Концентрированный препарат антител

1 Настоящее изобретение относится к концентрированному препарату антитела, фармацевтическим составам, содержащим такой препарат, его применению в терапии человека и способам его получения. Большинство коммерчески доступных иммуноглобулинов, которые производят в высокой концентрации, получают из сыворотки человека и производят в промышленности продуктов крови. Первый препарат очищенного иммуноглобулина G человека (IgG) с клиническим применением представлял собой сывороточный иммуноглобулин, который был получен в 1940-е годы (Cohn, E.J. et al. Preparation and propertiesseparation of antibodies, isoagglutinins, prothrombin, plasminogen and -lipoproteins into subfractions of human plasma. J. Am. Chem. Soc. 71,541-550 (1949. Следующее поколение очищенных IgG разрабатывали в 1960-е годы и уделяли основное внимание препаратам, пригодным для внутривенного введения (Barandun, S. et al. Intravenous administration of human -globulin. Vox.Sang. 7, 157-174 (1962. Первый из них - внутривенный препарат IgG (Gamimune, CutterBiological) - приготавливали как 5% (50 мг/мл) раствор IgG в 0,2 М глицине, 10% мальтозе, рН 6,8. Этот раствор был стабилен в течение, по меньшей мере, 2,5 лет при 5 С. Ключевым критерием приемлемости внутривенных продуктовIgG (IVIG) являлось то, что IgG претерпел малую фрагментацию, и что в нем не находилось агрегатов с высокой молекулярной массой. В настоящее время терапевтические продукты иммуноглобулинов человека доступны как для внутримышечного (IMIG), так и для внутривенного (IVIG) введения. IMIG применяются в основном для профилактики гепатита А и иногда для лечения пациентов с агаммаглобулинемией. IVIG применяются для лечения первичных иммунодефицитов и идиопатической тромбоцитопенической пурпуры, также как и для вторичных иммунодефицитов, различных инфекций, гематологических и других аутоиммунных заболеваний. Как правило, IMIG продукты выпускают в виде 16% мас./об. растворов (160 мг/мл), a IVIG продукты - в виде 5% мас./об. растворов (50 мг/мл). Опыт производителей IVIG показал, что эти препараты являются нестабильными в относительно разбавленных растворах (10%(мас./об., и эта нестабильность проявляется в образовании нерастворимых частиц посредством процесса, известного как выпадение в осадок, когда материал хранят при комнатной температуре (Fernandes, P.M. and Lundband, J.L. 2 39, 101-112 (1980. Коммерчески доступный 16,5% -глобулин обычно стабилизирован в буфере глицин/физиологический раствор. Показано, что применение 5-10% мальтозы в качестве стабилизатора эффективно для защиты 5% IVIG от образования частиц (Fernandes et al., см. выше). Кроме выпадения в осадок, концентрированные (16,5%) растворы IVIG склонны агрегировать в процессе долговременного хранения. 10-30% раствора IVIG (мас./мас.) может состоять из агрегатов (Gronski, P. et al. On the naturepreparations: kinetic studies. Behring Inst. Mitt. 82,127-143 (1988. Большинство этих агрегатов представляют собой димеры, образованные комплексами идиотипических и антиидиотипических антител. Поскольку моноклональные антитела, полученные из супернатантов культуры ткани, не содержат антиидиотипических антител, данный тип димеров отсутствует. Однако образование димеров в данных препаратах может быть вызвано образованием комплексов между частично денатурированными мономерными молекулами антител. Механическое давление, такое как встречается во время тангенциальной ультрафильтрации, применяемой для концентрирования препаратов антител, может также приводить к усилению агрегации (Wang, Y. -C.J. andSci. Technol. 