Применение гидрокситирозола для восстановления мышц

011957 Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к применению антиоксидантных соединений для сохранения или восстановления состояния мышц. Эти соединения могут использоваться в приготовлении композиции для сохранения или восстановления состояния мышц, тем самым, например, предохраняя и/или восстанавливая повреждение мышц вследствие нагрузки. В частности, такая композиция включает пищу, напиток, пищевые добавки и корм. Уровень техники Спортсмены регулярно подвергаются интенсивной и/или длительной мышечной нагрузке. Результаты исследований позволяют предположить, что в течение интенсивного физического упражнения, образование активных форм кислорода (АФК) возрастает до уровня, который подавляет антиоксидантные защитные системы ткани. В результате чего развивается окислительный стресс, который может являться причиной повреждения тканей, например мышечной ткани. Обычно, хорошее состояние мышц имеет крайне важное значение для их функционирования, особенно скелетных мышц. Нагрузка может, таким образом, нарушить состояние мышц, результатом чего могут быть, например, утомление, более низкая выносливость, потеря функции. Применение антиоксидантных напитков предполагает предохранение от такого повреждения (Dietary anti-oxidants and exercise, Journal of Sports Sciences, 2004, 22, 81-94, Powers etHe все антиоксиданты, тем не менее, пригодны для восстановления повреждения мышц. Исследования показали, что некоторые антиоксиданты почти не оказывают какое-либо действие. Это может быть по нескольким причинам. Во-первых, биодоступность антиоксидантов может быть низкой. При этом усвоение антиоксидантов в кишечнике остается сравнительно низким, что приводит к потребности в больших количествах антиоксиданта для эффективного действия. Во-вторых, не все антиоксиданты могут проникать через мембрану мышечных клеток. Более того, некоторые антиоксиданты истощаются при использовании, что также требует относительно большого количества потребления антиоксидантов для оказания эффекта. А это не желательно не только из-за перспективы здоровья (много метаболитов в организме), но также и из-за расходной перспективы. Известно, что некоторые антиоксиданты регенерируются в так называемой антиоксидантной системе, например регенерация витамина Е с помощью витамина С. Однако исследования in vivo в отношении витамина Е не показали какие-либо значимые эффекты на антиоксидантные маркеры. Сущность изобретения Задачей изобретения является представление соединения, пригодного для мышечного восстановления, которое может принимать участие в антиоксидантной системе, имея хорошую биодоступность. Неожиданно было обнаружено, что пищевое соединение формулы (1) может использоваться для сохранения или восстановления мышечного состояния где m - 1, 2 или 3,с условием, что R и R1 - это не H одновременно. Примерами пригодных соединений формулы (1) являются гидрокситирозол и его ацетат, олеуропин, тирозол и его ацетат, гомованилиновый спирт и/или катехол. Также могут использоваться комбинации этих соединений. Неожиданно было обнаружено, что это соединение может регенерироваться при использовании витамина С. Это делает соединение формулы (1) пригодным для использования в приготовлении композиции для предохранения или восстановления мышечного повреждения вследствие окислительного стресса. Предпочтительно R - это ОН. Более предпочтительно, по меньшей мере, использование в композиции гидрокситирозола и его ацетата. Гидрокситирозол имеет дополнительное преимущество, так как он амфифильный. Он может растворяться как в водных, так и в жирных композициях, например, во внутриклеточных и межклеточных жидкостях и мембранах. Соединение формулы (1) может использоваться в приготовлении композиции для лечения или пре-1 011957 дохранения мышечного повреждения. Предпочтительно, чтобы эта композиция не содержала салидрозид. Другим аспектом изобретения является применение согласно изобретению, где компонент, пригодный для восстановления мышечной ткани, используется в продукте питания, пригодного для