Иммуностимулятор противоопухолевого действия и способ его получения

007839 Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к препаратам активной иммунотерапии злокачественных новообразований, например меланомы, а также к способам получения этих препаратов. В настоящее время известен иммуностимулятор, представляющий собой водную смесь клеточных компонентов, содержащих раковые антигены и источник ионов марганца (пат. Великобритании 1592496 от 24.11.77 и пат. Франции 2423223 от 20.05.79 по М.кл.3 А 61 К 39/00). Такой иммуностимулятор эффективен в начальной стадии заболевания или при остаточном лечении, когда число клеток, оставшихся после первого лечения, невелико. Однако, если обрабатывается заметная опухоль, то инъекция может оказаться бесполезной, а возможно даже вредной, увеличивающей количество циркулирующих собственных опухолевых антигенов,блокирующих имунные клетки. Возможности приготовления специфичных вакцин из индивидуальных опухолей человека ограничены как временем, так и количеством материала. Известны также иммунностимулирующие адъюванты, содержащие первичный антиген убитого штамма B.Pertussis NRRL-11,232, соединенного сочетающим агентом диизоцианатом со вторым антигеном из живых клеток аденокарциномы (пат. США 4285930 от 13.11.79 по М.кл.3 А 61 К 39/12). Применение данных стимуляторов повышает эффект комплексной терапии. В то же время применение препаратов этого типа сопровождается побочными эффектами как локального, так и общего характера: воспалительные грануломы, язвы, лимфоденопатия, явление гиперчувствительности и т.п. Из числа известных наиболее близок заявляемому иммуностимулятор клеточного иммунитета противоопухолевого действия, содержащий аттенуированую вирусную культуру вакцины семейства Vaccinia virus AS ATCC No VR 2010 (пат. США 4315914 от 04.04.80 М.кл.3 А 61 К 45/05). Известный иммуностимулятор получают путем выделения апатогенного вируса осповакцины, размножения его в монослойной культуре клеток эмбриона цыпленка после пассивирования в монослойной культуре клеток почек крысы. Данный иммуностимулятор является наибольшим, структурно- и антигенно-сложно устроенным ДНК-геномным вирусом, представляющим собой поликлональный стимулятор имунной системы, преимущественно действующий на клеточный иммунитет. При длительном парентеральном применении известного иммуностимулятора возникают различные побочные эффекты, в частности, реакции гиперчувствительности, характерные и для бактериальных неспецифичных иммуностимуляторов. Побочные эффекты снижают эффективность применения препарата при подавлении развития опухоли, возникающей после операции. В ряде случаев эти эффекты делают применение известного препарата вообще невозможным. Целью настоящего изобретения является повышение эффективности подавления роста опухоли,возникающей после операции, при длительном применении. Повышение эффективности подавления роста опухоли, возникающей после операции, достигается тем, что включающий апатогенную вирусную культуру иммуностимулятор противоопухолевого действия содержит штамм энтеровируса типа ECHO, выделенный из кишечника человека с титром в монослойной культуре фибробластов эмбриона человека, равным 5-7 lg ТЦД 50/0,1 мл. Штамм энтеровируса выделен из кишечника ребенка в возрасте 2-5 лет. В качестве энтеровируса типа ECHO используют семейство Picornaviridae Enterovirus. Способ получения данного иммуностимулятора отличается тем,что апатогенную культуру энтеровирусов выделяют из кишечника человека, отбирают вирусную культуру, имеющую сродство к опухоли,пассивирование проводят в культуре ткани индивидуальных опухолей и размножают пассивированный штамм в культуре фибробластов эмбриона человека до титров 5-7 lg ТЦД 50/0,1 мл. Энтеровирус группы ECHO семейства Picornaviridae Enterovirus относится к наиболее простым РНК-геномным вирусам. Он имеет только 4 структурных полипептида и, соответственно, меньшее количество антигенных детерминант (активных центров) для взаимодействия с различными клонами иммунокомпетентных клеток. Данный иммуностимулятор является стимулятором преимущественно гуморального звена иммунитета (-клетки) с противоопухолевым действием. Функциональная активность -клеток поражается при индукции опухолевого процесса раньше поражения Т-клеток. Совокупность отличительных признаков способа позволяет адаптировать выделенную апатогенную культуру энтеровирусов к опухолевым тканям различным больным и обеспечить ее размножение. При титре вируса ниже 5 lg ТЦД 50/0,1 мл эффект иммуностимуляции не наблюдается, т.