42, Suppl. S3-S26 (1988. Концентрированные (100 мг/мл) препараты иммуноглобулинов, таким образом, доступны, но до сих пор они представляют собой препараты поликлональных антител, производимых промышленностью обработки крови, и стабилизированы добавлением различных эксципиентов, таких как глицин и мальтоза. Таким образом, удивительно, что получены препараты моноклональных антител в концентрации 100 мг/мл при отсутствии эксципиентов и без сопутствующего увеличения агрегатов. В Derwent Abstract JP01268646A (AN89359879) сообщается, что в заявке описан инъекционный препарат моноклонального антителаIgG3 в концентрации от 0,1 мкг до 100 мг/мл. Объект, описанный в данных публикациях, не входит в объем настоящего изобретения. В настоящем изобретении, таким образом,предлагается препарат моноклонального антитела для введения человеку, отличающийся тем,что данное антитело в указанном препарате находится в концентрации 100 мг/мл или выше,предпочтительно выше, чем 100 мг/мл. В концентрации выше 350 мг/мл препарат может быть очень вязким, и скорости его выделения становятся неприемлемо низкими. Идеальная концентрация составляет от 100 до 300 мг/мл. 3 Препараты по изобретению являются в основном свободными от агрегата. Приемлемые уровни агрегированных примесей должны быть менее 5%, идеально менее 2%. Уровни, столь низкие, как 0,2%, являются достижимыми, хотя более обычным является примерно 1%. Препарат также предпочтительно является свободным от эксципиентов, традиционно применяемых для стабилизации поликлональных препаратов,например, глицина и/или мальтозы. В настоящем изобретении, таким образом,предлагается препарат моноклонального антитела для введения человеку, отличающийся тем,что антитело в указанном препарате находится в концентрации 100 мг/мл или выше, предпочтительно выше, чем 100 мг/мл, и препарат является в основном свободным от агрегата. Рекомбинантные антитела по самой своей природе продуцируются в синтетическом или не природном окружении клеточной культуры. Системы экспрессии, которые применяют для получения достаточных количеств белка для коммерциализации, стандартно основаны на хозяйских клетках миеломы или яичника китайского хомячка (СНО). Для культивирования таких клеток изобрели сложные синтетические среды, свободные от контаминации животным белком, что приводит к паттерну гликозилирования белка, осуществление которого в природе не должно было ожидаться. Таким образом, более удивительно,что сложный гликопротеин, который продуцируется в таких синтетических условиях, можно получить в концентрациях в несколько раз выше, чем должен образовываться в нормальной сыворотке человека со всеми ее буферными свойствами. В настоящем изобретении, таким образом,предлагается препарат моноклонального антитела для введения человеку, отличающийся тем,что антитело в указанном препарате представляет собой рекомбинантное антитело и находится в концентрации 100 мг/мл или выше, предпочтительно выше, чем 100 мг/мл. Препарат предпочтительно является в основном свободным от агрегата. В процессе производства очищенных антител как для терапевтического, так и диагностического применения важно, что антитело является достаточно стабильным при хранении,а различные химические вещества могут оказывать вредное влияние на стабильность антитела. Например, сейчас известно, что следовые количества меди (Сu) оказывают дестабилизирующее влияние на молекулы иммуноглобулина при хранении (WО 93/08837), и что это влияние можно элиминировать посредством приготовления препарата молекулы иммуноглобулина с подходящим хелатирующим агентом ионов меди, например, ЭДТА или цитратным ионом. Настоящее изобретение применимо к препарату иммуноглобулинов всех классов, то есть, 001860IgM, IgG, IgA, IgE и IgD, и оно также распространяется на препарат Fab фрагментов и биспецифичных антител. Изобретение предпочтительно применяют к препарату иммуноглобулинов класса IgG, который включает в себя подклассы IgG1, lgG2, IgG3 и lgG4. Более предпочтительно изобретение применяют к препарату иммуноглобулинов класса lgG4 и IgG1, наиболее предпочтительно IgG1. Изобретение находит конкретное применение в препарате рекомбинантных антител,более конкретно, химерных антител или гуманизированных (CDR-трансплантатных) антител. Конкретные примеры включают в себя химерные или гуманизированные антитела противCDw52 антигена. Дополнительные примеры включают в себя химерные или гуманизированные антитела против различных маркеров опухолевых клеток, например 40 кД (J. Cell. Biol. 125 (2) 437-446 (1994, или антигенов инфекционных агентов, таких как вирус гепатита В или цитомегаловирус