Способ получения гидрохлорида 1(10)b-эпокси-13-диметиламино- 5,7a,6,11b(н)-гвай-3(4)-ен-6,12-олида, лиофилизированного противоопухолевого средства "арглабин"

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ Дата публикации и выдачи патента СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИДРОХЛОРИДА 1(10)-ЭПОКСИ-13-ДИМЕТИЛАМИНО 5,7,6,11(Н)-ГВАЙ-3(4)-ЕН-6,12-ОЛИДА, ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО СРЕДСТВА "АРГЛАБИН" Изобретение относится к технологии получения новых лекарственных препаратов из растительного сырья, а именно противоопухолевого препарата "Арглабин", и может быть использовано для химиотерапии злокачественных опухолей и расширения ассортимента иммуномодулирующих средств. Задачей и техническим результатом изобретения является разработка способа получения противоопухолевого средства на основе природного сесквитерпенового лактона, позволяющего исключить использование токсичных реагентов и обеспечивающего значительное снижение продолжительности процесса. Указанный технический результат обеспечивается в способе получения гидрохлорида 1(10)-эпокси-13 диметиламино-5,7,6,11(H)-гвай-3(4)-ен-6,12-олида, лиофилизированного, противоопухолевого средства, обладающего радиосенсибилизирующим и иммуномодулирующим свойствами,включающем экстрагирование растительного сырья - полыни гладкой Artemisia glabellaKar. et Kir., разделение полученной смолки на индивидуальные компоненты с получением технического арглабина, из которого синтезируют гидрохлорид диметиламиноарглабина, с последующей его очисткой, сушкой и лиофилизацией, в котором экстрагирование проводят с использованием в качестве экстрагента жидкого диоксида углерода при давлении 1502105 Па и температуре 600,5C, разделение смолки на индивидуальные компоненты осуществляют методом препаративной флюидной хроматографии с применением обращенной фазы C18, при синтезе гидрохлорида диметиламиноарглабина технический арглабин растворяют в ацетонитриле при массовом соотношении 1:10 с добавлением диметиламмоний диметилкарбамата в мольном соотношении 1:1,62.(71)(72)(73) Заявитель, изобретатель и патентовладелец: АДЕКЕНОВ СЕРГАЗЫ МЫНЖАСАРОВИЧ (KZ) 015557 Изобретение относится к технологии получения новых лекарственных препаратов из растительного сырья, а именно противоопухолевого препарата "Арглабин", и может быть использовано для химиотерапии злокачественных опухолей и расширения ассортимента иммуномодулирующих средств. В качестве противоопухолевого средства используется производное сесквитерпенового лактона арглабина-гидрохлорид 1(10)-эпокси-13-диметиламино-5,7,6,11(H)-гвай-3(4)-ен-6,12-олид (1), синтезированный из 1(10)-эпокси-5,7,6(H)-гвай-3(4),11(13)-диен-6,12-олида (2), выделенного из полыни гладкой Artemisia glabella Kar. et Kir. Известен способ получения гидрохлорида 1(10)-эпокси-13-диметиламино-гвай-3(4)-ен-6,12-олида,лиофилизированного, противоопухолевого средства "Арглабин" из растительного сырья (патент Республики Казахстан 10913, кл. A61K 31/343, 31/336, A61 Р 35/00, 15.03.2004). Способ включает экстракцию растительного сырья (надземная часть полыни гладкой Artemisia glabella Kar. et Kir.), очистку суммы экстрактивных веществ от балластных компонентов, разделение смолки на индивидуальные соединения методом колоночной хроматографии, в результате которой получают технический арглабин, с дальнейшей перекристаллизацией, аминированием и гидрохлорированием с получением диметиламинопроизводного. Основным недостатком способа является значительная продолжительность процесса. