Консорциум бифидобактерий bifidobacterium bifidum 791-мб, bifidobacterium longum в 379м- мб, bifidobacterium adolescentis г 7513-мб, bifidobacterium infantis 73-15-мб, bifidobacterium breve 79-119-мб,используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.

006509 Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и может быть использовано для получения консорциума бифидобактерий, в производстве продуктов функционального питания и препаратов-пробиотиков, неферментированных продуктов, при приготовлении косметических и гигиенических средств. Препараты и бифидосодержащие продукты широко используют для лечения и профилактики дисбактериозов различной этиологии, нормализации работы желудочно-кишечного тракта человека и животных, стрессовых влияний, длительной антибиотико-химиотерапии. Как известно, в кишечнике взрослого человека с наибольшей частотой в биоценозе преобладают виды Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium adolescentis, а виды Bifidobacteriuminfantis и Bifidobacterium breve - преимущественно у детей грудного возраста. Известны консорциумы штаммов бифидобактерий различных комбинаций, используемые для приготовления пробиотиков, продуктов лечебного питания, кисло-молочных продуктов, биологически активных добавок и бифидосодержащих ферментированных и неферментированных продуктов зарубежных и отечественных фирм-разработчиков (патент США 6335040, 01.01.2002, заявка США 2002015990,07.02.2002, RU 2109054 C1, 20.04.1998, WO 98/44090, 08.10.1998, RU 2196173 С 1, 10.01.2003, RU 2196174 C1, 10.01.2003). Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является консорциум 5-ти штаммов бифидобактерий: Bifidobacterium bifidum 791, Bifidobacterium longumB 379M, Bifidobacterium infantis Г 73-15,Bifidobacterium adolescentis Г 7513, Bifidobacterium breve 79-119-МБ, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных пищевых продуктов, биологически активных пищевых добавок и бактерийных препаратов. Штаммы имеют близкие культуральные и физиолого-биохимические свойства,консорциум активно размножается в питательных средах с накоплением производственной биомассы в короткие сроки культивирования, обладает специфической активностью. Готовый продукт содержит в 1 мл 109 живых клеток бактерий. Содержание в 1 дозе препарата не менее 107 живых клеток бифидобактерий (RU 2109054 С 1, 20.04.1998). Недостатком известных консорциумов можно считать их слабую устойчивость к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта (кислот, протеолитических ферментов) при прохождении бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте, что указывает на недостаточную колонизирующую активность и жизнеспособность при прохождении пищеварительного тракта. Техническим результатом заявленного изобретения является создание консорциума штаммов бифидобактерий, более устойчивого к повреждающим факторам агрессивных сред гастроинтестинального тракта при прохождении бифидобактерий в желудочно-кишечном тракте и повышения, таким образом,его колонизирующей активности при прохождении пищеварительного тракта, выраженной антиоксидантной активностью и пробиотическим действием, проявляемым в условиях как in vivo, так и in vitro. Консорциум получен также путем сочетания пяти штаммов бифидобактерий Bifidobacterium bifidum 791-МБ, ВКПМ Ac-1688; Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, ВКПМ Ac-1689; Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, ВКПМ Ас-1690; , Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, ВКПМ Ас-1692; Bifidobacteriumbreve 79-119-МБ, ВКПМ Ас-1691, характерной особенностью которых является высокая антибиотикоустойчивость с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность консорциума не ниже 24,9 ед/мг белка и пробиотическое действие культур, используемых в производстве проявляется при потреблении пищевых продуктов и продуктов функционального питания. Штамм Bifidobacterium bifidum 791-МБ получен из коллекционного штамма Bifidobacterium bifidum 791 путем последовательного перепассирования на тиогликолевой среде и обезжиренном молоке (50 пассажей), депонирован в ВКПМ ВНИИгетика под номером ВКПМ Ac - 1688. Штамм Bifidobacterium longum В 379 М-МБ получен из коллекционного штамма Bifidobacteriumlongum путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление), депонирован в ВКПМ ВНИИгетика под номером ВКПМ Ас 1689. Штамм Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ получен из коллекционного штамма Bifidobacteriumadolescentis Г 7513 путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление), депонирован в ВКПМ ВНИИгетика под номером ВКПМ Ас- 1690. Штамм