человека. Конкретно предпочтительные примеры включают в себя химерные или гуманизированные антитела против CDw52,CD4 и CD23 антигенов. Иммуноглобулины, предназначенные для терапевтического применения, в общем случае следует вводить пациенту в форме фармацевтического состава. Такие составы предпочтительно содержат, кроме иммуноглобулина, физиологически приемлемый носитель или разбавитель,возможно в смеси с одним или более чем одним из других агентов, таких как другие иммуноглобулины или лекарственные средства, такие как антибиотики. Подходящие носители включают в себя, но не ограничиваются ими, физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор, глюкозу и забуференный физиологический раствор, забуференный цитратом физиологический раствор, буфер лимонная кислота/цитрат натрия, малеатный буфер, например буфер малеиновая кислота/гидроксид натрия, сукцинатный буфер, например буфер янтарная кислота/гидроксид натрия, ацетатный буфер, например буфер ацетат натрия/уксусная кислота, или фосфатный буфер,например буфер дигидроортофосфат калия/ гидроортофосфат динатрия. Состав возможно содержит Polysorbate для стабилизации антитела. Альтернативно иммуноглобулин можно лиофилизировать (высушить при замораживании) и восстановить для применения при необходимости добавлением воды и/или водного буферного раствора, как описано выше. Предпочтительный рН фармацевтических составов по изобретению должен зависеть от конкретного пути введения. Однако, чтобы максимизировать растворимость антитела в концентрированном растворе, рН раствора должен 5 быть отличным от рН изоэлектрической точки антитела. Таким образом, в следующем аспекте в изобретении предлагается препарат моноклонального антитела для введения человеку, отличающийся тем, что антитело в указанном препарате находится в концентрации 100 мг/мл или выше, и рН препарата отличается от рН изоэлектрической точки антитела. Пути введения в установившейся практике являются парентеральными, включая внутривенную, внутримышечную и внутрибрюшинную инъекцию или доставку. Однако препарат является особенно полезным в поколении подкожных составов, которые должны быть малыми по объему, например, примерно 1 мл в объеме на дозу. Чтобы гарантировать, что в таком составе можно достичь терапевтической дозировки, неизменно необходим концентрированный препарат. Предпочтительные концентрации для подкожных препаратов находятся, например, в пределах от 100 мг/мл до 200 мг/мл, например, от 150 мг/мл до 200 мг/мл. Подкожный препарат обладает тем преимуществом, что его можно вводить самостоятельно, избегая таким образом необходимости в госпитализации для внутривенного введения. Предпочтительно подкожные составы по изобретению являются изотоническими и должны быть доведены буфером до конкретного рН. Предпочтительный уровень рН для подкожного состава должен, как правило, находиться в пределах от рН 4 до рН 9. Предпочтительный рН и,следовательно, буфер будут зависеть от изоэлектрической точки интересующего антитела,как обсуждалось выше. Таким образом, в случае подкожных препаратов, содержащих анти-СD4 антитела, указанный рН предпочтительно должен находиться в пределах от 4 до 5,5, например от рН 5,0 до рН 5,5, например рН 5,5, а в случае анти-СD23 антител в пределах от рН 4 до рН 6,5. Следовательно, предпочтительными буферами для применения в подкожных составах,содержащих анти-СD4 антитела, являются малеатный, сукцинатный, ацетатный и более предпочтительно фосфатный буфер. Буферы предпочтительно используют в концентрации от 50 мМ до 100 мМ. Подкожные составы по изобретению могут также возможно содержать хлорид натрия для регуляции тоничности раствора. Таким образом, в дальнейшем аспекте в изобретении предлагается препарат моноклонального антитела для подкожного введения человеку, отличающийся тем, что антитело в указанном препарате находится в концентрации 100 мг/мл или выше, и рН препарата отличается от рН изоэлектрической точки антитела. В дальнейшем аспекте изобретения моноклональный препарат рассматривается для применения в терапии человека. Можно лечить различные расстройства у человека, такие