Применение глицинбетаина в качестве антитромботического средства

1 Настоящее изобретение относится к применению глицинбетаина для устранения физиопатологических сосудистых приступов. Изобретение также относится к применению глицинбетаина в качестве лечебного и профилактического средства при патогенезе тромбоэмболических и гемостатических болезней артериального или венозного происхождения. Глицинбетаин обладает профилактической активностью, предупреждая образование тромбов, и лечебной активностью, предупреждая пролиферацию тромбов путем их разрушения. Важность настоящего изобретения состоит в том, что применение глицинбетаина не связано с каким-либо риском возникновения кровотечения или развитием аллергии, в отличие от применяемых в настоящее время соединений и методов лечения. Предпосылки создания изобретения Тромбозы сосудов представляют собой реакцию организма, который подвергается атаке на стенку сосуда и на содержащиеся в нем клетки и плазму. Тромбоз представляет собой локальную активацию коагулирования с образованием тромба. Исследования этой патологии, проведенные в последние годы, позволили выявить ряд факторов, обусловливающих эту патологию, а именно:- сосуд, стенка сосуда и эндотелиальные клетки,- роль элементов, присутствующих в крови,- системы коагулирования и фибринолиза и их ингибиторы. Известны несколько типов тромбозов, которые могут иметь место в артериях, в венах, в системе микроциркуляции органов, в полостях сердца и на искусственных поверхностях, находящихся в контакте с кровью. Тромбозы сосудов представляют собой реакцию на атаку на стенку сосуда и на содержащиеся в нем клетки и плазму. Тромб представляет собой упорядоченную массу, состоящую из компонентов крови(тромбоцитов, эритроцитов и лейкоцитов), фибрина и других протеинов плазмы, которые накапливаются на поверхности или которые блокируют свободное прохождение через систему сосудов. Механизмы тромбоза напоминают механизмы гемостаза, однако они являются патологическими вследствие их аномальной локализации внутри сосудов. Тромбозы и эмболии являются основными причинами клинических осложнений, связанных с сердечно-сосудистыми болезнями и атеросклерозом. Согласно Вирхову по крайней мере три типа тромбогенных факторов определяют локализацию, степень и регресс тромбоза:- активация компонентов крови, прежде всего тромбоцитов, и коагулирование, приводящие к образованию тромбина. Тромбоэмболическая болезнь артериального или венозного происхождения остается одной из главных причин смерти в развитых странах. Артериальный тромбоз часто происходит в результате разрыва атеросклеротической бляшки, тогда как венозный тромбоз вызывается дефицитом ингибитора коагулирования (AT III) или дефицитом активатора фибринолиза (протеина S и/или протеина С), или более часто стазом. В действительности они оба обусловлены взаимодействием между кровью и стенкой сосуда, образованием венозного тромба и/или гемостатической аномалией. Артериальный тромбоз наиболее часто является вторичным по отношению к париетальной аномалии и в нем в основном участвуют тромбоциты. Он приводит к большому разнообразию клинических картин в зависимости от слоев стенки артерии, участвующих в нарушении васкуляризации. Тромбоз в основном способен поражать сердечные артерии (коронарные) и артерии органов нижних отделов тела, органов головного мозга или пищеварительных органов. Так, сама артериальная болезнь способствует образованию тромба, что обусловливает большинство закупорок концевых сосудов. Кроме того, очевидно, что гемостатические нарушения и образовавшийся тромб вносят вклад в другие повреждения сосудов, такие как усиление повреждений стенки сосуда, ишемия и ухудшение циркуляции крови в микрососудах. Существуют три стратегии предупреждения нарушений, связанных с тромбозом. Использование антикоагулянтов. Антикоагулянты представляют собой основной элемент при лечении пациента, страдающего