Применение экстракта гинкго двудольного для изготовления композиции топического использования, обладающей иммуномодулирующей активностью, и способ косметического ухода за сверхчувствительной кожей с его использованием

1 Настоящее изобретение относится к применению в области иммуномодуляции экстрактов, которые могут быть получены из гинкго двудольного. Эти экстракты могут быть, в частности, использованы для лечения, предупреждения или модуляции кожных проявлений иммунных расстройств. Гинкго двудольный (Ginkgo biloba) представляет собой двудомное дерево, которое произрастает на Дальнем Востоке и листья которого используются для получения лекарственных препаратов. Экстракты гинкго были предложены для улучшения симптомов, связанных с умственной отсталостью у пожилых людей, скачкообразной хромотой, облитерирующей артериопатии и болезни Рейно; эти экстракты были также рекомендованы в случаях нарушения сетчатки, где для нужной активности особенно необходимо участие компонентов гинкголидной группы. Заявителем было неожиданно обнаружено,что экстракты, полученные из гинкго двудольного, обладают иммуномодулирующей активностью. В соответствии с этим объектом настоящего изобретения является применение, по крайней мере, одного активного компонента,который может быть получен из гинкго двудольного для изготовления композиции местного применения, имеющей иммуномодулирующую активность. Иммунные реакции регулируются комплексной системой и участвуют в поддержании общего хорошего состояния организма. Они обеспечивают защиту организма от инородных частиц, присутствующих в патогенных агентах суставов, или от клеток, подвергшихся опухолевой трансформации. Такая защита заключается в определении инородной природы антигена и стимуляции клеточных или гормональных медиаторов. Механизм этой защиты зависит от генетических факторов, а в частности от генов главного комплекса гистосовместимости. Однако в некоторых случаях этот механизм может быть неприемлем, если он протекает слишком интенсивно или если он направлен против антигенов окружающей среды, которые сами по себе не обладают каким-либо неблагоприятным действием; и неприемлем он и в том случае, если он направлен на трансплантированный орган или трансплантированную ткань. Кроме того, некоторые функциональные нарушения приводят к ошибочному определению клеток хозяина, что приводит к разрушению собственной иммунной системы хозяина, и может вызвать ряд патологий (например, таких как диссеминированная красная волчанка, дерматомиозит, ревматоидный артрит или некоторые типы внезапного гепатита). Кроме того, было установлено, что среди людей, подверженных аллергическим реакциям,также преобладают индивидуумы, имеющие так 2 называемую "чувствительную" кожу. Вообще говоря, люди все больше жалуются на "чувствительную" кожу. Хотя этиология таких состояний является сложной, однако, очевидно, что в большинстве случаев значительную роль играет их аллергическая и воспалительная природа. Понятие "чувствительная" кожа охватывает ряд симптомов, включающих реактивную кожу и кожу, склонную к аллергии. Стимулирующими аллергию факторами могут служить условия окружающей среды, такие как ветер,грязь, колебания температуры, очень жесткая вода или неподходящие гигиенические средства, косметические продукты или средства ухода за кожей; эти явления могут также ассоциироваться со стрессами или эмоциональным состоянием индивидуума, с некоторыми продуктами питания или приемом лекарственных препаратов. Кроме того, имеются также факторы индивидуальной предрасположенности (особенно неврологические или гормональные факторы) или факторы наследственной предрасположенности индивидуума, которые усиливают указанные реакции. Обычно индивидуум ощущает кожный дискомфорт, который может проявляться сам по себе в виде субъективных и/или объективных симптомов. Иногда индивидуум ощущает просто острую боль, зуд или покалывание; может быть