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ получения арглабиналиофилизированного, обладающего противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью, из растительного сырья, в качестве которого используют цветочные корзинки и листья полыни гладкой - Artemisia glabella Kar. et Kir. (предварительный патент Республики Казахстан 5277, кл. C07D 307/93,A61K 31/365, 15.10.1997). Первоначально сухое измельченное растительное сырье обрабатывают в экстракторе растворителем, в качестве которого используют хлороформ, затем экстрагированные вещества(смолку) очищают от балластных компонентов обработкой водно-спиртовой смесью. Смолку, полученную на стадии очистки, делят на индивидуальные компоненты методом колоночной хроматографии на силикагеле в течение 72 ч. При элюировании бензолом выделяют фракции, содержащие арглабин. После отгонки бензола получают технический арглабин, который подвергают перекристаллизации, аминированию и гидрохлорированию с получением диметиламинопроизводного. Продолжительность стадии синтеза 48 ч. Аминирование проводят диметиламином с получением раствора, содержащего аминоарглабин. Затем из спиртового раствора аминоарглабина барботированием хлористым водородом выделяют технический гидрохлорид диметиламиноарглабина. Полученный продукт подвергают очистке методом кристаллизации с последующей сушкой и лиофилизацией. Данный способ с использованием хлороформной экстракции растительного сырья имеет следующие недостатки: хлороформ является дорогостоящим растворителем и обладает токсическим действием; продолжительность экстракции составляет 6-8 ч; использование метода колоночной хроматографии при разделении смолки длительно по времени и составляет 72 ч, а применяемый при этом элюент бензол является также токсичным растворителем; продолжительность стадии синтеза диметиламинопроизводного около 48 ч. Задачей и техническим результатом изобретения является разработка способа получения противоопухолевого средства на основе природного сесквитерпенового лактона (1), позволяющего исключить использование токсичных реагентов и обеспечивающего значительное снижение продолжительности процесса. Указанный технический результат обеспечивается в способе получения гидрохлорида 1(10)эпокси-13-диметиламино-5,7,6,11(H)-гвай-3(4)-ен-6,12-олида, лиофилизированного, противоопухолевого средства, обладающего радиосенсибилизирующим и иммуномодулирующим свойствами, включающем экстрагирование растительного сырья - полыни гладкой Artemisia glabella Kar. et Kir., разделение полученной смолки на индивидуальные компоненты с получением технического арглабина, из которого синтезируют гидрохлорид диметиламиноарглабина, с последующей его очисткой, сушкой и лиофи-1 015557 лизацией, в котором экстрагирование проводят с использованием в качестве экстрагента жидкого диоксида углерода при давлении 1502105 Па и температуре 600,5C, разделение смолки на индивидуальные компоненты осуществляют методом препаративной флюидной хроматографии с применением обращенной фазы C18, при синтезе гидрохлорида диметиламиноарглабина технический арглабин растворяют в ацетонитриле при массовом соотношении 1:10 с добавлением диметиламмоний диметилкарбамата в мольном соотношении 1:1,62. Для апробации промышленной технологии выделения арглабина с использованием оборудования фирмы "Flavex" (Германия) проведена экстракция 600 кг травы полыни гладкой при заданных по предлагаемому способу условиях экстракции. Результаты показали, что содержание арглабина в CO2-экстракте в 2 раза выше, чем в хлороформном экстракте по известному способу. Себестоимость выделения арглабина из CO2-экстракта ниже за счет экономии растворителей. Метод CO2-экстракции способствует селективному извлечению арглабина из растительного сырья и сопровождается закономерным уменьшением остаточного содержания арглабина в шроте. Результаты эксперимента по подбору оптимальных условий выделения арглабина приведены в табл. 1, из которой видно, что наибольшее содержание арглабина в CO2-экстракте 28,5% достигается при давлении 150105 Па, температуре 60C, времени экстракции 75 мин. Расход CO2 составляет 100 кг/ч. Содержание арглабина в экстракте после CO2-экстракции определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Анализ проводят на жидкостном