потребления человеком. Любой продукт питания может быть пригоден, например пища, напиток или диетическая добавка. Предпочтительно продукт питания не является жевательной резинкой. Предпочтительно антиоксидантное соединение формулы (1) входит в состав продуктов для питания спортсменов для потребления спортсменами. Известно, что спортсмены могут использовать специфическую пищу или пищевые ингредиенты помимо рекомендованного питания для населения в целом. Термин продукты для спортивного питания в используемом здесь значении означает любые пищу или напиток, особенно подходящие для спортсменов. Существует несколько видов продуктов для спортсменов, пригодных для цели изобретения, например, специальные диетические добавки, спортивные напитки или спортивная пища. Напитки для спортсменов могут быть гипотоническими, гипертоническими или изотоническими. Спортивные напитки могут быть в жидкой форме, в виде концентратов порошков (для растворения в жидкости, например в воде). Пища для спортсменов может быть в виде плитки, таблеток или гелей. Диетическая добавка может быть в виде пилюли или капсулы. Кроме того, питание может содержать обыкновенные добавки, например подсластители, ароматизаторы, сахар, жир, эмульгаторы, консерваторы. Питание также может включать другие активные компоненты, такие как (гидролизованные) протеины, которые описаны в WO 02/45524. Также другие антиоксиданты могут быть представлены в питании, например флавоноиды, каротиноиды, убихиноны, рутин,липоевая кислота, каталаза, глутатион (GSH) и витамины, как, например, С и Е или их предшественники. Комбинация соединения формулы (1) и витамина С или его предшественника оказывала синергетический эффект. Предпочтительно гидрокситирозол или его ацетат комбинируется с витамином С. Композиция, содержащая соединение формулы (1) и витамин С, является новой и является другим объектом изобретения. Требуется, чтобы соединение формулы (1) было представлено в эффективном количестве. Обычно требуется от 1 мг до 3 г соединения на порцию для оказания эффекта, предпочтительно от 10 мг до 1 г на порцию. Это зависит от некоторых факторов, таких как вес, возраст, диетические предпочтения и интенсивности нагрузок. Действие антиоксиданта может быть определено посредством определенных маркеров. При мышечной нагрузке происходит как окисление липидов, так и окисление протеинов. Пригодными маркерами для определения уровня липидного окисления являются, например, малоновый диальдегид (МДА) и изопротаны. Пригодным маркером для определения уровня протеинового окисления являются, например, белковые карбонилы. Питание, включающее соединение формулы (1), может применяться перед, во время или после нагрузки. В случае, если оно применяется перед нагрузкой, предпочтительно, чтобы оно использовалось приблизительно за один час до нагрузки. В случае, если оно используется после нагрузки, предпочтительно его применять в течение одного часа после нее, более предпочтительно сразу после нагрузки. Дополнительно к продуктам питания, пригодным для потребления человеком, также возможно использование соединения формулы (1) в корме для животных, включая корм для домашних животных. Кроме того, оно особенно пригодно для животных, которые используют свою мышечную силу, например(скаковые) лошади или собаки (т.е. беговые собаки или упряжные собаки). Изобретение в дальнейшем разъясняется следующими не ограничивающими примерами. Примеры Пример 1. Эксперименты в ванне для органов. Использовались крысы-самцы линии Lewis (возрастом 12-14 недель). После декапитации диафрагма быстро удалялась и нарезались небольшие полоски (около 2 мм шириной и 1 см длиной), которые затем помещались в термостатированные ванны для органов, содержащие буфер Кребса, насыщенный смесью 95% O2 и 5% CO2, pH 7,4. Каждая полоска диафрагмы соединялась вертикально с изометрическим датчиком. В состав буфера Крепса входили (мМ): NaCl - 117,5, KCl - 5,6, MgSO4 - 1,18, CaCl2 - 2,5,NaHPO4 - 1,28, NaHCO3 - 25 и глюкоза - 5,5. В течение эксперимента буфер менялся каждые 15 мин. Область стимуляции создавалась вдоль всей длины