эстрадиол вытесняется из рецепторов лигандами, которые охотно связываются с рецептором и поэтому далее называются модуляторами рецептора. В качестве модуляторов рецептора использовали как нерадиоактивный эстрадиол, так и исследуемый экстракт. Препарат рецептора готовили из цитозольной фракции из матки свиньи, которая содержит оба подтипа рецептора эстрогена, а именно ER-alpha и ER-beta. Результаты типичного эксперимента представлены на фиг. 1. Фиг. 1 показывает кривые вытеснения эстрадиола (Е 2, светлые символы) и экстрактов VAC (темные символы). Ордината показывает процентную долю (еще оставшихся) связей радиоактивно маркированного эстрадиола с рецептором эстрогена. Верхняя абсцисса обозначает концентрацию Е 2, в то время как нижняя абсцисса соответствует концентрации VAC. Вытеснение, полученное при самой минимальной концентрации тестовых веществ, принято за 100%. Средние значения SEM (среднеквадратичное отклонение) были рассчитаны как средние из трех измерений. ЕС 50 для VAC составляет 7,8 мкг/мл. Как видно на фиг. 1, связывание на экстрактах VAC конкурирует в зависимости от дозы с радиоактивно маркированным эстрадиолом за места в соединениях с рецептором эстрогена. Полученные данные убедительно демонстрируют, что исследованные экстракты содержат фитоэстрогены.-1 008708 Для подтверждения результата тот же анализ был проведен с препаратом рецептора из эндометрия человека. Опять же, в растворе были представлены оба подтипа ER. Результаты этих исследований представлены на фиг. 2. На фиг. 2 показаны кривые вытеснения радиоактивного маркированного эстрадиола из ER из эндометрия человека эстрадиолом (Е 2, светлые символы) и экстрактами VAC (темные символы). Ордината показывает процентную долю (еще оставшихся) соединений радиоактивно маркированного эстрадиола с рецептором эстрогена. Верхняя абсцисса обозначает концентрацию Е 2, в то время как нижняя абсцисса передает концентрацию VAC. Вытеснение, полученное при самой минимальной концентрации тестовых веществ, принято за 100%. Средние значения SEM были получены после трехкратного определения. ЕС 50VAC составляет 12,7 мкг/мл. Результаты ясно показывают, что фитоэстрогены из экстрактов VAC связываются с рецепторами эстрогена человека, что является начальным событием на молекулярном уровне при эстрогеноподобном действии соединений VAC у человека. Благодаря доступности рекомбинантных протеинов рецептора можно провести селективный анализER для отдельного подтипа (ER-alpha или ER-beta). Результат в форме типичной кривой вытеснения ERalpha представлен на фиг. 3. На фиг. 3 показаны кривые дозы/действие эстрадиола (Е 2, светлые символы) и экстрактов VAC,представленных заявителем (темные символы) в анализе с рекомбинантным ER-alpha человека. Верхняя абсцисса обозначает концентрацию Е 2, в то время как нижняя передает концентрацию VAC. Связывание,полученное при самой минимальной концентрации тестовых веществ, принято за 100%. Средние значения SEM были получены после трехкратного определения при одном и том же значении концентрации. В то время как Е 2 конкурирует с радиоактивными лигандами рецептора в зависимости от дозы, фитоэстрогены экстракта VAC не блокируют ER-alpha. Таким образом, ЕС 50 рассчитать не удалось. При помощи тех же тестовых соединений, что и при анализе ER-alpha, были проведены анализыER-beta. Данные и график репрезентативного эксперимента показаны на фиг. 4. На фиг. 4 показаны кривые дозы/действия эстрадиола (Е 2, открытые символы) и экстрактов VAC заявителя (темные символы) в анализе с рекомбинантным ER-beta человека. Верхняя абсцисса обозначает концентрацию Е 2, в то время как нижняя передает концентрацию VAC. Вытеснение, полученное при самой минимальной концентрации тестовых соединений, принято за 100%. Средние значения SEM были получены после трехкратного измерения при одном и том же значении концентрации. ЕС 50 VAC составляет 9,9 мкг/мл. В отличие от результатов анализа ER-alpha фитоэстрогены экстрактов VAC, представленные заявителем, связывают ER-beta в зависимости от дозы. Эти данные без всяких сомнений подтверждают селективность ER-beta экстрактов Vitex Agnus castus, представленных заявителем. Далее будет показано эстрогенное действие Vitex Agnus castus на гранулезные/лютеиновые клетки человека и лютеиновые клетки свиньи. Секреция стероидов фолликулов яичников и лютеома регулируется эндокринно посредством гормонов гипофиза ЛГ и ФСГ. Дополнительно происходит местный контроль посредством эстрадиола, который называют паракринным регулятором. Этот локальный контроль требует экспрессии рецептора эстрогена. Недавние молекулярно-биологические исследования доказывают, что гранулезные клетки преобладающим образом экспрессируют подтип ER-beta по сравнению с ER-alpha. Лютеиновые клетки,напротив, экспрессируют исключительно ER-beta. Традиционной методикой исследования паракринных эффектов стероидов являются культуры лютеиновых клеток. Такие клетки у человека получить