хроматографе фирмы HEWLETTPACKARD Agilent 1100 Series с УФ-детектором при следующих условиях: аналитическая колонка, заполненная сорбентом Zorbax CB-C18 4,6150 мм, с размером частиц 5 мкм; состав подвижной фазы ацетонитрил-вода в соотношении 50:50; детектирование при длине волны 204 нм; температура колонки комнатная; скорость подвижной фазы 0,75 мл/мин; объем вводимой пробы 20 мкл. Таблица 1. Содержание арглабина в CO2-экстракте в зависимости от условий экстрагирования. Точную навеску исследуемого образца CO2-экстракта растворяют в 10 мл подвижной фазы при тщательном перемешивании. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора до метки и перемешивают. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм. По 20 мкл фильтрата и раствора достоверного образца арглабина хроматографировали в условиях, описанных выше. Количественное содержание арглабина (X) в процентах определяли методом сравнения с внешним стандартом по формуле где S1 - среднее значение площадей пика арглабина на хроматограммах испытуемого раствора;So - среднее значение площадей пика арглабина на хроматограмме раствора достоверного образца;mo- навеска арглабина достоверного образца, г;m1- навеска CO2-экстракта, г; 25 - разведение. Данные по содержанию арглабина в пробе CO2-экстракта травы полыни гладкой и шроте приведены в табл. 2. По результатам проведенных экспериментов видно, что максимальный выход среди первых сепараторов отмечается при режиме: давление 150105 Па и температура 60C. При этом увеличивается выход-2 015557 целевого вещества и значительно сокращается время экстракции, чем при ранее используемой хлороформной экстракции. Полученный углекислотный экстракт подвергают очистке от липидной фракции, белковых веществ,хлорофилла путем обработки его водно-спиртовой смесью в соотношении 1:2 при температуре 70C, с отстаиванием фильтрата в холодильнике 24 ч при температуре 10-15C. Обработанную смесь фильтруют,собирают в отдельную емкость, остаток на фильтре подвергают водно-спиртовой обработке трижды при соотношении 1:2, фильтраты объединяют и упаривают до 1/5 исходного объема. К упаренному фильтрату в соотношении 1:1 добавляют этилацетат, раствор помещают в сепаратор, перемешивают в течение 5 мин, дожидаясь четкого разделения слоев. Слои разделяют, нижний водный слой трижды экстрагируют этилацетатом. Этилацетатные извлечения объединяют, этилацетат упаривают досуха. Выход очищенного экстракта составляет 73,3% в расчете на густой экстракт. Таблица 2. Определение содержания арглабина в образцах после CO2-экстракции методом ВЭЖХ. Очищенный экстракт передают на стадию препаративной хроматографии для выделения индивидуального соединения на установке по препаративной флюидной хроматографии "Super Pure - 350". Хроматографическое разделение осуществляется при помощи изокритической системы растворителей (ацетонитрил - вода при соотношении 1:1) на обращенной фазе C18 с дискретно работающей установкой. Диапазон рабочего давления составляет от 50105 до 320105 Па, температура от 5 до 80C, скорость потока сорастворителя от 20 до 350 мл/мин в системе, внутренний диаметр колонки 10 см. Чистота полученного технического арглабина с помощью установки по препаративной флюидной хроматографии"Super Pure - 350" составляет 99%. Использование метода препаративной флюидной хроматографии с применением обращенной фазыC18 позволяет проводить разделение на индивидуальные компоненты за 3 ч, в то время как в известном способе на разделение методом колоночной хроматографии требуется 72 ч. Кроме того, при колоночной хроматографии используется токсичный растворитель бензол, что исключается в заявляемом способе. Для дальнейшего получения водорастворимой формы лактона синтезируют гидрохлорид его диметиламинопроизводного - гидрохлорид 1(10)-эпокси-13-диметиламино-5,7,6,11(H)-гвай-3(4)-ен-6,12 олид (1). Исходное вещество - сесквитерпеновый лактон арглабин (2), растворяют в