тромбоэмболическим нарушением. В настоящее время для этой цели применяются гепарин и его производные. Однако применение гепаринов может приводить к двум основным осложнениям, а именно к кровотечению или тромбопении. Использование антивитаминов К (KAV). Эти лекарственные средства показаны для продолжительного лечения, они не могут использоваться в экстренных случаях и не могут применяться одновременно с другими антиагрегантами, поскольку они усиливают их геморрагическое действие. Использование антиагрегантов тромбоцитов. Показаны для предупреждения артериального тромбоза, обусловленного атеросклерозом. Основными ингибиторами функции тромбоцитов, которые применяются в настоящее время,являются: аспирин, тиклопидин, дипиридамол и некоторые нестероидные противовоспалитель 3 ные агенты, такие как флурбипрофен и простациклин. Лечение с применением этих средств является достаточно эффективным, но оно сопровождается побочными действиями на пациентов, страдающих аллергиями или кровотечением. Несмотря на свою эффективность все эти виды лечения требуют соблюдения мер предосторожности при их назначении, такие как введение антидотов, проблемы, связанные с передозировкой и нежелательные побочные действия. Эти виды лечения требуют обязательного наблюдения за пациентами, прежде всего,вследствие проблем, связанных с кровотечением, которое может возникнуть в процессе или после лечения, а также вследствие возможной несовместимости с другими лекарственными средствами. Таким образом, существует потребность в выявлении соединения, обладающего высоким антитромботическим потенциалом,которое не оказывает нежелательных побочных действий. При создании изобретения совершенно неожиданно было установлено, что глицинбетаин обладает высоким терапевтическим потенциалом при лечении тромбозов. Глицинбетаин или бетаин формулы(CH3)3NCH2COO- представляет собой молекулу, обладающую осмозащитными свойствами, и которая применяется в области косметики и фармацевтики. Известны различные фармацевтические применения бетаина, прежде всего, применение бетаина для лечения гомоцистинурии, приводящей к сердечно-сосудистым осложнениям (L. и В. Wilken, J. Inher. Methab.Dis., 1997). Так, пациенты, имеющие гомоцистинурию, обусловленной генетической аномалией, страдают от ранних атеросклеротических и тромбоэмболических болезней (S.H. Mudd и др., The methabolism and molecular bases of inherited disease, 1995) и сердечно-сосудистых болезней (McCully, Atherosclerosis Rev., 11,1983). Гомоцистинурия представляет собой наследственную недостаточность, гомозиготная форма которой является редкой. Оценки свидетельствуют о том, что эта гомозиготная форма встречается у 1 из 200 в общей популяции пациентов. Гомоцистинурия обусловлена повышенными уровнями гомоцистеина в плазме страдающего болезнью пациента. Введение бетаина позволяет понизить концентрацию гомоцистеина в крови. В опубликованной заявке WO 95/15750 описано применение ингредиентов, включающих бетаин, для предупреждения сосудистых болезней у пациентов, страдающих гомоцистинурией. Опубликованная заявка WO 98/19690 также касается пациентов, страдающих от повышенных уровня гомоцистеина в крови. Использование бетаина среди прочих ингредиентов направлено на снижение уровня гомоцистеина в 4 крови; было установлено, что гомоцистеин является позитивным фактором риска возникновения сердечно-сосудистых болезней, а также болезни Альцгеймера. В опубликованной заявке ЕР 0347864 описано применение бетаина в сочетании с другими ингредиентами для борьбы с увеличением количества сульфгидрильных групп, которые в составе цистеина и гомоцистеина присутствуют в плазме человека, и тем самым для ингибирования образования атеросклеротических бляшек. Такое антиатеросклеротическое действие является известным и описано во многих публикациях. Эти публикации касаются влияния бетаина на метаболизм липидов (Zapadnyuk и др., Biol. Med., 1987) и холестерина (Panteleimonova и др., Farmakol. Toksikol., Москва,1983). В заявке WO 97/38685 описано применение бетаина и таурина для лечения осложнений,связанных с ишемией в некоторых органах. Ишемия представляет собой локальную закупорку кровеносной системы и является только одним из проявлений патологий, обусловленных тромбозом. В заявке ЕР 0781554 приведены примеры,в которых описаны эксперименты на энуклеированных сердцах, т.