как рак 6 или инфекционные заболевания, например упомянутые выше, и нарушение иммунитета, такое как расстройства, опосредованные Т-клетками,включающие в себя тяжелый васкулит, ревматоидный артрит, системную волчанку, а также аутоиммунные расстройства, такие как рассеянный склероз, болезнь "трансплантат против хозяина", псориаз, ювенильный диабет, болезнь Сьогрена (Sjogrens' disease), болезнь щитовидной железы, тяжелая псевдопаралитическая миастения, отторжение трансплантата, воспалительное кишечное заболевание и астма. В изобретении, следовательно, предлагается применение концентрированного препарата моноклонального антитела, как описано здесь, в производстве лекарственного средства для лечения любого из указанных выше расстройств. Предлагается также способ лечения человека,обладающего любым таким расстройством, при котором вводят указанному индивидууму терапевтически эффективное количество препарата по изобретению. Дозировки таких препаратов антител должны варьировать в зависимости от состояний, которые нужно лечить, и реципиента лечения, но должны находиться в пределах от 50 до примерно 2000 мг для взрослого пациента,предпочтительно 100-1000 мг, вводимых ежесуточно или еженедельно в течение периода от 1 до 30 суток и при необходимости повторяемых. Дозы можно вводить в виде однократных или множественных доз. Препарат антитела можно концентрировать различными способами, такими как ультрафильтрация с поперечным потоком (тангенциальная) или ультрафильтрация с перемешиванием, предпочтительно путем тангенциальной ультрафильтрации. Низкие скорости выделения и образование преципитата могут представлять собой проблему при концентрировании антитела. Настоящее изобретение решает данную конкретную проблему посредством способа концентрирования, в который вовлечено ослабление касательного напряжения при ультрафильтрации с поперечным потоком при высоких скоростях циркуляции (500 мл/мин). Снижение рециркуляции, например, до 250 мл/мин приводит к успешному концентрированию антитела до 150 мг/мл и к высокому выделению материала. В изобретении, таким образом, предлагается способ получения концентрированного препарата антитела, как описано здесь. Выделение антитела из концентрированного препарата предпочтительно составляет более 70%, но обычно более 90%. Концентрированные препараты антитела,полученные по вышеописанному способу, могут содержать дополнительные ингредиенты, такие как буферы, соли, Polysorbate и/или ЭДТА. Эти дополнительные агенты могут не требоваться в конечном фармацевтическом составе, и в этом 7 случае их можно удалить или заменить с использованием диафильтрации стандартными методами, известными специалистам. Например, концентрированные препараты антитела,содержащие цитратный буфер и ЭДТА, можно превратить в концентрированные препараты антитела, содержащие фосфатный или малеатный буфер, с использованием этого метода. В изобретении также предлагается новый концентрированный препарат антитела, который можно получить такими способами. Далее приводятся примеры, не ограничивающие изобретение. Пример 1. Концентрирование Campath 1 Н. Оснащение для ультрафильтрации Minitan(Minitan XX42 ASY MT Ultrafiltration System,Millipore) собирали с 2 полисульфоновыми фильтрующими пластинами 30K NMWCOAssembly, Operation, Maintenance Instructions,Millipore Corporation, P15076). Дезинфицирующий раствор удаляли посредством промывания 1-2 литрами забуференного фосфатом физиологического раствора (ФСБ), рН 7,2.Campath-1H (гуманизированное антитело против CDw52 антигена: Reichmann et al., Nature, 332. 