каждой мышечной полоски при использовании платиновых электродов. В начале эксперимента полоски промывались в течение 45 мин при комнатной температуре до снижения температуры, связанной с истощением. Затем включалась водяная баня при температуре 37 С (за 15 мин до начала эксперимента). Каждую полоску сначала корректировали по оптимальной длине (До),используя мышечные сокращения (1 Гц). Продолжительность импульса была всегда 10 мс. Первыми определялись Pt (давление при сокращении мышц при стимуляции 1 Гц) и Ро (максимальное удельное давление при стимуляции 100 Гц, продолжительность 250 мс). Затем определялся ответ диафрагмальных мышечных полосок на увеличение частоты стимулов при До путем использования 10, 20, 33, 50 и 100 Гц-импульсов, приложенных с интервалами в 250 мс. Использовался 2-минутный период восстановления между сокращениями. По завершению протокола для силы-частоты применяется-2 011957 протокол для истощения. Полоски стимулировались в течение 6 мин при 5 Гц. После такого протокола стимуляции гидрокситирозол (ГТ) или контроль (среда, этанол) инкубировали в течение 5 мин. Далее пероксид водорода (H2O2) или контроль (MilliQ) инкубировали в течение 10 мин. После чего снова определяли Pt, Ро, силу-частоту и истощение. Гидрокситирозол был приобретен у Cayman Chemical, Ann Arbor, США. Пероксид водорода был получен от Sigma, St. Louis, США. Все другие химикаты соответствовали аналитической степени чистоты. Краткое описание фигур Фиг. 1 демонстрирует действие H2O2 на мышечную силу. В зависимости от дозы H2O2 уменьшает силу при всех используемых частотах стимуляции по сравнению с контролем. Данные выражены как средние на основании, по меньшей мере, двукратных измерений. Фиг. 2 показывает защитное действие ГТ против H2O2, являющегося посредником мышечного повреждения. ГТ защищает против H2O2, являющегося посредником мышечного повреждения, при всех частотах стимуляции (10, 20, 33, 50 и 100 Гц). 300 мкМ ГТ при отсутствии H2O2 инкубации точно поддерживает функцию мышц. Данные выражены как средние на основании, по меньшей мере, двукратных измерений. Фиг. 3 показывает защитное действие ГТ против H2O2, являющегося посредником мышечного повреждения. ГТ, в зависимости от дозы, защищает против снижения силы, индуцированное H2O2. Частота стимуляции составляла 50 Гц и концентрация H2O2 составляла 1 мМ. Данные выражены как средние на основании по меньшей мере двух повторных измерений. Пример 2. Эксперименты по утилизации и сравнение с липоевой кислотой. Материалы. Гидрокситирозол был получен от Cayman Chemical, Ann Arbor, США. Тирозол и KO2 были получены от Fluka, Buchs, Швейцария. Гомованилиновый спирт, 2-метоксифенол, фенол и дигидрородамин-123(DHR-123) были получены от Sigma, St. Louis, США. Катехол бал получен от Janssen Chimica, Geel,Бельгия. Липоевая кислота была приобретена у Asta Medicac AG, Frankfurt, Германия. Моноксид азота был представлен AGA, Hamburg, Германия. Все другие химикаты соответствовали аналитической степени чистоты.ONOOH утилизация. Защита от ONOOH, вызываемая DHR-123 окислением этих соединений, была измерена, как описано Kooy et al. (Peroxynitrite-mediated oxidation of dihydrorhodamine 123. Free Radic Biol Med, 16; 149-56). Вкратце, 5 мкМ DHR-123 и различные концентрации акцептора были проинкубированы в 100 мМ натрийфосфатном буфере (pH 7,4) при 37 С. Затем в пробирки был добавлен ONOOH путем пипетирования 10 мкл аликвоты при быстром перемешивании, достигая конечной концентрации 0,7 мкМ. Измерения флюоресценции осуществлялись при длинах волн возбуждения и излучения приблизительно 500 и 536 нм. Результаты выражались в виде концентрации акцептора, дающей 50% ингибирования окисленияDHR-123 (IC50). утилизация (перехват). были получены путем реакции ксантина (150 мкМ) и ксантиноксидазы (ХО) (5,5 мкМ/мл) в 50 мМ калийфосфатного буфера (pH 7,8). радикалы были определены с использованием нитросинего тетразолия (НСТ, 50 мкМ). НСТ с образованием формазана. Скорость такого восстановления оцевосстанавливался под действием нивалась спектрофотометрически при длине волны 560 нм в