к. активность культуры слаба. При титрах выше 7 lg ТЦД 50/0,1 мл наблюдается снижение активности культуры. Из кишечного тракта людей, преимущественно здоровых детей в возрасте 2-5 лет, выделяют кишечные вирусы на первичной культуре эмбриона человека. Затем отбирают апатогенные серологические типы энтеровирусов Picornaviridae Enterovirus типа ECHO, например ЕСНО-7. Для выделения вируса используют фекалии. После выделения исходной культуры определяют ее онкотропность к меланобластоме или другим опухолям, используя короткосрочно переживающие культуры опухоли.-1 007839 Отобранную культуру адаптируют пассивированием в опухолевых тканях меланобластомы различных больных для усиления специфичности действия. Пассивированный штамм размножают в культуре фибробластов эмбриона человека до титра 5-7 lg ТЦД 50/0,1 мл. Ниже приводится детальное описание способа. Исходную апатогенную культуру Picornaviridae Enterovirus типа ECHO, например ЕСНО-7, выделяют из кишечника здоровых детей в возрасте 2-5 лет. Для первичного выделения используют фекальные пробы. Пробу в стерильном флаконе немедленно помещают в холодильник при температуре -10 С. Для выделения вирусов используют 20% взвесь материала в растворе Хенкса. Взвесь центрифугируют при 3000 об./мин в течение 30 мин. Над осадочную жидкость замораживают и выдерживают при этой температуре в течение 24 ч. Затем суспензию оттаивают, добавляют антибиотики: пенициллин - 1000 ед./мл, стрептомицин - 250 ед./мл и выдерживают в течение 1-2 ч. Полученную взвесь повторно центрифугируют 1-2 раза при 3000 об./мин в течение 30 мин. Надосадочная жидкость после проверки на стерильность вновь замораживается и выдерживается при температуре /-10 С/ - /-20 С/. Полученным вирусосодержащим материалом инфицируют монослойную трипсинизированную культуру фибробластов эмбриона человека. Поддерживающая среда для инфицированных культур представляет собой среду 199 и 2% телячьей сыворотки, начальная - среда 199 и 10% телячьей сыворотки. После контакта с клетками в течение 1 ч отсасывают суспензию и добавляют поддерживающую среду. Далее пробирки с клетками инкубируют при 37 С в течение 2-10 дней. В течение этого времени проводят 2-3 последовательных пассажа материала в культуре фибробластов эмбриона человека. При каждом пассаже срок инкубации пробирок длится до полной дегенерации клеток. После выделения цитопатогенного вируса полученный материал подвергается титрованию и серологическому типированию. Вируссодержаций материал осветляют центрифугированием при 3000 об./мин в течение 20 мин,замораживают и хранят при температуре /-20 С/ - /-70 С/. Титр вируса в культуре фибробластов эмбриона человека составляет 5-7 lg ТЦД 50/0,1 мл. После выделения штаммов вируса определяют их онкотропность в условиях переживающих культур опухолей. Для адаптации выделенной вирусной культуры используют опухолевые ткани, полученные при операции от различных больных, не подвергавшихся какой-либо терапии. Опухолевая ткань очищается от жировой ткани, некротических очагов и крови. Затем очищенную опухолевую ткань выдерживают 18-20 ч при температуре 0 С, после чего ее размельчают на кусочки размером 0,1-0,2 мл, помещают в питательную среду 199, или питательную среду Игла без сыворотки (100 мг ткани на 4 мл питательной среды). Ткань инфицируют вирусной культурой 105-106 ТЦД 50 и помещают в термостат при температуре 37 С без подачи углекислого газа. Ежедневно заменяют по 5 мл свежей питательной средой. Культивирование прекращают при достижении гибели кусочков опухоли, которая определяется морфологически и визуально по окислению среды. Для определения интенсивности размножения титруют вирус в жидкой фазе культуры опухоли, собираемой ежедневно. Интенсивность репродукции вирусов оценивают при подсчете процента выявленного в зараженной ткани вируса по отношению к дозе заражения. При выявлении размножения вируса в опухолевой ткани культуры, полученные в дни максимального размножения, центрифугируют