ацетонитриле при массовом соотношении 1:10. Затем в ацетонитрильный раствор по каплям при перемешивании в течение 10 мин добавляют диметиламмоний диметилкарбамат в мольном соотношении исходное вещество:диметиламмоний диметилкарбамат, равном 1:1,62. После полной конверсии исходного вещества (в течение 25 мин) упаривают ацетонитрил и остатки диметиламмоний диметилкарбамата на роторном испарителе. После завершения процесса в реакционную смесь добавляют этилацетат, охлажденный до температуры 5-15C в соотношении 1:2. При медленном перемешивании при температуре 12-150,3C (начало реакции) ведут процесс барботирования газообразным хлористым водородом (HCl), реакция заканчивается при температуре 16-180,5C. Оптимальная продолжительность реакции 15 мин. Подачу газа останавливают при достижении в пределах pH 5,2-5,50,05. После завершения процесса реакционную смесь переносят в колбу ротационного испарителя вместимостью 2 л, избыток этилацетата и хлористого водорода отгоняют до сиропообразного состояния. К полученному раствору приливают предварительно ох-3 015557 лажденный до температуры 10C абсолютный этилацетат (99,9%) и энергично встряхивают до выпадения белых кристаллов. Колбу с кристаллизуемой массой выдерживают в холодильнике при температуре 12-15C в течение 1 ч. Выпавшие кристаллы отфильтровывают через фильтр Шотта и промывают на этом же фильтре охлажденным этилацетатом. Отфильтрованные кристаллы после перекристаллизации из этилацетата высушивают на ротационном испарителе при температуре 40-70C в течение 1 ч. Досушивание кристаллов проводят в вакуум-сушильном шкафу при температуре 40-50C, давлении 5-10 мм.рт.ст. до потери массы при высушивании не выше 0,5%. Полученный продукт представляет собой белый кристаллический порошок гидрохлорида диметиламиноарглабина (1) с выходом 90%. В предлагаемом способе на стадии синтеза гидрохлорида диметиламиноарглабина используется диметиламмоний диметилкарбамат в отличие от диметиламина в известном способе, что позволило сократить продолжительность стадии синтеза с 48 до 3 ч. Субстанцию гидрохлорида диметиламиноарглабина (1) используют для получения лиофилизированной лекарственной формы. Конечный продукт (субстанция) растворяют в воде для инъекций из расчета: 2 г сухого вещества 100 мл воды. Полученный 2%-ный раствор лиофилизируют следующим способом. Раствор фильтруют,используя фильтрационную установку "Sartorius" через стерильную капсулу "Sartobran", размером пор 0,45 мкм, 0,2 мкм соответственно в стерильную стеклянную емкость. Полученный фильтрат с помощью автомата "Роза-2" разливают в ампулы по 2 мл и сушат в лиофилизаторе LZ-45. Раздозированный раствор в ампулах помещают в кассеты. Кассеты покрывают листами стерильного пергамента и помещают в низкотемпературные столы "Debri" производства Голландия для замораживания при -40C не менее чем на 12 ч. После окончания процесса заморозки кассеты с ампулами размещают на этажерки сублиматора и помещают в вакуумный котел сублиматора LZ-45 для проведения процесса сублимационной сушки. Через 1 ч после погружения этажерки в котел сублиматора подключают вакуумный насос, далее по мере достижения необходимого значения вакуума (не менее 5-6 МПа) подают подогрев полок на этажерки сублиматора, примерно через 2 ч после начала процесса сушки. Полки нагревают постепенно до+55(+5C), добавляя от 0 до +55C по 5C на каждом часе сублимационной сушки. На минусовой температуре - от 0 до -30C по 10C. Переход продукта с минусовой температуры на плюсовую происходит на 12-13-ом часу сушки. Конечная температура продукта не должна превышать +50, +52C. Продолжительность сушки 24 ч. Подлинность препарата определяют по температуре плавления, ИК-спектру, ВЭЖХ-анализу. Как видно из вышеприведенных данных, заявляемый способ осуществляется в условиях, соответствующих нормам GMP, а именно жидкий диоксид углерода является нетоксичным экстрагентом; выделение индивидуального