е. на сердцах, которые были отделены и выделены из сосудистой системы. Применение бетаина, основанное на его известных осмозащитных свойствах и свойствах, позволяющих осуществлять защиту от свободных радикалов, дало возможность авторам заявить о его защитном действии в отношении сердечной мышцы. Были предложены и другие формы бетаина(WO 97/06785), однако потенциальные возможности и эффективность глицинбетаина до настоящего времени не были оценены. Ни в одной из указанных публикаций не описаны ни потенциальные возможности глицинбетаина в отношении лечения венозного и/или артериального тромбоза, ни его антиагрегантная и антикоагулирующая эффективность. Краткое описание сущности изобретения В контексте настоящего изобретения глицинбетаин, а также производные бетаина общей формулы (CH3)3N+-(CH2)n-COO-, могут применяться при различных клинических показаниях,таких как:- тромбозы и повторная закупорка сосудистой системы вследствие тромбоза или пластической операции на сосудах;- наличие гемофилии, применение химиотерапии, старение, использование пероральной контрацепции с применением эстрогенов, ожирение, привычка к табаку, протезирование, диабет;- предупреждение рисков, связанных с введением контрастных ионных и неионных продуктов. Оборудование и метод исследования А. Принцип создания модели тромбоза,индуцированного лазером (D. Seiffge и др.,1989; W. Weichter и др., 1983) В этой модели повреждение стенки сосуда индуцируют лазерным лучом. Этот луч вызывает локальное повреждение эндотелия сосуда(разрушаются только 1-2 клетки). В результате этого обнажается субэндотелий, который представляет собой тромбогенную поверхность, что приводит к прилипанию тромбоцитов с помощью гликопротеина II. После прилипания тромбоцитов происходит их активация. Они образуют псевдоподы и секретируют содержимое их гранул. Эта активация приводит к образованию гликопротеинов IIb-IIIa, которые необходимы для агрегации тромбоцитов. Такое повреждение создают в мезентеральной системе микрососудов крысы. Оно сразу же приводит к образованию тромба (через несколько секунд). Этот тромб, который быстро увеличивается под действием потока крови, уходит в кровоток, после чего образуется новый тромб. С использованием этой модели проводили оценку фармакологического действия глицинбетаина совместно с исследованием двух действующих веществ, которые использовались для сравнения, а именно, ацетилсалициловой кислоты и гепарина (с низкой молекулярной массой). Также проводили оценку активности глицинбетаина в отношении протромботического действия, вызываемого контрастными продуктами. Б. Тромбоз, индуцированный стазом. Осуществляли лапаротомию, обнажая нижнюю полую вену, на которую в момент времени T0 накладывали лигатуру, после чего в момент времени Т 0+2 ч вводили глицинбетаин путем подкожной инъекции, а затем в момент времени T0 + 6 ч удаляли сгусток. В. Методика эксперимента. Для указанных тестов использовали самцов крыс линии Wistar. Они имели вес тела 200250 г. После 8-дневного периода стабилизации крыс заставляли голодать в течение 12 ч. Затем их анестезировали, вводили подкожно глицинбетаин и после окончания эксперимента вскрывали мезентерий (в опытах с использованием лазера) или полую вену (в опытах с использованием стаза). Пример 1. Оценка количества эмболов и продолжительность эмболизации после нару 004047 6 шения сосуда в результате ожогов, вызванных лучом лазера. Количество эмболов Отрицательный контроль NaCl 0,9% Глицинбетаин 5 мг/кг Ацетилсалициловая