при 3000 об./мин в течение 20 мин. Адаптацию культуры проводят по следующей схеме: репродуцированный в опухолевой ткани вирус пассивируется (размножается) в тест-культуре фибробластов эмбриона человека и вновь пассивируется через ткань опухоли. При этом проводится 3-10 последовательных чередованных пассажей в культурах переживающей ткани от индивидуальных опухолей и в тест-культуре. Маточный штамм вируса хранится в замороженном виде при температуре /-20 С/ - /-70 С/. Размножение штамма ведут в културе фибробластов эмбриона человека до титра 5-7 lg ТЦЦ 50/0,1 мл на питательной среде 199 без сыворотки с добавлением антибиотиков: пенициллин 100 ед./мл, стрептомицин 50 ед./мл. В среду может быть добавлен индикатор рН-феноловый красный с концентрацией 0,002%. Жидкая фаза инфицированной культуры фибробластов эмбриона человека после полной дегенерации клеток осветляют центрифугированием при 3000 об./мин в течение 2 мин. Полученный иммуностимулятор противоопухолевого действия представляет собой стерильную жидкость розового цвета. Она фасуется по 2 мл (2 х 107 ТДЦ 50) - доза для одной инъекции. Препарат хранится в замороженном виде. Полученный иммуностимулятор применялся у больных злокачественной меланомой кожи (Т 1-3NoMo) после хирургического удаления первичного очага, или первичного очага вместе с региональными лимфоузлами. Применение препарата начинается через 2-4 недели после операции парентерально (внутримышечно) в верхний наружный квадрат ягодичной области. Схема применения препарата следующая: первые 3 месяца три ежедневные инъекции по 2 мл(2 х 107 ТЦД 50 вируса), после каждого курса - перерыв в 3 недели, последующие 3 месяца - по одной инъекции ежемесячно. После этого следует трехмесячный перерыв с повторением ежемесячных инъекций в течение 3 месяцев с 9-го по 12-ый месяц послеоперационного периода. Применение препарата может быть начато перед удалением первичного очага опухоли за 1-2 недели: трехкратное ежедневное введение по 2 мл (2x107 ТЦД 50 вируса). Возможен более длительный срок применения препарата в послеоперационном периоде до 2-3 лет с повторением ежемесячных инъекций по 2 мл. Введение препарата практически не вызывает побочных явлений. Ниже приводятся результаты клинических испытаний заявляемого иммуностимулирующего препарата (ИСВП - иммуностимулятор вирусной природы), препарата бактериальной природы (препарат С.Р. Corynebacterium Parum) и химического препарата декариса (левомизола) у больных злокачественной меланомой. Препарат декарис применялся по следующей схеме: таблетки парентерально еженедельно 2 раза с интервалом в 3 дня в течение 8 месяцев, начиная со 2-4 недели после удаления опухоли. Препарат С.Р. применялся по схеме: иммуностимуляция начинаясь через 1-4 недели внутривенно после радикальной операции. Первые 5 дней препарат вводят внутривенно 1-4 мг в день при возрастающей дозировке. В последующем в течение года препарат вводят подкожно еженедельно по 1 мл в 4 точках в области живота. Проанализирован материал для больных, которые находились под наблюдением не менее 3 лет. Ниже в табл. 1 приведены данные по выживаемости и характеру течения процесса у больных меланомой кожи после радикальной операции. Таблица 1 В таблице в числителе указано число больных с положительными показателями, а в знаменателе общее число наблюдаемых больных. Таким образом, данные показывают, что наилучшие данные по выживаемости получены при применении заявляемого иммуностимулятора на основе культуры энтеровирусов. В табл. 2 представлена динамика смертности больных меланомой кожи после хирургического лечения и иммуностимуляции. Таблица 2 В числителе указано число умерших, а в знаменателе общее число наблюдаемых больных. Из данных таблицы следует, что иммуностимуляция заявляемым препаратом существенно повышает выживаемость, так при применении препарата в первый год не умерло ни одного больного, в то время как при лечении другими препаратами умерло соответственно 5 и 7% от общего числа больных. Разница в смертности наблюдается и через 2 года, по сравнению с наилучшим по данным препаратом декарис разница в смертности составляет 1,3 раза. Заявляемый препарат уменьшает частоту прогрессирования процесса после радикальной операции. Ниже