соединения осуществляется на установке по препаративной флюидной хроматографии "Super Pure - 350" с применением обращенной фазы C18; на стадии синтеза осуществляется модифицирование с использованием диметиламмоний диметилкарбамата. Субстанцию препарата - гидрохлорид 1(10)-эпокси-13-диметиламино-5,7,6,11(H)-гвай-3(4)-ен 6,12-олид (1), в эксперименте изучают на противоопухолевую активность на 11 штаммах экспериментальных опухолей. К арглабину чувствительны следующие штаммы перевиваемых опухолей: карцинома легких, солидная опухоль Эрлиха, аденокарцинома молочной железы Ca - 755, саркома 37, лимфоцитарная лейкемия P-388, лимфоидная лейкемия L-1210, саркома M - I, карциносаркома Уокера, альвеолярный слизистый рак печени PC-1 крыс при внутрибрюшинном и внутриопухолевом введении препарата в максимально переносимых дозах (МПД). Арглабин также проявляет эффективность в отношении перевиваемых опухолей, устойчивых к проспидину, рубомицину и сарколизину. Установлено, что препарат "Арглабин-лиофилизированный" эффективно влияет на начальные этапы формирования метастазов, то есть снижает возможность их появления. Арглабин обладает способностью оптимизировать окислительно-восстановительные процессы и метаболизм в соединительной ткани. Определено иммуномодулирующее действие арглабина, зависимое от дозы препарата и проявляющееся преимущественным влиянием на T-клеточное звено иммунитета. Арглабин обладает свойством корректировать иммунодепрессивный эффект цитостатиков. Выявлено, что арглабин является конкурентным ингибитором фарнезилирования RAS-онкобелков,снижает экспрессию RAS-генов и содержание АТФ, вызывает апоптоз опухолевых клеток. Препарат имеет достаточно высокий показатель времени удерживания в организме, составляющий почти 22 ч. Арглабин быстро проникает из центральной камеры (кровь) в периферические ткани. В течение первого часа наибольшие концентрации препарата создаются в селезенке и легких, через 3 ч он накапливается также в печени и скелетных мышцах. Препарат в максимально переносимых дозах не влияет на морфологический состав периферической-4 015557 крови и костного мозга, не нарушает функционального состояния печени, почек, сердечно-сосудистой системы, дыхания, периферической нервной системы. При внутривенном, внутрибрюшинном, внутримышечном, подкожном введении препарат не оказывает местно раздражающего действия. Не выявлены аллергизирующие и пирогенные свойства. Арглабин также не обладает эмбриотоксическим, тератогенным и мутагенным свойствами. Клиническое изучение "Арглабина-лиофилизированного" на I фазе проведено на 53 больных с IIIIV стадией злокачественного процесса 11 локализаций. Однократная доза колебалась от 240 до 480 мг в день. Препарат вводился внутривенно струйно в виде 2% водного раствора. При наличии у больных асцита и плеврита 2%-ный раствор вводился в полость в дозе 480 мг (на физрастворе). Выявлено, что препарат в рекомендуемых дозах не обладает токсичностью, не оказывает угнетающего действия на кроветворение, не нарушает функции внутренних органов, периферической нервной системы. Вторая фаза клинических испытаний препарата проведена на 72 больных с IV стадией опухолевого процесса 11 локализаций (рак печени, легкого, желудка, молочной железы, прямой кишки, пищевода,яичника, поджелудочной железы, подчелюстной слюнной железы, лимфосаркома и др.). В результате II фазы клинических испытаний получены следующие результаты: частичная регрессия опухоли 32 (44,4%); стабилизация процесса 12 (16,7 %); прогрессирование процесса 28 (38,9%) пациентов. Оценка объективного эффекта монохимиотерапии препаратам проведена по критерию, рекомендованному Всемирной организацией здравоохранения и Международным противораковым союзом. Наиболее лучшие результаты химиотерапии арглабином получены при первичном раке печени, молочной железы, легких и яичника. Лечение больных диссеминированным раком молочной железы проведено