323-327 (1988 (2200 мл при концентрации 16,4 мг/мл в 50 мМ цитрате натрия, рН 6,0) подвергали циркуляции через задерживающую сторону мембран при скорости потока 600 мл/мин при противодавлении 2-2,5 бар. Противодавление поддерживали при этом значении в течение всего эксперимента, и скорость потока растворенного вещества измеряли в различные интервалы времени. Образцы антитела отбирали из удерживающего сосуда в различные моменты времени и анализировали на концентрацию антитела, мутность, % агрегата и вязкость. В связи с тем, что скорость фильтрации в данном эксперименте являлась столь низкой,требовалось проводить концентрирование в течение 3 дней. Систему промывали ФСБ, и концентрат хранили в течение ночи при 4 С. После дня 2 перед хранением в течение ночи к концентрату добавляли Thiomersal 0,01% мас./об., чтобы предотвратить контаминацию микробами. По окончании концентрирования систему промывали 500 мл ФСБ, затем дальнейшую промывку 500 мл ФСБ проводили при рециркуляции вокруг задерживающей стороны мембран в течение 30 мин. Концентрацию антитела в этих промывках определяли посредством измерения оптической плотности при 280 нм. Общее время, затраченное на концентрирование Campath-1H от 16,4 мг/мл до 257 мг/мл с использованием 2 пластин в Minitan составило 17,25 ч. В таблице 1(а) показано изменение в концентрации Campath-1H в течение этого времени. Концентрация увеличивалась экспоненциально до пика 300 мг/мл через 17 ч. Конечная концентрация была немного ниже, чем эта пиковая величина; расхождение, вероятно, связано с трудностью получения репрезентативного образца из очень вязкой жидкости. В таблице 1(б) показано, что концентрирование Campath-1H сопровождалось соответствующим уменьшением скорости проходящего потока растворенного вещества. Таблица 1(б) Конц. 16 34 В данной таблице также показано, что наблюдалось резкое повышение вязкости остаточного концентрата при концентрации выше 189 мг/мл. В таблице 1(в) показано, что выделение было высоким до концентрации 190 мг/мл, но начинало заметно снижаться выше этой концентрации, поскольку повышение вязкости приводило к прилипанию материала к стеклу и трубам и потерям во время промывки перед хранением в течение ночи. Конц. (мг/мл) Выделение (%)(исключая материал, отобранный во время взятия образцов и потерянного при промывках) составляла 63,4%. Дополнительные 14,6% выделяли в первую промывку ФСБ системы и 0,5% во вторую рециркуляционную промывку ФСБ. Таким образом, всего 78,5% исходного материала выделили в конце эксперимента (исключая материал, отобранный во время взятия образцов и потерянный при промывках), с потерей оставшихся 21,5%, в основном, вследствие прилипания вязкого материала к стеклу и пластику. Вычисляли мутность раствора Campath-1H во время концентрирования. В качестве меры мутности использовали оптическую плотность 1,0 мл аликвот с подходящим разведением при 650 нм. В таблице 1(г) показано, что увеличения не наблюдалось. Таблица 1(г) Конц. 16 41 79 106 136 190 Образцы для определения агрегатов разбавляли до концентрации белка 1 мг/мл с использованием ФСБ и вводили аликвоты 50 мкл или 100 мкл в HPLC колонку для высокоразрешающей хроматографии по размеру молекулTSK-GEL G3000SWXL. Колонку разрабатывали 0,05% NaN3 и 0,1 М Na2SO4 в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,7 при скорости потока 1,0 мл/мин. Количество агрегата определяли посредством интегрирования пиков оптической плотности при 280 нм и обнаружили, что оно всегда остается около 1%. Пример 2. Концентрирование анти-СD4 антитела. Способ А. Оснащение для ультрафильтрации Minitan собирали и дезинфицировали как в примере 1,за исключением того, что вместо 2 использовали 8 полисульфоновых фильтрующих пластин 30 К NMWCO, а все оснащение помещали под стерильный колпак. Антитело анти-СD4 (2142 мл при концентрации 13,9 мг/мл в 50 мМ цитрате натрия, рН 6,0) подвергали циркуляции через задерживающую сторону мембран при скорости потока 190 мл/мин при противодавлении 2-2,5 бар. Противодавление поддерживали при этом значении в течение всего эксперимента, и скорость проходящего потока растворенного вещества измеряли в различные интервалы времени. Образцы антитела отбирали из удерживающего сосуда в различные моменты времени и анализировали на концентрацию антитела, связывание CD4, мутность, % агрегата и вязкость. По окончании эксперимента ретентат выкачивали из оснащения Minitan, и задерживающую сторону мембран промывали 500 мл 50 мМ цитрата натрия, 0,05 мМ ЭДТА, рН 6,0, и собирали фракции промывки по 50 мл. В конце систему промывали посредством рециркуляции 500 мл 50 мМ цитрата натрия, 0,05 мМ ЭДТА, рН 6,0 вокруг удерживающей