Синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами

006248 Изобретение относится к медицине, в частности, к иммунологии, и может быть использовано при лечении наркоманий, отравлении различными ядами в промышленности и быту, при техногенных катастрофах и т.п. Предпосылки изобретения В настоящее время широко используются в отечественной медицинской практике синтетические иммуногены, состоящие из носителя - полиоксидония (N-оксидированного производного полиэтиленпиперазина с высоким молекулярным весом) и гаптена - высокомолекулярного соединения, например фермента гиалуронидазы, или смеси гемагглютина и нейрамидазы, или холерного токсина, или тритонового экстракта (гликопептида) клеточных стенок микробактерий БЦЖ, или др. [см., например. з. 97103034,МПК А 61K 38/43, заявл. 28.02.1997, опубл. 10.09.1998; п.1580617, МПК А 61 К 39/145, заявл. 13.05.1988, опубл. 10.02.1997; п.2021816, МПК А 61K 39/106, з. 05.06.1991, опубл. 30.10.1994; п.2153354, МПК А 61K 39/04, заявл. 31.03.1999, опубл. 27.07.2000; ж. Иммунология 6, 2002, с.324333; ж. Лечащий врач 4, 1998]. Несмотря на то, что входящий в состав известных иммуногенов полиоксидоний обладает уникальными свойствами (воспроизводимостью химической структуры, отсутствием балластных примесей, ярко выраженной иммуностимулирующей активностью, выраженными детоксицирующими, антиоксидантными и мембраностабилизирующими свойствами), описанные выше препараты могут быть применены только для лечения острых и хронических бактериальных или вирусных инфекций из-за наличия в них специфических гаптенов. Известен наиболее близкий по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому изобретению синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими веществами (в частности, опиатной зависимости), представляющий собой конъюгат в виде носителя природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения. Причем, в качестве носителя он содержит бычий сывороточный альбумин или синтетические полипептиды и гликопротеины, а в качестве гаптена-морфин, или кодеин, или героин, или метадон, или т.п. [см. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям, М., Наука, 1985]. Недостатки прототипа следующие: наличие балластных примесей; низкая терапевтическая (иммуностимулирующая) активность; необходимость применения больших доз (до 20 мг/кг) и продолжительность иммунизации (до 6 месяцев); невозможность достижения стабильного и/или пролонгированного иммунитета. Задачей настоящего изобретения является создание легко воспроизводимого, доступного и безвредного синтетического иммуногена, способного защитить человека от действия широкого спектра токсических веществ, формирующего в его организме стойкий, пролонгированный иммунный ответ. Описание изобретения Поставленная задача решается тем, что в известном синтетическом иммуногене для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами, представляющем собой конъюгат в виде носителя - природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения, согласно изобретению, конъюгат модифицирован иммунокомпетентным полиэлектролитом-полиоксидонием при соотношении, вес.%: конъюгат : полиоксидоний = 1:1,5-5,0,причем он содержит в качестве носителя - яичный альбумин, или человеческий гамма-глобулин, или микробные токсины; а в качестве гаптена - низкомолекулярные соединения из следующих групп: ароматические пропанамины, или изохинолины, или дифенилметаны, или индоламины, или производные барбитуровой кислоты, или производные замещенных пиперидинов. Модификация предлагаемого конъюгата полиоксидонием обеспечивает отсутствие в синтетическом иммуногене балластных примесей, при этом, заявляемое соотношение конъюгат: полиоксидоний необходимо и достаточно для достижения высокой иммуностимулирующей активности стабильного пролонгированного действия. Использование в предлагаемом синтетическом иммуногене конкретных носителей и гаптенов защищает организм человека от действия широкого спектра токсических веществ (в том числе наркотиков,промышленных ядов, различных канцерогенов). Заявляемый синтетический иммуноген стимулирует процессы в рамках иммунной системы: миграцию и взаимодействие Т- и В-лимфоцитов, продукцию антител в ответ на чужеродные