в трех группах, сформированных методом рандомизации:II группа - арглабин в комбинации со схемой CMF (15 больных);III группа - химиотерапия по схеме CMF (15 больных) - контрольная. Разовая доза арглабина в среднем составила 240 мг, суммарная 4,8 г. Высокий показатель частичной регрессии и стабилизации процесса достигнут во II группе (арглабин+CMF). Изучена выживаемость больных диссеминированным раком молочной железы (расчеты по E. Kaplan-P. Meier). В группе больных, получавших только "Арглабин-лиофилизированный", шестимесячная выживаемость составила 57,8%, годичная 3,9%. Медиана выживаемости - 6,3 месяца. В группе больных, получавших только полихимиотерапию по схеме CMF, данные показатели составили, соответственно 72,0 и 17,3%, а медиана выживаемости 7,6 месяца. Более высокие показатели наблюдались в группе, получавших арглабин в комбинации с полихимиотерапией по схеме CMF, где шестимесячная выживаемость 100%, годичная 39,1%. Медиана выживаемости 10,9 месяцев (P0,05). После лечения наблюдали уменьшение объема опухоли в первой и второй группах в конце лучевой терапии и перед операцией достоверно больше (P0,001), чем у больных третьей группы. Патоморфоз опухоли III-IV степени в первой и второй группах составил соответственно 649,8% и 500,2%, тогда как в третьей группе 379,5%. Определены кумулятивные показатели выживаемости (расчеты по E. Kaplan-P. Meier). Трехлетняя выживаемость среди больных первой и третьей групп оказалась одинаковой и составила соответственно 23,97,8% и 24,47,8%, тогда как во второй группе 45,29,1%. Аналогичную картину наблюдали и при изучении безрецидивной выживаемости. При этом в первой и третьей группах 3-годичная выживаемость составила соответственно 5,24,1% и 5,24,1%, во второй группе 32,58,6%. Медиана выживаемости в первой и третьей группах была одинаковой 30,03 года, во второй группе этот показатель был достоверно выше, чем в предыдущих двух группах, и составил 7,40,2 года. При использовании "Арглабина-лиофилизированного" на 34 пациентах с диссеминированными формами опухолей и развившейся устойчивостью к химиопрепаратам в комбинации с химиотерапией у инкурабельных и ослабленных больных (индекс Карновского 60-70%) получен положительный эффект в 44%. Эти результаты свидетельствуют о химиосенсибилизирующей способности "Арглабиналиофилизированного". "Арглабин-лиофилизированный" является препаратом выбора у ослабленных и инкурабельных больных, когда другие виды стандартной противоопухолевой терапии не приемлемы. Проведены исследования на 55 больных первичным раком печени, распределенных на 3 группы: 1 группа (контрольная) - получавшая полихимиотерапию (26 больных). 2 группа - получавшие "Арглабин-лиофилизированный" в разовой дозе из расчета 5 мг/кг веса (185 мг/м 2) внутривенно в течение 20-21 дней (17 больных). 3 группа - получавшие "Арглабин-лиофилизированный" из расчета 5 мг/кг веса (185 мг/м 2) в/в в комбинации с фторурацилом 600 мг/м 2 1,8 день (12 больных).-5 015557 Эффективность химиотерапии определялась по критерию ВОЗ. Выживаемость рассчитывалась актуриальным методом. Годичная выживаемость в первой и второй группах больных, получавших полихимиотерапию стандартными препаратами и чисто "Арглабином-лиофилизированным" составила соответственно: 32,2 и 32,3%. В третьей группе выживаемость достоверно превышала показатели первых двух групп 55,1%(P0,05). Определение медианы выживаемости также показало, что она была выше в третьей группе и составила 15,3 месяца, в то время как в первой и во второй группах 7,85 и 8,45 месяцев соответственно. При лечении "Арглабином-лиофилизированным" 45 больных раком легкого в основном с T3N1MO стадией заболевания, из них 6 после пробной торакотомии, первичных больных было 21, повторных после ранее примененных курсов лучевой и химиотерапии - 24. У всех больных имело место гистологическое подтверждение диагноза: плоскоклеточный рак - у 16, мелкоклеточный - у 12, железистый - 10 и недифференцированный рак - у 7 пациентов.III. Контрольная группа 2: метотрексат 25 мг 1, 4, 8, 11 дни, эндоксан 1,0 г 1, 5, 9 дни (15 больных). При проведении химиотерапии "Арглабином-лиофилизированным" у части больных отмечалось улучшение общего состояния, уменьшение кашля и болей в грудной клетке, оцененное в основном в 1 балл. К концу лечения у подавляющего числа больных достигнута стабилизация процесса. У двух больных первой контрольной группы отмечалось прогрессирование заболевания. Часть больных поступила в стационар повторно через месяц после окончания первого курса лечения. При контрольном обследовании практически у всех больных продолжала определяться стабилизация процесса. Определена эффективность препарата "Арглабин-лиофилизированный" в качестве радиосенсибилизирующего средства для лучевой и химиолучевой терапии у 20 больных местнораспространенным раком молочной железы. Полная и частичная регрессия опухоли достигнута у 19 из 20 больных в исследуемой группе (95,5%), причем у 4 (20,0%) из них отмечена полная резорбция опухоли. В контрольной группе объективный противоопухолевый эффект составил 70%. Для более объективной оценки лечения "Арглабином-лиофилизированным" при гистологическом исследовании операционного материала определялась степень лечебного патоморфоза в опухоли и метастатически измененных лимфоузлах. Третья степень лечебного патоморфоза (некроз, фиброз, единичные дегенеративно измененные клетки рака) зафиксирована у 11 (55%) больных исследуемой группы и у 4 (20%) пациенток контрольной группы. Полный и выраженный противоопухолевый эффект по морфологическому критерию отмечен у 14 (70%) больных,получавших "Арглабин-лиофилизированный", что в 3,5 раза выше, чем в группе контроля (20%). Установлено, что "Арглабин-лиофилизированный" в разовой дозе 5 мг/кг, вводимый внутривенно струйно за 15 мин до лучевой терапии через день, не обладает побочными эффектами и хорошо переносится больными. Таким образом, "Арглабин-лиофилизированный" обладает выраженным радиосенсибилизирующим эффектом, достоверно увеличивая частоту объективных регрессий и частоту выраженного лечебного патоморфоза (III-IV степени) как в первичной опухоли, так и в метастатически измененных лимфоузлах. Исследование интерферонового (ИФН) статуса и цитокинового профиля у 18 женщин с раком молочной железы в динамике до и после лучевой терапии с применением препарата "Арглабинлиофилизированный" свидетельствуют, что он восстанавливает механизм синтеза следующих цитокинов: ИФН-, ИЛ-2, противовоспалительного цитокина - ИЛ-4, ФНО-, ИЛ-1. У обследованных больных после лечения препаратом "Арглабин-лиофилизированный" отмечено следующее. 1. Снижение спонтанно вырабатываемого ИФН у всех пациентов. 2. Повышение до нормы способности к продукции ИФН- и ИФН- в среднем у 40% больных. 3. Повышение чувствительности к препаратам ИФН- и ИФН- у 44 и 11% больных соответственно. 4. Чувствительность к иммуномодулирующим препаратам (ридостин, циклоферон и амиксин) улучшалась в 30-40% случаев, а к исследуемому препарату "Арглабин-лиофилизированный" в 40-50% случаев. Также показано, что у всех больных с положительным клиническим эффектом при терапии, включающей препарат "Арглабин-лиофилизированный", отмечена экспрессия генов ИФН- и ИЛ-2 (50%) или только ИЛ-2 (50%). При этом активность генов указанных цитокинов у остальных пациентов отмечена лишь в 27 и 73% случаев соответственно. Известно, что эти цитокины вырабатываются Th1 лимфоцитами, и подавление активности Th1 со снижением выработки IFN- или ИЛ-2 приводит к более тяжелому течению заболевания. Терапия с применением "Арглабина-лиофилизированного", судя по этим показателям, может быть эффективна. Отмечено, что при положительном клиническом эффекте терапии с применением препарата "Арг-6 015557 лабин-лиофилизированный" мРНК ИЛ-12 - цитокина, принимающего участие в развитии Th1-типа