стороны мембраны в течение 30 мин. Концентрацию антитела в промывочных фракциях определяли посредством измерения их оптической плотности при 280 нм. Результаты приведены в таблицах 2(а)-(г). Увеличение числа пластин, использованных для концентрирования, привело к уменьшению времени, затраченного для достижения концентрации 250 мкг/мл-250 мг/мл до 6 ч по сравнению с 17,25 ч для концентрирования Campath-1H(смотри таблицу 2(а. В таблице 2(а) также показано, что вязкость антитела анти-СD4 измеримо не повышалась, пока не была достигнута концентрация 113 мг/мл. Выше данной концентрации вязкость значительно увеличивалась. Время (ч) Конц. (мг/мл) Вязкость cPs При концентрациях выше 83 мг/мл наблюдалась заметная опалесценция в концентрированном материале, вызванная тем, что, когда 10 концентрация увеличивалась выше данного значения, образовывался осадок. Это привело к снижению скоростей проходящего потока растворенного вещества, показанных в таблице 2(б), а также к повышению мутности, показанному в таблице 2(в). Уровень агрегата оставался очень низким при всех концентрациях и все время составлял менее чем 0,2% (смотри таблицу 2(в. В таблице 2(б) показано, что показатели выделения являлись высокими, пока не увеличивалась вязкость и не появлялся осадок, тогда они значительно снижались до конечного выделения из ретентата 50% после извлечения из оснащения. Конц. (мг/мл) Выделение (%) Поток (мл/мин) Это низкое выделение было связано с высокой вязкостью концентрированного антитела анти-СD4, делающей его липким к трубам и мембранам системы для ультрафильтрации. Все антитело анти-СD4, потерянное таким образом,можно последовательно выделять посредством промывки системы буфером. В таблице 2(г) показано выделение антитела анти-СD4 в последовательных промывочных фракциях по 50 мл во время промывки оснащения Minitan в конце эксперимента. Первая фракция содержит 11,7 г антитела анти-СD4 в концентрации 235 мг/мл,следовательно, ее можно объединить с 12,6 г концентрата, исходно выделенного из оборудования, при 252 мг/мл, без значительного разбавления суммарной концентрации. Оставшиеся промывочные фракции содержали всего 5,1 г антитела анти-СD4, но оно находилось в концентрации менее чем 57 мг/мл, следовательно,его нельзя было объединить с концентрированным материалом. Общее выделение из концентрата и первой промывочной фракции составляла 90%. Было отмечено, что хранение конечного концентрированного антитела анти-CD4 в течение ночи при 4 С приводило к тому, что часть преципитата вновь растворялась. Таблица 2(г) мл 50 100 150 мг 11727 2828 866 Таким образом, эксперимент поставили,чтобы определить концентрацию, при которой преципитированное антитело анти-СD4 полностью растворяется повторно. Аликвоту 10 мл антитела анти-СD4 в концентрации 250 мг/мл постепенно разбавляли посредством добавления 50 мМ цитрата натрия, 0,05 мМ ЭДТА, рН 6,0. Оптическая плотность 1 мл аликвот образцов антитела с подходящим разведением при 650 нм Преципитат вновь растворялся, но мутность и опалесценция полностью не исчезали,пока не достигалась концентрация антитела анти-СD4 примерно 80 мг/мл. Именно выше этой концентрации впервые наблюдали опалесценцию, поэтому преципитат, по-видимому, является обратимым и зависимым от концентрации. Пример 3. Концентрирование антитела анти-СD4. Способ Б. Доведение буфером антитела анти-СD4 Антитело анти-СD4 (1460 мл; 24 г) готовили в 50 мМ цитрате натрия, 0,05 мМ ЭДТА, рН 6,0. Этот буфер доводили до 100 мМ цитрата натрия, 0,05 мМ ЭДТА, рН 6,0 посредством добавления твердой лимонной кислоты к препарату антитела и доведения рН до 6,0 с использованием NaOH. Полученный препарат стерильно фильтровали через 0,22 мкм фильтр и хранили в 2 аликвотах по 12 г. Концентрированние антитела анти-СD4 в FiltronUse Manual., Filtron Technology Corporation). Дезинфицирующий раствор удаляли посредством промывки стерильной водой, а затем 1-2 л стерильного ФСБ, рН 7,2, пока рН вытекающего потока не становился 7,2. Анти-СD4 подвергали циркуляции через задерживающую сторону мембран при скорости потока 250 мл/мин все время. После концентрирования