антигены, функционирование NK - клеток и макрофагов. Под его влиянием усиливается синтез антител, количество которых возрастает в геометрической прогрессии уже в течение первых двух недель, а к концу второго месяца от начала введения в организме накапливаются антитела, способные связывать дозы наркотических или других токсических веществ, в 5-10 раз превышающие летальные. В частности, наряду с продукцией антигероиновых антител, индуцируется образование мононуклеарных клеток селезенки, связывающих героин. Таким образом, иммунизация пациента предлагаемым препаратом приводит к развитию продол-1 006248 жительной толерантности к конкретным веществам при отсутствии любых отрицательных явлений. Для приготовления заявляемого синтетического иммуногена использовали следующие промышленно выпускаемые или самостоятельно синтезированные компоненты: Приготовление синтетического иммуногена осуществляли по известным традиционным методикам. Методика 1. К смеси 1,2 г бензидина, 2 мл муравьиной кислоты и 70 мл воды при -10 С добавляли 1 г нитрата натрия в 2 мл воды. Реакционную смесь выдерживали при охлаждении и перемешивании в течение одного часа. Затем полученный раствор добавляли при 0 С к раствору 2 г фентанила (карфентанила, метадона, кокаина, никотина, героина и т.п.) в 15 мл воды, поддерживая рН 7,0-8,0 добавлением 10%-ного раствора едкого натра. Осадок отфильтровывали, промывали водой и многократно хлороформом. К 200 мг приготовленного пара -аминодифенилазофентанила (-карфентанила, - метадона, - кокаина,- никотина, - героина и т.п.) и 10 мл концентрированной соляной кислоты при минус 10 С добавляли 29 мг нитрита натрия в 2 мл воды. Реакционную смесь выдерживали при охлаждении и перемешивании в течение 30 мин. Полученный раствор прибавляли на холоде к раствору человеческого гамма-глобулина или синтетического полипептида в воде, поддерживая рН 7,0-8,0 добавлением едкого натра. Смесь оставляли на 12 ч в холодильнике. Очистку полученного конъюгата проводили через полупроницаемые мембраны против тока дистиллированной воды в течение 5 дней или на сефадексе. Конъюгат модифицировали полиоксидонием, предварительно активированным известным путем(см., например, п.1580617) при соотношении конъюгат: полиоксидоний= 1:1,5-5,0. Структурная формула полученного синтетического иммуногена представлена в Приложении. Методика 2. Брали стехиометрические количества налтрексона (морфина, кодеина, и т.п.) 0,01 моль (3,8 г) в пиридине 0,01 моль (0,8 г) и сукцинилдихлорида 0,01 моль (1,6 г). Пиридин использовали в реакции как элиминатор хлороводорода, выделяющегося в процессе присоединения налтрексона к одной из хлоркарбоксигрупп сукцинилдихлорида. Вторая же подобная группа оставалась свободной для последующего присоединения к белку человеческому гамма-глобулину или синтетическому полипептиду. Очистку конъюгата и его модификацию полиоксидонием осуществляли также, как описано в методике 1. Структурная формула полученного синтетического иммуногена представлена в Приложении. Заявляемый синтетический иммуноген синтезировали в условиях кафедры фармакологии Уральской медицинской академии, имеющей разрешение Минздрава России на научные работы с наркотическими и психотропными веществами в соответствии со следующими документами: Приказом МЗ СССР 1311 от 30.12.1982 г. и Федеральным законом О наркотических средствах и психотропных веществах 3 - ФЗ от 8.01.98. Синтезированные иммуногены многократно испытывали на мышах, а также на группах добровольцев в соответствии со ст. 124 УК РФ, ст.43 Основ законодательства об охране здоровья граждан и ст.21, ч. 2 Конституции РФ. Синтетический иммуноген вводили пациентам в виде раствора подкожно в качестве 0,5 мл. Через две недели процедуру повторяли и затем продолжали введение иммуногена 1 раз в неделю еще в течение шести недель. Время активной иммунной реакции определяли стандартными методами: РПГА, РТПГА,ИФА, РИА. Пациенты находились под регулярным наблюдением за изменением состояния их здоровья в течение 5 лет. Пример 1. Синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами. Синтетический иммуноген представляет собой конъюгат в виде носителя - природного белка - человеческого гамма-глобулина и гаптена - низкомолекулярного соединения из группы изохинолина налтрексона. Конъюгат модифицирован иммунокомпетентным полиэлектролитом - полиоксидонием при соотношении, вес.