кислота 100 мг/кг Гепарин 2 мг/кг Глицинбетаин существенно уменьшал количество эмболов и продолжительность эмболизации после нарушения сосуда в результате ожогов, вызванных лучом лазера. Эти результаты свидетельствуют о его выраженной антитромботической активности. Пример 2. Оценка продолжительности вызванного кровотечения (Е. Dejana, Bleeding time Полученные результаты свидетельствуют о том, что при введении глицинбетаина продолжительность кровотечения не превышала значений, полученных для отрицательного контроля. В дополнение к своей антитромботической активности глицинбетаин отличается тем, что он не вызывает риска кровотечения по сравнению с положительными контролями. Пример 3. Оценка агрегации тромбоцитов после повреждения сосуда в результате ожогов,вызванных лучом лазера (Cardinal и Flower,Pharmacol. Method., 1980) Амплитуда Эти результаты демонстрируют антиагрегационное действие глицинбетаина. Пример 4. Оценка действия на кровяные клетки а) Количество тромбоцитов Отрицательный контроль NaCl 0,9% Глицинбетаин 5 мг/кг Ацетилсалициловая кислота 100 мг/кг Гепарин 2 мг/кг б) Количество лейкоцитов Отрицательный контроль NaCl 0,9% Глицинбетаин 5 мг/кг Ацетилсалициловая кислота 100 мг/кг Гепарин 2 мг/кг в) Количество эритроцитов Отрицательный контроль NaCl 0,9% Количества элементов, присутствующих в крови, сохраняются в пределах значений, определенных для отрицательного контроля, что свидетельствует о безвредности глицинбетаина. Пример 5. Биологический баланс. а) Время Квика (ВК, протромбиновое время) Отрицательный контроль NaCl 0,9% Глицинбетаин 5 мг/кг Ацетилсалициловая кислота 100 мг/кг Гепарин 2 мг/кг в) Анализ фибриногена Отрицательный контроль NaCl 0,9% Глицинбетаин 5 мг/кг Ацетилсалициловая кислота 100 мг/кг Гепарин 2 мг/кг Пример 6. Оценка активности глицинбетаина в зависимости от времени. Экспериментальные группы: Продукт тестировали в дозе 5 мг/кг Тромбоз, индуцированный лучом лазера Контроль NaCl 0,9% Группа I Продукт инъецировали за 1 ч до эксперимента Группа II Продукт инъецировали за 2 ч до эксперимента Группа III Продукт инъецировали за 3 ч до эксперимента Группа IV Продукт инъецировали за 4 ч до эксперимента а) Влияние тестируемого продукта (5 мг/мл/кг) на продолжительность вызванного кровотечения (В.Т.С.) Группа 8 б) Влияние тестируемого продукта (5 мг/мл/кг) на артериальный тромбоз, индуцируемый лазерным лучом Количест- Количество ожогов во эмболов в) Влияние тестируемого продукта (5 мг/мл/кг) на агрегацию тромбоцитов, индуцируемую ex vivo Группа в) Влияние глицинбетаина на факторы коагулирования после периодического введения в течение 5 дней Пример 7. Оценка влияния глицинбетаина на венозный тромбоз, индуцированный стазом. а) Влияние глицинбетаина на массу сгустка Масса сгустка (мг) 4,0332 3,10,4 1,630,76 0,760,4 Необработанный контроль Глицинбетаин (1 мг/кг) Глицинбетаин (2,5 мг/кг) Глицинбетаин (5 мг/кг) б) Оценка влияния глицинбетаина на плазминогенез Плазминогенез (%) 2,70,33 1,660,58 20,15 2,440,58 Необработанный контроль Глицинбетаин (5 мг/кг) Глицинбетаин (2,5 мг/кг) Глицинбетаин (1 мг/кг) в) Оценка влияния глицинбетаина на коагулированиеACT (с) Необработанный контроль Глицинбетаин (1 мг/кг) Глицинбетаин (2,5 мг/кг) Глицинбетаин (5 мг/кг) г) Оценка влияния глицинбетаина на факторы коагулирования Глицинбетаин (5 мг/кг) Глицинбетаин (2,5 мг/кг) Глицинбетаин (1 мг/кг) 9 Обработка глицинбетаином ингибирует тромбоэмболические осложнения, которые инициируются ожогами, вызванными лазером. Так,обработка глицинбетаином перед вызыванием ожогов с помощью лазера уменьшает прилипание тромбоцитов к сосудам и их агрегацию. Обработка глицинбетаином ингибирует тромбоэмболические осложнения. Так, обработка глицинбетаином перед индуцированием тромбоза вызывает сильное антитромботическое действие в отношении всех параметров,которые участвуют в процессе образования тромба. Кроме того, результаты исследования