течение 2 мин. Добавлялись различные концентрации акцептора и инкубировались при 37 С. Реакция начиналась при добавлении ХО. Потенциал утилизации выражался как концентрация акцептора, дающая 50% снижение в восстановлении НСТ(IC50). Для регулирования возможного ингибиторного действия акцептора на активность ХО, акцептор с более высокой концентрацией инкубировался при 37 С и затем измерялась скорость образования уратов при длине волны 293 нм в течение 2 мин. Результаты тестов утилизации представлены ниже в табл. 1. Таблица 1 Активности утилизации ONOO- и тестируемых соединений. Показаны величины IC50SEM (в мкМ), n=3-3 011957 Пример 3. Восстановление гидрокситирозола (ГТ) аскорбатом. Окисление ГТ (Cayman Chemical, Ann Arbor, США) осуществлялось при 37 С в 145 мМ фосфатного буфера, pH 7,4, содержащего 50 мкМ ГТ и 5 U/мл тирозиназы (Sigma, St. Louis, США). Инкубация тирозиназы и ГТ приводила к образованию хинона (HTQ). Реакции контролировались спектрофотометрически и путем высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Спектр записывался при скорости сканирования 240 нм/мин. ВЭЖХ анализ инкубационной смеси выполнялся при использовании колонкиSupelcosil LC318. Колонка элюировалась с дистиллированной водой, содержащей 0,1% (вес./вес.) трифторуксусной кислоты и 5% (вес./вес.) ацетонитрила, при скорости потока 1 мл/мин. Использовалось детектирование диодной матрицы (DAD) при длине волны 280 нм. Способность аскорбата реагировать сHTQ определялась, как указано ниже. Сначала образовывался HTQ в течение двух с половиной минут. Затем 150 мкМ аскорбата (Sigma, St. Louis, США) добавлялось к HTQ и смесь немедленно вводилась вручную в ВЭЖХ в течение 3 мин. Фиг. 4 демонстрирует результаты ВЭЖХ измерения только ГТ (контроль). Фиг. 5 демонстрирует действие добавления тирокиназы к ГТ, тем самым показывая образование его хинона (контроль). Фиг. 6 демонстрирует действие добавления аскорбата к смеси ГТ и тирокиназы. Это показывает, что ГТ образовался снова и через 3 мин после этого HTQ более не присутствует. Имеет место восстановление ГТ аскорбатом (пример). Пример 4. Рецепт печенья, содержащего гидрокситирозол. Активные ингредиенты: гидрокситирозол 10-50 мг/на порцию (обычно 30 г) Все ингредиенты добавлялись медленно при смешивании до образования сладкого песочного теста. Затем тесто хранилось в холоде (4 С) в течение по меньшей мере 2 ч перед раскатыванием до толщины приблизительно 5 мм. Нарезаются полоски и перед выпечкой на их поверхность наносится кисточкой яичный желток. Выпекать можно в течение 15 мин в канальной печи при 180 С. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Применение композиции, содержащей гидрокситирозол или его ацетат для сохранения или восстановления состояния мышц для профилактики повреждений мышц, связанных с окислительным стрессом или физическими упражнениями, для сохранения состояния мышц в процессе физических упражнений или для ускорения мышечного восстановления после физической нагрузки, при условии, что указанная композиция не является жевательной резинкой и что в ней не присутствует салидрозид. 2. Применение по п.1, при котором гидрокситирозол или его ацетат присутствует в диетический добавке, корме животного, спортивном напитке или в спортивном питании. 3. Применение по п.1 или 2, при котором композиция дополнительно содержит витамин С. 4. Применение гидрокситирозола или его ацетата для производства пероральной композиции для сохранения или восстановления состояния мышц, для профилактики повреждений мышц, связанных с окислительным стрессом или физическими упражнениями, для сохранения состояния мышц в процессе физических упражнений или для ускорения мышечного восстановления после физической нагрузки при условии, что указанная композиция не является жевательной резинкой и что в ней не присутствует салидрозид. 5. Применение по п.4, при котором указанная пероральная композиция представляет собой диетическую добавку, корм для животного, спортивный напиток или спортивное питание. 6. Применение по п.4, при котором указанная композиция дополнительно содержит витамин С.