нельзя, так как все оперативные вмешательства, при которых можно взять биопсию, всегда проводят в фолликулярной фазе во избежание риска неустановленной беременности. Однако в рамках программ оплодотворения in vitro доступны так называемые гранулезные/ лютеиновые клетки, которые поддерживаются в культуре, и эти клетки ведут себя, по существу, подобно лютеиновым клеткам относительно блокирования рецептора и секреторных функций. Посредством вышеописанной методики in vitro на клетках человека был проверен эстрогенный эффект Vitex Agnus castus. Далее, необходимо провести сравнительное тестирование действия 17-бета-эстрадиола (природного изомера эстрадиола) и изомера 17-альфа-эстрадиола на секрецию прогестерона гранулезных/лютеиновых клеток человека. Эти данные графически представлены на фиг. 5. Фиг. 5: 5-часовая инкубация этих клеток с 17-бета-эстрадиолом (1 мкМ) ведет к значительному подавлению секреции прогестерона, в то время как изомер 17-альфа-эстрадиола (также 1 мкМ) не оказывает никакого эффекта.- означает значительное отклонение от контрольной среды (культуры). Это означает: 1) подавление in vitro секреции прогестерона является проявлением эстрогенного действия; 2) действие 17-бета-эстрадиола очень селективно, поскольку 17-альфа-эстрадиол не оказывает такого действия. На фиг. 6 представлено действие экстрактов Vitex Agnus castus в этой тестовой системе на секрецию прогестерона после 5-часовой инкубации. Как видно на фиг. 6, экстракт Vitex Agnus castus также ингибирует, как и встречающийся в природе 17-бета-эстрадиол, секрецию прогестерона гранулезных/лютеиновых клеток человека. Фармакологиче-2 008708 ски это следует расценивать как эстрогенное действие.- означает значительное отклонение от контроля(= среды культуры). Указания концентрации на абсциссе означают соответствующую концентрацию экстракта VAC в тестовом образце. Так как гранулезные/лютеиновые клетки человека экспрессируют преимущественным образом, но не исключительно, ER-beta, была повторена попытка с лютеиновыми клетками свиньи, т.е. с клетками,экспрессирующими исключительно ER-beta. Соответствующие результаты представлены на фиг. 7. Согласно фиг. 7 Vitex Agnus castus оказывает очевидное эстрогенное действие на эти клетки, также поскольку секреция прогестерона (левая часть графика, первых три столбца после первой контрольной среды) значительно подавлена. Неспецифическое, цитотоксическое действие было исключено посредством измерения жизнеспособности клеток (по стандартной методике контрастирования МТТ) (правая часть графика, последних три столбца после второго контроля среды). Экстракт Vitex Agnus castus не оказывает влияния на жизнеспособность клеток. Таким образом, пониженная секреция прогестерона является специфическим эстрогенным эффектом.- означает значительное отклонение от контрольной среды (культуры). Значения концентрации на абсциссе означают соответствующую концентрацию экстракта VAC. Для подтверждения этих выводов клетки с экстрактом Vitex Agnus castus были инкубированы вместе с антиэстрогеном тамоксифеном. Результаты эксперимента представлены на диаграмме фиг. 8. На фиг. 8- означает значительное отклонение от контрольной среды (культуры). Обозначения на абсциссе означают: ТАМ = тамоксифен, указания концентрации соответствующей концентрации экстракта VAC, и VAC+TAM - сочетание экстракта VAC с указанной концентрацией из последнего столбца с чистым экстрактом VAC плюс тамоксифен. Согласно фиг. 8 сам антиэстроген тамоксифен не оказывает действия на секрецию прогестерона. Связывание тамоксифена при помощи ER приводит к тому, что меньшее количество сайтов связывания оказывается доступным для компонентов VAC и ожидаемый эффект, который заключается в подавлении секреции прогестерона, снижается. Этот результат однозначно показывает, что действие VAC на синтез прогестерона специфическим образом передается посредством рецепторов эстрогена. Для проверки утеротропного действия был проведен следующий эксперимент, данные которого графически представлены на фиг. 9. В течение 3 месяцев две различные концентрации экстрактов VAC (100 мг/кг = VAC100 и 400 мг/кг массы тела = VAC400) подмешивали в корм самок крыс с овариэктомией и самцов крыс с орхиэктомией. В отличие от эстрадиола, VAC не оказывал утеротропного действия, и даже эпителий влагалища оставался без изменений. Оба пролиферативных эффекта эстрадиола в рамках пери- и постклимактерической эстрогенозаместительной терапии или при гормонозаместительной терапии нежелательны для женщин после овариэктомии, поскольку при постоянном приеме эстрогенов и в отсутствие противоположно направленной регуляции прогестагенами нельзя исключать гиперплазию эндометрия вследствие продолжительного пролиферативного эффекта эстрадиола. На фиг. 9 на ординате указана масса матки крыс. Отдельные столбики представляют контрольную группу (только с овариэктомией), положительный контроль эстрадиола, а также данные для двух