биологических параметров свидетельствуют о полной безвредности глицинбетаина, который в отличие от изученных продуктов, с которыми производилось сравнение (аспирин и гепарин) не вызывает кровотечения или нежелательного побочного действия. Эти данные означают, что глицинбетаин помимо того, что он обладает указанной эффективностью, характеризуется еще и тем, что он может вводиться людям, подверженным риску возникновения кровотечения,а также людям, подверженным риску возникновения чувствительности или аллергической реакции при использовании для их лечения обычных антитромботических средств (пациенты,страдающие гемофилией, аллергией). Глицинбетаин не вызывает тромбопению или геморрагических нарушений (примеры 2 и 4). Экспериментальные результаты, приведенные в примере 5 в, свидетельствуют о том, что при этом имеет место поглощение фибриногена. Следует отметить, что в одних и тех же экспериментальных условиях в опытах по консервации крови в пробирках установлено, что глицинбетаин обладает высокой антикоагулирующей способностью по сравнению с гепарином или ЭДТК. Эффективная доза глицинбетаина составляет 3-5 мг на пробирку для гемолиза. Этот экспериментальный результат демонстрирует высокий потенциал глицинбетаина в качестве антикоагулянта. Таким образом, можно утверждать, что глицинбетаин может применяться в качестве антикоагулянта как при лечении организма человека in vivo, так и для консервации крови ex vivo. Оценка активности глицинбетаина по сравнению с активностью контрастных продуктов В контексте исследований антитромботических действий и для дополнения полученных ранее заявителями результатов, касающихся эффективности глицинбетаина, при создании изобретения была проведена оценка действия глицинбетаина на увеличение риска возникновения тромбоэмболии, связанного с применением контрастных продуктов, которые, как известно, обладают протромботическими свойствами. Важность этой модели заключается в том,что она позволяет проводить непосредственное наблюдение за образованием тромба в месте 10 повреждения сосуда. Эти результаты объясняют возникновение тромботических закупорок при пластической операции на сосудах, прежде всего у пациентов, уже имеющих повреждение или нарушение эндотелия. Пластическая операция на коронарных сосудах приводит к удалению эндотелия, обнажению коллагена, эластина и клеток гладкой мускулатуры системы кровообращения аналогично тому, как это происходит в используемой модели экспериментального тромбоза. Таким образом, у пациентов, у которые недавно возник коронарный тромбоз или у которых имеется эксцентрическая коронарная бляшка, имеется более высокая вероятность образования новых тромбов. Введение контрастных продуктов уменьшает количество лейкоцитов, количества эритроцитов и количество тромбоцитов. Контрастные продукты взаимодействуют с лейкоцитами,индуцируют высвобождение лейкотриенов, увеличивают проницаемость сосудов и оказывают хемотаксическое действие. Кроме того, контрастные продукты контролируют экспрессию Р-селектина и вызывают прилипание лейкоцитов к эндотелию сосудов. Было установлено, что применение контрастных продуктов сопровождается образованием различного количества тромбов, которое зависит от применяемого продукта. Были изучены два контрастных продукта:Hexabrix (ионный) и Iopamidol (неионный). Пример 8. Оценка количества эмболов и продолжительности эмболизации после изменений сосуда, после ожогов, вызванных лазером и введением контрастных продуктов. Продолж. Количестэмболизаво эмболов ции (мин) Отрицательный контроль NaCl 0,9% Пример 9. Оценка времени индуцированного кровотечения (ВИК). Отрицательный контроль NaCl 0,9% Пример 10. Оценка агрегации тромбоцитов после повреждения сосуда, вызванного ожогами лучом лазера. Амплиту- Скорость да (омы) (омы/мин) Отрицательный контроль NaCl0,9% 13,11 91 Пример 11. Оценка действия глицинбетаина на кровяные клетки. а) Количество тромбоцитов