также ощущение жара, укуса или жжения. Кожа может подвергаться покраснению или шелушению. Иногда могут наблюдаться ксероз,себорея, телеангиэктазия, волдыри или даже отеки. Это состояние может проявляться само по себе в области кожи, слизистых оболочек или волосистой части головы. В последнем случае,оно может ассоциироваться с перхотью и/или алопецией. Как указывалось выше, такое состояние часто обусловлено аллергическим компонентом. Кроме того, оно может прогрессировать с возникновением дерматологических болезней иммуноаллергического типа, таких как атопия,экзема или нейродерматиты. Аллергические состояния были классифицированы по природе иммунологических реакций и разделены на четыре типа; при этом все эти состояния являются результатом иммунологического механизма воспаления. В настоящее время было обнаружено, что экстракты гинкго обладают иммуномодулирующей активностью. Это может быть продемонстрировано на смешанных лимфоэпидермальных культурах. Действительно кожа, а особенно эпидермис, где расположены клетки Лангерганса, играют определенную роль в иммунной защите организма. Было установлено, что клетки Лангерганса (LC) функционируют как антигенпредставляющие клетки, и был установлен тот факт, что кератиноциты могут генерировать 3 факторы, участвующие в иммунном ответе, который лежит в основе понятия "кожная иммунная система". Периферическое положение клеток Лангерганса возлагает на них главную роль в осуществлении контроля, подготовки и представления антигена Т-лимфоцитам. Представление антигена предусматривает взаимодействие между молекулами класса II главного комплекса гистосовместимости (HLA-DR), экспрессируемыми клетками Лангерганса, и Т-рецепторомCD4+-лимфоцитов. В ранней фазе сенсибилизации антигены контролируются в эпидермисе клетками Лангерганса и превращаются в иммуногенные пептиды. Представление антигена Тлимфоцитам происходит в ганглии посредством взаимодействия между комплексом "HLA-DR иммуногенные пептиды" на поверхности клеток Лангерганса и Т-рецептором CD4+-лимфoцитoв. Смешанные лимфоэпидермальные культуры (MLEC) позволяют определить иммуномодулирующие свойства вещества, способного модифицировать кожное иммунологическое равновесие, путем измерения пролиферации лимфоцитов, индуцированной антигенпредставляющими аллогенными эпидермальными клетками, при обработке или без обработки этим веществом. Антиаллергическая активность была подтверждена с использованием кератиноцитов и макрофагов. Макрофаги являются особенно предпочтительными клетками, поскольку они присутствуют в коже в таких количествах, которые регулируют не только местные воспалительные реакции, но также и иммунные ответы благодаря своей способности представлять антиген и продуцировать большое число цитокинов, которые регулируют местный иммунитет. Эти макрофаги также участвуют во взаимодействиях с системой кровообращения, которая может, если это необходимо, активировать различные типы клеток (моноциты, нейтрофилы,эозинофилы и Т-лимфоциты), увеличивая, тем самым, неспецифическую и специфическую иммунную защиту рассматриваемой ткани. Активность активного компонента, экстрагированного из гинкго, может быть, таким образом, оценена на культурах человеческих кератиноцитов и макрофагов, стимулированных или как-либо иначе активированных цитокинами IL4, которые индуцируют СD23-рецептор на поверхности клеток, а затем IgE-содержащими иммунными комплексами. Этот тип стимуляции обнаруживает аллергическое воспаление (IgE) и ставит клетки в условия ускоренного окислительного ответа (генерирование супероксидного аниона или свободных радикалов NO, уровень которых может быть оценен путем измерения продуцирования азотных производных) и иммуновоспалительного ответа (продуцирование цитокинов, таких как TNF-). Кроме того, эта иммуномодулирующая активность усиливается благодаря тому, что ак 000974 4 тивные компоненты, экстрагированные из гинкго, также влияют на воспаление, которое является неспецифическим и имеет местное проявление. Более конкретно, активный компонент согласно изобретению присутствует в композиции в форме экстракта, полученного из гинкго двудольного. Для применения согласно изобретению подходящими могут быть различные экстракты гинкго двудольного, при этом концентрация терпена в этих экстрактах составляет менее чем 3 мас.