иммунного ответа, определялась у 60% больных, что в 2 раза чаще, чем у остальных пациентов. Проведенные исследования также показали, что мРНК ИЛ-1 определялась практически у всех обследованных больных после лечения. При этом отмечена активность мРНК ИЛ-6 и ИЛ-8 при положительном клиническом эффекте у 70% и 60% пациентов соответственно, а при стабилизации состояния - у 80 и 70% больных соответственно. Одновременно с исследованием ИФН статуса и оценкой экспрессии генов цитокинов по уровню синтеза их мРНК у тех же больных с раком молочной железы определяли содержание цитокинов (методом ИФА) в сыворотке крови и при культивировании клеток крови. После курса проведенного лечения "Арглабином-лиофилизированным" отмечена нормализация или тенденция к нормализации количества исследованных цитокинов, определяемых в сыворотке крови, у 20-40% обследованных женщин. При этом также показано, что у 10-30% больных повышалось в сыворотке крови содержание цитокинов, что могло свидетельствовать об активации клеток иммунной системы. Данные, полученные в ходе исследования состояния системы интерферона и цитокинов у больных раком молочной железы в рамках клинического испытания препарата "Арглабин-лиофилизированный",свидетельствуют о высокой иммуномодулирующей способности исследованного препарата у данной группы больных. Преимущества предлагаемого способа получения противоопухолевого средства "Арглабин": наличие промышленной сырьевой базы - полынь гладкая (Artemisia glabella Kar. et Kir.) возделывается в опытном хозяйстве Карагандинского фармацевтического завода (Казахстан, г. Караганда) на площади 5,6 га с ежегодным производством 6,0 т сухой массы для последующей переработки. В перспективе до 2010 года планируется ежегодное производство сырья довести до 40 т в год; целевое вещество - сесквитерпеновый лактон 1(10)-эпокси-5,7,6(H)-гвай-3(4),11(13)-диен-6,12 олид (2) - экстрагируют из сырья полыни гладкой с применением экологически чистой технологии с использованием нетоксичного экстрагента - жидкого диоксида углерода, что соответствует нормам GMP,так как исключает извлечение токсичным растворителем хлороформом; выход целевого вещества при экстракции жидким диоксидом углерода в 2 раза выше, чем при хлороформной экстракции в расчете на воздушно-сухое сырье; предлагаемый способ обеспечивает значительное снижение продолжительности процесса: время экстракции сокращается в 2 раза (с 6 до 3 ч), хроматографического разделения в 36 раз (с 72 до 3 ч); стадии синтеза в 16 раз (с 48 до 3 ч); выделение и очистка индивидуального соединения осуществляется на установке по препаративной флюидной хроматографии "Super Pure - 350" с применением обращенной фазы C18, при этом исключается использование токсичного растворителя бензола; стадия синтеза субстанции гидрохлорида 1(10)-эпокси-13-диметиламино-5,7,6,11(H)-гвай-3(4)ен-6,12-олида (1) осуществляется с использованием диметиламмоний диметилкарбамата вместо диметиламина; результаты клинических испытаний показали высокое радиосенсибилизирующее, иммуномодулирующее действие противоопухолевого средства "Арглабин", полученного по предлагаемому способу. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Способ получения гидрохлорида 1(10)-эпокси-13-диметиламино-5,7,6,11(H)-гвай-3(4)-ен-6,12 олида, включающий экстрагирование Artemisia glabella Kar. et Kir. жидким диоксидом углерода при давлении 1502105 Па и температуре 600,5C; получение экстракта смолки экстрагированием этилацетатом; разделение экстракта смолки методом препаративной флюидной хроматографии с применением обращенной фазы C18 на индивидуальные компоненты с получением технического арглабина; синтез гидрохлорида диметиламиноарглабина растворением технического арглабина в ацетонитриле при массовом соотношении 1:10 с добавлением диметиламмоний диметилкарбамата в мольном соотношении 1:1,62 и очистку, сушку и лиофилизацию гидрохлорида диметиламиноарглабина.