Bifidobacterium infantis 73-15-МБ получен из коллекционного штамма Bifidobacterium infantis 73-15 путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление), депонирован в ВКПМ ВНИИгетика под номером ВКПМ Ас 1692. Штамм Bifidobacterium breve 79-119-МБ получен из коллекционного штамма, Bifidobacterium breve 79-119 путем последовательных циклов лиофилизационной сушки и восстановления на тиогликолевой среде (50 циклов сушка-восстановление), депонирован в ВКПМ ВНИИгетика под номером ВКПМ Ас 1691. Созданный консорциум бифидобактерий показал высокую сочетаемость пяти штаммов бифидобактерий между собой, совместное культивирование смешанной популяции всех 5-ти штаммов предполо-1 006509 жительно протекает аналогично раздельному культивированию штаммов. В среднем количество клеток по сравнению с исходным количеством увеличивалось в сотни раз за 14-16 ч культивирования при оптимальной температуре. Консорциум сохранил свои специфические свойства в течение 2-х лет. Культурально-морфологические признаки консорциума Клетки штаммов микроорганизмов представляют собой грамположительные полиморфные палочки с бифуркацией или утолщением на 1-2-х концах, склонные к образованию скоплений. В жидких питательных средах растут по всей высоте объема, кроме зоны аэробиоза. Логарифмическая фаза заканчивается к 24 ч. Физиолого-биохимические признаки консорциума Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания 37,5 С, рН питательных сред 7,2-7,4. Каталазу не образует, разжижение желатины отсутствует. Ферментирует лактозу с образованием уксусной и L+ молочной кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 3,9-41. Маннозу, целлобиозу, ксилозу, маннит, сорбит, салицин, инулин, арабинозу не ферментирует. Кислотообразующая активность: к 24 ч - 105 Т, к 72 ч -160-195 Т (на тиогликолевой среде), на гидролизатно-молочной среде - до 140-160 Т и 200-220 Т, соответственно. Консорциум активно размножается на средах разного состава. Максимальный титр бифидобактерий консорциума в стерильном обезжиренном молоке без ростовых факторов к 20 ч составляет 2 х 108 КОЕ/мл. Максимальный титр бифидобактерий на кукурузно-лактозной среде наблюдается к 16 ч и составляет 2 х 109 КОЕ/мл, на тиогликолевой среде к 16 ч накапливается до 1-3 х 109 КОЕ/мл. Бифидобактерии консорциума способны утилизировать свободные аминокислоты в стерильном обезжиренном молоке, такие как валин, метионин, аланин, аргинин, изолейцин, глицин. ДНК относится к выраженному ГЦ-типу с коэффициентом специфичности 1,57, молярный процент содержания ГЦ в ДНК равен 61,3. Консорциум проявляет антагонистическую активность по отношению к тест-культурам, полученным из ГИСК им Л.А. Тарасовича: Е. coli В-125, Staphilococcus aureus 209- Р, шигеллам Зонне, Флекснера. (табл. 1). Консорциум устойчив к амикоцину, бензилпенициллину, гентамицину, стрептомицу, канамицину, тетрациклину, офлоксалину (табл. 2). Способность консорциума пяти штаммов бифидобактерий Bifidobacteruim bifidum 791-МБ , Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ,Bifidobacterim breve 79-119-МБ активно накапливать микробную биомассу на различных питательных средах за 16-20 ч выращивания, высокая антибиотическая и супероксиддисмутазная активность с выраженной антиоксидантной активностью: супероксиддисмутазная активность консорциума не ниже 24,9 ед/мг белка микробной массы, проявляемая специфическая активность позволили использовать его в приготовлении кисло-молочных, неферментируемых продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств. Проведенные исследования показали, что при совместном культивировании на тиогликолевой среде при значении рН 7,0-7,3 и кукурузно-лактозной среде при значении рН 6,8-7,0 в стационарных условиях изучаемые штаммы бифидобактерий антагонизма по отношению друг к другу не проявляют. Отмечено, что при совместном развитии отмечается лучшее развитие штаммов В. adolescentis Г 5315-МБ, В.bifidum 791- МБ, В. longum В 379 М-МБ и наименьшее - В. infantis 73-15- МБ и В. breve 79-119- МБ. Антагонистическую активность консорциума штаммов бифидобактерий определяли методом развивающихся смешанных популяций при совместном выращивании с патогенными тестмикроорганизмами по зоне задержки роста тест-микробов методом штриховых кодов. Таблица 1 Наибольшее антагонистическое действие консорциум оказывает на Staphilococcus aureus и Shigellasonnei, которые наиболее часто являются причиной пищевых отравлений, возникающих при потреблении кисло-молочных продуктов. Определение уровней устойчивости штаммов бифидобактерий к антибиотикам проводили по методу серийных разведений в жидкой питательной среде