%, а концентрация флавонгетеразидов - более 24 мас.%. Действительно, гинкго двудольный имеет сложный химический состав, включающий алифатические спирты и углеводороды, стероиды,аминокислоты, полифенолы, такие как лютеолин, кверцетол, и более специфические бифлавоны, происходящие от аментафлавона (билобетин, гинкгетин); он также содержит гинкголевую кислоту и анакардиновые производные,содержащие сесквитерпеновую цепь; терпены,происходящие от лимонена, и терпены с третбутиловыми группами (билобалиды и гинкголиды). Экстракты, подходящие для использования согласно изобретению, могут содержать терпеновые производные в количестве примерно менее, 3 мас.% по массе сухого вещества, в частности менее 1 мас.%, а предпочтительно менее 0,5 мас.%. Предпочтительно, чтобы из используемого экстракта были в основном удалены хлорофилл,липиды, воски и пектины. В этом экстракте также, в основном, отсутствуют такие вещества, как гинкголевая кислота, бифлавоноиды или свободные агликоны. Концентрация проантоцианидинов предпочтительно составляет менее 5 мас.% по массе сухого экстракта. Экстракты, которые могут применяться согласно изобретению, имеют концентрацию флавонгетерозидов более 24% по массе сухого вещества, более предпочтительно более 28 мас.%,предпочтительно от около 29 до 35 мас.% Флавонгетерозиды представляют собой соединения, в которых агликоном является флавонол, такой как кверцетин, кемпферол или изорамнетин. Эти соединения представляют собой моно-, три- и особенно диглюкозиды, главными углеводными составляющими которых являются глюкоза и рамноза. Они присутствуют в значительных количествах в виде кумариновых сложных эфиров кверцетина и кемпферолглюкорамнозида. Экстракт гинкго, который является наиболее предпочтительным для использования согласно изобретению, имеет содержание воды менее 3 мас.%, концентрацию флавонгетерозида 323 мас.%, концентрацию гинкголевой кислоты менее 10 млн.д., концентрацию проантоциа 5 нидина менее 5 мас.% и концентрацию терпена менее 0,5 мас.% Т.о. настоящее изобретение относится к применению, по крайней мере, одного активного компонента, который может быть получен из экстракта гинкго двудольного, для приготовления композиции, предназначенной для предупреждения, лечения и/или модуляции реакций"чувствительной" кожи, описанных выше. Настоящее изобретение относится также к использованию активного компонента, экстрагированного из гинкго и определенного выше,для приготовления композиций, предназначенных для лечения или предупреждения состояний группы, включающей атопию, витилиго,псориаз, полиморфную эритему, нейродермиты,ксеродермию, розацеа, крапивницу, пузырчатку(пемфигус), системную красную волчанку, дерматит, доброкачественный летний фотодерматоз и экзему. Согласно изобретению экстракты гинкго двудольного могут быть использованы путем адаптации их дозы в целях модуляции некоторых иммунных механизмов. Таким образом, они могут быть использованы при некоторых дерматологических состояниях, ассоциированных со СПИДом; так,например, по современной интерпретации болезнь Капоши, которая обычно имеет 4 клинические формы (и возбудителем которой является, как предполагается, вирус группы герпесвирусов), проявляется в гиперплазии, состоящей в основном из воспалительных клеток. Предпочтительно в композициях согласно изобретению экстракт гинкго присутствует в концентрации от 0,0001 до 10 мас.%, а предпочтительно от 0,01 до 2 мас.