различных концентраций VAC. Как видно на фиг. 9, у животных, которых лечили при помощи VAC, не было обнаружено утеротропного эффекта, аналогичного действию эстрадиола, что означает, что VAC не оказывает пролиферативного действия на ткани матки. Однако при дальнейших исследованиях с удивлением было установлено, что VAC может оказывать эстрогенное действие на другие системы органов. При помощи компьютерной томографии были определены абдоминальные и паратибиальные жировые ткани у самцов и самок крыс. При Е 2 и высокой дозе Vitex Agnus castus наблюдалось снижение обеих долей ткани. Одновременно снизился уровень лептина в сыворотке животных, которые принималиVAC. Результаты этого исследования представлены на фиг. 10 и 11. Фиг. 10 показывает действие эстрадиола и двух различных концентраций VAC на паратибиальную жировую ткань, выраженное в виде соотношения доли поверхностной жировой ткани в процентах на снимке, полученного компьютерной томографией в области большеберцовой кости, к аналогичной доли для контрольного образца. На фиг. 11 показано действие эстрадиола и двух различных концентраций VAC на содержание лептина в сыворотке, указанное на ординате в нг/мл. Как видно на фиг. 10 и 11, при приеме VAC проявляются снижение паратибиального содержания жира и снижение концентрации лептина в сыворотке. Также при помощи компьютерной томографии наблюдали изменение плотности костей (сниженное развитие остеопороза) на метафизе большеберцовой кости у самцов и самок крыс. Было установлено, что при применении VAC плотность костей снижается в значительно меньшей степени, чем у контрольных животных, которых не лечили им. Инстилляция 1 мл физиологического раствора поваренной соли посредством катетера в мочевой пузырь самок крыс с овариэктомией в течение 1 мин ведет к увеличению внутреннего давления мочевого-3 008708 пузыря. У животных, у которых в течение 3 месяцев проводилась заместительная терапия с Е 2, прирост давления составлял значение примерно в 3 раза выше, чем у контрольных животных с плацеболечением, и немного слабее, но все же значительный прирост давления был у животных, которых лечили эстрадиолом,если животных лечили при помощи VAC. Результаты этого исследования представлены на фиг. 12 и 13. На фиг. 12 на ординате указано максимальное внутреннее давление мочевого пузыря в мм рт.ст.,которое было измерено для контроля, эстрадиола в качестве положительного контроля и двух различных концентраций VAC. Для сравнения, на фиг. 13 показана на ординате площадь под кривой измерения давления [AUC] в мм рт.ст.с для контроля, эстрадиола в качестве положительного контроля и двух различных концентраций VAC. Таким образом, согласно представленному выше описанию можно использовать экстракты VAC для производства лекарственных аппаратов для лечения состояния, выбранного из группы, включающей при отсутствии утеротроптного эффекта ожирение и, возможно, обусловленный им метаболический синдром; гипертонию, артериосклероз, инфаркт миокарда, гиперандрогенемию; менопаузные нарушения способности регулирования экскреторных функций; менопаузальные приливы, связанные с гиперстимуляцией гипотоламной пульсирующей секреции гонадотропин-рилизинг-гормона; нарушения синтеза стероидного гормона, в частности синтеза прогестерона желтым телом человека как причины лютериальной недостаточности; болезнь Альцгеймера, обусловленную повышенной экспрессией бета-рецептора эстрогена в гиппокампусных нейронах. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение фитоэстрогеносодержащего экстракта из Vitex Agnus Cactus для приготовления лекарственного препарата, который селективно модулирует бета-рецептор эстрогена, не вызывая утеротропного действия, для лечения и профилактики состояний, при которых показано применение эстрогензаместительной терапии. 2. Применение по п.1, согласно которому состояние выбрано из группы, включающей ожирение и, возможно, обусловленный им метаболический синдром; гипертонию, артериосклероз, инфаркт миокарда, гиперандрогенемию; менопаузальные нарушения способности регулирования экскреторных функций; менопаузальные приливы, связанные с гиперстимуляцией гипотоламной пульсирующей секреции гонадотропин-рилизинг-гормона; нарушения синтеза стероидного гормона, в частности синтеза прогестерона желтым телом человека как причины лютериальной недостаточности; болезнь Альцгеймера, связанную с повышенной экспрессией бета-рецептора эстрогена в гиппокампусных нейронах. 3. Применение по п.1 или 2, отличающееся тем, что экстракт используют в виде стандартного фармацевтического препарата. 4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что фармацевтический препарат представляет собой капли, таблетки, таблетки с покрытием, капсулы, грануляты, драже, суппозитории, мази, кремы. 5. Применение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что экстракт из Vitex Agnus Castus, в частности из его плодов и/или листьев, получают экстракцией этанолом или СО 2.