%: конъюгат : полиоксидоний=1:1,5.-3 006248 10,0 мг 15,0 мг В примерах 2-8 представлен синтетический иммуноген с варьированием носителей, гаптенов и соотношения (конъюгат: полиоксидоний) в заявляемых пределах. Составы предлагаемого синтетического иммуногена и известного, взятого за прототип [см. Ковалев И.Е., Полевая Ю.И. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям, М., Наука, 1985], а также их фармакологические действия приведены в таблице. Как видно из примеров и данных таблицы, использование заявляемого синтетического иммуногена по сравнению с известным, взятым за прототип [см. Ковалев И.Е., Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям, М. , Наука, 1985], обеспечивает следующие технические и общественно-полезные преимущества: легкую воспроизводимость без балластных примесей; доступность и безвредность; высокую иммунологическую активность; сокращение доз и сроков лечения; стабильный пролонгированный иммунитет; защиту от действия широкого спектра токсических веществ (наркотических и психоактивных). Доклинические исследования В специальной серии опытов методом биологической пробы была выяснена возможность нейтрализации токсического действия героина на животных. Группе контрольных животныхчетыре неиммунизированных кролика и опытной группе - четыре иммунизированных кролика внутривенно вводили абсолютно летальную дозу героина 100 мг/кг (LD100). Было установлено, что все четыре кролика контрольной группы погибли от указанных доз. Среди иммунизированных кроликов гибели не зарегистрировано ни в одном из четырех случаев, т.е. наблюдалась четкая иммунологическая защита. Также проводили исследования сыворотки крови иммунизированных животных. Восемь кроликов весом каждый по 2 кг иммунизировали препаратом 3-гемисукцинилналтрексончеловеческий гамма-глобулин - полиоксидоний, содержащий 45 молей 3-гемисукцинилналтрексона и 3 моля полиоксидония на молекулу белка, который вводили внутримышечно по 30 мг/кг два раза в неделю в течение 8 недель. В сыворотке крови животных до иммунизации и после нее определяли наличие антител к препаратам и изучали их специфичность в реакции торможения пассивной гемагглютинации стандартными методами. Составы синтетических иммуногенов и их фармакологическое действие Примечание: 1. В качестве носителей, кроме приведенных в таблице, могут быть использованы: микробные токсины (столбнячный, стрептококковый, ботуллистический), или синтетические полипептиды (хаотично полимеризованные L- или D-аминокислоты). 2. В качестве гаптенов, кроме приведенных в таблице, могут быть использованы низкомолекулярные соединения следующих групп: ароматические пропанамины (первитин, экстази), или изохинолины(морфин, кокаин, никотин, этарфин, дигидроэтарфин), или дифенилметаны, или индоламины (LSD-25,псилоцин, ибогаин, диэтиламид лизергиновой кислоты), или производные барбитуровой кислоты (барбитураты и их возможные аналоги), или производные замещенных пиперидинов (фентанил, лофентанил,3-метилфентанил, суфентанил; алфентанил, фенциклидин). 3. Фармакологическое действие синтетических иммуногенов с различными указанными в пп.1 и 2 конкретными носителями и гаптенами характеризуется синтезом антител, специфичных для каждого гаптена. Иммунизация кроликов препаратом по приведенной схеме приводила к появлению в сыворотке крови высоких титров антител к иммунокомплексу 3-гемисукцинилналтрексон-человеческий гаммаглобулин - полиоксидоний (1:2560). В реакции торможения пассивной гемагглютинации было установлено, что образующиеся антитела связывают героин и 3-гемисукцинилналтрексон: титр антител к иммунокомплексу уменьшался до 1:320 при использовании концентрации героина и 3 гемисукцинилналтрексона 0,001 моль, что свидетельствует о наличии антител к этим соединениям. Таким образом, синтезированный иммунокомплекс специфически связывает героин не только invitro, но и в целом организме. Полученные из сыворотки крови кроликов антитела изучены на специфичность связывания опиатов фенантренового ряда. Исследование специфичности антител, т.