в табл. 3 приведены данные по частоте прогрессирования процесса у больных меланомой кожи после радикальной операции и иммуностимуляции. Таблица 3 В числителе указано число больных с прогрессированием процесса, в знаменателе - общее число наблюдаемых больных. Как видно из таблицы, самое медленное прогрессирование процесса наблюдается при применении-3 007839 заявляемого препарата. Характер диссеминации опухоли - меланомы кожи после радикальной операции в зависимости от применяемого иммуностимулятора приведен в табл. 4. Таблица 4 В числителе указано число больных с рецидивами (метастазами), в знаменателе - общее число наблюдаемых больных. Из данных табл. 4 видно, что при применении заявляемого препарата, в основном, образуются подкожные метастазы и метастазы в лимфоузлах, которые сравнительно легко обнаруживаются и удаляются. Метастазы в легких образуются 6 раз и в 2,5 раза реже, чем при применении других известных препаратов. В табл. 5 представлен характер течения заболевания умерших больных. Таблица 5 Из данных табл. 6 следует, что заявляемый препарат существенно удлиняет время стабилизации,время диссеминации и длительность жизни на 12 месяцев по сравнению с декарисом и на 7 месяцев по сравнению с препаратом на основе Corynebacterium Parum. Ниже в табл. 6 приведены данные по выживаемости больных раком желудка, радикально оперированных на III стадии заболевания. Таблица 6 В числителе указано общее число живых больных, а в знаменателе - общее число наблюдаемых больных. Из данных таблицы следует, что при применении заявляемого препарата частота выживаемости повышается в 1,5-2 раза по сравнению с только операционным лечением. Ниже в табл. 7 приведены данные по выживаемости больных раком прямой кишки после радикальной операции. Таблица 7 В числителе указано число живых больных, а в знаменателе - общее число наблюдаемых больных. Как видно из приведенной таблицы, применение заявляемого препарата повышает выживаемость на 14%. Ниже приводятся данные по контролю иммунологического статуса при приеме заявляемого иммуностимулятора (ИСВП).-4 007839 1. Реакция ГЗТ на опухолеассоииированный меланомный антиген. Частота встречаемости положительной реакции ГЗТ у больных, получивших ИСВП, существенно не меняется в первые 6 месяцев (50-60%). При возобновлении стимуляции (9-12 месяцев) данный показатель увеличивается у 10% больных, т.е. частота встречаемости нормальных реакций ГЗТ не меняется или увеличивается в течение стимуляции ИСПВ. При применении декариса частота встречаемости нормальных реакций ГЗТ меняется, через 2 месяца у 35% больных данная реакция не проявляется. У ряда больных частота встречаемости данной реакции резко меняется (20-35%). Поскольку реакция ГЗТ отражает способность организма распознавать, реагировать и отторгать опухолеассоциированный антиген, то стабилизация показателя или его увеличение является благоприятным признаком, а резкие колебания и снижение данной реакции - неблагоприятный признак состояния имунной системы во время иммуностимуляции. Таким образом, по данному показателю ИСПВ лучше препарата декарис. 2. РППЛ на опухолеассоциированный меланомный антиген. Применение ИСВП в послеоперационном периоде не вызывает резких колебаний реакции. Частота выявляемосги данной реакции по ходу иммуностимуляции имеет тенденцию в сторону увеличения. В группе больных, получивших иммуностимуляцию декарисом, частота выявляемосги реактивности по мере стимуляции уменьшается от 80 до 30%, т.е. в конце курса только у 30% больных лейкоциты крови узнают и реагируют на меланомный антиген. РППЛ так же как реакция ГЗТ отражает способность Тлимфоцитов узнавать и реагировать на опухолеассоциированный антиген. Исчезновение, снижение данной реактивности следует рассматривать как показатель снижения противоопухолевой резистентности. Следует отметить, что после прекращения стимуляции декарисом данный показатель достигает исходного уровня. 