б) Количество лейкоцитов Отрицательный контроль NaCl 0,9% в) Количество эритроцитов Отрицательный контроль NaCl 0,9% Пример 12. Биологический баланс. а) Время Квика Отрицательный контроль NaCl 0,9% в) Анализ фибриногена Отрицательный контроль NaCI 0,9% Обработка глицинбетаином ингибирует тромбоэмболические осложнения, связанные с применением контрастных продуктов. Так, обработка глицинбетаином до или во время инъекции контрастных продуктов уменьшает прилипание тромбоцитов и их агрегацию на уровне сосудов. Эти результаты демонстрируют антитромботическое и тромболитическое действия глицинбетаина. Следует отметить, что контрастные продукты могут оказывать другие побочные действия, такие как гемостаз в катетерах и эндотелиальные повреждения, вызванные самой процедурой введения лекарственного средства. Глицинбетаин позволяет устранить эти нежелательные действия. Заключение Глицинбетаин обладает такими же или даже лучшими терапевтическими свойствами, что и исследованные антикоагулянты и антиагреганты (ацетилсалициловая кислота и гепарин),при этом он не оказывает нежелательных действий. Очень высокая терапевтическая эффективность глицинбетаина по сравнению с указанными двумя соединениями (ацетилсалициловой кислотой и гепарином) является предпосылкой для изготовления лекарственного средства, содержащего глицинбетаин в качестве терапевтически активного ингредиента, которое предназначено для лечения тромбозов и тромбоэмболических болезней. В соответствии с представленными выше результатами это лекарственное средство также обладает антикоагулирующей, антиагрегантной и фибринолитической активностями. Продемонстрировано, что это соединение является безвредным, что позволяет рассматривать возможность осуществления продолжительного лечения, которое не требует биологического мониторинга. Интерес к применению глицинбетаина основан на том факте, что он действует на нескольких уровнях гемостаза, а именно, он действует на агрегацию тромбоцитов, коагулирование и фибринолиз. Эта активность сохраняется в течение продолжительного времени и позволяет избежать повторного введения, что представляет собой существенное преимущество по сравнению с существующими средствами лечения. Введение бетаина на вызывает риск возникновения кровотечения или других побочных действий (например, индуцируемой гепарином тромбопении), что является большим преимуществом в антитромботической терапии. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение глицинбетаина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения тромбозов, которые не индуцируются гипергомоцистеинемией или гомоцистинурией. 2. Применение глицинбетаина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения тромбоэмболических болезней, которые не индуцируются гипергомоцистеинемией или гомоцистинурией. 3. Применение глицинбетаина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения нарушений коагулирования крови у пациента. 4. Применение глицинбетаина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения нарушений агрегации тромбоцитов у пациента. 5. Применение глицинбетаина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лизиса тромба. 14 6. Применение глицинбетаина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения тромбозов у пациентов,имеющих риск возникновения кровотечения. 7. Применение глицинбетаина в качестве антикоагулянта для консервации крови ex vivo. 8. Применение глицинбетаина для приготовления лекарственного средства, предназначенного для противодействия тромбоэмболическим воздействиям, индуцированным контрастными продуктами. 9. Применение глицинбетаина по п.8, отличающееся тем, что его можно вводить пациенту одновременно с контрастными продуктами. 10. Применение глицинбетаина в качестве действующего вещества по любому из пп.1-9,отличающееся тем, что эффективное количество глицинбетаина объединяют с фармацевтически приемлемой подложкой, носителем или эксципиентом.