е. способности связываться с морфином,героином и другими лигандами опиатных рецепторов, проводили ингибиторным иммуноферментным анализом. В качестве ингибиторов использовали морфин, героин, кодеин, N-аллилморфин и метадон. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при активной иммунизации животных иммунокомплексом 4-гемисукцинилналтрексон - человеческий гамма-глобулин полиоксидоний индуцируются антитела, специфически связывающие морфин, героин, кодеин, N-аллилморфин и практически не реагирующие с метадоном. Специфичность антител против героина в кроличьей иммунной сыворотке. Из полученных данных видно, что связывание опиатов зависит от наличия в их молекулах определенных функциональных групп и радикалов. Так, в частности, высокая специфичность антител к героину обусловлена наличием в иммунокомплексе сложной эфирной связи налтрексона с янтарной кислотой, а кN-аллилморфину - с присоединенным к атому азота циклопропилметильным радикалом в химической-5 006248 структуре налтрексона. Таким образом, образующиеся антитела обладают высокой специфичностью только к опиатам фенантренового ряда (героину и его структурным аналогам). Учитывая результаты экспериментов, авторы пришли к выводу о том, что 3-гемисукцинилналтрексон пригоден для синтеза иммуногена. Его химическая структура содержит разветвленные радикалы для формирования иммунного ответа и синтеза высоко аффинных антител к опиатам фенантренового ряда. Клинические исследования Аналогичные исследования специфичности были проведены с антителами, выделенными из сыворотки крови добровольцев больных наркоманией, иммунизированных синтезированным иммуногеном. Иммуноген вводили 22 добровольцам, страдающим опийной наркоманией, возраст 21-36 лет. Продолжительность приема наркотиков 2-13 лет. Иммуноген вводили подкожно в верхнюю треть плеча правой и левой руки попеременно, один раз в неделю, 8-10 инъекций на курс. Из исходных 22 сывороток наркоманов антиопиатные антитела выделены во всех образцах. По данным ИФА в сыворотках содержатся антитела IgG- и IgM-класса против морфина, героина и кодеина,реагирующие в одинаковой степени с каждым из метаболитов. Специфичность антител против героина в человеческой иммунной сыворотке Как и в случае иммунных кроличьих антиопиатных антител, антитела, выделенные из сыворотки крови наркоманов, практически не взаимодействовали с наркотическими веществами не фенантренового ряда. Антитела, выделенные из сыворотки крови больных наркоманией, по сравнению с антителами из кроличьих иммунных сывороток обладают более широким спектром специфичности. Для подтверждения данных, приведенных в таблице Составы синтетических иммуногенов и их фармакологическое действие (см. описание изобретения, таблица стр. 7) приведены дополнительные сведения. Конкретные примеры применения синтетических иммуногенов, представленных в таблице. Пример 9. (соответствует составу I таблицы) Пациент 25 лет, 7 лет опийная наркомания. Исходные лабораторные данные: 1 мл плазмы крови - 2570 пмоль героиносвязывающих антител,определяемых радиоиммунным анализом (РИА). Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном - человеческий гамма-глобулинналтрексон(гаптен из группы изохинолинов) - полиоксидоний. Лабораторные данные (через 9 недель от начала лечения иммуногеном) : РИА 1 мл 77550 пмольсинтез героиносвязывающих антител. Через 8 недель созревают Т-лимфоциты и стимулируется образование антител, вызывающих созревание В-лимфоцитов, возникает пожизненный клеточный иммунитет; отсутствуют аллергические реакции. Контрольные лабораторные данные (через 12 месяцев от начала лечения иммуногеном): РИА 1 мл 50120 пмоль. Пример 10. Пациент 32 года, 9 лет опийная наркомания. Исходные лабораторные данные: 1 мл - 152 0 пмоль; сорбционная способность эритроцитов (ССЭ) детоксикационная функция организма 64,15,7% (определение экспресс-методом поглощения эритроцитами витальных красителей - метиленовой сини, см. ж. Лабораторное дело, 1988 г.,9, ст. А.А.Тогайбаева, А.В.Кургузкина и др. Способ диагностики эндогенной интоксикации). Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном-человеческий гамма-глобулинналтрексон-полиоксидоний. Лабораторные данные: РИА 1 мл - 78610 пмоль, ССЭ - 44,1+5,8% - усиление детоксикационной функции организма. Другие характеристики аналогичны приведенным в примере 1. Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл - 51100 пмоль. Пример 11. Пациент 21 год, 4 года опийная наркомания. Исходные лабораторные данные: РИА 1 мл - 1680 пмоль; ССЭ - 63,8+5,6%; определение опиатов(иммуно-хроматографические тесты мочи) - положительно. Пациента иммунизировали синтетическим иммуногеном-человеческий гамма-глобулинналтрексон-полиоксидоний. Лабораторные данные: РИА 1 мл - 78900 пмоль, ССЭ - 42,45,8%; определение опиатов - отрицательно, т.е. усиливается сорбция метаболитов и ксенобиотиков. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1 и 2. Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл - 52600 пмоль. Примечание к примерам 1-3: приведенные данные зафиксированы документально в историях болезни пациентов. Пример 12. Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном яичный - альбумин-амфетамин (гаптен из группы ароматических пропанаминов)-полиоксидоний из расчета 50 мг/кг. Вводили летальную дозу психоактивного вещества - первитина. Лабораторные данные: РИА 1 мл - 76500 пмоль. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1-3. Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл - 51200 пмоль. Пример 13. Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном яичный альбумин-метадон (гаптен из группы дифенилметана)-полиоксидоний из расчета 50 мг/кг. Вводили летальную дозу наркотического вещества - героина. Лабораторные данные: РИА 1 мл - 75300 пмоль. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1-3. Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл - 52600 пмоль. Пример 14. Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном дифтерийный токсин-гармин (гаптен из группы индоламинов)-полиоксидоний из расчета 50 мг/кг. Вводили летальную дозу психоактивного вещества - первитина. Лабораторные данные: РИА 1 мл - 77900 пмоль. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1-3. Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл - 54700 пмоль. Пример 15. Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном человеческий гамма-глобулин - фенобарбитал (гаптен из группы производных барбитуровой кислоты)полиоксидоний из расчета 50 мг/кг. Вводили летальную дозу снотворного - барбитурата. Лабораторные данные: РИА 1 мл - 72300 пмоль. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1-3. Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл- 51100 пмоль. Пример 16. Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали синтетическим иммуногеном дифтерийный человеческий гамма-глобулин-карфентанил (гаптен из группы производных замещенных пиперидинов) - полиоксидоний из расчета 50 мг/кг. Вводили летальную дозу наркотического вещества - морфина. Лабораторные данные: РИА 1 мл - 75400 пмоль. Другие характеристики аналогичны приведенным в примерах 1-3. Контрольные лабораторные данные: РИА 1 мл - 57200 пмоль. Прототип Шесть половозрелых беспородных крыс обоего пола иммунизировали иммуногеном - дифтерийный бычий сывороточный альбумин-героин из расчета 50 мг/кг. Вводили только внутривенно летальную дозу наркотического вещества - морфина. Лабораторные данные: РИА 1 мл - 70100 пмоль. Высокая аллергенность, обусловленная образованием иммуноглобулинов реагинного типа класса IgE. Гибель животных через 3 мес. в результате анафилактического шока во время повторной иммунизации. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Синтетический иммуноген для терапии и профилактики злоупотреблений наркотическими и психоактивными веществами, представляющий собой конъюгат, состоящий из носителя - природного или искусственного белка и гаптена - наркотического или психотропного соединения, отличающийся тем, что конъюгат модифицирован иммунокомпетентным полиэлектролитом - полиоксидонием при соотношении, вес.%: конъюгат:полиоксидоний=1:1,5-5,0, причем он содержит в качестве носителя яичный альбу-7 006248 мин, или человеческий гамма-глобулин, или микробные токсины; а в качестве гаптена - низкомолекулярные соединения из следующих групп: ароматические пропанамины, или изохинолины, или дифенилметаны, или индоламины или производные барбитуровой кислоты, или производные замещенных пиперидинов.