антитела антиСD4 до 150 мг/мл ретентат выкачивали изMini-Ultrasette, и задерживающую сторону мембран промывали 3 х 20 мл 50 мМ цитрата натрия,0,05 мМ ЭДТА, рН 6,0, и каждую фракцию по 20 мл промывки собирали. Концентрацию антитела в промывочных фракциях определяли посредством измерения их оптической плотности при 280 нм, как описано в примере 1. Результаты позволили предположить, что снижение скорости проходящего потока растворенного вещества может обеспечить способ для концентрирования анти-СD4 до 150 мг/мл посредством ультрафильтрации с поперечным потоком, избегающей какой-либо преципитации. Это проверили с использованием Filtron MiniUltrasette и скорости удерживающей циркуляции растворенного вещества 250 мл/мин. 12 Подходящий изотонический буфер для данной работы представлял собой 100 мМ цитрат натрия, 0,05 мМ ЭДТА, рН 6,0. Таким образом, из оставшихся 1460 мл анти-СD4 в 50 мМ цитрате натрия, 0,05 мМ ЭДТА, рН 6,0 заново приготовили препарат посредством добавления 16,8 г лимонной кислоты, и рН итогового раствора довели с использованием NaOH. Этот материал стерильно профильтровали и разделили на 2 равные аликвоты, которые затем отдельно концентрировали на приборе для ультрафильтрации Filtron с использованием скорости рециркуляции 250 мл/мин. Результаты приведены в таблице 4. Таблица 4. Концентрирование анти-СD4 до концентрации более 100 мг/мл в ячейке для ультрафильтрации с поперечным потоком при скорости рециркуляции 250 мл/мин до концен- концентри- концентриПараметр трирования рование 1 рование 2 Достигнутый максимум 169 156 концентрации (мг/мл) Концентрация конечного 14,4 106,4 100,5 продукта (мг/мл) Выделение после кон 90 95 центрирования (%) Время, затраченное для 11 9 концентрирования (ч) Агрегат (%) 4,14 3,95 3,97 Мутность (А 650 нм) 0,003 0,018 0,037 Осмотическое давление 281 288 306(мОс/кг) Связывание CD4 (мг/мл) 20 98,8 68,3 Агрегатный анализ посредством HPLC по размеру молекул. Образцы для определения агрегата разбавляли до концентрации белка 1 мг/мл с использованием ФСБ, и аликвоты 50 мкл или 100 мкл вводили в HPLC колонку для хроматографии по размеру молекул TSK-GEL G3000SWXL. Колонку разрабатывали 0,05% NаN3 и 0,1 М Na2SO4 в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,7 при скорости потока 1,0 мл/мин. Количество агрегата определяли посредством интегрирования пиков оптической плотности при 280 нм. При обоих концентрированиях достигали максимума концентрации 150 мг/мл в аппарате для ультрафильтрации без вредного влияния на растворимость антитела. Концентрирования занимали 9-11 ч. Конечные концентрации 100 мг/мл являлись результатом разбавления с использованием промывок, требующихся для максимизации выделения из аппарата для ультрафильтрации. Общее выделение составляло 9095%, и не наблюдали видимого преципитата или увеличения уровней агрегата. Небольшое повышение мутности после концентрирования,измеренной по оптической плотности при 650 нм, вызывало легкую непрозрачность конечного концентрата, но ее удаляли при приготовлении препарата с использованием Polysorbate 80 и стерильного фильтрования и не считали значительной. СD4-связывающая активность для концентрирования 1 составляла почти 100 мг/мл, как 13 ожидали, но для концентрирования 2 получили намного меньшее значение. Конечное осмотическое давление объединенного материала из концентрирований 1 и 2 составляло приблизительно 297 мОс/кг, и объединенный материал представлял собой чистый, светлый раствор,который мог легко проходить через стерильный фильтр 0,2 мкм. Концентрирование антитела CD4 в ячейке с перемешиванием Аликвоту антитела анти-СD4 330 мл (такого, как описано выше) концентрировали при 5 С в ячейке для ультрафильтрации с перемешиванием Amicon (оборудованной мембраной YM30Amicon) до конечной концентрации 170 мг/мл посредством приложения давления 1,5 бар с использованием газообразного азота. Образцы антитела анти-СD4 отбирали в интервалах и определяли концентрацию посредством измерения оптической плотности при 280 нм и мутность посредством измерения поглощения при 650 нм. По окончании эксперимента концентрированный