%. Эти экстракты могут быть использованы в препаратах как таковые, либо они могут быть объединены с фосфолипидами, которые повышают их биологическую доступность в носителях типа липосом, или фитосом (Phytosome). Объектом изобретения является также способ косметического ухода за сверхчувствительной кожей, отличающийся тем, что, по крайней мере, один активный компонент, который может быть получен путем экстракции из гинкго двудольного, наносят топическим путем. Композиции согласно изобретению могут быть изготовлены с использованием косметологически и или дерматологически приемлемых носителей, известных специалистам. Нижеследующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение. Пример 1. 1. Материалы и методы. Продукты Во время исследований были использованы следующие продукты: IL-4 фирмы Immugenex (Los Angeles, СА) в концентрации 10 нг/мл; моноклональные IgE фирмы Straller 000974(Tilburg, Holland). Культура кератиноцитов Первичные культуры кератиноцитов получали из неонатальной крайней плоти и выдерживали в условиях разрастания ex vivo в среде,не содержащей сыворотки. Конфлюэнтные культуры кератиноцитов трипсинизировали и переносили в 24-луночные планшеты в свежую среду при плотности клеток 105 клеток/мл на лунку. Присутствие рецептора IgE (CD23) на поверхности клеток контролировали путем иммуного мечения. Культура макрофагов Макрофаги получали из периферической крови нормальных (не склонных к аллергии) доноров. Мононуклеарные клетки выделяли на градиенте фиколла и получали кольцо лимфоидных клеток, которые три раза промывали, а затем клетки культивировали так, чтобы происходила адгезия макрофагов. После адгезии в течение 1 ч эти клетки выделяли и культивировали (106 кл./мл на лунку). Перед стимуляцией цитокинами IL-4 присутствие рецептора IgE(CD23) на поверхности клеток тестировали путем иммуного мечения. Активация клеток Клетки сначала активировали с использованием IL-4 для индуцирования CD23, а затем культивировали и стимулировали с использованием IgE-содержащих иммунных комплексов в течение 3-5 дней с последующим выделением различных супернатантов. Азотные производные анализировали с использованием Griess, а уровень TNF измеряли с использованием наборов для анализа от Medgenix (Fleurus, Belgium). 2. Результаты: Действие экстракта гинкго двудольного наIL-4-стимулированные кератиноциты и макрофаги. Сухие листья гинкго двудольного подвергали продолжительной экстракции смесью ацетона и воды в вакууме и проводили несколько стадий удаления растворителя, а также хлорофилла, липидов, восков, пектинов и некоторых веществ, в результате чего получали экстракт,который далее обозначали Н 37. Этот экстракт имел форму мелкозернистого порошка, соответствующего следующему составу: Остаточные растворители Этанол 3% Ацетон 0,1% Бутанол 0,1% Этилацетат 0,1% Сульфатированная зола 1,5% Содержание воды 3% Проантроцианидины 5% Терпены 0,5% Гинкголевая кислота 10 м.д. Тяжелые металлы 20 м.д. Флавонгетерозиды 323% 7 Он является растворимым при 6%(масс./об.) в 90% этанола. Клетки стимулировали в течение 48 ч в присутствии IL-4 (10 нг/мл) для индуцирования рецептора с низкой связью по отношению к IgE(CD23) на их поверхности. По окончании указанного периода культивирования, 30-80% кератиноцитов и макрофагов экспрессировалиCD23. Отдельные изменения ни в коем случае не являются отражением различных аллергических состояний у этих индивидуумов. Независимо от ситуации, в этой фазе индуцирования,тестируемый продукт не модифицирует это индуцирование CD23; фактически, не может наблюдаться снижения менее, чем на 5% (n = 8). Таблица 1. Индуцирование экспрессии CD23 различными клетками, стимулированными IL-4 в присутствии или отсутствии 10 мг/мл Н 37 Клетки СредаND 514 Клетки стимулировали в течение 48 ч в присутствии или в отсутствии 10 нг/мл IL-4 и в присутствии или в отсутствии различных продуктов, ND = не обнаружено. После присоединения CD23 IgE-содержащими иммунными комплексами индуцируется большое число медиаторов и цитокинов (особенно TNF), и