3. Ингибитор прилипания лейкоцитов в сыворотке крови. Во время иммуностимуляции ИСВП выявление данного показателя увеличивается от 35% в начале курса до 80% в конце курса стимуляции. В группе, получавшей декарис, частота встречаемости данного параметра по мере стимуляции уменьшается от 40% в начале курса до 20% в конце курса иммуностимуляции. Ингибитор прилипания лейкоцитов, обнаруживаемых в РППЛ, выявляется у здоровых людей от 60 до 80% случаев. Такой же показатель у больных меланомой после радикальной операции, получивших ИСВП и при стабилизации процесса. Ингибитор исчезает во время диссеминации процесса, поэтому присутствие ингибитора прилипания лейкоцитов в сыворотке является одним из параметров нормального иммунологического статуса. Появление его у 45% больных, стимулированных ИСВП, является показателем положительного эффекта иммуностимуляции. Сравнительно в группе больных, получивших декарис после 4 месяцев стимуляции, ингибитор в крови обнаруживается только у 20% больных. 4. Блокирующий фактор сыворотки крови, выявляемый в РППЛ. Блокирующий фактор отражает состояние блокады иммунокомпетентных клеток, участвующих в процессах противоопухолевого иммунитета. Данный фактор выявляется после удаления первичного очага меланомы почти у 25-30% больных. Вследствие применения ИСВП данный фактор выявляется на 6-й месяц иммуностимуляции только у 10% больных. Блокирующий фактор в сыворотке крови также снижается в течение 2 первых месяцев иммуностимуляции декарисом и выявляется у 10% больных, однако на 6-й месяц иммуностимуляции блокирующий фактор обнаруживается у 30-40% больных, при этом обнаруживается у таких больных, которые после удаления опухоли блокирующего фактора в крови не имели. 5. Противовирусные антитела в сыворотке крови. В первые месяцы при иммуностимуляции ИСВП в сыворотке крови резко возрастают противовирусные антитела, обнаруживаемые в реакциях нейтрализации и торможения гемаглютинации. Прирост вируснейтрализующих антител в это время достигает титр от 1:20 до 1:5000-10000. При прекращении иммуностимуляции (6-9 месяцев) титры антител падают и стабилизируются при обновлении иммуностимуляции (9-12 месяцев). Таким образом, в организме больных происходит активный вирусный иммуногенез. Вирусный иммуногенез является благоприятным сроком для проявления противоопухолевого иммунитета путем восстановления и нормализации процессов, заблокированных опухолевым ростом. Таким образом, применение ИСВП в послеоперационном периоде после радикального удаления первичного очага меланомы кожи стабилизирует или активирует иммунные реакции организма. При этом не наблюдаются явления перестимуляции, аутоимунных реакций. Показатели иммунологического статуса свидетельствуют об отсутствии токсических эффектов при длительном парентеральном применении ИСВП. Заявляемый иммуностимулятор на основе апатогенного адаптированного к опухоли штамма энтеровирусов Picornaviridae Enterovirus типа ECHO эффективен при подавлении роста опухолей.-5 007839 Данный тип вирусов не имеет оболочек, включающих антигены клеточного происхождения, индуцирующих явление аутоиммунитета. Кроме того, этот тип вирусов обладает генетической безопасностью, обеспеченной организацией генома не интегрирующегося с клеточным геномом и не дающего рекомбинаций с геномами других вирусов. Разработанный способ получения иммуностимулятора обеспечивает получение препарата с наибольшей активностью. Заявляемый иммуностимулятор активно подавляет рост опухоли при рецидиве, удлиняет время стабилизации между рецидивами, увеличивает время диссеминации. Кроме того, при рецидивах, в основном, образуются подкожные метастазы в лимфоузлах, которые сравнительно легко удалить. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Иммуностимулятор противоопухолевого действия, включающий апатогенную вирусную культуру, отличающийся тем, что в качестве указанной культуры он содержит адаптированный к опухоли штамм энтеровируса типа ECHO, выделенный из кишечника человека с титром в монослойной культуре фибробластов эмбриона человека, равным 5-7 lg ТЦД 50/0,1 мл. 2. Иммуностимулятор по п.1, отличающийся тем, что штамм энтеровируса выделен из кишечника ребенка в возрасте 2-5 лет. 3. Способ получения иммуностимулятора по п.1, заключающийся в том, что апатогенную культуру энтеровирусов выделяют из кишечника человека, отбирают вирусную культуру, имеющую сродство к опухоли, пассивирование проводят в культуре ткани индивидуальных опухолей и размножают пассивированный штамм в культуре фибробластов эмбриона человека до титра 5-7 lg ТЦД 50/0,1 мл.