для каждого штамма в отдельности. Устойчивость определяли на стерильном обезжиренном молоке. В питательную среду вводили различные концентрации стерильных растворов антибиотиков и 16-часовые культуры бифидобактерий в количестве 5%. В контрольный образец вносили только биомассу изучаемого штамма бифидобактерий. Устойчивость определяли по изменению титруемой кислотности в образцах после 48 ч инкубирования при температуре-2 006509 37-38 С. Штамм устойчив к антибиотикам, когда разница между титруемой кислотностью в контрольном и опытном образцах составляет не более 30 Т. Таблица 2. Антибиотическая устойчивость штаммов бифидобактерий, составляющих заявленный консорциум Анализ полученных данных свидетельствует о том, что штаммы бифидобактерий устойчивы к наибольшим концентрациям следующих антибиотиков: В. bifidum 791-МБ - к ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину, стрептомицину;B.infantis 73-15-МБ - к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину,стрептомицину; В.breve 79-119-МБ - к амикоцину, ампициллину, бензилпенициллину, канамицину, линкомицину,стрептомицину. Аналогичное исследование в отношении заявленного консорциума бифидобактерий показал, что он обладает устойчивостью по крайней мере к 6-ти антибиотикам: амикоцину, тетрациклину, бензилпенициллину, гентамицину, канамицину, офлаксацину, стрептомицину. Условия хранения заявляемого консорциума Консорциум хранят на питательной среде с массовой долей сухих веществ 14-16% с добавлением защитной среды, содержащей сахарозу, желатозу, лимоннокислый натрий, высушивают сублимационным способом в ампулах. Консорциум хорошо хранится при 6-8 С без потери титра активности в течение года. Основным производственно-полезным признаком заявляемого консорциума бифибобактерий, отличающим его от известных, следует считать выраженную супероксиддисмутазной активностью, которая составляет 24,9 ед/мг белка, содержащегося в микробной массе. Выявленная СОД-активность консорциума бифидобактерий свидетельствует о его выраженном пробиотическом действии, которое может проявляться в условиях in vivo, так и in vitro. Высокая активность кислотообразования, антибиотикоустойчивость к широкому спектру основных антибиотиков, способствует эффективному восстановлению нормальной микрофлоры кишечника уже в процессе антибиотикотерапии.-3 006509 Полученный консорциум может быть использован в качестве биологически активного начала пробиотической направленности при производстве различных форм бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, кисло-молочных продуктов, неферментированных пищевых продуктов, в приготовлении косметических и гигиенических средств. При этом повышается биологическая ценность продуктов функционального питания и препаратов, приготовляемых на его основе. Употребление в пищу продуктов, использующих заявленный консорциум, способствует колонизации слизистой кишечника,вытеснению патогенной и условно патогенной микрофлоры, коррегированию кишечного дисбактериоза,и восстановлению бифидофлоры. Использование заявленного консорциума в производстве кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств, например кремов, салфеток, лосьонов тампонов, питательных масок, женских прокладок,мыла, косметического молока и т.п., обеспечивает пробиотический и бактериологический эффект, способствует восстановлению нормальной микрофлоры, кожных и слизистых покровов, а также направлено на расширение арсенала аналогичных средств. Пример 1. Использование консорциума штаммов бифидобактерий в составе закваски для приготовления кисло-молочных продуктов. 1-й пассаж: Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacteriumbreve 79-119-МБ в количестве 0,1 г (1 доза) сухой биомассы вносят по отдельности в среду выращивания и титруют методом десятикратных разведении до 10-9. Выращивают до появления отдельных колоний в последнем разведении при 37,5-38 С или 1 дозу сухой биомассы каждого штамма вносят в две пробирки с 30 мл питательной среды в каждой. Выращивают до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл. 2-й пассаж: Выросшую культуру каждого из штаммов объемом не более 10% вносят в среду выращивания и культивируют до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 108/мл. 3-й пассаж (продукт): Полученную биомассу каждого из штаммов смешивают, получая консорциум, и в объеме не более 5% вносят в стерильное молоко и культивируют до образования сгустка, который разливают в емкости и охлаждают. Полученный продукт содержит в 1 мл не менее 108 живых бифидобактерий. Пример 2. Использование консорциума штаммов бифидобактерий в составе биологически активной добавки. 