продуктов, образующихся в результате окислительного метаболизма, таких как азотные производные. Эта стимуляция позволяет заново оценить in vitro воспалительную реакцию аллергического типа. Полученные результаты систематизированы в следующих двух таблицах: Таблица 2 А. Продуцирование нитропроизводных (NO2, мкМ) после стимуляции+ Н 37 12(11) 8(2) 10(10) 8(6)Величины в скобках соответствуют величинам для клеток, не стимулированных IgEсодержащими иммунными комплексами. Продукт Н 37 обладает ингибирующим действием на продуцирование нитропроизводных макрофагами и кератиноцитами, стимулированными IgE-содержащими иммунными комплексами. Величины в скобках даны для клеток, не стимулированных IgE-содержащими иммунными комплексами, ND = не обнаружено. Продукт Н 37 способствовал небольшому снижению продуцирования TNF макрофагами и кератиноцитами, стимулированными IgE-содержащими иммунными комплексами. Отсюда очевидно, что продукт Н 37 обладает противовоспалительной активностью при аллергиях. Это свойство является очень важным, поскольку тяжелые воспалительные реакции, особенно, аллергического происхождения,вызываются нарушением окислительного метаболизма этих клеток. Таким нарушением, в частности, является нарушение, которое ответственно, по крайней мере частично, за регулирование иммунологических состояний, ассоциированных с этими реакциями, как, например, в случае специфических аллергических реакций и продуцирования цитокинов. Пример 2. Исследование действия Н 37 на аллогенные смешанные лимфоэпидермальные культуры (MLEC) (представление антигена Тлимфоцитам). Понятие "смешанные лимфоэпидермальные культуры" (MLEC) означает смешанные культуры лимфоцитов, различающиеся только тем, что стимулирующей популяцией является суспензия полных эпидермальных клеток (кератиноцитов, клеток Лангерганса и т.п.). Поскольку эта сокультура дает возможность оценивать способность клеток Лангерганса представлять антиген Т-лимфоцитам, то эта культура, в частности, может быть с успехом использована для тестирования молекул (или стресса), способных модифицировать кожные иммунные ответы. Вкратце, партии контрольных полных эпидермальных клеток, а также, партии эпидермальных клеток культивировали с Т-лимфоцитами. Обработку экзогенной молекулой осуществляли во время совместного культивирования. Затем оценивали пролиферацию лимфоцитов, индуцированную эпидермальными клетками. Этот способ дает возможность прослеживать иммунные функции клеток Лангерганса во время лимфоэпидермального сокультивирования и их модификацию посредством экзогенных обработок. Эти исследования проводили в аллогенной ситуации (различные доноры для эпидермальных клеток и Т-лимфоцитов) с использованием только что собранных полных эпидермальных 9 клеток, полученных в результате пластической операции молочной железы. Процедура Этот эксперимент проводили с использованием эпидермальных клеток, полученных от 2 или 3 различных доноров. Эпидермальные клетки совместно культивировали с аллогенными Т-лимфоцитами в 96 луночных планшетах: число полных эпидермальных клеток было эквивалентно числу лимфоцитов (105 эпидермальных клеток - 105 Тлимфоцитов на лунку). Полное время совместного культивирования составило 6 дней, а введение меченного тритием тимидина осуществляли за 18 ч до окончания совместного культивирования (5-ый день). Пролиферацию лимфоцитов оценивали путем измерения включения меченного тритием тимидина (с помощью счетчика радиоактивности после "сдавливания" планшетов). Во время совместного культивирования эпидермальных клеток добавляли молекулы(экстракт Н 37 или циклоспорин) и аллогенные Т-лимфоциты. Образцы, обработанные аналитическими молекулами; Сокультуры эпидермальных клеток и аллогенных Т-лимфоцитов с исследуемыми молекулами в увеличивающихся концентрациях,полученных путем добавления небольшого объема концентрированного раствора молекулы (4 конечных концентрации). Для Н 37, который