материал извлекали из ячейки для ультрафильтрации и стерильно фильтровали через фильтр 0,22 мкм. Чтобы преодолеть большие поперечные силы, генерируемые на аппарате для ультрафильтрации с поперечным потоком Filtron, концентрирование осуществляли в ячейке для ультрафильтрации с перемешиванием с использованием 50 мМ цитрата натрия, 0,05 М ЭДТА, рН 6,0 в качестве буфера. В таблице 5 приведены результаты этого эксперимента. Таблица 5. Концентрирование посредством ультрафильтрации анти-СD4 в ячейке с перемешиванием Amicon Объем Приблизительная Скорость потока Время конценконцентрация в ультрафильтрации(мл/ч) 0 330 16,7 6 150 37 30 9 100 55 17 11 75 73 12 14 46 120 10 38 40 134 0,25 54 27 171 0,81 Действительную концентрацию определяли посредством измерения оптической плотности при 280 нм. В целом концентрирование занимало примерно 2,5 дня, и скорости потока быстро снижались по мере того как увеличивалась вязкость концентрированного антитела. Конечной концентрации 171 мг/мл успешно достигали без видимого преципитата. Данный материал извлекали из ячейки для ультрафильтрации, и мембрану промывали достаточным количеством 50 мМ цитрата натрия, 0,05 мМ ЭДТА, рН 6,0 с получением конечной концентрации 100 мг/мл при объединении концентрата. Материал легко проходил через стерильный фильтр 0,2 мкм. Измеренная действительная концентрация этого объединенного материала составляла 94,3 мг/мл в объеме 46 мл. Это 14 соответствовало выделению 79% на стадии ультрафильтрации. Таким образом, данный эксперимент свидетельствует о том, что 50 мМ цитрат натрия,0,05 мМ ЭДТА, рН 6,0 представлял собой подходящий буфер для концентрирования антиСD4, по меньшей мере, до 171 мг/мл, и, вероятно, именно большие поперечные силы являлись причиной преципитации в первоначальных экспериментах по ультрафильтрации с поперечным потоком как в Minitan , так и в Filtron MiniUltrasette, описанных выше. Пример 4. Подкожные составы для антител анти-СD4 и анти-СD23. а)Антитело анти-СD4 или анти-СD23 Дигидроортофосфат калия, КН 2 РO4Polysorbate 80 (% от общей массы состава) Вода б)Антитело анти-СD4 или анти-СD23Na ацетат Ледяная уксусная кислота, 10% растворPolysorbate 80 (% от общей массы состава) Вода в) Антитело анти-СD4 или анти-СD23 Малеиновая кислота 0,5 М NaOHPolysorbate 80 (% от общей массы состава) Вода г) Антитело анти-СD4 или анти-СD23 Янтарная кислота 0,5 М NaOHPolysorbate 80 (% от общей массы состава) ВодаNB Каждый из составов а), б), в) или г) возможно может содержать 0,05 мМ ЭДТА. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Препарат моноклонального антитела для введения человеку, имеющий концентрацию 100 мг/мл или выше, который получен способом, включающим осуществление следующих стадий: а) получение раствора антитела; б) ультрафильтрацию раствора антитела со стадии (а); в) рециркуляцию фильтрата со стадии (б) со скоростью рециркуляции менее чем 500 мл/мин. 2. Препарат моноклонального антитела по п.1, отличающийся тем, что раствор на стадии(а) имеет концентрацию менее чем 100 мг/мл. 3. Препарат по п.1, отличающийся тем, что указанный препарат является в основном свободным от агрегатов. 4. Препарат по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что антитело находится в концентрации от 150 мг/мл до 350 мг/мл. 5. Препарат по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что антитело представляет собой изотип IgG. 6. Препарат по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что антитело представляет собой рекомбинантное антитело. 7. Препарат по п.6, отличающийся тем, что антитело представляет собой измененное антитело. 8. Препарат по п.7, отличающийся тем, что антитело представляет собой химерное или 16 9. Препарат по п.7, отличающийся тем, что антитело связывается с Т-клеточным или раковым антигеном. 10. Препарат антитела по любому из пп.19, отличающийся тем, что его рН отличается от рН изоэлектрической точки антитела. 11. Фармацевтический состав, содержащий препарат по любому из пп.1-10. 12. Применение препарата по любому из пп.1-10 в производстве лекарственного средства для лечения расстройств, опосредованных Тклетками.