1-й пассаж: Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum 791-MБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacteriumbreve 79-119-МБ активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5 С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл. 2-й пассаж: Выросшую биомассу каждого из штаммов в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 108/мл. Получение биологически активной добавки Полученную биомассу каждого из штаммов смешивают, получая консорциум, вносят в питательную среду не более 5% и выращивают до получения биомассы с высоким, не менее 108/мл, титром бифидобактрий. В концентрат можно вносить различные бифидогенные факторы, способствующие стабилизации свойств культуры и лучшей приживляемости штамма в организме. Концентрат, разлитый в емкости, можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебнопрофилактического действия. Можно получить сухую биологическую активную добавку, для этого к полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую, обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45 С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 107/мл, который можно использовать в качестве биологической добавки, внося ее в пищевом сырье непосредственно перед употреблением. Пример 3. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения бифидосодержащего препарата. 1-й пассаж: Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacterum breve 79-119-МБ активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5 С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл. 2-й пассаж: Выросшую биомассу каждого из штаммов в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 108/мл. Получение бифидосодержащего препарата К выросшей биомассе консорциума, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 108/мл, титром бифидобактерий, добавляют защитные среды высушивания (сахарозожелатиновую,обезжиренное молоко), суспензию замораживают при температуре не менее -45 С, лиофилизируют, укупоривают и получают сухой концентрат с содержанием бифидобактерий не менее 108/мл, который мож-4 006509 но использовать в качестве бифидосодержащего препарата. Согласно НТД на сухой бифидумбактерин(ФС-1.32 ВС 94) допускается содержание в 1 дозе препарата не менее 107 живых клеток бифидобактерий Пример 4. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения кваса или сока. 1-й пассаж: Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacteriumbreve 79-119-МБ активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5 С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл. 2-й пассаж: Выросшую биомассу каждого из штаммов в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 108/мл. 3-й пассаж (получение продукта): Выросшую биомассу каждого из штаммов смешивают, получая консорциум, и в объеме не более 5% вносят в хлебный квас или сок после их пастеризации из расчета,чтобы содержание бифидобактерий в 1 мл кваса или сока составило не менее 108/мл. Квас или сок охлаждают и употребляют без последующего брожения. Пример 5. Использование консорциума штаммов бифидобактерий для получения косметического средства. 1-й пассаж: Лиофилизированные штаммы Bifidobacterium bifidum 791-МБ, Bifidobacterium longum В 379 М-МБ, Bifidobacterium adolescentis Г 7513-МБ, Bifidobacterium infantis 73-15-МБ, Bifidobacteriumbreve 79-119-МБ активизируют путем посева в питательную среду и выращивают при 37-38,5 С до получения биомассы с содержанием клеток не менее 108/мл. 2-й пассаж: Выросшую биомассу каждого из штаммов в объеме не более 10% вносят в питательную среду и культивируют до получения биомассы с количеством клеток не менее 108/мл. 3-й пассаж (получение косметического средства): Выросшую биомассу смешивают, получая консорциум, и в объеме не более 5% вносят в биореактор с тиогликолевой средой и инкубируют при 37,538 С при слабом перемешивании до достижения титра бифидобактерий 109 клеток/мл. Впоследствии полученную суспензию клеток разрушают нагреванием в автоклаве. Полученную взвесь биологически активных компонентов охлаждают и смешивают с кремовой основой в соотношении 1:2-1:20 в зависимости от назначения изготовляемого крема. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ Консорциум бифидобактерий Bifidobacterium bifidum ВКПМ Ac-1688, Bifidobacterium longum ВКПМ Ac-1689, Bifidobacterium adolescentis ВКПМ Ac-1690, Bifidobacterium infantis ВКПМ Ac-1692,Bifidobacterium breve ВКПМ Ac-1691, используемый для приготовления кисло-молочных, неферментированных продуктов, биологически активных добавок, бифидосодержащих препаратов, косметических и гигиенических средств.