является растворимым в воде, исходный раствор получали в воде, а затем в среде. Для циклоспорина, который является растворимым в ДМСО,исходный раствор получали в ДМСО, а затем получали дочерние растворы в среде. В лунках использовали небольшие количества конечного ДМСО (0,1% конечный объем для контрольного ДМСО и для циклоспорина). В качестве негативного контроля использовали:- только необработанные эпидермальные клетки (контроль ЕС);(контроль РВМС); другой контроль: только эпидермальные клетки, обработанные ДМСО (растворитель,используемый для циклоспорина); только Тлимфоциты, обработанные ДМСО; только эпидермальные клетки, обработанные молекулами при самой высокой концентрации; и только Тлимфоциты, обработанные молекулами при самой высокой концентрации. В качестве позитивного контроля использовали: эпидермальные клетки + аллогенные Тлимфоциты (ЕС = контроль РВМС); 10 Стандартом являлся циклоспорин (Cyclo) 106 М. Продукт Н 37 использовали при следующих конечных концентрациях: 1: 0,03%; 2: 0,01%; 3: 0,001%; 4: 0,0001%. Результаты Предварительные эксперименты показали,что продукт Н 37 с концентрацией вплоть до 0,03%, не обнаруживает какого-либо цитотоксического действия как на лимфоциты, так и на эпидермальные клетки. Проведенные эксперименты показывают,что пролиферация Т-лимфоцитов происходит в присутствии полных эпидермальных клеток(увеличение при введении меченного тритием тимидина). Амплификация пролиферации лимфоцитов связана со штаммом эпидермальных клеток, который отличается в каждом эксперименте. Эта индуцированная пролиферация соответствует представлению антигена Т-лимфоцитам клетками Лангерганса, выделенными из препарата полных эпидермальных клеток. Циклоспорин, который является известным иммуномодулятором, ингибирует пролиферацию лимфоцитов в MLEC (ингибирование 70%). Продукт Н 37 оказывает заметное ингибирующее действие на пролиферацию лимфоцитов в MLEC при концентрациях 1 (0,03%) и 2(0,01%). Эти результаты показали, что продукт Н 37 обладает иммуномодулирующими свойствами,которые продемонстрированы во время in vitro - эксперимента с использованием MLEC. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение экстракта гинкго двудольного, содержащего менее 3% терпена или более 24% флавонгетерозидов в расчете на массу сухого вещества для изготовления композиции топического использования, обладающей иммуномодулирующей активностью. 2. Применение по п.1, отличающееся тем,что композиция предназначена для предупреждения или лечения иммунозависимых кожных реакций. 3. Применение по любому из пп.1 и 2, отличающееся тем, что указанный экстракт получен из листьев гинкго двудольного. 4. Применение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что композиция предназначена для лечения или предупреждения непереносимости и/или аллергических реакций кожи и слизистых оболочек. 5. Применение по любому из пп.1-4, отличающееся тем, что композиция предназначена для лечения или предупреждения состояний группы, включающей: атопию, витилиго, псориаз, полиморфные эритемы, нейродермиты, 11(пемфигус), системную красную волчанку, дерматит, доброкачественный летний фотодерматоз, экзему и ассоциированные со СПИДом дерматологические проявления. 6. Применение по п.5, отличающееся тем,что в композиции экстракт гинкго присутствует в концентрации от 0,0001 до 10 мас.%. 7. Применение по любому из пп.3-6, отличающееся тем, что в композиции экстракт гинкго присутствует в концентрации от 0,01 до 2 мас. %. 12 8. Способ косметического ухода за сверхчувствительной кожей, заключающийся в том,что на кожу наносят топическим путм композицию, содержащую экстракт гинкго двудольного, включающий менее 3% терпена или более 24% флавонгетерозидов в расчте на массу сухого вещества. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что наносимая топическим путем композиция содержит экстракт гинкго в комбинации с дерматологически приемлемыми носителями.